INTRODUCERE

Din vremuri memorabile, omul a cunoscut fructele oferite de natură, pe care le-a

folosit pentru hrană. Fructele adunate din pomii și arbuștii crescuți de la sine ( în păduri,zone

necultivate) reprezintă o producție fără intervenția omului.

Dându-și seama de faptul că deși natura este foarte generoasă, dărnicia ei nu este

constantă și continuă, astfel că omul a încetat să mai privească fructele care cresc fără

intervenția lui, ca ceva lipsit de importanță. În urma acestei constatări, omul a început să

observe și să fie izbit de regularitatea unor manifestări vitale ca: înmugurirea, înfrunzirea,

apariția fructelor, iar maturarea nu numai că l-a impresionat plăcut prin diversitatea de

forme, mărime și nuanțe,ci l-a satisfăcut și prin armonia așa de variată a gustului și aromelor.

Fructele au o importanță în alimentația omului, atât în stare proaspătă cât și în formă

procesată, reprezentând aproximativ 15 % din necesarul energetic al omului.

Un studiu recent a arătat că doar un sfert din populația globului mănâncă două, trei

fructe pe zi, dar este mai simplu ca oamenii să bea câteva pahare de nectar/suc de fructe ce

va reprezenta o creștere considerabilă de nutrienți în mâncarea zilnică. Nu sunt mulți oameni

1

care reușesc să mănânce un kilogram de fructe pe zi, dar oricine poate să adauge în

programul zilnic chiar trei litri de suc natural de fructe.

Materia primă folosită la obţinerea sucurilor cu pulpă trebuie să fie de bună calitate,

procesul tehnologic neputând înlocui defectele de calitate ale acesteia.

Fructele au, în general, un înveliş exterior “epicarpul”, unul inferior “endocarpul”,

iar între ele “mezocarpul”.

Epicarpul este pieliţa sau coaja fructului, endocarpul uneori se poate transforma în

casă seminală sau se lignifică sub formă de sâmbure.

Mezacarpul prin multiplicarea celulelor se tansformă într-o masă cărnoasă al cărui suc

conţine o importantă cantitate de zahăr, acizi, aromă şi gust, specific speciei şi soiului.

În cursul dezvoltării, fructele trec prin mai multe faze sau stadii de maturitate.

Aprecierea stadiului de maturitate se face în funcţie de schimbarea coloraţiei epidermei,

pierderea fermităţii pulpei, apariţia maximului de arome, modificarea compoziţiei chimice,

etc. înregistrându-se, în general un conţinut maxim de zahăr.

În ceea ce priveşte evoluţia maturităţii unii pomicultorii apreciază trei stadii de

maturitate:

- stadiul de maturitate aparentă, când unele fructe pot fii colorate în întregime, dând impresia

că sunt coapte, fără ca să atingă gradul de maturitate de consum (cazul merelor);

- stadiul de maturitate fiziologică, atunci când seminţele pot reproduce planta;

- stadiul de maturitate reală care corespunde cu maturitatea de consum (cazul strugurilor).

Important în obţinera produselor din fructe de calitate superioară este şi modul de

recoltare şi transport al fructelor. Metoda de recoltare poate avea o deosebită influenţă asupra

traumatizării materiei prime. Ambalajele în care se face transportul acestora, trebuie să fie

dimensionate în funcţie de rezistenţa acestora. Păstrarea fructelor trebuie să se facă în

depozite bine aerisite, curate ,ferite de praf, de influenţa razelor solare,la temperaturi de

maximum 18ºC.

1.2 SUCURILE DE FRUCTE

2

Sucurile de fructe sunt băuturile obţinute din diferite specii de fructe, coapte şi

sănătoase, printr-un procedeu mecanic (presare, centrifugare) sau prin difuzie şi care sunt

conservate prin diferite procedee (concentrare, conservare chimică şi pasteurizare). Sunt

produse la care principalul component este reprezentat de apă, care pentru a fi mai agreabilă

şi răcoritoare se amestecă cu substanţe care îi imprimă gust şi aromă plăcută, culoare

frumoasă şi cel mai adesea sunt impregnate cu dioxid de carbon. În ultimul timp în industria

de profil s-a trecut şi la introducerea în băuturi a unor substanţe necesare pentru om :

vitamine, fier , lecitină, miere de albină, cofeină, fosfor, sodiu, potasiu, etc.

Pionerii sucurilor de fructe au răspândit de la începutul secolului nostru gândul

valorificării fructelor fără fermentaţie, au optat pentru ''fructe lichide'' şi au dezvoltat

procedee de producţie şi utilaje pentru punerea în practică. Băuturile naturale din fructe se

obţin direct din fructe, iar dintre acestea se amintesc : sucuri de fructe, siropuri, extractele şi

apele de fructe naturale cu gaz.

Fabricarea sucurilor de fructe s-a dezvoltat în două direcţii:

- sucuri limpezi (fără particule în suspensie), care datorită eliminării suspensiilor au un grad

mare de transparenţă;

- sucurile cu pulpă (cu particule în suspensie), la care trebuie asigurată stabilitatea

suspensiilor.

1.2.1 Caracteristicile sucurilor

Sucurile trebuie să aibă următoarele caracteristici :

- aspect de lichid omogen, limpede sau opalescent, fără sedimente sau impurităţi în suspensie

cu culoare specifică materiilor prime folosite ;

- consecinţa fluidă;

- miros plăcut, aromat, caracteristic fructelor fără miros de fermentat, de mucegai;

- gust plăcut, dulce sau dulce-acrişor, uşor acidulat în cazul celor cu CO2, caracteristic

fructelor, plantelor sau substanţelor aromatizate folosite, fără gust străin;

- aciditatea titrabilă, minimum 1 (exprimată cu acid citric).

Băuturile răcoritoare îmbogăţite cu vitamina C trebuie să aibă minimum 150 mg vit:

C/l. Băuturile răcoritoare hipocalorice trebuie să aibă substanţa uscată de maximum 3º

3

refractometrice (cele fără adaus de fructe) şi maximum 5º refractometrice cele cu adaus de

suc de fructe.

Apa, principala componentă a băuturilor răcoritoare, se poate cerceta din două puncte

de vedere : din punct de vedere sanitar-igienic, spre a stabili dacă este proprie pentru

consumul direct al populaţiei şi din punct de vedere tehnic, spre a constata în ce măsură, este

bună pentru uzul intreprinderilor alimentare.

La prepararea sucurilor din diferite specii de fructe, în toate cazurile, se porneşte de la

fructe proaspete şi prin aplicarea mai multor faze de prelucrare se ajunge în final la sucul de

fructe.

Pentru obţinerea sucurilor valoroase, gustoase şi sănătoase şi a unei durabilităţi sigure,

trebuie ca în procesul tehnologic să se respecte anumite principii:

- să nu se folosească fructe stricate;

- să se lucreze cât mai rapid, influenţele căldurii să fie reduse cât mai mult;

- să fie evitat contactul fructelor cu metalul;

- să fie respectate strict condiţiile de igienă;

- să se evite temperaturile ridicate şi timpul îndelungat al menţinerii temperaturilor ridicate.

1.2.2 Microorganismele prezente în sucuri

În condiţii de lucru obişnuite, sucurile în general ajung să conţină un număr suficient

de mare de microorganisme provenite din aer, de pe unele , care să le fermenteze. În unele

cazuri fermentarea este alcoolică. Dintre microorganisme predomină bacilii sporulaţi gram-

pozitivi, bacteriile lactice, coci, drojdiile care fermentează, respectiv transformă zaharurile

în alcool şi bioxid de carbon şi eventual mucegaiurile.

În cazul producerii sucurilor de fructe, toate drojdiile sunt dăunătoare, determinând o

fermentaţie care începe în fructele zdrobite sau în suc şi provoacă, pe lângă pierderea în

zaharuri, formarea de alcooli şi modificări nedorite ale mirosului şi gustului. În timpul

pasteurizării pot fi distruse toate drojdiile care trăiesc în sucuri, dar cu cât numărul lor iniţial

este mai redus, cu atât mai scurt va fi tratamentul termic necesar pentru a le distruge total.

De pe coaja fructelor unde sunt întâlnite drojdii kahm, acestea ajung în sucuri, unde trăiesc şi

se multiplică, formând la suprafaţă o pojghiţă numită strat kahm.

Mucegaiurile prezente în sucuri provoacă acestora un gust şi miros neplăcut de

mucegai. La fel ca şi în fructele năpădite de mucegaiuri şi în sucuri, acestea pot forma

4

produşi metabolici proprii, toxinogeni, extrem de periculoşi, făcând parte din categoria

micotoxinelor. Cea mai importantă măsură care poate fi luată împotriva mucegaiurilor, este

închiderea etanşă a sucurilor, deoarece ciupercile sunt dependente de oxigen.

În timpul procesului tehnologic există multe posibilităţi de contaminare de la

materiile prime, utilaje, recipiente, ocazie cu care ajung în produsul finit bacterii, drojdii şi

mucegaiuri.

Pe lângă microorganismele care produc alterări ale sucurilor acestea pot fi

contaminate şi cu microorganisme patogene. Deşi viabilitatea acestora este redusă,

reprezintă un potenţial patogen din cauza consumării acestui tip de băuturi imediat după

preparare.

S-a demonstrat experimental că in băuturile gazoase Salmonela Typhi şi

S.paratthyphi au o viabilitate de 2-3 zile. Când pH - ul băuturilor este de 3,3 şi 4,2 , bacteriile

patogene sunt distruse in primele 24 ore.

Tot experimental a fost demonstrată şi acţiunea bactericidă a sucurilor naturale de

fructe asupra unor germeni ca: Bacteruim prodigiosus , Proteus vulgaris , Escherichia coli ,

Bacterium pyocyaneum , Pseudomonas fluorescens liquefaciens , Micrococcus. Prin

neutralizarea sucurilor , proprietăţile bactericide se reduc brusc. În cazul băuturilor

carbogazoase , efectul bactericid este exercitat atât de bioxidul de carbon cât si de zaharină.

A fost urmărită acţiunea bioxidului de carbon din ape şi sucuri asupra viabilităţii

microorganismelor şi s-a constatat că la temperatura de 19-23ºC , este mai moderată decât la

1ºC. În băuturile care conţin 0,094 % sau mai mult acid citric sau lactic , are loc distrugerea

rapidă a microorganismelor contaminante. Salmonella typhi şi Salmonella paratyphi sunt

mai rapid distruse de bioxidul de carbon decât Escherichia coli. Sporii de Bacillus

mesentericus şi cei de Clostridium perfingens sunt mai rezistenţi la adausul de CO2 ,

supravieţuind timp de o lună , fără ca numărul lor să se reducă.

Se observă că CO2 are acţiune diferită asupra diferitelor tipuri de microorganisme;

astfel Proteus vulgaris , Corynebacterium diphetriae , Salmonella pullorum , Salmonella

gallinarum , Salmonella typhi sunt repede inhibate în dezvoltare.

Oxidarea sucurilor are loc pe cale enzimatică sau neenzimatică.

Oxidarea enzimatică se datorează enzimelor naturale din fructe care ajung şi în

sucuri. Acesta enzime atacă taninul , polifenolii care ajung să fie transformaţi în substanţe de

culoare brună , nedorită. Prezenţa vitaminei C în sucuri împiedică transformarea

polifenolilor în substanţe de culoare brună. Aşa se şi explică folosirea acesteia la prepararea

5

unor sucuri. S-a arătat că tot prin procesele de oxidare se distrug multe substanţe care

imprimă aroma şi fructuozitatea specifică sucurilor.

Oxidările neenzimatice ce au loc în sucuri şi care de asemenea produc modificări ale

culorii se datorează unor reacţii de oxidare accelerată de prezenţa sărurilor de fier şi cupru.

Aceste săruri pot ajunge în sucuri în urma contactului sucului cu obiecte şi utilaje

confecţionate din fier sau cupru pe care acizii din suc le atacă uşor.

Modificarea culorii , mai exact închiderea culorii sucurilor mai are loc şi în urma

reacţiei dintre zaharuri si substanţele proteice , substanţe care se află în mod natural în suc.

Un alt factor important este menţinerea calităţii zahărului. el trebuie păstrat in

încăperi

Din căile de reducere a efectelor nedorite se pot aplica cu succes următoarele :

- reducerea duratei de timp la prelucrare ;

- diminuarea numărului de microorganisme ce ajung în sucuri prin spălarea fructelor,

curăţarea utilajelor şi în general păstrarea unor condiţii severe de igienă;

- inactivarea enzimelor şi microorganismelor prin procedeul tratării termice;

- folosirea utilajelor confecţionate din materiale rezistente la acizii din sucuri, cum sunt

lemnul, plasticul alimentar, oţelul inoxidabil .

Sucurile de fructe sunt produse lichide, nealcoolice, cu grad diferit de claritate şi

vâscozitate, obţinute prin presarea sau mărunţirea fină a fructelor, cu sau fără adus de zahăr

sau dioxid de carbon. Pentru ţara noastră, pornind de la disponibilul de fructe, cel mai indicat

obiect de studiu îl constituie merele, aflate în cantităţi mai mari decât oricare alt tip de fruct.

Pentru proprietăţile sucului obţinut din fructe sunt importante caracteristicile materiei

prime, deci calitatea ei. La aprecierea calităţii merelor în scopul obţinerii sucului de mere

prezintă iportanţă atât factorii economici de prelucrare tehnologică cât şi factorii

organoleptici şi proprietăţile fructelor.

Sucurile naturale conţin principiile active prezente în materia primă, principii benefice

organismului uman, de aceea ele s-au impus pe piaţă ( datorită proprietăţilor lor

organoleptice şi a celor nutritive).

În industria bauturilor răcoritoare, calitatea microbiologică și igienică, inclusiv

stabilitatea biologică a produselor, sunt criterii importante de performanța. Motivul: câțiva

microbi sunt deseori suficienți pentru a altera cantitați mari de bautură. Cu toate ca progresul

tehnologic rapid a redus riscul de contaminare cu microbi alteranți, problema

6

microorganismelor a căpatat noi dimensiuni ca rezultat al cantitaților uriașe posibile de

produs în prezent.

Controlul calității la îmbuteliere/umplere, în ceea ce privește stabilitatea chimica și

mai ales cea biologică, trebuie adaptate la aceasta evoluție prin metode moderne de

verificare.

2. METODE DE DETERMINARE A MICROORGANISMELOR DIN

SUCURILE DE FRUCTE

2.1 DETERMINAREANUMĂRULUI TOTAL DE GERMENI AEROBI DIN

PRODUSELE ALIMENTARE (NTG)

Stabileşte prezenţa sau absenţa de microorganisme aerobe în produsele alimentare

cercetate (sucul de fructe) prin metoda numărării coloniilor la temperatura de 30o C. în

vederea stopării vinderii produsului, acestea fiind un pericol pentru sănătatea

consumatorului în caz de contaminare.

Principiul metodei -însămânţarea în profunzime a unui mediu solid turnat în două

cutii Petri cu o cantitate determinată de eşantion pentru analiză dacă produsul care se

examinează este lichid, în cazul acesta sucul din fructe.

Însămânţarea se face prin înglobare în mediul de cultură solid a unei serii de diluţii

decimale în cutii Petri prin încorporare după solidificarea mediului.

Incubarea cutiilor Petri se realizează timp de 72 de ore la temperatura de 30oC, în

condiţii de aerobioză

Eşantionarea - trebuie să se efectueze conform standardului internaţional specific al

produsului respectiv

Se prepară atâtea diluţii de lucru încât într-o cutie Petri să se obţină cel mult 300 de

colonii. Pentru a se evita lezarea microorganismelor datorită schimbărilor bruşte de

temperatură, soluţia de diluare trebuie să albă aproximativ aceeaşi temperatură cu proba,

dacă nu există alte prescripţii.

7

Reguli de procedură

Pentru a obţine o cultură pură de germeni este necesar ca materialul de laborator folosit

(recipiente, instrumente, sticlării) să fie steril. Sticlăria întrebuinţată este sterilizată la etuvă

la 180oC timp de 30 minute, iar mediile sterilizate la 121oC timp de 30 minute. Pregătirea

materialului de sterilizat: spălarea şi sterilizarea sticlăriei se face respectând următoarele

reguli: Spălarea sticlăriei cu apă cu detergent, apoi limpezirea la jet continuu de apă, după

care spălarea cu apă distilată; Punerea de dopuri de vată cu tifon, învelirea cu hârtie a gâtului

eprubetelor sau baloanelor; Introducerea în etuvă pentru 30 de minute la 121oC

Pregătirea eşantionului pentru analiză - Se prepară atâtea diluţii de lucru încât într-o cutie

Petri să se obţină cel mult 300 de colonii. Pentru a se evita lezarea microorganismelor

datorită schimbărilor bruşte de temperatură, soluţia de diluare trebuie să albă aproximativ

aceeaşi temperatură cu proba, dacă nu există alte prescripţii.

Pentru lapte şi produse lactate, alte lichide – se agită energic eşantionul de analizat

pentru a asigura o repartizare uniformă a microorganismelor răsturnând rapid de 25 de ori

recipientul cu eşantion. Trebuie evitată formarea spumei iar cea formată trebuie dispersată.

Intervalul dintre omogenizarea eşantionului şi prelevarea probei necesare analizei nu trebuie

să depăşească 3 minute.

Modul de lucru

Pregătirea eşantionului pentru analiză şi a diluţiei iniţiale

Cu o nouă pipetă sterilă se introduce 1 ml din soluţia iniţială într-o eprubetă care conţine 9

ml de soluţie diluare sterilă. Pipeta se schimbă pentru fiecare diluţie.

Diluţii decimale următoare - prin operaţia de diluţie în tuburile cu diluţii se vor obţine

cantităţile de probă ilustrate în tabel, din care reiese că între două diluţii consecutive,

diferenţa de concentraţie este de 10 ori (diluţii decimale):

Nr. tub 1 2 3 4

Diluţia 1/10 x) 1/100 1/1000 1/10000

Cantitate (g)

sau volum (ml)

0,1 0,01 0,001 0,0001

8

Sau Sau Sau Sau

Din proba iniţială pe ml

diluţie xx)

10-1 10-2 10-3 10-4

x) în cazul produselor solide sau semi-solide această diluţie se află în recipientul

omogenizatorului sau în mojar;

xx) în cazul însămânţării a 1 ml produse lichide sau 1 g produse solide sau semi-

solide (10 ml diluţie 10-1) această cantitate se notează cu 10-0.

Însămânţare şi incubare

1. Se iau două cutii Petri în care se introduce cu o pipetă sterilă câte 1 ml eşantion de analizat

dacă produsul este lichid sau câte 1 ml din diluţie iniţială a produselor solide şi semi-solide.

Pe fiecare cutie se notează numărul probei, diluţia şi data.Se iau alte două cutii Petri sterile.

Cu o nouă pipetă sterilă se introduce în fiecare cutie câte 1 ml din prima diluţie decimală a

eşantionului de analizat (10-1), dacă produsul este lichid sau câte 1 ml din prima diluţie

decimală a suspensiei iniţiale (10-2) în cazul altor produse. Se repetă aceste operaţii cu

diluţiile următoare folosind câte o nouă pipetă sterilă pentru fiecare diluţie decimală.

2. Se toarnă în fiecare cutie Petri în care s-a depus inoculul cca 15 ml mediu agar nutritiv sau

geloză albă la 45+-1oC. Timpul care se scurge între sfârşitul preparării diluţiei iniţiale (sau a

diluţiei 10-1 în cazul unui produs lichid) şi momentul în care diluţiile vin în contact cu

mediul de cultură nu trebuie să depăşească 15 minute. Se amestecă cu grijă inoculul cu

mediul de cultură şi se lasă să se solidifice punând cutiile Petri pe o suprafaţă rece şi

orizontală.

3. După solidificarea completă şi numai în cazul în care se bănuieşte că eşantionul de analizat

conţine microorganisme ale căror colonii ar putea invada suprafaţa mediilor, se toarnă pe

suprafaţa mediului însămânţat 4 ml geloză albă la 45oC. Se lasă să se solidifice aşa cum s-a

descris mai sus. Această operaţie, dacă a fost efectuată trebuie menţionată în buletinul de

analiză.

4. Se incubează cutiile Petri cu capacul în jos. Nu trebuie puse mai mult de 6 cutii una peste

alta. Incubarea se face la 30+-1oC timp de 72+

-2 de ore.

9

Interpretarea

După expirarea perioadei de incubare specificată se procedează la numărarea coloniilor din

fiecare cutie Petri care conţine cel mult 300 de colonii.

Calculul

Se reţin cutiile care conţin de la 15 la 300 de colonii la nivelul a două diluţii succesive.

Exprimarea rezultatelor

Pentru numărătoare se utilizează cutiile ce conţin cel mult 300 de colonii şi cel puţin

15 colonii. Numărul de microorganisme pe ml sau gram de produs, N, se calculează, ca

medie ponderată cu următoarea formulă:

C

N = ------------------------

(n1 + 0,1 n2) x d

unde; C – suma coloniilor numărate în toate cutiile reţinute

n1 – numărul cutiilor reţinute la prima diluţie

n2 - numărul cutiilor reţinute la adoua diluţie

d – factorul de diluţie corespunzător primei diluţii

Rezultatele calculate se rotunjesc la două cifre semnificative. Ca rezultat se ia

numărul de microorganisme pe ml sau pe gram de eşantion exprimat printr-un număr cuprins

între 1,0 şi 9,9 x 10x unde x este puterea atribuită lui 10.

Nici o colonie - dacă cele două cutii corespunzătoare eşantionului de analizat

(produse lichide) sau diluţiei iniţiale (alte produse) nu conţin nici o colonie rezultatul se dă

sub forma: mai mic decât limita minimă admisă, raportându-ne la prevederile legislaţiei în

vigoare ( ex. Pentru laptele materie primă Directiva UE nr. 92/46 prevede limita de 100.000

UFC – unităţi formatoare de colonii)

10

Fidelitate - din considerente de ordin exclusiv statistic, în 95% din cazuri limitele de

încredre ale acestei metode variază de la 12% la 37%. În practică se pot costata variaţii şi

mai mari mai ales între rezultatele obţinute de microbiologi diferiţi.

2.2 DETERMINAREA BACTERIILOR COLIFORME DINTR-UN PRODUS

ALIMENTAR - SUCUL DE FRUCTE

Pentru a reflecta calitatea microbiologică a produselor alimentare în timpul fabricaţiei,

în timpul conservării, cât şi pentru a asigura protecţia faţă de microorganismele patogene

transmisibile prin alimente, se efectuează analize microbiologice în scopul de a garanta

siguranţa igienei pentru consum.

Bacteriile coliforme fac parte din categoria microorganismelor indicatori igienico-

sanitari, fiind bacterii Gram negative nesporulate, aerobe sau facultativ anaerobe, ce pot să

se înmulţească în prezenţa sărurilor biliare, capabile de a fermenta lactoza cu producere de

gaze.

Principiul metodei: Metoda pentru determinarea bacteriilor coliforme include teste

prezumptive şi de confirmare, bazate pe capacitatea bacteriilor coliforme de a fermenta

lactoza cu producere de acid lactic, CO2 şi H2, în timp de 48 ore la 370C.

Testul prezumptiv constă în inocularea probei în mediul nutritiv de îmbogăţire cu

lactoză, favorabil atât coliformilor cât şi altor bacterii capabile să folosească lactoza drept

sursă de carbon. Aprecierea probelor pozitive se face fie în funcţie de acumularea de gaze în

tubul Durham (plutitor), fie ca urmare a modificării pH-ului datorită acumulării de acizi.

Testul de confirmare constă din inocularea culturilor din eprubetele pozitive ale

testului prezumptiv, pe medii selective care inhibă dezvoltarea bacteriilor însoţitoare şi

evidenţiază bacteriile coliforme.

Materiale utilizate:

- proba de analizat (apă, sucuri de fructe, carne tocată, produse lactate etc)

11

- eprubete în care a fost introdus tubul Durham

- bec de gaz

- termostat

- stativ pentru eprubete

- mediul pentru testul prezumptiv: bulion lactozat - peptonă ………..10g

- NaCl……………..5g

- extract de carne….3g

- lactoză …………..5g

- apă dist. ……….1000ml

sau mediu Mac Conkey (conform cataloagelor de medii de

cultură)

- mediu pentru testul de confirmare - bulion bilă lactoză verde briliant (BLBV) sau

- bulion E.C. (conform cataloagelor)

Mod de lucru: Mediile lichide de cultură se introduc în eprubetele ce conţin tuburile

Durham răsturnate, astfel încât să nu rămână aer în acestea, în volum de aproximativ 10 ml,

în funcţie de grosimea eprubetei. Se sterilizează prin autoclavare, după indicaţiile de pe

flaconul cu mediu deshidratat.

Din proba de analizat şi din diluţii decimale succesive se inoculează câte 1 ml în câte

3 eprubete cu mediu pentru testul prezumptiv (ce conţin tuburile Durham inversate) şi se

incubează 24 - 48 ore la 370C, după care se citesc rezultatele, conform tabelului de mai sus.

Se consideră pozitive eprubetele în care se înregistrează tulburarea mediului de cultură,

acumulare de gaz în plutitor (mai mult de 1/3 din volum) şi, unde este cazul, virarea

indicatorului de pH.

Pentru testul de confirmare, din eprubetele pozitive se recoltează câte o ansă (fir cu

buclă) şi se face inocularea în mediul pentru confirmare. Se termostatează 48 ore la 370C, se

citesc rezultatele.

12

După înmulţirea numărului citit în tabel cu factorul de diluţie, se obţine numărul cel

mai probabil de coliformi /g sau ml probă de analizat (MPN = most probable number).

2.3 DETERMINAREA STAFILOCOCULUI (AUREUS) COAGULAZĂ

POZITIV DIN SUCUL DE FRUCTE

Metoda stabileşte prezenţa sau absenţa unei încărcături bacteriene stafilococ (aureus)

coagulază pozitiv în produsele alimentare cercetate.

Principiul metodei

Însămânţare în suprafaţa unui mediu selectiv solid, turnat în două serii de plăci Petri cu o

cantitate determinată din eşantionul de analizat dacă produsul este lichid sau din suspensia

mamă în cazul altor produse. În aceleaşi condiţii se însămânţează şi diluţiile decimale

obţinute din eşantionul de analizat sau din suspensia mamă în prealabil însămânţate într-un

mediu de îmbogăţire (chapman lichid);

Incubarea acestor plăci timp de 24 - 48 de h la 35oC sau 37oC;

Calculul numărului de stafilococcus aureus pe ml sau pe gram de eşantion pornind de la

numărul de colonii caracteristice şi/sau necaracteristice care se obţin în plăcile alese, la

nivelurile de diluţie care dau rezultate semnificative şi care se confirmă prin proba

coagulazei.

Soluții de diluare și medii de cultură

Soluţii de diluare de utilizare generală

Soluţie salină sterilă

Soluţii de utilizare specială

13

Bulion hipersalin cu manită şi indicator (chapman lichid),agar hipersalin cu manită şi

indicator (chapman solid), plasmă citratată de om sau de iepure, bulion de inimă de creier

Repartizarea, sterilizarea şi păstrarea soluţiilor de diluare

Se repartizează soluţiile de diluare pentru diluţiile iniţiale în flacoane sau sticle iar

pentru diluţiie următoare în eprubete sau sticle. Cantităţile trebuie astfel repartizate, astfel

încât după sterilizare fiecare flacon sau sticlă să conţină 90 ml soluţie de diluare sau un

multiplu de 9 ml. Eprubetele, flacoanele sau sticlele trebuie închise cu dopuri. Sterilizarea

trebuie făcută în autoclav la 121+-1oC timp de 15 minute (un timp mai lung poate fi necesar

pentru volume mai mari). Dacă soluţiile de diluare nu sunt folosite imediat, ele trebuie

păstrate la întuneric între 0-5oC maxim o lună pentru evitarea oricărei modificări a volumului

sau compoziţiei lor.

Eșantionare

Eşantionarea se efectuează conform standardului specific al produsului de analizat.

Dacă nu există standard specific se recomandă ca părţile interesate să se pună de acord

asupra acestui subiect.

Eşantioanele sunt etichetate, cuprinzănd: produsul recoltat, examenul cerut, locul

prelevării, ziua şi data prelevării, data de valabilitate, sigiliul, martorii prelevării, cine a

prelevat.

Eşantionul se pregăteşte conform standardului internaţional specific al produsului

respectiv:

Produsele aflate în stare lichidă – se agită energic eşantionul de analizat pentru a asigura o

repartizare uniformă a microorganismelor răsturnând rapid de 25 de ori recipientul cu

eşantion. Trebuie evitată formarea spumei iar cea formată trebuie dispersată. Intervalul

dintre omogenizarea eşantionului şi prelevarea probei necesare analizei nu trebuie să

depăşească 3 minute;

Acţiuni şi/sau măsuri preventive

14

Pentru a obţine o cultură pură de germeni este necesar ca materialul de laborator

folosit (recipiente, instrumente, sticlării) să fie steril. Sticlăria întrebuinţată este sterilizată la

etuvă la 180oC timp de 30 minute, iar mediile sterilizate la 121oC timp de 30 minute.

Pregătirea materialului de sterilizat:

- Spălarea sticlăriei cu apă cu detergent, apoi limpezirea la jet continuu de apă, după care

spălarea cu apă distilată;

- Punerea de dopuri de vată cu tifon, învelirea cu hârtie a gâtului eprubetelor sau baloanelor;

- Introducerea în etuvă pentru 30 de minute la 121oC.

Protecţia personalului: Obligatorie purtarea halatului, Folosirea lampei de U.V.

(înainte şi după însămânţare), Folosirea hotei de însămânţare

Metodologia de lucru

Însămânţare şi incubare

Din produsul omogenizat şi din fiecare diluţie se însămânţează câte 1 ml în câte o

eprubetă cu 10 ml chapman lichid.În cazul celorlalte produse din suspensia mamă se

însămânţează câte 10 ml în câte o eprubetă cu 10 ml chapman lichid.

Se incubează eprubetele însămânţate cu mediu de îmbogăţire timp de 24 – 48 h la

temperatura de 35o 37oC.

Din fiecare eprubetă în care au apărut semne de dezvoltare microbienă prin virarea

culorii mediului de îmbogăţire se fac treceri pe suprafaţa unui mediu selectiv (chapman

solid) turnat în plăci Petri sterile prin strierea cu ajutorul unei anse de însămânţare.

Plăcile Petri astfel însămânţate se incubează la 35o 37oC timp de 24 – 48 h.

Interpretarea

Se controlează plăcile Petri însămânţate şi din cele unde s-au dezvoltat colonii

caracteristice şi/sau necaracteristice, se reţin plăcile care conţin între 15 şi 150 colonii

caracteristice şi/sau necaracteristice. Din fiecare placă Petri se aleg pentru confirmare câte 5

colonii caracteristice şi/sau necaracteristice după caz.

Test de confirmare (proba coagulazei)

15

Cu ajutorul unei anse bacteriologice sterile se prelevează o parte din fiecare colonie

selecţionată şi se însămânţează într-o eprubetă cu bulion de inimă creier. Se incubează la 35o

sau 37oC timp de 20 – 24 h. Se adaugă în mod steril câte 0,1 ml din fiecare cultură la câte 0,3

ml plasmă de iepure în eprubete sterile cu diametru de 10 x 75 ml şi se incubează la 35o sau

37oC. Se examinează coagularea plasmei după 4 – 6 h.

Se consideră că reacţia coagulazei este pozitivă când coagulul ocupă mai mult de trei

pătrimi din volumul ocupat iniţial de lichid.

Pentru control se adaugă 0,1 ml bulion de inimă creier steril la cantitatea

recomandată de plasmă de iepure (0,3ml) şi se incubează fără însămânţare.

Pentru ca reacţia să fie valabilă plasma din eprubeta martor nu trebuie să prezinte

semne de coagulare.

Calculul

Dacă cel puţin 80% din coloniile selecţionate sunt coagulază pozitiv se ia ca număr

de stafilococcus (aureus) numărul prezumtiv dat de numărătoarea făcută conform punctului

10.5.

În toate celelalte cazuri numărul se calculează pornind de la numărul de stafilococcus

aureus prezumtiv (punctul 10.5.) care sunt coagulază pozitiv (punctul 10.6.).

Cutiile care conţin între 15 şi 150 colonii caracteristice şi/sau necaracteristice pentru

două diluţii consecutive numărul de stafilococcus aureus pentru fiecare diluţie se calculează

aşa cum se indică la punctul 10.7.1. şi 10.7.2. şi se face media aritmetică a celor două valori

obţinute exceptănd cazul când raportul dintre valoarea cea mai mare şi valoarea cea mai

mică este peste 2; în acest caz se reţine ca rezultat valoarea cea mai mică.

Exprimarea rezultatelor

Cu rezultatele obţinute în cele două serii de cutii sau cu cele două diluţii consecutive

se calculează numărul mediu de stafilococcus aureus.Se adună mediile de stafilococcus

aureus obţinute din coloniile caracteristice şi/sau necaracteristice, luând în considerare

pentru fiecare factorul de diluţie.

Nu se reţin decât două cifre semnificative procedând după cum urmează:

- dacă numărul este mai mic de 100 se rotunjeşte la cel mai apropiat multiplu de 5

16

- dacă numărul este mai mare de 100 şi se termină cu 5, se rotunjeşte la cel mai apropiat

multiplu de 20

- dacă numărul este mai mare de 100 şi nu se termină cu 5, se rotunjeşte la cel mai apropiat

multiplu 10

Pentru a se obţine numărul de Stafilococcus aureus pe gram de produs după caz se

multiplică această valoare cu inversul volumului inoculului şi apoi cu inversul ratei de diluţie

a eşantionului de analizat.

Rezultatul se exprimă printr-un număr cuprins între 1,0 şi 9,9 multiplicat cu 10n, unde

n este puterea corespunzătoare.

Pentru estimarea numerelor mici se face o medie din numărul coloniilor confirmate

caracteristice şi necaracteristice şi se rotunjeşte la numărul întreg următor cel mai apropiat.

2.4 METODE MODERNE DE DETECTARE A PATOGENILOR ÎN UNITĂȚILE

DE PROCESARE A SUCURILOR DE FRUCTE

Cerintele principale impuse unei metode practice de control microbiologic sunt de a

permite o detectare cantitativă reproductibilă a unor urme de contaminare și de a putea fi

aplicată eficient și economic în condiții de rutina. Aceste cerințe sunt indeplinite optim de

către metoda filtrelor membrana.

Principiul acestei metode este bazat pe concentrarea microorganismelor din probe

relativ mari pe suprafata unor filtre membrana, urmata de o incubare a acestora pe medii de

cultura sub forma de cartonaoe sau de tip agar.

2.4.1 Metoda filtrului membranã. Descriere

Un filtru membranã cu o porozitate adecvatã este montat într-un suport (holder) iar

proba este filtratã prin acesta. În acest proces microrganismele din proba de controlat sunt

reþinute pe suprafața filtrului prin efectul de separare al membranei acestuia. Inhibitori ai

creșterii pot fi îndepãrtați prin clãtirea holder-ului cu soluție sterilã de NaCl dupã filtrare.

Filtrul membranã este plasat apoi pe un mediu de culturã și incubat.

La metoda Monitor MF, monitorul este gata de utilizare, datoritã unui filtru

membranã asamblat în interior la un mediu nutritiv. La aceastã metodã se adaugã mediu

17

nutritiv pe partea de sus și se creeazã un scurt vid (<1 sec.). Dupã demontarea pâlniei,

capacul și partea de jos corespund unei cutii Petri. Schimbul de produse nutritive și

metabolice are loc prin sistemul poros al filtrului membranã. Coloniile care s-au dezvoltat pe

suprafața filtrului în timpul incubãrii sunt apoi numãrate și raportate la volumul probei.

Avantajel acestei metode ar fi precizie de detectare înaltã, în comparatie cu metoda directã,

pot fi testate volume de probã considerabil mai mari. Acest efect de concentrare ridicã

acurateþea detectarii microbiene. Rezultate cantitative -coloniile vizibile pot fi

raportatedirect la volumul de probã.

– Documentare- filtrele membranã cu coloniile crescute pe ele pot fi arhivate pentru

documentarea testului efectuat.

Fără inhibitori

Inhibitorii, ca de exemplu uleiuri eterice sau dezinfectanți pot fi clãtiți de pe suprafața

filtrului dupã filtrare.

Pentru detectarea microorganismelor sunt utilizate de obicei metode de culturã si

examinare microscopicã iar pentru diferențierea lor metode biochimice si serologice. Pentru

detectarea microorganismelor în culturi sunt necesare medii nutritive lichide și solide, în sau

pe care microorganismele sunt concentrate prin creștere.

O determinare cantitativã este posibilã numai cu medii nutritive solide, deoarece

coloniile dezvoltate pe suprafața acestora pot fi evaluate și numãrate individual.

Pentru analize microbiologice pot fi utilizate urmãtoarele medii de culturã:

Seturi de cartonaşe impregnate cu mediu nutritiv - CMN, care optimizează masiv

metoda filtrului membrană. Acestea raţionalizează şi standartizează procesul de

control microbiologic, făcându-l şi mai eficient.

Cartonașe absorbante de umezit cu mediu nutritiv lichid

Medii nutritive cu agar sau gelatinã ca agent solidificator

CMN sunt medii de culturã sterile uscate, preambalate în cutii Petri sterile. Dupã o

umezire cu 3,0–3,5 ml apã sterilã distilatã sau demineralizatã, sunt gata de utilizare.

Umezirea cartonaºelor nutritive este optimã când în zona lor de margine este clar vizibil un

surplus de lichid. Toate tipurile de CMN sunt livrate cu filtrele membranã corespunzatoare,

de asemenea ambalate individual steril. Aceste filtre, dezvoltate special pentru cerințele

controlului microbiologic, sunt disponibile cu diametrul de 50 mm sau de 47 mm.

Pentru a obține rezultate relevante ale testelor microbiologice, sunt necesare condiții

de lucru lipsite de risc de contaminare cu microorganisme strãine alterante. Din acest motiv

18

se va lucra în apropierea unui arzãtor Bunsen, într-o încãpere lipsitã de curenți de aer. Înainte

de începerea lucrului, suprafața de muncã va fi stropitã sau spãlatã cu o soluție dezinfectantã

(de ex. alcool, 70%). Înainte de utilizare, aparatele de filtrare ca și pensetele și foarfecile vor

fi sterilizate prin metode standard pentru teste de rutinã precum flambarea.

2.5 DESCRIERE ȘI REZULTATE TIPICE DE EVALUARE A CREȘTERII

MICROORGANISMELOR

2.5.1 CMN Malt Extract

Pentru izolarea și numãrarea drojdiilor și mucegaiurilor. Mediu de culturã deshidratat

pentru creșterea microorganismelor în vin, bãuturi rãcoritoare, concentrate, sucuri de fructe,

alimente și alte produse.

Condiţii de incubare:

Pânã la 3 zile la 25}2° C sau 7 zile la 30}2° C� �Evaluare şi rezultate tipice:

Drojdiile dezvoltã de obicei colonii netede, albe, rarerori colorate. Mucegaiurile cresc

în general în colonii cu aspect catifelat sau ca de vatã de bumbac, albe în faza timpurie de

creștere și de diferite culori mai târziu, dupã formarea conidiosporilor. Observație: pH-ul

scãzut al acestui mediu suprimã creșterea majoritãții bacteriilor. El este disponibil cu douã

tipuri diferite de filtre membranã Saccaromyces cerevisiae.Culturã mixtã de Saccaromyces și

Rhodutorula

2.5.2 CMN Glucose Tryptone

Tip 14066 Pentru numãrarea bacteriilor mezofile și termofile, în specia microorganisme

“flat-sour” în conserve de alimente. Cutiile petri sunt de construcție specialã, închise etanș

pentru incubare microaerofilã. Mediu de culturã deshidratat pentru creșterea

microorganismelor în sucuri de fructe, zahãr, produse zaharoase, alimente și alte produse.

Condiţii de incubare*:

48h la 55 �}2° C sau pânã la 3 zile la 31 �}1° C

19

Evaluare şi rezultate tipice: Microorganismele care fermenteazã glucoza și produc acizi

cresc în colonii gãlbui spre verde. Coloniile “flat-sour” au un diametru de 2 - 5 mm, sunt de

culoare gãlbuie - verde și sunt înconjurate de un halou galben. Observație: pentru incubarea

la 55°C, cutiile petri trebui sã fie introduse într-o camerã climaticã cu atmosferã umedã.

Bacillus

2.5.3 CMN Wort

Pentru detectarea și determinarea drojdiilor și mucegaiurilor. Mediu de culturã

deshidratat pentru creșterea microorganismelor în materii prime, bãuturi, vin, bere, bãuturi

rãcoritoare, concentrate, alimente și alte produse.

Condiţii de incubare:

2–5 zile la 25–30° C

Evaluare şi rezultate tipice:

Drojdiile dezvoltã de obicei colonii netede, albe sau colorate. Mucegaiurile formeazã

în general colonii catifelate sau pufoase, cu aspect de vatã, în faze timpurii de creºtere ºi de

diferite alte culori mai târziu, dupã producerea conidiosporilor.

2.5.4 CMN Jus de Tomate (Tomato Juice)

Pentru detectarea bacteriilor acidolactice alterante ale produselor, în special

Oenococcusoeni conform Dubois,, Bindan și Lafon- Lafourcade. Cutii petri speciale, cu

închidere etanșã, pentru incubare microaerofilã. Mediu de culturã deshidratat pentru

creșterea microorganismelor în vin, suc de fructe și altele.

Condiţii de incubare:

4-6 zile (pânã la 8 zile) la 28–30° C

Evaluare şi rezultate tipice:

Lactobacilii formeazã colonii compacte,albicioase pânã la ușor gãlbui, cu diametrul

de 1–3 mm. Pediococii dezvoltã colonii ceva mai mici, cu diametrul de ca. 1 mm, care mai

târziu capãtã o culoare albicioasã pânã la slab maronie. Oenococcus oeni crește în colonii

incolore pânã la albicioase, cu diametrul sub 1 mm. Observație: acest mediu trebuie sã fie

incubat în condiþii anaerobe.

20

Bibliografie

Puchianu Gh., Lucrări practice de microbiologie alimentară, 2010 Brașov

Banu C., Tratat de industrie alimentară- Tehnologii alimentare, Editura ASAB București,

2009

Banu C., Manualul inginerului de industrie alimentară – volumul II, Editura Tehnică,

Bucureşti, 2002

Beceanu D., Chira A., Paşca I. – Fructe, legume şi flori. Metode de prelungire a păstrării în

stare proaspătă. Conserve de legume şi fructe – Editura MAST, Bucureşti, 2003

Dragsted L.O. (2003). Antioxidant actions of polyphenols in humans. Int J Vitam Nutr Res.

73(2),112-119.

Dumitru Ţucu, Dumitru Mnerie – Tehnologiile culinare şi gastronomia – Timişoara, Editura

Politehnică, 2001

Gergen I., Analiza produselor Agroalimentare, Editura Eurostampa, Timisoara 2004

Mencinicopschi Gheorghe, Diana Raba – Siguranţa alimentară autenticitate şi transabilitate –

Editura Mirton, Timişoara, 2005

ntrolul microbiologic

21

www.sartorom.ro/sites/default/files/.../control_microbiologic_ro.pdf

www.legex.ro/Ordin-611-1995-7825.aspx

www. bursaagricola .ro/Info-CONDITIILE_MICROBIOLOGICE_

http://adevarul.ro/sanatate/dieta-fitness/un-pahar-suc-fructe-contine-

1_50ad4aaf7c42d5a66392626f/index.html

http://www.watermag.ro/determinare-coliformi-totali/p-174

22