Mecanisme moleculare ale virulentei si patogenitatii la drojdii

Genul Candida

Peste 200 sp.

Cuprinde specii potential patogene: ex. C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis,

C. tropicalis, C. krusei, C. inconspicua, C. dubliniensis etc.

Cea mai cunoscuta si studiata C. albicans

Nise ecologice

Nise permante: organismul uman si animal

- tegumentului: C. parapsilopsis, guillermondii, krusei

- tractului digestiv si genital: C. albicans, tropicalis, krusei, glabrata

Nise temporale:

- ape reziduale: C.albicans, guillermondii, maltosa

- soluri poluate: C. albicans, tropicalis, robusta

- plante: C. azyma, guillermondii, maltosa, zeylanoides

Caractere generale

Microorganisme: eucariote,unicelulare, aerobe, facultativ anaerobe, conditii de cultivare: 28-37C, pH neutru

Principalii polimeri ai peretelui celular: glucan, mananproteinele si chitina

Coloniile apar sub mai multe forme: netede, rugoase, fibroase, zbarcite

Adaptabilitate ridicata

-Tract digestiv-Tract genital

Tipuri de relatii intre gazda si microorganisme

Principalele tipuri de relaii dintre microorganisme (autohtone /alohtone) i organismul gazd

(animal/uman):

- neutre; neutralism

- benefice: comensalism, simbioza

- antagonice: antibioza

Neutralism (0/0) = Tip de relaii biotice care se stabilesc ntre indivizii a dou specii care nu utilizeaz

aceeai surs de hran

Comensalism (+/0) = form de relaii ntre dou organisme n care unul dintre acestea beneficiaza de

pe urma celuilalt fara sa-l prejudicieze pe celalalt

Simbioza (+/+) = convieuire strns, reciproc avantajoas, a dou organisme din specii diferite

Antibioza (-/+) = tip de relaii ntre dou sau mai multe specii de microorganisme n care una mpiedic

dezvoltarea celorlalte

Infectiile cauzate de specii ale genului Candida

Frecventa

C. albicans ocupa locul 4 in infectiile sistemice cu

o mortalitate de 40%.

Mortalitate ridicata datorita:

- diagnosticarii tarzie

- rezistentei crescute la compusi cu actiune antifungica

Predispozitie ridicata

-persoanele cu imunitate scazuta (varsnicii si nou-nascutii)

-persoanele care urmeaza diferite tratamente cu: corticosteroizi, antineoplazice,

antibiotice cu spectru larg, alte imunosupresoare

-persoanele infectate cu virusul HIV

Coagulase-negative Staph 31.3%

S. aureus 20.2%

Enterococci 9.4%

Candida spp 9.0%

E. coli 5.6%

Klebsiella spp 4.8%

P. aeruginosa 4.3%

Enterobacter spp 3.9%

Serratia spp 1.7%

Acinetobacter spp

1995-2002 (Edmond M.

SCOPE Project)

1.3%

Tehnici clasice microscopie, CHROM Agar, API, Vitek, Biolog

- costuri scazute - timp crescut de raspuns (48-72h)

Tehnici imunobiochimice- utilizeaza anticorpi specifici pentru (beta-glucan, D-arabinitol, manoza)

- relativ rapide - senzitivitate scazuta, specificitate scazuta

Tehnici moleculare- PCR, DNA microarray

- rapide, senzitive - costuri ridicate, dificil de izolat ADN-ul microbian

Metode de diagnostic

Dezvoltarea procesului infectios

- calea de patrundere a agentului patogen (rani deschise)

- gradul de virulenta al agentului patogen

-numarul initial de celule microbiene care patrund in organismul gazda

-statusul imunitar al gazdei

Afectiunile produse de specii apartinand genuluiCandida

Candidoza muco-cutanata

Onicomicoza

Candidoza orofaringiana

Candidoza vulvo-vaginala

Candidoza de scutec

Candidoza neonatala

Candidoza muco-cutanata

Zonele afectate: axilara, pliurile submamare, spatiile interdigitale, ombilicul.

Caracterizata prin: eritem bazal cu margini solzoase, leziunile sunt inconjurate de

eruptii gen pustule care se sparg si produc rani deschise.

Predispozitie crescuta:

- disfunctii metabolice (diabetici, alcoolici, supraponderali)

- persoane care lucreaza in medii cu risc crescut: spalatorii, pescarii, curatatorii

OnicomicozaInfectii ale unghiilor produse de specii din genul Candida in asociere cu o serie de fungi

(Trichophyton rubrum) determina peste 80% dintre onicomicoze.

Aspecte clinice: unghia devine galbena, alba sau maron inchis, ingrosata si sfarimicioasa in cazul

invadarii portiunii terminale a acesteia. In situatia in care invazia fungica se face direct prin

suprafata unghiei, pe aceasta apar la inceput pete albe (interpretate de multe ori ca lipsa de

calciu), ulterior prezentindu-se moale, cu aspect prafuit, dar fara a se ingrosa sau detasa de patul

unghial

Transmitere: infectiei fungica se transmite prin contact direct, sau prin folosirea in comun a

unor articole de imbracaminta si incaltaminte, obiecte folosite in igiena personala (unghiera,

forfecuta pentru unghii, pila pentru unghii, prosop), baile publice (dusumeaua, gratarul de lemn

din saune, bazine de inot).

Persoane predispuse: unghie incarnata, varsnicii.

Candidoza orofaringiana (bucala)

Candida sp. face parte din microbiota normala a orofaringelui aceasta devine patogena in

diferite cazuri: imunitate scazuta: bolnavi varstnici, diabetici, cu neoplasme, antibioterapie de

lunga durata, SIDA, alimentatia (deficiente nutritionale ale: riboflavinelor, folatilor, Fe.) insa

aceasta poate fi contactata si in urma consumarii unor alimente infestate.

Candida albicans este cea mai frecventa specie implicata in aparitia candidozei bucale poate fi si

asociata cu infectii bacteriene: streptococi, stafilococi, enterococi

Clinic, se prezinta sub forma unor depozite de culoare alba localizate la nivelul gurii si pe limba

cu aspect branzos tesutul din jurul acestor depozite devine rosu si dureros, persoanele afectate

prezinta o senzatie de arsura la nivelul gurii si a gatului.

La copii aceast afeciune este frecvent asociat cu defecte genetice i disfuncii ale glandelor

endocrine

Candidoza vulvo-vaginala

determinata de Candida albicans in proportie de 80% sau Candida glabrata,

krusei, inconspicua, parapsilosis.

Factorii interni care favorizeaza aparitia candidozei vulvovaginale sunt

reprezentati de:

- administrarea pe o perioada mai lunga a antibioticelor, contraceptivelor,

- sarcina,

- anumite boli endocrine

Poate fi transmisa direct in special prin contact sexual.

Aproximativ 75% din femei dezvolta infectia odata in viata si 4050% sunt

recurente.

Manifestari clinice: scurgeri albicoase, discomfort

Candidoza neonatala

Candidoza neonatal este transmis nou-nscutului

in timpul nasterii datorita tranzitarii tractului vaginal

i se constat prezena acesteia la 5% din nou-

nscui; apare de cele mai multe ori n cavitatea

bucal sau mai rar sub forma unei infecii a pielii n

jurul anusului i n jurul organelor genitale.

La nou-nascui , candidoza generalizata se dezvolt

doar n mod excepional n condiii de imunitate

precar. Infectarea copilului n timpul naterii, poate

duce la apariia candidozelor pulmonare, care i poate

produce moartea mai ales dac nou- nscutul este

nascut preamatur

Candidoza de scutec

Candidoza de scutec apare la puin timp de la natere i este

determinat de invadarea speciilor genului Candida datorit

umiditii crescute.

Acest lucru este posibil exclusiv din motive de igien, n mod

special prin neschimbarea scutecului bebeluului. Leziunile care se

dezvolta la nivelul tegumentelor acestuia sunt leziuni eritematoase

tip satelit (pustule satelit), cu eroziuni ale tegumentelor.

Mecanismele de virulenta ale speciilor din genul Candida

Aderena Colonizarea, Formarea de biofilm, Hidrofobicitatea

Dimorfismul celular (blastospori, pseudohife, hife)

Modificarea fenotipica

Producerea unor enzime extracelulare- proteinaze, fosfolipaze, lipaze, esteraze, DN-aze, metaloproteaze

Rezistenta la substante antifungice

Modificarea fenotipica

Etapele procesului infectios

Etape ale procesului infectios la C. albicans

Figura 1 Tesut inainte de infectie

Figura 3 Infectie profunda si diseminare

Figura 2 Infectie superficiala

Aderenta

Aderenta- fixarea celulelor microbiene la nivelul gazdei reprezinta o etapa

esentiala in dezvoltarea unui proces infectios

Adezinele Als, Ala si Hwp1 fac parte din grupul de proteine de la nivelul peretelui

celular glicozilfosfatidilinozitol dependente (acestea fiind reglate de factori

transcriptionali ca Bcr1, Tec1, Nrg1, Tup.

Adezinele se leaga la componente ale matricei extracelulare cum ar fi laminina,

fibronectina, mucina sau componente serice fibrinogen, C3b, C3d

Capacitatea de aderenta este dependenta de forma celulelor, astfel in stare

germinativa (hifa) aderenta este de 5 ori mai mare decat in faza de blastospori.

Factorii care contribuie la cresterea aderentei formelor hifale include schimbari

calitative ale adezinelor si exprimarea unor adezine specifice.

Testarea capacitatii de aderenta la substrat inert si la celule epiteliale

FORMAREA DE BIOFILME

Enzimele hidrolitice produse de speciile din genulCandida

Proteinaze

Fosfolipaze

Lipaze

Esteraze

Fosfataze

DN-aze

Rolul enzimelelor hidrolitice

Obtinerea de nutrienti

Distrugerea componentelor celulare (matrix extracelular,

membrana plamatica)

Inactivarea moleculelor implicate in apararea organismului gazda

Proteinazele produse de specii din genul Candida

Aspartil proteinaze

Serin proteinaze

Cistein proteinaze

Metalo proteinaze

Aspartil proteinazele

Codificate de gene SAP [SAP 1-10]

Proteinele Sap functie similara si cu proprietati diferite (masa molec., pH izoelectric)

Proteina matura dimensiuni 35-48kDa si contine doua regiuni conservate care interactionaza

extracelular iar 9 si 10 sunt ancorate de membrana prin GPI (glicozilfosfatidilinozitolul cu

resturile de acid aspartic)

Sap 1-8 secretate

Molecule scindate de aspartil proteinaze sunt:

- matrixul extracelular si prot. de supafata ex.: colagenul, laminina, fibronectina, mucina

sunt degradate cu o rata mai mare de Sap2.

-proteine ale gazdei implicate in aparare precum: lactoferina salivara, -macroglobulinele,

precursori ai factorilor de coagulare, macrofagele, majorit imunoglabulinelor inclusiv IgA care

e rezistent la majoritatea proteinazelor bateriene.

-componente cheie ale sitemului imunitar precum: citokinele proinflamatorii interleukina

1beta, lactoperoxidaze, catepsina D, comp. complement,

proteinele Saps au rol in mentinerea raspunsului inflamator la nivelul epiteliului in vivo.

Aspartil proteinazele sunt inhibate de pepstatin A, un hexapeptid izolat de la Streptomyces

Expresia genelor SAP

Reglajul SAP are loc la nivel transcriptional se sintetizeaza o prepropeptida care e cu

aprox 60 de aa mai mare decat enzima matura si este alcatuita din molecula semnal

si propeptida

Scindarea are loc la nivelul RE si este realizata de o proteinaza, dupa care este

transportata de o proteinaza Kex2-like iar capatul carboxil e procesat la nivelul AG

pentru a obtine enzima activa.

Exprimate constititiv: SAP9 si SAP10 sau inductibila genele SAP1-8

Expresia este influentata de:

pH (Sap 1 si 3 actioneaza la pH acid, iar Sap 2,4 si 6 sunt stabile la pH neutru)

temperatura (la 250 C, creste rata transcrierii genei SAP8 )

sursa de N, (albumina serica bovina SAP 2)

forma morfologica (SAP 4-6 exclusiv formele de hifa si SAP 1-3 secretate de formele

blastospori)

Evidenierea activitii proteinazelor

Fosfolipazele

Fosfolipaza A (hidrolizeaza leg. acil dintre esterii AG)

Fosfolipaza B (hidrolizeaza leg. acil din pozitia 1 si 2 de la nivelul glicerolului)

Fosfolipaza C (hidrolizeaza leg. fosfodiesterice de la nivelul scheletului fosfolipidic

producand 1,2- acil-lizofosfolipid sau 1-acil-lizofosfolipid)

Fosfolipaza D (scindeaza leg. fosfodiesterica obtinandu-se acid fosfatidic si colina sau

etanol amina

FOSFOLIPAZELE

Expresie ridicata in timpul invaziei datorita scindarii legaturilor esterice dintre

glierofosfolipidele membranei celulare;

Prezente si la alte microorganisme: Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, neoformans,

Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,

Mycobacterium tuberculosis, Toxoplasma gondii;

In ultimii ani au fost puse in evidenta si la alte specii din genul Candida precum:

glabrata, parapsilosis, tropicalis, krusei;

Doar cele din familia B sunt secretate in afara celulei, fosfolipaza PlB1 joaca un rol

important in procesul infectios;

Prima gene identificata a fost PLB1 care se afla pe cromozomul 6 si care prezinta o

omologie de secventa de 45% cu gena PLB1 de la S. cerevisiae.

Lipazele

Codificate de genele LIP 1-10

Actioneaza asupa gruparilor esterice de la niv mono- di- si tri-aciziglicerolilor pe care ii

scindeaza in glicerol si acizi grasi

Au fost evidentiate si la speciile: tropicalis, parapsilosis, krusei si glabrata

Lipazele contin secvente conservate (4 resturi de cisteina), un situs N-glicozilat si prezinta

acelasi grad de hidrofobicitate.

Stabilitate termica ridicata, rezistenta la solventi organici si la actiunea unor proteinaze

Rol: digestia lipidelor pt. acumulare de nutrienti, aderarea la cel gazdei, initierea

proceselor inflamatorii

Evidentiate prin cultivarea cu tween ca unica sursa de C

Expresia genelor LIP

Sunt reglate si exprimate diferit in functie de conditiile de crestere

Gena LP7 mai contine la capatul N-terminal o secventa semnal

Genele LIP3LIP6 au fost evidentiate in toate fazele de crestere.

Genele LIP1, LIP3-6 si LIP8 sunt exprimate atat in mediu cu Tween 40 ca unica sursa de C

dar si in mediu fara lipide

LIP1, LIP2, LIP3 si LIP9 au fost detectate in infectiile gastrice insa nu sunt exprimate in

infectiile mucoasei orale

Hemolizinele

Tulpinile de Candida prezinta hemoliza de tip a si b

Insuficiente date obtinute pana la ora actuala privind natura hemolizinelor,

hemoliza a fost asociata cu mai multi factori: prezenta unei mananproteine,

producerea de fosfolipaze, lipaze, proteinaze extracelulare

Expresia hemolizinelor este dependenta de forma celulara (unicelulara sau

hifala), de conditiile de mediu (sursa de carbon, temperatura)

Proteine de legare a Fe

Fe necesar in metabolismul celular al drojdiilor (functionarea unor enzime

implicate atat in procesele de respiratie cat si de aparare impotriva speciilor

reactive de oxigen)

In timpul infectiei cel de drojdii sunt supuse riscului actiunii sp. reactive de O2 care apartin sistemului de aparare al gazdei (catalaza, SOD, proteine de soc

termic)

Proteina Rbt5 este implicata in acumulare de Fe de la nivelul hemoglobinei

Proteina Als3 ancorata la nivelul peretelui celular are capacitatea de a lega Fe

DN-aze

Capacitatea unot tulpini patogene de a sintetiza DN-aze ajuta celula sa lupte impotriva Neutrophil extracellular traps (NETs) produse de leucocite

Inhibarea unor mecanisme de generare a speciilor reactive de oxigen in cazul neutrofilelor

Rezistenta la antibiotice

Inascuta - rezistena natural, nespecific, comun tuturor indivizilor unei specii, necondiinat de un contact anterior cu compusul antimicrobian

Dobandita apare in urma expuneriimicroorganismului la un compus inhibitor, si estedatorata unor modificari la nivel genetic (mutatii, achizitia de gene), persista in timp

Principalele tipuri de rezistenta

Neutralizarea antibioticului

Alterarea tintei de actiune a antibioticului

Scoaterea din celula a antibioticului

Modificarea permeabilitatii celulei microbiene

Principalele clase de antifungice

Polienele (amfotericina B, nistatinul, natamicinul, candicin etc.)

Azolii: imidazoli (ketoconazolul, clotrimazolul, miconazolul)

triazoli (fluconazol, voriconazol, posaconazol, itraconazol)

tiazoli (abafuginul)

Alilaminele (terbinafina, butenafina)

Morfolinele (amorolfina)

Echinocandinele (caspofungin, micafungin, anidulafungin)

Altele: 5-fluorocitozina, acidul benzoic

Reguli generale administrarea tratamentelorantifungice

identificarea patogenului

evitarea toxicitatii

asigurarea dozelor optime

monitorizarea complicatiilor

Determinarea sensibilitatii la diferite substanteantifungice

Testarea calitativ Testarea cantitativ

Fluconazolul

Timp de injumatatire: 30h

Metabolizat de ficat 12%

Excretat- renal 61-88%

Utilizat in: infectii interne Cryptococcus (meningitei criprococica)

Infectii ale cavitatii bucale si esofagului, tegumentului, septicemie,

cailor urinare si vaginale produse de Candida sp.

Toxicitate: scazuta

Celulele de C. albicans sensibile la azoli

Fluconazolul actioneaza asupra enzimei lanosterol-14-demetilaza impiedicand formarea

ergosterolului si astfel sunt acumulati compusi toxici in organism

Mecanismul de actiune

Fluconazolul actioneaza asupra enzimei lanosterol-14-demetilaza impiedicand formarea

ergosterolului si astfel sunt acumulati compusi toxici in organism

Modificarile la nivel molecular a tulpinilor de C. albicans rezistente la fluconazol

Supraexprimarea genei ERG11 si producerea in canditati mai mari a enzimei lanosterol 14 demetilaza

Mutatie punctiforma la nivelul genei ERG11 care determina modificarea structurii enzimei lanosterol 14 demetilaza

Alterarea genelor ERG3 si ERG5 si producerea de steroli cu afinitate scazuta

Supraexprimarea pompelor de efulx CDR sau MDR care ajuta la eliminarea fluconazolului din celula

Echinocandinele

Tratarea sp. Candida (rezist. la triazoli), actiune fungistatica asupra speciilor

Aspergillus

Caspofungina tratarea candidemiei, candidozei esofagiene, neutropeniei febrile

Micafunginul- transplant de cel stem hematopoetice, candidoze esofagiene

Anidulafunginul- Food and Drug Administration n februarie 2006

Puncte tari

Toxicitate relativ scazuta

Grad de interactiune cu alte medicamente redus

Puncte slabe

Costul de productie ridicat

Alilaminele

Clorhidratul de butenafina i terbinafina au fost introduse in 1993, n Japonia.

Terbinafina actioneaza asupra: unei game largi de dermatofiti, fungi si drojdii

din genul Candida sp.

Terbinafina (administrata pe cale orala) este utilizata in tratarea

onicomicozelor, este bine tolerata de organismul uman si prezinta relativ un

grad scazut de interactiune cu celelalte medicamente. Este considerat ca

facand parte din prima linie de tratament alaturi de itraconazol in cazul

micozelor cutanate negeneralizate (restranse)

Amfotericina B

Sintetizat in 1957

Timp de injumatatire: prima faza-24h, a doua faza-15 zile

Excretat: renal si biliar

Amphotericin B este produsa de Streptomyces nodosus.

Spectru larg de actiune: Candida, Aspergillus, Trichosporon beigelii, Fusarium.

Nefrotoxicitate ridicata

Pt scaderea toxicitatii s-a adaugat o coada lipidica pt a impiedica legarea de

colesterol (scadere cu 45-75%)

Mecanismul de actiune al amfotericinei B

Mecanismul de rezistenta la amfotericina Bdezvoltat de C. albicans

Scaderea concentratiei de ergosterol de la nivelul membranei plasmatice (in

urma aparitei unei mutatii la nivelul unor enzime implicate in biosinteza

ergosterolului )

Cele mai frecvente mutatii apar la nivelul genelor care codifica pentru

enzimele implicate in ultimele etape ale sintezei ergosterolului. Mutatiile

conduc la o scadere a sensibilitatii la poliene fara o destabilizare a membranei

celuare.

Directii de cercetare

Descoperirea unor metode rapide de identificare si detectare a

tulpinilor de Candida patogene

Gasirea unor noi compusi cu actiune antifungica

Intelegerea mecanismelor moleculare implicate in

patogenitate

Metode de control a tulpinilor patogene de la nivel clinic