Home >Documents >116116170 Cap6 Ing Gen Drojdii

116116170 Cap6 Ing Gen Drojdii

Date post:21-Jan-2016
Category:
View:88 times
Download:7 times
Share this document with a friend
Transcript:
  • Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

    1

    C A P. 6. T E H N I C I d e I N G I N E R I E G E N E T I C l a D R O J D I I

    Drojdiile prezint numeroase avantaje care le recomand ca model experimental n ingineria genetica i biotehnologie. n primul rnd, levurile prezint un timp scurt de multiplicare i apariie a unei noi generaii, de aproximativ 2 ore, ceea ce permite obinerea a mii de colonii de drojdii , n numai 2 zile, prin cultivare pe plci Petri, pe un mediu relativ simplu. n al doilea rnd, genomul de S. cerevisiae are dimensiuni relativ reduse (1,4 x 107 pb) fa de cel mamalian (3,5 x 109 pb), ceea ce simplific analizele genetice i moleculare. n al treilea rnd, drojdiile reprezint un material optim pentru analizele genetice deoarece pot fi meninute att n stadiu haploid ct i n stadiu diploid. Astfel, mutaiile genetice recesive pot fi relativ uor obinute i exprimate n celulele haploide, iar complementaia genetic poate fi realizat prin simpla mperechere a dou mutante haploide.

    Ingineria genetic la drojdii, ca de altfel i la alte organisme, cuprinde 2 tehnologii: tehnologia ADN recombinant - inginerie genetic molecular i fuziunea de protoplati inginerie genetic celular.

    Primele experimente de inginerie genetic molecular (transformare genetic) cu drojdii au fost realizate de Hinnen i Beggs (1978) care au demonstrat posibilitatea clonrii i exprimrii genelor heterologe n celula de Saccharomyces cerevisiae. Pn n prezent au fost construii numeroi vectori att pentru tulpinile de drojdii de laborator, avnd o aplicabilitate mai mult teoretic, ct i pentru tulpinile de drojdii industriale n scopul ameliorrii productivitii acestora.

    Vectori, markeri genetici si procedee de transformare genetica Vectorii utilizabili la drojdii pot fi clasificai n funcie de posibilitatea de clonare i / sau

    exprimare a genelor heterologe n: vectori de clonare care permit numai clonarea fragmentelor de ADN heterolog; vectori de exprimare care permit exprimarea prin transcrierea ADN heterolog clonat

    datorit prezenei unor promotori foarte puternici constitutivi, inductibli sau hibrizi; vectori de secreie care permit secreia produilor genelor clonate datorit prezenei unor

    peptide semnal, reprezentate, de regul, prin peptida semnal a precursorului factorilor de mperechere a sau i cea a factorului killer.

    Toate aceste tipuri de vectori prezint, n comun, ca baz de construcie, un fragment dintr-un vector pentru celule bacteriene (pBR322, pUC118/119, pUC18/19, pBluescript SK/KS +/-). Acest fragment asigur o origine de replicare pentru amplificarea vectorului n celula bacterian, o gen de selecie a transformanilor n populaia bacterian (gena pentru rezisten la ampicilin este cel mai des ntlnit) i, n unele cazuri, origini de replicare caracteristice fagilor filamentoi care permit obinerea de ADN monocatenar i casete care fac posibil transcrierea in vitro a fragmentului clonat (pentru vectori bazai pe fagimidul pBluescript SK/KS +/-).

    Toi vectorii utilizabili n drojdii prezint i markerii genetici selectabili n celula de drojdie. Acestea sunt gene ce codific enzime implicate n cile metabolice ale unor amionoacizi sau nucleotide (Tab.1). Primul marker genetic de acest tip a fost gena LEU 2 care codific pentru -izopropilmalat dehidrogenaza i care este capabil s complementeze mutaia leuB de la Escherichia coli, mutaie care se exprim prin deficien n aceeai enzim a celulelor bacteriene.

    Tab.1 Markeri selectabili utilizai pentru drojdii

    Gena Enzima Selectia HIS3 imidazol glicerofosfat dehidrogenaza histidina LEU2 -izopropilmalat dehidrogenaza leucina LYS2 -aminoadipat reductaza lizina TRP1 N -5fosforibozil-antranilat izomeraza triptofan URA3 Orotidin-5-fosfat decarboxilaza uracil

    Principalele clase de vectori de clonare: n funcie de stabilitate i modul de transmitere n descenden n celulele de levuri, se pot

    defini dou clase majore de vectori de clonare (Fig.6. 1): - vectori integrativi; - vectori cu replicare autonom.

  • Cap.6 Tehnici de Inginerie Genetic la Drojdii

    ADN de drojdie

    LEU2

    ADN de drojdie

    ARS

    ADN de drojdie

    LEU2

    2

    CEN

    ARS

    LEU2

    ADN de drojdie

    Fragmentdin plasmida 2 m

    LEU2

    pBR322

    pBR322pBR322pBR322

    Vector integrativ (YIp)

    Vector replicativ (YRp) Vector centromeric (YCp) Vector episomal (YEp) Fig. 6. 1. Principalele clase de vectori de clonare pentru drojdii.

    pBR322 - secven provenit din plasmidul pBR322; conine gene pentru rezisten la antibiotice (ampicilin i/sau tetraciclin) i oriColE1 (pentru replicare autonom n celula bacterian);

    LEU2 - gena pentru prototrofie la leucin; ADN drojdie - secven din genomul de drojdie; ARS - secvena ARS cromosomal sau din plasmida 2 m (pentru replicare autonom n drojdii); CEN -

    secven centromeric dintr-un cromosom de drojdie; secven extins din plasmida 2 m care conine secvena ARS, REP1, REP2, REP3 (STB ) i, de cele mai

    multe ori, FLP. Vectori de clonare A. Vectorii integrativi (YIp = Yeast Integrating plasmids) conin markeri selectabili pentru drojdii, dar nu prezint secvene care s permit replicarea autonom a vectorilor n celula de drojdie. Transformarea celulei de drojdie are loc n urma unui proces de integrare al plasmidei n genomul drojdiei prin recombinare omoloag ntre o secven din cadrul plasmidei i regiunea corespunztoare de la nivelul unuia dintre cromozomii drojdiei. Eficiena transformrii cu vectorii YIp este de numai 1 10 transformanig ADN.

    n Fig. 6. 2 este reprezentat un vector din aceasta clas - YIp 5. Vectorul prezint: - genele de rezisten la ampicilin i tetraciclin (ApR, TcR) care permit selecia transformanilor (ampicilin rezisteni- tetraciclin sensibili); - originea replicrii din plasmidul ColE1 (oriColE1) confer capacitate de replicare autonom n celula bacterian; - tulpinile de drojdie receptor sunt auxotrofe pentru uracil (ura3). Transformarea celulelor de drojdie are loc prin integrarea vectorului la nivelul secvenei URA3 la locusul de omologie din cromosomul de drojdie, celulele transformate revenind la starea de prototrofie pentru uracil.

    ApR

    oriColE1

    URA3

    TcR

    YIp 55.5 kb

    ApR

    oriColE1

    URA3

    TcR

    YIp 55.5 kb

    Fig. 6. 2. Vectorul integrativ YIp 5

  • Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

    B. Vectorii cu replicare autonom: - replicativi (YRp = Yeast Replicating plasmids) - centromerici (YCp = Yeast Centromeric plasmids) - episomali (YEp = Yeast Episomal plasmids) - lineari (YLp = Yeast Linear plasmids)

    conin markeri selectabili n celula de drojdie i, spre deosebire de vectorii integrativi, pe lng secvenele care le permit replicarea autonom n celula bacterian mai prezint i secvene ce confer capacitatea de replicare autonom n celula de drojdie de unde i denumirea de vectori navet sau shuttle.

    Vectorii replicativi (YRp) prezeni n numar de 1 10 copii/celul, conin secvena ARS (autonomously replicating sequence) de la nivelul plasmidei 2 m sau dintr-un cromosom de drojdie, se replic autonom fa de ADN-ul cromosomial al drojdiilor, numai o dat pe parcursul unui ciclu celular. Acest tip de vectori prezint un grad destul de mare de instabilitate mitotica i meiotica astfel nct vor fi prezeni n numai aproximativ 5% - 10% dintre descendeni dup circa 10 generaii. Eficiena transformrii cu vectori YRp este de 103 104 transformani/g ADN.

    Vectorii centromerici (YCp) prezeni n 1 2 copii/celul, au fost obinui din plasmidele YRp prin ncorporarea unei secvene centromerice CEN dintr-un cromozom de drojdie (de exemplu: CEN IV) pentru a mri stabilitatea mitotica i meiotica a acestora. Ca urmare, rata de pierdere a plasmidelor este de numai 1% / generaie.

    Fig. 6. 3 reprezint schema general de construcie a unui vector centromeric din seria pRS 413 - 414 - 415 - 416. Vectorul este constituit dintr-o regiune care provine din fagimidul pBluescript SK +/- i o regiune originar din drojdii. I - din fagimidul pBluescript SK +/- se pstreaz:

    - oriColE1 - permite replicarea autonom n celula bacterian (n lipsa unui fag helper pentru f1), permind meninerea vectorului n forma ADN CCC;

    - gena ApR - confer rezisten la ampicilin celulelor bacteriene purttoare a vectorului; - ori f1 - originea replicrii fagului filamentos f1; prin co-infecia celulei bacteriene gazd cu un

    virus helper pentru f1 se declaneaz replicarea ADN de la ori f1 cu obinerea ADN monocatenar sens sau antisens n funcie de orientarea ori f1 (+ sau -);

    - lac Z - gena care codific pentru captul amino-terminal al galactozidazei; aceast regiune permite, prin complementaie intraalelic, selecia histochimic a vectorilor recombinani (purttori de ADN exogen la nivelul MCS). Prezena unui promotor inductibil upstream de gena lac Z permite obinerea de proteine de fuziune; II - din drojdii: - gena URA3 ( HIS3/ LEU2/ TRP1) confer prototrofie celulelor de drojdie transformante; - caseta ARS/CEN - permite replicarea autonom i asigur stabilitatea mitotic a vectorilor n descenden.

    ApR

    oriColE1

    URA3

    ori f1 (+)

    ori f1 (-)

    lac Z

    MCS

    BssHII

    BssHII

    T3

    T7Sac I

    Kpn I

    ARS CEN

    Fig. 6. 3. Schema general de construcie a vectorilor centromerici din seria pRS 413 - 414 - 415 - 416

    3

  • Cap.6 Tehnici de Inginerie Genetic la Drojdii

    O variant a vectorilor centromerici o reprezint vectorii de tip YAC (Yeast Artificial Chromosomes) care conin n plus secvene telomerice de drojdie. Acestea le pemite YAC-urilor s se replice asemenea cromosomilor lineari. Dei YAC-urile nu sunt folosite n acelai tip de experimente de clonare ca celelalte categorii de ve

Click here to load reader

Reader Image
Embed Size (px)
Recommended