Teste imunologice în laboratorul clinic Reacţia antigen-anticorp A. Reacţii imnochimice folosite în laboratorul clinic 1. Reacţia de precipitare a) Reacţia de precipitare în mediul solid - Difuzia în gel - Imunodifuzia radială simplă - Dubla difuzie în gel - Difuzia combinată cu migrarea electroforetică - Imunoelectroforeza - Contraimunelectroforeza - Electroimunodifuzia - Imunofixarea b) Reacţia de precipitare în mediul lichid - Reacţia de precipitare în inel - Imunonefelometria 2. Reacţia de aglutinare a) Reacţia de aglutinare directă b) Reacţia de aglutinare indirectă c) Reacţia de inhibare a aglutinării d) Reacţia de aglutinare mediată de anticorpi anti-imunoglobuline 3. Reacţia de neutralizare 4. Reacţii ce utilizează complement a) Reacţia de fixare a complementului b) Testul de imunohemoliză pasivă în prezenţa complementului c) Determinarea imunohemolitică a complementului 5. Reacţii cu reactivi marcaţi a) Reacţia de imunofluorescenţă - Reacţia de imunofluorescenţă directă - Reacţia de imunofluorescenţă indirectă - Reacţia de imunofluorescenţă cu fixarea complementului b) Analiza radioimunologică c) Analiza imunoenzimatică -Tehnica ELISA
Transcript
Teste imunologice în laboratorul clinicReacţia antigen-anticorpA. Reacţii imnochimice folosite în laboratorul clinic
1. Reacţia de precipitarea) Reacţia de precipitare în mediul solid
- Difuzia în gel - Imunodifuzia radială simplă- Dubla difuzie în gel- Difuzia combinată cu migrarea electroforetică- Imunoelectroforeza- Contraimunelectroforeza- Electroimunodifuzia- Imunofixarea
b) Reacţia de precipitare în mediul lichid- Reacţia de precipitare în inel- Imunonefelometria
2. Reacţia de aglutinare a) Reacţia de aglutinare directăb) Reacţia de aglutinare indirectăc) Reacţia de inhibare a aglutinăriid) Reacţia de aglutinare mediată de anticorpi anti-imunoglobuline
3. Reacţia de neutralizare4. Reacţii ce utilizează complement
a) Reacţia de fixare a complementuluib) Testul de imunohemoliză pasivă în prezenţa complementuluic) Determinarea imunohemolitică a complementului
5. Reacţii cu reactivi marcaţia) Reacţia de imunofluorescenţă
- Reacţia de imunofluorescenţă directă- Reacţia de imunofluorescenţă indirectă- Reacţia de imunofluorescenţă cu fixarea complementului
b) Analiza radioimunologicăc) Analiza imunoenzimatică
-Tehnica ELISA6. Tehnica Western Blot
B. Metode şi tehnici de imunocitologie1. Tehnica pentru celule lupice 2. Testul reducerii NBT3. Chemiluminiscenţa4. Testul inhibiţiei aderenţei leucocitelor5. Imunofenotiparea cu ajutorul citometriei în flux6. Testul de transformare blastică a limfocitelor 7. Reacţia de limfocitotoxicitate
C. Principalele reacţii antigen-anticorp şi aplicaţiile acestora
Teste imunologice în laboratorul clinic
Imunologia clinică foloseşte numeroase tehnici pentru studiul proteinelor care mediază imunitatea umorală, ca şi pentru studiul celulelor care uau parte la imunitatea celulară
Analiza imunologică este considerată ca una dintre cele mai de vârf tehnici din domeniul biomedical. Fiind foarte costisitoare, aceasta a pătruns cu dificultate în laboratoarele clinice.
Complexitatea şi evoluţia rapidă a acestor tehnici au făcut necesară conturarea unui departament specializat în cadrul laboratorului clinic, care se ocupă cu metodele imunologice de diagnostic (imunodiagnostic). Domeniile mai nou dezvoltate sau în curs de dezvoltare în laboratoarele clinice cuprind: imunochimia, imunocitologia, histocompatibilitatea, radioimunoanaliza, enzimimunoanaliza.
Imunitatea celulară se studiază printr-o serie de teste de imunocitologie.Metodele de imunochimie aduc informaţii asupra unor proteine din sânge şi alte
lichide biologice. De obicei se folosesc antigenul (Ag) necunoscut şi reactivul, anticorpul (Ac) cunoscut.
Metodele de analiză imunochimică cuprind operaţiile de obţinere şi purificare a Ag şi Ac şi de măsurare a reacţiilor dintre acestea. Măsurarea reacţiei Ag-Ac permite atât estimarea cantitativă a Ag cât şi caracterizarea acestuia sub aspect imunochimic. Metodele cele mai utilizate în analiza imunochimică se bazează pe reacţia Ag-Ac
Reacţia dintre un Ag şi un Ac presupune legarea grupării determinante a Ag (epitop) de situsul de combinare al Ac (paratop). Legarea este dependentă de complementaritatea sterică a Ag şi Ac şi se realizează cu participarea unor forţe de legătură necovalente (forţe van der Waals, forţe electrostatice, legături de hidrogen şi legături hidrofobe) care asigură stabilitatea complexului Ag-Ac.
Caracteristica generală a reacţiei Ag-Ac este specificitatea, adică capacitatea ac de a discrimina Ag omolog de alt Ag. Specificitatea ag nu este absolută. Reacţia încrucişată are loc când un ag reacţionează cu un Ac format faţă de un alt Ag. Ag care reacţionează cu un Ac produs faţă de un alt Ag se numeşte Ag cross-reactiv sau Ag cu reactivitate încrucişată. Reacţia încrucişată a Ag este datorată faptului că Ag posedă în comun anumite grupări determinante, fie că între grupările determinante există o asemănare chimică ce nu poate fi decelată de Ac.
Reacţiile încricişate de tip I. Capacitatea a două Ag de a reacţiona cu acelaşi situs de combinare de pe aceeaşi moleculă de Ac (ex. Ag proteice ce dau reacţii încrucişate din cauza diferenţei foarte mici a secvenţei de aminoacizi glicina nu poate fi deosebită de alanină)
Reacţiile încricişate de tip II. Capacitatea unui Ag de a reacţiona cu o subpopulaţie de Ac dintr-un ser heterolog care conţine Ac faţă de un alt Ag parţial asemănător cu primul
Reacţia Ag-Ac se desfăşoară în unul sau mai multe stadii: - interacţiunea primară se datoreşte legării efective a ac cu ag şi depinde de
cantitatea şi afinitatea Ac. Tehnicile care evidenţiază interacţiunea primară ag-ac sunt tehnici curente de diagnostic (ex. nefelometria). In vivo, interacţiunile primare participă la protecţia gazdei (neutralizarea toxinelor, inhibarea acţiunii unor virusuri sau bacterii) sau la declanşarea unor reacţii anafilactice
- interacţiunea secundară urmează celei primare (după aprox. 30 min.). Produsul final este complexul ag-Ac insolubil. Interacţiunea secundară stă la baza tehnicilor imunochimice (reacţiile de precipitare aglutinare, fixare de complement, neutralizare).
- interacţiunea terţiară prezintă o complexitate mai mare decât cea secundară. Depinde de variabilele gatdei (receptori pentru Ag, complement, mastocite). Pot determina protecţia gazdei (neutralizarea virusurilor, imobilzarea bacteriilor) sau degranularea celulelor (fenomenul Arthus, şocul anafilactic)
Reacţia antigen-anticorp
Imunochimia disciplină de graniţă a imunologiei şi biochimiei studiază substanţele şi procesele chimice ce participă la reacţiile imunologice.
Metodele cele mai utilizate în analiza imunochimică se bazează pe reacţia Ag-Ac, utilizînd procedee care rezultă din îmbinarea tehnicilor fizico-chimice cu cele imunologice, primele conferind analizei precizie şi acurateţe, iar ultimele asigurând sensibiliate şi specficitate.
Datele furnizate de metodele imunochimice (calitative sau cantitative) pot conduce uneori la informaţii preţioase pentru diagnostic, adesea rezultatul de laborator capaătă valoarea informativă reală numai dacă interpretarea acestuia se face în contextul clinic.
1. Reacţia antigen-anticorp (Ag-Ac) are o mare putere de rezoluţie. În fapt, prepararea anticorpilor prin imunizarea repetată a unui animal (iepure, şoarece, capră, etc…) cu un antigen dat conduce în general la obţinerea anticorpilor puternici şi specifici, adică capabili să recunoască selectiv antigenul în prezenţa numeroaselor substanţe, astfel prin reacţia Ag-Ac, să detectăm şi să dozăm selectiv în ser o proteină (hormon, enzimă, etc.) prezentă la o concentraţie de câteva picograme/ml, ceea ce reprezintă mai puţin de o miliardime din conţinutul proteic al serului. Această caracteristică cu rezoluţie crescută ţine de energia crescută a reacţiei Ag-Ac (reacţie sigur non-covalentă dar datorată unei adăugări de numeroase legături unitare ca legături electrostatice, punţi de hidrogen, interacţii hidrofobe) şi altor forme reduse (complementaritate între structura epitopului Ag şi aceea a situsului Ac).
2. Selectivitatea fiecărei reacţii nu este absolută. Aceasta admite o anumită degenerescenţă: un Ac dat poate recunoaşte mai multe Ag puţin diferite cu preţul unei diminuări a energiei de legare. În practică, acest fenomen fundamental este descris prin observarea reacţiei “încrucişate” dintre diferite substanţe faţă de acelaşi Ac. Înaintea oricărei aplicaţii a reacţiei Ag-Ac trebuie să ne asigurăm de specificitatea funcţiei verificând că în condiţiile de utilizare, singurul Ag vizat este semnificativ recunoscut.
3. Reacţia Ag-Ac prezintă un domeniu de aplicare extrem de larg:- detectarea antigenelor sau anticorpilor: se poate aplica la dozarea
medicamentelor, hormonilor peptidici, antigenelor virale sau bacteriene şi chiar Ac când, de exemplu, se poate explora răspunsul individului la un element patogen (serodiagnostic)
- evaluarea cantitativă a Ag şi Ac: reacţia Ag-Ac este de fapt adaptabilă la dozarea proteinelor plasmatice foarte reprezentate (imunoglobuline, transferina, etc.), de asemenea, pentru substanţe foarte rare (anumiţi markeri virali, hormoni, etc.). Concentraţiile fiind între 10-4 şi 10-12 M).
4. Reacţia Ag-Ac necesită obţinerea unui semnal secundar pentru a fi detectabilă. Aceasta poate să se formeze în timpul reacţiei (ex. hemaglutinarea), fie să fie preformată prin marcarea prealabilă a Ag sau Ac prin markeri radioactivi, enzimatici sau alţii. Reacţiile din prima categorie fac în general apel la formarea unei reţele Ag-Ac de dimensiune mare, prin prezenţa de cel puţin două situsuri Ac pe imunoglobulină şi de cel puţin doi epitopi pe Ag. Această reţea se traduce prin aglutinare (eritrocitele acoperă Ag) sau prin precipitarea (cazul antigenului macromolecular care formează o reţea cu Ac).
Reacţiile din a doua categorie se subdivid în două subtipuri:- Reacţii prin competiţie: o cantitate limitată de unul sau doi compuşi
(ex.: Ac) este pusă în prezenţa eşantionului de dozat şi o cantitate minimă de element marcat (ex.. Ag radioactiv). Concentraţia de Ag din eşantion va influenţa negativ valoarea de legare a Ag marcat cu Ac (prin efect de competiţie pentru o cantitate limitată de situsuri). Antigenul marcat fiind singurul decelabil (în contorul de radioactivitate), nivelul său de legare va servi la stabilirea etalonajului reacţiei (ex.: dozarea de medicamente).
- Reacţiile prin imunoextracţie: reactivii (ex. Ac) sunt din contră în exces şi capteză în totalitate substanţa de dozare. Cazul clasic este dozarea “în sandwich” unde antigenul de dozat este fixat prin doi Ac care servesc la insolubilizarea pe o suprafaţă (peretele eprubetei) şi altul aduce semnalul detectabil (Ac marcaţi prin izotop sau o enzimă). În acest caz, semnalul va fi funcţionarea directă a concentraţiei de Ag şi acesta este Ac marcat vcare permite etalonarea; Tehnicile de imunofluorescenţă pe cupe sunt un alt exemplu de imunoextragere: antigenul (parazit, bacterie, virus) prezent în preparatul etalat pe lamă este recunoscut de Ac marcat (produs fluorescent). Spălarea rapidă permite să eliminăm Ac în exces (nefixaţi) apoi fixarea este relevată la microscopul cu fluorescenţă pentru diagnosticul direct.
Numeroase tehnici utilizate în imunologie sunt asemănătoare celor din ştiinţele biologice (ex: metodele de izolare a antigenelor şi anticorpilor sunt asemănătoare cu cele din biochimie utilizate pentru separarea fracţiunilor proteice). Totuşi, în imunologie se utilizează şi tehnici proprii, cum sunt reacţiile Ag-Ac (ex: tehnicile de imunofluorescenţă, imunodifuzie în gel, radioimunologice şi imunoenzimatice).
În funcţie de natura Ag şi de metodele aplicate pentru evidenţierea reacţiei Ag-Ac, acestea se pot împărţi în reacţii de precipitare, aglutinare, neuralizare, reacţii care folosesc complement sau reactivi marcaţi (fluorocromi, izotopi, enzime).
A. Reacţii imnochimice folosite în laboratorul clinic
Reactivii imunochimici sunt produse biologice (Ac, Ag, C, hematii), ce se utilizează pentru determinări calitative sau/şi cantitative de Ag sau Ac.
Pentru a furniza informaţii corecte, reactivii imunochimici trebuie folosiţi conform instrucţiunilor de utilizare. Persoanele care execută tehnici imunochimice trebuie să verifice în permanenţă instrucţiunile de utilizare a produselor, încât permanenta optimizare a acestora se reflectă şi în modificarea instrucţiunilor respective.
Manipularea reactivilor imunochimici trebuie făcută ţinând cont de toate normele de protecţia muncii în vigoare)
1. Reacţia de precipitare
În cazul reacţiei de precipiatere, Ag este o macromoleculă solubilă. Reacţia de precipitare poate avea loc în mediul solid (difuzia în gel) sau în mediul lichid.
Formarea precipiatului depinde de: cantitatea şi concentraţia Ag, calitatea şi concentraţia Ac, temperatura, molaritatea, pH-ul, volumul de reacţie, conţinutul în lipide al antiserului, etc.
Compoziţia precipitatului imun, proporţia de combinare a Ag cu Ac sunt variabile în funcţie de zona în care a avut loc precipitarea: exces de Ag, echivalenţă sau exces de Ac.
a) Reacţia de precipitare în mediul solid
Difuzia în gel
Difuziile în gel se grupează în trei categorii: difuzia simplă, difuzia dublă, difuzia combinată cu migrarea în câmp electric.
Se utilizează gel de agar sau agaroză în concentraţie de 0,8-1,6 g % (conţinutul mare de apă permite moleculelor de Ag şi Ac să migreze liber în gel). Difuzia poate fi accelerată de aplicarea unui câmp electric (contraimunoelecroforeză).
În cazul dublei difuzii, are loc difuzia ambilor reactanţi. În acazul difuziei simple are loc difuzia unuia către celălalt reactant înglobat în faza solidă. Într-o zonă relativ îngustă se creează datorită gradientului de concentraţie condiţii optime pentru imunoprecipitare. În gelul transparent apar linii sau zone opace. Liniile se pot deplasa până când se ajunge la echilibrul sistemului ag-Ac. Nivelul liniilor corespunde numărului minim de sisteme Ag-Ac.
Imunodifuzia radială simplă
Imunodifuzia radială simplă sau imunodifuzia simplă bidimensională a fost imaginată de Mancini, Carbonara şi Heremans în 1965.
Această metodă presupune difuzia unui reactant (în faza lichidă) într-un gel în care este înglobat celălalt reactant. În această tehnică Ac trebuie să fie în stare pură.
Dimensiunea haloului de precipitare este direct proporţională cu concentraţia Ag ce difuzează şi invers proporţională cu concentraţia şi înălţimea de gel în care sunt înglobaţi.
Existenţa unei proporţionalităţi directe între concentraţia Ag şi diametrul zonei de precipitare pentru difuzia completă Mancini permite trasarea curbei etalon prin măsurarea diametrelor de precipitare a cel puţin trei concentraţii ale unui Ag de referinţă.
Pentru obţinerea unei dimensiuni convenabile a zonei de precipiatre şi un contur bine delimitat, concentraţia Ac înglobat în gel trebuie aleasă în funcţie de titrul antiserului şi concentraţia Ag testat.
Cantitatea de Ag introdusă în godeuri nu trebuie să depăşească capaciatea de legare a Ac înglobat.
Timpul necesar difuziei complete este în funcţie de temperatura la care are loc reacţia (370C), de greutatea moleculară şi concentraţia Ag.
Imunodifuzia radială simplă efectuată în condiţii optime prezintă coeficientul de variaţie sub 10%, iar sensibilitatea este de 2 g/ml.
Concentraţia Ag (proteinei) se stabileşte în funcţie de curba etalon trasată cu trei diluţii ale serului dereferinţă. Rezultatele metodei se exprimă în mg/dl.
Aplicaţii posibile sunt determinările cantitative pentru: imunoglobuline (IgG, IgA, IgM), complement (C3), alfa-1 antitripsină, siderofilină, proteina C-reactivă (CRP), etc.
Dubla difuzie Ouchterlony
Dubla difuzie a fost imaginată de Ouchterlony şi Elek în 1948. Tehnica se poate efectua în mai multe variate. În laboratorul clinic se foloseşte
tehnica cu 4-6 godeuri rotunde dispuse în jurul unui godeu central. Liniile de precipitare se formează la distanţe constante pentru fiecare sistem Ag-
Ac. Se descriu trei tipuri de reacţii:- reacţia de identitate completă în care cele două Ag sunt complet identice:
antiserul conţine Ac specifici faţă de Ag; liniile de precipitare deviază şi fuzionează complet în zona centrală
- reacţia de neidentitate, absenţa deviaţiei liniilor. Antiserul conţine Ac diferiţi faţă de cele două Ag neînrudite, liniile de precipiatre se intersectează
- reacţia de identitate parţială (fuziune parţială a liniilor). Cele două Ag prezintă un număr de grupări determinante comune, dar conţin şi unele distincte; antiserul are Ac faţă de cele două grupări Ag; linia de precipitare este curbată ca urmare a fuziunii parţiale a celor două linii şi prezintă un mic pinten.
Aplicaţii posibile sunt determinările calitative pentru: proteinele Bence-Jones tip kappa şi lambda, crioglobuline.
Difuzia combinată cu migrarea electroforetică
Mobilitatea proteinelor în gelul supus câmpului electric se datoreşte încărcării electrice a proteinelor şi curentului electroendosmotic (migrarea tamponului spre catod).
La pH-ul la care se efectuează electroforeza (EF), agarul se încarcă negativ, tamponul din porii acestuia se încarcă pozitiv şi la aplicarea câmpului electric migrează spre catod. Deplasarea tamponului este inversă mişcării proteinelor, care la pH-ul neutru sau alcalin migrează spre anod (+).
Dacă electroendosmoza este mai mare decât viteza de deplasare a proteinelor spre anod, acestea vor fi deplasate spre catod (-), deşi sunt încărcate tot negativ (ex. gamma globulinele se deplasează catodic la imunoelctroforeză şi contraimunoelectroforeză).
Viteza fluxului osmotic este direct proporţională cu diferenţa de potenţial şi concentraţia gelului şi invers proporţională cu forţa ionică a tamponului.
Viteza curentului electroendosmotic este de trei ori mai scăzută în gelul de garoză comparativ cu cel de agar, probele trebuie analizate, nu trebuie plasate la mijlocul lamei aşa cum se procedează în cazul gelului de agar.
Imaginile de electroforeză se citesc cu ochiul liber (intensitatea spoturilor migrării), către anod a albuminei; către catod alfa, beta, gama globulinele.
Imunoelectroforeza
Metoda a fost imaginată de Grabar şi Williams în 1953. Transformarea într-o microvariantă executată pe lame de microscop se datoreşte lui Scheidegge în 1955.
Imunoelectroforeza reprezintă asocierea electroforezei cu dubla difuzie. În prima etapă are loc electroforeza proteinelor, urmată de dubla difuzie cu un antiser corespunzător. Reacţia Ag-Ac se vizualizează prin linii de precipitare corespunzătoare sistemelor Ag-Ac din reacţie.
Imunoelectroforeza (IEF) oferă numai informaţii calitative în diagnosticul gamapatiilor monoclonale. Metoda ilustrază în cazul componentei monoclonale a Ig, clasa şi tipul de Ig patologice.
Metoda se foloseşte pentru studiul purităţii unui Ag sau Ac. Imunoelectroforeza bidimensională cantitativă a fost imaginată de Ressler (1960), Laurell (1965), Clarke şi Freeman (1968). Metoda combină EF în gel de agaroză cu imunodifuzia.
Contraimunelectroforeza
Metoda a fost imaginată de Bussard (1959), CIEF reprezintă o dublă difuzie în care deplasarea Ag şi Ac este accelerată de un câmp electric.
În gelul de agar sau agaroză la pH 8,2-8,6 Ac se deplasează spre catod (-), Ag migrează către anod (+).
Reacţia este mai sensibilă şi mai rapidă decât dubla difuzie. CIEF oferă informaţii calitative şi semicantitative.
Electroimunodifuzia
EID a fost imaginată de Laurell (1965). Se realizează prin electroforeza Ag în strat de gel ce conţine Ac monospecifici.
Preciptatul Ag-Ac apare sub formă de rachete (conuri) a căror înălţime ste direct proporţională cu concentraţia Ag şi invers proporţională cu cea a Ac.
Reacţia are sensibilitate mai mare decât IDRS. În cazul Ig se utilizează ca suport agarul sau agaroza. IgG migrează anodic în gelul de agar. IgA şi IgM migrează către anod în gelul de agaroză.
Reacţia prezintă unele dificultăţi la efectuare.
Imunofixarea
Metoda a fiost imaginată de Alper şi Johnson (1969). Cuprinde un grup de tehnici imunochimice care au comun EF probei în gel, combinată cu imobilizarea (fixarea) unui reactant de către celălalt (imobilizarea Ag de către ac cunoscut, fie invers). Precipitatele se evidenţiază după colorare.
Metoda se utilizează pentru stabilirea clasei şi tipului de Ig monoclonală pentru diagnosticul imunochimic al bolii lanţurilor grele şi pentru diagnosticul deiferenţial al hipergamaglobulinemiilor monoclonale.
b) Reacţia de precipitare în mediul lichid
Urmare a reacţiei Ag-Ac în mediul lichid se formează complexe care precipită când cei doi reactanţi se găsesc în anumite proporţii. Inhibarea reacţiei este determinată de excesul unuia dintre aceştia.
Reacţia este mai sensibilă pentru evidenţierea Ag (Ac participă la formarea complexelor în proporţie mai mare).
Reacţia de precipiatre în mediul lichid presupune existenţa a cel puţin doi determinanţi antigenici pe molecula de Ag.
Curbele de precipitare. Prin adăugarea unr concentraţii crescătoare de ag la concentraţii constante de Ac, în urma izolării şi analizării precipitatelor şi supernatantelor obţinute, se pot trasa curbe de precipiatre ce relevă existenţa a trei zone distincete.
- zona excesului de Ac (precipitatul creşte la o nouă adăugare de Ag)- zona de echivalenţă (precipitatul rămâne constant la o nouă adăugare de Ag)- zona excesului de Ag (precipiatul scade la o nouă adăugare de Ag)Se cunosc două tipuri de curbe de precipiatre în mediul lichid. - curba de tip iepure. Prezintă un maxim rotunjit, indiferent de natura chimică a
ag. Precipiatul este mai mult sau mai puţin solubil în exces de Ag, dar insolubil în exces de Ac.
- curba de tip cal (curba de floculare). Curba pentru Ag proteice nu trece prin origine. Precipitatul este solubil atât în exces de Ac cât şi în exces de Ag.
Reacţia de precipitare în inel
Ag şi Ac se pun în contact încât să nu se amestece. La interfaţa celor doi reactanţi apare un inel de precipiare. Reacţia de precipitare în mediul lichid se efectuează în tubul capilar.
Imunonefelometria
În prezenţa unei cantităţi fixe de Ac sau Ag, complexele Ag-Ac precipitate într-o suspensie, modifică intensitatea şi dispersia luminii proporţional cu concentraţia Ag sau Ac.
Complexarea Ag cu Ac specific atinge o valoare maximă stabilă în aprox. 60 sec. Deoarece formarea complexelor care dispersează lumina este dependentă de prezenţa în proporţii optime a moleculelor de Ag şi Ac pentru o cantitate constantă de Ac (respectiv Ag), gradul de complexitate creşte proporţional cu cantitatea de Ag (respectiv de Ac) până la un maximum, după care Ag în exces determină scăderea progresivă a complexităţii; din această cauză se recomandă ca determinările nefelometrice să fie executate în exces moderat de Ac. Avantajele constau în rapiditatea obţinerii rezultatelor (automatizarea determinărilor).
Evaluarea se exprimă în mg/l, automat în funcţie de curba existentă în memoria nefelometrului
Dezavantajele nefelometriei constau în costul ridicat al aparaturii şi imposibilitatea determinării directe a proteinelor în probele icterice, hemolizate sau lactescente.
Metoda este limitată şi de deficienţe ce pot să apară în sistemele mecanice şi electronice ale instalaţiei.
2. Reacţia de aglutinare
Aglutinarea reprezintă agregarea de particule prin Ac. Ac reacţionează cu Ag (natural sau fixat artificial) de la suprafaţa unor particule (bacterii, hematii, latex) şi determină aglutinarea acestora.
Aglutinarea depinde de o serie de factori: valenţa Ac (Ac din clasa IgM sunt mult mai aglutinanţi decât cei care aparţin clasei IgG), densitatea determinanţilor antigenici de la suprafaţa particulei, forţa ionică a mediului în care are loc reacţia. Aglutinarea se datorează scăderii forţelor de respindgere electrostatice dintre particule şi creeri unor punţi de legătură prin intermediul Ac.
Reacţia de aglutinare are sensibilitatea mai mare decât reacţia de precipitare (Ag este o particulă şi nu o moleculă solubilă), excesul de Ag nu inhibă reacţia, concentraţiile mari de ac pot inhiba reacţia şi produce fenomenul de prozonă, raportul între Ag-Ac este tot în favoarea ac (ca şi la precipitare). Ac reacţionează numai cu determinantul Ag specific. Alături de Ac aglutinanţi există Ac neaglutinanţi (blocanţi sau incompleţi) şi Ac care aglutinează numai la rece (+40C).
Reacţia de aglutinare directă
Aglutinarea directă (aglutinarea simplă, clasică) este aglutinarea Ag naturale ale unor particule de către Ac specifici (ex. determinarea grupelor sanguine, aglutinarea bacteriană)
Sensibilitatea acestui tip de aglutinare poate fi crescută prin tratarea celulelor cu enzime sau prin executarea reacţiei în mediul cu vâscozitate crescută.
Reacţia de aglutinare indirectă
Aglutinarea indirectă (pasivă) este o reacţie ce presupune particule naturale sau artificiale (hematii, stafilococ proteină A, latex) încărcate in vitro cu Ag sau Ac. Particulele sunt aglutinate de către Ac, respectiv Ag omolog din probă.
Hemagluinarea pasivă este o metodă deosebit de sensibilă de cercetare a Ac serici, imaginată de Gzegibes şi Sehon.
Ac care nu pot produce reacţii vizibile cu Ag din cauză că se găsesc în ser în cantităţi reduse, pot fi evidenţiaţi prin metode de aglutinare pasivăă, crescând cantitatea de Ag prin absorbţia acstora pe un substrat inert. În acest fel, cantităţi mici de Ac produc aglutinări vizibile.
Reacţia de inhibare a aglutinării
Reacţia de aglutinare a particulelor încărcate cu Ag solubil este inhibată în cazul în care Ac reacţionează în prealabil cu Ag omolog (ex. diagnosticul imunologic de sarcină prin inhibarea aglutinării hematiilor sau prin inhibarea aglutinării latexului).
Diferenţa principală între hemaglutinarea pasivă şi tehnica de inhibare a hemaglutinării este aceea că în prima metodă (hemaglutinarea) se investighează prezenţa Ac, în timp ce în a doua (inhibarea) se investighează prezenţa Ag.
Reacţia de aglutinare mediată de anticorpi anti-imunoglobuline
Ac anti-imunoglobuline aglutinează particule încărcate (natural sau artificia)l cu Ac (ex. decelarea FR prin reacţia Waaler-rose sau Latex-FR, decelarea Ac incompleţi fixaţi la suprafaţa hematiilor prin reacţia coombs).
Reacţia de aglutinare poate fi calitativă de screening (ex. latex-FR, reacţia coombs) sau cantitativă (ex. reacţia Waaler-Rose, reacţia Coombs).
Reacţia Latex-FR este mai sensibilă, iar reacţia Waaler-Rose este mai specifică.
3. Reacţia de neutralizare
Antigenul este reprezentat de un imunogen cu proprietăţi biologice (toxină, enzimă, virus). Ac specifici determină (in vivo sau in vitro) blocarea acestor proprietăţi.
Reacţia de neutralizare depinde de aviditatea Ac, adică de viteza cu care Ac se poate combina cu Ag şi de gradul de stabilitate a legăturii ag-Ac.
Neutralizarea efectelor biologice ale Ag se constată numai în cazul în care situsul (toxic sau enzimatic) responsabil de activitatea biologică a Ag este identic cu situsul Ag.
În laborator, acest tip de reacţie se utilizează pentru determinarea Ac anti-streptolizină O prin reacţia ASLO (etapa finală de vizualizare este hemoliza) şi pentru identificarea unor virusuri.
Testul ASLO este o reacţie de neutralizare (inhibare a hemolizei). Se bazează pe proprietatea streptolizinei de a produce liza hematiilor de diverse specii.
4. Reacţii ce utilizează complement
În laboratorul clinic se execută patru reacţii de acest tip:
Reacţia de fixare a complementului
Reacţia de fixare a complementului (RFC), hemoliză directă. J. Bordet a imaginat o metodă de vizualizare indirectă a unei reacţii Ag-Ac, folosind complement (C) şi un sistem indicator (hemolitic).
Complexul Ag-Ac fixează C, iar hematiile sensibilizate adăugate ulterior rămân intacte (absenţa hemolizei înseamnă reacţie pozitivă), în lipsa complexului Ag-Ac specific (iniţial), C se fixează pe hematiile sensibilizate (sistemul indicator) producând hemoliza (hemoliza înseamnă reacţie negativă).
Fixarea C pe complexul Ag-Ac este evidenţiată indirect prin absenţa hemolizei sistemului indicator din a doua etapă a reacţiei (ser antihematii berbec-hematii berbec)
Activitatea anticomplement se datoreşte prezenţei complexelor Ag-Ac preformate, agregatelor de Ig şi a altor substanţe care pot activa calea clasică sau calea alternativă de activare a C.
Testul de inhibare a hemolizei imune pasive în prezenţa complementului
Testul este analog testului de inhibare a hemaglutinării, deosebirea esenţială constă în desfăşurarea reacţiei în prezenţa C. În cazul în care în prima etapă a reacţiei se formează complexul Ag-Ac nu mai rămân disponibili Ac care să reacţioneze cu hematiile sensibilizate, astfel încât în ultima etapă, C nu este cuplat cu hematiile sensibilizate şi acestea nu sunt lizate. În acest caz rezltatul testului este considerat pozitiv.
În situaţia în care nu se formează complexul Ag-Ac, Ac liberi reacţionează cu hematiile sensibilizate şi are loc liza acestora, rezultatul testului este considerat negativ.
În testul de imunohemoliză pasivă, interpretarea rezultatului se face în funcţie de gradul hemolizei obţinute, luându-se în considerare dimensiunile sedimentului de hematii şi intensitatea culorii supernatantului.
Testul de inhibare a hemolizei imune pasive în prezenţa C investighează prezenţa Ag în ser, în timp ce testul clasic investighează prezenţa Ac în ser.
Testul de imunohemoliză pasivă în prezenţa complementului
Ca şi în cazul testului de hemaglutinare pasivă, Ag este fixat pe hematie şi reacţionează cu Ac specific, formându-se în acest fel complexe Ag-Ac. Realizarea acestui complex în prezenţa C determină liza hematiilor sensibilizate cu Ag.
Determinarea imunohemolitică a complementului
Se referă la reacţia Ag-Ac numai în măsura în care se foloseţte ca indicator sistemul hemolitic (hematii de berbec sensibilizate cu ser anti-hematii berbec).
Reacţia măsoară activitatea hemolitică totală a sistemului complement.Metoda are ca punct final hemoliza 50%. Citirea se face la spectrofotometru.
5) Reacţii cu reactivi marcaţi
Detectarea, localizarea şi identificarea antigenelor se poate realiza utilizând anticorpi care recunosc şi se leagă specific de antigenele respective.
Vizualizarea complexului Ag-Ac format poate fi realizată prin marcarea Ac. Marcarea Ac trebuie să îndeplinească două condiţii: 1) să permită detectarea unor
cantităţi infime de substanţă 2) să nu altereze capacitatea de legare a Ac la Ag corespunzătoare.
În aceste reacţii se utilizează Ag sau Ac marcaţi: izotiocianatul de fluoresceină (produce strălucire caracteristică la examenul microscopic în lumina ultravioletă, Coons, 1942), izotopi radioactivi (Zalow şi Berson, 1960), şi enzime (au activitate asupra unui substrat-cromogen specific (Engwall şi Perlman, 1972).
a) Reacţia de imunofluorescenţă
În reacţia de imunofluorescenţă (IF) unul dintre reactanţi (Ag sau Ac de cercetat) trebuie să constituie o parte dintr-o structură biologică (celulă sau ţesut), reactivul marcat cu fluorocrom relevând reacţia Ag-Ac.
Vizualizarea complexului Ag-Ac format poate fi realizată prin marcarea Ac. Substanţele fluorescente (fluorocromii) absorb lumina incidentă de diferite lungimi de undă şi emit o lumină vizibilă care este în funcţie de fluorocromul utilizat: albastră, verde, galbenă, roşie sau albă.
Reacţia se poate realiza direct, indirect, cu fixarea complementului
Reacţia de imunofluorescenţă directă
Metoda directă (Coons) permite identificarea Ag specifice în preparate cu ajutorul conjugatului fluorescent anti-Ac. Se folosesc secţiuni de ţesuturi, seruri fluorescente anti-Ig şi anti-C.
Reacţia de imunofluorescenţă indirectă
Reacţia de imunofluorescenţă indirectă (IFI) vizualizează reacţia Ag-Ac prin aplicarea unui conjugat fluorescent anti-Ac.
Se foloseşte pentru detectarea Ac fixaţi pe Ag. Serul de bolnav se pune în contact cu un substrat celular (tisular). Urmează incubarea preparatului cu un ser antiglobulină umană marcat cu izotiocianat de fluoresceină care vizualizează în lumină ultravioletă reacţia Ag-Ac.
Testul poate fi folosit atât pentru determinarea Ag necunoscut cu ser imun cunsocut cât şi pentru detectarea ac necunoscuţi cu ag cunoscut.
Reacţia de imunofluorescenţă cu fixarea complementului
Complexul Ag-Ac fixează C. Metoda fixării C pe secţiuni de ţesut este derivată din metoda indirectă prin adăugarea C, apoi a serului marcat care va vizualiza complexul Ag-Ac-C.
b) Analiza radioimunologică
Analiza radioimunologică (RIA) este o tehnică de determinare cantitativă a unui număr mare de substanţe prezente în lichidele biologice în cantitate foarte mică.
RIA este o tehnică obiectivă, cu mare sensibilitate, parţial automatizată, aparatură costisittoare (echpament nuclear), reactivi scumpi, cu durată de utilizare scurtă, personal cu calificare specială, supusă unei legislaţii speciale (radioizotopi).
c) Analiza imunoenzimatică
În 1966, Avrameas şi Uriel introduc în histochimie marcarea enzimatică cu peroxidază, iar în 1971, Van Weemen şi independent Engwall şi Perlmann utilizează enzimele ca marker pentru reacţiile Ag-Ac. Analiza imunoenzimatică (EIA) se poate realiza în sistem omogen sau heterogen.
-reacţia imunoenzimatică în sistem omogen constă în competiţia pentru Ac între Ag marcat enzimatic şi Ac de determinat (din probă). Activitatea enzimatică este invers proporţională cu concentraţia Ag din probă.
-reacţia imunoenzimatică în sistem heterogen poate fi utilizată atât pentru determinatrea Ac cât şi a Ag. Activitatea enzimatică a conjugatului nu este influenţată de reacţia Ag-Ac şi necesită o etapă de separare.
Avantajele EIA: obiectivă, poate fi automatizată, foloseşte reactivi cu valabilitate convenabilă, aparatura este simplă, are sensibilitate crescută, nu este supusă unei legislaţii restrictive ca RIA.
Tehnica ELISA
În cazul utilizării sistemelor de fază solidă pentru separarea moleculelor libere şi a celor marcate, tehnica este denumită ELISA (enzime linked immunosorbent asssay). Tehnica imunoenzimatică ELISA este bazată pe reacţia Ag-Ac.
Sistemul de analiză constă din mai multe reacţii:- Ag sau Ac este imobilizat pe suport solid (plăci de pastic cu godeuri)- Ag sau Ac din proba de testat se leagă specific de reactantul imobilizat- reactantul marcat enzimatic reacţionează cu complexul reactant imobilizat-Ag
(sau Ac) din probă. Reactantul marcat enzimatic format din Ag (sau Ac) conjugat cu o enzimă este
activ atât imunologic cât şi enzimatic şi reacţionează atât cu Ag (sau Ac) din probă imobilizat pe suportul solid cât şi cu substratul corespunzător enzimei.
Vizualizarea reacţiei dintre reactantul enzimatic şi complexul Ag-Ac iniţial se realizează prin adăugarea unui substrat corespunzător enzimei utilizate.
Formarea complexului este identificată prin reacţia de culoare care apare la adăugarea substratului specific (p-nitrofenilfosfat disodic pentru fosfataza alcalină şi tetrametilbenzidina pentru peroxidază).
Intensitatea culorii indică prezenţa sau absenţa Ag, respectiv Ac din probă (se citeşte spectrofotometric folosind un cititor de plăci ELISA).
Tehnica ELISA se poate folosi pentru evidenţierea Ac (boliinfecţioase, autoimune) sau a Ag (boli infecţioase, neoplazice, endocrinologice, farmacologie).
6. Tehnica Western Blot
Tehnica cuprinde trei etape: separarea Ag prin electroforeză, transferul Ag, testarea probei de ser utilizând tehnica RIA sau ELISA. Numai partea a treia este efectuată în laboratoarele clinice.
Tehnica WB este disponibilă sub formă de truse comerciale.
B. Metode şi tehnici de imunocitologie
1. Tehnica pentru celule lupice
Tehnica pentru celule lupice (LE) este o tehnică morfologică de decelare a Ac antinucleari - gamaglobuline cu proprietăţi antinucleare (factorul Haserick) - ce apar în serul pacienţilor cu lupus eritematos sistemic (LES).
Acest factor seric acţionează asupra nucleilor de leucocite şi îi transformă în corpusculi omogeni, care pierd structura cromatiniană şi îşi modifică colorabilitatea (corpusculi LE).
Corpusculii LE sunt apoi fagocitaţi de leucocite intacte şi astfel apare imaginea caractertistică pe care o numim celulă LE.
Procesul de omogenizare a nucleului şi de fagocitoză are loc in vitro. Interpretarea preparatelor presupune o experienţă temeinică de mIcroscopist
(cunoaştere exactă a morfologiei celulelor LE). Celula LE este de obicei mai mare decât un polimorfonuclear. Caracteristică este
culoarea roz-violacee a corpusculilor LE care nu prezintă nici o structură. În jurul corpusculilor LE apare, ca o semilună, nucleul celulei fagocitante, cu structura şi culoarea obişnuite. Imaginea de rozetă este gruparea leucocitelor în jurul unui corpuscul LE.
2. Testul reducerii NBT
Determinarea procentului de granulocite care produc intracelular anion superoxid datorită activării oxidazelor celulare. La microscopul optic se determină procentul de celule care conţin depozite intracelulare albastre de formazan.
3. Chemiluminiscenţa
Formarea speciilor reactive de oxigen (ROS) de către granulocitul PMN este asociată cu emisia de energie luminoasă. Emisia luminoasă poate fi intensificată cu ajutorul luminolului sau lucigeninei şi convertită de către un chemiluminometru în semnal electric. Rezultatele se exprimă în mV.
4. Testul inhibiţiei aderenţei leucocitelor
Testul inhibiţiei aderenţei leucocitelor investighează răspunsul imun mediat celular în prezenţa unui Ag tumoral. Rezultatele sunt exprimate sub formă de indice de deviaţie a aderenţei (exprimă procentual creşterea sau scăderea aderenţei faţă de proba martor).
5. Imunofenotiparea cu ajutorul citometriei în flux
Citometria în flux reprezintă o abordare tehnică de mare complexitate ce permite determinarea simultană a mai multor parametri fizici şi chimici caractweristici unei singure celule aflate în mişcare într-un curent de lichid.
Metoda permite caracterizarea pe baze morfologice şi fenotipice a populaţiilor celulare din sângele periferic (limfocite, monocite, granulocite, etc.).
Prin citometria în flux se pot determina procentele seturilor şi subseturilor limfocitare din sânge.
6. Testul de transformare blastică a limfocitelor
Dacă o suspensie de limfocite prelevate de la un subiect sensibilizat se cultivă în vitro în prezenţa unui Ag se constată după un interval de timp creşterea numărului de celule blastice cu numeroase mitoze.
Transformarea blastică a celulelor in vitro se datoreşte stimulării metabolismului celular ca urmare a reacţiei dintre Ag şi structura membranei limfocitelor.
În urma cuplării Ag cu receptorii pe suprafaţa limfocitelor sensibilizate, membrana celulară se activează, declanşând transmiterea unui semnal spre nucleu, ceea ce determină iniţierea sintezei de ADN. Ca urmare, are loc creşterea dimensiunilor celulelor, nucleul devenind mai mare cu cromatina laxă şi citoplasma bazofilă.
5. Reacţia de limfocitotoxicitate
Metoda a fost descrisă de Gorer, apoi a fost aplicată la om de Terasaki. Reacţia constă în a incuba la 370C o suspensie de limfocite în prezenţa C şi a
antiserului. Dacă antiserul întâlneşte Ag corespunzător pe suprafaţa limfocitelor membrana
celulelor este alterată şi permite trecerea colorantului în citoplasmă, colorând celulele.Citirea se face la microscopul optic. Testul este pozitiv când există un anumit procentaj de celule colorate. Testul
serveşte pentru determinarea Ag de histocopatibilitate (HLA).
C. Principalele reacţii antigen-anticorp şi aplicaţiile acestora
Testul pentru determinarea grupelor sanguine ABO şi Rh
Reactivi pentru grupele de sânge ABOReactivi Anti-A, Anti-B, Anti-AB sunt derivaţi din liniile de celule hibridizate
care sunt obţinute prin fuzionarea anticorpilor de şoarece ce produc limfocite B cu celule de mielom.
Anticorpii derivaţi dintr-o singură clonă (celulele apărute din celula hibrid), precum şi amestecul de diferiţi anticorpi derivaţi de la diferite clone sunt desemnaţi ca monoclonali: Anti-A, Anti-B, Anti-AB.
Reactivii Anti-A, Anti-B, Anti-AB au fost evaluaţi în toate tipurile de teste, incluzând sisteme automate în paralel cu reactivii ABO convenţionali, policlonali.
Nu s-au observat reacţii fals-pozitive şi fals-negative între serul monoclonal şi cel policlonal.
Afinitatea serului reactiv a fost adesea mai puternică decât a serului policlonal, în mod special faţă de celulele de nou-născuţi şi subgrupele cu reactivitate slabă.
Material biologicSe foloseşte sânge total (puncţie în deget)
Modul de lucru
I. Testul pe lamă
A.Testul rapid-Se pune o picătură de anti-A, Anti-B, Anti-AB pe o lamă de sticlă-Se adaugă o picătură mică de sânge total şi se omogenizează bine-Se roteşte uşor lama timp de 2 min. -Se observă apariţia aglutinării. Aglutinarea apare între 30-60 secRezultatele negative pot fi semnalate după 2 min.
B.Testul cu incubare-Se prepară o suspensie de celule 5-10% în soluţie salină izotonică sau se foloseşte sânge total-Se pune o picătură din fiecare reactiv Anti-A, Anti-B, anti-AB pe o lamă-Se adaugă o picătură de suspensie ori o picătură mică de sânge şi se amestecă bine-Se incubează 15-30 min. la temperatura de 200C-Se amestecă uşor şi se observă apariţia aglutinării
II. Testul în tub-Se prepară o suspensie de celule de 3-5% în soluţie salină izotonică-Se pune o picătură de Anti-A, Anti-B, Anti-AB în tubul notat corespunzător-Se adaugă în fiecare tub o picătură din suspensia de celule şi se omogenizează bine
-Se centrifughează 2 min. la 1000 rpm sau 20 sec. La 3000 rpm ori se incubează 20 min. la temperatura de 200C-Se dislocă uşor butonul de celule şi se observă apariţia aglutinării
Reactivul anti-DAnticorpi monoclonali umani din clasa IgM, obţinuţi din culturi celulareSe păstrează la 2-80CConservare cu NaN3-0,1%Reactivul este pentru diagnosticul in vitro
ReactiviConţine anticorpi monoclonali de origine umană din clasa IgM, obţinut din culturi
celulare. Specificitatea şi reproductibilitatea sunt proprietăţi bine cunoscute la anticorpii monoclonali.
Majoritatea reactivilor anti-D monoclonali aparţin clasei de IgM.
Modul de lucru
I. Testul pe lamă
A. Testul rapidTestul trebuie efectuat pe o suprafaţă ce are temperatura cuprinsă între 20-370C
-Se pune o picătură de reactiv Anti-D pe lamă-Se adaugă o picătură mică de sânge total. Se omogenizează bine.-Se roteşte energic lama 2 min. Se observă dacă apare aglutinarea-Se citeşte rezultatul după 2 min. (suprafaţa uscată poate fi interpretată ca o reacţie fals-pozitivă.
B. Testul cu incubareSe poate folosi sânge total sau suspensia de celule-Se prepară o suspensie de 5-10% din celule ce trebuie testate în soluţie salină izotonică sau se foloseşte sânge total-Se pune câte o picătură de reactiv anti-D în cerculeţele lamei, ce se vor folosi-Se adaugă o picătură de suspensie sau o picătură mică de sînge total şi se omogenizează bine-Se incubează 30 minla 20-370C-Se agită uşor lama şi se observă aglutinarea
II. Testul în tub
-Se pregăteşte o suspensie 3-5% din celule ce trebuie testate în soluţie salină izotonică-Se pune o picătură de reactiv anti-D în tubul-probă-Se adaugă în fiecare tub o picătură din suspensia de celule şi se omogenizează bine-Se centrifughează 2 min. la 1000 rpm-Se dislocă uşor butonul de celule şi se observă prezenţa aglutinării.
Dacă reacţia este negativă se incubează tubul 15 min. la 200C, se centrifughează 2 min la 1000 rpm, se dislocă uşor butonul de celule şi se observă aglutinarea.
Anti-A Anti-B Anti-ABGrupa A + - +Grupa B - + +Grupa O - - -Grupa AB + + +
Testul pentru determinarea anticorpilor antistreptolizina OReacţia ASLO
Test calitativ şi cantitativ pentru explorarea stării de imunitate antitoxică faţă de toxinele streptococului.
Testul este bazat pe reacţia de aglutinare. Testul permite stabilirea diagnosticului anginei streptococice sau de infecţii streptococice, ca şi a celui de reumatism articular acut (RAA).
Menţinerea titrului ASLO crescut chiar şi la câteva luni după puseul reumatismal permite stabilirea diagnosticului retrospectiv al bolii.
Principiul metodeiReactivul folosit este o suspensie de particule latex de polistiren încărcate cu
streptolizina O stabilizată. Reactivul a fost astfel preparat încât, în prezenţa unui titru ASLO normal de 200
ui/ml sau mai crescut, să dea o aglutinare vizibilă a particulelor latex, fără diluarea serului.
Reactivi1 flacon cu reactiv latex de 5 ml1 flacon cu control pozitiv de 1 ml1 flacon cu control negativ de 1 ml1 plăcuţă pe care se efectuează reacţia
Material biologicSerul de cercetat trebuie să fie clar şi proaspăt. Plasma, serul lipemic ori contaminat poate determina erori în obţinerea
rezultatelor. Dacă testul nu poate fi efectuat imediat, atunci serul se păstrează la 2-8 0C, maximum 72 ore. Pentru o perioadă mai îndelungată serul trebuie să fie păstrat congelat.
Modul de lucru
I. Testul ASLO calitativ
-Se aduc reactivii şi probele la temperatura camerei înaintea folosirii cu 30 min-Se pun 2 picături (50 l) de control (+) în unul din cercurile plăcuţei de testare. -Se pun 2 picături (50 l) de control (-) în al doilea cerc.-Cu o pipetă se pun câte o picătură de ser (45 l) din fiecare probă în cercurile următoare.-Se agită uşor suspensia de reactiv latex şi se pune în fiecare cerc folosit câte o picătură de reactiv. Pentru omogenizare se foloseşte un beţişor pentru fiecare test în parte.-Se roteşte plăcuţa 2 min şi se citeşte aglutinarea imediat lângă o sursă de lumină.
II. Testul ASLO cantitativ
-Se aduc reactivii şi probele la temperatura camerei, înainte de folosire cu 30 min.-Se diluează probele 1/2; 1/4; 1/8 1/16 în soluţie salină izotonică. Se pot face diluţii şi mai mari dacă este necesar-Se pune 1 picătură (45 l) din fiecare diluţie în succesiunea de cercuri ale plăcuţei de testare-Se agită reactivul latex şi se adaugă o picătură de reactiv în fiecare cerc de testare. -Se omogenizează cele două picături folosind un beţişor pentru fiecare probă-Se roteşte uşor placa 2 min. şi se citeşte rezultatul imediat în dreptul unei surse de lumină
Interpretarea testuluiReacţia ASLO negativă: obţinerea unei suspensii lăptoase, fără aglutinare, ca cea
observată la controlul negativReacţia ASLO pozitivă: obţinerea unei aglutinări observată în cercul probei
asemănătoare cu cea observată la controlul pozitiv.Reacţia ASLO indică starea de imunitate antitoxică faţă de streptococ.Valori normale: între 0-200 uiValori crescute: I. > 200 uiLa pacienţii care au avut în ultimele trei luni o angină streptococică sau alte
retrospectiv al bolii, deoarece titrul anticorpilor antistreptolizină O se menţine crescut timp de câteva luni după puseul reumatismal acut.
Titrul ASLO creşte odată cu evoluţia puseului reumatismal. Reacţia ASLO este pozitivă în stenoză mitrală, amigdalită acută streptococică, endocardita streptococică lentă.
ObservaţiiReactivii conţin azidă de sodiu ce se poate combina cu Cu şi Pb, putând asfel
deveni explozibili.
Controlul pozitiv şi negativ a fost preparat din ser uman care a fost testat folosind metoda licenţiată FDA şi s-a demonstrat că nu reacţionează cu anticorpii pentru AgHBs şi HCV.
Toate probele umane pot fi considerate potenţial infectate.Reactivii şi controalele sunt stabile până la data expirării, dacă sunt păstrate la
temperatura de 2-80C. Reactivii nu se păstrează la congelator.
Testul pentru identificarea proteinei C reactive
Testul este utilizat pentru identificarea proteinei C reactive (CRP) în ser pentru diagnosticul unor afecţiuni inflamatorii sau pentru monitorizarea inflamaţiei.
Principiul metodeiReactivul CRP este o suspensie de particule latex de polistiren, marcate cu o
fracţiune de gamaglobulină a serului anti-uman CRP specific. Când CRP este prezentă în probă, se observă o aglutinare ce indică un conţinut de 6 mg/l.
Reactivi1 flacon cu reactiv latex de 5 ml1 flacon cu control pozitiv de 1 ml1 flacon cu control negativ de 1 ml1 plăcuţă pe care se efectuează reacţia
Material biologicSe foloseşte ser clar şi proaspăt. Plasma, serul lipemic, ori contaminat poate duce la erori în obţinerea rezultatelor. Dacă testul nu poate fi făcut imediat, serul se păstrează la 2-80C, pentru 72 de ore. Pentru o perioadă mai îndelungată, serul trebuie păstrat congelat.
Modul de lucru-Se aduc reactivii şi probele la temperatura camerei înaintea folosirii cu 30 min.-Se pun 2 picături (50 l) de control (+) în primul cerc şi 2 picături în al doilea cerc al plăcuţei de testare-Se pune o picătură (45 l) de ser nediluat din fiecare probă în cercurile ce urmează-Se agită uşor suspensia de reactiv latex-Se pune în fiecare cerc folosit o picătură (45 l)Pentru omogenizare se foloseşte un beţişor pentru fiecare test efectuat-Se roteşte plăcuţa 2 minute şi se citeşte rezultatul imediat în dreptul unei surse de lumină
Interpretarea rezultatelorReacţia negativă: apariţia unei suspensii lăptoase, fără aglutinare, ca cea observată
în controlul negativReacţia pozitivă: orice aglutinare observată la proba asemănătoare celei observate
la controlul pozitivProteina C reactivă nu este prezentă în serul pacienţilor aparent sănătoşi.
Determinarea CRP poate servi la monitorizarea activităţii inflamatorii, fie ca rezultat al terapiei, fie al remisiunii spontane
Valori normale: <6 mg/lValori crescute:I. În faza iniţială a inflamaţiei în
II. Alte afecţiuni -febre reumatice, afecţiuni reumatice diverse, colagenoze, tuberculoza activă
ObservaţiiReactivii conţin azidă de sodiu ce se poate combina cu Cu şi Pb, putând deveni
explozibili.Controlul pozitiv şi negativ din ser uman, a fost testat prin metoda licenţiată FDA
şi s-a demonstrat că nu reacţionează cu anticorpii pentru AgHBs şi HIV. Toate probele umane pot fi considerate potenţial infectate.Reactivii şi controalele sunt stabile până la data expirării, dacă sunt păstrate la
temperatura de 2-80C, maximum 72 de ore. Reactivii nu se păstrează congelaţi.
Testul pentru identificarea factorului reumatoid
Principiul metodei Reactivul pentru factorul reumatoid (FR) este o suspensie de particule latex de
polistiren încărcate cu IgG uman. Sensibilitatea reactivului FR detectează o concentraţie minimă de 8 ui/ml, în acord cu WHO Internaţional Standard, fără diluarea probei. În mod practic, particulele de polistiren-latex învelite cu gamaglobulină denaturată sunt aglutinate de seruri ce conţin FR.
Reactivi1 flacon cu reactiv latex de 5 ml1 flacon cu control pozitiv de 1 ml1 flacon cu control negativ de 1 ml1 plăcuţă pe care se efectuează testul
Material biologicSe foloseşte ser clar şi proaspăt. Plasma, serul lipemic sau contaminat poate duce la erori în obţinerea rezultatelor.
Dacă testul nu poate fi făcut imediat, serul se păstrează la 2-80C, pentru 72 de ore. Pentru o timp mai îndelungat, serul trebuie păstrat congelat.
Modul de lucru-Se aduc reactivii şi probele la temperatura camerei înaintea folosirii cu 30 min-Se pun 2 picături (50 l) de control (+) în primul cerc şi 2 picături în al doilea cerc al plăcuţei de testare
-Se pune o picătură (45 l) de ser nediluat din fiecare probă în cercurile ce urmează-Se agită uşor suspensia de reactiv latex-Se pune în fiecare cerc folosit o picătură (45 l)Pentru omogenizarea conţinutului se foloseşte un beţişor pentru fiecare test efectuat-Se roteşte plăcuţa 2 minute şi se citeşte rezultatul imediat în dreptul unei surse de lumină
Interpretarea rezultatelorReacţia negativă: apariţia unei suspensii lăptoase, fără aglutinare, ca cea observată
în controlul negativReacţia pozitivă: orice aglutinare observată la proba întocmai celei observate la
controlul pozitivFactorii reumatoizi sunt imunoglobuline cu activitate de anticorpi. FR sunt
prezenţi la pacienţii care prezintă poliartrită reumatoidă (PR). În continuare se recomandă folosirea testului Waaler-Rose-test specific pentru determinarea FR împotriva IgG de animal
Factorul reumatoid este prezent şi la persoanele aparent sănătoase. Peste vârsta de 60 de ani, frecvenţa FR este de 5-6%
Valori normale: între 0-6 ui/mlValori patologice:Reacţia pozitivă: poliartrită reumatoidă; boli de colagen (la 10-50%), ex: lupus
eritematos sistemic, sclerodermie; unele disglobulinemii (ex: Kala-Azar, maladia Waldenström)
ObservaţiiReactivii conţin azidă de sodiu ce se poate combina cu Cu şi Pb, putând deveni
explozibili.Controlul pozitiv şi negativ din serul uman, a fost testat prin metoda licenţiată
FDA şi s-a demonstrat că nu reacţionează cu anticorpii pentru AgHBs şi HIV. Toate probele umane pot fi considerate potenţial infectate.Reactivii şi controalele sunt stabile până la data expirării, dacă sunt păstrate la
temperatura de 2-80C. Reactivii nu se congelează.Serurile contaminate sau citirea mai târziu de 3 min., pot da reacţii fals-pozitive.
Nu se poate pune un diagnostic doar pe baza unui singur test, este necesară corelarea cu datele clinice.
Testul pentru identificarea Factorul Reumatoid (FR) în serul şi lichidul articular cu reactivul Waaler-Rose
Principiul metodeiReactivul Waaler-Rose este o suspensie stabilizată de hematii de oaie sensibilizate
la rândul lor cu anti IgG de şoarece. Sensibilitatea reactivului este pentru a detecta o cantitate minimă de FR de 6 ui/ml în acord cu WHO Internaţional Standard), fără diluarea probei.
Material biologic
Se foloseşte serul clar şi proaspăt. Plasma, serul lipemic, ori contaminat poate duce la erori în obţinerea rezultatelor.
Dacă testul nu poate fi făcut imediat, serul se păstrează la 2-80C, pentru 72 de ore. Pentru un timp mai îndelungat, serul trebuie păstrat congelat.
Modul de lucru
I. Testul calitativ
-Se aduc reactivii şi probele la temperatura camerei înaintea folosirii cu 30 min.-Se agită bine reactivul astfel încât particulele să se disperseze-Se pun 2 picături (50 l) de ser nediluat din fiecare probă în cercurile plăcuţei de testare-Se adaugă o picătură de reactiv în fiecare cerculeţ utilizat-Se omogenizează conţinutul cu un beţişor pentru fiecare test efectuat-Se pune plăcuţa pe o suprafaţă plană 2 min.-După expirarea timpului se apleacă plăcuţa la 450 şi se aşteaptă 1 min.-Se citeşte prezenţa sau absenţa aglutinării vizibile aparută în acest timp. Dacă se depăşeşte timpul, atunci se va citi o reacţie de aglutinare nespecifică.Prezenţa aglutinării indică prezenţa în ser a unei cantităţi de FR egal cu 6 ui/ml. Scăderea intensităţii aglutinării indică un nivel mai scăzut.
II. Testul semicantitativ
Acest test se realizează prin efectuarea unor diluţii succesive ale serului în soluţie salină izotonică.
Diluţii 12 14 18 116
Serul probei 100 lSoluţie salină 100 l 100 l 100 l 100 l
100 l100 l
100 l
Volumul probei 50 l 50 l 50 l 50 l
Calcularea conc. 6x2 6x4 6x8 6x16
Factorii reumatoizi sunt imunoglobuline cu activitate de anticorpi. Factorii reumatoizi sunt prezenţi la majoritatea pacienţilor cu poliartrită reumatoidă (PR).
Interpretarea rezultatelorValori normale: între 0-6 ui/mlValori patologice: poliartrita reumatoidă (95% dintre cazuri), în unele colagenoze
(lupusul eritematos sistemic, dermatomiozită), în unele forme de neoplasm şi unele
hemopatii maligne, intr-un numar mare de afecţiuni reumatismale ale copilăriei (spondilartrita anchilozantă), boli infecţioase (sifilis, TBC, hepatita virală), boli respiratorii (astm bronşic, fibroza pulmonară, bronşite).
ObservaţiiReactivii conţin azidă de sodiu ce se poate combina cu Cu şi Pb, putând deveni
explozibili.Controlul pozitiv şi negativ din ser uman, a fost testat prin metoda licenţiată FDA
şi s-a demonstrat că nu reacţionează cu anticorpii pentru AgHBs şi HIV. Toate probele umane pot fi considerate potenţial infectate.Reactivul se va agita bine înainte de folosire, astfel încât suspensia să fie bine
omogenizată. Sensibilitatea testului depinde de volumul picăturii (50 l). Reactivii şi
controalele sunt stabile până la data expirării, dacă sunt păstrate la temperatura de 2-8 0C. Reactivul nu se păstrează congelat.
Serurile contaminate sau citirea mai târziu de 3 min., pot da reacţii fals-pozitive. Nu se poate pune un diagnostic doar pe baza unui singur test, este necesară corelarea cu datele clinice.
Testul pentru identificarea AgHBs
Principiul metodeiTestul pentru identificarea AgHBs este un test rapid se efectuează din ser, este util
în diagnosticul infecţiei cu virusul hepatitic B. Rezultatul testului poate fi citit vizual, fără niciun instrument. Testul se bazează pe principiul determinării semicantitative a AgHBs din ser, cu
ajutorul metodei imunoenzimatice de tip “sandwich”. Anticorpii monoclonali şi policlonali sunt folosiţi pentru identificarea AgHBs cu o înaltă sensibilitate. Testul durează aprox. 15 min.
Reactivi25 de plăcuţe imunocromatograficeReactivul 1=enzima conjugatăReactivul 2=soluţia de spălareReactivul 3=soluţia revelatoare
Material biologicPacientul nu necesită o pregătire prealabilă.
-Se recoltează sânge fără anticoagulant-Se lasă sângele să se coaguleze-Se separă serulDacă probele nu pot fi testate în ziua recoltării, serul se păstrează în frigider sau congelat. Nu se recomandă congelare şi decongelare repetată. -După decongelare, serul se omogenizează bine.
Modul de lucru-Se aduc toţi reactivii, plăcuţa şi toate materialele necesare la temperatura camerei înainte de efectuarea testului cu 30 min. Nu se amesteca capacele eprubetelor ce conţin probe-Se adaudă 300-400 l de ser în situsul de testare. Se lasă serul să se absoarbă complet-Se adaugă 2 picături Reactiv 1 (Enzima conjugată). -Se lasă soluţia să se absoarbă complet. Se aşteaptă 10 min.-Se adaugă 8 picături Reactiv 2 (Soluţia de spălare) în situsul de testare.-Se lasă ca soluţia să se absoarbă complet. -Se îndepărtează filtrul-Se adaugă 3 picături Reactiv 3 (Revelator de culoare) în situsul de testare. -Se lasă ca soluţia să se absoarbă complet. -Se adaugă încă 5 picături Reactiv 3-Se citeşte rezultatul după 3 min.
Interpretarea rezultatelorNegativ: sunt vizibile doar cele 3 spoturi miciIntens pozitiv: toate cele trei spoturi mici şi spotul mare sunt vizibile, iar spotul
mare este intens coloratSlab pozitiv: apar cele 3 spoturi mici şi spotul central, dar spotul mare nu foarte
intens coloratNeconcludent: când spotul central este vizibil, dar cele mici nu sau când nu apare
nici un spot. Se repetă testul
ObservaţiiKitul trebuie păstrat la temperatura de 2-80C. După deschiderea pachetului, kitul
poate fi păstrat la temperatura camerei o săptămână, dar nu la temperaturi mai mari de 300C. Flaconul cu reactiv reprezintă enzima conjugată şi trebuie păstrată la 2-80C.
Testul calitativ pentru identificarea AgHBs
Principiul metodeiReactivul este o suspensie de particule latex de polistiren ]nc[rcate cu
gamaglobulină anti-HBs înalt purificată. Când AgHBs este prezent în probă se observă o aglutinare evidentă.
Reactivi1 flacon cu reactiv latex de 5 ml1 flacon cu control pozitiv de 1 ml1 flacon cu control negativ de 1 ml1 plăcuţă pe care se efectuează reacţia
Material biologicSe foloseşte ser clar şi proaspăt. Probele pot fi păstrate la 2-80C pentru 48 de ore,
înainte de efectuarea testului. Pentru o perioadă mai lungă serul trebuie păstrat congelat
Modul de lucru-Se aduc reactivii şi probele la temperatura camerei cu 30 min. înaintea folosirii-Se agită uşor reactivul pentru dispersia particulelor şi pentru omogenizare -Pentru fiecare probă se pregăteşte o eprubetă etichetată şi se adaugă în 2 ml soluţie salină izotonică, 50 l de probă (diluţie 1/40)-Se pipetează 1 picătură de control negativ şi pozitiv nediluat în câte un cerculeţ al plăcuţei.-Se pipetează 50 l de probă diluată într-un cerculeţ al plăcuţei şi 50 l de probă nediluată într-un alt cerculeţ-Se adaugă o picătură de suspensie latex AgHBs în fiecare cerculeţ utilizat. Se amestecă ambele picături de pe plăcuţă cu un beţişor-Se roteşte plăcuţa manual sau cu un rotator (60-80 rpm) timp de 5 min. -Se citeşte imediat lângă o sursă de lumină aglutinarea-Sensibilitatea testului descreşte proporţional cu temperatura camerei
Rezultatul testului calitativ:
Proba nediluată Proba diluată
Negativ Aglutinare.- Aglutinare –PozitivConc. scăzută Aglutinare + Aglutinare –Conc. medie Aglutinare+ Aglutinare +Conc. mare Aglutinare - Aglutinare +
ObservaţiiReactivii conţin azidă de sodiu care în contact cu plumbul şi cuprul ţevilor poate
forma azidă metalică explozivă. După îndepărtarea reactivilor se spală sistemul de scurgere cu un volum mare de apă.
Reactivii se aruncă sub jet de apă pentru a preveni formarea de azidă metalică explozivă .
Controlul pozitiv prezintă caracteristicile antigenice nu şi pe cele infecţioase. Totuşi, nici o metodă de testare nu poate oferi siguranţa absolută.
Toate probele umane pot fi considerate potenţial infectate.
Testul pentru identificarea anticorpilor anti-HBs
Principiul metodeiAcesta este un test rapid pentru identificarea anticorpilor anti-HBs în ser, fiind util
în diagnosticul infecţiei cu virusul hepatitic B. Rezultatele pot fi citite vizual. Testul se bazează pe principiul determinării semicantitative a anticorpilor anti-
HBs în ser cu ajutorul metodei imunoenzimatice de tip “sandwich”. Anticorpi sintetici şi recombinaţi sunt folosiţi pentru identificarea specifică a anticorpilor anti-HBs, metoda prezintă o sensibilitate crescută.
Anticorpii anti-HBs mai mici de 10 mui/l pot fi detectaţi în 10-15 min.
Spotul mare sau linia celor 3 spoturi mici ne ajută la citirea rezultatelor pozitive şi negative. Cele 3 spoturi mici servesc pentru controlul intern. Spotul mic central este un control slab pozitiv, celelalte 2 spoturi laterale sunt pentru controlul intens pozitiv. Aceste spoturi apar cînd reacţia imunoenzimatică este completă
Reactivi25 de pliculeţe imunocromatograficeR1 Enzima conjugatăR2 Soluţia de spălareR3 Soluţia de developare
Kitul se păstrează la temperatura de 2-80C. După deschiderea pachetului, acesta poate fi păstrat la temperatura camerei o săptămână, dar nu la temperaturi mai mari de 300C.
Flaconul cu enzima conjugată trebuie păstrat la 2-80C.
Material biologicPacientul nu necesită în prealabil o pregătire. Se recoltează sânge într-o eprubetă
fără anticoagulant. Se lasă sângele să se coaguleze şi se separă serul. Dacă probele nu pot fi lucrate în ziua recoltării, serul se păstrează în frigider sau congelator. Se evită congelarea şi decongelarea repetată. După decongelare serul trebuie să se omogenizeze.
Modul de lucru-Se aduc toţi reactivii, plăcuţa, probele şi toate materialele necesare la temperatura camerei înainte de efectuarea testului. Pentru fiecare test se foloseşte o singură casetă.-Cu pipeta se adaugă 3 picături de soluţie de spălare (R2) în dispozitivul de testare. Se lasă să se absoarbă complet soluţia înaintea continuării testării. -Se adaugă 300-400 l de ser în situsul de testare.-Se adaugă 2 picături de Reactiv 1 (Enzima conjugată). Se lasă reactivul să se absoarbă complet (se aşteaptă 10 min).-Se adaugă 8 picături de Reactiv 3 (Soluţia de developare) în situsul de testare. Din nou se lasă să se absoarbă complet-Se adaugă alte 5 picături de Reactiv 3. Se lasă 2 min-Se citeşte rezultatul
Interpretarea rezultatelorNegativ: sunt vizibile doar cele 3 spoturi miciIntens pozitiv: Sunt vizibile toate cele 3 spoturi mici şi spotul mare. Spotul mare
este intens coloratSlab pozitiv: Apar cele 3 spoturi mici şi spotul mare central, dar spotul mare nu
este foarte intens coloratNeconcludent: Când spotul central este vizibil, dar cele mici nu sunt vizibile sau
când nu apare nici un spot. În această situaţie se recomandă repetarea testului.
