INGINERIE GENETICA-1

5/25/2018 INGINERIE GENETICA-1

1/120

INGINERIE GENETICA

Conf. Dr. Biolog Vasilica Barbu


2/120

Cercetatori vs. profani

BIOTEHNOLOGIA

Antichitate: fabricarea vinului, a berii, a painii, a

produselor lactate, a conservelor, etc.;

In prezentramura noua a biologiei contemporane;

Sintetizeaza ideile si metodele biologiei celulare si

moleculare, biochimiei, geneticii si ingineriei

genetice;

Are ca ax central tehnologia ADN recombinant

tehnologie de baza a ingineriei genetice.


3/120

Ingineria genetica

Ramura a biologiei care, pe baza tehnologiei ADNrecombinant, urmareste creearea de noi programegenetice utilepentru cercetarea fundamentala, dar maiales pentru diferite ramuri ale economiei: industriaalimentara, farmaceutica, agricultura, medicina, etc.

Stiinta scumpainvestitii enorme in echipamente deultima generatie, dar pe deplin compensate de valoarearezultatelor obtinute.

Prima companie bazata pe tehnologia ADN recombinantGENETECH - s-a infiintat in San Francisco, in 1976.

Permanenta cursa a cunoasterii (din 1944 pana inprezent.)


4/120

Istoric 1928E. GriffithDiplococcus pneumoniae

S - virulent- colonii netede (smooth)

- cu capsula polizaharidica: SI, SII, SIII

R - nevirulent

- colonii rugoase (rough)- nu au capsula.

S se poate transforma prin mutatii spontane doar in serotipulcorespunzator: SI in RI, SII in RII, etc

Experienta in vivo: S (soarecii mor de pneumonie), R (soareciisunt perfect sanatosi), apoi RII impreuna cu SIII omorat in

prealabil prin fierbere (soarecii mor de pneumonie si dinplamani se recolteaza pneumococi SIII vii)

Nu a putut explica rezultatul!!!!


5/120

Istoric 1935N.P. Dubinin, prin iradiere cu UV determina

modificarea complementului cromozomal de laDrosophillamelanogasterde la 2n=8 2n=6 (D. willstoni)

Serie robertsoniana= specii inrudite cu numar diferit de

cromozomi, dar numar egal de brate cromozomale, deci aceeasi

cantitate de ADN. Ex. D.virilis (2n=12) D. pseudoobscura(2n=10) (1+2)

D. melanogaster (2n=8) (2+3 si 4+5)

D. willstoni(2n=6) (1+2, 4+5 si 6+3)

1944

O.T Avery, Mac Leod si Mac Cartyrolul ADN

1956E. Searsobtine un soi nou de grauTransfer (rezistentla rugini), prin iradierea cu raze X a polenului hibridului dintre T.

aestivum (2n=42) siAegilops umbellulata(2n=14).


6/120


7/120

T. monococcum(2n=14) xA. speltoides (2n=14)

T. dicoccoides(2n=28) xA. squarrosa (2n=14)

T. aestivum (2n=42) xA. umbellulata (2n=14)

Transfer (2n=56)

AMFIPOLIPLOIDIE

Istoric


8/120

1965G. Harrishibridarea celulelor somatice de la speciiindepartate filogenetic (om - soarece, soarecehamster, etc.),creste daca se adauga in mediul de cultura virusul paragripal detip Sendai, inactivat termic.

Hibridarea somatica la plante - fuziunea de protoplasti(celulevegetale rezultate dupa indepartare peretelui celular

pectocelulozic cu celulaza si pectinaza) duce la obtinerea unuicalus (masa de celule nediferentiate) si apoi a unor plante intregi

amfidiploizi (hibrizi parasexuali interspecifici sauintergenerici) care nu pot fi obtinuti pe calea clasica aincrucisarii sexuate.

Hibridarea somatica la animale duce numai la formarea de clonecelulare hibride si nu de animale hibride

Soarecii alofenici

Microchirurgia ovulelor clone de elita

linii total homozigote

Istoric


9/120

1969Beckwithizoleaza operonul lacde laE. coli;

1970Khoranasinetizeaza pe cale chimica gena ce codifica ARNt cetransporta alanina la locul sintezei proteice, la S. cerevisiae(77pb);

1970Temin si Baltimoredescopera reverstranscriptaza

1977-1978Maxam si Gilbertclarifica structura genei eucariote (genaovalbuminei cu 8 exoni si 7 introni);

1977Itakuraclarifica structura genei somatostatinei umane;

1979Goddel - clarifica structura genei insulinei umane;

1982Kolosov si Gorodeni - clarifica structura genei bradichininei umane;

Tehnologia ADN recombinant, descoperirea restrictazelor si a ligazelor, folosirea

plasmidelor ca vectori au dus la clonarea genelor si la infiintarea bancilor de gene

Istoric


10/120

Istoric 1977Boyer - plasmidul pBR322cu ajutorul caruia

s-au clonat in genomul deE. coligenele: insulinei umane,

a hormonului STH sau a interferonului (146-166

aminoacizi)


11/120


12/120

Istoric1981-1982Garfinkel si Zambriski

incearca clonare unor gene derezistenta la plante (rezistenta la

metrotexat de la plante necultivate latutun) utilizand plasmide Ti(de la

Agrobacterium tumefaciens) sau Ri(de laA. rhizogenes). Aceste plasmidecontin gene ce determina malignizarea

(boala tuberculilor fuziformi la cartofsau boala radacinilor paroase laplante), dar prin eliminarea genelorresponsabile de malignizare siclonarea unor gene utile, pot servi cavectori genetici. S-a incercat astfelclonarea la plante a celor 17 genele nif(care codifica nitrogenaza) de la

Rhizobium leguminosarium. Enzimafunctioneaza insa doar in conditiianaerobe, iar celula vegetala este o

celula cu metabolism aerob.


13/120

Genomtotalitatea genelor dintr-un set haploid de cromozomi.

Genomicaramura a geneticii care investigheaza structura sifunctia genelor.

In prezent se cunosc integral genomurile de la 259 specii sipartial - genomurile de la 798 gene. Este era genomicii.

1995 - genomul de laHaemophillus influenzae;

1996genomul de la Saccharomyces cerevisiae; 1997genomul de laEscherichia coli;

1998genomul de la Caenorabditis elegans;

2000genomul de laArabidopsis thaliana;

- genomul de laDrosophila melanogaster;

2002genomul de laMus musculus;

2003genomul de laHomo sapiens;

2004genomul de laRattus norvegicus;

2005 - genomul dePan troglodytes(cimpanzeu).

Istoric


14/120

Istoric Transcriptomicaramura a geneticii care

investigheaza moleculele de ARNm (structura,

secventiere, marime, etc) din celula, rezultate printranscrierea genelor.

Proteomicaramura a geneticii care studiazaprocesul de translatie a moleculelor de ARNm, la

nivelul ribozomilor si sinteza proteinelorcorespunzatoare.

Metabolomicaramura a biologiei celulare carestudiaza procesul de sinteza a altor molecule din celula

(nu proteine sau enzime) cum ar fi aminoacizi,vitamine, pigmenti, etc.

Toate alcatuiesc sistemulOMIC`sal celulei saubiologia celulara sistemica.


15/120

TEHNOLOGIA ADN RECOMBINANT

Include tehnici de manipulare a fragmentelor de ADN sau a

genomului unui organism. Presupune:

Izolarea sau sinteza pe cale chimica a genelor de la diferite

organisme;

Introducerea lor in repliconi mici (plasmide sau virusuri) cu

rol de vectori;

Transferul acestora in celule-gazda adecvate.

Cea mai obisnuita metoda de a izola gene din surse naturale

consta in REVERSTRASCRIERE- sinteza de ADN

complementar monocatenar dupa matrita de ARN cu ajutorul

reverstranscriptazei, ADN care apoi este convertit in ADN

dublu catenar si clonat in diferite celula gazda.

ARNm reverstranscriere ADNc monocatenar ADN dc


16/120

Virusuri

Dezoxiribovirusuri au material genetic ADN: ADNmc (fagul fx174)sau ADN dc (fagul l, T4, F1, virusurile: variolei, polioma, herpes,

hepatita B, etc.); Ribovirusuri au material genetic ARN si se replica ARN ARN(MS2, F2, VMT, gripal, polio, virusul turbarii, Lassa, Ebola);

Retrovirusuri au material genetic ARN dar se replica printr-unintermediar ADN (ARN ADN intermediar ARN). Suntvirusuri oncogene (tumorale) care induc leucemii, sarcoame, alte tipuride neoplazii de la reptile pana la primate. Cele mai studiate sunt v.leucemiei aviare, v. mieloblastozei aviare, v. sarcomului Rous la gaina(RSV), v. HIV, etc.


17/120

Retrovirusurile

Poseda 3 gene majore:

gagcare codifica proteinele structurale ale invelisuluicorpusculului central;

polpentru reverstranscriptaza si nucleazele virale;

envpentru glicoproteinele virale implantate in invelisul

exterior format din fosfolipide din membrana celulara.

Biosinteza reverstranscriptazeila virusul

mieloblastozei aviare consta in formarea unui

precursor proteic de 180kdaltoni codificat de genele

gag-pol care apoi se transforma in enzima propriu-

zisa ce poseda 2 subunitati ade 68 kda si bde 92kda.Enzima se gaseste sub 3 forme active aa, absibb


18/120

Ciclul viral la virusul HIV


19/120

REVERSTRANSCRIPTAZA

1960 - H. Teminrastoarna dogma fundamentala a geneticii

conform careia informatia genetica se transmite unidirectionalde la ADN ARN proteine

Experienta: infecteaza embrioni de gaina cu RSV si observa caciclul viral seamana cu cel al unui fag temperat care, in stadiul

de profag (provirus), are materialul genetic inclus in genomulcelulei gazda. Stadiul de profag este greu de explicat deoarecese cunostea ca RSV este un ribovirus (are material geneticARN). Mai mult, actinomicina D (care blocheaza replicareaADN) impiedica transformarea maligna a embrionilor de gaina

infectati cu RSV.

Concluzia: ARN-ul virusului RSV este convertit intr-untranscript ADN care constituie provirusul integrat incromozomii celulei gazda.


20/120

RSV


21/120


22/120

REVERSTRANSCRIPTAZA

1970 - David Baltimore si Howard Temindescoperaenzima raspunzatoare de acest proces denumita ADN-

polimeraza dependenta (sau dirijata) de ARN, transcriptaza

inversa sau reverstranscriptaza (RT).

Enzima nu se intalneste doar la retrovirusuri (v. tumorale) cisi laE. coli, fibroblaste, limfocite umane normale,

neinfectate (poate ca dovada a unei infectii virale latente),

oocite deXaenopus laevis(legat de fenomenul de

amplificare genica a genelor ADNr in peste 1000

copii/celula).

S A SC A A


23/120

Activitate enzimatica:

ADN polimeraza dependenta de ARN (reverstranscriere); ADN polimeraza dependenta de ADN (replicare);

RN-aza H (exonucleaza care degradeaza catena ARN a hibrizilor

ADN-ARN naturali sau sintetici, fie de la capatul 3 fie de la cel 5;

Repararea moleculelor ARN sau ADN (asemanator ADNpolimerazei I);

Unwindaza (proteina destabilizatoare a dublului helix - HDP care

nu permite reasocierea monocatenelor complementare, deci

stabilizeaza monocatenele); Endonucleaza (desface legaturi fosfodiesterice din interiorul

cetenelor polidezoxiribonucleotidice);

Are un mecanism progresiv, ramane atasata de matrita si de primer

si catena ADN fiica creste prin adaugarea de nucleotide.

REVERSTRANSCRIPTAZA


24/120

Conditiile reactiei enzimatice de reverstranscriere: Temperatura: 40-50C la retrovirusurile aviare sau 37-

40C in cazul retrovirusurilor de la mamifere;

pH: 7,8-8,5 (optim 8,2);

Substratul: este obligatorie prezenta tuturor celor 4 tipuri de

d(NTP) libere, la concentratii inalte (1000mM din fiecare);

lipsa uneia blocheaza reactia);

Matrita: ARNm care la eucariote are capatul 3 poliadenilat

poli(A);

Primerul: oligo (dT)12-18;

Alte cerinte: Mg2+si Mn2+.

REVERSTRANSCRIPTAZA


25/120

Etapele replicarii


26/120

Etapele reverstranscrierii in vitro

1. Izolarea ARN totaldin celula presupune inactivarea

ribonucleazelor celulare, denaturarea proteica si inlaturareaADN-ului prin:

Liza celulara rapida;

Denaturare proteica cu guanidintiocianat 4M si SDS 2% + proteinaza K;

Separare de ADN prin centrifugare in gradient de CsCl 5,7M;

Pentru inlaturarea totala a ADN se incubeaza la 4C cu DN-aza I

pancreatica.

2. Izolarea din ARN celular total a ARNmcare are captul 3poliadenilat (20-250 nucleotide cu Adenina) se face prin

cromatografie de afinitate pe coloana de oligo(dT)-celuloza sau

poli(U)-sepharoza, la 60C si concentratii saline mici;


27/120

3. Identificarea ARNm specific (dorit) ridica probleme deoarece

in celula sunt mii de molecule de ARNm de diferite marimi si

secvente de nucleotide. Se recomanda alegerea unor celule

inalt specializate ce contin mari cantitati de ARNm de un

anumit tip (de exemplu ARNm pentru globina se extrage din

reticulocitele de iepure). Se realizeaza prin precipitare cu

anticorpi corespunzatori, urmata de electroforeza in gel de

SDS-poliacrilamida.


Et l t i ii i it


28/120

4. Clonarea ADN complementar dublucatenar

Obtinerea hibridului ARNm-ADNc in prezenta reverstranscriptazei, a

primerului oligo(dT)12-18si a tuturor celor patru tipuri de d(NTP);

Hidroliza alcalina a ARNm si a primerului oligo(dT)12-18 de la capatul 5terminal si se obtine un ADNcomplementar ( ADNc) monocatenar: simplusau cu structura in ac de par la capatul 3 terminal.

Obtinerea ADN complementar dublucatenar se poate face pe doua cai:

Calea autoprimerului (cand capatul 3 in ac de par: serveste ca primer sieste elongat cu d(NTP) tot de catre reverstranscriptaza) sau

Prin atasarea unei cozi scurte homopolimerice poli (dC) la capatul 3 alADNc mc cu ajutorul terminal transferazei (citidin-transferazei). La acestcapat se va atasa un primer oligo(dG) la care reverstranscriptaza va

adauga apoi dNTP

Inlaturarea cozilor homopolimerice sau deschiderea structurii in ac de parcu ajutorul nucleazei S1izolata de laAspergillus oryzae.

Adaugarea de cozi homopolimerice poli(dC) la capatele 3 inprezenta citidin-transferazei si a dCTP-urilor



29/120

Clonarea genei izolate prin reverstranscriere


30/120

Clonarea genei izolate prin reverstranscriere

Linearizarea vectorului

(plasmidul pBR322 sau pUC

18/19 sau pSC101, etc) cu

ajutorul endonucleazelor derestrictie care taie in situsuri

specifice si formeaza capete

netede sau lipicioase.

Exemplu: Vectorul pBR 322

este linearizat cu endonucleazade restrictie PstI, apoi se adauga

cozi homopolimerice poli(dG)

complementare cu cozile

poli(dC) ale fragmentului de

ADN izolat prinreverstranscriere. Cu ajutorul

ADN ligazei se uneste

plasmidul linearizat cu gena de

interes si se obtine un ADN

recombinat ce poate fi clonatintr-o celula deE coli.


31/120

Folosirea vectorului

pUC19 pentru

clonarea genica


32/120

Dupa un astfel de protocol s-au clonat genele:

Insulinei umane;

Hormonului de crestere; b-globinei de iepure;

Interferonului;

Ovalbuminei;

Hemaglutininei virusului gripal; Virusului hepatitei B;

Factorilor stimulatori pentru multiplicarea macrofagelor sigranulocitelor (tratarea pacientilor cu sistem imunitardeficitar dupa tratament antitumoral chimic sau priniradiere);

Factorului necrozant al celulelor tumorale (perspective inrezolvarea problemei cancerului), etc.


33/120

ORGANIZAREA MATERIALULUI GENETIC LA PROCARIOTE

Prin genom( gr.genos= urma], mo]tenitor) se n\elege totalitatea genelor dintr-un setcomplet haploid de cromozomi mo]tenit, ca o unitate, de la un p`rinte. Genomurile

indivizilor unei specii constituie genofondulacelei specii. Genomicastudiaz` genomurile organismelor:

secven\ializarea materialului genetic,

[ntocmirea h`r\ilor genetice,

fenomenele de interac\iune intragenic` ]i intergenic`,

rela\iile func\ionale dintre gene (expresia genelor [n diferite condi\ii).

Studiul [ntregului set de proteine dintr-un tip de celul` sau \esut, schimb`rile petrecute

[n diferite condi\ii, fac obiectul proteomicii.


34/120

Genomica a ap`rut in anii 1980, odat` cu ini\ierea proiectelor privind genomurileunor specii.

{n 1972, Walter Fiers ]i echipa sa de la Laboratorul de Biologie Molecular` dinGhent (Belgia), secven\ializeaz` pentru prima dat`, gena ce codific` o protein` a[nveli]ului bacteriofagului MS2, iar [n 1976 este secven\ializat [ntregul genom ARN

al fagului. Primul genom ADN secven\ializat [n [ntregime este cel al bacteriofagului F-X174

(5368pb), de c`tre Frederick Sanger, [n 1977.

{n 1995 este secven\ializat genomul primei bacterii (Haemophilus influenzae) carede\ine 1,8Mb.

In 2003 este complet secven\ializat genomul uman.

ORGANIZAREA MATERIALULUI

GENETIC LA PROCARIOTE


35/120

P@n` [n septembrie 2007 se cunoa]tea secven\a genomic` complet` la: 1879 de virusuri,

577 bacterii,

23 specii eucariote (din care aproape jum`tate sunt fungi).

Dintre eucariotele al c`ror genom este complet secven\ializat enumer`m pe cele mai

importante: drojdia de bere - Saccharomyces cerevisiae(modelul celulei eucariote),

musculi\a de o\et - Drosophila melanogaster,

viermele pluricelular - Caenorhabditis elegans,

pe]tii: Brachydanio rerio ]i Tetraodon nigroviridis,

dintre angiospermeArabidopsis thaliana, dintre mamifere: c@inele - Canis familiaris, ]obolanul - Rattus norvegicus, ]oarecele Mus

musculus, cimpanzeul Pan troglodytes.




36/120


GENETIC LA PROCARIOTE Celula bacterian`, spre deosebire de celulele organismelelor

eucariote, nu are un nucleu adev`rat, ci un "nucleu" cu organizare

primitiv`, fiind lipsit de membran`, iar materialul genetic este liber

[n citoplasm`, [n partea central` a celulei. Aceast` form` de

existen\` a materialului genetic nu parcurge procesele specifice

diviziunii indirecte, de aceea se nume]te nucleoidsau pur ]i simplucromozom bacterian.

Astfel, [n cazul celulelor procariote, condi\ia normal` este haploidia

]i informa\ia genetic` este de\inut` de un singur cromozom, iar

genele din componen\a acestuia se transmit [nl`n\uit constituind

unicul grup de linkage.

Multiplicarea se realizeaz` prin diviziune direct` sau amitoz`(f`r`

diferen\ierea fusului de diviziune).


37/120



Genomul bacterian este alc`tuit din

dou` categorii de gene: gene esen\ialeeucromozomale, localizate [n

cromozomul bacterian ]i geneaccesoriiprezente [n plasmide, inelemente genetice transpozabile ]i [n

unii fagi (Campbell, 1981). {n celulaprocariot` putem vorbi deci, despre ungenom cromozomal ]i unulplasmidial.



38/120



CROMOZOMUL BACTERIAN

are forma circular` este alc`tuit dintr-o singur` molecul`de ADN dublucatenar, circular, covalent [nchis,

suprar`sucit negativ ]i [mpachetat,

ata]at de membrana plasmatic` [n una sau mai multe puncte (p@n` la 20), numite mezozomi.

Cel mai important mezozom este cel din vecin`tatea originii de replicare (ori C) ]i are unprocent mare de perechi A=T.

Cromozomul bacterian poart` [n structura sa, toat` informa\ia ereditar` necesar` pentruexisten\a unei celule, adic` poart` toate genele necesare pentru desf`]urarea metabolismului ]ipentru reglarea activit`\ii celulare. Acesta determin` ]i arhitectura celulei care-l con\ine,ereditatea ]i capacitatea ei de evolu\ie.


39/120

CROMOZOMUL BACTERIAN Lungimea macromoleculei de ADN poate varia de la 600-800 kpb (la Mycoplasma,

Ureaplasmabacterii f`r` perete celular), p@n` la 12000-13000 kpb la genurile

Myxococcus]i Calothrix. La Escherichia colieste un cromozom de m`rime medie, de

aproximativ 4700 kpb

Replicarea acestei macromolecule de ADN [ncepe dintr-un punct numit origine de

replicare (ori C) ]i se termin` [ntr-un punct notatter, iar mecanismul replic`rii a fost

elucidat de Cairns [n 1963 ]i decurge dup` modelul Theta, modelul inelului rotativ(engl. rolling circle) sau modelul buclei D.

Treimea cromozomului care are [n centru regiunea ori Cde\ine clusterigenetici cu o

pozi\ie fix` ]i precis`, [nalt conservat` [n evolu\ie (similari la taxoni bacterieni foarte

[ndep`rta\i filogenetic). Aceasta [nseamn` c` ini\ierea ]i terminarea replic`rii sunt

procese extrem de vechi, controlate prin mecanisme asem`n`toare, la majoritateabacteriilor.


40/120

Replicarea la procariote

M`rime Num`r de Data


41/120

Microrganism Tipul AT (Mbp) gene transcris public`riiEscherichia coli tulpina K-12 MG1665 Gram - 49 4.64 4288 88% Oct,1997

Escherichia coli tulpina K-12 W3110 Gram - 49 4.64 4085 79% -

Haemophilus influenzae Gram - 62 1.83 1703 87% Aug, 1995

Helicobacter pylori Gram - 61 1.67 1590 90% Iun, 1997

Treponema pallidum Gram - 47 1.14 1041 93% Iul,1998

Borrelia burgdorferi Gram - 71 0.91 853 94% Iul,1997

Campylobacter jejuni Gram - 69 1.64 1731 94% Oct, 1998

Chlamydia trachomatis Gram - 59 1.04 938 91% Nov, 1998

Rickettsia prowazekii Gram - 71 1.11 834 76% Nov,1998

Rhizobiumsp. NGR234 plasmid pNGR234a Gram - 42 0.54 483 71% 1998

Bacillus subtilis Gram + 56 4.20 4222 88% Nov,1997

Mycoplasma genitalium Gram + 68 0.58 470 89% Oct, 1995

Mycoplasma pneumoniae Gram + 60 0.82 677 87% Nov, 1996

Mycobacterium tuberculosis Gram + 34 4.41 3924 91% Iun,1998

Aquifex aeolicus Eubacteria 57 1.55 1512 94% Mar,1998Synechocystis sp. Alg` albastr`-verde 52 3.57 3168 87% Sep, 1996

Archaeoglobus fulgidus Archaebacteria 51 2.18 2436 91% Iun,1997

Methanococcus jannashchii Archaebacteria 69 1.66 1738 88% Aug, 1996

Methanobacterium

thermoautotrophicumArchaebacteria 50 1.75 1918 91% Mai,1997

Pyrococcus horikoshii Archaebacteria 58 1.74 2022 88% Ian,1998

Saccharomyces cerevisiae Eucariot 62 12.07 5885 72% Ian, 1996


42/120


De]i condi\ia normal` a celulei procariote este haploidia, unele gene se pot aflasimultan ]i pe cromozomul bacterian ]i pe plasmide, de aceea, starea real` a celulei

procariote este meroploidia par\ial`.{n func\ie de pozi\ia genei [n cromozom (pornindde la ori Cc`tre regiunea ter), unele gene sunt deja replicate, [n timp ce altele, [nc`nu. Deci unele gene sunt [n mai multe copii per genom, dec@t altele.

Mai mult dec@t at@t, exist` specii bacteriene care prezint` copii multiple ale [ntreguluicromozom, [n aceea]i celul`:

Desulfovibrio vulgaris4 copii,

D. gigas17 copii,

Azotobacter chroococcum20-25 copii,

A. vinelandii40-80 copii.

{n aceste cazuri, exist` mecanisme de reglaj genetic prin inactivare cromozomal`, astfel [nc@t,r`m@n func\ionale genele de pe un singur cromozom.



43/120

CROMOZOMUL BACTERIAN Compozi\ia global` [n nucleotide poate varia [n limite destul de largi, [n func\ie de gen ]i

chiar de specie. Astfel:

la Mycoplasma%GC este de 25%,

la Micrococcus luteus%GC este de 75%, la Escherichia colicon\inutul de GC de 49-51,5% iar acest procent este controlat de dou` gene: mut T, care

controleaz` transversiile AT [n CG ]i mut Y, care controleaz` transversiile CG [n AT. Procentul este corelat]i cu frecven\a anumitor codoni sens sinonimi care sunt prefera\i (anume aceeia care au [n pozi\ia 3adenina sau timina).

Densitatea informa\iei genetice este un parametru variabil [n genomul bacterian ]i se exprimaprin mai multe mecanisme:

1. printr-un grad diferit de suprapunere a genelor(par\ial sau total), c@nd transcrierea [ncepe dinpuncte diferite ale aceleia]i catene, dar se termin` [n acela]i punct, rezult@nd astfel catenepolipeptidice diferite. Exemple:

locusul McrB(implicat in restrictia in pozitia 5-metil-citozina) con\ine 48%GC si 3 ORF-uri care, printranscriere, formeaza 3 polipeptide de greutati moleculare diferite (51,53,54 Kda), cu capete NH2diferite ,dar cu acelasi capat COOH terminal,

locusul CysE(care codific` serin-acetil-transferaza) contine 58%GC si de\ine gena cysX suprapus` total (printranscrierea ambelor catene) cu gena cys E;



44/120

Densitatea informa\iei genetice:

prin frameshifttransla\ional, c@nd pe aceea]i gen` rezult`, prin transcriere, unsingur transcript ARNm, dar prin transla\ia acestuia [n moduri diferite, rezult`

dou` catene polipeptidice distincte. De exemplu: subunit`\ile g]i tale ADNpolimerazei III, codificate de gena dnaX;

prin existen\a copiilor de siguran\`pentru unele gene care func\ioneaz` [n scopurimetabolice diferite sau [n condi\ii diferite de mediu ]i care sunt reglate diferit(sisteme backup sau redundan\` genic`). De exemplu: genele aroF, G, Hcodific`toate aceea]i enzim`: 3-Deoxi-D-Arabino-Heptulosanat-7-Fosfat-sintetaza(DAHPaza), dar aceasta prezint` sensibilitate la diferi\i aminoacizi (tirozin`,

fenilalanin`, respectiv triptofan).



45/120


Genele sunt distribuite de obicei, randomizat[n cromozomul bacterian. Uneori [ns`,

genele [nrudite fiziologic au o distribu\ie ce pare mai pu\in [nt@mpl`toare, fapt ceargumenteaz` teoria conform c`reia, la arhitectura cromozomului bacterian auparticipat, de-a lungul evolu\iei filogenetice, mai mul\i taxoni, de la care s-au p`stratanumite fragmente cromozomale. Astfel:

genele implicate [n catabolismul glucozei la E. colisunt dispuse [n patru zone echidistante alenucleoidului.

genele housekeeping(menajere), implicate [n metabolismul central al oric`rei celule, sunt aranjatela Pseudomonassp. [ntr-o jum`tate a nucleoidului, [n timp ce, cealalt` jum`tate este aproapegoal`.

la Streptomycetae, genele sunt grupate [n dou` regiuni diametral opuse pe cromozom, [ntre elefiind dou` zone aproape goale (lipsite de gene).

C O O O AC A


46/120

CROMOZOMUL BACTERIAN La unele bacterii, [n cromozom, exist` situsuri specifice pentru inser\ia

genomului bacteriofagilor ([n stadiul lizogen, de profag, [n care genomul

fagic se replic` simultan cu nucleoidul bacterian). Astfel, fagull(]i [n

general fagii lambdoizi) se inser` situs-specific [n genomul de E. coli,tulpina K-12, [n situsuri intergenice.

Inser\ia se realizeaz` pe baza omologiei dintre situsul bacterian attB(engl.at tachment on bacteria) sau BOBcare are min. 21pb ]i cel fagic attP(engl.at tachment on phage) sau POPcare are 234pb.

Secven\a Odin cele dou` situsuri (miezul de 15pb:GCTTTTTTATACTAA) este identic`, iar procesul de integrare este facilitatde enzime codificate de gene fagice:

integraza (int),

excizionaza (xis),

dar ]i de proteina histone-like, IHF, codificat` de o gen` din cromozomulbacterian.

La E. coliK-12 s-au identificat 15 astfel de situsuri pentru fagi lambdoizi,situate [ntre pozi\iile 6 ]i 44 (exprimate [n minute de conjugare).

Situs fagic

Situs bacterian

Enzime specifice

Fagul integrat [n cromozomulbacterian



47/120


La Escherichia coli, ca la majoritatea celorlalte bacterii, cromozomul esteformat dintr-o unic` molecul` de ADN dublu catenar, circular covalent

[nchis ]i superhelicat. Perimetrul acestei molecule de ADN este de 1400 m, iar diametrul de 2,5

nm.

Masa molecularaestede circa 2,5 109daltoni ]i con\ine aproximativ4000 de gene, dispuse liniar pe cromozomul circular, alc`tuind un singurgrup de linkage.

{n structura secundar` a nucleoidului bacterian predomin` forma B(dedreapta dextrogir sau dextru), cu un diametru de 20 , cu un pas al

helixului (un tur complet, de 360) de 10 pb ]i de 34 . Pe distan\escurte, [nt@lnim ]i forma senestr` ADN-Z (r`sucit [n sens inversacelor de ceasornic).

{n condi\iile [n care o bacterie are form` cilindric` cu un diametru de 1m

]i o lungime de maxim 3m, este normal ca acest cromozom s` fiesuprar`sucit pentru a putea [nc`pea [n celul`. A. Worcel si W. Burgi [n1972 ]i Pettijohn, [n 1974, au reu]it s` clarifice structura cromozomuluide la Escherichia coli.


48/120

CROMOZOMUL BACTERIAN S-a demonstrat c` el const` [n 40-50 de buclesau domenii topologice

semiindependente, care []i p`streaz` structura cu ajutorul ARN nascent.

Fiecare bucl` are aproximativ 100 kpb, este bogat` [n ARN ]i poatefunc\iona (sufer` suprar`suciri ]i relax`ri) relativ independent decelelalte.

Cele 40-50 de bucle mari au suprar`suciri secundare (engl. supercoil),fiecare cu o lungime de aproximativ 400pb.

Men\inerea acestor bucle de dimensiuni diferite se pare c` se face, nu

numai cu ajutorul ARN, ci ]i cu ajutorul unor proteine ]i enzime detipul endonucleazelor. {n acest fel, structura cromozomal` este stabil`,iar cromozomul bacterian []i p`streaz` continuitatea. Una din enzimelecare joac` un rol esen\ial [n replicarea ADN bacterian ]i esteresponsabil` de suprar`sucirea sa, este ADN-giraza.

Dac` [ntr-o cultur` de E. colise adaug` [n mediu coumeromicina, (unantibiotic cu rol inhibitor al func\iei ADN-girazei), cromozomul celuleirespective []i va pierde constitu\ia suprahelical`.


49/120

CROMOZOMUL BACTERIAN Al`turi de ADN-giraz` exist` ]i o a doua enzim` implicat` [n r`sucirea cromozomului -

topoizomeraza I. Aceasta enzim` produce relaxarea regiunilor suprahelicale. Au fost izolate]i mutante lipsite de topoizomeraz` sau care produc o form` inactiv` a acesteia. Nucleoidulizolat de la astfel de mutante prezint` un grad [nalt de suprar`sucire, cu circa 32 % maimult dec@t normal. Paradoxal [ns`, aceste multante nu sufer` defecte de cre]tere ]i, [nplus, sufer` frecvent muta\ii ale genei pentru ADN-giraz`, care conduc la producerea uneigiraze mai pu\in eficiente. {n consecin\`, cromozomul prezint` un grad normal de

superspiralizare.

MECANISMUL DE ACTIUNE

ADN-giraza se ata]eaz` la situsuri specifice, situate la baza buclelor (secven\elenecodificatoare REP(din engl. Repeated Extragenic Palindromes), care sunt palindroamede 38pb, grupate c@te 2-4 [n clusteri(elemente REPE). Exist` c@te o molecul` de ADN-

giraz` la aproximativ 100kpb, deci la un domeniu topologic (sau bucl`).



50/120


Ata]area ADN-girazei la REPE este facilitat` de o protein` histone-like, proteina HU(din engl. HelixUnwinding):

are o compozi\ie chimic` bogat` [n lizin` ]i asem`n`toare histonei H2A de la eucariote;

este un dimer, cu o greutate molecular` de 9,7 kdaltoni;

format din dou` catene polipeptidice HU-a ]i HU-b codificate de dou` gene hupA ]i hupB; se asociaz` cu segmente de ADN de 200pb, rezult@nd forma\iuni nucleosome-like.

S-au identificat aproximativ 25.000 proteine HUper genom de E. coli, cu o frecven\` mai mare laperiferia nucleoidului.

Cromozomul bacterian nu prezint` proteine histonice tipice (cunoscute la eucariote), ci proteine histone-like.Se cunosc 9 astfel de proteine bazice, cu greutate molecular` cuprins` [ntre 9-28 kdaltoni ]i care se ata]eaz` de

ADN [ntr-o manier` situs nespecific`, de regul . {nafar` de proteina HU, se mai cunosc proteinele H, H1, H-NS, IHF. Proteina IHF(engl. Integration Host Factor) se ata]eaz` situs specific ]i are rol [n integrarea faguluil[n genomul de E. coli. Are o greutate molecular` de 20kd ]i este format` din dou` subunit`\i: a ]i bcodificate de dou` gene: himA ]i himB.



51/120


Ca ]i la eucariote, ]i [n cromozomul bacterian exist` secven\e deADN repetitiv: unelenecodificatoare, altele codificatoare.

ADN repetitiv necodanteste dispus [n afara ORF-urilor (cadre deschise citirii, din engl. OpenReadin Frames). Este reprezentat de: secven\ele REP, ce intr` [n alc`tuirea elementelor REPE(100-200/genom la E.coli]i Salmonella typhimurium),

situsurile chiau 8pb: (5GCTGGTGG3) ]i sunt recunoscute specific de endonucleazele de restric\ie: Rec A, RecBCD, favoriz@nd recombinarea genetic` la procariote. La E. coliexist` 950 situsuri chi/genom (1 situs/5kpb),mai frecvente [n regiunea oriC(un clusterde 22 situsuri chi).

situsurile damau 4pb: (5GATC3) ]i sunt recunoscute de metilaze bacteriene ce metileaz` adenina [n pozi\iaN6. LaE. coli exist` aproximativ 18000 astfel de situsuri (1 situs /250pb), mai frecvente [n oriC.

ADN-ul repetitiv codanteste reprezentat de operonii rrn(7 - la E.colisau 10 - la S. typhimurium]i care codific` ARNr), genele pentru ARNt(41 la E.coli) ]i secven\elerhs(engl. rearrangemnethot-spots,implicate [n generarea duplica\iilor genice prin crossing-over inegal [ntre secven\erepetate).



52/120

GENETIC LA PROCARIOTEGENOMUL ACCESORIU (plasmidial)Plasmidele

reprezint` material genetic accesoriu[n celula bacterian`,

Lederberg le define]te, [n 1952, ca unit`\i genetice extracromozomale, fizic independente denucleoid.

{n 1958, F. Jacob ]i E.L.Wollman le denume]te epizomiunit`\i genetice capabile de a existaalternativ at@t [n stare autonom`, c@t ]i integrate [n cromozomul bacterian.

Denumirea cea mai potrivit` este aceea de plasmide cu func\ii epizomale(starea liber`, [ncitoplasm`, reprezint` plasmidul, iar starea integrat` [n nucleoid, reprezint` epizomul).

Unii cercet`tori le consider` organisme acelulare sau specii moleculare, al`turi de virusuri,transpozoni, secven\e de inser\ie.

Prezen\a lor pare s` fie un fenomen universal [n lumea bacterian` (bacterii Gram pozitive sauGram negative), dar sunt [nt@lnite ]i la unele eucariote inferioare (drojdii sau fungi) precum ]i [nmitocondrii sau cloroplaste. Peste 300 din num`rul total de plasmide cunoscute p@n` [n prezent aufost descrise la E. coli.

GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)


53/120

GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)Plasmidele Sunt structuri moleculare invizibile prin tehnici uzuale in situ, dar vizibile la microscopul

electronic, dup` extrac\ie ]i purificare. Plasmidele sunt molecule de ADN dublu catenar,circular covalent [nchis (ADNdcCCC) sau liniar(mai rar, la Borrelia burgdorferi,holobacterii), care posed` informa\ie genetic` proprie ]i, de regul`, diferit` de cea anucleoidului (posed` un %GC diferit de cel al cromozomului bacterian).

Au calitate de repliconi, deci se replic` autonom de cromozomul bacterian ]i posed` chiarunele gene ce codific` enzime necesare propriei replic`ri.

Cromozomul bacterian exercit` [ns` un control asupra replic`rii plasmidiale care poate fiabsolut (c@nd plasmidul este integrat ca epizom [n nucleoid), stringent (pentru plasmidemari, aflate [n num`r mic [n celul`) sau relaxat (pentru plasmidele mici ]i numeroase).

Plasmidele se replic` prin trei mecanisme: Theta, Rolling Circle (RC-modelul cercului rotativ),Strand-Displacement(SD-modelul buclei D).

GENOMUL ACCESORIU ( l idi l)


54/120


Plasmidele Se transmit pe vertical`(de la o genera\ie la alta)

prin diviziune direct` - prin parti\ia echilibrat` anum`rului de plasmide din celula mam` [n celulelefiice, dar ]i pe orizontal`(de la un individ la altul,[ntr-o popula\ie) prin conjugare.

Sunt exemplul tipic de clonare natural`, in vivo,

fiind capabile s` transfere, pe l@ng` informa\iagenetic` proprie ]i unele gene cromozomaledeoarece, c@nd se desprind din cromozomulbacterian, pot prelua una sau c@teva gene de peacesta, din vecin`tatea situsului de integrare ]i s` le

transfere unei alte bacterii prin procesul deconjugare bacterian`.

Receptor



55/120

GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)Plasmidele Pot fi naturale (ColE1) sau artificiale (create prin tehnici de

inginerie genetic`) ]i sunt folosite cavectori [n experimentele

de clonare genic`. Nota\ia lor presupune, de regul`, la

[nceput, itemulp(exemple: pBR322, pUC18/19, pGEM ,

pBluescript).

Plasmida artificial` pBR322posed` gene marker(gene pentru

rezisten\` la antibiotice: ApRsau TcR) precum ]i numeroase

situsuri pentru endonucleaze de restric\ie(PstI, EcoRI,HindIII, BamHI, SalI, etc.), cu o topografie cunoscut`, utile [n

tehnicile de inginerie genetic` [n care se folosesc.

Exist` ]i plasmide criptice care par s` nu confere gazdei un

caracter adaptativ ]i se [ncadreaz` [n categoria selfish DNA.

{ns`, cele mai multe plasmide, confer` gazdei caractere

adaptative avantajoase(rezisten\` la antibiotice, la metalegrele, etc.) datorit` unor gene marker pe care le posed`.



56/120

(p )

Plasmidele con\in gene:

pentru propria replicare(originea replic`rii plasmidiale se noteaz` oriV pentru a se deosebi de

oriC de pe cromozom), stabilitate ]i parti\ie; pentru transferul pe orizontal` prin conjugare: operonul tra,din cadrul unui element genetic

superior, CONJUGON(pentru plasmidele autotransferabile, conjugative) ]i genele mob

(pentru plasmidele mobilizabile care pot realiza transferul conjugativ doar [n prezen\a altei

plasmide conjugative); pentru metabolismul centralal celulei gazd`, gene care controleaz` c`i metabolice esen\iale,

catabolice sau anabolice:

gene ce codific` enzime proteolitice, amilolitice, glicolitice, gene fixatoare de azot (genele nifde la

Rhisobium leguminosarium),

gene implicate [n metabolismul opinelor: octolina ]i nopalina, din plasmidul Tide laAgrobacteriumtumefaciens (care produce cancerul de colet la plante) etc.


57/120

Genele nifde laRhisobium leguminosarium

Plasmidul Tide laAgrobacterium tumefaciens



58/120

(p )Plasmidele con\in gene:

pentru fenotip adaptativ:

gene ce codific` antibiotice: de exemplu la Actinomicete din genul Streptomycessp. careproduc streptomicin` (S. griseus), kanamicin` (S. kanamiceticus), neomicin` (S. fradiae),cloramfenicol (S. venezuelae), tetraciclin` (S. aureofaciens), eritromicin` (S. erithreus),rifampicin` (S. mediterranei), nistatin (S. noursei) sau la bacterii formatoare de endospori:Micromonospora purpureagentamicin`, Bacillus polymyxapolimixin`, Bacilluscolistinuscolistin, B. licheniformisbacitracin`, Nocardia uniformisnocardicin`.

gene ce codific` bacteriocine- substan\e cu efect antimicrobian, inhibitor, de regul` asupraunor microorganisme [nrudite, dar ]i asupra unui spectru mai larg de bacterii, unele chiarpatogene ]i chiar asupra unor drojdii, fungi. Aceste gene pot fi localizate fie [ncromozomul bacterian, fie [n plasmide, mai ales la bacterii Gram pozitive din genurileLactobacillus, Streptococcus.Cele mai studiate ]i utilizate bacteriocine sunt: nisina,

diplococina, helveticina, plantaricina, brevicina, bulgaricina, lactocidina, reuterina,acidofilina, acidolina.



59/120



gene de rezisten\` la antibiotice, pentru care, plasmidele au fost denumite la [nceput, factori

R(au fost descoperite [n 1956, de c`tre Watanabe, pe tulpini de Shigella dysenteriae).

La bacteriile gram-negative, factorii R pot de\ine determinan\i de rezisten\` pentru practic toate

antibioticele ]i chimioterapicele cunoscute: macrolide (Mr), tetracicline (Tc), streptomicin` (Sr), sulfamide

(Su1), peniciline (P), ampicilina (Ap), cloramfenicol (Cf), grupul kana-neo-paromomicin`-aminosidin`

(A/Nr), grupul nitrofurantoin-furazolidon (N/Fr), cefalosporine (Cephr), acid nalidixic (ANr), gentamicin`

(Gr), polimixine (Por) etc.

Num`rul determinan\ilor de rezisten\` prezen\i concomitent pe un acela]i plasmid poate varia de la unul

(monorezistent) la 6-8 (multirezisten\`);

Av@nd n vedere rezisten\a ncruci]at`, un unic factor R poate induce rezisten\` fa\` de 10-15 antibiotice.

La stafilococ, un plasmid are n general un unic marker de R, dar o bacterie poate purta mai multeplasmide cu markeri diferi\i de rezisten\`;



60/120



gene de rezisten\` la bacteriocine; gene de rezisten\` la metale grele(Hg,

Co, Ni, Pb, Cd, Zn, Ag, Bi, Sb), iar

bacteriile purt`toare ale unor astfel de

plasmide sunt utilizate pentru

concentrarea acestor metale din diferite

medii;

gene pentru patogenitate, toxicitate ]i

virulen\`;



61/120


CLASIFICAREA PLASMIDELOR Dup` criteriul autotransferabilit`\iiexist` trei categorii de plasmide:

Conjugative sau autotransferabilecare sunt numite ]i plasmide transferabile,

infec\ioase, conjugoni sau transferoni. Ele posed` conjugonulcu operonul tra]ise pot transfera pe orizontal`, de la o bacterie la alta, [n cadrul unei popula\ii,

prin conjugare.

Mobilizabilecare nu posed` operonul tra, dar posed` gene mob]i pot realiza

transferul conjugativ doar [n prezen\a altei plasmide conjugative care s` ini\ieze

procesul.

Neconjugativesunt plasmide f`r` operonul tra ]i f`r` gene mob, deci nu pot

realiza conjugarea bacterian`.



62/120

GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)CLASIFICAREA PLASMIDELOR Dup` criteriul integr`rii [n cromozomul bacterianexist` dou` grupe de plasmide:

Epizomisau plasmide integrative ce pot exista alternativ at@t [n stare autonom`

c@t ]i [n form` integrat` reversibil [n nucleoid.

Neintegrative, plasmide care exist` doar [n stare autonom` ]i nu se pot integra

[n nucleoid.

Dup` criteriul incompatibilit`\iiprin care plasmide din aceea]i grup` nu pot coexista(nu se pot men\ine ]i propaga stabil) [n aceea]i linie celular` bacterian`, deoarece, fiind

acela]i replicon-type, au origini de replicare similare ]i intr` [n competi\ie molecular`

pentru acelea]i enzime implicate [n proces. La Enterobacteriaceaese cunosc 30 astfel de

grupe de incompatibilitate plasmidial`.


63/120

Incompatibilty group Plasmids

FI F, R386

FII R1

FIII Col B-K99, Col B-K166

FIV R124

IR62, R64, R483 (at

least 5 subgroups)

J R391

N R46

O R724

P RP4, RK2

Q RSF1010

T R401

W R388, S-a



64/120

GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)CLASIFICAREA PLASMIDELOR Dup` criteriul num`ruluide copii plasmidialeper celul`, sunt plasmide:

High-copycare au [ntre 10 ]i c@teva sute de copii per celul` bacterian`;

Low-copyposed` 1-10 copii per celul` bacterian`.

Dup` criteriul structurii moleculare, exist` dou` clase de plasmide: Circularecare sunt alc`tuite din ADNdc care, cel mai adesea, este CCC (engl. circular covalently closed) ]i

doar temporar, se poate [nt@lni ]i forma CO (engl. circular open) ce prezint` o leg`tur` fosfodiesteric`

desf`cut`, pe o caten`. In vivose mai [nt@lnesc ]i intermediari concatemeri (oligo/multimeri).

Liniarecare sunt formate din ADNdc liniar (L) ]i care pot fi:

Cu telomere [n ac de p`r(engl. hairpin), adic` cele dou` catene se continu` una pe cealalt` printr-o

leg`tur` covalent` ]i au palindroame terminale, bogate [n perechi A=T. Se [nt@lnesc la spirochete din

genul Borrelia, dar ]i [n mitocondrii la unele drojdii ]i la fungi.

Cu telomere invertoni, la care, cele dou` catene nu se continu` una pe cealalt`, ci prezint` fiecare, la

cap`tul 5 o protein` TP(engl. telomeric protein) ata]at` covalent. {n 1990, K. Sakaguchi, define]te cainvertoni o categorie de elemente genetice mobile, cu replicare autonom`, similare cu transpozonii, care

posed` la capete proteine TP. Astfel de plasmide se g`sesc [n mitocondrii, la fungi ]i la plante.



65/120

CLASIFICAREA PLASMIDELOR Dup` propriet`\ile majore(func\ionale)exist` mai

multe categorii de plasmide: Plasmide Fsau factori de fertilitate (engl. fertility)

con\in operonul tra(alc`tuit din 14-15 gene) carecontroleaz` transferul conjugativ [ntre bacteriadonor ]i cea receptor prin intermediul pilului deconjugare(denumirea veche - pil de sex). Primul

plasmid descris a fost plasmidul F de la E. coli(din grupul Inc F) care are 44,5kpb (cu 49% GC),din care 33,3kpb reprezint` operonul tra. Este unplasmid low-copy(1-2 copii/celul`), cu peste 70ORF-uri cartate p@n` [n prezent.

Operon tra

Ori T

Gene implicate[n replicare

Ori V


66/120



67/120


CLASIFICAREA PLASMIDELOR{n func\ie de prezen\a/absen\a, localizarea ]i structura plasmidului F, bacteriile pot fi: F-- celule bacteriene care nu posed` plasmid F nici liber, nici ca epizom. Are [ntotdeauna

rol de receptor[n conjugare. Erau considerate bacterii femele [n perioada c@ndconjugarea era asimilat` fenomenului de sexualitate.

F+- celule bacteriene (considerate mascule) care prezint` factorul de fertilitate [n form`extracromozomal` (1-2 copii/celul`). {ndepline]te rol de bacterie donor[n procesul deconjugare.


68/120


69/120

Integrarea mediat` de IS a plasmidului F [n cromozomul

bacterian

Transformarea unei bacterii F+ [n bacterie Hfr

Hfr (engl. high frequency of recombination) celule procariote care prezint`plasmidul F integrat ca epizom [n nucleoid ]i care prezint` un poten\ial crescut derecombinare a genelor cromozomale. Integrarea este posibil` deoarece plasmidul Fposed` 4 secven\e de inser\ie IS, care mai poart` denumirea de situsuri Hfr ]i caresunt omoloage cu situsuri din cromozomul bacterian. {ntre acestea se poate realizaproces de recombinare genetic`.



70/120

(p )

{n conjugare, o astfel de bacterie Hfr poate

[ndeplini rol de donor, chiar cu plasmidul [n form`

integrat` ]i atunci transferul conjugativ dintr-o

bacterie [n cealalt`, [ncepe cu regiunea lider]i rep-

incdin epizom, apoi o monocaten` [ntreag` a

cromozomului bacterian (deci toate genele

cromozomale) ]i la sf@r]it, partea final` din

epizom. Cele dou` bacterii donor ]i receptor

trebuie s` r`m@n` [n contact direct timp

[ndelungat. Prin experimente de conjugare

[ntrerupt` a fost realizat` harta cromozomului

circular de la E. coli, [n care distan\a dintre gene

este exprimat` [n minute de conjugare.

Conjugarea dintre o bacterie donor Hfr ]i o bacterie

receptor F-



71/120


CLASIFICAREA PLASMIDELOR

Fbacterii la care excizia epizomului F din cromozomul bacterian se face incorect ]iastfel plasmidul achizi\ioneaz` una sau c@teva gene cromozomale (care exist` [n celul`

tot [ntr-un singur exemplar, [n acest caz, doar [n plasmidul F). Poate avea rol de

donor [n conjugare. Fbacterii care rezult` [n urma conjug`rii dintre o celul` F ]i o celul` F- ]i care

posed` genele achizi\ionate de plasmidul F (recombinant) [n stare diploid` (at@t pe

cromozom, c@t ]i [n plasmid).



72/120


CLASIFICAREA PLASMIDELOR {n afar` de plasmidul F mai exist` ]i alte plasmide conjugative (cu operon tra) din alte grupe

de incompatibilitate: RP1, RP4 din grupul de incompatibilitate Inc P.

Plasmidul RP4se caracterizeaz` prin: o greutate molecular` de 40Mdal,

un procent de 60% GC,

prezen\a a 8 secven\e de inser\ie (IS),

trei gene marker de rezisten\` la antibiotice: ApR, TcR, KmR.

exist` [ntr-un num`r de 4-7 copii/celul` (este o plasmid` low-copy),

originea replic`rii ori Veste diferit` de originea transferului conjugativ ori T,

prezint` 1-3 regiuni tra(pentru autotransferabilitate) ]i o gen`pricare codific` o primaz` proprie.

posed` pili de conjugare rigizi, de aceea transferul conjugativ se poate realiza eficient doar pe suport solid. a fost descoperit` la Pseudomonas aeruginosa, dar ulterior ]i la alte gazde bacteriene Gram negative.



73/120


CLASIFICAREA PLASMIDELOR

Plasmide Rcon\in gene ce determin` rezisten\acelulei gazd` la antibiotice, sulfamide,

chimioterapice. Ele au caracter de conjugon

precum ]i capacitatea de a forma prinrecombinare agregate plasmidiale (plasmide

gigant) de rezisten\` multipl`. Ridic` mari

probleme [n prezent, [n medicin`, deoarece face

imposibil` tratarea unor maladii infec\ioase.



74/120

(p )

REPLICAREA PLASMIDELOR1. Replicarea plasmidelor liniarea fost elucidat` de H.Hinnebusch et al. [n 1993. La plasmidele cu telomere hairpin, ADN polimeraza trece de pe o caten` pe cealalt`, la

nivelul capetelor legate covalent, rezult@nd un intermediar replicativ concatemeric.

Ini\ierea replic`rii

Telomerele se rup]i se reunesc

Nick-are situs specific` la nivelultelomerelor

Formarea capetelor hairpin

Replicare



75/120

(p )

REPLICAREA PLASMIDELOR La plasmidele liniare cu telomere invertoni, primarea replic`rii este realizat` de proteina TP

care este legat` de o adenin` (A) de la cap`tul 5 al fiec`rei catene. {n citoplasm` se formeaz`noi complexe TP-A. Noul complex va dimeriza, prin intermediul proteinei TP, de cel existentla cap`tul 5 al fiec`rei catene, iar adenina nou-adus` se va lega prin dou` pun\i de hidrogen detimina de la capatul 3 al catenei opuse ]i, [n acela]i timp, ofer` cap`tul 3hidroxil liber pentru

o nou` leg`tur` fosfodiesteric` cu al doilea nucleotid, astfel av@nd loc elongarea noii catene [ndirec\ia 5-3

T

A

3

553

5Proteina TP

Proteina TP



76/120

REPLICAREA PLASMIDELOR2. Replicarea plasmidelor circularea fost elucidat` de M. Espinosa et al. [n 1995 ]i se realizeaz` prin

3 mecanisme: Theta, Rolling Circle(RC), Strand Displacement(SD).

Mecanismul Thetade replicare plasmidial` este similar celui de replicare a cromozomuluibacterian. Denumirea e dat` de forma intermediarului de replicare asem`n`toare literei grece]ti

theta.



77/120

REPLICAREA PLASMIDELOR CIRCULARE MECANISMUL THETA Relicarea plasmidei [ncepe de la regiunea oriV care cuprinde: 4-5 secven\e ADN cu repeti\ie

direct` (numite iteroni), o regiune bogat` [n perechiA/T]i cutiile dnaA.

Proteina care ini\iaz` acest mecanism de replicare este proteina Rep, singura enzim` din aparatulde replicare codificat` plasmidial (restul sunt codificate de gene din cromozomul bacterian ]i sunt

acelea]i cu cele care intervin [n replicarea nucleoidului).

Sinteza celor dou` catene noi (leading ]i lagging) se desf`]oar` unidirec\ional (]i nu bidirec\ional

ca [n cazul cromozomului bacterian), cuplat ]i cvasisimultan.

Plasmide care se replic` prin mecanismul Thetasunt: pSC101, P1, R1, RP4, RK2, RK6, Col E2,

ColE3.



78/120

(p )REPLICAREA PLASMIDELOR CIRCULARE MECANISMUL THETA Procesul de replicare decurge cu urm`toarele etape:

Ata]area situs specific` a proteinei Repla iteroni determin` curbarea moleculei de ADN plasmidial [n aceast`zon`, ceea ce favorizeaz` etapa urm`toare.

Ata]area proteinei DnaA(codificat` de o gen` cromozomal`) la cutiile dnaA. Ata]area complexului proteic DnaB-DnaCla regiunea din oriVbogat` [n A=T. Dna Bare func\ie de helicaz`

]i desface dublul helix [n aceast` zon`.

Ata]area unei ARN-polimeraze, cu rol de primaz` (codificat` de o gen` cromozomal` [n regiunea oriV) care

ini\iaz` sinteza unui primer ARN.

DNA polimeraza III asigur` etapa de elongare a replic`rii cu dezoxiribonucleotide complementare cu celecitite pe catena matri\`.

Direc\ia de replicare

Plasmid oriV Secven\ele din iteronila care se leag` proteina Rep


79/120



80/120

pREPLICAREA PLASMIDELOR CIRCULARE MECANISMUL THETAMecanismul de control negativ al replic`rii, elucidat la plasmida ColE1. ARN primer[ncepe s` fie sintetizat de la 555pb mai sus de oriV ]i este numit ARNII. Aceast` molecul` contine 6

resturi consecutive de guanin`, situate la aproximativ 265 pb de la cap`tul 5 al acesteia, care sunt complementare cu6 resturi consecutive de citozin`, aflate la 20pb [n amonte de oriV, pe catena matri\` ADN. Pe baz` decomplementaritate, se stabilesc triple leg`turi de hidrogen GC ]i are loc hibridizarea temporar` ADN-ARN II. RN-azaH desface o leg`tur` fosfodiesteric` pe primer ]i ADN polimeraza I elongheaz` primerul ARN la cap`tul 3OH, cu

dezoxiribonucleotide.

La 445 pb [n amonte de ori V, pe catena opus` (deci [n sens invers fa\` de ARN II primer), se sintetizeaz` o alt`

molecul`, numit`ARN antisens]i notat` ARN I. Acesta are 108 ribonucleotide ]i hibridizeaz` cu ARN II,modific@ndu-i acestuia conforma\ia astfel [nc@t nu-i mai permite s` hibridizeze cu matri\a ADN, [n regiunea oriV.{n acest fel replicarea este blocat` controlat, c@nd exist` un num`r suficient de plasmide [n celul`.

ARN I este instabil, iar hibridizarea lui cu primerul este facilitat` de proteina Rop(codificat` de gena rop). Astfel,ad`ugarea, [n mediul de cultur`, a unui inhibitor al sintezei proteice (cloramfenicolul), care blocheaz` sintezaproteinei Rop, dar nu ]i a ADN polimerazei I (care exist` [n stoc [n celul`), determin` cre]terea frecven\ei de ini\ierea replic`rii plasmidei Col E1, [n celula gazd` de E. coli(controlul negativ nu mai func\ioneaz`).Acest lucru este utiladesea in vitro, [n experimentele de amplificare plasmidial`.


81/120

Replicare Blocareareplic`rii


REPLICAREA PLASMIDELOR CIRCULARE


82/120

Mecanismul Strand Displacementmodelul buclei D)const` [n dislocare uneia din cele dou` catene ADN[n timpul procesului de replicare, sub forma unei

bucle (de unde ]i denumirea mecanismului)

Este [nt@lnit la plasmide din grupul deincompatibilitate IncQ (pRSF 1010), la care regiuneaoriVeste alc`tuit` din: 3 iteroni, o regiune bogat` [n

AT(31pb), o regiune bogat` [n GC(174pb) precum]i secven\ele cele mai importante: ssiAsau ssiB

situate fiecare pe o caten`, simetric ]i adiacent, de lacare porne]te replicarea [n momentul c@nd suntexpuse monocatenar.

Ini\ierea replic`rii decurge numai cu ajutorul unorproteine codificate plasmidial (RepA, RepB, RepC) ]inu depinde de enzime codificate de gene

cromozomale.




83/120

REPLICAREA PLASMIDELOR CIRCULAREMecanismul Strand DisplacementEtapele acestui mecanism de replicare sunt urm`toarele:

Ata]area proteinei RepCla secven\ele iteronidin oriV.Ata]area proteinei RepA, cu rol de helicaz` [n regiunea bogat` [nA/Tdin oriV]i desfacerea

dublului helix.

Ata]area proteinei RepB, cu rol de primaz`, la regiunea ssiBde pe o caten` a ADN-uluiplasmidial (aceea ce se replic` prima) ]i [ncepe sinteza unui primer ARN. Cealalt` caten`

([nt@rziat`) nereplicat` deocamdat`, pe care se afl` ssiA, este disclocat` ]i [ndep`rtat` treptat(de c`tre helicaza RepA), form@nd bucla D.

Ata]areaADN polimerazeice determin` elongarea catenei noi (leading) pe catena matri\` B. Lasf@r]itul acestei etape rezult` o molecul` de ADNdc circular` (catena matri\` B ]i catena nousintetizat` leading) ]i o molecul` de ADN monocatenar (catena matri\` A, ce forma bucla D),

pe care se afl` descoperit situsul ssiA]i de la care va [ncepe un nou proces de replicare acatenei noi, lagging. Deci, [n acest mecanism, sinteza celor dou` catene noi nu este cuplat` ]isimultan`.



84/120

Mecanismul Rolling circle(RC cerc rotativ) Este [nt@lnit la plasmidele pT181, de la Staphylococcussp.,

pUB110 ]i pC194 de la Bacillus subtilis, pMV158, pSN2, etc. Originea replic`rii este dubl`, adic` exist` c@te un oriVpe

fiecare caten`, situat` distan\at una de cealalt`: dso(double-stranded origin) ]i sso(single-stranded origin). Regiunea dsoasigur` ini\ierea replic`rii primei catene noi

(leading) ]i are dou` regiuni: bind- la care se ata]eaz` proteina

ini\iatoare Rep]i nick - unde proteina Reprupe o leg`tur`fosfodiesteric`.

Regiunea ssoasigur` replicarea catenei lagging. Deci ]i [n

acest mecanism replicarea celor dou` catene este defazat`, astfel

[nc@t cele dou` catene noi (leading]i lagging) nu se sintetizeaz`

simultan ]i cuplat.




85/120

REPLICAREA PLASMIDELOR CIRCULAREMecanismul Rolling circle(RC cerc rotativ) Etapele procesului de replicare prin mecanismul RC sunt :

Ata]area proteinei ini\iatoare Repsub form` de dimer, la regiunea binddindso.

Desfacerea unei leg`turi fosfodiesterice din secven\a nickdin dso,de c`treun monomer al dimerului Rep.Proteina Rep r`m@ne ata]at` printr-unmonomer, la cap`tul 5al catenei rupte, printr-o leg`tur` Tyr-fosfodiesteric`.Cap`tul 3al catenei rupte serve]te ca primer [n replicarea catenei leading.

Helicaza, codificat` de o gen` cromozomal`, desface dublul helix al ADN-ului plasmidial.

Proteina Ssb, de asemenea codificat` cromozomal, se leag` de cealalt` caten`matri\`, care temporar nu este replicat` ]i [i confer` stabilitate [n form`monocatenar`.



86/120

REPLICAREA PLASMIDELOR CIRCULAREMecanismul Rolling circle(RC cerc rotativ) ADN polimeraza IIIasigur` elongarea catenei noi, leading, cu dezoxiribonucleotide

complementare cu cele citite pe catena matri\` ]i relicarea nu se opre]te dup` parcurgereaintegral` a catenei matri\` circulare, ci se dep`]e]te regiunea dso, ]i continu` mai multe runde dereplicare, rezult@nd un intermediar concatemericformat din mai multe catene noi leading,cap lacap.

Monomerul Repse desprinde de catena matri\` r`mas` deocamdat` nereplicat` ]i reface leg`turilefosfodiesterice at@t pe aceasta (redevenind circular`), c@t ]i pe cea nou sintetizat`, leading. Astfel rezult`:

o molecul` de ADN monocatenar (cealalt` caten` matri\` din plasmidul ini\ial, care va fi replicat` ulterior,pornind de la sso, ]i sintetiz@ndu-se catena lagging),

o plasmid` [ntreag` din ADNdc (cu o caten` matri\` ]i una nou sintetizat` - leading),

concatemerul monocatenar, chiar pe m`sur` ce este elongat, []i sintetizeaz` catena complementar` ]i estefragmentat de o endonucleaz` [n monomeri plasmidiali bicatenari.



87/120

Plasmida pSC101 a fost folosit` pentru prima dat` ca vector de

clonare genic`, [n 1973, de c`tre Cohen,

este o plasmid` natural` care se [nt@lne]te la

tulpini de Salmonella]i Escherichia coli.

este o plasmid` low-copy(6-7 copii/celul`) ]i

de\ine un marker de rezisten\` la tetraciclin`[n care se reg`sesc situsuri pentru

restrictazele: HindIII, BamHI, BstI, SalGI.

are o lungime de 9263pb ]i a fost [n

[ntregime secven\ializat`.



88/120

Plasmida pSC101 Regiunea replicativ` a acestei plasmide are 2,2kpb]i este cuprins` [ntre situsurile a dou` endonucleaze de restric\ie:

HincII]i RsaI.De\ine trei subregiuni:

genarepA care codific` proteina RepA (cuprinde 316 aminoacizi ]i are o greutate molecular` de 37kdal), geneleparA]i B(ce codific` proteinele Par A ]i Par B) ]iparS(situsul la care se ata]eaz` proteinele Par A ]i B) cu

rol [n parti\ia controlat` ]i echilibrat` a plasmidelor low-copy [n celulele fiice rezultate prin diviziune direct`,

subregiunea oriV(aproximativ 200pb) care cuprinde:

un cluster de 3 secven\e repetate direct(RS1 24pb, RS2 18pb, RS3 24pb) la care se ata]eaz` proteinaRep A.De la un promotor situat [n mijlocul lui RS2, [ncepe sinteza unui ARN-Y, care faciliteaz` deschiderea

dublului helix [n regiunea oriV; cutiile dnaAla care se ata]eaz` proteina DnaA;

dou` secven\e repetate direct(RS1 ]i RS2), de c@te 13pb, la care se ata]eaz` complexul proteic DnaB-DnaC(replicare prin model Theta). ARN polimeraza (primaza) se ata]eaz` la promotorul pentru ARN-Y situat [nclusterulcu cele trei secven\e repetate direct;

o secven\` bogat` [n perechiA=T la care se ata]eaz` proteina histone-likeIHF form@ndu-se astfel, replisomul.

Legarea simultan` a proteinelor RepA, DnaA, DnaB-DnaC, este favorizat` de curbarea cu 150a moleculei deADN, determinat` de ata]area proteinei IHF la secven\a bogat` [n A=T.


89/120



90/120

MECANISME GENETICE DE CONTROL ACTIV AL STABILIT~|II }IPARTI|IEI PLASMIDIALE

Asigur` men\inerea ]i repartizarea echilibrat` a plasmidelor [n celulele fiice rezultate prin

diviziune direct`, se desf`]oar` cu consum energetic din partea celulei bacteriene ]i sunt

necesare, [n special, pentru plasmidele low-copy.

Cre]terea frecven\ei de ini\iere a replic`rii plasmidiale care asigur` un num`r

suficient de mare de copii/celul`, ca s` permit` distribu\ia lor randomic` [n celulele

fiice. Sisteme de rezolu\ie multimeric` (mrs multimer resolution system) identificate

la plasmidele: ColE1, RP4, F, P1. Con\in gene ce codific` o resolvaz`, enzim`

r`spunz`toare de scindarea multimerilor plasmidiali (plasmide gigant formate prin

unirea mai multor plasmide de acela]i fel) [n monomeri. Astfel cre]te num`rul de

copii discrete ale plasmidului [n celul` ceea ce permite repartizarea lor relativechilibrat`, [n celulele fiice.

GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)MECANISME GENETICE DE CONTROL ACTIV AL STABILIT~|II


91/120

}I PARTI|IEI PLASMIDIALESistemele genetice de parti\ie activ` sunt variate:

1. Lociparexist` [n multe plasmide. Mai studia\i sunt lociiparde la plasmidul P1

Plasmidul P1este de fapt un bacteriofag care, [n stadiul de profag, nu se integreaz` [n nucleoid, ci se circularizeaz` ]idevine plasmid-like (se comport` ca un plasmid). Locusulparcuprinde trei gene:parAce codific` proteina ParA, genaparBce codific` proteina ParB ]i gena sau situsulpar Ssau incB(3 palindroame a c@te 13pb) la se ata]eaz` proteineleParA ]i ParB. Etapele mecanismului sunt:

Ata]area a trei monomeri proteici ParB la cele trei palindroame din situsul incBal fiec`rei plasmide;

Dimerizarea plasmidelor prin intermediul monomerilor ParB existen\i pe fiecare;

Ata]area la complexul astfel format (dou` copii plasmidiale + trei dimeri ParB) a unui dimer de proteine Par A; Ancorarea complexului, prin intermediul dimerului ParA, la un receptor proteic din membrana plasmatic`, [n zo

de ini\iere a septului intercelular (celula este [n diviziune). Complexul proteic este alc`tuit din proteinele Fts I-FtsA, care se ata]eaz` sub form` de dimer, de o parte ]i de alta a unei proteine FtsZ, de la nivelul c`reia porne]teseptul ce va separa cele dou` celule.

Pe m`sur` ce septul intercelular [nainteaz`, separ` [n cele dou` celule c@te o copie a plasmidului, legat` prin trei

monomeri ParB, de o protein` ParA, care se leag` de un complex FtsI-FtsA din membrana plasmatic`


92/120

FtsZ FtsIFtsI

FtsAFtsA

Membrana bacterieiSeptul intercelular

3 monomeriParB

IncBParA

Plasmid



93/120

2. Sisteme ccd(coupled cell division) au fost descrise la plasmidul F, ulterior ]i la alte plasmide. Sistemul de\inedou` gene: ccd Ace codific` proteina Ccd Ade 8,3Kdal ]i gena ccd Bce codific` proteina Ccd Bde 11,7Kdal.Proteina Ccd B(are rol de represor) blocheaz` activitatea ADN girazei ]i astfel inhib` replicarea ADN ]i duce la

moarte celular`.

Proteina Ccd A(are rol de antirepresor) se cupleaz` cu Ccd B]i astfel o inactiveaz`. {ns`, proteina Ccd Aesteinstabil` [n celul`, este rapid degradat` de proteaza Lon. Pentru asigurarea replic`rii normale, trebuie creat un stoccitoplasmatic de protein` CcdAprintr-o rat` crescut` a transcrierii genei ccdA.Astfel,

descenden\ii F+ posed` gena ccdAcare, prin transcriere intens`, asigur` sinteza antirepresorului r`spunz`tor de blocareaactivit`\ii represorului CcdB]i deci, ADN se replic` normal.

descenden\ii F-, care nuau primit o copie a plsmidului F, nu posed` gena ccdA, ca urmare proteaza Lon degradeaz`rapid stocul citoplasmatic de protein` Ccd Aprimit de la celula mam`, iar proteina CcdB, existent` ]i ea [n stoccitoplasmatic, []i exercit` func\ia de represor asupra ADN-girazei, blocheaz` replicarea ]i determin` moartea celulei.

Deci, descenden\ii f`r` copii plasmidiale sunt elimina\i din popula\ie.

MECANISME GENETICE DE CONTROL ACTIV AL STABILIT~|II }I PARTI|IEI PLASMIDIALESistemele genetice de parti\ie activ` sunt variate:

GENOMUL ACCESORIU (plasmidial)MECANISME GENETICE DE CONTROL ACTIV AL STABILIT~|II }I PARTI|IEI PLASMIDIALE


94/120

3. Sisteme hok-mok-soksunt descrise la plasmidele R1, F, RP1. Ele de\in trei gene:

gena hokare 160pb, codific` proteina Hokcare modific` poten\ialul electric de membran`, opre]te procesul derespira\ie celular` (func\ie care la procariote este [ndeplinit` de complexe enzimatice localizate [n plasmalem`);

gena mokcu 150pb, situat` [n amonte de gena hok, pe aceea]i caten`, cele dou` gene fiind co-transcrise(transcriere policistronic`). Deci, ca s` aib` loc transcrierea genei hok,trebuie s` fie integr` ]i activ` gena mok,pentru c`, de fapt cu aceasta [ncepe transcrierea;

gena sok are 130pb, este suprapus` par\ial cu gena mok, dar pe cealalt` caten` ADN. Transcriptul ARNsok

hibridizeaz` cu ARNmok,bloc@nd transla\ia co-transcriptului ARNmok-ARNhok. {ns` ARN sokeste extremde instabil ]i este necesar` o rat` crescut` a transcrierii genei sok.

Deci,

Descenden\ii R1+ posed` gena soktranscris` intens pentru a asigura o cantitate suficient` de ARNsokcare, princuplare cu ARNmok, s` fac` imposibil` traducerea co-transcriptului ARNmoh-ARNhok. {n aceste condi\ii ([n lipsaproteinei Hok), respira\ia celular` nu este afectat`, iar bacteriile se dezvolt` ]i se divid normal.

Descenden\ii R1-, care nu au primit o copie a plasmidului, nu posed` gena sok, ARNsok(mo]tenit ca stoc de la celulamam`) este rapid degradat, are loc transla\ia cotranscriptului ARNmok-ARNhok, iar proteina Hokafecteaz` fiziologiaplasmalemei ]i, implicit, respira\ia celular`, iar bacteriile nu supravie\iuesc.

Sistemele genetice de parti\ie activ` sunt variate:


95/120

VECTORI ADN

T h l i ADN bi t ( l i ) i t f l


96/120

Tehnologia ADN recombinant (clonare genica) asigura transferul

de material genetic de la o specie la alta, mai mult sau mai putin

indepartata filogenetic.

Un sistem clonator de gene are 5 componente:

AND pasager(exogen) ce urmeaza a fi transferat in celula gazda si care

contine gena sau genele de interes; are greutate moleculara mica;

Vectorulsau vehiculul care transfera genele, le multiplica si le mentine in

celula gazda. Poate fi: plasmid,

bacteriofag l sau derivati ai acestuia,

alte virusuri,

cosmid (plasmid + situsul cos de la fagul l),

fagimid (plasmid + ADN de la fagi filamentosi).

Endonucleaze de restrictiecare taie in situsuri specifice si formeaza capete

adezive (coezive sau lipicioase) sau netede;

AND-ligazece catalizeaza legarea covalenta a ADN-ului pasager la vector;

Celula gazda(E. coli, S. cerevisiae, alte celule: vegetale sau animale)

VECTORI ADN


97/120

VECTORI ADN

Etapele principale ale unei experiente de transfer de gene: Obtinerea ADN vector;

Obtinerea fragmentelor de ADN pasager (heterolog);

Obtinerea moleculelor de ADN hibride prin insertia pasagerului

in vector; Introducerea ADN recombinant (hibrid) in celula gazda (prin

transformare, transductie, conjugare, transfectie);

Selectia si caracterizarea recombinantilor;

Exprimarea moleculelor de ADN clonate in celula gazda.

VECTORI ADN


98/120

Proprietatile vehiculelor plasmidice:

Sa aiba dimensiuni cat mai reduse;

Sa aiba o capacitate cat mai mare de a accepta ADNheterolog;

Sa posede un cluster PCS=Poly Cloning Site(MCS =Multi Cloning Site) care sa contina un numar cat mai mare

de situsuri specifice pentru restrictaze; Sa prezinte o serie de markeri genetici (rezistenta la

antibiotice, proprietati fermentative, etc.) care lipsesc incelula gazda, pentru a usura selectia recombinantilor;

PCS sa fie localizat intr-o gena care prin neexprimarea eifenotipica (dupa ce in ea s-a inserat ADN-ul heterolog) sapermita contraselectia;

Sa fie usor de izolat, manipulat, sa fie intr-un numar catmai mare de copii per celula.

VECTORI ADN1. Vectori de clonare


99/120

1. Vectori de clonare

plasmidiali

pBR322

Construita in vitrode H.W.Boyer, in

1977; are 2,6 x 106daltoni;

Contine:

gena de rezistenta la tetraciclina

TcR

derivata de la pSC101 gena de rezistenta la ampicilina

ApRderivata de la pRSF212;

Originea replicariii de la Col E1;

Situsuri pentru un numar foarte

mare de endonucleaze derestrictie: PstI in gena ApR,

HindIII si EcoRI intre cele doua

gene de rezistenta TcRsi ApR,

BamHI si SalI in gena TcR


100/120

pBR322

VECTORI ADN

1 V t i d l l idi li


101/120

1. Vectori de clonare plasmidiali

pUC18/19

Sunt vectori de clonare, dar nu permitexprimarea ADN heterolog;

2,69 kpb;

Doi markeri genetici: ApRsi gena defectiva

lacZ care exprima capatul NH2terminal al b

galactozidazei, dar e capabila decomplementatie intra-alelica cu o alta forma

defectiva lacZ(ce codifica capatulCOOH

terminal al bgalactozidazei) dintr-o gazda

bacteriana adecvata in care se va reface

integral bgalactozidaza in urma clonarii; PCSformat din numeroase situsuri pentru

restrictaze. PCS are orientare inversa in

pUC18 fata de pUC19;

lac I codifica represorul genei lacZ (deci e

gena reglatoare).


102/120

pUC19


103/120

VECTORI ADN

1 V t i d l l idi li


104/120

1. Vectori de clonare plasmidiali

pGEM 3/4 (si 3z/4z)

Vector de clonare, dar si de exprimare a ADN-ului heterolog; Contine:

oriV de la Col E1;

ApR

PCS cu situsuri pentru foarte multe restrictaze, orientat invers la

3 fata de 4 si flancat de doi promotori din fagii SP6 si din T7

(orientati invers unul fata de altul, pe cele doua catene ale ADN,

permitand transcrierea genelor de interes clonate in PCS, pe

ambele catene); pGEM3Z/4Z are, in plus, gena defectiva lac Z de la pUC18/19;


105/120

VECTORI ADN

2 Vectori de clonare derivati de la fagi filamentosi


106/120

2. Vectori de clonare derivati de la fagi filamentosi

Fagii filamentosi (M13, f1, fd, Pf1) sunt formati din ADN monocatenar circularinchis, catena infectanta +;

Greutate moleculara de 2 x 106daltoni; Replicare RC (Rolling circle) se formeaza un intermediar dublu catenar din

care, catenava servi ca matrita pentru transcrierea genelor fagice, dar sipentru sinteza (prin replicare) a catenelor + sub forma unui intermediarconcatemer ce va fi scindat in genomuri individuale.

VECTORI ADN M13 (6,4kpb) specific pentru


107/120

M13 (6,4kpb)specific pentruE. coli.

Prezinta omologie cu

genomul fagilor f1 si fd;

90% din genom sunt gene cecodifica proteine, separateintre ele doar de cateva

nucleotide; mai mari suntregiunea intergenica majoraIG 1(situata intre genele II siIV) si IG2(intre genele VIIIsi III).

M13mp18/19are 7,25kpb,are inserata in IG1 unfragment din pUC 18/19 cecontine gena lacZ, PCS sigena lac I.

VECTORI ADN


108/120

3. Vectori de clonare hibrizi: fagimide si cosmide

Fagimide

Combina caracterele de plasmide: oriVde la Col E1 (ce asigura replicarea dupa

model RC si mentine forma plasmidiala standard) si o gena de rezistenta la

antibiotice,

Cu caractere de fag filamentos: gene pentru morfogeneza particulelor virale si

regiunea intergenica majora IG1care, in prezenta unui fag filamentos

helper (posesor al genei II ce codifica endonucleaza II ce interfera cu IG1)asigura replicarea dupa modelul fagilor filamentosi (cu intermediar

concatemer).

pUC118/119

- stabilitate mai mare,- accepta AND heterolog mai mare decat fagii filamentosi,

- oriV de la ColE1 dar si ori V de la f1 sau M13;

- PCS si gene marker ApR(pentru selectie) lacZ (permite contraselectie)


109/120


110/120

VECTORI ADN

3. Vectori de clonare hibrizi: fagimide si cosmide


111/120

pBluescript

MCS in gena lac Z pentru 20 de

restrictaze, incadrat de promotorii T3

si T7 (permit transcrierea ambelor

catene ale ADN-ului heterolog

inserat in MCS)

ApR, lac Z pentru selectie si

contraselectie;

oriV de la f1, dar si de la un plasmid;

In prezenta fagului M13 helper,

AND heterolog se va replica dupa

modelul fagilor filamentosi si se

formeaza o monocatena concatemera

ce poate fi utilizata pentru obtinerea

de sonde pentru hibridizarea

moleculara.

Fagimide:

VECTORI ADN3. Vectori de clonare hibrizi: fagimide si cosmide


112/120

Derivati din genomul fagului lFagul l: A fost folosit pentru prima data in experiente de clonare,in 1974, de catre Murray;

Are dimensiuni mari: 48 kpb, 3,1 x 107daltoni,aproximativ 50 de gene;

ADN dc liniar care are la capetele 5 ale fiecarei catenecate 12 nucleotide ce formeaza capete coezive

complementare ce permit circularizarea cand infecteazacelula gazda (cercuri Hershey);

Prin asocierea capetelor coezive se formeaza situsul cos;

Partea centrala a genomului cuprinde gene responsabile de recombinare (red, gam, bio), gene

pentru lizogenie (integrarea ca profag in cromozomul gazdei si replicare sincrona cu acesta):

att, int, xis. Deoarece aceasta regiune (40% din genom) cuprinde gene neesentiale ce pot fi

indepartate si inlocuite cu ADN heterolog, aceasta regiune se numeste regiune stuffer; 1/3 din genom cuprinde genele A W B C D E F Z..J ce codifica proteine ale capului si cozii;

1/3 din genom cuprinde gene pentru reglare (cI, cro) si imunitate la suprainfectie fagica, gene

pentru replicare (O, P, Q) sau gene pentru ciclul litic (S, R);

In ciclul evolutiv prezinta doua optiuni: ciclul liticsi ciclul lizogen


113/120

VECTORI ADN3. Vectori de clonare hibrizi: fagimide si cosmide


114/120

Derivati din genomul fagului l: Vectori insertionalicand ADN-ul se insera intr-un situs unde a

taiat o endonucleaza de restrictie si nu inlociueste un fragmentde ADN stuffer;

Vectori de substitutiecand ADN-ul heterolog inlocuieste ADNstuffer deoarece restrictaza gaseste doua situsuri specifice ceflancheaza fragmentul.

lCharonsunt vectori insertionali sau de substitutie, de clonare(pentru constituirea bancilor de gene) nu si de exprimare.

F. Blattner construieste in 1977 16 vectori Charon

lCharon 4Apoarta un ADN heterolog de 0-6kpb (prin insertie) sau de 7-20kpb (prin substitutie);

lCharon 40este numai vector de substitutie, poseda 2 PCS(fiecare cu cate16 situsuri) cu orientare inversa, regiunea stuffer poseda o secventa repetatade 80 de ori (operonul lac + un fragment de ADN de la un adenovirus), intrerepetitii se gaseste situsul pentru endonucleaza NaeI , accepta un ADNheterolog mare (9,2 - 24,2 kpb).


115/120

VECTORI ADNDerivati din genomul fagului l:


116/120

g g

l EMBL: vectori de clonare, nu de exprimare, de substitutie(deoarece regiunea stuffer e incadrata de 2 PCS-uri orientate invers cu

cate 3 situsuri), accepta ADN heterolog de 20 kpb; Ex. l EMBL 4 are

in PCS situsuri pentru EcoRI, BamHI, SalI.

lgt: vectori insertionali, de clonare dar si de exprimare, accepta ADNheterolog de dimensiuni mici (6kpb). Situsul EcoRI e situat in gena

imm(pentru imunitate).

l DASH: vectori de exprimare si de substitutie, au regiunea stuffer(cu genele red, gam si bio) flancata de 2 PCS-uri cu cate 7 situsuri

orientate invers si insotite de promotorii T3 si T7 (deci servesc pentru

obtinerea sondelor ARN.

l ZAP: vectori de insertie care au in regiunea stuffer, fagimidulpBluescript SK, poseda 1 PCS in regiunea terminala a genei defective

lacZ


117/120


118/120

VECTORI ADN

C id


119/120

Cosmide:

Poseda oriV de la ColE1 si gena ApR(pentru replicare, selectie);

Poseda situsul cosde la fagul l(permite impachetarea in vitrosi

propagarea prin transductie si transfectie);

Accepta AND heterolog mare (45kpb), chiar si a unor gene

eucariote intregi;

Construite pentru prima data de J. Collins in 1978.

pJB8: ori V de la Col E1; ApR, situsul cosde la fagul lCharon

4A, PCS pentru 4 endonucleaze BamHI, EcoRI, ClaI, Hind III.

c2RB: ori V de la Col E1; ApR, KmR, PCS pentru 4

endonucleaze (identic cu cel de la pJB8), 2 situsuri cosce

flancheaza gena KmR.


120/120

Date post:	15-Oct-2015
Category:	Documents
Upload:	sorina-georgiana
View:	133 times
Download:	8 times

INGINERIE GENETICA-1

Documents