Aspecte moleculare şi biochimice ale interacţiei gazdă - parazit în cadrul procesului tumorigen la plante LIGIA GHEŢEA, MARGARETA DUMITRESCU, NICOLAE TOMA Institutul de Genetică al Universităţii din Bucureşti 1. Introducere In cadrul procesului patologic, interacţiunea dintre parazit şi planta gazdã induce modificãri atât în expresia anumitor gene, cât şi în conformaţia anumitor enzime (modificãri epigenetice). In consecinţã, are loc o modificare a cãilor metabolice în sensul sintezei unor metaboliţi care aparţin aparatului defensiv al plantei, pe de o parte, iar pe de altã parte, este indusã, de cãtre parazit, sinteza unor produşi care îi asigurã stabilizarea relaţiei sale cu planta gazdã. O analiză directă a expresiei genice, utilizând tehnici moleculare specifice, precum izolarea de molecule de ARN mesager, reverstranscrierea, secvenţierea moleculelor de ADN complementar corespunzătoare, analiza Northern şi Southern, traducerea ARN mesager “in vitro”, dar şi investigaţiile biochimice asupra produşilor genici şi asupra căilor metabolice activate, analizele de structură şi ultrastructură a celulelor şi ţesuturilor vegetale afectate, oferă informaţii valoroase asupra dinamicii acestui proces complex şi totuşi încă puţin înţeles, care este patogeneza la plante. Lucrarea de faţã reprezintă o sinteză de date, cu privire la modificãrile biochimice şi genetice care caracterizeazã, pe de o parte, procesul de formare a nodozităţilor la diferite specii de leguminoase, prin acţiunea bacteriilor din genul 81
Transcript
Aspecte moleculare şi biochimice ale interacţiei gazdă - parazit în cadrul procesului tumorigen la plante
LIGIA GHEŢEA, MARGARETA DUMITRESCU, NICOLAE TOMA
Institutul de Genetică al Universităţii din Bucureşti
1. Introducere
In cadrul procesului patologic, interacţiunea dintre parazit şi planta gazdã induce modificãri atât în expresia anumitor gene, cât şi în conformaţia anumitor enzime (modificãri epigenetice). In consecinţã, are loc o modificare a cãilor metabolice în sensul sintezei unor metaboliţi care aparţin aparatului defensiv al plantei, pe de o parte, iar pe de altã parte, este indusã, de cãtre parazit, sinteza unor produşi care îi asigurã stabilizarea relaţiei sale cu planta gazdã.
O analiză directă a expresiei genice, utilizând tehnici moleculare specifice, precum izolarea de molecule de ARN mesager, reverstranscrierea, secvenţierea moleculelor de ADN complementar corespunzătoare, analiza Northern şi Southern, traducerea ARN mesager “in vitro”, dar şi investigaţiile biochimice asupra produşilor genici şi asupra căilor metabolice activate, analizele de structură şi ultrastructură a celulelor şi ţesuturilor vegetale afectate, oferă informaţii valoroase asupra dinamicii acestui proces complex şi totuşi încă puţin înţeles, care este patogeneza la plante.
Lucrarea de faţã reprezintă o sinteză de date, cu privire la modificãrile biochimice şi genetice care caracterizeazã, pe de o parte, procesul de formare a nodozităţilor la diferite specii de leguminoase, prin acţiunea bacteriilor din genul Rhizobium iar pe de altă parte, cecidogeneza (formarea tumorilor de tip galã) indusã de nematodul Meloidogyne incognita.
S-a urmărit evidenţierea elementelor comune celor două procese, în special în privinţa mecanismelor defensive declanşateîn planta gazdă, prin acţiunea parazitului.
2. Mecanisme genetice şi biochimice implicate în răspunsul defensiv, la plante
Plantele au dezvoltat un spectru deosebit de larg de mecanisme de apărare, deşi mult mai puţin specifice în comparaţie cu cele elaborate de animale.
Baron & Zambryski (1995) distribuie diferitele gene induse în cadrul răspunsului defensiv, în câteva grupe funcţionale.
Intr-una dintre aceste grupe, autorii includ genele codificatoare ale enzimelor metabolismului fenilpropanoizilor, precum fenilalanin amonia-liaza (PAL), chalcon-sintetaza (CHS) şi chalcon-izomeraza (CHI). Aceste gene reprezintă markerii clasici ai răspunsului plantei la infecţie şi rănire. Produşii fenilpropanoidici joacă diverse roluri în răspunsul plantei la diferiţi stimuli abiotici şi biotici (figura 1).
81
LIGIA GHEŢEA, MARGARETA DUMITRESCU, NICOLAE TOMA
O altă grupă conţine genele care codifică pentru sinteza glicoproteinelor bogate în hidroxiprolină (HRGP) şi pentru peroxidaze. Aceşti produşi genici pot contribui la formarea unei bariere structurale care să oprească invazia patogenului sau a produşilor elaboraţi de acesta.
In cea de a treia grupă sunt cuprinse genele care codifică sinteza enzimelor chitinază, pectinază şi -1,3-glucanază. Aceste enzime pot produce degradarea pereţilor celulari ai fungilor invadatori sau eliberarea elicitorilor endogeni din pereţii celulei vegetale, aceştia din urmă stimulând mai departe, răspunsul defensiv al plantei.
In fine, într-un alt grup, cei doi autori includ genele care codifică pentru lipoxigenază (LOX), a cărei activitate creşte în câteva sisteme plantă – patogen.
Produşii LOX, cum ar fi acidul jasmonic, sunt frecvent întâlniţi în cadrul răspunsului plantelor la atacul patogenilor şi la răniri. Acidul jasmonic şi esterul său – metil-jasmonatul – sunt reglatori hormonali naturali care controlează senescenţa la plante, precum şi inductori ai inhibitorilor de proteinază, în răspunsul la rănire şi atacul patogenilor (Gundlach H. et al., 1992). Acidul jasmonic şi derivaţii lui sunt consideraţi elemente semnal cheie care conduc la transcrierea “de novo”, traducerea şi biosinteza metaboliţilor secundari în culturile de celule vegetale. Eliberarea acidului -linolenic – un precursor al acidului jasmonic şi al metil-jasmonatului – este mediată de un receptor specific pentru elicitor. Adiţia metil-jasmonatului în culturile de celule vegetale iniţiază transcrierea “de novo” a unor gene precum cea pentru fenilalanin amonia-liază.
Figura 1. Produşi ai fenilalaninei, sintetizaţi pe calea fenilpropanoidică : săgeata simplă – o etapă enzimatică ; săgeata dublă – mai multe etape enzimatice. PAL – fenilalanin amonia-liaza; CHS – chalcon
sintetaza; CHI – chalcon izomeraza; IFR – izoflavon reductaza.
Franceschi şi Grimes (citaţi de Gundlach et al.) au raportat inducerea, de către jasmonat, a acumulării de antocianină, ca răspuns la tratamentul plăntuţelor de soia cu metil-jasmonat, demonstrând, prin aceasta, că acest mecanism este operant şi “in vivo”. Acidul jasmonic a fost comparat cu prostaglandinele – substanţe asemănătoare hormonilor, la mamifere.
2
Aspecte moleculare şi biochimice ale interacţiei gazdă – parazit în cadrul procesului tumorigen la plante
După cum se observă şi în figura 1, o categorie de produşi rezultaţi în urma activării căii fenilpropanoidice este reprezentată de fitoalexine.
Fitoalexinele sunt fenoli ca pisatina, faseolina, acidul clorogenic, acidul cofeinic etc. Ele sunt analoge anticorpilor din organismele animale, dar, spre deosebire de aceştia, sinteza lor are loc nu în tot organismul, ci numai în celula infectată, fitoalexinele putându-se identifica numai la distanţă mică faţă de celulele care le-au sintetizat. De asemenea, o deosebire a fitoalexinelor faţă de anticorpi este lipsa lor de specificitate. Astfel, în timp ce anticorpii animalelor au proprietatea de a precipita numai antigenii care le-au indus formarea, fitoalexinele au acţiune nespecifică, manifestându-se chiar şi asupra ţesuturilor plantelor care le produc. Această acţiune se manifestă prin producerea unor necroze ale ţesuturilor vegetale, în timpul reacţiilor de hipersensibilitate ale acestor ţesuturi.
Reacţia de hipersensibilitate este reacţia de apărare a plantelor, prin care acestea, în urma infecţiei produsă de agenţi patogeni, îşi omoară propriile celule atacate, localizând efectul infecţiei. Astfel, o reacţie de apărare sporită, cauzată de o sensibilitate crescută faţă de agentul patogen, poate conferi plantelor un avantaj faţă de plantele aşa-zis rezistente. Nu numai mecanismul, dar şi efectul reacţiilor de hipersensibilitate este altul decât al celorlalte mecanisme de rezistenţă. In timp ce, în alte situaţii, este tolerată existenţa cuplului gazdă-parazit, reacţia de hipersensibilitate este un indiciu de incompatibilitate între un agent patogen şi o anumită gazdă. Reacţia de hipersensibilitate este mediată de un set de gene R (de rezistenţă) care sunt capabile să detecteze tipul de patogen prin recunoaşterea proteinelor desemnate Avr (de avirulenţă), codificate şi sintetizate de parazit. Rezistenţa mediată de genele R este numită si rezistenţa genă-pentru-genă, fiind, în mod obişnuit, dar nu obligatoriu, asociată cu necroza rapidă a celulelor plantei, la locul invaziei (Feys & Parker, 2000).
In afară de fitoalexine, sintezele proteice sunt procesele cel mai profund implicate în reacţiile de apărare ale organismelor vegetale.
Un aspect deosebit de interesant, din acest punct de vedere, este capacitatea plantelor de a produce interferoni, în urma infecţiei cu virusuri. Considerată, iniţial, un atribut exclusiv al celulei animale, sinteza interferonilor la plante a fost demonstrată încă din 1964, de către Loebenstein şi colab. (citat de Dumitrescu şi Vlădescu, 1973). Cercetătorii au indus sintezade interferoni în plantele de Datura stramonium, prin infecţii virale sistemice sau locale, izolându-i apoi, cu ajutorul unor metode folosite curent în cazul organismelor animale.
Cele mai interesante enzime din punct de vedere al implicaţiilor lor în rezistenţa plantelor la atacul diferiţilor agenţi patogeni, sunt enzimele oxidative. Rolul enzimelor oxidative este complex şi constă în formarea chinonelor care oxidează sau precipită proteine ale diferiţilor paraziţi. Se declanşează astfel, un adevărat “război enzimatic” între agentul patogen şi plantă.
Anihilarea acţiunii agenţilor patogeni de către oxidazele vegetale este, uneori, urmată de un contra-atac al parazitului, prin secretarea unor catalaze care, prin competiţia pentru substrat (H2O2), inhibă catalazele sau peroxidazele plantei. Schimbarea spectrelor izoenzimelor oxidative ale plantelor sub influenţa atacului unor agenţi patogeni, a fost frecvent semnalată.
Deosebit de interesantă este problema rolului peroxidazelor plantelor, suplimentar sintetizate sub acţiunea agenţilor patogeni, în reacţiile de hipersensibilitate. Efectul dublu pe de o parte, al creşterii intensităţii activităţii enzimelor oxidative, al apariţiei unor fracţii izoenzimatice noi şi al necrozelor pe de altă parte, a pus problema existenţei sau a inexistenţei unor relaţii cauzale între aceste fenomene. A fost emisă ipoteza potrivit căreia procesele de necrozare pot să apară ca urmare a acţiunii enzimelor oxidative. Ulterior însă, s-a demonstrat că, deşi reacţia de hipersensibilitate este însoţită de creşterea concentraţiei substanţelor fenolice (substraturi ale unor enzime oxidative), acestea conduc la necroze de hipersensibilitate şi că sinteza fenolilor nu ar fi decât un efect secundar al procesului infecţios.
3
LIGIA GHEŢEA, MARGARETA DUMITRESCU, NICOLAE TOMA
De asemenea, s-a arătat că schimbările activităţilor enzimatice şi apariţia unor enzime oxidative noi în reacţiile de hipersensibilitate ale plantelor, sunt o consecinţă şi nu un factor determinant al morţii celulelor.
3. Aspecte moleculare şi biochimice ale simbiozei dintre plantele leguminoase şi bacterii din genul Rhizobium
3.1 Mecanismul interacţiunii dintre plantă şi bacterie Simbioza dintre plantele leguminoase şi Rhizobium, în condiţiile existenţei unei surse
limitate de azot în sol, conduce la dezvoltarea unor formaţiuni noi la nivelul plantei – nodozităţile fixatoare de azot atmosferic. Nodozităţile se formează, de obicei, pe rădăcini, dar, în cazul anumitor specii, şi la nivelul tulpinilor, fiind un rezultat al unei creşteri tisulare anormale dar limitate, cu organizare armonioasă şi diferenţiată (Mihăescu şi Gavrilă, 1989). In interiorul nodozităţii, bacteroizii fixează azotul molecular care este apoi utilizat de către planta-gazdă.
Formarea nodozităţilor radiculare implică succesiunea unor mecanisme celulare şi moleculare: dediferenţierea celulelor corticale şi stimularea lor mitotică, iniţierea formării nodozităţii prin organizarea unui ţesut meristematic, diferenţierea structurală a ţesuturilor nodozităţii, creşterea şi maturarea structurii nou formate.
Interacţiunea simbiotică debutează odată cu colonizarea, de către bacterie, a suprafeţei rădăcinii şi inducerea răsucirii vârfului părului radicular. Urmează invaginarea pereţilor celulari şi formarea unui cordon de infecţie în interiorul părului radicular. Cordonul de infecţie traversează straturile celulare superficiale, ajungând în zona în care va fi iniţiată formarea nodozităţii, aceasta presupunând activarea procesului mitotic (Gavrilă şi Mihăescu, 1989).
Celulele poliploide încărcate cu bacteriozi se află în zona centrală a nodozităţii. Endopoliploidia care caracterizează nodozităţile leguminoaselor, apare doar în zona de infecţie cu celulele de Rhizobium şi manifestă un gradient distalo-proximal crescând, în raport cu vârful cordonului de infecţie, aşa încât nodozitatea matură posedă o zonă centrală poliploidă, în care celulele sunt încărcate cu bacteroizi. Această zonă este înconjurată de un ţesut alcătuit din celule diploide neinfectate. Celulele încărcate cu bacteroizi au o cantitate de ADN de 4 – 8 ori mai mare în comparaţie cu celulele diploide. Numărul nucleolilor corespunde gradului de ploidie. Celulele zonei meristematice au de 2 – 4 ori mai mult ADN în comparaţie cu celulele cortexului nodozităţii, care sunt diploide şi lipsite de bacteroizi (Mihăescu şi Gavrilă, 1989).
Dezvoltarea celulelor vegetale şi bacteriene trebuie să se desfăşoare coordonat. Procesul nodulării se desfăşoară în câteva faze, succesiunea acestor faze presupunând comunicarea dintre cei doi parteneri. In fiecare etapă a dezvoltării nodozităţii, are loc inducerea, atât în plantă, cât şi în parazitul bacterian, a unor programe genetice specifice (Schultze & Kondorosi, 1998).
Unii compuşi ai plantelor, cum este şi flavonoidul luteolina, induce activarea genelor pentru nodulare, în organismul bacterian. Această activare este exprimată prin producerea de semnale “nod” reprezentate de câteva lipo-chito-polizaharide. Pentru planta gazdă, aceste semnale reprezintă factori externi de creştere care declanşează programul endogen de nodulare.
In timpul invaziei, bacteriile din genul Rhizobium produc exopolizaharide (EPS), lipopolizaharide (LPS) şi polizaharide capsulare (KPS). Aceste polizaharide au câteva funcţii printre care şi cea de comunicare intracelulară şi de protecţie a bacteroizilor faţă de reacţia defensivă a plantei.
4
Aspecte moleculare şi biochimice ale interacţiei gazdă – parazit în cadrul procesului tumorigen la plante
La nivelul ADN-ului bacterian, genele nod sunt organizate în câţiva operoni localizaţi fie pe cromozom, fie în plasmide de dimensiuni mari. Expresia genelor nod este reglată pozitiv de proteina NodD. Interacţiunea proteinei NodD cu flavonoizi specifici ai plantei gazdă reprezintă primul nivel de recunoaştere specifică a gazdei Multe specii de Rhizobium conţin câteva gene nod cu grad înalt de omologie, care conduc la producerea de proteine Nod capabile să interacţioneze cu un spectru mai larg de molecule (flavonoizi) inductoare.
Factorii Nod sunt derivaţi din chitin-oligozaharide în care gruparea N-carbonil a zahărului nonreducător este înlocuită de un lanţ de acizi graşi. Structura lipo-chito-oligozaharidică de bază (LCO) este comună tuturor bacteriilor genului Rhizobium, fiind determinată de genele nod “comune” – nodABC.
Răspunsurile fenotipice majore ale plantei gazdă la semnalele Nod sunt deformarea perilor radiculari, formarea cordonului de preinfecţie şi diviziuni celulare corticale. Aceste răspunsuri sunt însoţite de inducerea genelor exprimate timpuriu în dezvoltarea nodozităţii (gene timpurii ale nodulării). Zonele de diviziune celulară pot cuprinde primordiul nodozităţii sau întreaga nodozitate, depinzând de specia gazdă. Atât diviziunile celulare corticale, cât şi formarea cordonului de preinfecţie par să aibă la origine procese similare de activare celulară. Acest proces este similar cu reiniţierea ciclului celular în celule diferenţiate (Gorenflot, 1990). Cu toate acestea, celulele corticale, în funcţie de poziţia lor în straturile interne sau externe, prezintă potenţialităţi diferite pentru a intra în diviziune. Astfel, există o categorie de celule care parcurg un ciclu celular complet, iar în cazul celulelor care formează punţile citoplasmice, ciclul celular se opreşte în G2.
Modificările în morfologia părului celular ca răspuns la factorii Nod, prezintă anumite specificităţi. Deformarea părului este indusă de reiniţierea diviziunii celulare în acei peri radiculari care şi-au încetat elongarea (creşterea). Este posibil ca sistemele de percepere a semnalelor Nod să fie diferite în diferitele straturi celulare.
Perii radiculari răspund la factorii Nod (care acţionează ca nişte elicitori) printr-o depolarizare rapidă a membranei plasmatice – consecinţa influxului de ioni de Ca 2+ şi a efluxului de ioni de Cl--. Mai mult, a fost observată o alcalinizare extracelulară tranzitorie, dublată de o alcalinizare intracelulară persistentă. Primul eveniment care este semnalat la câteva secunde după acţiunea factorilor Nod, este un influx de ioni de Ca2+, urmat de un eflux de ioni de Cl-, ceea ce produce o depolarizare membranară. Acest proces este contrabalansat de un eflux de K+.
Influxul de Ca2+ are un efect profund asupra creşterii vârfului părului radicular. Procesul este însoţit de schimbări ale dinamicii citoscheletului. Filamentele de actină suferă un proces de fragmentare sub incidenţa factorilor Nod (în urma infecţiei cu Rhizobium). Procese similare au loc în tuburile polinice, unde influxul de Ca2+ induce fragmentarea filamentelor de actină.
Modificările în concentraţia ionilor de Ca2+ intracelular declanşează o cascadă de semnale intracelulare care se finalizează cu exprimarea genelor specifice implicate în programul simbiotic care conduce la dezvoltarea nodozităţii. Diferitele gene timpurii ale nodulării sunt induse de factorii Nod.
Multe gene identificate pe baza inducerii sau amplificării exprimării lor în timpul dezvoltării nodozităţii (genele nodulinice) par să codifice, printre altele, proteine ale pereţilor celulari. Aceasta subliniază importanţa alterărilor biochimice induse la nivelul pereţilor celulari în timpul formării nodozităţii. Astfel de gene codifică pentru proteine bogate în prolină (PRP): Enod2, Enod5, Enod10, Enod11, Enod12, PRP4, pentru extensine, pentru proteine bogate în glicină (GRP) si pentru o peroxidază (gena rip1).
Printre markerii genici ai etapei foarte timpurii a nodulării, se numără enod12 şi rip1. Ambele gene sunt asociate cu stadiul de preinfecţie, având rol în modificările pereţilor celulari, modificări observate în urma infecţiei cu Rhizobium sau în urma interacţiunii cu
5
LIGIA GHEŢEA, MARGARETA DUMITRESCU, NICOLAE TOMA
factorii Nod. Faptul că factorii Nod induc modificări ale pereţilor celulari este susţinut şi de descoperirea şi caracterizarea unei hidrolaze a cărei sinteză se declanşează în urma tratamentului cu factori Nod. Această hidrolază prezintă omologie de secvenţă cu o clasă de glicozil-hidrolaze care acţionează în condiţii normale, asupra componentelor pereţilor celulari.
Competenţa pentru inducerea nodozităţii este determinată de condiţii fiziologice şi de activitatea fitohormonilor.
Genele căii sintetice a fenilpropanoizilor, ca de exemplu, gena pentru chalcon-sintetază, sunt induse în timpul simbiozei, iar factorii Nod măresc producţia de flavonoizi. Deoarece s-a descoperit că factorii Nod acţionează şi ca inhibitori ai transportului de auxină, concluzia a fost că diviziunea celulară indusă de aceştia poate fi cauzată de o perturbare a fluxului de auxină.
Se cunoaşte faptul că Rhizobium are capacitatea de a converti triptofanul la acid indol acetic; cultivate “in vitro”, bacteriile din acest gen produc auxină şi citochinină (Gavrilă şi Mihăescu, 1989).
Mutantele de Rhizobium defective în sinteza de factori Nod pot fi parţial recuperate, în privinţa capacităţii de nodulare, la Medicago sativa, prin introducerea în ADN bacterian, a unei gene care codifică pentru sinteza de citochinină.
In plus, s-a constatat că factorii Nod şi citochininele induc, în mod similar, exprimarea genei enod12A, produsul acesteia stimulând diviziunea celulară la nivelul celulelor corticale.
Etilena afectează negativ formarea nodozităţii. Unele mutante de mazăre, incapabile de nodulare, recâştigă această capacitate în urma acţiunii unor inhibitori ai etilenei. Dimpotrivă, la specia Medicago truncata, există mutanta “sickle” defectivă în sensibilitatea la etilenă, ceea ce conduce la o creştere drastică a numărului de infecţii persistente cu Rhizobium. Acidul 1-aminociclopropan carboxilic (ACC) – precursorul biosintetic al etilenei, supresează dezvoltarea nodozităţii la plantele normale, dar nu şi în cazul mutantei “sickle”. Rezultatele cercetărilor sugerează că etilena joacă un rol în controlul local al infecţiei, prin blocarea procesului infecţios.
3.2 Simbioza – o relaţie armonioasă ?
In contrast cu lupta dintre plante şi patogeni, interacţia simbiotică este mai puţin agresivă, conducând la o asociere a celor două organisme participante. Cu toate acestea, o privire mai atentă asupra răspunsului plantei demonstrează faptul că interacţia nu este chiar atât de armonioasă cum pare la prima vedere, putând apare, în orice stadiu al infecţiei, o respingere a bacteriilor invadatoare (Baron & Zambryski).
In ciuda abilităţii demonstrate de Rhizobium, de a supresa, parţial, răspunsul gazdei, doar un procent mic al infecţiilor se finalizeaza cu succes, conducând la formarea nodozităţilor pline cu bacteroizi.
Inducerea expresiei genelor pentru fenilalanin amonia-liază (PAL) şi chalcon-sintetază (CHS) constituie markeri pentru iniţierea căii fenilpropanoidice ca o componentă a răspunsului plantei la atacul patogenilor. Inducerea acestei enzime a fost detectată în primele stadii ale interacţiei lui Bradyrhizobium japonicum cu soia.
Printre familiile genice ce codifică pentru izoenzimele din categoriile PAL si CHS, diferite subseturi sunt induse atât de către bacterii din genul Rhizobium, cât şi de patogeni propriu-zişi (bacterii, nematode, acarieni, insecte). Un alt aspect interesant a fost descoperirea că gena pentru izoenzima CHS5 de la trifoi poate fi indusă atât prin infecţia cu Rhizobium leguminosarum biovar trifolii, cât şi în urma rănirii.
Poate Rhizobium să supreseze răspunsul defensiv al gazdei ? Ipoteza potrivit căreia o nodulare reuşită depinde de supresarea răspunsului gazdei este susţinută puternic de analiza infecţiilor respinse, ale tipului sălbatic de Rhizobium şi a mutantelor defective în polizaharide
6
Aspecte moleculare şi biochimice ale interacţiei gazdă – parazit în cadrul procesului tumorigen la plante
de suprafaţă celulară. Mutantele ExoB de Bradyrhizobium japonicum au o exopolizaharidă cu structură alterată şi produc nodozităţi la soia, după o oarecare întârziere şi cu eficienţă redusă. In acest caz, în faza timpurie a infecţiei, în exudatele rădăcinii au fost depistate nivele drastic crescute ale fitoalexinei gliceolina (absentă la tipul sălbatic). In final, nodularea apare, dar nodozităţile prezintă caracteristici morfologice şi biochimice specifice, precum expresia crescută a chitinazei, sugerând un răspuns defensiv.
Mutantele de Rhizobium meliloti care au absentă o exopolizaharidă nu pot infecta rădăcinile de alfalfa (lucernă) la primul contact, dar secretă factori Nod şi induc, pe această cale, pseudonoduli care nu conţin bacteroizi. După o infecţie secundară a rădăcinilor, bacteriile mutante sunt înconjurate de pereţi îngroşaţi ai celulelor radiculare, indicând un proces de lignificare a pereţilor celulari. Pereţii celulelor care intră în constituţia pseudonodozităţilor prezintă aspecte biochimice şi citologice caracteristice pentru o reacţie defensivă a gazdei, de exemplu, schimbări în conţinutul depozitelor de fenoli şi caloză.
4. Tumorigeneza indusă de nematodul Meloidogyne incognita
Primele etape ale ciclului de viaţă al nematodului, din momentul ecloziunii, se desfăşoară în sol. După ecloziune, nematozii tineri se deplasează prin pelicula de apă care înveleşte particulele de sol, către rădăcinile tinere ale viitoarelor gazde. Larvele de stadiul 2 perforează pereţii celulari cu stomatostiletul, pătrund în rădăcină şi se deplasează către cilindrul central unde pătrund şi se localizează.
Prin acţiunea unei enzime care este eliberată de către parazit, celulele vegetale care înconjoară nematodul suferă hipertrofie, devenind gigantice şi servind, mai apoi, ca sursă de hrănire pentru parazit. Rezultatul este formarea unei gale caracteristice care înveleşte, în scurt timp, complet parazitul, blocând circulaţia în vasele conducătoare.
Rănirea vârfurilor rădăcinilor tinere constituie, în acest caz, primul pas în procesul de infecţie. Rănirea mecanică induce frecvent dediferenţierea urmată de rediferenţierea celulelor parenchimatice în elemente traheidale, în jurul locului rănit . Aceste elemente traheidale apar ca o consecinţă a întreruperii legăturilor vasculare şi a perturbării transportului hormonal (Fukuda, 1996).
In general, răspunsul plantei la rănire include inducerea unor gene implicate în răspunsul defensiv, codificatoare pentru peroxidază şi lipoxigenază. Unele dintre enzimele induse în urma rănirii funcţionează în sinteza ligninei care contribuie la consolidarea pereţilor celulari afectaţi (Baron & Zambryski, 1995). Inducerea chalcon-sintetazei şi a chalcon-izomerazei indică producerea de fitoalexine (flavonoizi). Rănirea stimulează şi producerea de polifenoloxidază, care conduce la acumularea unor produşi toxici de oxidare a fenolului (de exemplu, a taninurilor). De asemenea, la unele specii de plante, apare sinteza de inhibitori ai proteinazelor, ei contribuind la apărarea plantei împotriva atacului larvelor de insecte, prin blocarea căilor de metabolizare a proteinelor de către parazit.
Studiile noastre asupra galelor induse de nematodul Meloidogyne incognita – care prezintă un spectru foarte larg de gazde (peste 700 de specii aparţinând dicotiledonatelor) – au condus la concluzia potrivit căreia parazitul modifică profund organizarea intracelulară şi cursul proceselor metabolice la nivelul ţesutului infectat (Gheţea şi colab. - material în curs de publicare).
Astfel, în celulele din vecinătatea cilindrului central, unde, dealtfel, se găseşte localizat parazitul, ciclul eumitotic devine unul endomitotic. Consecinţa acestui fapt este că aceste celule devin poliploide, iar prin mărirea proporţională a volumului lor citoplasmic, ele devin celule gigantice. Nivelele înalte de endopoliploidie reprezintă, dealtfel, o caracteristică foarte
7
LIGIA GHEŢEA, MARGARETA DUMITRESCU, NICOLAE TOMA
comună a ţesutului galar, dată fiind frecvenţa cu care apar astfel de nuclei endopoliploizi în gale produse pe multe specii de plante.
Pereţii celulari suferă importante modificări biochimice şi structurale. Structurile multinucleare care se remarcă în urma analizei ţesutului galar, sunt rezultatul unei profunde degradări a proceselor celulare generale, degradare care conduce la diviziunea amitotică a nucleilor înalt endopoliploizi, urmată, uneori, de liza pereţilor celulari şi de fuziuni celulare. In stadiile finale ale tumorigenezei, la nivelul nucleilor de dimensiuni variabile, rezultaţi prin diviziune amitotică, apare fenomenul de inactivare prin hipercondensarea cromatinei. Aspectul acestor nuclei este picnotic.
Complementul organelar apare, de asemenea, alterat, atât în privinţa numărului, cât şi în cea a structurii organitelor.
Biosinteza auxinei şi transportul hormonului de-a lungul rădăcinilor tinere sunt perturbate prin prezenţa parazitului în ţesutul plantei, acesta, prin activitatea sa, inducând şi modulând un model nou de diferenţiere celulară la nivelul rădăcinilor. Se cunoaşte faptul că, în galele tinere, concentraţia auxinei este semnificativ crescută comparativ cu ţesutul normal diferenţiat.
Stadiul final al tumorigenezei este caracterizat de îngroşarea prin lignificare, a pereţilor celulari şi de vacuolizarea celulelor transformate.
Galele bătrâne apar lignificate şi cu arii necrotice extinse, mimând un răspuns de hipersensibilitate. Care ar putea fi explicaţia ? Lupta care se dă între nematod şi planta gazdă, pe tot parcursul procesului de formare a tumorii, este intensă. Ca şi în cazul lui Rhizobium, în galele în creştere, parazitul reuşeşte să diminueze răspunsul defensiv al plantei gazdă. Deşi diminuate de către parazit, mecanismele defensive ale plantei sunt active (sau activate după primele stadii ale infecţiei). Ca şi în cazul formării nodozităţilor (Schultze & Kondorosi, 1998), în tumorigeneza indusă de nematod, schimbările în concentraţia ionului Ca2+
intracelular se constituie într-un semnal care declanşează exprimarea genelor implicate în mecanismele defensive ale plantei.
Interacţiunea prelungită a nematodului şi a metaboliţilor săi (cu rol de elicitori) cu ţesuturile radiculare conduce la o alcalinizare extracelulară. Unul dintre efectele acestei alcalinizări este favorizarea reacţiilor oxidative în urma cărora sunt generate enzimatic specii active de oxigen, prin acţiunea unor peroxidaze extracelulare sau enzime oxidative legate de membrană (Bolwell, 1995). Producerea tranzitorie de apă oxigenată la suprafaţa celulei poate fi considerată analogă reacţiei oxidative din timpul activării macrofagice, la nivelul sistemului imunitar. Producerea de apă oxigenată cauzează formarea rapidă de legături încrucişate (crosslinking) între proteinele din pereţii celulari, la fel ca şi în cazul rănirii ţesuturilor vegetale. Efectul este acela de localizare a parazitului în interiorul ţesutului (Baron & Zambryski, 1995).
Lignificarea pereţilor celulari, care apare şi în cazul tumorigenezei produsă de nematod, reprezintă o consecinţă a inducerii enzimelor căii fenilpropanoidice, ca o componentă a răspunsului defensiv al plantei la invazia nematozilor.
Cercetările pe care le-am efectuat asupra activităţii peroxidazice din ţesutul normal şi tumoral (Gheţea şi colab. – material în curs de publicare), au fost remarcate schimbări în activitatea izoperoxidazelor, în cursul procesului tumorigen. Astfel, s-a observat faptul că ţesutul galar prezintă, în etape succesive de formare a galei, similarităţi ale activităţii izoperoxidazelor cu diferite ţesuturi ale plantei, în funcţie de stadiul de diferenţiere a galei. Astfel, galele tinere prezintă activităţi ale izoperoxidazelor similare cu cele ale frunzei, în timp ce galele bătrâne prezintă activităţi izoenzimatice comparabile cu cele ale rădăcinii sănătoase. In stadiile timpurii ale dezvoltării galei, parazitul reuşeşte să reducă drastic activitatea majorităţii izoperoxidazelor, pe când, în galele bătrâne, se poate constata o revenire a activităţii peroxidazice, aproape de parametrii iniţiali, caracteristici ţesutului sănătos.
8
Aspecte moleculare şi biochimice ale interacţiei gazdă – parazit în cadrul procesului tumorigen la plante
Potrivit datelor din literatură, modificarea spectrului izoperoxidazic în procesul de formare a galelor, reprezintă, mai curând, o reflectare a plasticităţii mecanismelor genetice (de inducere / represare a expresiei genelor pentru diferitele izoperoxidaze), modificările epigenetice, în măsura în care se realizează, având un rol secundar.
Concluzii
Tumorile la plante constituie rezultatul unor mecanisme deosebit de complexe, care antrenează modificări ale expresiei genice în ţesutul vegetal afectat, inducerea exprimării unor gene care aparţin arsenalului de apărare al plantei, producerea unor metaboliţi care, fie au efect toxic asupra parazitului, fie consolidează structurile celulare, pentru a limita efectele nocive ale agentului agresor.
Sub influenţa metaboliţilor produşi şi eliberaţi în ţesutul atacat, de către parazit, are loc o reorganizare celulară şi tisulară, care presupune o serie de procese : dediferenţiere/rediferenţiere celulară, hiperplazie/hipertrofie celulară, endoreduplicări la nivelul nucleilor celulelor care suferă hipertrofiere. Această reorganizare celulară şi tisulară conduce, în final, la edificarea unei neoformaţiuni cu caracteristici morfo-anatomice şi funcţionale diferite de cele ale ţesutului sănătos, netransformat.
Edificarea tumorii vegetale este, în egală măsură, un efect al acţiunii parazitului şi al strategiei de apărare a plantei.
In acest sens, este impresionant arsenalul de mecanisme de care dispune planta şi pe care le activează, în mod direct sau indirect, parazitul, în momentul atacului. Este o reacţie în cascadă care, uneori, conduce la respingerea categorică a parazitului (reacţia de hipersensibilitate), alteori finalizându-se cu formarea unor excrescenţe (fie că ele se numesc nodozităţi, fie că se numesc gale, în fapt, ambele sunt neoformaţiuni proliferative localizate), care realizează o izolare a parazitului şi o localizare a efectelor acţiunii sale la nivelul plantei.
La ora actuală, se fac corelaţii funcţionale între componente ale aparatului de apărare la plante şi la animale. Astfel, acidul jasmonic este comparat cu prostaglandinele (substanţe asemănătoare hormonilor de la mamifere), fitoalexinele sunt considerate analogi ai anticorpilor din organismele animale (însă spre deosebire de aceştia din urmă, ele nu prezintă specificitate); din plante infectate cu virusuri, au fost izolaţi interferoni, cu acelaşi rol în celula vegetală ca şi în cea animală.
Cercetările legate de mecanismele de apărare la plante sunt în plină desfăşurare, nefiind exclus ca, în viitor, să se descopere noi elemente de asemănare între mecanismele defensive dezvoltate de plante şi cele elaborate de animale. Chiar dacă asemănările nu merg până la detaliu, importantă este semnificaţia funcţională, care este aceeaşi la ambele regnuri.
Bibliografie
1. Baron C., Zambryski – The Plant Response in Pathogenesis, Symbiosis and Wounding : Variations on a Common Theme ? Annual Review of Genetics 29 : 107 – 129, 1995.
2. Bolwell G.P. – Cyclic AMP, the reluctant messenger in plants – TIBS 2, 492-494, 1995
3. Clarke H.R.G., Leigh J.A., Douglas C.J. – Molecular signals in the interaction between plants and microbes – Cell, Vol.71, 1992, pp.191 – 199
9
LIGIA GHEŢEA, MARGARETA DUMITRESCU, NICOLAE TOMA
4. D’Amato F. – Chromosome Endoreduplication in Plant Tissue Development and Function –John Wiley & sons, 1998, pp. 153-166.
5. Dumitrescu M., Vlãdescu – Izoenzimele plantelor – Editura Ceres, Bucureşti, 1973, pag.105 – 123.
6. Feys B.J., Parker J.E. – Interplay of signaling pathways in plant disease resistance – Trends in Genetics Vol.16, No.10, Oct.2000, pp.449 – 455.
7. Fukuda Hiroo – Xylogenesis: Initiation, progression and cell death – Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol., 1996, 47 : 299 – 325
