Inginerie Genetica

TEHNOLOGIA ADN RECOMBINANT

CAPITOLUL II


Tehnologia ADN recombinant se refer la metodologia obinerii moleculelor de ADN recombinant, adic de realizare "in vitro" a unor molecule de ADN noi prin mbinarea de fragmente provenite fie din genomul unor specii biologice diferite, fie de la aceeai specie. Imbinarea respectivelor fragmente se realizeaz ntr-o ordine diferit de cea natural, astfel nct elementele genetice utilizate capt o structur aparte, conferind organismului n care sunt introduse proprieti noi pe care nu le-ar dobndi pe cale natural. Aa cum s-a prezentat anterior (fig.1), pentru a obine moleculele de ADN recombinant este necesar s se parcurg mai multe etape care pot fi sintetizate astfel: 1. izolarea genelor naturale sau sinteza chimic a unor molecule de ADN ce codific proteinele dorite; 2. selecia unui vehicul sau vector adecvat care s transporte genele respective i apt s se replice autonom n celula receptoare; 3. inseria genelor strine n structura genetic a moleculei vector i obinerea unei himere moleculare; 4. introducerea acesteia ntr-o gazd specific i transformarea ei; 5. asigurarea condiiilor care permit exprimarea informaiei strine n celula acceptoare; 6. selectarea celulelor modificate genetic din populaia celular rezultat prin multiplicare; 7. evidenierea produsului genei n celulele modificate sau n mediul de cultur al acestora i purificarea lui pentru a fi folosit n scopurile pentru care s-au realizat tehnicile respective.

35


2.1. Etapele de lucru pentru obinerea i selecia moleculelor recombinate de ADN Scopul experimentelor de inginerie genetic este acela al obinerii moleculelor de ADN prelucrate in vitro astfel nct ele s conin genele de interes i s poat fi transferate n gazde corespunztoare. Etapele de lucru ce au ca rezultat obinerea acestor molecule presupun elaborarea unor metode de izolare i purificare a acizilor nucleici, a utilizrii unor enzime specifice i selectarea unor vectori de clonare adecvai. 2.1.1. Izolarea i purificarea acizilor nucleici Realizarea experimentelor de clonare a genelor presupune ca etap de baz purificarea unor diferite tipuri de molecule de acizi nucleici: ADN celular total (din celule vegetale, animale, bacteriene sau din levuri), ADN plasmidial, ADN viral sau ARN. In funcie de tipul de molecule de acizi nucleici i de organismul de origine au fost elaborate numeroase metode de izolare i purificare. Indiferent de metoda utilizat este necesar parcurgerea mai multor etape: obinerea (cultivarea) materialului biologic; liza celulelor pentru eliberarea acizilor nucleici; ndeprtarea componentelor celulare nedorite (resturi celulare, proteine etc); purificarea acizilor nucleici de interes; concentrarea acizilor nucleici obinui anterior. 2.1.1.1. Izolarea ADN total Pentru izolarea ADN total se utilizeaz fie fragmente de esuturi (vegetale sau animale), culturi celulare sau suspensii celulare. Indiferent de tipul de celule utilizate n experimente este necesar liza acestora, proces realizat prin metode variate (liza chimic n prezena unor soluii alcaline i/sau a unor detergeni; liza enzimatic cu ajutorul unor enzime specifice; liza produs prin procedee fizice: ultrasonicare, nghearea celulelor n azot lichid, metode mecanice etc). Protejarea de aciunea nucleazelor endogene a ADN liberat prin spargerea celulelor se realizeaz, de regul, prin folosirea unor soluii tampon ce conin EDTA (reactiv ce leag ionii de magneziu fcndu-i inaccesibili DN-azelor, ai cror cofactori sunt). De asemenea, dup ndeprtarea prin centrifugare a resturilor celulare, soluia apoas obinut este supus unor tratamente suplimentare ce au drept scop degradarea ARN (prin adugarea RN-azei) sau a proteinelor contaminante (prin folosirea unor proteaze sau prin extracie cu fenol). ADN este apoi recuperat prin precipitare cu etanol (2-2,5 volume), n36


prezena unor cationi monovaleni (de exemplu, ioni de sodiu n concentraie de 0,3M) i apoi prin centrifugare. Deseori, ADN obinut este redizolvat n tampon, proces urmat de o nou rund de deproteinizare, ceea ce asigur o puritate mai bun preparatului. Dac este ns necesar un grad foarte ridicat de puritate, soluia de ADN este supus ultracentrifugrii (n gradient de clorur de cesiu). 2.1.1.2. Izolarea ADN plasmidial Pentru purificarea ADN plasmidial au fost elaborate numeroase metode dar utilizarea uneia sau a alteia depinde de scopul urmrit: evidenierea prezenei plasmidelor n celulele bacteriene sau purificarea plasmidelor i utilizarea lor n diferite experimente (transformarea genetic, clivare cu enzime de restricie, clonri de gene etc). Toate metodele elaborate pn n prezent pentru izolarea plasmidelor bacteriene implic trei etape de baz: cultivarea bacteriilor; depunerea i liza celular; purificarea ADN plasmidial (Mazza, 1986). Posibilitatea de a izola selectiv ADN plasmidial i de a ndeprta ADN cromosomal se datoreaz unor diferene importante dintre cele dou tipuri de molecule. Astfel, ADN cromosomal este reprezentat de molecule de dimensiuni mari, legate de membrana plasmatic, el rmnnd fixat de resturile celulare rezultate dup spargerea celulelor. Avnd dimensiuni mari, moleculele de ADN cromosomal sunt linearizate i fragmentate n cursul procesului de extracie, n timp ce ADN plasmidial este obinut, n cea mai mare parte, sub forma unor molecule circulare nchise covalent (CIC). De asemenea, cele dou tipuri de molecule se comport diferit n prezena unor detergeni (SDS) sau la concentraii mari de sruri. Expunerea la temperaturi ridicate sau tratarea cu soluii cu pH puternic alcalin (12,0 12,4) determin ruperea legturilor de hidrogen dintre cele dou catene ale moleculelor de ADN, ducnd la denaturarea acestora. Datorit conformaiei moleculare speciale (CIC), catenele de ADN plasmidial denaturat se menin alturate, astfel c dup rcire, respectiv neutralizare, aceste molecule redobndesc configuraia iniial. In schimb, ADN cromosomal rmne n stare denaturat fiind eliminat n cea mai mare parte dup centrifugare. Moleculele ce contamineaz soluia de ADN (ARN sau proteine) sunt eliminate prin tratamente similare celor menionate pentru ADN total, iar recuperarea ADN plasmidial se face tot prin centrifugare dup precipitarea cu alcooli (alcool izopropilic sau alcool etilic). Pentru o purificare nalt a ADN plasmidial se poate utiliza ultracentrifugarea n gradient n clorur de cesiu, metod ce permite separarea nu

37


numai a tipurilor diferite de molecule ci i a moleculelor de ADN plasmidial cu conformaii moleculare diferite (fig.20).proteine ADN linearizat sau crestat (conformaia CD) ADN de tip CIC Sediment reprezentat de molecule de ARN Fig.20. Separarea moleculelor de ADN prin ultracentrifugare

2.1.1.3. Izolarea ADN viral Pentru obinerea ADN viral este necesar mai nti s se obin celulele ce reprezint gazda specific a virusului de interes. De cele mai multe ori, multiplicarea viral este nsoit de liza celulelor gazd (aa cum este cazul bacteriofagilor litici), astfel nct particulele virale sunt obinute din lizatul celular prin precipitare (de exemplu, prin precipitare cu polietilenglicol) urmat de centrifugare. ndeprtarea capsidei virale se realizeaz prin tratament cu fenol sau prin folosirea unor proteaze. ADN viral este recuperat, dup precipitare, prin centrifugare sau ultracentrifugare n gradient de CsCl. 2.1.1.4. Izolarea moleculelor de ARN In anumite tipuri de experimente n care izolarea genelor direct din moleculele de ADN nu este posibil, pentru fragmentelor de interes este necesar utilizarea unor molecule de ARN care sunt apoi convertite, prin reverstranscriere, la molecule de ADN corespunztoare. Izolarea moleculelor de ARN este relativ complicat de faptul c RN-aza endogen este capabil s degradeze cea mai mare parte a ARN celular. Inactivarea acestei enzime termostabile i rezistente la aciunea EDTA sau a detergenilor este realizat prin folosirea unui inhibitor specific: dietilpirocarbonat. De regul, metodele de izolare ale ARN permit obinerea de ARN total. Pentru purificarea unui anumit tip de ARN se folosesc metode specifice ce in cont de anumite38


particulariti ale moleculelor de interes. Spre exemplu, pentru obinerea ARNm se ine cont de faptul c acest tip de ARN, izolat din celule eucariote, prezint la captul 3 o coad monocatenar poliA. Pornind de la aceast caracteristic, pentru purificarea ARNm se utilizeaz metoda cromatografiei de afinitate pe o coloan cromatografic ce conine o umplutur specific la care sunt legate resturi de poliT sau poliU. Secvenele poliT sau poliU interacioneaz specific, pe baz de complementaritate, cu coada poliA a ARNm, legnd moleculele respective. Eluarea moleculelor de interes se realizeaz cu ajutorul unor soluii tampon specifice, iar apoi ARNm este concentrat prin precipitare cu etanol i recuperat prin centrifugare. 2.1.1.5. Determinarea puritii i concentraiei de acizi nucleici Utilizarea acizilor nucleici n diferite experimente este condiionat de un anumit grad de puritate i o cantitate corespunztoare. Concentraia de acizi nucleici din diferite probe se poate determina pe baza absorbiei radiaiilor ultraviolete, tiut fiind faptul c absorbana radiaiilor UV cu lungimea de und de 260nm este direct proporional cu cantitatea de ADN din soluie. Determinrile efectuate asupra unor probe cunoscute (n cuve cu grosimea de 1 cm) au stabilit c valoarea 1,00 a absorbanei la 260 nm corespunde unei concentraii de 50 g/ml ADN dublu catenar sau 40g/ml ARN. Variaia absorbiei n ultraviolet a soluiilor de ADN permite studiul denaturrii acestuia. Odat cu trecerea de la forma dublu catenar la forma monocatenar, absorbia soluiilor de ADN crete cu pn la 40% (efect hipercromic), variaie care depinde de procentul bazelor G-C. Pe baza proprietilor de absorbie a soluiilor de acizi nucleici, se poate evalua puritatea acestora. Acizii nucleici au un spectru de absorbie ntre 250 320 nm. O extincie, la 320 nm, mai mare cu cteva procente dect cea corespunztoare lungimii de und de 260 nm, indic prezena altor tipuri de molecule n soluie. n cazul acizilor nucleici izolai de la E. coli o astfel de contaminare este foarte rar dar pentru preparatele obinute de la alte organisme, absorbia la 320 nm poate fi cu pn la 10% mai ridicat dect la 260 nm. Pentru determinarea tipului de molecule cu care proba este contaminat se citesc extinciile soluiilor la dou lungimi de und diferite: 260 nm lungimea de und la care acizii nucleici au absorbia maxim i 280 nm lungimea de und la care proteinele au absorbia maxim.39


Rezultatele obinute pn n prezent au permis stabilirea unor, aa numite, criterii de puritate: - o valoare a raportului A260 / A280 ntre 1,65 i 1,85 indic o puritate ridicat a soluiei de acizi nucleici, dac procentul bazelor G C este unul obinuit; - valori mai mari de 1,85 ar indica prezena n soluie a unei cantiti mari de ARN; - valori sub 1,65 indic o contaminare cu proteine sau fenol a probei analizate. De asemenea, nainte de utilizarea probelor de ADN n experimente de inginerie genetic este necesar s existe, n plus, informaii legate de conformaia molecular a ADN; dac ADN plasmidial este contaminat cu ADN cromosomal sau dac ADN cromosomal este puternic fragmentat. Dac puritatea probei de ADN de interes se poate stabili spectrofotometric, celelalte informaii se pot obine prin utilizarea altor tehnici, cum sunt cele electroforetice. Metoda standard de separare i identificare a moleculelor de ADN izolate dintr-un anumit organism este electroforeza n gel de agaroz. Principiul general al metodei const n faptul c, la pH alcalin sau neutru, acizii nucleici au sarcin negativ i, prin urmare, dac sunt plasai ntr-un cmp electric, ei vor migra spre anod (+). Atunci cnd dimensiunea fragmentelor de ADN este foarte mic (sub 1000 pb), pentru separarea electroforetic se prefer gelul de poliacrilamid, a crui concentraie este aleas n funcie de mrimea moleculelor. Indiferent de tipul de gel utilizat pentru separarea moleculelor de ADN, pentru ca acestea s poat fi vizualizate, este necesar ca mai nti ele s fie colorate. Colorarea se realizeaz cu bromur de etidiu iar vizualizarea benzilor de ADN se face prin expunerea gelului la radiaii UV (pe un transluminator), ele prezentnd o fluorescen roz (fig.21). Metoda electroforezei n gel de agaroz permite stabilirea dimensiunilor moleculelor de ADN precum i conformaia molecular a acestora. 2.1.2. Metode de izolare a fragmentelor de ADN utile pentru clonare Tehnicile care urmresc manipularea direct a ADN prin clonare molecular se desfoar n etape succesive, una dintre acestea fiind obinerea genelor de interes. Aceasta se poate realiza fie prin izolarea genelor naturale, fie prin sinteza chimic a unor molecule de ADN ce codific proteinele dorite. n prezent, prin aceste tehnici se poate realiza prelucrarea i transferul unor secvene relativ mici, de dimensiuni cuprinse ntre 1.000-20.000 pb.

40

TEHNOLOGIA ADN RECOMBINANTGodeurile unde sunt introduse probele 49,0 kb 21,8 kb 7,53 kb 5,93 kb+ 5,54 kb 4,80 kb 3,41 kb ADN, conformaia CD ADN linearizat ADN parial relaxat ADN, conformaia CIC

Fig.21. Separarea electroforetic a unor molecule de ADN (dup Boffey, 1983)

Reuita experimentelor n urma interveniilor prin diverse procedee este condiionat de prezena integral a genei dorite i a unei ct mai mici cantiti de ADN contaminant, inutil pentru buna funcionare a genei de interes. Obinerea fragmentelor de ADN ce servesc pentru clonare se poate realiza pe mai multe ci: sinteza chimic a genei; sinteza enzimatic a ADN dublu catenar complementar (ADNc); izolarea genelor din ADN natural cu ajutorul enzimelor de restricie; izolarea i amplificarea genelor prin tehnologia PCR. Metodele prezentate mai sus presupun utilizarea unei game variate de enzime, cum ar fi: enzimele de restricie (endonucleaze de restricie), metilazele, ADN polimeraze dependente de ADN, reverstranscriptaza, fosfataza alcalin, ligaza, polinucleotid kinaza, nucleazele (DNaze, RN-aze). 2.1.2.1. Obinerea ADN de interes prin utilizarea endonucleazelor de restricie Enzimele restricie cunoscute i sub numele de endonucleaze de restricie sunt produse de ctre bacterii i sunt rspunztoare de fenomenul de degradare a moleculelor de ADN strin ce ptrund n interiorul celulelor bacteriene. Aceste enzime, dup "recunoaterea" unei secvene nucleotidice specifice, hidrolizeaz moleculele de ADN dublu catenar. Hidroliza ADN se realizeaz prin clivarea a dou legturi fosfodiesterice, situate cte una pe fiecare caten a moleculei de ADN, determinnd formarea unui numr limitat de fragmente per molecul. n celulele productoare, endonucleazele de restricie fac parte integrant dintrun sistem de restricie i modificare, alctuit dintr-o restrictaz i o enzim de modificare. "Modificarea", realizat n special prin metilare, protejeaz ADN propriu fa de aciunea41


restrictazelor specifice, n timp ce ADN strin, ptruns n celul, fiind lipsit de o modificare adecvat, este sensibil la distrugerea cu endonucleaze de restricie (Nathans i Smith 1975; Old i Primrose 1980; Zarnea 1986). Sistemele de restricie i modificare au fost descoperite prin efectul lor asupra bacteriofagilor ce infecteaz celulele bacteriene. Astfel, s-a observat c particulele fagice ce au fost eliberate prin liza celulelor bacteriene aparinnd unei anumite tulpini determin infectarea eficient a altor bacterii aparinnd aceleiai tulpini deoarece acestea au acelai tip de modificare ca i gazda iniial. In cazul n care respectivele particule fagice infecteaz bacterii aparinnd altor tulpini, numrul de plaje de liz (dovada eficienei infeciei cu bacteriofagi viruleni) este foarte mic sau chiar nu se produc plaje de liz deoarece ADN fagic infectant a fost atacat i distrus n cea mai mare parte de ctre enzimele de restricie ale noii gazde. Faptul c totui, n anumite situaii apar plaje de liz, dovedete c sistemul de restricie nu este absolut. Exist astfel posibilitatea ca ADN exogen s scape fenomenului de restricie fie datorit unor mutaii spontane aprute la nivelul situsurilor int pentru enzimele de restricie, fie aciunii ineficiente a acestora. Mai mult, particulele fagice din noile plaje de liz sunt capabile s infecteze eficient noua tulpin bacterian, dar nu i cea de origine. Aceasta dovedete c ADN din aceste particule fagice a suferit tipul de modificare specific noii gazde i nu mai este recunoscut de gazda de origine. In 1968, Arber i Linn au demonstrat activitatea restrictazic a enzimei Eco B, produs de o tulpin de E.coli, iar Meselson i Yuan (1968) au purificat o enzim cu aciune similar sintetizat de tulpina E.coli K. Aceste enzime au fost capabile de a degrada ADN izolat din alte surse dar nu i pe cel al tulpinii productoare, ele tind ADN n mod ntmpltor, la nivelul unor situsuri localizate departe de situsul de recunoatere. In 1970, Smith, Wilcox i Kelly au reuit purificarea i caracterizarea unei alte enzime de restricie, Hind II, enzim care taie macromolecula de ADN la nivelul situsului de recunoatere. Aceast enzim a fost apoi utilizat de Dana i Nathans (1971) pentru clivarea genomului circular al virusului SV40 reuind obinerea a 11 fragmente distincte. Acest experiment a nsemnat realizarea primei hri de restricie. Trstura de baz a unui sistem de restricie i modificare este aceea c tulpina bacterian prezint o activitate de metilare a ADN propriu cu aceeai specificitate de secven ca i activitatea restrictazic. Metilaza adaug grupri metil la resturile de adenin sau citozin de la nivelul situsurilor int ale enzimei de restricie corespunztoare, ceea ce

42


confer respectivelor molecule de ADN rezisten la aciunea restrictazei (protejeaz ADN propriu de autodigestia pe care ar produce-o enzima de restricie sintetizat). Toate endonucleazele de restricie recunosc scurte secvene de nucleotide de la nivelul macromoleculelor de ADN, secvene ce reprezint situsurile de recunoatere i legare. Legarea este urmat de clivarea legturilor fosfodiesterice fie la nivelul situsului de recunoatere fie la deprtare de acesta, n funcie de enzim. ADN genomic al bacteriei ce produce o anumit enzim de restricie este metilat la nivelul situsurilor int, astfel nct devine imun la aciunea enzimei de restricie corespunztoare. ADN este metilat pe ambele catene ns, n cursul procesului de replicare, moleculele fiice conin doar una dintre catene metilat (cea matri); se poate spune n acest fel c ele sunt hemimetilate. In acest moment ntr n aciune enzimele ce catalizeaz procesul de metilare i introduc grupri metil la nivelul bazelor azotate corespunztoare. Atunci cnd n celul ptrunde ns o molecul de ADN strin, care nu prezint modelul de metilare al respectivei gazde, el este rapid recunoscut de enzimele de restricie i degradat. In cazul ADN al tulpinilor de E.coli s-a evideniat faptul c acesta conine mici cantiti de 6-metiladenin i 5-metilcitozin. Aceste baze azotate sunt generate prin aciunea a trei tipuri diferite de metilaze care au fost ncadrate n trei sisteme de modificare specifice: - sistemul hsd care acioneaz pentru a genera un model specific de metilare a adeninei (sau uneori a citozinei); - sistemul dam care este capabil s deosebeasc noile catene de ADN replicate prin metilarea adeninei. El este implicat n controlul procesului de replicare, n marcarea catenelor de ADN n vederea reparrii sau influeneaz activitatea altor elemente cromosomale la E.coli; - sistemul dcm care metileaz citozina dar al crui mecanism de aciune nu este cunoscut. Au fost identificate bacterii ce prezint mutaii la nivelul sistemelor de metilare, ele fiind incapabile de metilare dar capabile de supravieuire; aceasta dovedete c totui metilarea nu este un eveniment esenial pentru supravieuirea bacteriilor. Sistemele enzimatice de restricie/modificare au fost mprite n trei categorii: tipul I, tipul II i tipul III. Diferena principal dintre cele trei categorii este aceea c sistemele enzimatice de tipul II conin enzime diferite ce realizeaz metilarea, respectiv restricia, n timp ce sistemele de tip I i II grupeaz enzime ce prezint att proprieti de metilare ct i de restricie. Enzimele ce alctuiesc aceste sisteme au 2-3 subuniti heterologe cu proprieti43


funcionale distincte. Sistemele enzimatice de tip I i II sunt mai puin cunoscute i mai puin folosite n practic dei sunt interesante din punct de vedere biologic. Sistemul de tip II include o serie de enzime de restricie foarte bine cunoscute, ele fiind utilizate n numeroase experimente de biologie molecular. Au mai fost descrise i alte tipuri de enzime de restricie care acioneaz asupra ADN doar dac acesta este metilat. Acesta este cazul enzimei de restricie Dpn I produs de unele tulpini de Streptococcus pneumoniae: ea cliveaz situsul de recunoatere GATC doar dac acesta este metilat. Din contr, enzima DpnII, produs de alte tulpini de streptococi, i exercit aciunea doar asupra situsurilor de recunoatere GATC nemetilate. In ceea ce privete nomenclatura enzimelor de restricie, a fost propus un model original, ce combin denumirea speciei i a tulpinii de la care s-a izolat enzima (abreviere) i numrul de enzime pe care aceasta le produce (cifre romane). De exemplu, tulpina Escherichia coli R produce mai multe enzime de restricie notate Eco RI, Eco RII, Eco RV, n timp ce Bacillus globigii sintetizeaz dou enzime de restricie, Bgl I i Bgl II (tabelul 2). Tabelul 2. Caracteristicile unor enzime de restricieTulpina bacterian Anabaena variabilis Bacillus amyloliquefaciens Bacillus globigii Escherichia coli Haemophilus aegyptius H. haemolyticus H.parainfluenzae H.influenzae Rd Moraxella bovis Providencia stuartii Serratia marcescens Streptomyces stanford Thermus aquaticus Xanthomonas malvacearum Denumirea enzimei Ava I Bam HI Bgl II Eco RI Hae III Hha I Hpa II Hind III Mbo I Pst I Sma I Sst I Taq I Xma I Situs de recunoatere i clivare

CCGGAG GGATCC AGATCT GAATTC GGCC GCGC CCGG AAGCTT GATC CTGCAG CCCGGG GAGCTC TCGA CCCGGG

Relativ recent (Jacquier i Dujon, 1985; Macreadie i colab., 1985) au evideniat faptul c anumite gene mitocondriale, cloroplastice sau chiar nucleare de la unele organisme eucariote conin introni ce codific nucleaze specifice. Aceste nucleaze determin clivri44


dublu-catenare ale ADN, la nivelul unor situsuri specifice, ntr-un mod similar aciunii enzimelor de restricie produse de bacterii. Spre deosebire de acestea ns, secvenele de recunoatere nu sunt protejate prin metilare ci ele, se pare c sunt implicate n eliminarea intronilor din anumite gene, genernd gene alele fr introni. Endonucleazele eucariote recunosc secvene mai lungi de nucleotide, formate din 1012 perechi de baze, astfel c ele ar putea fi utilizate n experimentele n care se dorete obinerea unor fragmente de ADN de dimensiuni mai mari (ca n cazul construirii bncilor genomice). Una dintre caracteristicile enzimelor de restricie este aceea c ele recunosc anumite secvene de nucleotide (situsul de recunoatere) i cliveaz n mod specific legturile fosfodiesterice dintre anumite nucleotide (situsul de clivare), situsurile fiind plasate pe ambele catene ale ADN. In cazul multor enzime de restricie, situsul de recunoatere coincide cu cel de clivare (mai ales la enzimele de restricie de tip II), fiind format dintr-un numr limitat de nucleotide (4, 5, 6, 7 sau 8 perechi de nucleotide), cu structur de palindrom. De exemplu, enzima Eco RI recunoate o secven specific format din 6 nucleotide, GAATTC. Uneori, palindromul este ntrerupt de o serie de 1 pn la 9 nucleotide nespecifice. De exemplu, enzima de restricie Sfi I recunoate secvena GGCCNNNNNGGCC, unde N poate fi orice baz azotat. Deseori, situsul de recunoatere al unei enzime de restricie nu coincide cu cel de clivare, acesta din urm fiind localizat la o anumit deprtare de situsul de recunoatere, spre captul 5 sau 3. Un exemplu de acest tip este enzima Mbo II care recunoate situsul GAAGA, dar locul de clivare este situat la o distan de 8 nucleotide de la captul 3 al situsului de recunoatere pe o caten i la o distan de 7 nucleotide spre captul 5 pe cealalt caten. Numrul i mrimea fragmentelor de ADN generate prin aciunea enzimelor de restricie depinde de frecvena apariiei situsurilor de recunoatere la nivelul ADN supus clivrii. Presupunnd c, n medie, coninutul n G+C al ADN ar fi 50%, aceasta ar nsemna c un situs de restricie format din patru nucleotide s-ar regsi la nivelul acelui ADN la fiecare 256 perechi de baze (44). Dac situsul de restricie este format din ase nucleotide, el s-ar regsi la fiecare 4096 perechi de baze (46), n timp ce un situs de restricie format din opt nucleotide ar putea aprea la fiecare 65.536 perechi de baze (48). In funcie de enzima de restricie utilizat i de scopul urmrit n experiment, ADN poate fi scindat n fragmente de dimensiuni mici (ca n cazul experimentelor de amprentare genetic = DNA fingerprinting)45


sau mai mari, mai ales atunci cnd sunt folosite enzime al cror situs de recunoatere este format din 8 nucleotide (ca n cazul experimentelor de clonare a unor fragmente genomice sau n cele de cartare genetic). Un alt aspect de care se ine seama atunci cnd se alege o enzim de restricie pentru un anumit tip de experiment este acela al tipului de extremiti pe care le genereaz enzima dup clivarea macromoleculei de ADN. Se cunoate faptul c enzimele de restricie ce recunosc secvene de tip palindrom rup legturile fosfodiesterice la nivelul acestor secvene, genernd fie extremiti monocatenare complementare 3 sau 5 (atunci cnd clivarea se face decalat n raport cu axul de simetrie al secvenei palindromice), fie extremiti drepte (atunci cnd clivarea se face n aceeai poziie pe ambele catene ale ADN). In cazul fragmentelor de restricie cu extremiti monocatenare, ele se pot reasocia pe baza complementaritii, ntre ele stabilindu-se legturi de hidrogen; legarea este mai stabil atunci cnd extremitile respective conin mai multe baze azotate de tip GC. Pentru testarea aciunii enzimelor de restricie se pot utiliza diferite tipuri de ADN la care se cunoate numrul de situsuri de recunoatere (stabilit prin studii anterioare). Dintre acestea, cele mai utilizate molecule de ADN provin de la bacteriofagul , de la adenovirusul Ad2, bacteriofagul X174, plasmida pUC18 sau pBR322 (tabelul 3). Tabelul 3. Aciunea unor enzime de restricie pe diferite tipuri de molecule de ADNEnzima Bam HI Bgl II Dpn I Eco RI Eco RV Hind III Hinf I Mbo I Pst I Pvu I Sma I Taq I Situs de recunoatere i clivare G GATCC A GATCT GmeA TC G AATTC GAT ATC A AGCTT G ANTC GATC CTGCA G CGAT CG CCC GGG T CGA Numr de situsuri Ad2 X174 pUC18 pBR322

5 6 116 5 21 7 148 116 28 3 3 121

3 11 87 5 9 12 72 87 30 7 12 50

0 0 0 0 0 0 21 0 1 0 0 10

1 0 15 1 0 1 6 15 1 2 1 4

1 0 22 1 1 1 10 22 1 1 0 7

= indic locul clivrii; N = reprezint orice nucleotid; Gme = indic starea metilat a bazei respective

46


Izolarea genelor din ADN genomic cu ajutorul enzimelor de restricie constituie cea mai simpl metod de obinere a unor fragmente de ADN ce pot conine gena dorit. Metoda const n fragmentarea specific a genomului unui organism cu ajutorul enzimelor de restricie, urmat de selecia i purificarea fragmentului dorit. Fragmentarea a ADN cu ajutorul endonucleazelor de restricie se bazeaz pe proprietatea acestor enzime de a cliva moleculele de ADN la nivelul situsului de recunoatere, aa cum este cazul endonucleazelor de tipul II. Acestea cliveaz ADN dublu catenar prin ruperea a dou legturi fosfodiesterice, cte una pe fiecare caten, producnd fie extremiti drepte fie extremiti decalate (ce determin prelungiri monocatenare lungi de 3, 4 sau 5 baze, n funcie de enzima folosit)(Cornea i colab., 1998). Cele mai multe situsuri de recunoatere ale enzimelor de restricie sunt palindromice, astfel c prelungirile monocatenare formate de o anumit enzim la extremitile moleculei de ADN sunt complementare, coezive ("lipicioase"), fapt care asigur legarea lor eficient, pe baz de complementaritate, indiferent de proveniena moleculelor de ADN. Cu toate avantajele sale, metoda se poate aplica numai dac genomul organismului de la care se dorete izolarea unei gene se poate purifica, dac i se cunoate harta genetic sau, i mai bine, harta sa de restricie. Condiia esenial este ca enzima de restricie folosit s cliveze gena, astfel nct funcia acesteia s rmn nealterat. Atunci cnd nu exist informaii asupra localizrii genelor, clivarea se face la ntmplare, iar informaiile obinute sunt prelucrate astfel nct s permit stabilirea ordinii situsurilor de restricie i apoi a identificrii prezenei genei (genelor) de interes la nivelul fragmentelor selectate. Trebuie precizat faptul c examinarea exclusiv a mrimii fragmentelor de restricie nu ofer informaii asupra localizrii situsurilor de recunoatere. Pentru determinarea poziiei situsurilor la nivelul moleculei de ADN analizate se aplic teste suplimentare (fig.22). Etapele unor asemenea teste sunt urmtoarele: ADN de interes este clivat mai nti cu o anumit enzim de restricie, de exemplu, Pst I, obinndu-se mai multe fragmente de restricie de dimensiuni diferite Fragmentele obinute cu prima enzim sunt supune aciunii unei alte enzime de restricie, de exemplu, Hind III, rezultnd fragmente de dimensiuni mai mici Experimentul se reia prin inversarea ordinii de aciune a celor dou enzime de restricie, mai nti Hind III i apoi Pst I.47


n final se compar dimensiunea fragmentelor finale i se stabilete ordinea situsurilor de restricie pentru Pst I i Hind III.

Fig.22. Stabilirea localizrii situsurilor de restricie la nivelul unui fragment de ADN. A. Fragmentul originar de 6,6 kb este clivat separat cu enzimele Hind III i PstI, iar fragmentele obinute sunt digerate cu cealalt enzim de restricie. B. Pe baza dimensiunii fragmentelor obinute prin simpla i dubla clivare s-a stabilit ordinea situsurilor de restricie (dup Snyder i Champness, 1997).

O alt metod de stabilire a hrii fizice este aceea a realizrii unei biblioteci de fragmente de restricie de ADN provenit de la organismul analizat. Dup clivarea ADN cu o enzim de restricie, fragmentele rezultate sunt introduse ntr-un vector de clonare i apoi ntro gazd caracteristice, obinndu-se un numr mare de clone. Clonele sunt apoi analizate prin folosirea hibridizrii moleculare (Southern-blot hybridization). Astfel, dup separarea electroforetic a fragmentelor de restricie, acestea sunt denaturate iar ADN monocatenar este transferat pe o membran de nitroceluloz. Fragmentele respective sunt supuse apoi interaciunii cu o prob de ADN marcat radioactiv, determinndu-se n acest fel care dintre fragmentele de restricie se suprapun unele cu altele. Odat ce clonele au fost identificate i ordonate, situsurile de restricie sunt determinate la nivelul fiecrui fragment conform metodei prezentate anterior, dup care rezultatele obinute pentru fiecare fragment n parte sunt alturate obinndu-se n acest fel cartarea ntregii molecule de ADN supuse analizei.

48


Uurina cu care genele de interes pot fi izolate depinde de localizarea lor pe cromosomi. Pe baza efectelor lor fenotipice, a organizrii la nivelul cromosomilor i a gradului de dificultate al izolrii lor, genele de la procariote pot fi clasificate n mai multe categorii: gene simple care codific enzime monomere, ARNt, ARNr. Aceste gene sunt cel mai uor de izolat; gene complexe pentru proteine multimere, constituite din subuniti diferite care, deseori, nu sunt localizate grupat pe cromosomi; operoni pentru diferite ci metabolice; regloni sau minioperoni dispersai pe cromosom, avnd rol n controlul funciilor de biosintez; reglonii multipli, cum sunt cei ce controleaz sinteza antibioticelor din precursori ai mai multor ci metabolice diferite (Vtafu, 1995). Pentru a stabili localizarea anumitor gene la nivelul unei molecule de ADN, deci pe o hart fizic, pot fi utilizate diferite metode, una dintre ele presupunnd localizarea anumitor mutaii lund ca referin situsuri de restricie cunoscute. Organismele aparinnd unei anumite specii conin aceleai gene, ordonate la fel la nivelul hrii genetice, dar ntre indivizi exist unele diferene la nivelul secvenei de nucleotide din ADN. Aceste diferene asigur polimorfismul individual. Polimorfismul genetic a fost utilizat din cele mai vechi timpuri, la nceput n mod empiric, pentru ameliorarea organismelor: prin ncruciarea a doi indivizi diferii aparinnd aceleiai specii sau obinut organisme noi, cu performane mbuntite. Deoarece diferitele forme ale unei gene se datoreaz variaiilor n secvena de nucleotide ce le alctuiete, poziia situsurilor de restricie pentru anumite enzime poate varia, fenomenul putnd fi evideniat electroforetic dup migrarea fragmentele de ADN obinute prin clivarea cu o enzim de restricie. Tehnica a primit denumirea de RFLP (restriction fragment lenght polymorphism), ea fiind cuplat, de obicei, cu tehnica Southern blot pentru caracterizarea unei regiuni de ADN (prin utilizarea unei probe de ADN specific regiunii de analizat)(fig.23) La eucariote, unde harta genetic este departe de a fi cunoscut, apar dificulti suplimentare n ceea ce privete obinerea genelor prin metoda descris. In acest caz, deoarece nu exist informaii suficiente asupra localizrii genei de interes, prin utilizarea enzimelor de49


restricie pentru clivarea ADN genomic, se obine o populaie heterogen (ca dimensiuni) de fragmente de restricie.

50

TEHNOLOGIA ADN RECOMBINANT Fig.23. Reprezentarea schematic a etapelor tehnicii RFLP, aplicate n scopul identificrii localizrii unei gene la nivelul unui fragment de restricie, pe dou probe de ADN (1 i 2) (dup Bougaize i colab.,2000)

Clonarea ulterioar a tuturor acestor fragmente (separate pe baza dimensiunii lor) n vectori de clonare specifici i apoi introducerea lor n E.coli permite obinerea, aa numitelor "bnci genomice" ("biblioteci de gene"). Numrul de clone recombinate de E.coli ce trebuie analizate pentru a gsi fragmentul ce conine gena dorit (n funcie de dimensiunea sa) este dat de ecuaia:

N = ln(1-p)/ln(1-x/y)unde N = numrul de clone ce trebuie analizate pentru a obine secvena dorit cu o probabilitate de 95% sau 99% p = probabilitatea de obinere a genei de interes (de obicei se alege 99%) x = dimensiunea n kb a secvenei integrate y = dimensiunea n kb a genomului haploid al organismului analizat ln = logaritm natural Pentru analiza genomului celulelor eucariote se prefer folosirea unor enzime de restricie ce recunosc secvene mai lungi de nucleotide, astfel nct fragmentele rezultate s aib dimensiuni mai mari. Ulterior, clonarea acestora se face n vectori speciali, ce permit inserarea unor secvene de dimensiuni mai mari, dup care, selecia genei de interes se poate realiza prin diferite metode. O astfel de tehnic a fost folosit de Maxam i colab.(1977) pentru izolarea genei ce codific sinteza ARNr 5S de la drojdii. Tehnologia ADN recombinant presupune combinarea unor fragmente de ADN de origini diferite astfel nct s se obin o molecul nou, ce codific funcii specifice. Aa cum s-a precizat deja, fragmentele de ADN sunt obinute, de obicei, cu ajutorul enzimelor de restricie care genereaz extremiti monocatenare complementare. Deseori se pot folosi fragmente de ADN obinute prin utilizarea a dou tipuri de enzime de restricie, cu condiia ca cele dou enzime s fie compatibile, adic s formeze acelai tip de extremiti monocatenare. De exemplu, n aceast categorie intr enzimele Bam HI, Bgl II, Sau 3A i Bcl I care formeaz extremiti monocatenare de tip GATC.51


Exist i enzime de restricie (Hpa I, Eco RV, Sma I) care, prin aciunea asupra ADN int, formeaz extremiti drepte (extremiti oarbe = blunt ends). Avantajul unor asemenea extremiti este c indiferent de enzima folosit, extremitile formate sunt compatibile putnd fi utilizate pentru legare i formarea moleculelor de ADN recombinant. Eficiena legrii fragmentelor cu extremiti drepte este ns cu mult mai mic dect cea nregistrat prin folosirea fragmentelor cu extremiti monocatenare complementare. Totui, n anumite experimente este necesar legarea unor fragmente cu extremiti necompatibile, situaie n care acestea sunt convertite la extremiti drepte. Aceasta se realizeaz fie prin ndeprtarea extremitilor monocatenare n urma tratamentului cu nucleaza S1, fie prin sinteza unei catene complementare utilizndu-se ADN-polimeraza I (fragmentul Klenow). 2.1.2.2. Obinerea ADN de interes prin utilizarea ADN polimerazelor ADN polimerazele sunt enzimele necesare pentru sinteza ADN n timpul replicrii cromosomale sau a procesului reparator. ADN polimerazele catalizeaz formarea de legturi fosfodiesterice ntre nucleotidele de la captul 3OH al catenelor de ADN i grupul fosfat de la nivelul dNTP libere, cu liberarea unei molecule de pirofosfat:

ADN polimeraza (dNMP) n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi cationi bivaleni (Mg2+)Caracteristic acestor enzime este faptul c, pentru a aciona, ele au nevoie de o secven de tip primer care s prezinte captul 3OH liber, alungirea catenei de ADN realizndu-se n direcia 5 3 prin utilizarea unei alte catene de ADN drept matri. In absena primerului, sinteza de ADN nu este posibil. Unele ADN polimeraze (cum este ADN polimeraza I produs de E.coli) manifest nu numai activitate polimerazic ci i exonucleazic n sensul 5 3 i/sau 3 5 (eliminarea pe rnd a nucleotidelor fie de la captul 3 fie 5). Activitatea exonucleazic n sensul 3 5 este asociat in vivo cu rolul reparator al polimerazei respective: recunoaterea i apoi eliminarea nucleotidei incorect adugat (necomplementar). Deseori ns, datorit activitii exonucleazice 5' 3' a ADN polimerazei I, apar probleme ce in de degradarea captului 5' al primerilor i eliminarea gruprilor 5' fosfat de la capetele fragmentelor de ADN utilizate c52


substrat pentru ligare. De aceea, activitatea exonucleazic 5' 3' poate fi eliminat prin tratament proteolitic, obinndu-se un fragment de dimensiuni mari, numit fragment Klenow, capabil de activitate ADN polimerazic i exonucleazic 3' 5'. 2.1.2.2.1. ADN polimeraze termostabile i tehnologia PCR Elaborarea i apoi perfecionarea tehnologiei PCR (Polymerase Chain Reaction) a determinat gsirea unor noi ADN polimeraze cu aciune mai eficient i, eventual termorezistente. Tehnica PCR utilizeaz unele trsturi fundamentale ale replicrii ADN: ADNpolimeraza folosete ca matri ADN monocatenar pentru a determina sinteza unei catene noi, complementar. Metoda permite amplificarea "in vitro" a unei secvene de ADN, de aproximativ 10kb, de pn la 106 ori; ea poate fi aplicat i pentru amplificarea ARN dar, pentru aceasta, mai nti, se sintetizeaz o molecul de ADNc i apoi aceasta este multiplicat. Pentru a realiza amplificarea unei anumite secvene de ADN este necesar s fie cunoscute dou mici secvene de ADN, care flancheaz regiunea dorit. Aceste secvene sunt apoi utilizate ca baz pentru sinteza chimic a doi primeri oligonucleotidici de aproximativ 20 baze, care sunt complementari cu regiunile corespunztoare de pe ambele catene ale genei de interes (fig.24). Matria de ADN monocatenar este obinut prin nclzirea unei soluii de ADN dublu catenar la o temperatur apropiat celei de fierbere i apoi rcire brusc, astfel nct cele dou catene complementare rmn desprite (denaturate). La acest ADN denaturat se adaug un primer specific, necesar pentru iniierea reaciei de polimerizare catalizat de ADNpolimeraz, precum i nucleotide. n tehnica de multiplicare "in vitro", ambele catene ale unui fragment de ADN pot servi ca matri pentru sinteza catenelor complementare, cu condiia adugrii unor primeri oligonucleotidici pentru fiecare dintre cele dou catene. Dup un ciclu de replicare, amestecul este nclzit pentru a se desface catenele nou sintetizate de cele vechi i ciclul este reluat (Benedetto, 1993). n acest fel, numrul de molecule de ADN nou sintetizate crete n progresie geometric dup fiecare ciclu de replicare, estimndu-se c, spre exemplu, dup 32 cicluri de replicare se pot obine 1.073.741.824 molecule de ADN dublu catenar, pornind de la o unic molecul iniial.53


O etap critic a acestei tehnici este alegerea primerilor specifici, dar utilizarea lor nu mai face necesar izolarea prin alte metode a secvenei dorite de ADN dintr-o populaie heterogen de molecule de ADN. Cantitatea de ADN necesar ca material de start a reaciei este foarte mic, sub 1 g de ADN genomic total, dar se poate amplifica o secven de ADN pornind chiar de la o singur molecul.5.CTGACACAACTGTGTTCACTAGCAA.AAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTG3 3.GACTGTGTTGACACAAGTGATCCTT..TTCCACTTGCACCTACTTCAACCAC.5

nclzire (denaturare)5.CTGACACAACTGTGTTCACTAGCAA.AAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTG3

3.GACTGTGTTGACACAAGTGATCCTTTTCCACTTGCACCTACTTCAACCAC.5

adugarea unor secvene complementare (primeri)5.CTGACACAACTGTGTTCACTAGCAA.AAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTG3 3 CCACTTGCACCTACTTCAACC 5 5ACACAACTGTGTTCACTAGG 3 3.GACTGTGTTGACACAAGTGATCCTTTTCCACTTGCACCTACTTCAACCAC.5

nceperea sintezei de ADN pornind de la captul 3 al primerilor5.CTGACACAACTGTGTTCACTAGCAA.AAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTG3 3 TTCCACTTGCACCTACTTCAACC 5

5ACACAACTGTGTTCACTAGCAA

3

3.GACTGTGTTGACACAAGTGATCCTTTTCCACTTGCACCTACTTCAACCAC.5

Fig.24. Reprezentarea schematic a primerilor utilizai pentru amplificarea genei pentru -globin (dup Watson i colab., 1992). Secvenele de 20 nucleotide marcate sunt folosite ca primeri pentru ca ADN-polimeraza s-i poat exercita funcia de sintez.

Prima etap a procesului de amplificare presupune nclzirea soluiei de ADN la 94oC, timp de 5 minute, pentru a rupe legturile de hidrogen, n aa fel nct ambele catene complementare separate s poat servi ca matri pentru ADN-polimeraz. La acest ADN se adaug primerii oligonucleotidici ce vor fi folosii drept amors pentru ADN-polimeraz, ca i amestecul celor patru dezoxiribonucleotide. Temperatura este apoi sczut la 30-65 oC pentru a asigura prinderea primerilor la secvenele complementare din catena de ADN54


corespunztoare. Continuarea experimentului depinde de valoarea temperaturii la care se desfoar acest eveniment (fig.25). Urmtoarea etap const n creterea temperaturii la 72oC; aceast temperatur se menine timp de 2-5 minute, pentru a se realiza procesul de polimerizare a ADN. Din nou, temperatura este crescut la 94oC pentru 20 secunde, pentru ca noile catene sintetizate s se desfac de cele vechi, dup care procesul se reia pentru 30-60 cicluri de sintez.

Fig.25. Schema realizrii reaciei de polimerizare n lan (PCR)(dup Cornea i colab., 1998) 1 separarea catenelor originare i adugarea primerilor (P1 i P2); 2 sinteza catenelor complementare pornind de la primerii P1 i P2; 3 separarea celor dou catene i adugarea unor noi cantiti de primeri; 4 nou rund de sintez a ADN; 5 separarea catenelor i adugarea de noi primeri; 6 nou rund de sintez, ciclurile putndu-se repeta. Sgeata indic sensul sintezei ADN.

n fazele de nceput ale elaborrii tehnicii PCR era necesar s se adauge, dup fiecare ciclu de sintez, cantiti noi de ADN polimeraz, deoarece polimeraza de E.coli, fiind termosensibil, era denaturat n momentul creterii temperaturii. Cercetrile realizate pentru optimizarea procesului de polimerizare, n sensul gsirii i utilizrii unor ADN polimeraze capabile s reziste la variaiile mari de temperatur pe care le presupune tehnica menionat au condus la izolarea i caracterizarea Taq polimerazei. Aceasta este o ADN polimeraz termostabil, ce acioneaz eficient la temperaturi de 75-80oC. Enzima a fost izolat de la o bacterie termofil (Thermus aquaticus). Ca orice ADN polimeraz, ea nu poate iniia "de novo" sinteza de ADN, ci necesit pentru aciune prezena unei secvene de nucleotide care s funcioneze ca primer. O aciune similar are i enzima55


Pfu polimeraza izolat de la o alt bacterie termofil, Pyrococcus furiosus, ea manifestnd n plus i o activitate exonucleazic 3 5, ceea ce i mrete fidelitatea. Utilizarea unei asemenea enzime pentru sinteza ADN asigur o fidelitate de 12 ori mai mare dect cea obinut prin folosirea Taq polimerazei. Studierea bacteriilor din genul Thermus a permis izolarea de la specia T.thermophilus a cinci ADN polimeraze termostabile, dintre care dou sau dovedit eficiente n tehnologia PCR. De asemenea, n ultimii ani au fost obinute ADN polimeraze nalt termostabile prin modificarea controlat a genelor ce codific asemenea enzime la bacterii termofile cum sunt Thermus thermophilus, Thermotoga maritima sau Thermococcus litoralis (Newton i Graham, 1997). Spre exemplu, ADN polimeraza recombinat notat Tth, obinut prin clonarea n E.coli a unei gene modificate ce codific una dintre ADN polimerazele de la T.thermophilus, s-a dovedit extrem de eficient n sinteza ADN n anumite condiii: adugarea ionilor de magneziu i chelarea cationilor de mangan. Dac ns ionii de mangan sunt prezeni, la temperaturi de aproximativ 70oC, enzima recombinat Tth manifest activitate de reverstranscriere, ceea ce permite utilizarea acestei enzime n experimentele de amplificare a ADN pornind de la molecule matri de ARN (molecule bogate n secvene G-C sau care prezint structuri secundare). Utilizarea Tth polimerazei pentru ARN-PCR prezint unele avantaje fa de procedeul convenional n care sunt folosite dou enzime distincte (mai nti se folosete o reverstranscripaz, care asigur sinteza unor molecule de ADNc, iar apoi se utilizeaz o polimeraz termostabil pentru amplificarea fragmentului dorit). Avantajele constau n faptul c se utilizeaz o singur enzim ce manifest, n funcie de condiiile de reacie, fie activitate reverstranscriptazic fie de ADN polimeraz. n privina surselor de ADN ce pot fi multiplicate prin PCR exist mai multe posibiliti de obinere a acestora. In primul rnd, poate fi utilizat ADNc obinut prin reverstranscrierea ARNm i introdus ntr-un vector de clonare, metoda numindu-se n acest caz revers-PCR (RT-PCR). Condiia ca reacia de polimerizare s se desfoare este existena primerilor oligonucleotidici complementari pentru anumite secvene din vector (de obicei, secvenele ce flancheaz situsurile de clonare). n aceast situaie se pot studia mai multe tipuri de fragmente de ADN clonate ntr-un anumit vector, la nivelul situsului corespunztor (cu secvena cunoscut). Metoda poate fi aplicat i pentru identificarea secvenelor de ADN ai cror primeri nu sunt stabilii: selecia fragmentelor obinute prin clonare i apoi56


amplificare se face cu ajutorul unor metode variate (de exemplu, Southern blotting). Ulterior, acest ADN poate servi pentru subclonare n diverse gazde sau se poate realiza secvenierea sa. Pornind de la aceast aplicaie iniial, metoda PCR a cptat o larg utilizare n diverse domenii ale biologiei moleculare. Astfel, prin intermediul ei se poate stabili existena unor boli ereditare la nou-nscui, de exemplu a fenilcetonuriei. Tot cu ajutorul tehnicii PCR se pot amplifica secvene specifice din genom, cum este cazul secvenelor Alu din genomul uman (regiuni ce conin aproximativ 106 copii ale unei secvene de 300 pb, dispersate n ntreg genomul uman). De asemenea, se poate determina eficiena tratamentului unor tipuri de cancer cu citostatice sau radiaii, testul PCR permind s se stabileasc dac celulele maligne au fost sau nu distruse. O alt utilizare este legat de determinarea sexului ftului nainte de natere, prin utilizarea unor celule fetale. n acest caz se folosesc primeri pentru anumite secvene de ADN, coninute doar de cromosomul Y. Asemenea analize s-au fcut, n special la familii cu risc mare de a avea urmai cu boli genetice X linkate. Tehnica PCR este utilizat i pentru studii moleculare asupra nrudirii filogenetice a unor specii. Prin acuratee i sensibilitate, metoda a putut fi folosit chiar i pentru multiplicarea unor probe de ADN aparinnd unor organisme care au disprut, pornind de la resturi fosilizate ale acestora (tabelul 4). Tabelul 4. Aplicarea tehnicii PCR pentru analiza unor probe de ADN strvechi (dup Newton i Graham, 1997)Originea probei de ADN Lupul marsupial Oase umane Creier uman Mamut siberian Frunze fosile de magnolie Viespi fosilizate n chihlimbar Termite fosilizate n chihlimbar Gena amplificat ADNmt (cyt b) ADNmt (ARNr 12S) ADNmt (NADH dehidrogenaza) ADNmt (cyt b2) ADNmt (cyt b) Gene cloroplastice (rbc L) ARNr 18S ADNmt (ARNr 16S) ADN nuclear (ARNr 18S) Mrimea ampliconului (pb) 116 94 205 471 375 820 555, 195 sau 597 150 225 Vrsta probei (ani) ~100 300-5500 7000 47.000 17-20.000.000 30.000.000 30.000.000

In ultimii ani, tehnica PCR a servit ca punct de start pentru dezvoltarea unor tehnici speciale de caracterizare a fragmentelor de ADN: tehnica RAPD (randomic amplified polymorphic DNA=amplificare randomizat a ADN polimorfic), AFLP (amplified57


fragment lenght polymorphisms = polimorfismul lungimii fragmentelor amplificate), stabilirea microsateliilor (secvene de TG sau CA repetate de 10-60 ori) sau VNTR (variable number tandem repeats = numrul variabil al repetiiilor n tandem). Dintre aceste metode, cea mai mare utilizare o au tehnicile RAPD i AFLP. Tehnica RAPD presupune utilizarea unor secvene scurte de nucleotide (de aproximativ 10 nucleotide) drept primeri arbitrari pentru amplificarea unor fragmente de ADN fa de care manifest complementaritate, chiar dac nu perfect. Metoda este utilizat frecvent n experimentele de amprentare genetic deoarece este rapid, necesit cantiti sczute de material i este simpl din punct de vedere tehnic. Cu toate acestea, deoarece complementaritatea primerilor nu este ntotdeauna perfect cu fragmentele amplificate, metoda nu este aplicat n situaiile n care este necesar o acuratee ridicat, aa cum este cazul testelor de paternitate sau analizele de pedigree. In schimb, metoda este utilizat pentru caracterizarea tulpinilor bacteriene aparinnd aceluiai serotip sau pentru studiile de ameliorare a plantelor (la cpun, gru, ovz, orz, soia, tomate, cartof sau porumb), prin folosirea unor seturi de primeri arbitrari. Astfel, acelai primer folosit pentru amplificarea unor fragmente de ADN provenite de la linii nrudite de plante poate determina apariia unui profil electroforetic diferit, ceea ce poate ilustra, de exemplu, existena unor mutaii la unele linii consangvine (fig.26).M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Fig.26. Profilul electroforetic al fragmentelor de ADN de la diferite soiri de vi-de vie, amplificate prin utilizarea primerului GTGATCGCAG (tehnica RAPD)(dup Mutulescu, 2002) M.-ADNmarker (1 Kb); 1.- Profilul soiului Feteasca neagra; 2.- Profilul soiului Feteasca alba;3.Profilul soiului Feteasca regala; 4.- Profilul soiului Grasa de Cotnari; 5.- Profilul soiului Furmint; 6.Profilul soiului Coarna alba; 7.- Profilul soiului Coarna neagra; 8.- Profilul soiului Petit Sauvignon; 9.Profilul soiului Gros Sauvignon;

Tehnica AFLP se bazeaz pe amplificarea selectiv a unor fragmente de restricie provenite prin clivarea ADN genomic cu o anumit enzim de restricie. Astfel, dup clivarea ADN de analizat cu una sau dou endonucleaze, la fragmentele rezultate, se adaug adaptori58


specifici, complementari cu extremitile monocatenare generate de enzime. Se refac, n acest fel, la extremitile fragmentelor, situsurile de recunoatere pentru enzimele folosite (fig.27). Amplificarea se realizeaz prin utilizarea a 1-2 categorii de primeri a cror secven de nucleotide corespunde situsurilor de recunoatere pentru enzimele de restricie folosite (fig 27). Ca urmare, doar primerii complementari cu extremitatea 3 a fragmentului de restricie vor realiza amplificarea, rezultnd o populaie de fragmente amplificate. Din aceast populaie de fragmente amplificate, prin utilizarea unor primeri cu o mai mare specificitate (conin att nucleotidele corespunztoare situsului de restricie ct i un numr de alte nucleotide, alese de experimentator) sunt apoi selectate o serie de fragmente care pot avea valoare de markeri moleculari. De remarcat c, n acest caz, primerii utilizai pot fi marcai radioactiv la extremitatea 5, prin folosirea unei polinucleotid kinaze i a [-33P] ATP, iar dup separarea electroforetic n gel de poliacrilamid 6% (care permite evidenierea i a fragmentelor foarte mici), fragmentele amplificate sunt identificate prin autoradiografie.

Fig.27. Comparare a profilului electroforetic al fragmentelor de ADN genomic de la dou tipuri de albine, africane i europene, obinute prin aplicarea tehnicii AFLP (dup Suazo i Hall, 1999)

2.1.2.2.2. ADN-polimeraze dependente de ARN Tipurile de ADN polimeraze menionate mai sus utilizeaz drept matri o alt molecul de ADN (sunt dependente de ADN). Spre deosebire de acestea, reverstranscriptazele realizeaz sinteza de ADN pornind de la o matri ARN (sunt ADN polimeraze dependente de ARN), obinndu-se molecule de ADNc (complementar). Reacia de polimerizare depinde de existena celor patru deoxiribonucleotide trifosforilate n59


concentraie mare pentru a obine un ADN complementar cu lungime mare. Omiterea unui dNTP din amestecul de reacie duce la oprirea polimerizrii. Obinerea i clonarea direct a ADN genomic mai ales la eucariote este tehnic mai dificil i, n consecin, s-a recurs la o tehnic indirect de sintez a genei sub forma de ADN complementar, origine viral. In acest scop, ARNm este izolat din celulele esutului n care gena dorit se exprim la maximum. n anumite condiii fiziologice favorabile, un anumit tip de ARNm poate reprezenta ntre 0,1 i 10% din cantitatea de ARNm celular total. n alte cazuri el este prezent n cantiti foarte mici. Izolarea ARNm i identificarea tipului dorit presupune anumite dificulti. n general, alegerea unui anumit tip de ARNm se poate face prin determinarea capacitii de a controla sinteza unei proteine specifice n sisteme acelulare sau prin hibridare cu oligonucleotide sintetice. Deoarece la eucariote ARNm matur prezint la captul 3' OH o extremitate lung de pn la 150 nucleotide = capt poliadenilat, pentru a se iniia sinteza ADN complementar se folosete o secven sintetic oligo dT, lung de aproximativ 10 nucleotide (resturi de timin), care va fi cuplat cu extremitatea poliadenilat. Aceast secven constituie de fapt primerul de la care va ncepe polimerizarea nucleotidelor de ctre reverstranscriptaz (fig.28). pornind de la ARNm corespunztor. Tehnica a fost denumit reverstranscriere i se bazeaz pe utilizarea unei enzime specifice, reverstranscriptaz, de

Fig.28. Reprezentarea schematic a etapelor procesului de sintez a ADNc prin procesul de reverstranscriere

60


Toate variantele de clonare a ADN complementar dublu catenar pornesc de la sinteza unei copii ADN pe matria de ARNm cu ajutorul reverstrancriptazei. Aceast copie monocatenar de ADN este convertit la forma dublu catenar cu ajutorul unei ADNpolimeraze "normale", dup ce mai nti se ndeprteaz ARNm matri prin tratament cu RN-aza H (enzim ce degradeaz n mod specific ARN din duplexul ARN-ADN). ADN complementar monocatenar obinut prin reverstranscriere are la captul 3' o bucl n "ac de pr", format prin interaciunea intramolecular a bazelor componente. Pornind de la acest capt, se iniiaz sinteza catenei complementare (bucla funcionnd ca "primer"), cu ajutorul unei ADN polimeraze. Dup ncheierea sintezei catenei complementare (legat covalent de catena matri) se elimin bucla monocatenar prin folosirea unei nucleaze (nucleaza S1). Deseori nu este posibil s se separe un anumit tip de ARNm, n aceste situaii fiind preferat varianta obinerii bibliotecilor de ADN complementar; pornind de la ARNm total, izolat din anumite tipuri de celule. Obinerea bibliotecii complete sau pariale de molecule de ADNc de la un anumit organism se face prin convertirea ntregii populaii de ARNm, sau doar a unei poriuni din ea, n ADN complementar (ADNc). Moleculele de ADNc prezint importan pentru clonarea genelor dar, n acelai timp, reprezint i o surs pentru obinerea unor probe n vederea hibridizrii, folosite ulterior pentru purificarea de ARNm specific. Pentru a alege celulele n care gena de interes s-a integrat, este necesar s se analizeze un numr foarte mare de clone recombinate. Teoretic, numrul de colonii ce trebuie analizate poate fi calculat pe baza urmtoarei ecuaii:

N = ln(1-p)/(1-n)unde N = numrul de clone de trebuie analizate p = probabilitatea de izolare a clonei dorite (de obicei 0,95 sau 0,99) n = proporia reprezentat de ARNm corespunztor genei de interes din totalul populaiei de ARNm ln = logaritm natural.61


Spre exemplu, pentru a identifica o clon ce conine ADNc de interes, tiind c n = 1000 (deci ARNm de la care s-a pornit pentru sinteza genei este relativ rar n celulele utilizate pentru purificare), este necesar s se analizeze 5000 de clone recombinate. n cazul celulelor mamaliene ce pot conine aproximativ 20.000 tipuri diferite de ARNm, pentru a identifica o anumit secven ADNc trebuie analizate 106 clone. n prezent exist dou forme comerciale ale enzimei reverstranscriptaz: una ce provine de la virusul mieloblastozei aviare (din culturi celulare infectate cu acest virus), iar alta a fost izolat din celule de E.coli (tulpini modificate genetic), ce conin clonat gena corespunztoare de la virusul leucemiei murine. Enzima avian este alctuit din dou catene polipeptidice care prezint att activitate polimerazic, ct i o puternic activitate de RN-az H. Enzima murin este alctuit dintr-o singur caten polipeptidic cu puternic activitate polimerazic i o mai slab activitate de RN-az H. Aceast slab activitate RN-azic este considerat ca avantaj atunci cnd se dorete sinteza de ADNc, pornind de la molecule lungi de ARNm. Procesul ncepe prin adugarea la amestecul de reacie a unor oligonucleotide dT care se leag, prin complementaritate la captul 3' al ARNm (la nivelul secvenei poliA). Se constituie astfel secvena primer necesar ADN polimerazei pentru a-i ncepe aciunea. Hibrizi ARN-ADN obinui sunt supui aciunii RN-azei (de tip RN-aza H) a reverstranscriptazei: aceasta ncepe s degradeze matria de ARN, elibernd catena de ADNc. Ulterior, prin folosirea unei ADN-polimeraze corespunztoare (ADN-polimeraza I) se sintetizeaz catena complementar a ADNc, obinndu-se o molecul de ADN dublu-catenar ce poate fi inserat ntr-un vector adecvat. 2.1.2.2.3. Terminal-transferaza Un tip special de ADN polimeraz este terminal transferaza (TT) care adaug mononucleotide la captul 3 OH liber al ADN monocatenar, ADN dublu catenar sau chiar al ARN, aciunea enzimatic nefiind dependent de existena unei matrie ADN. Terminal transferaza este folosit n practic pentru adugarea de extremiti homopolimere, de obicei la nivelul unor fragmente de ADN sau, n anumite situaii, pentru adugarea unei singure nucleotide modificate de tipul dideoxinucleotidelor (in cazul experimentelor de secveniere). Activitatea enzimatic este condiionat de prezena n amestecul de reacie a ionilor de Co2+

62


(preferai n cazul n care se dorete adugarea purinelor) sau Mg2+ (preferai pentru adugarea pirimidinelor)(Cornea i colab., 1998).

2.1.2.3. Obinerea ADN de interes prin sintez chimic Sinteza moleculelor mari de ADN pe cale pur chimic prezint serie de dificulti care apar, n principal, la asamblarea nucleotidelor pentru obinerea catenelor polinucleotidice lungi. Aceste dificulti au determinat ca sinteza total a unei gene s nu fie realizat numai prin metodele chimiei organice. n aceste cazuri se combin metodele chimice care permit doar sinteza unor oligonucleotide cu o secven dorit, cu metodele biochimice ce asigur legarea oligonucleotidelor ntre ele. Strategia adoptat pentru sinteza chimic a unor gene a implicat realizarea a dou etape fundamentale, i anume: sinteza chimic a unor segmente oligodeoxinucleotidice cu lungimea medie de 8-12 uniti; legarea cap-coad a segmentelor respective, ntr-o ordine identic celei din gena natural, cu ajutorul ADN-ligazei; Prima sintez chimic a unei gene, cea care codific sinteza ARNt pentru alanin, efectuat de Khorana i colab. (1970), a fost considerat, pe drept cuvnt, ca marcnd debutul ingineriei genelor ca domeniu de activitate. Sinteza s-a fcut sub forma unor mici fragmente oligonucleotidice, pornind de la fosfodiesteri. Condensarea succesiv a blocurilor oligonucleotidice a determinat formarea unor secvene mai mari de oligonucleotide. n timpul reaciilor de condensare are loc blocarea selectiv a gruprilor funcionale ale nucleotidelor cu grupri chimice protectoare i pstrarea liber numai a acelor grupri care intr n reacie n momentul dorit. Randamentul de obinere a fragmentelor de ADN scade pe msur ce lungimea catenei crete, astfel c produii finali se obin n cantiti mici. Fiecare etap de condensare este controlat i nsoit de purificarea produsului obinut. Segmentele obinute n acest mod sunt monocatenare, fiind apoi fosforilate la captul 5' cu ajutorul kinazei de fag T4 dup care se face legarea ordonat a segmentelor obinute cu ajutorul ligazei.63


Itakura i colab. (1970) au realizat o alt metod, mai rapid, pentru sinteza de ADN. Aceasta presupune parcurgerea mai multor etape: sinteza unor trimeri cu secvena bazelor prestabilit; cuplarea trimerilor ntre ei pentru obinerea de oligonucleotide cu secvena bazelor dorit; legarea oligonucleotidelor ntre ele cu ajutorul ADN-ligazei, pentru a obine genele de interes. n prezent exist adevrate "maini de fabricat gene" care, asistate de un microprocesor, sunt capabile s sintetizeze ADN monocatenar pe baza unei secvene date (introdus n computer), lung de aproximativ 40 nucleotide, asigurnd legarea unei nucleotide la fiecare 30 minute. Sinteza chimic a ADN are o serie de avantaje: permite producerea de gene funcionale, chiar dac nu se cunoate secvena bazelor din ADN natural. Sinteza se realizeaz pe baza secvenei de aminoacizi din proteina dorit, care este mai uor de determinat. Deoarece prezena intronilor blocheaz exprimarea unei gene de tip eucariot n E.coli, sinteza chimic, ca de altfel i ADNc sintetizat pe baza ARNm matur, furnizeaz o versiune scurtat a genei respective (ce conine doar secvene exonice), funcional n E.coli; deoarece bacteriile i celulele animale tind s utilizeze anumii codoni n mod preferenial pentru un anumit aminoacid, n sinteza chimic pot fi utilizai codonii cei mai potrivii pentru gazda n care se dorete exprimarea genei; n cursul sintezei chimice pot fi introduse substituiri de aminoacizi care modific avantajos proprietile biologice ale proteinelor codificate de gena sintetic. In prezent, prin sintez chimic s-au obinut unele gene de dimensiuni mai mici (de exemplu, secvenele codificatoare ale insulinei umane) i, de asemenea, se obin primerii necesari proceselor de sintez enzimatic a genelor (prin reverstranscriere, prin tehnologia PCR sau prin folosirea altei ADN polimeraze). 2.1.2.4. Alte enzime utilizate n tehnologia ADN recombinant Pentru obinerea moleculelor de ADN recombinant este necesar utilizarea unor enzime ce catalizeaz formarea legturilor fosfodiesterice dintre extremitile 3' OH i 5' P ale fragmentelor de ADN participante la realizarea respectivelor molecule hibride. Aceste enzime au fost denumite ADN-ligaze.64


Studiul ligazelor a nceput n urma observaiilor experimentale efectuate asupra proceselor de recombinare, procese n care au loc ruperi i apoi reuniri ale moleculelor de ADN, ca i prin constatarea faptului c, n procesul de infectare a E.coli cu bacteriofagul , ADN fagic ptruns n celula bacterian trece din forma linear ntr-o form circular. Aceste fapte au sugerat existena n celulele bacteriene a unor mecanisme de legare enzimatic a moleculelor lineare de ADN. In anul 1967 a avut loc descoperirea enzimelor implicate n procesele amintite mai sus att n celulele de E.coli infectate cu bacteriofagul T4 ct i n cele neinfectate. Identificarea acestor enzime a coincis cu ipoteza enunat de Okazaki privind mecanismul de replicare segmentar a ADN, prin fragmente scurte care sunt unite ulterior ntr-o caten continu. Prin aceasta s-a definit i rolul major al ADN-ligazelor ca parte integrant a mecanismelor de replicare a ADN. Dup descoperirea ligazelor din E.coli neinfectate cu bacteriofagi, activiti similare acestei ligaze au fost observate i ntr-o mare varietate de esuturi provenite de la organisme eucariote (n splina i mduva osoas de iepure, n microsporocitele de crin c i n celulele infectate cu virusul sarcomului Rous, n mieloame murine etc.). Aceste date demonstreaz existena ADN ligazelor la toate organismele vii, ele fiind eseniale pentru replicarea materialului genetic i pentru meninerea integritii sale. Pentru a se putea realiza legarea fragmentelor de ADN, este necesar c n amestecul de reacie s existe o serie de elemente: cofactorii specifici ai ligazei (NAD pentru ligaza de E.coli i ATP pentru ligaza de fag T4) ioni de magneziu, n concentraie optim de 10mM ditiotreitol; n absena sa activitatea enzimei se reduce la 25% (fig.28). nlocuirea ditiotreitolului cu -mercaptoetanol duce, de asemenea, la scderea cu 60% a activitii enzimei. In experimentele de inginerie genetic este preferat ADN-ligaza de fag T4, datorit proprietilor sale. Pentru obinerea sa se pornete de la o cultur bacterian de E.coli B, infectat cu bacteriofagul T4, din care apoi se separ enzima activ. Pentru mbuntirea randamentului de obinere a enzimei a fost creat n mod artificial un bacteriofag n care a fost inclus gena 34 provenit de la fagul T4 (gena rspunztoare de sinteza ligazei). Cu acest bacteriofag a fost lizogenizat o tulpin de E.coli. Pentru obinerea ligazei se face inducia fagului cu ajutorul temperaturii (42oC) i apoi se procedeaz la purificarea enzimei. Cu ajutorul acestei metode cantitatea de enzim obinut pornind de la65


acelai volum de cultur bacterian este de 500 ori mai mare. Ligaza de fag T4 este capabil de a lega att fragmentele de ADN cu extremiti coezive ct i fragmente cu extremiti drepte (fig.29). Testarea activitii enzimatice n procesul de purificare se realizeaz prin mai multe procedee dintre care, cel mai rapid presupune reconvertirea ADN plasmidial linearizat la forma circular. Cele dou forme, circular i linear migreaz diferit n gel de agaroz i, n consecin, se poate recunoate i activitatea ligazei. a) legarea fragmentelor de ADN cu extremiti coezive 5 pApCpG-OH pGpApTpCpCpGpT 3 3 TpGpCpCpTpApGp OH-GpCpAp 5 ATP Mg2+ 5 pApCpGpGpApTpCpCpGpT 3 3 TpGpCpCpTpApGpGpCpAp 5 b) legarea fragmentelor de ADN cu capete drepte 5 pApCpGpG-OH pApTpCpCpGpT 3 3 TpGpCpCp OH-TpApGpGpCpAp 5 ATP Mg2+

5 pApCpGpGpApTpCpCpGpT 3 3 TpGpCpCpTpApGpGpCpAp 5Fig.29. Modalitile de aciune ale ADN ligazei de fag T4

Fosfataza alcalin este o enzim care catalizeaz ndeprtarea gruprii fosfat de la captul 5' al ADN sau ARN, ceea ce determin defosforilarea fragmentelor respective. Enzima poate fi de origine bacterian sau poate fi izolat din intestin de viel. Fosfataza alcalin bacterian este mai activ dect cea eucariot; este termostabil i rezist la aciunea unor detergeni. Pentru blocarea reaciei de defosforilare, aciunea enzimei este inhibat prin diferite metode: tratament cu proteinaz K, folosirea EDTA sau nclzirea la 75oC. Cel mai adesea, fosfataza alcalin este utilizat pentru ndeprtarea gruprii fosfat de la captul 5' al ADN, n scopul prevenirii autocircularizrii plasmidelor sau autolegarea66


fragmentelor obinute prin aciunea unor enzime de restricie care genereaz capete coezive (fig.30). Atunci cnd plasmidele linearizate defosforilate sunt utilizate pentru clonare (pentru introducerea la nivelul lor a unor fragmente de ADN i apoi tratare cu ligaza) ele sunt supuse unor tratamente specifice care inhib aciunea fosfatazei alcaline.

Fig.30. Reprezentarea schematic a utilizrii fosfatazei alcaline n experimentele de clonare molecular

Polinucleotid-kinaza de fag T4 este utilizat pentru transferul unui grup fosfat de la ATP la captul 5' al ADN sau ARN, ea avnd o aciune invers fosfatazei alcaline. Datorit acestei aciuni, enzima poate fi utilizat pentru marcarea radioactiv a capetelor 5' ale ADN n experimentele de secveniere prin metoda Maxam i Gilbert sau pentru analiz cu nucleaza S167


i pentru fosforilarea linkerilor sintetici sau a altor fragmente de ADN la care lipsesc gruprile 5' fosfat necesare pentru legare. Nucleaza S1 este o enzim izolat din Aspergillus oryzae, care determin degradarea ADN sau ARN monocatenar genernd mono- sau oligonucleotide 5 fosfat. De regul, ADN sau ARN dublu-catenar precum i hibrizii ADN-ARN prezint rezisten la aciunea acestei enzime. Cu toate acestea, acizii nucleici dublu-catenari sunt digerai complet n prezena unor cantiti mari de nucleaz S1. Utilizarea n experimente a unor cantiti moderate de enzim determin clivarea acizilor nucleici dublu-catenari doar la nivelul unor crestturi, genernd fragmente de dimensiuni mari. Aceast enzim poate fi utilizat pentru: analizarea structurii hibrizilor ADNARN; pentru ndeprtarea cozilor monocatenare de la nivelul fragmentelor de ADN determinnd formarea de extremiti drepte; pentru crestarea buclei de tip ac de pr format n cursul procesului de reverstranscriere. 2.1.3. Vectori de clonare Un vector de clonare reprezint o molecul de ADN n care este integrat fragmentul de ADN de interes obinndu-se molecule recombinate. Acestea sunt apoi introduse ntr-o gazd specific pentru exprimarea informaiei genetice noi. Pentru a putea fi utilizat n experimentele de clonare, un vector trebuie s ndeplineasc mai multe condiii: s prezinte markeri genetici selectabili (cum ar, fi rezistena la antibiotice); s aib mai multe situsuri unice de clivare cu enzime de restricie, la nivelul unor regiuni neeseniale ale vectorului; s i se cunoasc secvena de nucleotide; s prezinte siguran n folosire (s aib o transmisibilitate redus n prezena unor plasmide conjugative, iar replicarea s fie sensibil la temperatura corpului mamiferelor); s aib o greutate molecular mic i s prezinte ct mai multe copii per celul (eventual s fie amplificabil prin tratament cu cloramfenicol); s fie uor de purificat, s permit obinerea unor cantiti mari, suficiente pentru experimentele de clonare.68


Cercetrile efectuate pn n prezent asupra particularitilor vectorilor de clonare au determinat completarea caracteristicilor deja menionate cu altele noi pe care ar trebui s le ndeplineasc vectorii ideali: s prezinte dimensiuni din ce n ce mai reduse dar s permit clonarea unor fragmente mari de ADN heterolog; s conin un numr crescut de situsuri unice de restricie grupate la nivelul unei regiuni specifice numit situs multiplu de clonare ("multiple cloning site"); s conin secvene specifice de ADN ce permit selecia rapid a clonelor recombinate (selecie direct pe medii specifice sau selecie prin teste histochimice); s prezinte secvene care s asigure generarea de molecule monocatenare necesare tehnicilor de secveniere sau pentru construirea de sonde de ADN; s conin secvene specifice de tip promotori, terminatori, activatori (enhanceri) ce asigur transcrierea "in vitro" a ADN clonat. Cei mai cunoscui i mai utilizai vectori de clonare sunt cei derivai de la plasmidele bacteriene. Dei multe dintre plasmidele naturale ndeplinesc o parte dintre caracteristicile unui vector ideal, s-a preferat prelucrarea lor "in vitro", n sensul eliminrii sau adugrii anumitor secvene, care s permit obinerea unei eficiene mari n experimentele de clonare de gene. n acest fel, Boyer i colab. au "construit" n laborator o plasmid hibrid, pornind de la trei plasmide naturale: pSC101, pMB1 (derivat de la ColE1) i RSF2124. Aceast plasmid, denumit pBR322, a reprezentat, pentru mult timp, vectorul cel mai frecvent utilizat n clonarea de gene n E.coli. Perfecionarea tehnicilor de prelucrare in vitro a materialului genetic a permis nlocuirea acestui vector (i a derivailor si) cu vectori noi, care asigur exprimarea mai eficient a genelor clonate (de exemplu, vectorii de exprimare). Dintre particularitile plasmidei pBR322 menionm: are dimensiuni mici, coninnd 4362pb (2,9 MDa); prezint o replicare relaxat, avnd un numr mare de copii/celul (conine secvena ori de la plasmida ColE1); este amplificabil prin tratament cu cloramfenicol; este uor de purificat;69


conine doi markeri genetici de selecie: gena de rezisten la tetraciclin (derivat de la plasmida pSC101) i gena de rezisten la ampicilin (derivat din plasmida RSF2124);

are mai multe situsuri unice de restricie pentru diferite enzime de restricie: EcoRI, Bam HI, Pst I, Hind III, Sal I etc; permite clonarea inserional deoarece conine situsuri unice de restricie n genele marker: Bam HI n gena de rezisten la tetraciclin i Pst I n gena de rezisten la ampicilin (fig.31).

Majoritatea vectorilor de clonare obinui pn n prezent sunt specifici pentru E.coli dar, pentru c n experimentele de clonare sunt utilizate gazde foarte variate, au fost construii vectori specifici pentru acestea, ei fiind prezentai ntr-un capitol urmtor. Vom prezenta n continuare principalele tipuri de vectori de clonare pentru E.coli.

Fig.31. Harta genetic a plasmidei pBR322 Ampr = gena de rezisten la ampicilin; Tetr =gena de rezisten la tetraciclin; ori = originea replicrii plasmidei

n general, pentru clonarea de gene n celulele de E.coli se pot folosi mai multe tipuri de vectori care, n funcie de structur i mod de funcionare, pot fi: vectori plasmidiali, vectori virali i vectori hibrizi. La rndul lor, vectorii hibrizi pot fi fagimide (cu structur hibrid, de plasmid i de fag filamentos) sau cosmide (cu structur hibrid, de genom de fag i de plasmid). Pe lng aceste categorii corespunztoare originii lor, vectori de clonare mai pot fi clasificai i n funcie de alte criterii (Stoica, 1997): 1. n funcie de posibilitatea studierii exprimrii fragmentelor de ADN clonate: vectori de clonare (permit doar clonarea unei anumite secvene de ADN, nu i analiza exprimrii sale, deoarece nu conin secvene promotor)70


vectori de exprimare (au n structura lor secvene promotor, astfel c permit, inclusiv exprimarea fragmentului de ADN clonat, determinnd, n anumite situaii, obinerea de proteine de fuziune)

2. n funcie de tehnica folosit pentru clonarea fragmentului de ADN de interes: vectori de clonare inserional (ADN de interes este introdus la nivelul unui situs unic de restricie din vector) vector de clonare prin nlocuire (ADN strin nlocuiete un fragment din vector, dup fragmentarea acestuia cu dou enzime de restricie). 3. n funcie de spectrul de gazde (posibilitatea replicrii i meninerii stabile a vectorului): vectori congenerici (pot fi folosii doar la organisme aparinnd aceluiai gen taxonomic) vectori de tip "shuttle" (naveta) (se replic i se menin stabil n dou gazde microbiene diferite). Un grup modern de vectori plasmidiali este reprezentat de vectorii de tip pUC (pUC 18, pUC19). Aceti vectori au fost construii ntre anii 1982-1985 de ctre grupul de cercettori condui de Messing, denumirea vectorilor reprezentnd locul unde acetia au fost obinui (plasmid of University of California). Ei sunt derivai de la pBR322, prin includerea genei lacZ' (partea din gena pentru -galactozidaz ce codific secvena NH2-terminal a proteinei = peptidul ce conine primii 145 de aminoacizi din cei 1023 ci are fiecare dintre catenele tetramerului -galactozidaza) i a unei secvene sintetice (polilinker de 54 perechi de baze) ce conine situsuri unice de recunoatere pentru mai multe enzime de restricie (13 enzime de restricie)(fig.32).

71


Fig.32.Reprezentarea schematic a vectorilor de tip pUC (pUC 18 i pUC 19)

Prezena fragmentului din gena lacZ permite complementaie intraalelic de tip cu o alt form defectiv a genei lacZ' (ce codific regiunea COOH-terminal a galactozidazei formei respective de peptid i lipsesc aminoacizii din poziiile 11-41 existeni n -galactozidaz) dintr-o gazd bacterian adecvat (fig.33). n urma procesului de complementaie genic, tulpina defectiv dar purttoare a vectorului nerecombinat este capabil s refac integral enzima -galactozidaza. Vector de clonare H2N 1 145 Bacteria mutant care nu produce -galactozidaz COOH 41 1023

x

Bacterie transformat capabil s sintetizeze -galactozidazFig.33. Reprezentarea schematic a procesului de complementaie genic

Sub aciunea IPTG (inductor al genei lacZ), o asemenea tulpin este capabil s degradeze analogul lactozei, X-gal (substrat cromogen), coloniile formate fiind albastre. De asemenea, prezena acestei gene permite selectarea clonelor recombinate (a celor care conin plasmide n care a fost integrat un fragment de ADN strin, la nivelul polilinkerului): aceste colonii manifest rezisten la ampicilin i sunt albe, n timp ce coloniile nerecombinate sunt albastre (n prezena X-gal i a inductorului specific = IPTG).

72


2.1.3.1. Vectori derivai de la fagul Aa cum se cunoate, bacteriofagul are un genom reprezentat de o molecul linear de ADN dublu catenar, ce conine 48502 perechi de baze. La capetele acestei molecule lineare se gsesc secvene specifice, complementare (coezive) de 12 nucleotide (situsul cos), care permit circularizarea ADN fagic n celulele bacteriene infectate (tulpini de E.coli). n forma sa natural, fagul poate prelua, ca fag transductor, doar scurte secvene de ADN din genomul gazdei n care s-a multiplicat (dup ce a parcurs ciclul lizogen), dimensiunea acestora fiind limitat de capsida fagic. De asemenea, numrul mare de situsuri de recunoatere pentru enzime de restricie, plasate la nivelul unor regiuni eseniale pentru evoluia litic a fagului limiteaz utilizarea sa ca vector de clonare. Cu toate acestea, pornindu-se de la genomul fagului , prin prelucrri "in vitro" au fost construii o serie de vectori de clonare, ncadrai n dou categorii: vectori de nlocuire i vectori de inserie. Pentru a se putea obine asemenea vectori, genomul fagului a fost modificat: au fost eliminate situsurile de restricie din zonele eseniale, iar prin folosirea oligonucleotidelor sintetice, situsurile de restricie au fost plasate n poziiile cele mai favorabile pentru clonare. Mai mult, tiind c regiunea central a genomului viral (aproximativ o treime din genom) nu este esenial pentru evoluia litic, ea poate fi ori eliminat complet, ori nlocuit cu ADN de interes. Vectorii de nlocuire (substituie) se caracterizeaz prin faptul c ADN heterolog nlocuiete un fragment neesenial din vector, dup ce acesta a fost tratat cu dou enzime de restricie ale cror situsuri de aciune flancheaz respectiva regiune viral. Asemenea vectori permit clonarea unor fragmente de ADN de 9-23 kb, fiind folosii, de obicei, pentru obinerea bibliotecilor de gene (colecie de vectori recombinai ce conin fragmente de restricie de ADN genomic de la o anumit specie). Din aceast categorie fac parte vectorii de tip Charon i EMBL. Vectorii Charon sunt vectori care permit doar clonarea unui anumit fragment de ADN strin, nu i exprimarea sa. Aceti vectori au fost obinui prin introducerea unor modificri importante la nivelul genomului fagului : deleii la nivelul regiunii de imunitate; mutaii la nivelul genei cI (vectorul nu poate fi meninut n stare lizogen); deleia genelor necesare atarii i integrrii; mutaii la nivelul genelor pentru proteinele capsidale A i B, etc.73


Vectorii de acest tip (Charon 4A, Charon 40) prezint dou grupe de situsuri de clonare (MCS) la capetele unei regiuni neeseniale a ADN viral, astfel c aceasta poate fi nlocuit de ADN strin. Pentru a se realiza clonarea, att vectorul ct i ADN strin sunt tratai cu o aceeai endonucleaz de restricie (al crei situs se regsete la nivelul MCS din vector); fragmentele rezultate se amestec i se trateaz cu ligaz, obinndu-se vectorul recombinat. Dup introducerea vectorului recombinat ntr-o gazd corespunztoare (E.coli recA-) se realizeaz selecia fagilor recombinai din plajele de liz, produse la nivelul tulpinii bacteriene sensibile, ei fiind analizai ulterior pentru determinarea caracteristicilor fragmentului de ADN clonat. Vectorii EMBL sunt tot vectori de clonare prin nlocuire, la care regiunea neesenial a genomului viral este flancat de dou situsuri de policlonare (MCS). La nivelul regiunii neeseniale se gsesc genele red i gam implicate n recombinare (prezint deci fenotip Spi+, ceea ce nseamn c n gazde lizogene pentru fagul P2 asemenea vectori nu se pot dezvolta, deci nu produc plaje de liz)(fig.34). Genele de interes ce sunt clonate la nivelul unor asemenea vectori nlocuiesc regiunea viral neesenial, fr a afecta funcionarea vectorului. Selecia vectorilor recombinai se realizeaz n gazde specifice, lizogene pentru fagul P2, prin apariia plajelor de liz (eliminarea genelor red i gam determin apariia fenotipului Spi-, deci formarea de plaje de liz).

Fig.34. Reprezentarea schematic a vectorului EMBL 4: A-R = gene ale bacteriofagului ; red, gam = gene fagice; trp = gen ce codific sinteza triprofanului; MCS = situs de policlonare ce conine secvenele de recunoatere pentru enzimele de restricie EcoRI, BamHI i SalI.

Vectorii de inserie se caracterizeaz prin faptul c ADN de interes este clonat la nivelul unui situs unic de restricie, localizat la nivelul unei gene neeseniale pentru evoluia litic a fagului. Din aceast categorie fac parte vectorii de tip gt i cei de tip ZAP.

74


Vectorii gt sunt vectori de clonare i exprimare, ce permit introducerea unor fragmente mici de ADN strin (de pn la 6kb). Din aceasta categorie menionm vectorii gt 10 i gt 11. n cazul vectorului gt 10, situsul unic de restricie (EcoRI) la nivelul cruia se poate clona ADN de interes se gsete la nivelul regiunii de imunitate. n acest fel, vectorii nerecombinai sunt cI+, deci sunt capabili de a lizogeniza n gazdele corespunztoare; vectorii recombinai au fenotip cI-, incapabili de lizogenie, ei producnd plaje de liz caracteristice. Vectorul gt 11 permite att clonarea unui fragment de ADN heterolog (de pn la 7,2kb) ct i exprimarea acestuia sub forma unei proteine de fuziune cu -galactozidaza, deoarece situsul unic de restricie, EcoRI, n care se integreaz ADN de interes se afl localizat la nivelul genei lacZ. n acest fel, vectorii gt 11 recombinai determin fenotipul de tip Lac- (nu mai are loc complementaia genetic n gazdele corespunztoare)(fig.35).

Fig.35. Reprezentarea schematic a vectorului gt 11

Vectorii de tip ZAP sunt vectori de inserie compleci. Ei conin, la nivelul regiunii centrale neeseniale, n locul genelor virale, vectorul pBluescript SK (M13-)(fig.36). La nivelul genei lacZ' din pBluescript, n situsul multiplu de clonare, se poate introduce ADN de interes (pn la 10kb). Asemenea vectori pot fi utilizai pentru experimente de secvenializare a ADN i ARN; pentru obinerea de sonde ARN cu ajutorul promotorilor T3 i T7 ce flancheaz ADN clonat; pentru obinerea de proteine de fuziune cu -galactozidaza.

Fig. 36. Reprezentarea schematic a unui vector de tip ZAP: A-R = gene fagice; MCS = situs de policlonare; I, T = secvene semnal pentru iniierea/terminarea exciziei fagimidului pBluescript, sub form de monocatene +

2.1.3.2.Vectorii hibrizi de tip cosmide

75


Aceti vectori reprezint plasmide modificate, ce conin secvena cos de la fagul necesar mpachetrii ADN n particulele fagice. De asemenea, cosmidele prezint originea replicrii de la plasmida ColE1 i un marker de selecie (de obicei, gena de rezisten la ampicilin). n acest fel, cosmidele se pot replica i menine ca plasmide (permind selecia coloniilor purttoare pe mediu ce conine antibioticul corespunztor) sau, n condiii specifice, datorit prezenei situsului cos, ele se pot mpacheta n particule fagice, fiind propagate prin transducie sau transfecie (transformarea celulelor sensibile cu ADN izolat din particule fagice recombinate). Asemenea vectori permit clonarea la nivelul lor a unor fragmente mari de ADN strin (de pn la 45 kb), favoriznd n acest fel propagarea unor gene eucariote ntregi. Deoarece n cosmide se pot insera fragmente mai mari de ADN, comparativ cu vectorii derivai de la fagul , ele sunt preferate n experimentele de realizare a bncilor genomice la eucariote. O categorie special de cosmide sunt cele de tip Charomid. Acestea, pe lng elementele specifice ale unei cosmide (secvena cos, originea replicrii, o gen marker), conin o secven spaiatoare, format din 1-23 copii repetate n tandem ale unui fragment de 2kb derivat din pBR322, flancat de dou situsuri de restricie pentru endonucleaza AvaI. Datorit prezenei secvenei spaiatoare, vectorii Charomid trebuie meninui n gazde recA(incapabile de recombinare). Prin transferul lor n gazde recA+ se realizeaz destabilizarea regiunii spaiatoare i apariia unor molecule Charomid cu dimensiuni variate, n funcie de numrul de copii ale secvenei de 2kb (de la 0 la 23 copii). Variaia dimensiunii secvenei spaiatoare determin dimensiunea fragmentului de ADN ce poate fi clonat ntr-un asemenea vector: micorarea dimensiunii secvenei spaiatoare este nsoit de posibilitatea introducerii unui fragment mai mare de ADN de interes. Vectorul recombinat rezultat este mpachetat n particule fagice (2-45 kb), prin folosirea unor fagi ajuttori. Vectorii de tip Charomid sunt mult utilizai n experimentele de obinere a bncilor genomice pentru ADN de origine mamalian. 2.1.2.3. Vectorii hibrizi de tip fagimide Fagimidele sau plasmidofagii reprezint o categorie special de vectori, ce combin caracteristicile vectorilor de tip plasmidiali cu cele ale fagilor filamentoi. Fagimidele, n cea mai simplificat form, conin:76


originea replicrii de la plasmida ColE1 (asigur meninerea vectorului n forma plasmidial); gen marker de selecie (rezisten la antibiotice, sintez de -galactozidaz etc); copie a unei secvene dintr-un fag filamentos (de obicei M13 sau f1), ce conine informaia genetic pentru replicarea ADN viral i pentru morfogeneza particulelor fagice.

Datorit acestor caracteristici, fagimidele pot fi propagate i meninute stabil n forma plasmidial ntr-o tulpin bacterian cultivat n condiii normale de mediu (pe mediu selectiv ce conine antibioticul corespunztor). Atunci cnd celulele gazd sunt infectate cu un fag filamentos ajuttor ("helper"), sunt activate funciile virale, iar ADN este mpachetat n particule fagice (ca ADN monocatenar circular). ADN monocatenar purificat din asemenea particule poate fi utilizat pentru procesele de secveniere a fragmentelor de ADN clonate sau pentru obinerea de sonde moleculare (de ADN monocatenar). ADN heterolog poate fi integrat ntr-un asemenea vector, la nivelul unui MCS localizat la nivelul unei gene ce permite rapida selecie a vectorilor recombinai. Dintre cele mai cunoscute i utilizate fagimide menionm pUC118/pUC119 i pBluescript. Primul grup de fagimide deriv din plasmidele pUC18, respectiv pUC19, i conin: originea replicrii din ColE1; originea replicrii fagului filamentos M13; gena lacI ce codific represorul Lac I al operonului lac; gena lacZ' (gena lacZ mutant, ce codific peptidul ), precedat de secvenele promotor i operator proprii; un situs MCS localizat la nivelul genei lacZ'. Clonarea ADN de interes se face la nivelul MCS determinnd blocarea sintezei de peptid . n felul acesta, selecia clonelor recombinate se va face pe baza testelor histochimice (colonii albe/albastre pe mediu cu X-gal, n prezena IPTG). Vectorii de tip pBluescript sunt vectori multifuncionali, construii pentru a simplifica clonarea molecular i analiza genetic (fig.37).

77


Fig.37. Reprezentarea schematic a vectorului pBluescript SK+/-. Apr = gena de rezisten la ampicilin; ori = originea replicrii plasmidei (derivat de la ColE1); lac Z= gena pentru sinteza galactozidazei; lac I= gena reglatoare a operonului lac; ori f1 (+) = originea replicrii ca fag filamentos; MCS = situs multiplu de clonare; T3 i T7 = promotori specifici derivai de la fagii T3 i T7.

Comparativ cu celelalte tipuri de vectori, fagimidele pBluescript ofer unele avantaje n procesul de clonare: clonare la nivelul unui MCS (polilinker), ce conine 20 situsuri diferite de restricie (SacI, Bst XI, Not I, Eag I, Xba I, Spe I, Bam HI, Sma I, Pst I, Eco RI, Eco RV, Hind III, Cla I, Sal I, Acc I, Hinc II, Xho I, Apa I, Dra II, Kpn I. Regiunea este ncadrat de promotorii fagici T3 i T7, iar ntreaga secven este flancat de cte un situs pentru endonucleaza de restricie Bss H II (situs foarte rar n genomuri), cu ajutorul creia poate fi, deci, excizat; selecia rapid a clonelor recombinate (teste histochimice: pe mediu cu X-gal i IPTG coloniile recombinate sunt albe) transcrierea eficient in vitro a ADN heterolog, mediat de promotorii T3 i T7. Cei doi promotori se gsesc n orientare invers unul fa de cellalt i, ca urmare, ADN heterolog clonat poate fi transcris de pe oricare dintre cele dou catene, n funcie de orientarea pe care o are n molecula de vector recombinat i de activarea specific a unuia sau altuia dintre promotorii fagici;78


obinerea de monocatene de ADN datorit existenei secvenelor de origine viral (fag filamentos). Pentru a obine ADN monocatenar, tulpina bacterian n care se afl vectorul recombinat este infectat cu un fag M13 defectiv ce conine gena II mutant. Produsul acestei gene virale va aciona preferenial asupra secvenei ori-f1 din fagimid, declannd replicarea ADN pe modelul fagilor filamentoi. n funcie de orientarea regiunii de origine a replicrii

Date post:	13-Jul-2015
Category:	Documents
Upload:	andreea-cristina-grigoriu
View:	1,468 times
Download:	15 times

Inginerie Genetica

Documents