+ All Categories
Home > Documents > Inginerie Genetica-2 Completat

Inginerie Genetica-2 Completat

Date post: 20-Dec-2015
Category:
Upload: andreea-flory
View: 62 times
Download: 5 times
Share this document with a friend
Description:
ingineria genetica
84
Fenomenul de restrictie - Fenomenul de restrictie - modificatie modificatie Descoperirea si elucidarea fenomenelor de restrictie (R) Descoperirea si elucidarea fenomenelor de restrictie (R) si modificatie (M) ale celulelor bacteriene s-au realizat si modificatie (M) ale celulelor bacteriene s-au realizat in principal, prin studii ale fenomenului de in principal, prin studii ale fenomenului de transductie transductie (transfer de material genetic cu ajutorul (transfer de material genetic cu ajutorul bacteriofagilor) efectuate de Luria si Bertani, in 1952- bacteriofagilor) efectuate de Luria si Bertani, in 1952- 1953 si de Arber si Linn in 1969. 1953 si de Arber si Linn in 1969. Bariera principala in mentinerea ADN nou transferat in Bariera principala in mentinerea ADN nou transferat in celula gazda este restrictia acestuia controlata de celula gazda este restrictia acestuia controlata de gazda. gazda. Sistemul de restrictie Sistemul de restrictie este reprezentat de este reprezentat de endonucleaze endonucleaze de restrictie de restrictie care scindeaza moleculele de ADN care scindeaza moleculele de ADN recunoscute ca exogene (straine), la nivelul ambelor recunoscute ca exogene (straine), la nivelul ambelor catene, rezultand fragmente de ADN cu extremitati libere. catene, rezultand fragmente de ADN cu extremitati libere. Sistemul de restrictie nu distruge genomul propriu, Sistemul de restrictie nu distruge genomul propriu, deoarece este contrabalansat de sitemul de deoarece este contrabalansat de sitemul de modificatie/modificare. modificatie/modificare. Sistemul de modificatie Sistemul de modificatie este reprezentat de este reprezentat de metilaze metilaze care care recunosc aceleasi situsuri ca restrictazele, dar situate recunosc aceleasi situsuri ca restrictazele, dar situate in genomul propriu, pe care le metileaza pentru a le feri in genomul propriu, pe care le metileaza pentru a le feri de atacul propriilor endonucleaze de restrictie. de atacul propriilor endonucleaze de restrictie.
Transcript
Page 1: Inginerie Genetica-2 Completat

Fenomenul de restrictie - modificatieFenomenul de restrictie - modificatie Descoperirea si elucidarea fenomenelor de restrictie (R) si Descoperirea si elucidarea fenomenelor de restrictie (R) si

modificatie (M) ale celulelor bacteriene s-au realizat in principal, modificatie (M) ale celulelor bacteriene s-au realizat in principal, prin studii ale fenomenului de prin studii ale fenomenului de transductietransductie (transfer de material (transfer de material genetic cu ajutorul bacteriofagilor) efectuate de Luria si Bertani, in genetic cu ajutorul bacteriofagilor) efectuate de Luria si Bertani, in 1952-1953 si de Arber si Linn in 1969.1952-1953 si de Arber si Linn in 1969.

Bariera principala in mentinerea ADN nou transferat in celula Bariera principala in mentinerea ADN nou transferat in celula gazda este restrictia acestuia controlata de gazda.gazda este restrictia acestuia controlata de gazda.

Sistemul de restrictieSistemul de restrictie este reprezentat de este reprezentat de endonucleaze de restrictieendonucleaze de restrictie care scindeaza moleculele de ADN recunoscute ca exogene care scindeaza moleculele de ADN recunoscute ca exogene (straine), la nivelul ambelor catene, rezultand fragmente de ADN (straine), la nivelul ambelor catene, rezultand fragmente de ADN cu extremitati libere. cu extremitati libere.

Sistemul de restrictie nu distruge genomul propriu, deoarece este Sistemul de restrictie nu distruge genomul propriu, deoarece este contrabalansat de sitemul de modificatie/modificare.contrabalansat de sitemul de modificatie/modificare.

Sistemul de modificatieSistemul de modificatie este reprezentat de este reprezentat de metilazemetilaze care recunosc care recunosc aceleasi situsuri ca restrictazele, dar situate in genomul propriu, pe aceleasi situsuri ca restrictazele, dar situate in genomul propriu, pe care le metileaza pentru a le feri de atacul propriilor endonucleaze care le metileaza pentru a le feri de atacul propriilor endonucleaze de restrictie. de restrictie.

Page 2: Inginerie Genetica-2 Completat

Fenomenul de restrictie - modificatieFenomenul de restrictie - modificatie

Sistemul R-M poate fi privit ca un sistem de aparare al celulei Sistemul R-M poate fi privit ca un sistem de aparare al celulei bacteriene de ADN strain ce patrunde in celula prin conjugare, bacteriene de ADN strain ce patrunde in celula prin conjugare, transformare, transductie.transformare, transductie.

Este deci, un Este deci, un sistem imuno-genetic de apararesistem imuno-genetic de aparare.. ExempluExemplu: bacteriofagul : bacteriofagul , multiplicat un timp pe tulpina , multiplicat un timp pe tulpina E. coliE. coli B, se B, se

multiplica foarte greu cand e trecut pe tulpina multiplica foarte greu cand e trecut pe tulpina E. coliE. coli K. S-a marcat K. S-a marcat radioactiv cu Pradioactiv cu P3232, ADN fagic si s-a constatat ca acesta este restrictat , ADN fagic si s-a constatat ca acesta este restrictat imediat dupa ce patrunde in celula gazda. Daca, intamplator, cativa au imediat dupa ce patrunde in celula gazda. Daca, intamplator, cativa au parcurs un ciclu lizogen (ca profagi), replicandu-se sincron cu parcurs un ciclu lizogen (ca profagi), replicandu-se sincron cu cromozomul gazdei cromozomul gazdei E. coli E. coli K, in prezenta metilazei modificatoare, K, in prezenta metilazei modificatoare, devin si ei rezistenti la atacul endonucleazelor de restrictie, la fel ca si devin si ei rezistenti la atacul endonucleazelor de restrictie, la fel ca si nucleoidul bacterian. Daca fagul e trecut iarasi pe tulpina nucleoidul bacterian. Daca fagul e trecut iarasi pe tulpina E. coli E. coli B, se B, se intampina aceleasi probleme deoarece intampina aceleasi probleme deoarece modificarea ADN fagic este modificarea ADN fagic este neereditara si este controlata, ca si restrictia, de catre celula-gazda.neereditara si este controlata, ca si restrictia, de catre celula-gazda.

Page 3: Inginerie Genetica-2 Completat
Page 4: Inginerie Genetica-2 Completat
Page 5: Inginerie Genetica-2 Completat

Fenomenul de restrictie - modificatieFenomenul de restrictie - modificatie Genele care codifica sistemul R-M sunt localizate fie in cromozomul bacterian, fie Genele care codifica sistemul R-M sunt localizate fie in cromozomul bacterian, fie

pe plasmide. pe plasmide. Arber, in 1974, evidentiaza 3 gene raspunzatoare de aceasta activitate:Arber, in 1974, evidentiaza 3 gene raspunzatoare de aceasta activitate:

hsdhsd S S implicata in recunoasterea situsului pe ADN; implicata in recunoasterea situsului pe ADN; hsdhsd R R codifica endonucleaza de restrictie; codifica endonucleaza de restrictie; hsdhsd M M codifica metilaza: codifica metilaza: dcmdcm – metileaza citozina, – metileaza citozina, damdam – metileaza adenina. – metileaza adenina.

Aceste gene pot suferi mutatii:Aceste gene pot suferi mutatii: mutatii ce afecteaza hsd R determina fenotip mutatii ce afecteaza hsd R determina fenotip r-m+r-m+ (ADN nu mai este restrictat, (ADN nu mai este restrictat,

ci doar metilat).ci doar metilat). mutatii ce afecteaza hsd S determina fenotip mutatii ce afecteaza hsd S determina fenotip r-m-r-m- (ADN nu mai sufera nici (ADN nu mai sufera nici

restrictie, nici metilare, deoarece enzima nu se mai poate atasa la situsul specific restrictie, nici metilare, deoarece enzima nu se mai poate atasa la situsul specific sau nu-l mai recunoaste);sau nu-l mai recunoaste);

mutatii ce afecteaza hsd M determina mai degraba fenotip mutatii ce afecteaza hsd M determina mai degraba fenotip r-m-r-m- decat r+m- decat r+m- (deoarece subunitatea M intervine in functionarea normala a subunitatii R, ca un (deoarece subunitatea M intervine in functionarea normala a subunitatii R, ca un sistem de siguranta, pentru a nu-si degrada propriul ADN).sistem de siguranta, pentru a nu-si degrada propriul ADN).

Page 6: Inginerie Genetica-2 Completat

Fenomenul de restrictie - modificatieFenomenul de restrictie - modificatie Nomenclatura endonucleazelor de restrictie (H.O.Smith si D. Nathans)Nomenclatura endonucleazelor de restrictie (H.O.Smith si D. Nathans)

Prima litera (format italic) – genul de la care s-a izolat enzima;Prima litera (format italic) – genul de la care s-a izolat enzima; Urmatoarele 2 litere (format italic) – primele doua litere ale speciei de la care s-Urmatoarele 2 litere (format italic) – primele doua litere ale speciei de la care s-

a izolat enzima;a izolat enzima; Urmatoarea litera (poate lipsi, format normal) – desemneaza tulpina de la care Urmatoarea litera (poate lipsi, format normal) – desemneaza tulpina de la care

s-a izolat enzima;s-a izolat enzima; Cand de la aceeasi tulpina s-au izolat mai multe restrictaze, ele sunt identificate Cand de la aceeasi tulpina s-au izolat mai multe restrictaze, ele sunt identificate

cu cifre romane (I, II, III)cu cifre romane (I, II, III) Exemple:Exemple:

• EcoEcoR I de la R I de la E. coliE. coli R 13 R 13• EcoEcoR II de la R II de la E. coliE. coli R 245 R 245• HinHind I, II, III de la d I, II, III de la Haemophillus influenzaeHaemophillus influenzae• HpaHpa I, II de la I, II de la Haemophillus parainfluenzaeHaemophillus parainfluenzae• Hae Hae I, II, IIII, II, III de la Haemophillus aegypticus de la Haemophillus aegypticus• Bgl Bgl I, II de la I, II de la Bacillus globigiiBacillus globigii• BamBamH I de la H I de la Bacillus amyloliquefaciensBacillus amyloliquefaciens H H• BstBst I de la I de la Bacillus stearothermophillusBacillus stearothermophillus

• NaeNae de la de la Nocardia aerocolonigenesNocardia aerocolonigenes• SalSal I de la I de la Streptomyces albusStreptomyces albus• Mbo Mbo II de la Moraxella bovis de la Moraxella bovis• Xma Xma I de la I de la Xanthomonas Xanthomonas malvacearummalvacearum• Sma Sma I de la I de la Serratia marcescensSerratia marcescens• PstPst I de la I de la Providencia stuartiiProvidencia stuartii 164 164

Page 7: Inginerie Genetica-2 Completat

Fenomenul de restrictie - modificatieFenomenul de restrictie - modificatieSisteme enzimatice R-M de tip ISisteme enzimatice R-M de tip I

Au GM mare: 300.000 daltoni;Au GM mare: 300.000 daltoni; Necesita cofactori (MgNecesita cofactori (Mg2+2+, ATP, S-adenosil L-metionina);, ATP, S-adenosil L-metionina); Sunt formate din 3 subunitati R (Sunt formate din 3 subunitati R (), M (), M (), S (), S () cu GM 135.000, 60.000 si ) cu GM 135.000, 60.000 si

55.000 daltoni.55.000 daltoni. Situsul de recunoastere este acelasi si pentru R si pentru M;Situsul de recunoastere este acelasi si pentru R si pentru M; Aceeasi enzima poate functiona ca restrictaza (cand poaseda toate subunitatile) si Aceeasi enzima poate functiona ca restrictaza (cand poaseda toate subunitatile) si

ca metilaza (cand pierde subunitarea R sau S);ca metilaza (cand pierde subunitarea R sau S); Metilaza actioneaza chiar la nivelul situsului de recunoastere;Metilaza actioneaza chiar la nivelul situsului de recunoastere; Restrictaza cliveaza catenele de AND la o distanta de 1000-5000 nucleotide in Restrictaza cliveaza catenele de AND la o distanta de 1000-5000 nucleotide in

afara situsurilor specifice.afara situsurilor specifice. Situsurile de recunoastere contin 13-15 perechi de nucleotide: Situsurile de recunoastere contin 13-15 perechi de nucleotide:

la un capat un trimer la un capat un trimer la mijloc un domeniu de 6-8 nucleotide care nu este implicat in recunoastere;la mijloc un domeniu de 6-8 nucleotide care nu este implicat in recunoastere; la celalalt capat un tetramerla celalalt capat un tetramer

5’ TGA*….(N)5’ TGA*….(N)6-86-8…TGCT 3’…TGCT 3’

3’ ACT…. (N)3’ ACT…. (N)6-86-8…*ACGA 5’…*ACGA 5’

Page 8: Inginerie Genetica-2 Completat
Page 9: Inginerie Genetica-2 Completat

Fenomenul de restrictie - modificatieFenomenul de restrictie - modificatie

Sisteme enzimatice R-M de tip ISisteme enzimatice R-M de tip I Exemple: Exemple: EcoEcoK si K si EcoEcoB.B. Daca adeninele marcate din situs sunt metilate enzima nu actioneaza in niciun fel;Daca adeninele marcate din situs sunt metilate enzima nu actioneaza in niciun fel; Daca situsul e hemimetilat (doar o adenina de pe o catena), enzima functioneaza ca o Daca situsul e hemimetilat (doar o adenina de pe o catena), enzima functioneaza ca o

metilaza si metileaza si cealalta catena;metilaza si metileaza si cealalta catena; Daca situsul este nemetilat enzima functioneaza ca o restrictaza si cliveaza ADN.Daca situsul este nemetilat enzima functioneaza ca o restrictaza si cliveaza ADN. Gruparea CHGruparea CH33 e data de S-adenosil L-metionina care are rol de donor, dar si de efector e data de S-adenosil L-metionina care are rol de donor, dar si de efector

alosteric, deoarece schimba confromatia subunitatii S si permite atasarea enzimei la alosteric, deoarece schimba confromatia subunitatii S si permite atasarea enzimei la situs.situs.

Clivarea nu este randomica (la 1000-5000 nucleotide distanta de situs), ci are loc in Clivarea nu este randomica (la 1000-5000 nucleotide distanta de situs), ci are loc in doua etape: mai intai este incizata o catena, apoi cealalta, in apropierea primei incizii si doua etape: mai intai este incizata o catena, apoi cealalta, in apropierea primei incizii si apoi urmaza o activitate exonucleazica, cu consum de ATP.apoi urmaza o activitate exonucleazica, cu consum de ATP.

Exista doua ipoteze privind clivajul: Exista doua ipoteze privind clivajul: fie ca enzima se ataseaza la situsul de recunoastere si apoi se deplaseaza pe fie ca enzima se ataseaza la situsul de recunoastere si apoi se deplaseaza pe

molecula de ADN pana la locul de clivare, molecula de ADN pana la locul de clivare, fie dupa atasare, determina plierea moleculei de ADN astfel incat situsul de fie dupa atasare, determina plierea moleculei de ADN astfel incat situsul de

clivare este adus in apropierea celui de atasare.clivare este adus in apropierea celui de atasare.

5’ TGA*….(N)6-8…TGCT 3’ 3’ ACT…. (N)6-8…*ACGA 5’

Page 10: Inginerie Genetica-2 Completat

Fenomenul de restrictie - modificatieFenomenul de restrictie - modificatieSisteme enzimatice R-M de tip IISisteme enzimatice R-M de tip II:: Au greutate moleculara mica.Au greutate moleculara mica. Actioneaza si in absenta unor cofactori.Actioneaza si in absenta unor cofactori. Restrictazele sunt enzime diferite de metilazeRestrictazele sunt enzime diferite de metilaze.. Situsul de atasare este un palindrom (secventa cu bisimetrie rotatorie) de 4-5-6 pb. Situsul de atasare este un palindrom (secventa cu bisimetrie rotatorie) de 4-5-6 pb. Clivarea si metilarea se fac chiar la nivelul situsului de recunoastere.Clivarea si metilarea se fac chiar la nivelul situsului de recunoastere. Metilarea Metilarea

are loc la A sau C din situs, atunci cand acesta este hemimetilat, are loc la A sau C din situs, atunci cand acesta este hemimetilat, ca donor functioneaza tot S-adenosil L-metionina; ca donor functioneaza tot S-adenosil L-metionina; are loc denaturarea locala a ADN-ului in zona situsului si catena ce va fi metilata intra are loc denaturarea locala a ADN-ului in zona situsului si catena ce va fi metilata intra

intr-un sant format intre doua domenii ale metilazei; intr-un sant format intre doua domenii ale metilazei; nucleotida ce trebuie metilata este extrasa din catena, este metilata, si apoi reasamblata in nucleotida ce trebuie metilata este extrasa din catena, este metilata, si apoi reasamblata in

catena catena Contin in centrul catalitic 2 aminoacizi cu caracter acid (acid glutamic Glu si Contin in centrul catalitic 2 aminoacizi cu caracter acid (acid glutamic Glu si

aspartic Asp) si unul cu caracter bazic (lizina Lys) ce intervin in mecanismul de aspartic Asp) si unul cu caracter bazic (lizina Lys) ce intervin in mecanismul de clivareclivare. Astfel, Lys activeaza o molecula de apa care executa un atac nucleofilic . Astfel, Lys activeaza o molecula de apa care executa un atac nucleofilic asupra gruparii fosfat si desface legatura fosfodiesterica, Mgasupra gruparii fosfat si desface legatura fosfodiesterica, Mg2+2+ stabilizeaza sarcinile stabilizeaza sarcinile negative ale gruparii negative ale gruparii 2-2-POPO44, iar Glu si Asp cedeaza cate un proton gruparilor OH, iar Glu si Asp cedeaza cate un proton gruparilor OH--

Page 11: Inginerie Genetica-2 Completat

Fenomenul de restrictie - modificatieFenomenul de restrictie - modificatie

Sisteme enzimatice R-M de tip IISisteme enzimatice R-M de tip II::

Dupa modul de clivare, se clasifica in:Dupa modul de clivare, se clasifica in: Enzime care produc Enzime care produc capete netedecapete netede ( (flush, blunt, smouthflush, blunt, smouth ends): ends):

HinHind II, d II, HaeHae III III, , Sma Sma II, , HpaHpa I, I, NaeNae I I;;

Enzime care produc Enzime care produc capete adezivecapete adezive ( (cohesive, stickycohesive, sticky ends) 5’ ( ends) 5’ (EcoEcoR R I si II, I si II, HinHind III, d III, HpaHpa II, II, BamBam H I, H I, SalSal I, I, XmaXma I) sau 3’ (Bgl I sau I) sau 3’ (Bgl I sau KpnI)KpnI)

5’GG CC 3’5’GG CC 3’3’CC GG 5’3’CC GG 5’

Page 12: Inginerie Genetica-2 Completat

Fenomenul de restrictie - modificatieFenomenul de restrictie - modificatie

Sisteme enzimatice R-M de tip IISisteme enzimatice R-M de tip II

EcoEcoR IR I Descoperita la Descoperita la E. coliE. coli tulpina R13; tulpina R13; Codificata de o gena plasmidiala de pe un plasmid conjugativ R de 7 x 10Codificata de o gena plasmidiala de pe un plasmid conjugativ R de 7 x 1066 daltoni; daltoni; Este un dimer cu GM de 30.000 daltoni;Este un dimer cu GM de 30.000 daltoni; Situsul de recunoastere este un palindrom de 6 nucleotide (5’GAATTC3’);Situsul de recunoastere este un palindrom de 6 nucleotide (5’GAATTC3’); Prin clivare formeaza capete 5’ lipicioase din cate 4 nucleotide (5’AATT3’) ;Prin clivare formeaza capete 5’ lipicioase din cate 4 nucleotide (5’AATT3’) ; Metilarea are loc la A din vecinatatea timinei;Metilarea are loc la A din vecinatatea timinei; La fagul La fagul exista 5 situsuri pentru exista 5 situsuri pentru EcoEcoR I.R I.

5’G AA5’G AA**T T C 3’T T C 3’3’C T T A3’C T T A**A G 5’A G 5’

Page 13: Inginerie Genetica-2 Completat

Fenomenul de restrictie - modificatieFenomenul de restrictie - modificatie

Sisteme enzimatice R-M de tip IISisteme enzimatice R-M de tip IIEcoEcoR IIR II Descoperita la Descoperita la E. coliE. coli tulpina R245; tulpina R245; Codificata de o gena plasmidiala de pe un plasmid conjugativ R15;Codificata de o gena plasmidiala de pe un plasmid conjugativ R15; Situsul de recunoastere este un palindrom de 5 perechi de nucleotide Situsul de recunoastere este un palindrom de 5 perechi de nucleotide

(5’CCTGG3’);(5’CCTGG3’); Prin clivare formeaza capete 5’ lipicioase din cate 5 nucleotide Prin clivare formeaza capete 5’ lipicioase din cate 5 nucleotide

(5’CCTGG3’);(5’CCTGG3’); Metilarea are loc la C din vecinatatea timinei;Metilarea are loc la C din vecinatatea timinei;

5’ N …CC5’ N …CC**TGG 3’TGG 3’3’ GG AC3’ GG AC**C ….N 5’C ….N 5’

Page 14: Inginerie Genetica-2 Completat

Fenomenul de restrictie - modificatieFenomenul de restrictie - modificatie

Sisteme enzimatice R-M de tip IISisteme enzimatice R-M de tip II Exista enzime cu situsul inclus in situsul altei restrictaze: Exista enzime cu situsul inclus in situsul altei restrictaze: MboMbo are un situs de 4pb are un situs de 4pb

inclus in situsul de 6pb al enzimei inclus in situsul de 6pb al enzimei BamBam H I H I..

5’ G 5’ G GATCGATC* * C 3’C 3’

3’ C 3’ C CC**TAG TAG G 5’G 5’ Enzimele Enzimele izoschizomere izoschizomere sunt izolate de la specii diferite, recunosc aceleasi situsuri sunt izolate de la specii diferite, recunosc aceleasi situsuri

si produc aceeasi taietura, deci creeaza capete identice si produc aceeasi taietura, deci creeaza capete identice ((BamBam H I H I si si BstBst I I))

5’ G GATC5’ G GATC* * C 3’C 3’

3’ C C3’ C C**TAG G 5’TAG G 5’ Enzime Enzime neoschizomereneoschizomere sunt izolate de la specii diferite, recunosc aceleasi situsuri sunt izolate de la specii diferite, recunosc aceleasi situsuri

si produc taieturi diferite, deci creeaza capete diferite (si produc taieturi diferite, deci creeaza capete diferite (Nae I Nae I – capete netede iar– capete netede iar Xma IXma I capete 5’ coezive)capete 5’ coezive)

Page 15: Inginerie Genetica-2 Completat

Fenomenul de restrictie - modificatieFenomenul de restrictie - modificatie

Sisteme enzimatice R-M de tip IISisteme enzimatice R-M de tip II Unele enzime recunosc situsuri diferite, dar produc capete Unele enzime recunosc situsuri diferite, dar produc capete

identice (identice (Bam H IBam H I si si Bgl IIBgl II) )

Unele enzime recunosc un situs cu ambiguitati (Unele enzime recunosc un situs cu ambiguitati (HinHind II):d II):

5’ GT5’ GTCACAAC 3’ sau 5’ GTAC 3’ sau 5’ GTTATAAC 3’ sau 5’ GTAC 3’ sau 5’ GTCGCGAC 3’AC 3’

5’ G G ATC* C 3’5’ G G ATC* C 3’3’ C C*TAG G 5’3’ C C*TAG G 5’

5’ 5’ AA G ATC* G ATC* TT 3’ 3’3’ 3’ TT C*TAG C*TAG AA 5’ 5’

Page 16: Inginerie Genetica-2 Completat

Fenomenul de restrictie - modificatieFenomenul de restrictie - modificatie

Sisteme enzimatice R-M de tip IIISisteme enzimatice R-M de tip III

Descoperite in 1978, de catre Kauc si Piekarowicz, la fagul plasmide-like P1;Descoperite in 1978, de catre Kauc si Piekarowicz, la fagul plasmide-like P1; Exemple: Exemple: EcoEcoP I P I sau sau EcoEco P15 P15 Au situsul de clivare la mica distanta de cel de recunoastere si metilare (la 25-27 pb)Au situsul de clivare la mica distanta de cel de recunoastere si metilare (la 25-27 pb)

Sisteme enzimatice R-M de tip IVSisteme enzimatice R-M de tip IV Sunt rare si mai putin eficiente;Sunt rare si mai putin eficiente; Restrictaza recunoaste si cliveaza un situs metilat;Restrictaza recunoaste si cliveaza un situs metilat; DpnDpn I I si II de la si II de la Diplococcus pneumoniaeDiplococcus pneumoniae au acelasi situs si formeaza capete netede, au acelasi situs si formeaza capete netede,

dar dar Dpn Dpn II necesita pentru clivare A metilata (si nu poseda metilaza necesita pentru clivare A metilata (si nu poseda metilaza corespunzatoare), iar corespunzatoare), iar DpnDpn II cliveaza numai cand C nu e metilata (si poseda II cliveaza numai cand C nu e metilata (si poseda metilaza corespunzatoare, de aceea metilaza corespunzatoare, de aceea Dpn Dpn II apartine la sistemul R-M II): II apartine la sistemul R-M II):

5’ G A5’ G A** T C T C* * 3’3’

3’ C3’ C* * T AT A**G 5’G 5’

Page 17: Inginerie Genetica-2 Completat

LIGAZELELIGAZELE

Catalizeaza formarea legaturilor covalente fosfodiesterice intre capetele 3’OH si 5’ Catalizeaza formarea legaturilor covalente fosfodiesterice intre capetele 3’OH si 5’ POPO44 ale unor fragmente de ADN dc. ale unor fragmente de ADN dc.

Daca fragmentele au capete Daca fragmentele au capete netede,netede, se utilizeaza se utilizeaza Ligaza T4Ligaza T4 (izolata de (izolata de E. coliE. coli infectata cu fagul T4) si energia este furnizata de ATP;infectata cu fagul T4) si energia este furnizata de ATP;

Daca fragmentele au capete Daca fragmentele au capete coezive, coezive, se utilizeaza se utilizeaza ADN ligazaADN ligaza iar sursa de energie iar sursa de energie este NAD+ .este NAD+ .

Temperatura optima pentru refacerea legaturii fosfodiesterice este 15-22°CTemperatura optima pentru refacerea legaturii fosfodiesterice este 15-22°C Metoda decamerilorMetoda decamerilor : in prezenta ligazei T4, la capetele netede ale fragmentelor : in prezenta ligazei T4, la capetele netede ale fragmentelor

ADN ce urmeaza sa se uneasca, se adauga secvente linker de cate 10pb in care se ADN ce urmeaza sa se uneasca, se adauga secvente linker de cate 10pb in care se afla situsuri pentru endonucleaze de restrictie ce formeaza capete coezive si care, afla situsuri pentru endonucleaze de restrictie ce formeaza capete coezive si care, apoi, se unesc cu ADN ligaza si genereaza ADN recombinant.apoi, se unesc cu ADN ligaza si genereaza ADN recombinant.

Metoda cozilor homopolimericeMetoda cozilor homopolimerice adauga, cu ajutorul terminal transferazei, la adauga, cu ajutorul terminal transferazei, la extremitatile 3’ terminale ale fragmentelor ce urmeaza sa se sudeze, cozi scurte extremitatile 3’ terminale ale fragmentelor ce urmeaza sa se sudeze, cozi scurte poli (A) respectiv poli (T). Este posibil sa se utilizeze si perechile GC. Incubarea poli (A) respectiv poli (T). Este posibil sa se utilizeze si perechile GC. Incubarea fragmentelor cu capete complementare la 22°C duce la formarea ADN fragmentelor cu capete complementare la 22°C duce la formarea ADN recombinant. recombinant.

Page 18: Inginerie Genetica-2 Completat
Page 19: Inginerie Genetica-2 Completat

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Informaţia genetică la procariote se află într-un circuit intens, extrem de Informaţia genetică la procariote se află într-un circuit intens, extrem de activ, denumit activ, denumit flux geneticflux genetic şi care se realizează în două sensuri: şi care se realizează în două sensuri:

pe verticală (prin diviziuni succesive, informaţia genetică se pe verticală (prin diviziuni succesive, informaţia genetică se transmite de la ascendenţă la descendenţă, asigurându-se transmite de la ascendenţă la descendenţă, asigurându-se transmiterea ereditară a caracterelor de la o generaţie bacteriană la transmiterea ereditară a caracterelor de la o generaţie bacteriană la alta) şi alta) şi

pe orizontală (transmiterea informaţiei genetice între indivizii pe orizontală (transmiterea informaţiei genetice între indivizii aceleiaşi generaţii) prin trei mecanisme importante: aceleiaşi generaţii) prin trei mecanisme importante: transformarea, transformarea, conjugarea, conjugarea, transducţia. transducţia.

Fluxul genetic pe orizontală asigură Fluxul genetic pe orizontală asigură recombinarea genetică la recombinarea genetică la procarioteprocariote şi se realizează, direct sau indirect, între o şi se realizează, direct sau indirect, între o bacterie-bacterie-donordonor care furnizează o moleculă de ADN exogen ( care furnizează o moleculă de ADN exogen (exogenotexogenot) şi ) şi ADN-ul cromozomal sau plasmidial (endogen sau ADN-ul cromozomal sau plasmidial (endogen sau endogenotendogenot) al ) al bacteriei-receptorbacteriei-receptor. Cele două molecule formează un ADN-hibrid, . Cele două molecule formează un ADN-hibrid, astfel că, celula bacteriană care îl conţine, este un astfel că, celula bacteriană care îl conţine, este un recombinantrecombinant..

Page 20: Inginerie Genetica-2 Completat

I. I. Transformarea geneticăTransformarea genetică Reprezintă procesul prin care o bacterie-receptor încorporează ADN Reprezintă procesul prin care o bacterie-receptor încorporează ADN

exogenot extracelular, liber (cromozomal sau plasmidial), îl menţine exogenot extracelular, liber (cromozomal sau plasmidial), îl menţine stabil (îl fereşte de atacul endonucleazelor proprii) şi îl exprimă (prin stabil (îl fereşte de atacul endonucleazelor proprii) şi îl exprimă (prin transcriere şi translaţie).transcriere şi translaţie).

Procesul a fost descoperit în Procesul a fost descoperit în 19281928 de către microbiologul englez F. de către microbiologul englez F. GriffithGriffith la la Diplococcus pneumoniaeDiplococcus pneumoniae (pneumococ). (pneumococ).

După morfologie, structura şi patogenitate, pneumococii se încadrează După morfologie, structura şi patogenitate, pneumococii se încadrează în două grupe: în două grupe: Tulpini de tip Tulpini de tip SS I, II, III, (din engl. I, II, III, (din engl. smoothsmooth - neted), care au capsulă de natură - neted), care au capsulă de natură

polizaharidică, sunt patogeni şi pe medii solide formează colonii netede şi polizaharidică, sunt patogeni şi pe medii solide formează colonii netede şi Tulpini de tip Tulpini de tip RR I, II, III, (din engl. I, II, III, (din engl. roughrough – rugos) care nu posedă capsulă, sunt – rugos) care nu posedă capsulă, sunt

nepatogeni şi dezvoltă pe medii agarizate, colonii rugoase. nepatogeni şi dezvoltă pe medii agarizate, colonii rugoase. Patogenitatea, determinată de prezenţa capsulei, se transmite ereditar. Patogenitatea, determinată de prezenţa capsulei, se transmite ereditar.

Pierderea capsulei, însoţită de pierderea patogenităţii e determinată Pierderea capsulei, însoţită de pierderea patogenităţii e determinată întotdeauna de transformarea naturală a pneumococilor din tipul S, în întotdeauna de transformarea naturală a pneumococilor din tipul S, în acelaşi tip R (de exemplu: un pneumococ de tip S I nu se va acelaşi tip R (de exemplu: un pneumococ de tip S I nu se va transforma niciodată în pneumococ de tip R II, ci doar în tipul R I). transforma niciodată în pneumococ de tip R II, ci doar în tipul R I).

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 21: Inginerie Genetica-2 Completat

Medicul (Griffith) a realizat experimentele Medicul (Griffith) a realizat experimentele in vivoin vivo, pe loturi de , pe loturi de şoareci şi a observat cu surprindere că un amestec de: şoareci şi a observat cu surprindere că un amestec de: pneumococi vii, nepatogeni, de tip R şi de pneumococi vii, nepatogeni, de tip R şi de pneumococi patogeni, de tip S, dar omorâţi în prealabil prin pneumococi patogeni, de tip S, dar omorâţi în prealabil prin

căldură, a avut efect letal asupra lotului de şoareci.căldură, a avut efect letal asupra lotului de şoareci. De la animalele moarte de pneumonie, s-au izolat pneumococi De la animalele moarte de pneumonie, s-au izolat pneumococi

patogeni, de tip S, vii. patogeni, de tip S, vii. La acea dată, nu s-a putut explica fenomenul şi nici natura La acea dată, nu s-a putut explica fenomenul şi nici natura

chimică a substanţei care a produs transformarea. chimică a substanţei care a produs transformarea.

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 22: Inginerie Genetica-2 Completat

În În 19441944, experienţele lui Griffith au fost reluate , experienţele lui Griffith au fost reluate in vitroin vitro, de către , de către un grup de trei cercetători de la Institutul Rockefeller: un grup de trei cercetători de la Institutul Rockefeller: O. T. O. T. Avery, Mac Leod şi McCartyAvery, Mac Leod şi McCarty..

Ei au izolat mai întâi ADN de la tipul de pneumococi capsulaţi, Ei au izolat mai întâi ADN de la tipul de pneumococi capsulaţi, patogeni S III şi l-au introdus în mediul de cultură al patogeni S III şi l-au introdus în mediul de cultură al pneumococilor nepatogeni de tip R II. pneumococilor nepatogeni de tip R II.

După incubare, s-a observat că printre coloniile rugoase ale După incubare, s-a observat că printre coloniile rugoase ale pneumococilor R II, apar şi colonii netede, dar nu de tip S II, ci de pneumococilor R II, apar şi colonii netede, dar nu de tip S II, ci de tip S III (deci tipul capsulei dobândite a fost specific tulpinii de la tip S III (deci tipul capsulei dobândite a fost specific tulpinii de la care provenea ADN-ul exogen, transformant). care provenea ADN-ul exogen, transformant).

Această modificare este inhibată de DN-ază. Caracterul dobândit Această modificare este inhibată de DN-ază. Caracterul dobândit se transmite ereditar, fidel la descendenţi astfel că, prin diviziunea se transmite ereditar, fidel la descendenţi astfel că, prin diviziunea bacteriei rezultată prin transformare, apare o colonie netedă. bacteriei rezultată prin transformare, apare o colonie netedă.

Astfel, pentru prima dată, s-a stabilit că nu proteinele, ci ADN-ul Astfel, pentru prima dată, s-a stabilit că nu proteinele, ci ADN-ul este molecula care asigură transmiterea ereditară a caracterelor.este molecula care asigură transmiterea ereditară a caracterelor.

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 23: Inginerie Genetica-2 Completat

Acest mare adevăr, a fost o vreme negat, până în Acest mare adevăr, a fost o vreme negat, până în 19521952, când , când Hershey Hershey şi Chaseşi Chase, prin experienţe de marcare radioactivă, au demonstrat că , prin experienţe de marcare radioactivă, au demonstrat că ADN-ul este unicul purtător al informaţiei ereditare. ADN-ul este unicul purtător al informaţiei ereditare.

Ei au marcat cu Ei au marcat cu 3232S proteinele din capsida unor bacteriofagi şi cu S proteinele din capsida unor bacteriofagi şi cu 3535P, P, ADN-ul fagic. ADN-ul fagic.

Fagii respectivi au fost folosiţi pentru a infecta o tulpină de Fagii respectivi au fost folosiţi pentru a infecta o tulpină de Escherichia coliEscherichia coli şi s-a observat că proteinele capsidei ramân şi s-a observat că proteinele capsidei ramân extracelular şi numai ADN-ul fagic pătrunde în celula bacteriană, extracelular şi numai ADN-ul fagic pătrunde în celula bacteriană, determinând-o să multiplice virusul şi să producă particule fagice determinând-o să multiplice virusul şi să producă particule fagice complete, inclusiv cu capsulă. complete, inclusiv cu capsulă.

Pentru această demonstraţie, cei doi cercetători au primit Premiul Pentru această demonstraţie, cei doi cercetători au primit Premiul Nobel în 1969. Nobel în 1969. Aceste prime experienţe de transformare genetică au Aceste prime experienţe de transformare genetică au inaugurat revoluţia moleculară în genetică şi au deschis era ingineriei inaugurat revoluţia moleculară în genetică şi au deschis era ingineriei genetice.genetice.

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 24: Inginerie Genetica-2 Completat

Spre deosebire de celelalte mecanisme de recombinare genetică, Spre deosebire de celelalte mecanisme de recombinare genetică, transformarea nu necesită participarea directă a unei celule-donor vie, transformarea nu necesită participarea directă a unei celule-donor vie, ci doar a unui fragment din ADN-ul acesteia. ci doar a unui fragment din ADN-ul acesteia.

O condiţie a finalizării recombinării genetice prin transformare, este O condiţie a finalizării recombinării genetice prin transformare, este ca bacteria-receptor să fie într-o stare fiziologică activă, tranzitorie, ca bacteria-receptor să fie într-o stare fiziologică activă, tranzitorie, care să-i permită internalizarea ADN-ului exogen, liber, numită care să-i permită internalizarea ADN-ului exogen, liber, numită stare stare de competenţăde competenţă. .

Deoarece genomul procariot posedă aparatul genetic ce controlează Deoarece genomul procariot posedă aparatul genetic ce controlează strict starea de competenţă şi permite internalizarea ADN-ului strict starea de competenţă şi permite internalizarea ADN-ului exogenot, bacteriile sunt singurele organisme capabile să realizeze exogenot, bacteriile sunt singurele organisme capabile să realizeze transformarea genetică naturală. transformarea genetică naturală.

Competenţa constă în modificări ale structurii peretelui celular, mai Competenţa constă în modificări ale structurii peretelui celular, mai ales la nivelul mezozomilor, ceea ce determină expunerea ales la nivelul mezozomilor, ceea ce determină expunerea (demascarea) receptorilor pentru ADN şi facilitarea internalizării (demascarea) receptorilor pentru ADN şi facilitarea internalizării acestuia. acestuia.

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 25: Inginerie Genetica-2 Completat

Competenţa genetică este întâlnită la mulţi taxoni bacterieni şi are o Competenţa genetică este întâlnită la mulţi taxoni bacterieni şi are o origine evolutivă foarte veche. Poate fi anulată prin mutaţie. origine evolutivă foarte veche. Poate fi anulată prin mutaţie.

Poate fi: Poate fi: constitutivă (la genul constitutivă (la genul NeisseriaNeisseria) sau ) sau inductibilă.inductibilă.

Atinge maximum în diferite etape ale ciclului celular (în faza Atinge maximum în diferite etape ale ciclului celular (în faza logaritmică de creştere la genurile logaritmică de creştere la genurile Azotobacter, Streptococcus, Azotobacter, Streptococcus, StaphylococcusStaphylococcus sau la trecerea din aceasta fază, la faza staţionară, la sau la trecerea din aceasta fază, la faza staţionară, la genurile genurile Bacillus şi PseudomonasBacillus şi Pseudomonas). ).

În experimentele de laborator (În experimentele de laborator (in vitroin vitro), starea de competenţă este ), starea de competenţă este indusă artificial prin tratarea celulelor receptor cu CaClindusă artificial prin tratarea celulelor receptor cu CaCl22 (sau cu alţi (sau cu alţi cationi bivalenţi), agenţi chelatori sau enzime ce atacă peretele celular cationi bivalenţi), agenţi chelatori sau enzime ce atacă peretele celular (muraminidază). (muraminidază).

Proporţia de celule aflate în starea de competenţă dintr-o populaţie Proporţia de celule aflate în starea de competenţă dintr-o populaţie bacteriană se estimează prin frecvenţa celulelor transformate (< 5% la bacteriană se estimează prin frecvenţa celulelor transformate (< 5% la PseudomonasPseudomonas sp. şi sp. şi StreptomycesStreptomyces sp., între 10-25% la sp., între 10-25% la BacillusBacillus sp. şi sp. şi 100% la 100% la AzotobacterAzotobacter sp.). sp.).

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 26: Inginerie Genetica-2 Completat

Există mai multe tehnici de transformare genetică Există mai multe tehnici de transformare genetică in vitroin vitro: : fuziunea protoplaştilor – receptor cu ADN exogen fuziunea protoplaştilor – receptor cu ADN exogen

împachetat în lipozomi, împachetat în lipozomi, electrotransformarea (sau electroporarea care foloseşte electrotransformarea (sau electroporarea care foloseşte

curentul electric pentru a permeabiliza învelişurile curentul electric pentru a permeabiliza învelişurile receptorului pentru moleculele de ADN exogenot) sau receptorului pentru moleculele de ADN exogenot) sau

bombardarea receptorilor cu microparticule de aur sau bombardarea receptorilor cu microparticule de aur sau tungsten, pe care este adsorbit ADN exogen (metoda tungsten, pe care este adsorbit ADN exogen (metoda biolistica).biolistica).

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 27: Inginerie Genetica-2 Completat

Etapele transformării genetice la bacteriiEtapele transformării genetice la bacterii Adsorbţia ADN liber exogenAdsorbţia ADN liber exogen la celula-receptoare a fost descrisă de la celula-receptoare a fost descrisă de

către M. Lorenz şi colaboratorii, în 1994. De regulă, se leagă la către M. Lorenz şi colaboratorii, în 1994. De regulă, se leagă la receptori ADN d.c., mai rar ADN m.c. (la pH 5.0 la receptori ADN d.c., mai rar ADN m.c. (la pH 5.0 la Bacillus subtilisBacillus subtilis şi la şi la Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae sau la pH 7.0 la sau la pH 7.0 la Neisseria gonorrhoeaeNeisseria gonorrhoeae). ). Legarea poate fi Legarea poate fi situs nespecificăsitus nespecifică, permiţând încorporarea de ADN de , permiţând încorporarea de ADN de la specii îndepărtate filogenetic (ex. la la specii îndepărtate filogenetic (ex. la BacillusBacillus sp. există 50 situsuri sp. există 50 situsuri de legare a ADN per celulă competentă, iar la de legare a ADN per celulă competentă, iar la StreptococcusStreptococcus sp. există sp. există 70 astfel de situsuri). Unele specii bacteriene adsorb, într-o manieră 70 astfel de situsuri). Unele specii bacteriene adsorb, într-o manieră situs specificăsitus specifică, doar ADN exogen de la specii înrudite filogenetic. În , doar ADN exogen de la specii înrudite filogenetic. În acest caz, numărul situsurilor este mult mai mic (8 la acest caz, numărul situsurilor este mult mai mic (8 la Haemophilus Haemophilus influenzaeinfluenzae sau 10 la sau 10 la Neisseria gonorrhoeaeNeisseria gonorrhoeae) şi la acestea se leagă ) şi la acestea se leagă secvenţe scurte de 10-11 pb, cu o succesiune strictă de nucleotide. secvenţe scurte de 10-11 pb, cu o succesiune strictă de nucleotide. Iniţial, adsorbţia este reversibilă şi ADN exogen este sensibil la atacul Iniţial, adsorbţia este reversibilă şi ADN exogen este sensibil la atacul DN-azelor, apoi legarea este ireversibilă şi enzima nu mai poate DN-azelor, apoi legarea este ireversibilă şi enzima nu mai poate degrada ADN-ul transformant.degrada ADN-ul transformant.

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 28: Inginerie Genetica-2 Completat

Internalizarea ADN-ului transformantInternalizarea ADN-ului transformant se realizează prin mecanisme se realizează prin mecanisme diferite la bacteriile Gram pozitive de cele Gram negative. diferite la bacteriile Gram pozitive de cele Gram negative.

La bacteriile La bacteriile Gram-pozitiveGram-pozitive există un aparat de internalizare reprezentat există un aparat de internalizare reprezentat de setul de proteine de setul de proteine ComCom. .

Proteina Proteina Com CCom C are rol de proteină reglatoare şi intervine în procesarea are rol de proteină reglatoare şi intervine în procesarea celorlalte proteine din aparatul de translocare. celorlalte proteine din aparatul de translocare.

Proteinele din familia Proteinele din familia Com ECom E sunt situate în peretele celular şi au rol sunt situate în peretele celular şi au rol direct în legarea ADN-ului exogenot. direct în legarea ADN-ului exogenot. Com E1Com E1 proemină prin capătul proemină prin capătul NHNH33

++ la exteriorul celulei, această conformaţie alosterică asigurând la exteriorul celulei, această conformaţie alosterică asigurând ataşarea ADN la situs, iar ataşarea ADN la situs, iar Com E2-Com E3Com E2-Com E3 traversează peretele traversează peretele celular, fără să proemine la exterior şi facilitează translocarea ADN celular, fără să proemine la exterior şi facilitează translocarea ADN exogen prin peretele celulei-receptoare.exogen prin peretele celulei-receptoare.

Familia de proteine Familia de proteine Com GCom G sunt situate în membrana plasmatică şi sunt situate în membrana plasmatică şi sunt codificate de un operon cu 7 ORF-uri. sunt codificate de un operon cu 7 ORF-uri. Com G1 Com G1 este o ATP-ază ce este o ATP-ază ce furnizează energia necesară procesului. Celelalte 6 proteine furnizează energia necesară procesului. Celelalte 6 proteine Com GCom G formează un canal proteic transmembranar. formează un canal proteic transmembranar.

Proteinele Proteinele Com FCom F sunt codificate de un operon cu 3 ORF-uri, iar sunt codificate de un operon cu 3 ORF-uri, iar Com Com F1F1 este o translocază ADN-dependentă (B. Dreisekelmann, 1994). este o translocază ADN-dependentă (B. Dreisekelmann, 1994).

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 29: Inginerie Genetica-2 Completat

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

La limita dintre peretele celular şi plasmalemă, o La limita dintre peretele celular şi plasmalemă, o endonuclează degradează una din catenele ADN-ului endonuclează degradează una din catenele ADN-ului transformant, astfel încât, în celula receptoare pătrunde ADN transformant, astfel încât, în celula receptoare pătrunde ADN m.c. cu capătul 3’OH înainte.m.c. cu capătul 3’OH înainte.

Un alt model de înglobare în celula receptare Gram-pozitivă a Un alt model de înglobare în celula receptare Gram-pozitivă a ADN-ului transformant este printr-un canal neproteic format ADN-ului transformant este printr-un canal neproteic format din polihidroxibutirat (PHB), polifosfaţi şi Ca2+ cu diametru din polihidroxibutirat (PHB), polifosfaţi şi Ca2+ cu diametru de 2,4 nm (Vassu T. şi al., 2001).de 2,4 nm (Vassu T. şi al., 2001).

Page 30: Inginerie Genetica-2 Completat

Perete celular

Membrană plasmaticăComC

ComE1

ComE2-E3

ComG1

Com F1

Com G

3’OH

Endonuclează

AND transformant dc

Page 31: Inginerie Genetica-2 Completat

La bacteriile La bacteriile Gram-negativeGram-negative ((Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae), ), mecanismul de internalizare a fost descris de către M. Lorenz mecanismul de internalizare a fost descris de către M. Lorenz şi colaboratorii, tot în 1994. La locurile de adeziune între şi colaboratorii, tot în 1994. La locurile de adeziune între membrana externă şi cea internă există nişte formaţiuni membrana externă şi cea internă există nişte formaţiuni (extensii membranare) numite (extensii membranare) numite transformasomitransformasomi (10-12/celulă (10-12/celulă competentă)competentă).. În interiorul lor, ADN d.c. exogen e protejat de În interiorul lor, ADN d.c. exogen e protejat de atacul DN-azelor. Aceştia sunt alcătuiţi din componenete ale atacul DN-azelor. Aceştia sunt alcătuiţi din componenete ale membranei externemembranei externe şi au o înălţime de 35 nm şi un diametru de şi au o înălţime de 35 nm şi un diametru de 20 nm. La polul superior, sunt situaţi doi receptori de natură 20 nm. La polul superior, sunt situaţi doi receptori de natură proteică, la care se fixează ADN-ul transformant. La polul proteică, la care se fixează ADN-ul transformant. La polul inferior, posedă un por cu diametru de aproximativ 5 nm, la inferior, posedă un por cu diametru de aproximativ 5 nm, la nivelul căruia există o endonuclează, care degradează una din nivelul căruia există o endonuclează, care degradează una din catene, astfel că în celulă pătrunde doar o monocatenă de catene, astfel că în celulă pătrunde doar o monocatenă de ADN (cu capătul 3’OH înainte) (Vassu T. şi al., 2001).ADN (cu capătul 3’OH înainte) (Vassu T. şi al., 2001).

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 32: Inginerie Genetica-2 Completat

Membrană externă

Membrană internă

Por

Transformazom

3’OH

Endonuclează

Receptori pentru ADN transformant

dc

Page 33: Inginerie Genetica-2 Completat

Eclipsa Eclipsa este perioada în care ADN exogen, internalizat, nu se este perioada în care ADN exogen, internalizat, nu se exprimă încă în celula receptoare şi participă la procese de exprimă încă în celula receptoare şi participă la procese de recombinare genetică. Are loc sinapsa, împerecherea recombinare genetică. Are loc sinapsa, împerecherea monocatenei de ADN exogen cu regiunea omoloagă, dar monocatenei de ADN exogen cu regiunea omoloagă, dar neidentică din ADN celulei-receptor, devenită şi ea neidentică din ADN celulei-receptor, devenită şi ea monocatenară. Sinapsa presupune recunoaşterea regiunilor şi monocatenară. Sinapsa presupune recunoaşterea regiunilor şi împerecherea pe bază de complementaritate, cu formarea unui împerecherea pe bază de complementaritate, cu formarea unui heteroduplex ADN-donor-ADN-receptor.heteroduplex ADN-donor-ADN-receptor.

Exprimarea ADN-ului transformantExprimarea ADN-ului transformant în celula gazdă. Prin în celula gazdă. Prin transcriere şi translaţie, informaţia genetică nouă, adusă de transcriere şi translaţie, informaţia genetică nouă, adusă de ADN exogenot, determină sinteza unor proteine structurale ADN exogenot, determină sinteza unor proteine structurale sau enzime, care conferă caractere fenotipice noi, ce pot fi sau enzime, care conferă caractere fenotipice noi, ce pot fi evidenţiate şi în baza cărora sunt selectaţi recombinanţii.evidenţiate şi în baza cărora sunt selectaţi recombinanţii.

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 34: Inginerie Genetica-2 Completat

II. II. ConjugareaConjugarea reprezintă procesul dereprezintă procesul de transfer unidirecţional de material transfer unidirecţional de material genetic de la o bacterie-donor la o bacterie-receptor, prin intermediul genetic de la o bacterie-donor la o bacterie-receptor, prin intermediul unei legături intercelulare directe numită unei legături intercelulare directe numită pil de conjugarepil de conjugare. Pilul de . Pilul de conjugare este o formaţiune ce aparţine celulei donor şi prezenţa sa conjugare este o formaţiune ce aparţine celulei donor şi prezenţa sa este determinată de existenţa unui element genetic specializat, este determinată de existenţa unui element genetic specializat, localizat de regulă plasmidial, numit localizat de regulă plasmidial, numit conjugonconjugon..

Procesul de conjugare bacteriană a fost descris pentru prima dată de Procesul de conjugare bacteriană a fost descris pentru prima dată de către Lederberg şi Tatum în 1946, ca un fenomen de para-(proto-) către Lederberg şi Tatum în 1946, ca un fenomen de para-(proto-) sexualitate la procariote, legat de prezenţa/absenţa factorului de sexualitate la procariote, legat de prezenţa/absenţa factorului de fertilitate, notat F. Cercetările ulterioare au arătat că F este de fapt un fertilitate, notat F. Cercetările ulterioare au arătat că F este de fapt un plasmid din categoria plasmidelor conjugative şi conjugarea nu mai plasmid din categoria plasmidelor conjugative şi conjugarea nu mai este asimilată fenomenului de sexualitate, ci fenomenului de flux este asimilată fenomenului de sexualitate, ci fenomenului de flux genetic pe orizontală ce caracterizează regnul genetic pe orizontală ce caracterizează regnul MoneraMonera. .

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 35: Inginerie Genetica-2 Completat

CONJUGONULCONJUGONUL - sistemul genetic implicat în conjugarea genetică, este - sistemul genetic implicat în conjugarea genetică, este format la plasmidul F, din: regiunea format la plasmidul F, din: regiunea leaderleader, regiunea , regiunea ori Tori T şi operonul şi operonul tratra..

Regiunea Regiunea leaderleader este prima secvenţă de ADN care pătrunde prin este prima secvenţă de ADN care pătrunde prin conjugare, în celula receptoare şi este constituită din 13 pb (înalt conjugare, în celula receptoare şi este constituită din 13 pb (înalt conservate în evoluţie), situate între regiunea conservate în evoluţie), situate între regiunea ori Tori T (unde este (unde este nickatănickată monocatena) şi secvenţa monocatena) şi secvenţa rep-increp-inc. Genele mai importante pe care le . Genele mai importante pe care le conţine această regiune sunt: conţine această regiune sunt: gena gena ssbssb, ce prezintă omologie cu cea situată în cromozomul bacterian şi , ce prezintă omologie cu cea situată în cromozomul bacterian şi

codifică proteina codifică proteina Ssb Ssb cu rol în stabilizarea monocatenelor de ADN în timpul cu rol în stabilizarea monocatenelor de ADN în timpul transferului conjugativ;transferului conjugativ;

genele genele psi A psi A - - psi Bpsi B codifică proteine codifică proteine Psi APsi A şi şi Psi BPsi B, ce inhibă activitatea , ce inhibă activitatea proteazică a enzimei proteazică a enzimei Rec ARec A;;

genele genele flm A, B flm A, B şi şi CC, codifică enzime ce formeaza sistemul de stabilitate şi , codifică enzime ce formeaza sistemul de stabilitate şi partiţie plasmidială, prin eliminarea descendenţilor partiţie plasmidială, prin eliminarea descendenţilor plasmid-freeplasmid-free (care nu au (care nu au primit o copie a plasmidului);primit o copie a plasmidului);

un situs de recunoaştere, de la care este iniţiată sinteza catenei complementare un situs de recunoaştere, de la care este iniţiată sinteza catenei complementare (după pătrunderea monocatenei plasmidiale în celula receptoare) şi asamblarea (după pătrunderea monocatenei plasmidiale în celula receptoare) şi asamblarea primosomuluiprimosomului. Plasmidul F nu posedă o primază proprie (foloseşte primaza . Plasmidul F nu posedă o primază proprie (foloseşte primaza codificată de cromozomul bacterian).codificată de cromozomul bacterian).

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 36: Inginerie Genetica-2 Completat

Regiunea Regiunea ori Tori T reprezintă originea transferului conjugativ şi este reprezintă originea transferului conjugativ şi este de asemenea foarte bine conservată în evoluţie (diferă foarte de asemenea foarte bine conservată în evoluţie (diferă foarte puţin, chiar la taxoni bacterieni îndepărtaţi filogenetic). puţin, chiar la taxoni bacterieni îndepărtaţi filogenetic). Diferă de originea replicării plasmidiale, care se notează Diferă de originea replicării plasmidiale, care se notează ori Vori V. . Este flancată de situsul pentru endonucleaza de restricţie BEste flancată de situsul pentru endonucleaza de restricţie Bgl gl II II

(care o separă de regiunea (care o separă de regiunea leaderleader) şi de gena ) şi de gena tra Mtra M (prima din (prima din operonul operonul tratra). ).

Prezintă două segmente importante din punct de vedere Prezintă două segmente importante din punct de vedere funcţional: funcţional:

zona pentru nickare şi zona pentru nickare şi zona pentru transfer. zona pentru transfer.

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 37: Inginerie Genetica-2 Completat

Zona pentru nickareZona pentru nickare cuprinde, de la situsul pentru B cuprinde, de la situsul pentru Bglgl II către gena II către gena tra tra MM, următoarele situsuri:, următoarele situsuri: situsul unde are loc ruperea (situsul unde are loc ruperea (nicknick) legăturii fosfodiesterice dintr-o ) legăturii fosfodiesterice dintr-o

monocatenă a plasmidului, care urmează a fi transferată prin monocatenă a plasmidului, care urmează a fi transferată prin conjugare în celula recepoare;conjugare în celula recepoare;

zonă bogată în A/T, la nivelul căreia are loc curbarea intrinsecă a zonă bogată în A/T, la nivelul căreia are loc curbarea intrinsecă a moleculei de ADN plasmidial;moleculei de ADN plasmidial;

situsul situsul AA pentru care prezintă specificitate proteina pentru care prezintă specificitate proteina histone-likehistone-like IHF IHF ((IIntegration ntegration HHost ost FFactoractor), ataşare care determină curbarea moleculei ), ataşare care determină curbarea moleculei de ADN, în zonele bogate în A/T, cu 140°;de ADN, în zonele bogate în A/T, cu 140°;

jumătate din situsul jumătate din situsul sby Asby A, la care se ataşează specific proteina , la care se ataşează specific proteina Tra YTra Y, , determinând o curbare suplimentară a ADN plasmidial, cu încă determinând o curbare suplimentară a ADN plasmidial, cu încă 440°.0°.

Zona pentru transferZona pentru transfer cuprinde (respectând acelaşi sens): cuprinde (respectând acelaşi sens): cealaltă jumătate din situsul cealaltă jumătate din situsul sbyAsbyA;; zona bogată în perechi A/T, unde are loc de asemenea curbarea zona bogată în perechi A/T, unde are loc de asemenea curbarea

moleculei de ADN;moleculei de ADN; situsurile situsurile sbm C, B, Asbm C, B, A, la care se ataşează proteina , la care se ataşează proteina Tra MTra M (semnal (semnal

chimic al împerechierii donor-receptor).chimic al împerechierii donor-receptor).

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 38: Inginerie Genetica-2 Completat

Bgl II

nick

AAA...TTT TTT...AA

A

Situs A

IHF

sby A

Dimer Tra Y

Regiunea pentru nickare

AAA...TTTTTT...AA

A

sbm C B A

Tra M

Regiunea pentru transfer

zone de curbură intrinsică

Regiunea ori T din plasmidul F

tra M

Page 39: Inginerie Genetica-2 Completat

Operonul traOperonul tra este un ansamblu de gene (este un ansamblu de gene (ORFORF – – OOpenpen RReadingeading FFramesrames) ce funcţionează într-o ) ce funcţionează într-o succesiune strict controlată, printr-un reglaj succesiune strict controlată, printr-un reglaj genetic complex. Ordinea în care intervin în genetic complex. Ordinea în care intervin în procesul de conjugare, caracterizarea rolului şi procesul de conjugare, caracterizarea rolului şi reglajul lor specific, sunt prezentate în reglajul lor specific, sunt prezentate în descrierea etapelor conjugării.descrierea etapelor conjugării.

ETAPELE CONJUGĂRIIETAPELE CONJUGĂRII::

1.1. Formarea agregatelor de conjugare Formarea agregatelor de conjugare donor-receptordonor-receptor prin intermediul prin intermediul pilului de pilului de conjugare Fconjugare F, un element extracelular , un element extracelular prezent pe celulele cu rol de donor. prezent pe celulele cu rol de donor. Acesta Acesta recunoaşte şi se ataşează specific la recunoaşte şi se ataşează specific la suprafaţa celulelor receptor. suprafaţa celulelor receptor.

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 40: Inginerie Genetica-2 Completat

De asemenea, pilul de conjugare recunoaşte proteinele de De asemenea, pilul de conjugare recunoaşte proteinele de excludere de suprafaţă (din membrana altor celule donor, excludere de suprafaţă (din membrana altor celule donor, pentru a evita agregarea greşită donor-donor). pentru a evita agregarea greşită donor-donor).

Este format din monomeri de pilină, aranjaţi helical, formând Este format din monomeri de pilină, aranjaţi helical, formând astfel filamentul de pilină, cu o lungime de 1-20 μm. astfel filamentul de pilină, cu o lungime de 1-20 μm.

Pilul de conjugare poate să se scurteze prin depolimerizare de Pilul de conjugare poate să se scurteze prin depolimerizare de la ambele capete (atât dinspre donor, cât şi dinspre receptor) şi la ambele capete (atât dinspre donor, cât şi dinspre receptor) şi prezintă situsuri pentru fagi pilus-specifici. prezintă situsuri pentru fagi pilus-specifici.

Sinteza monomerilor de pilină este controlată de 3 gene: Sinteza monomerilor de pilină este controlată de 3 gene: tra Atra A care codifică subunităţile de pilină, gena care codifică subunităţile de pilină, gena tra Qtra Q codifică o codifică o proteină însoţitoare care protejează pilina, asigură translocarea proteină însoţitoare care protejează pilina, asigură translocarea acesteia prin membrana celulei donor şi expunerea ei la acesteia prin membrana celulei donor şi expunerea ei la suprafaţă, gena suprafaţă, gena tra Xtra X care codifică o proteină ce acetilează care codifică o proteină ce acetilează pilina. Asamblarea pilului este controlată de 11 gene pilina. Asamblarea pilului este controlată de 11 gene tratra L, E, L, E, K, B, V, C, W, U, F, H, GK, B, V, C, W, U, F, H, G (aceasta având funcţie dublă: (aceasta având funcţie dublă: asamblare şi stabilizare)asamblare şi stabilizare)

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 41: Inginerie Genetica-2 Completat

2.2. Stabilizarea agregatelor de conjugareStabilizarea agregatelor de conjugare constă în interacţiunea constă în interacţiunea pilului F cu proteina pilului F cu proteina OmpA OmpA de pe suprafaţa celulei receptoare. Etapa de pe suprafaţa celulei receptoare. Etapa este controlată de proteinele este controlată de proteinele Tra GTra G şi şi Tra NTra N codificate de genele codificate de genele tra tra GG şi şi tra Ntra N. Prin depolimerizare dinspre celula receptor, pilul se . Prin depolimerizare dinspre celula receptor, pilul se scurtează şi cele două celule se apropie foarte mult, până se scurtează şi cele două celule se apropie foarte mult, până se realizează comunicarea celulară directă. Gena realizează comunicarea celulară directă. Gena tra Dtra D codifică proteina codifică proteina Tra DTra D, care formează un canal pri, care formează un canal prinn membrana celulei donor. membrana celulei donor. Excluderea de suprafaţă între două celule de tip donor este controlată Excluderea de suprafaţă între două celule de tip donor este controlată de genele de genele tra Ttra T şi şi tra Stra S, care au promotor propriu ( , care au promotor propriu ( PT PT şi şi PSPS) şi se ) şi se exprimă chiar fără activarea întregului operonexprimă chiar fără activarea întregului operon tra tra de la promotorul de la promotorul PYPY. Proteina . Proteina Tra TTra T se află în membrana externă a celulei donor şi se află în membrana externă a celulei donor şi intervine în fazele iniţiale ale agregării celulare, iar intervine în fazele iniţiale ale agregării celulare, iar Tra STra S se află în se află în membrana internă a celulei donor şi blochează transferul membrana internă a celulei donor şi blochează transferul monocatenei de ADN plasmidial, către receptor, după o agregare monocatenei de ADN plasmidial, către receptor, după o agregare incorectă.incorectă.

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 42: Inginerie Genetica-2 Completat
Page 43: Inginerie Genetica-2 Completat

3.3. Transferul conjugativTransferul conjugativ al ADNm.c. plasmidial este iniţiat de al ADNm.c. plasmidial este iniţiat de proteina semnal proteina semnal Tra MTra M. Aceasta declanşează o cascadă de . Aceasta declanşează o cascadă de evenimente moleculare de reglaj într-o ordine strict controlată. Gena evenimente moleculare de reglaj într-o ordine strict controlată. Gena tra Mtra M prezintă promotor propriu prezintă promotor propriu PMPM şi astfel poate fi transcrisă şi astfel poate fi transcrisă separat şi independent de alte gene din operonul separat şi independent de alte gene din operonul tratra (ca şi genele (ca şi genele tra tra SS şi şi tra Ttra T). Evenimentele se determină unele pe altele, iar ordinea lor ). Evenimentele se determină unele pe altele, iar ordinea lor este următoarea: este următoarea: ataşarea specifică a proteinelor ataşarea specifică a proteinelor Tra MTra M la situsurile la situsurile sbm C, B, A,sbm C, B, A,

din zona pentru transfer a regiunii din zona pentru transfer a regiunii ori Tori T ; ; ataşarea proteinei ataşarea proteinei Tra YTra Y sub formă de dimer, la cele două sub formă de dimer, la cele două

jumătăţi ale situsului jumătăţi ale situsului sby Asby A din din ori Tori T; ; ataşarea proteinei ataşarea proteinei IHFIHF la situsul la situsul AA din zona pentru nikcare a din zona pentru nikcare a

regiunii regiunii ori Tori T;; curbarea extremă a moleculelor de ADN în cele două zone bogate curbarea extremă a moleculelor de ADN în cele două zone bogate

în A/T din în A/T din ori Tori T şi modificarea densităţii helicale în această zonă; şi modificarea densităţii helicale în această zonă;

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 44: Inginerie Genetica-2 Completat

gena gena tra Itra I codifică proteina codifică proteina Tra I Tra I care îşi exercită activitatea care îşi exercită activitatea de helicază-nickază:de helicază-nickază:

desfacerea progresivă a dublului helix; desfacerea progresivă a dublului helix; topirea punţilor de hidrogen; topirea punţilor de hidrogen; ruperea unei legături fosfodiesterice pe o catenă a ADN ruperea unei legături fosfodiesterice pe o catenă a ADN

(în zona pentru nickare a regiunii (în zona pentru nickare a regiunii ori Tori T); ); ataşarea proteinei ataşarea proteinei Tra ITra I la capătul 5’ al catenei nickate la capătul 5’ al catenei nickate

şi direcţionarea ei în celula receptor;şi direcţionarea ei în celula receptor; proteina proteina SsbSsb se ataşează de monocatenă şi o stabilizează se ataşează de monocatenă şi o stabilizează

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 45: Inginerie Genetica-2 Completat

DONOR

Membrană externă

Tra N

TraT

OmpA

Tra D

5’PO4

TraIAND dc

OmpA Tra N

TraT

Membrană internă

Membrană externă

Membrană internăRECEPTORSsb

Page 46: Inginerie Genetica-2 Completat

Regiunea reglatorie a operonului traRegiunea reglatorie a operonului tra constă în 3 gene, care sunt constă în 3 gene, care sunt transcrise de la promotori proprii: transcrise de la promotori proprii: gena gena tra Jtra J posedă promotor propriu posedă promotor propriu PJPJ şi codifică proteina şi codifică proteina Tra JTra J, ,

care este o proteină reglatoare ce asigură transcrierea genei care este o proteină reglatoare ce asigură transcrierea genei tra Ytra Y de la promotorul de la promotorul PYPY;;

gena gena tra Ytra Y cu promotorul cu promotorul PYPY care reprezintă care reprezintă promotorul majorpromotorul major, , central, al multor gene central, al multor gene tratra, de la care este iniţiată transcrierea , de la care este iniţiată transcrierea policistronică a acestora;policistronică a acestora;

gena gena fin Pfin P posedă promotorul posedă promotorul Pfin P, Pfin P, de la care este transcris un de la care este transcris un ARN, notat ARN, notat Fin PFin P, format din 75 ribonucleotide, cu rol de ARN , format din 75 ribonucleotide, cu rol de ARN antisens, deoarece se suprapune parţial pe gena antisens, deoarece se suprapune parţial pe gena tra Jtra J inhibându-i inhibându-i astfel transcrierea (şi, implicit, este blocată transcrierea întregului astfel transcrierea (şi, implicit, este blocată transcrierea întregului operon operon tratra). ). Fin PFin P este instabil şi se cuplează cu proteina este instabil şi se cuplează cu proteina Fin OFin O (codificată de gena (codificată de gena fin Ofin O), pentru a căpăta stabilitate. Astfel ), pentru a căpăta stabilitate. Astfel sistemul sistemul fin P – fin Ofin P – fin O este este sistemul de represiesistemul de represie ce inhibă întreg ce inhibă întreg operonul operonul tratra..

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 47: Inginerie Genetica-2 Completat

III.III. Transductia Transductia reprezintă transferul de material genetic de la o reprezintă transferul de material genetic de la o bacterie donor la una receptor, prin intermediul unui bacterie donor la una receptor, prin intermediul unui vector viralvector viral ((fag temperatfag temperat). ).

Termenul a fost folosit prima dată de Zinder şi Lederberg în 1952, pe Termenul a fost folosit prima dată de Zinder şi Lederberg în 1952, pe studii la studii la Salmonella typhimuriumSalmonella typhimurium. Cercetătorii au folosit două . Cercetătorii au folosit două tulpini auxotrofe: una incapabilă de a sintetiza fenilalanina, tulpini auxotrofe: una incapabilă de a sintetiza fenilalanina, triptofanul şi tirozina (Phe- Trp- Tyr-) şi alta incapabilă să triptofanul şi tirozina (Phe- Trp- Tyr-) şi alta incapabilă să sintetizeze metionina şi histidina (Met- His-), cultivate într-un tub sintetizeze metionina şi histidina (Met- His-), cultivate într-un tub Davis în formă de U, pe un mediu minimal, lipsit de aminoacizii Davis în formă de U, pe un mediu minimal, lipsit de aminoacizii menţionaţi, dar cu săruri anorganice şi glucide ca sursă de energie. menţionaţi, dar cu săruri anorganice şi glucide ca sursă de energie. Cercetătorii au constatat că din 109 tulpini auxotrofe iniţial, au Cercetătorii au constatat că din 109 tulpini auxotrofe iniţial, au apărut 105 tulpini prototrofe (Phe+ Trp+ Tyr+ Met+ His+).apărut 105 tulpini prototrofe (Phe+ Trp+ Tyr+ Met+ His+).

Din cauza timpului scurt în care au apărut, nu puteau fi mutante de Din cauza timpului scurt în care au apărut, nu puteau fi mutante de reversie, ci recombinanţi genetici. În acest caz, recombinarea reversie, ci recombinanţi genetici. În acest caz, recombinarea genetică nu se realizează prin contactul direct al celor două tulpini genetică nu se realizează prin contactul direct al celor două tulpini auxotrofe, ci prin intermediul fagului temperat P22 pe care s-a auxotrofe, ci prin intermediul fagului temperat P22 pe care s-a întâmplat să-l poarte, ca profag, unul dintre genitori. Acest fag se întâmplat să-l poarte, ca profag, unul dintre genitori. Acest fag se poate insera oriunde în genomul de poate insera oriunde în genomul de SalmonellaSalmonella typhimuriumtyphimurium şi şi poate transducta orice genă bacteriană (poate transducta orice genă bacteriană (transducţie generalizatătransducţie generalizată).).

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 48: Inginerie Genetica-2 Completat

Bacteriofagii Bacteriofagii sunt virusuri ale celulelor bacteriene şi pot fi virulenţi sunt virusuri ale celulelor bacteriene şi pot fi virulenţi sau temperaţi. Fagii virulenţi omoară bacteriile infectate, după ce sau temperaţi. Fagii virulenţi omoară bacteriile infectate, după ce acestea au realizat morfogeneza fagică completă. Fagii temperaţi acestea au realizat morfogeneza fagică completă. Fagii temperaţi prezintă două opţiuni evolutive în celula bacteriană gazdă:prezintă două opţiuni evolutive în celula bacteriană gazdă: ciclul liticciclul litic, ce constă în morfogeneza fagică, liza bacteriei gazde şi , ce constă în morfogeneza fagică, liza bacteriei gazde şi

eliberarea particulelor fagice mature;eliberarea particulelor fagice mature; ciclul lizogenciclul lizogen în care genomul fagic se integrează ca profag în în care genomul fagic se integrează ca profag în

cromozomul bacteriei gazdă, se replică sincron cu acesta. La un cromozomul bacteriei gazdă, se replică sincron cu acesta. La un moment dat, se poate face trecerea de la ciclul lizogen la ciclul moment dat, se poate face trecerea de la ciclul lizogen la ciclul litic, prin excizia corectă a genomului fagic din nucleoid (caz în litic, prin excizia corectă a genomului fagic din nucleoid (caz în care rezultă particule fagice mature intacte, identice cu cele care au care rezultă particule fagice mature intacte, identice cu cele care au realizat infecţia) sau incorectă (caz în care genomul fagic preia realizat infecţia) sau incorectă (caz în care genomul fagic preia gene bacteriene adiacente situsului de ataşare şi se eliberează astfel gene bacteriene adiacente situsului de ataşare şi se eliberează astfel bacteriofagi recombinaţi, ce determină recombinarea genetică prin bacteriofagi recombinaţi, ce determină recombinarea genetică prin transducţie a bacteriilor pe care le vor infecta ulterior). Când preia transducţie a bacteriilor pe care le vor infecta ulterior). Când preia două sau câteva gene bacteriene se numeşte două sau câteva gene bacteriene se numeşte cotransducţie. cotransducţie.

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 49: Inginerie Genetica-2 Completat

CICLUL LIZOGEN CICLUL LITIC

Inducţie fagică

Integrarea genomului fagic ca profag în cromozomul bacterian

Circularizarea genomului fagic

Ataşarea fagului şi injectarea ADN fagic în celula gazdă

Nucleoid bacterian

Page 50: Inginerie Genetica-2 Completat

Transducţia poate fi: Transducţia poate fi: specializatăspecializată, când genomul fagic se inseră în situsuri specifice , când genomul fagic se inseră în situsuri specifice

din cromozomul bacterian şi, deci, nu poate transducta decât din cromozomul bacterian şi, deci, nu poate transducta decât anumite gene;anumite gene;

generalizatăgeneralizată, când genomul fagic se poate integra în orice situs , când genomul fagic se poate integra în orice situs din nucleoid şi poate astfel transducta orice genă bacteriană.din nucleoid şi poate astfel transducta orice genă bacteriană.

Cel mai cunoscut şi mai utilizat fag temperat este Cel mai cunoscut şi mai utilizat fag temperat este fagul lambda fagul lambda λλ.. Are o greutate moleculară de 3,1·Are o greutate moleculară de 3,1·101066 dal. dal. Este alcătuit din cap cu simetrie icosaedricăEste alcătuit din cap cu simetrie icosaedrică (20 fețe) (20 fețe), cu , cu

diametru de aproximativ 60 nm. diametru de aproximativ 60 nm. Capsida este formată din 72 capsomere Capsida este formată din 72 capsomere Coada flexibilă, necontractilă, Coada flexibilă, necontractilă, din 35 discuri suprapuse, din 35 discuri suprapuse, se se

termină cu o prelungire. termină cu o prelungire. Există 4 fibre subterminale cu care se ancorează de învelişul Există 4 fibre subterminale cu care se ancorează de învelişul

celulei bacteriene pe care o infectează.celulei bacteriene pe care o infectează.

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 51: Inginerie Genetica-2 Completat

Genomul fagului λ Genomul fagului λ un ADNd.c. liniar format din 48.502 pb, complet un ADNd.c. liniar format din 48.502 pb, complet

secvenţializat. secvenţializat. Capetele 5’ ale fiecărei catene sunt mai lungi şi Capetele 5’ ale fiecărei catene sunt mai lungi şi

monocatenare şi sunt alcătuite din 12-20 monocatenare şi sunt alcătuite din 12-20 nucleotide complementare, formând astfel nucleotide complementare, formând astfel capete capete 5’coezive5’coezive (adezive, lipicioase). (adezive, lipicioase).

În momentul infecţiei fagice, sub acţiunea ADN-În momentul infecţiei fagice, sub acţiunea ADN-ligazei bacteriene, nucleotidele complementare ale ligazei bacteriene, nucleotidele complementare ale capetelor 5’ se unesc prin punţi de hidrogen, capetelor 5’ se unesc prin punţi de hidrogen, formând formând situsul cossitusul cos, iar genomul fagic devine , iar genomul fagic devine astfel circular - astfel circular - cercul Hersheycercul Hershey. .

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 52: Inginerie Genetica-2 Completat
Page 53: Inginerie Genetica-2 Completat

Replicarea genomului fagicReplicarea genomului fagic de către celula bacteriană gazdă, de către celula bacteriană gazdă, parcurge două etape. parcurge două etape. În prima fază, modelul deÎn prima fază, modelul de replicare este replicare este ɵ ɵ, bidirecţional, rezultând dimeri , bidirecţional, rezultând dimeri

circulari. circulari. Recombinaza Recombinaza RedRed, codificată de gena , codificată de gena redred, desparte cei doi monomeri circulari. , desparte cei doi monomeri circulari. La 30 min din momentul infecţiei, începe a doua fază a replicării, după modelul La 30 min din momentul infecţiei, începe a doua fază a replicării, după modelul

cercului rotativcercului rotativ, unidirecţional (, unidirecţional (Rolling CircleRolling Circle – RC), începând de la – RC), începând de la ori Vori V, unde , unde endonucleaza A incizează una din catene. endonucleaza A incizează una din catene.

Catena intactă serveşte ca matriţă, iar catena veche, incizată, este dislocată din Catena intactă serveşte ca matriţă, iar catena veche, incizată, este dislocată din dublul helix şi pe măsură ce este dislocată este, la rândul ei, replicată. dublul helix şi pe măsură ce este dislocată este, la rândul ei, replicată.

Astfel, după mai multe runde de replicare, se formează o moleculă dublu Astfel, după mai multe runde de replicare, se formează o moleculă dublu catenară multimerică (catenară multimerică (concatemericoncatemeri). ).

Endonucleaza A scindează concatemerii, la nivelul situsurilor cos, în monomeri Endonucleaza A scindează concatemerii, la nivelul situsurilor cos, în monomeri dublu-catenari, liniari, cu capete 5’coezive. dublu-catenari, liniari, cu capete 5’coezive.

Monomerii sunt încapsidaţi în capside fagice preformate (tot de către celula Monomerii sunt încapsidaţi în capside fagice preformate (tot de către celula gazdă) şi, la 60 min de la infecţie, celula bacteriană gazdă suferă fenomenul de gazdă) şi, la 60 min de la infecţie, celula bacteriană gazdă suferă fenomenul de liză şi se eliberează în mediu peste 100 particule fagice mature.liză şi se eliberează în mediu peste 100 particule fagice mature.

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 54: Inginerie Genetica-2 Completat

Cele aproximativ 50 de gene din genomul Cele aproximativ 50 de gene din genomul fagului λ se clasifică în funcţie de fagului λ se clasifică în funcţie de momentul transcrierii în:momentul transcrierii în:

gene cu transcriere timpurie: gene cu transcriere timpurie: NN,, crocro şi şi cIcI, , prin care se stabileşte decizia binară a prin care se stabileşte decizia binară a fagului spre ciclul litic ( fagului spre ciclul litic ( NN, , crocro) sau ) sau lizogen (lizogen (cIcI););

gene cu transcrierea mijlocie: gene cu transcrierea mijlocie: int, xis, red int, xis, red cII, cIII, O, PcII, cIII, O, P,, care controlează procesele care controlează procesele de replicare şi recombinare;de replicare şi recombinare;

gene cu transcriere târzie (gene cu transcriere târzie (Q, S, RQ, S, R, genele , genele pentru morfogeneză fagică: a capului - pentru morfogeneză fagică: a capului - W, B, C, D, E, FW, B, C, D, E, F şi a cozii - şi a cozii - Z, U, V, G, Z, U, V, G, H, M, L, K, I, JH, M, L, K, I, J).).

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 55: Inginerie Genetica-2 Completat
Page 56: Inginerie Genetica-2 Completat

DECIZIA BINARĂ LIZĂ-LIZOGENIEDECIZIA BINARĂ LIZĂ-LIZOGENIE1. CICLUL LIZOGEN1. CICLUL LIZOGEN se desfăşoară prin exprimarea genei se desfăşoară prin exprimarea genei cIcI.. Gena Gena cIcI este transcrisă începând de la promotorul este transcrisă începând de la promotorul PRMPRM

((repression maintenancerepression maintenance), la care se cuplează ARN ), la care se cuplează ARN polimeraza. polimeraza.

Produsul genei Produsul genei cIcI este un este un represorrepresor pentru genele pentru genele N, croN, cro, dar şi , dar şi pentru genele implicate în morfogeneza fagică. pentru genele implicate în morfogeneza fagică.

Represorul are o structură polipeptidică cu un capăt Represorul are o structură polipeptidică cu un capăt --COOH COOH terminal şi un capăt terminal şi un capăt --NHNH22 terminal. terminal.

Doi astfel de monomeri dimerizează prin intermediul capetelor Doi astfel de monomeri dimerizează prin intermediul capetelor -COOH terminale (forma dimerică a represorului este -COOH terminale (forma dimerică a represorului este esenţială pentru menţinerea lizogeniei), iar doi dimeri esenţială pentru menţinerea lizogeniei), iar doi dimeri formează un tetramer, în momentul cuplării cu formează un tetramer, în momentul cuplării cu operatorii operatorii multipli ai genelor adiacente multipli ai genelor adiacente NN şi şi crocro . .

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 57: Inginerie Genetica-2 Completat

Situs de ataşare la operatori

Situs de clivare

Situs de dimerizare

Situs de tetramerizare

Page 58: Inginerie Genetica-2 Completat

Operatorii multipli ai genei Operatorii multipli ai genei cro cro sunt: sunt: OR3, OR2, OR1OR3, OR2, OR1 (R – (R – rightright deoarece gena deoarece gena crocro este situată în dreapta genei este situată în dreapta genei cIcI). ).

Operatorii multipli ai genei Operatorii multipli ai genei N N sunt: sunt: OL3, OL2, OL1OL3, OL2, OL1 (L – (L – leftleft deoarece gena deoarece gena NN este situată în stânga genei este situată în stânga genei cIcI). ).

Represorii, în formă tetramerică, se ataşează la situsuri specifice de 17 Represorii, în formă tetramerică, se ataşează la situsuri specifice de 17 pb din operatorii multipli, prin intermediul capetelor lor -NHpb din operatorii multipli, prin intermediul capetelor lor -NH22 terminale. Consecinţa principală este terminale. Consecinţa principală este blocarea transcrierii genelor blocarea transcrierii genelor crocro şi şi NN (care sunt implicate în ciclul litic, si deci, se desfasoara ciclul (care sunt implicate în ciclul litic, si deci, se desfasoara ciclul lizogen). lizogen).

Deoarece promotorul:Deoarece promotorul: PRPR (al genei (al genei crocro) este parţial suprapus cu ) este parţial suprapus cu OR1OR1, , iar iar PLPL (promotorul genei (promotorul genei NN) este parţial suprapus cu ) este parţial suprapus cu OL1OL1, atunci când , atunci când operatorii sunt blocaţi de represori, ARN polimerazele nu pot să se operatorii sunt blocaţi de represori, ARN polimerazele nu pot să se ataşeze la promotori şi deci transcrierea acestor două gene este ataşeze la promotori şi deci transcrierea acestor două gene este blocată. blocată.

Ca urmare, se desfăşoară Ca urmare, se desfăşoară ciclul lizogenciclul lizogen. .

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 59: Inginerie Genetica-2 Completat

Represorul Represorul cIcI, când se află la un , când se află la un nivel constitutivnivel constitutiv, , funcţionează ca reglator pozitiv al propriei transcrieri, în funcţionează ca reglator pozitiv al propriei transcrieri, în sensul că sensul că OR3OR3, (care este parţial suprapus cu operatorul , (care este parţial suprapus cu operatorul OcIOcI şi şi promotorul promotorul PRMPRM ai genei ai genei cIcI) este liber şi permite ARN ) este liber şi permite ARN polimerazei să transcrie gena polimerazei să transcrie gena cIcI şi să sintetizeze în continuare şi să sintetizeze în continuare represorul represorul cIcI. .

Când concentraţia represorului Când concentraţia represorului cI cI este este prea mareprea mare, acesta se va , acesta se va cupla chiar şi de cupla chiar şi de OcIOcI şi îşi va bloca propria sinteză. şi îşi va bloca propria sinteză.

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 60: Inginerie Genetica-2 Completat

La concentraţii crescute, represorul cI se ataşeazăla toţi cei 6 operatori adiacenţi inhibându-şi propria sinteză

Inhibarea transcrierii de la PR respectiv PL ce are ca efect lizogenia

Sinteza represorului cI

Page 61: Inginerie Genetica-2 Completat

2. Ciclul litic2. Ciclul litic se desfăşoară prin exprimarea genei se desfăşoară prin exprimarea genei cro cro şişi NN, atunci când:, atunci când: represorul represorul cIcI există mai mult în formă monomerică decât ca dimer, există mai mult în formă monomerică decât ca dimer, când proteaza când proteaza Rec ARec A scindează monomerii. scindează monomerii.

Deci, când represorul Deci, când represorul cIcI se găseşte la o concentraţie scăzută, nu se se găseşte la o concentraţie scăzută, nu se mai ataşează de operatorii multipli ai genei mai ataşează de operatorii multipli ai genei crocro ( (OR3, OR2, OR1OR3, OR2, OR1) şi ) şi permite astfel ARN polimerazei să transcrie gena permite astfel ARN polimerazei să transcrie gena crocro. .

Se sintetizează astfel, o proteină Se sintetizează astfel, o proteină antirepresorantirepresor CroCro, care se va cupla cu , care se va cupla cu operatorul genei operatorul genei cIcI ( (OcI OcI care-i parţial suprapus cucare-i parţial suprapus cu PRM PRM). În acest fel, ). În acest fel, va împiedica ARN polimeraza să transcrie gena va împiedica ARN polimeraza să transcrie gena cIcI (deci nu se mai (deci nu se mai sintetizează represorul sintetizează represorul cIcI).).

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 62: Inginerie Genetica-2 Completat

LIZOGENIE

LIZA

Page 63: Inginerie Genetica-2 Completat

Tot în lipsa represorului Tot în lipsa represorului cIcI în formă dimerică, sunt liberi şi operatorii în formă dimerică, sunt liberi şi operatorii multipli ai multipli ai genei genei N N şi astfel are loc şi transcrierea acesteia. şi astfel are loc şi transcrierea acesteia.

Proteina Proteina NN are funcţie de are funcţie de anti-terminator al transcrieriianti-terminator al transcrierii,, în sensul că în sensul că transcrierea nu se opreşte spre stânga, după parcurgerea genei transcrierea nu se opreşte spre stânga, după parcurgerea genei NN, ci , ci continuă cu transcrierea genelor mijlocii continuă cu transcrierea genelor mijlocii cIII, xis, int, attcIII, xis, int, att. Spre . Spre dreapta, transcrierea nu se opreşte după parcurgerea genei dreapta, transcrierea nu se opreşte după parcurgerea genei crocro, ci , ci continuă cu citirea genelor mijlocii continuă cu citirea genelor mijlocii cII, O, P, Q.cII, O, P, Q.

Produsul genei Produsul genei QQ este de asemenea o proteină este de asemenea o proteină anti-terminator al anti-terminator al transcrieriitranscrierii, care permite transcrierea policistronică şi a genelor S şi R. , care permite transcrierea policistronică şi a genelor S şi R.

Transcrierea se opreşte doar când se atinge punctele Transcrierea se opreşte doar când se atinge punctele tLtL (spre stânga) (spre stânga) şi şi tR1, tR2tR1, tR2 (spre dreapta). (spre dreapta).

Consecinţa este desfăşurarea ciclului litic (degradarea ADN-ului Consecinţa este desfăşurarea ciclului litic (degradarea ADN-ului bacteriei gazdă, morfogeneza fagică, liza bacteriană, eliminarea bacteriei gazdă, morfogeneza fagică, liza bacteriană, eliminarea particulelor fagice mature).particulelor fagice mature).

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 64: Inginerie Genetica-2 Completat

Integrarea genomului fagicIntegrarea genomului fagic, ca profag în nucleoidul bacterian se , ca profag în nucleoidul bacterian se face situs specific între genele face situs specific între genele galgal (pentru metabolizarea galactozei) şi (pentru metabolizarea galactozei) şi biobio (pentru sinteza biotinei). (pentru sinteza biotinei).

Cromozomul bacterian posedă între aceste două gene, situsulCromozomul bacterian posedă între aceste două gene, situsul attB attB ((attachment on bacteriaattachment on bacteria) cu secvenţă de nucleotide notată ) cu secvenţă de nucleotide notată convenţional convenţional BOB’BOB’. .

Situsul Situsul attPattP ( (attachment on phageattachment on phage) din genomul fagic, are o secvenţă ) din genomul fagic, are o secvenţă de nucleotide notată de nucleotide notată POP’POP’. Secvenţa . Secvenţa OO (mijlocul celor două situsuri) (mijlocul celor două situsuri) este comună şi este formată din 15 pb este comună şi este formată din 15 pb (3’...GCTTTTTTATACTAA....5’). (3’...GCTTTTTTATACTAA....5’).

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Integrarea este controlată de gena Integrarea este controlată de gena intint, care codifică o recombinază situs , care codifică o recombinază situs specifică, dar şi de proteina histone-like specifică, dar şi de proteina histone-like IHFIHF bacteriană. bacteriană. După integrare, genomul fagic va fi După integrare, genomul fagic va fi flancat de două situsuri recombinate: flancat de două situsuri recombinate: attLattL ((leftleft) şi ) şi attRattR ( (rightright).).

Page 65: Inginerie Genetica-2 Completat

Excizia profaguluiExcizia profagului din nucleoidul bacterian (inducţie fagică) este din nucleoidul bacterian (inducţie fagică) este controlată de genele controlată de genele xis, intxis, int şi de proteina şi de proteina IHFIHF şi are loc când şi are loc când represorul represorul cI cI este inactivat. În momentul exciziei eronate, genomul este inactivat. În momentul exciziei eronate, genomul fagic poate prelua genele adiacente fagic poate prelua genele adiacente gal+gal+ sau sau bio+ bio+ şi le poate transfera şi le poate transfera altor tulpini bacteriene auxotrofe, realizând astfel recombinarea altor tulpini bacteriene auxotrofe, realizând astfel recombinarea genetică prin transducţie.genetică prin transducţie.

MECANISME DE TRANSFER MECANISME DE TRANSFER GENETIC GENETIC LA PROCARIOTLA PROCARIOTEE

Page 66: Inginerie Genetica-2 Completat

Încadrare sistematicăÎncadrare sistematică:: Filum AscomycotaFilum Ascomycota Clasa SaccharomycetesClasa Saccharomycetes Ordinul Saccharomycetales

Familia Saccharomycetaceae Saccharomyces cerevisiae (drojdia de bere)

S. cerevisiae S. cerevisiae ““cobaiul geneticiicobaiul geneticii” rivalizează cu ” rivalizează cu E. coli – E. coli – argumente:argumente: Are o organizare simplăAre o organizare simplă Se manipulează uşor în laboratorSe manipulează uşor în laborator Are rol important în industrie (alcool, vin ,bere, panificaţie)Are rol important în industrie (alcool, vin ,bere, panificaţie) Sursă bogată de vitamine din complexul BSursă bogată de vitamine din complexul B Are număr relativ redus de cromozomi (16) şi cantitate mică de ADN nuclear Are număr relativ redus de cromozomi (16) şi cantitate mică de ADN nuclear 10101010

daltonidaltoni Peretele celular poate fi uşor îndepărtat enzimatic rezultând protoplaştiPeretele celular poate fi uşor îndepărtat enzimatic rezultând protoplaşti Lipsa de patogenitate şi organizarea de tip eucariot facilitează exprimarea genelor Lipsa de patogenitate şi organizarea de tip eucariot facilitează exprimarea genelor

eucariote de interes medical, clonate în aceasta.eucariote de interes medical, clonate în aceasta.

Inginerie geneticInginerie genetică la drojdiiă la drojdiiMaterialul genetic nuclear la Materialul genetic nuclear la S. cerevisiaeS. cerevisiae

Page 67: Inginerie Genetica-2 Completat

Taxonomie molecularăTaxonomie moleculară::

Drojdiile Drojdiile S. cerevisiae S. cerevisiae (Ascomycota) sunt (Ascomycota) sunt forme teleomorfe forme teleomorfe (stadii perfecte, sexuate, care prezintă (stadii perfecte, sexuate, care prezintă meioză şi sporulare şi deci, implicit sexualitate) ale unor fungi imperfecţi (Deuteromycota) de tip meioză şi sporulare şi deci, implicit sexualitate) ale unor fungi imperfecţi (Deuteromycota) de tip Candida,Candida, consideraţi ca consideraţi ca forme anamorfeforme anamorfe (stadii imperfecte, asexuate, care se divid doar prin (stadii imperfecte, asexuate, care se divid doar prin mitoză).mitoză).

Ciclul de viaţăCiclul de viaţă::

DiplofazaDiplofaza (predominantă) debutează cu conjugarea a (predominantă) debutează cu conjugarea a două celule haploidedouă celule haploide (n) (n), formează un zigot , formează un zigot binucleat, care binucleat, care prin prin cariogamicariogamie, devine celulă diploidă (2n)e, devine celulă diploidă (2n), apoi înmugureşte, apoi înmugureşte şi formează colonii şi formează colonii diploidediploide. . Haplofaza Haplofaza (mai scurtă) debutează cu (mai scurtă) debutează cu diviziunediviziuneaa reducţională reducţională (meioză, sporulare) a unor (meioză, sporulare) a unor ccelulele diploide devenielulele diploide devenitătă asc ascăă, , prinprin care iau naştere 4 ascospori care iau naştere 4 ascospori (n) (n), diferenţiaţi sexual, diferenţiaţi sexual (2a/2 (2a/2αα)). . Prin germinare şi înmugurire, aceştia dau naştere la noi colonii haploide.Prin germinare şi înmugurire, aceştia dau naştere la noi colonii haploide. Rearanjamente Rearanjamente cromozomale stau la baza interconversiei tipului celular al ascosporilor (a→cromozomale stau la baza interconversiei tipului celular al ascosporilor (a→αα sau sau αα→a).→a).

Inginerie geneticInginerie genetică la drojdiiă la drojdiiMaterialul genetic nuclear la Materialul genetic nuclear la S. cerevisiaeS. cerevisiae

Page 68: Inginerie Genetica-2 Completat

Tipuri de fertilizare:Tipuri de fertilizare: AutofertilizareAutofertilizare: o tulpină homotalică, monosporală (cu ascospori de un singur fel: a : o tulpină homotalică, monosporală (cu ascospori de un singur fel: a

sausau α α) suferă interconversia tipului de împerechere şi se transformă într-o cultură ) suferă interconversia tipului de împerechere şi se transformă într-o cultură mixtă în care are loc apoi conjugarea între doi ascospori diferiţi: a x mixtă în care are loc apoi conjugarea între doi ascospori diferiţi: a x αα → diploizi (2n) → diploizi (2n)

Fertilizare încrucişatăFertilizare încrucişată: conjugarea are loc între ascosporii diferiţi dintr-o tulpină : conjugarea are loc între ascosporii diferiţi dintr-o tulpină heterotalică, disporalăheterotalică, disporală

Inginerie geneticInginerie genetică la drojdiiă la drojdiiMaterialul genetic nuclear la Materialul genetic nuclear la S. cerevisiaeS. cerevisiae

Celule 2nMAT a / MAT αFaza vegetativă

MeiozăFaza reproducătoare Celule n (ascospori)

2a , 2αFaza vegetativă

Tulpini homotalice a sau αcapabile de autofertilizare

Tulpini heterotalice a şi αcapabile de fertilizare încrucişată

Cultură (n) monosporală MAT aFaza vegetativă

Cultură (n) mixtă MAT a, MAT αFaza vegetativă

Interconversie

ConjugareFaza reproducătoare

Page 69: Inginerie Genetica-2 Completat

Interconversia tipului de împerechere:Interconversia tipului de împerechere: Pe cromozomul III există Pe cromozomul III există locusul locusul MATMAT (locusul tipului de împerechere = (locusul tipului de împerechere = mating mating

typetype). La ascosporii haploizi există doar MAT a sau MAT ). La ascosporii haploizi există doar MAT a sau MAT αα. Formele diploide sunt . Formele diploide sunt heterozigote pentru locusul MAT (MAT a / MATheterozigote pentru locusul MAT (MAT a / MAT α α) având cele două alele pe cei ) având cele două alele pe cei doi cromozomi omologi din perechea III.doi cromozomi omologi din perechea III.

Locusul MAT este flancat de două casete silenţioase: Locusul MAT este flancat de două casete silenţioase: HMLHML (homotalic left) şi (homotalic left) şi HMRHMR (homotalic right) care poartă informaţie suplimentară a sau (homotalic right) care poartă informaţie suplimentară a sau αα. La formele . La formele heterotalice nu se exprimă decât locusul MAT deoarece cele două casete silenţioase heterotalice nu se exprimă decât locusul MAT deoarece cele două casete silenţioase sunt represate de proteine specifice codificate de gene sunt represate de proteine specifice codificate de gene SIRSIR ( (silent information silent information regulatorregulator) .) .

Locusul MAT are 4 segmente X, Y, Z, W. Locusul MAT are 4 segmente X, Y, Z, W. Segmentul YSegmentul Y are 600 pb, este variabil şi are 600 pb, este variabil şi codifică fie pentru factorul a (alela MATa), fie pentru factorul codifică fie pentru factorul a (alela MATa), fie pentru factorul αα (alela MAT (alela MAT α α). ). Segmentele X, Z, W sunt, în esenţă, identice.Segmentele X, Z, W sunt, în esenţă, identice.

Gena dominantă HOGena dominantă HO (prezentă la (prezentă la tulpinile homotalicetulpinile homotalice) codifică o endonuclează ) codifică o endonuclează Ho (Y/Z) care recunoaşte o secvenţă specifică la joncţiunea dintre segmentele Y şi Ho (Y/Z) care recunoaşte o secvenţă specifică la joncţiunea dintre segmentele Y şi Z unde realizează o incizie dublu catenară. Z unde realizează o incizie dublu catenară. Tulpinile heterotalice Tulpinile heterotalice posedă posedă alela alela recesivă ho,recesivă ho, fapt care nu permite interconversia tipului de împerechere. fapt care nu permite interconversia tipului de împerechere.

Inginerie geneticInginerie genetică la drojdiiă la drojdiiMaterialul genetic nuclear la Materialul genetic nuclear la S. cerevisiaeS. cerevisiae

Page 70: Inginerie Genetica-2 Completat

Etapele interconversiei tipului de împerechere la tulpinile homotalice:Etapele interconversiei tipului de împerechere la tulpinile homotalice: endonucleazendonucleazaa Ho Ho recunoaşte o secvenţă de nucleotide între segmentele Y şi Zrecunoaşte o secvenţă de nucleotide între segmentele Y şi Z ale ale

locusului MAT locusului MAT αα (într-un ascospor de tip (într-un ascospor de tip αα) ) şi produce incizii dublucatenare numaişi produce incizii dublucatenare numai aiciaici, deoarece HML şi HMR sunt represate de proteinele Sir. , deoarece HML şi HMR sunt represate de proteinele Sir.

fragmentul Yfragmentul Y α α din locusul MAT din locusul MAT αα va fi degradat şi va fi înlocuit (sinteză va fi degradat şi va fi înlocuit (sinteză reparatorie) prin copierea informaţiei din segmentul Y al locusului HML sau HMRreparatorie) prin copierea informaţiei din segmentul Y al locusului HML sau HMR,, cel care poartă informaţia corespunzătoare tipului opus de împerecherecel care poartă informaţia corespunzătoare tipului opus de împerechere (în figură (în figură HMRa)HMRa).. Astfel ascosporul Astfel ascosporul αα devine ascospor de tip a. devine ascospor de tip a.

Inginerie geneticInginerie genetică la drojdiiă la drojdiiMaterialul genetic nuclear la Materialul genetic nuclear la S. cerevisiaeS. cerevisiae

Page 71: Inginerie Genetica-2 Completat

Intervenţia genelor cdc (Intervenţia genelor cdc (cell division cyclecell division cycle) în controlul ciclului celular la ) în controlul ciclului celular la S. cerevisiaeS. cerevisiae

Cum decide o celulă haploidă (ascospor) daca se divide sau conjugă ? Cum decide o celulă haploidă (ascospor) daca se divide sau conjugă ?

Interfaza are cele trei etape G1, S, G2. În G1 există un punct critic numit Interfaza are cele trei etape G1, S, G2. În G1 există un punct critic numit START START (până la care (până la care conjugarea este posibilă), dar care odată depăşit, dictează intrarea în diviziune (mitoză), deci conjugarea este posibilă), dar care odată depăşit, dictează intrarea în diviziune (mitoză), deci e cel mai precoce eveniment controlat genetic în care celula se angajează în diviziune.e cel mai precoce eveniment controlat genetic în care celula se angajează în diviziune.

Gene implicate:Gene implicate: cdc 36, cdc39 cdc 36, cdc39 activate înaintea momentului START, controlează procesul de conjugare şi activate înaintea momentului START, controlează procesul de conjugare şi

deci, formarea diploizilor capabili de sporulare (meioză).deci, formarea diploizilor capabili de sporulare (meioză). cdc 28 cdc 28 activată determină depăşirea punctului START şi continuarea fazelor S şi G2 cu activată determină depăşirea punctului START şi continuarea fazelor S şi G2 cu

mitoza. Această genă codifică o proteinkinază esenţială pentru desfăşurarea diviziunii. mitoza. Această genă codifică o proteinkinază esenţială pentru desfăşurarea diviziunii. La trecerea dintre G1 la S, cdc28 e activată de ciclinele N: Cln1,2,3. La trecerea dintre G1 la S, cdc28 e activată de ciclinele N: Cln1,2,3. La trecerea dintre S la G2, cdc28 este activată de ciclinele B: Clb1,2La trecerea dintre S la G2, cdc28 este activată de ciclinele B: Clb1,2 cdc 2, 7, 8, 9, 17, 21, 24, 31 cdc 2, 7, 8, 9, 17, 21, 24, 31 sunt alte gene implicate în trecerea de la G1 la Ssunt alte gene implicate în trecerea de la G1 la S

Inginerie geneticInginerie genetică la drojdiiă la drojdiiMaterialul genetic nuclear la Materialul genetic nuclear la S. cerevisiaeS. cerevisiae

Page 72: Inginerie Genetica-2 Completat

ORGANIZAREA MATERIALULUI NUCLEAR LA ORGANIZAREA MATERIALULUI NUCLEAR LA S. cerevisiaeS. cerevisiae 1,3 x 1,3 x 101077 daltoni daltoni 14 x 14 x 101033 kpb kpb 6500 gene6500 gene 16 cromozomi ( I 245 kpb, XII 2500 kpb) 16 cromozomi ( I 245 kpb, XII 2500 kpb) 140 gene pentru ARNr (pe cromozomul XII)140 gene pentru ARNr (pe cromozomul XII) 400 gene pentru ARNt400 gene pentru ARNt numai 4% dintre gene posedă structură mozaicată, cu introni (specifică eucariotelor)numai 4% dintre gene posedă structură mozaicată, cu introni (specifică eucariotelor) cromatina posedă proteine histonicecromatina posedă proteine histonice Secvenţele ARS (autonomously replicating sequence):Secvenţele ARS (autonomously replicating sequence):

Echivalente cu secvenţa Echivalente cu secvenţa oriori (deci au rol în iniţierea replicării); (deci au rol în iniţierea replicării); 400 secvenţe ARS care se succed la 35pb şi formează clustere (20-80 secv. ARS) numite 400 secvenţe ARS care se succed la 35pb şi formează clustere (20-80 secv. ARS) numite

unităţi replicative.unităţi replicative. Secvenţele CEN (secvenţe centromerice): au 130pb; au rol în structura centromerului Secvenţele CEN (secvenţe centromerice): au 130pb; au rol în structura centromerului

şi a kinetocorului; situate pe cromozomii III, IV, XI.şi a kinetocorului; situate pe cromozomii III, IV, XI. Secvenţele TEL scurte, repetate în tandem, plasate la capătul cromozomilor, cu rol de Secvenţele TEL scurte, repetate în tandem, plasate la capătul cromozomilor, cu rol de

a proteja telomerele; C(1-3) A sau G(1-3) T.a proteja telomerele; C(1-3) A sau G(1-3) T.

Inginerie geneticInginerie genetică la drojdiiă la drojdiiMaterialul genetic nuclear la Materialul genetic nuclear la S. cerevisiaeS. cerevisiae

Page 73: Inginerie Genetica-2 Completat

Plasmida 2µmPlasmida 2µm O moleculă de ADN dcCCC; 6,3 kpb; O moleculă de ADN dcCCC; 6,3 kpb;

4,2 Mdaltoni; 60-100 copii/celulă;4,2 Mdaltoni; 60-100 copii/celulă; Localizare nuclearăLocalizare nucleară !!!!!!!! Structură nucleosomală (deci Structură nucleosomală (deci

asemănătoare fibrei de cromatină: asemănătoare fibrei de cromatină: ADN+histone);ADN+histone);

Posedă două secvenţe invers repetate Posedă două secvenţe invers repetate IR de 599pb care împart plasmida în IR de 599pb care împart plasmida în două regiuni cu secvenţe unice două regiuni cu secvenţe unice (2774pb respectiv 2346pb). În funcţie (2774pb respectiv 2346pb). În funcţie de orientarea relativă a acestor de orientarea relativă a acestor regiuni unice, există două forme regiuni unice, există două forme echivalente de plasmidă 2µm : A şi B. echivalente de plasmidă 2µm : A şi B. Este posibilă trecerea (Este posibilă trecerea (flipingfliping) de la A ) de la A ↔ B precum şi existenţa formelor ↔ B precum şi existenţa formelor multimerice de 4 µm sau de 6µm.multimerice de 4 µm sau de 6µm.

Nu se inseră niciodată în ADN Nu se inseră niciodată în ADN cromozomal cromozomal

Inginerie geneticInginerie genetică la drojdiiă la drojdiiMaterialul genetic nuclear la Materialul genetic nuclear la S. cerevisiaeS. cerevisiae

Page 74: Inginerie Genetica-2 Completat

Plasmida 2µmPlasmida 2µm

Posedă 4 gene:Posedă 4 gene: FLPFLP (fliping) situată în regiunea unică mare, (fliping) situată în regiunea unică mare,

codifică o proteină de recombinare A↔B;codifică o proteină de recombinare A↔B; REP1REP1 situată în regiunea unică mică şi situată în regiunea unică mică şi REP2REP2

situată în regiunea unică mare, au rol în situată în regiunea unică mare, au rol în replicare, stabilitate, partiţie dar şi în replicare, stabilitate, partiţie dar şi în exprimarea genelor plasmidiale;exprimarea genelor plasmidiale;

RAF1RAF1 situată în regiunea unică mică, reglează situată în regiunea unică mică, reglează exprimarea genică;exprimarea genică;

Secvenţa ARS (originea replicării plasmidiale), Secvenţa ARS (originea replicării plasmidiale), situată între IR1 şi regiunea unică mică;situată între IR1 şi regiunea unică mică;

Secvenţa FRT plasată în regiunile IR1 şi 2, Secvenţa FRT plasată în regiunile IR1 şi 2, reprezintă situsuri de recunoaştere pentru reprezintă situsuri de recunoaştere pentru recombinaza FLP;recombinaza FLP;

Secvenţa STB reprezintă situs pentru produşii Secvenţa STB reprezintă situs pentru produşii genelor REP1 şi 2genelor REP1 şi 2

Inginerie geneticInginerie genetică la drojdiiă la drojdiiMaterialul genetic nuclear la Materialul genetic nuclear la S. cerevisiaeS. cerevisiae

Page 75: Inginerie Genetica-2 Completat

Mitocondria Mitocondria Este un organit specializat în respiraţia celulară şi fosforilarea oxidativă;Este un organit specializat în respiraţia celulară şi fosforilarea oxidativă; Are un sistem genetic propriu şi mecanisme proprii de sinteză proteică;Are un sistem genetic propriu şi mecanisme proprii de sinteză proteică; Biogeneza mitocondriei este rezultatul interacţiunii a două genomuri nuclear (95% din Biogeneza mitocondriei este rezultatul interacţiunii a două genomuri nuclear (95% din

enzimele necesare replicării şi transcrierii ADNmt) şi mitocondrial. enzimele necesare replicării şi transcrierii ADNmt) şi mitocondrial.

ADN mt ADN mt (m(mitocondriaitocondrial):l): Este o moleculă de ADNdc CCC (75kpb, 50Mda) necomplexat cu histone, ci cu proteine Este o moleculă de ADNdc CCC (75kpb, 50Mda) necomplexat cu histone, ci cu proteine

histone like;histone like; Posedă un procent mare de perechi AT(80%) şi un procent redus de GC (12-20%) cu tendinţa Posedă un procent mare de perechi AT(80%) şi un procent redus de GC (12-20%) cu tendinţa

de a suferi deleţii;de a suferi deleţii; Are multe gene mozaicate, ceea ce presupune prelucrarea posttranscripţională cu ajutorul Are multe gene mozaicate, ceea ce presupune prelucrarea posttranscripţională cu ajutorul

unei maturaze care îndepărtează intronii;unei maturaze care îndepărtează intronii; Sinteza proteică proprie este inhibată de cloramfenicol şi eritromicină şi este insensibilă la Sinteza proteică proprie este inhibată de cloramfenicol şi eritromicină şi este insensibilă la

cicloheximidină (inhibitor specific al proteosintezei la eukariote);cicloheximidină (inhibitor specific al proteosintezei la eukariote); Codul genetic mitocondrial prezintă o serie de diferenţe faţă de cel nuclear:Codul genetic mitocondrial prezintă o serie de diferenţe faţă de cel nuclear:

Inginerie geneticInginerie genetică la drojdiiă la drojdiiMaterialul genetic Materialul genetic extraextranuclear la nuclear la S. cerevisiaeS. cerevisiae

CODON Cod genetic universal Cod genetic mitocondrial

UGA Stop Trp

AUA Ile Met

CUA Leu Thr

Page 76: Inginerie Genetica-2 Completat

GENOMUL MITOCONDRIAL cuprinde:GENOMUL MITOCONDRIAL cuprinde: Gene pentru 24 specii moleculare de ARNt grupate într-un cluster;Gene pentru 24 specii moleculare de ARNt grupate într-un cluster; Gene pentru două specii moleculare de ARNr de 15S (din subunitatea mică a Gene pentru două specii moleculare de ARNr de 15S (din subunitatea mică a

mitoribozomilor) şi de 21S (ARNr de 5S lipseşte din ribozomii mitocondriei);mitoribozomilor) şi de 21S (ARNr de 5S lipseşte din ribozomii mitocondriei); Gena var1 codifică proteina principală ce leagă ARNr în mitoribozomi;Gena var1 codifică proteina principală ce leagă ARNr în mitoribozomi; Gena pentru ARN de 9S care, complexat de o proteină formează o ribozimă implicată în Gena pentru ARN de 9S care, complexat de o proteină formează o ribozimă implicată în

maturarea ARNtmaturarea ARNt Genele CO I, CO II, CO III pentru subunităţile citocrom-oxidazei;Genele CO I, CO II, CO III pentru subunităţile citocrom-oxidazei; Gena pentru apoproteina citocromului b;Gena pentru apoproteina citocromului b; Genele pentru subunităţile 6, 8, 9, ale ATP-azei mitocondriale;Genele pentru subunităţile 6, 8, 9, ale ATP-azei mitocondriale; ORF I-III cu funcţie încă necunoscută;ORF I-III cu funcţie încă necunoscută; 1-4 origini de replicare;1-4 origini de replicare; 13 puncte de iniţiere a transcrierii13 puncte de iniţiere a transcrierii

Toate aceste gene sunt plasate Toate aceste gene sunt plasate pe o singură catenă a ADN mtpe o singură catenă a ADN mt. .

Pe cealaltă catenă se află o singură genă (pentru ARNt pentru Thr).Pe cealaltă catenă se află o singură genă (pentru ARNt pentru Thr).

Inginerie geneticInginerie genetică la drojdiiă la drojdiiMaterialul genetic Materialul genetic extraextranuclear la nuclear la S. cerevisiaeS. cerevisiae

în ADN spacer

Page 77: Inginerie Genetica-2 Completat

Genomul mitocondrial se poate împărţi în 4 Genomul mitocondrial se poate împărţi în 4 fragmente:fragmente:

Un fragment bogat în AT (≤5%GC) ≈ Un fragment bogat în AT (≤5%GC) ≈ 50% din ADNmt, care este spaţiator 50% din ADNmt, care este spaţiator (spacer);(spacer);

Un fragment cu 22-65% GC ≈ 50% din Un fragment cu 22-65% GC ≈ 50% din ADNmt, careADNmt, care conţine genele;conţine genele;

Două fragmente scurte foarte bogate în GC Două fragmente scurte foarte bogate în GC (2-3% din ADNmt) care reprezintă situsuri (2-3% din ADNmt) care reprezintă situsuri pentru endonucleazele de restricţie.pentru endonucleazele de restricţie.

Inginerie geneticInginerie genetică la drojdiiă la drojdiiMaterialul genetic Materialul genetic extraextranuclear la nuclear la S. cerevisiaeS. cerevisiae

Page 78: Inginerie Genetica-2 Completat

Tehnologii performante care stau la baza studierii ADN cromozomal şi a ADNmt la drojdii:Tehnologii performante care stau la baza studierii ADN cromozomal şi a ADNmt la drojdii: HPLC (HPLC (High performance liquid chromatographyHigh performance liquid chromatography) prin care se hidrolizează ADN in ) prin care se hidrolizează ADN in

nucleotide şi se determină direct %GC;nucleotide şi se determină direct %GC; Tehnica densităţii de plutire (“Tehnica densităţii de plutire (“buoyant densitybuoyant density”) prin care s-a dovedit că densitatea ADNdc ”) prin care s-a dovedit că densitatea ADNdc

creşte liniar cu %GC datorită celor 3 punţi de hidrogen, care fac moleculele mai compacte, creşte liniar cu %GC datorită celor 3 punţi de hidrogen, care fac moleculele mai compacte, mai dense;mai dense;

Temperatura de topire Tm (Temperatura de topire Tm (melting midpointmelting midpoint) este temperatura la care jumătate din ADN este ) este temperatura la care jumătate din ADN este dublucatenar, jumătate este monocatenar (denaturat), va fi cu atât mai mare cu cât %GC este dublucatenar, jumătate este monocatenar (denaturat), va fi cu atât mai mare cu cât %GC este mai mare: %GC = 2,08 x Tm – 106,4 (Owen, 1985)mai mare: %GC = 2,08 x Tm – 106,4 (Owen, 1985)

RFLP (RFLP (Restriction Fragment Lenght PolymorphismsRestriction Fragment Lenght Polymorphisms) polimorfismul lungimii fragmentelor ) polimorfismul lungimii fragmentelor rezultate prin acţiunea simultană a mai multor enzime de restricţie (până la 40);rezultate prin acţiunea simultană a mai multor enzime de restricţie (până la 40);

OFAGE (OFAGE (Ortogonal Field Alternation Gel ElectrophoresisOrtogonal Field Alternation Gel Electrophoresis) constă în două perechi de ) constă în două perechi de elctrozi aşezate astfel încât produc câmpuri electrice în diagonală, iar moleculele de ADN elctrozi aşezate astfel încât produc câmpuri electrice în diagonală, iar moleculele de ADN migrează pe o traiectorie curbă depărtându-se de centru.migrează pe o traiectorie curbă depărtându-se de centru.

Inginerie geneticInginerie genetică la drojdiiă la drojdiiMaterialul genetic Materialul genetic extraextranuclear la nuclear la S. cerevisiaeS. cerevisiae

Page 79: Inginerie Genetica-2 Completat

FIGE (FIGE (Field Inversion Gel ElectrophoresisField Inversion Gel Electrophoresis) se schimbă cu 180° polaritatea câmpului la ) se schimbă cu 180° polaritatea câmpului la fiecare ciclu, lăsând un timp dublu pentru direcţia spre anod. Astfel s-au obţinut pentru fiecare ciclu, lăsând un timp dublu pentru direcţia spre anod. Astfel s-au obţinut pentru S. S. cerevisiae cerevisiae 13 benzi deoarece cromozomii cu dimensiuni apropiate comigrează (XIII cu XVI, 13 benzi deoarece cromozomii cu dimensiuni apropiate comigrează (XIII cu XVI, VII şi XV, V şi VIII). Mărimea cromozomului XII diferă (2-3Mda) în funcţie de numărul VII şi XV, V şi VIII). Mărimea cromozomului XII diferă (2-3Mda) în funcţie de numărul copiilor pentru ARNr (100-200).copiilor pentru ARNr (100-200).

CHEF (CHEF (Contur Clamped Homogeneous Electric FieldsContur Clamped Homogeneous Electric Fields) foloseşte o arie hexagonală în care ) foloseşte o arie hexagonală în care sunt plasaţi multi electrozi mici în serie astfel încât câmpurile se întretaie în unghiuri de 120°sunt plasaţi multi electrozi mici în serie astfel încât câmpurile se întretaie în unghiuri de 120°

RGE (RGE (Rotating Gel ElectrophoresisRotating Gel Electrophoresis) se roteşte gelul cu 90° la fiecare ciclu.) se roteşte gelul cu 90° la fiecare ciclu. TAFETAFE ( (TTransverse ransverse AAlternating lternating F Field ield ElElectrophoresis ectrophoresis ))

Inginerie geneticInginerie genetică la drojdiiă la drojdiiMaterialul genetic Materialul genetic extraextranuclear la nuclear la S. cerevisiaeS. cerevisiae

Page 80: Inginerie Genetica-2 Completat

Mutantele petiteMutantele petite Descrise pentru prima dată în 1949 de Efhrussi şi colaboratorii;Descrise pentru prima dată în 1949 de Efhrussi şi colaboratorii; Apar datorită unor modificări ale ADNmt care afectează capacitatea de respiraţie şi de Apar datorită unor modificări ale ADNmt care afectează capacitatea de respiraţie şi de

multiplicare, astfel că în laborator, pe medii de cultură, dau colonii mici (petite) deoarece ele se multiplicare, astfel că în laborator, pe medii de cultură, dau colonii mici (petite) deoarece ele se multiplică atât timp cât în mediu există glucoză şi produc ATP doar prin glicoliză anaerobă;multiplică atât timp cât în mediu există glucoză şi produc ATP doar prin glicoliză anaerobă;

Sunt incapabile să respire sau nivelul respiraţiei este foarte scăzut datorită afectării ADNmt şi Sunt incapabile să respire sau nivelul respiraţiei este foarte scăzut datorită afectării ADNmt şi implicit a structurii şi fiziologiei mitocondriei:implicit a structurii şi fiziologiei mitocondriei:

Mitocondrii mai mici, sferice sau filamentoase;Mitocondrii mai mici, sferice sau filamentoase; Numărul lor scade şi pierd cristele mitocondriale;Numărul lor scade şi pierd cristele mitocondriale; Au o distribuţie neregulată (tind să formeze agregate).Au o distribuţie neregulată (tind să formeze agregate).

Pot fi evidenţiate prin colorare cu săruri de tetrazoliu (coloniile normale apar roşii, cele petite Pot fi evidenţiate prin colorare cu săruri de tetrazoliu (coloniile normale apar roşii, cele petite apar incolore)apar incolore)

Sunt mutaţii ireversibile şi segregă în F1, de regulă, într-un raport nemendelian sau mendelian Sunt mutaţii ireversibile şi segregă în F1, de regulă, într-un raport nemendelian sau mendelian (când există gene nucleare: P, p1, p2 care controlează fenotipul petite);(când există gene nucleare: P, p1, p2 care controlează fenotipul petite);

Apar şi spontan cu o frecvenţă de 1-2 %, dar pot fi induse experimental cu o frecvenţă mult Apar şi spontan cu o frecvenţă de 1-2 %, dar pot fi induse experimental cu o frecvenţă mult mai mare;mai mare;

Genomul mitocondrial a fost notat cu Genomul mitocondrial a fost notat cu ρρ astfel că tulpinile sălbatice sunt astfel că tulpinile sălbatice sunt ρρ ++ . Prin deleţie . Prin deleţie completă apar mutantele neutre completă apar mutantele neutre ρρ 0 0 . Prin deleţii parţiale (20-90% din ADNmt), urmate de . Prin deleţii parţiale (20-90% din ADNmt), urmate de duplicaţii, apar mutante supresive duplicaţii, apar mutante supresive ρρ -- . Cu cât segmentul conservat din . Cu cât segmentul conservat din ρρ ++ este mai mic, cu atât este mai mic, cu atât numărul de copii /celulă este mai mare.numărul de copii /celulă este mai mare.

Inginerie geneticInginerie genetică la drojdiiă la drojdiiMaterialul genetic Materialul genetic extraextranuclear la nuclear la S. cerevisiaeS. cerevisiae

Page 81: Inginerie Genetica-2 Completat

Conjugarea ascosporilor haploizi : Conjugarea ascosporilor haploizi :

aaρρ ++ x x αραρ 0 0 → diploizi→ diploizi a aαραρ++ρρ 0 0 2a2aρρ++ + 2 + 2αραρ + +

deci între deci între ρρ+ + şişi ρρ 0 0 este preferat fenotipul este preferat fenotipul ρρ+ + (deci tipul sălbatic) ! (deci tipul sălbatic) !

aaρρ ++ x x αραρ - - → diploizi → diploizi aαaαρρ++ρρ - - 22aρ- + 2αρ - aρ- + 2αρ -

deci între deci între ρρ+ + şişi ρρ -- este preferat fenotipul este preferat fenotipul ρ-ρ- (deci mutantele supresive) ! (deci mutantele supresive) ! Explicaţia ar consta fie în replicarea preferenţială a moleculelor ADN mt ρ-, fie în Explicaţia ar consta fie în replicarea preferenţială a moleculelor ADN mt ρ-, fie în

recombinarea genetică cu distrugerea moleculelor ADN mt ρ+.recombinarea genetică cu distrugerea moleculelor ADN mt ρ+.

Inginerie geneticInginerie genetică la drojdiiă la drojdiiMaterialul genetic Materialul genetic extraextranuclear la nuclear la S. cerevisiaeS. cerevisiae

meioză

meioză

Page 82: Inginerie Genetica-2 Completat

Caracterul killer (K)Caracterul killer (K) a fost studiat de Bevan şi Somers (1963) a fost studiat de Bevan şi Somers (1963) Este determinat de prezenţa în citoplasmă a uneia sau mai multor specii moleculare de Este determinat de prezenţa în citoplasmă a uneia sau mai multor specii moleculare de

virusuri ARNdc virusuri ARNdc care codifică o toxină ce omoară celulele sensibile, dar care nu are nici un care codifică o toxină ce omoară celulele sensibile, dar care nu are nici un efect asupra celulei care o produce (deoarece manifestă imunitate, rezistenţă la propria efect asupra celulei care o produce (deoarece manifestă imunitate, rezistenţă la propria toxină) (K+R+). Există tulpini K1, K2, K3 şi pot avea imunitate încrucişată. Tulpinile toxină) (K+R+). Există tulpini K1, K2, K3 şi pot avea imunitate încrucişată. Tulpinile K2+R2+ sunt mai competitive în fermentaţia mustului de struguri nesteril pentru că sunt K2+R2+ sunt mai competitive în fermentaţia mustului de struguri nesteril pentru că sunt rezistente la sulfiţi şi sunt o garanţie pentru evitarea contaminării (inconvenientul constă în rezistente la sulfiţi şi sunt o garanţie pentru evitarea contaminării (inconvenientul constă în instabilitatea lor la 37°C şi transformarea lor în tulpini neutre sau chiar sensibile.instabilitatea lor la 37°C şi transformarea lor în tulpini neutre sau chiar sensibile.

Există celule de drojdie: Există celule de drojdie: sensibilesensibile (S) care nu posedă ARN viral, deci nu produc toxină şi sunt omorâte de tulpinile (S) care nu posedă ARN viral, deci nu produc toxină şi sunt omorâte de tulpinile

killer (K-R-) killer (K-R-) killer – sensibile killer – sensibile (K-S) care produc un tip de toxină la care sunt imune, dar în acelaşi timp (K-S) care produc un tip de toxină la care sunt imune, dar în acelaşi timp

sunt sensibile la alte toxine killersunt sensibile la alte toxine killer killer-termosensibilekiller-termosensibile care omoară celulele S numai la temperaturi mai mici de 30°C care omoară celulele S numai la temperaturi mai mici de 30°C super-killer super-killer care au un efect letal foarte puternic (K+++)care au un efect letal foarte puternic (K+++) neutre neutre (N) care nu produc toxină (nu omoară celulele S) dar sunt rezistente la toxină (K-R+) (N) care nu produc toxină (nu omoară celulele S) dar sunt rezistente la toxină (K-R+) autokiller autokiller care prezintă o mutaţie a genei care prezintă o mutaţie a genei rex1 rex1 ce determină autodistrugerea, când sunt ce determină autodistrugerea, când sunt

cultivate în anumite condiţiicultivate în anumite condiţii..

Inginerie geneticInginerie genetică la drojdiiă la drojdiiMaterialul genetic Materialul genetic extraextranuclear la nuclear la S. cerevisiaeS. cerevisiae

Page 83: Inginerie Genetica-2 Completat

Genetica fenotipului killerGenetica fenotipului killer:: În citoplasma drojdiilor de În citoplasma drojdiilor de S. cerevisiae S. cerevisiae killer s-au descoperit 2 killer s-au descoperit 2

tipuri de particule tipuri de particule virus-likevirus-like::

VSc-LVSc-L sunt sunt particule helperparticule helper codifică proteinele capsidelor (identice pentru cele două particule codifică proteinele capsidelor (identice pentru cele două particule

virus-like L şi M): o proteină majoră - 75kda şi 2 proteine minore – virus-like L şi M): o proteină majoră - 75kda şi 2 proteine minore – 53 kda şi 37kda53 kda şi 37kda

codificăcodifică polimerazele necesare replicării ambelor genomuri polimerazele necesare replicării ambelor genomuri 4,5kpb; 2,1-3,4 Mda; 100 copii/celulă4,5kpb; 2,1-3,4 Mda; 100 copii/celulă La tulpina K7 de La tulpina K7 de S. cerevisiae, S. cerevisiae, particula L mutantă a devenit particula L mutantă a devenit

dependentă de o mutantă nucleară mak10dependentă de o mutantă nucleară mak10

VSc-MVSc-M sunt sunt particule defective particule defective codificăcodifică toxina şi factorul de imunitate toxina şi factorul de imunitate necesitănecesită prezenţa particulei L dar şi a unor produşi sintetizaţi în prezenţa particulei L dar şi a unor produşi sintetizaţi în

celula drojdiei purtătoarecelula drojdiei purtătoare 1,8kpb; 1-1,2 Mda; 10-12 copii/celulă1,8kpb; 1-1,2 Mda; 10-12 copii/celulă dependentdependente de 29 gene nucleare care îi conferă stabilitatee de 29 gene nucleare care îi conferă stabilitate

Inginerie geneticInginerie genetică la drojdiiă la drojdiiMaterialul genetic Materialul genetic extraextranuclear la nuclear la S. cerevisiaeS. cerevisiae

Page 84: Inginerie Genetica-2 Completat

Producerea toxinei killer:Producerea toxinei killer: Se sintetizează un precursor care posedă 3 subunităţi: Se sintetizează un precursor care posedă 3 subunităţi: αα şi şi ββ (care vor forma toxina (care vor forma toxina

propriu-zisă) şi propriu-zisă) şi γγ (care va forma factorul de imunitate) (care va forma factorul de imunitate) Secvenţa leading are afinitate pentru membrana reticulului endoplasmatic unde are Secvenţa leading are afinitate pentru membrana reticulului endoplasmatic unde are

loc prelucrarea post-translaţională (glicozilare). Toxina are 43kda şi cele două loc prelucrarea post-translaţională (glicozilare). Toxina are 43kda şi cele două subunităţi subunităţi αα şi şi ββ sunt legate prin punţi disulfidice -S-S-) sunt legate prin punţi disulfidice -S-S-)

Proteinaze specifice îndepărtează secvenţa leading şi factorul de imunitate care va Proteinaze specifice îndepărtează secvenţa leading şi factorul de imunitate care va rămâne legat de receptori specifici din membrana celulei killer.rămâne legat de receptori specifici din membrana celulei killer.

Mod de acţiune:Mod de acţiune: Toxina se leagă de receptori din peretele celular (1,6-Toxina se leagă de receptori din peretele celular (1,6-ββ D-glucan) fără consum de D-glucan) fără consum de

energie, apoi de un receptor membranarenergie, apoi de un receptor membranar Subunitatea Subunitatea αα

este transferată în interiorul celulei sensibile , este transferată în interiorul celulei sensibile , generează pori în membrana plasmatică, generează pori în membrana plasmatică, îi modifică permeabilitatea, creşte efluxul de ioni de K şi de ATP din celulă, îi modifică permeabilitatea, creşte efluxul de ioni de K şi de ATP din celulă, scade pH intracelular, scade pH intracelular, perturbă metabolismul şi celula sensibilă moare.perturbă metabolismul şi celula sensibilă moare.

Inginerie geneticInginerie genetică la drojdiiă la drojdiiMaterialul genetic Materialul genetic extraextranuclear la nuclear la S. cerevisiaeS. cerevisiae


Recommended