GENETICA BACTERIANĂ GENETICA BACTERIANĂ Ereditatea Ereditatea : însuşirea tuturor vieţuitoarelor de : însuşirea tuturor vieţuitoarelor de a transmite caracterele specifice speciei la a transmite caracterele specifice speciei la urmaşi urmaşi Variabilitatea Variabilitatea : : apariţia unor caractere diferite apariţia unor caractere diferite de cele ale genitorilor. de cele ale genitorilor. Suportul material al eredităţii Suportul material al eredităţii : : ADN. ADN. Structura şi replicarea acestuia este similiară Structura şi replicarea acestuia este similiară cu cea de la celulele eucariote. cu cea de la celulele eucariote. Proporţia de baze complementare Proporţia de baze complementare este este constantă în constantă în cadrul cadrul unei unei specii specii . . R R aportul aportul adenină-timină/guanină- adenină-timină/guanină- citozină (AT/GC) citozină (AT/GC) serveşte serveşte drept drept criteriu criteriu taxonomic taxonomic de bază în clasificarea modernă a bacteriilor .
Transcript
GENETICA BACTERIANĂGENETICA BACTERIANĂEreditateaEreditatea: însuşirea tuturor vieţuitoarelor de a : însuşirea tuturor vieţuitoarelor de a transmite caracterele specifice speciei la urmaşitransmite caracterele specifice speciei la urmaşi
VariabilitateaVariabilitatea:: apariţia unor caractere diferite de cele apariţia unor caractere diferite de cele ale genitorilor.ale genitorilor.
Suportul material al eredităţiiSuportul material al eredităţii:: ADN. ADN. Structura şi replicarea acestuia este similiară cu cea de Structura şi replicarea acestuia este similiară cu cea de la celulele eucariote.la celulele eucariote.
Proporţia de baze complementare Proporţia de baze complementare esteeste constantă în cadrul constantă în cadrul unei unei speciispecii.. RRaportul aportul adenină-timină/guanină-citozină (AT/GC)adenină-timină/guanină-citozină (AT/GC) serveşteserveşte drept drept criteriucriteriu taxonomic taxonomic de bază în clasificareade bază în clasificarea modernă a bacteriilormodernă a bacteriilor..
I.I. Organizarea materialului genetic la Organizarea materialului genetic la bacteriibacterii
RepliconiRepliconi = = formaţiuni genetice ce se replică independent
codifică informaţiile absolut necesare supravieţuirii speciei în condiţii normale
organizarea “supercoil” sau “supertwist” a ADN (dublu spiralată spre dreapta şi suprahelicată spre stânga) asigură “împachetarea” economică a ADN şi o configuraţie optimă activităţii funcţinale a ADN (replicare, transcripţie, recombinare).
2.1 Plasmidele2.1 Plasmidele : : molecule circulare de ADN molecule circulare de ADN autonome, libere în citoplasmă care se replică autonome, libere în citoplasmă care se replică independent de cromozom independent de cromozom
conjugativeconjugative - se pot transfera singure la alte bacterii - se pot transfera singure la alte bacterii (plasmidele R)(plasmidele R)
neconjugativeneconjugative - care nu pot părăsi ele însăşi bacteria de - care nu pot părăsi ele însăşi bacteria de origine, ci numai prin intermediul unui alt plasmid conjugativ sau origine, ci numai prin intermediul unui alt plasmid conjugativ sau a unui bacteriofag (de exemplu plasmidul care codifică secreţia a unui bacteriofag (de exemplu plasmidul care codifică secreţia de beta-lactamază la S.aureus)de beta-lactamază la S.aureus)
episomiepisomi,, care se pot integra prin recombinare în care se pot integra prin recombinare în cromozomul bacteriancromozomul bacterian ( (combinaţii genetice noi prin rearanjarea, combinaţii genetice noi prin rearanjarea, materialului genetic cuprins în două unităţi genetice diferitematerialului genetic cuprins în două unităţi genetice diferite)), , pierzându-şi autonomia de replicare (plasmidul F saupierzându-şi autonomia de replicare (plasmidul F sau factorul factorul dede fertilitate). fertilitate).
Contin: Contin:
determinanţii genetici esenţialideterminanţii genetici esenţiali ai ai plasmidelor codifică informaţiile legate de plasmidelor codifică informaţiile legate de replicarea lor autonomăreplicarea lor autonomă
determinanţii accesorideterminanţii accesori codifică caractere codifică caractere fenotipice neesenţiale supravieţuirii celulei fenotipice neesenţiale supravieţuirii celulei bacteriene în condiţii naturalebacteriene în condiţii naturale
• gene de transfer (gene de transfer (tratra), ), • gene de rezistenţă la antibiotice (factorul R), gene de rezistenţă la antibiotice (factorul R), • gene de secreţie a unor toxine etc. gene de secreţie a unor toxine etc.
Plasmide de interes medicalPlasmide de interes medical
A. Plasmidele de virulenţă poartă determinanţii genetici ai unor factori de virulenţă secreţia de enterotoxina (termolabilă şi
termostabilă) factorul de colonizare la Escherichia coli, hemolizina la Staphylococcus aureus, Streptococcus
faecalis şi E.coli exfoliantina la S. aureus gena de invazivitate la Shigella
B. Plasmidele R -de rezistenţă (Factorul R) sunt molecule circulare de ADN care constau în esenţă din două regiuni genetice:
genele care codifică rezistenţa la antibiotice “R”, unice sau multiple (prin aglomerarea mai multor gene de rezistenţă R, pe acelaşi plasmid, prin fenomenul transpoziţiei repetate de material genetic)
genele “FTR” care conferă plasmidului capacitatea de a se transfera
Peste 90% din tulpinile de spital prezintă o rezistenţă de tip plasmidic:
familia Enterobacteriaceae, genurile:Escherichia, Salmonella, Shigella, Proteus, Providencia, Klebsiella, Serratia genurile Pseudomonas, Acinetobacter, Vibrio, Yersinia, Pasteurella, Campylobacter, Haemophilus, Neisseria, Bacteroides, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Clostridium, şi Corynebacterium. Plasmidele prezente la bacilii gram-negativi sunt mai mari decât cele evidenţiate la bacteriile gram-pozitive.
C. Plasmidul F –plasmid de de sex – factor de fertilitate şi conţine genele de transfer”tra”
-se pot transmite prin conjugare-mediază transferul de gene de la o celulă donor la una receptor
-în funcţie de prezenţa factorului bacterii F- lipsite de factorul F, denumite celule femele şi care sunt receptoare de material genetic,
bacterii F+, masculine, care au factorul F+, autonom, ca plasmid în citoplasmă şi care sunt celule donoare, bacterii Hfr care au factorul F+ integrat în cromozom, de asemenea masculine, bacterii F ‘ care au factorul F+ ca plasmid autonom, după ce acesta a fost integrat în cromozom şi l-a părăsit rupând un fragment ADN din cromozom.
Principalele caracteristici ale Principalele caracteristici ale plasmidelorplasmidelor
2.2 2.2 BacteriofagiiBacteriofagii
virusuri care pazaritează bacteriileMorfologie. un cap hexagonal alcătuit dintr-un înveliş proteic caracteristic virusurilor (capsida) şi adăposteşte ADN un gât o prelungire numită picior (coadă). Coada este un cilindru rigid învelit într-un manşon proteic asemănător miozinei şi se termină cu o placă hexagonală ce conţine o enzimă de tipul lizozimului. De placa bazală se aprind 6 fibre cu rol în fixarea bacteriofagului pe suprafaţa bacteriei.
Tipuri de bacteriofagiTipuri de bacteriofagi Genomul faGenomul faggic pătruns în celulă duce la sinteza unor ic pătruns în celulă duce la sinteza unor
bacteriofagi identici cu cei din care a provenit ADN.bacteriofagi identici cu cei din care a provenit ADN. ADN-ul se replică –ribozomii bacterieni vor sintetiza ADN-ul se replică –ribozomii bacterieni vor sintetiza
proteinele capsidale şi ale coziiproteinele capsidale şi ale cozii Asamblarea noilor componente –bacteriofagul Asamblarea noilor componente –bacteriofagul
părăseşte celulapărăseşte celula= = bacteriofagi lbacteriofagi liticiitici sau sau virulenţi virulenţi – – fagi care se fagi care se
multiplică în interiorul celulei gazdămultiplică în interiorul celulei gazdă, , lizează celula lizează celula şi şi eliberează fagii progenieliberează fagii progeni = ciclu litic= ciclu litic
llizogeniizogeni sausau tempera temperaţiţi:: ffagagi carei care se integrează se integrează în cromozomul celulei gazdă dar care pot iniţia în cromozomul celulei gazdă dar care pot iniţia oricând un ciclu litic, expresia majorităţii genelor oricând un ciclu litic, expresia majorităţii genelor fagice fiind reprimatăfagice fiind reprimată : : profag sau fag lizogen profag sau fag lizogen
Consecinţele lizogenieiConsecinţele lizogeniei
profagul codifică el însuşi unele caractere pe care le profagul codifică el însuşi unele caractere pe care le dobândeşte bacteria lizogenădobândeşte bacteria lizogenă. .
toxigeneza la bacilul difteric toxigeneza la bacilul difteric care este codificată care este codificată de un profag ce se află în cromozomul bacterian. de un profag ce se află în cromozomul bacterian. Tulpinile de bacili difterici care nu sunt Tulpinile de bacili difterici care nu sunt lizogenizate de acest profag, nu sunt capabile să lizogenizate de acest profag, nu sunt capabile să secrete toxina şi sunt, deci, nepatogene,secrete toxina şi sunt, deci, nepatogene,
transducţiatransducţia-- transmiterea de material genetic prin transmiterea de material genetic prin intermediul bacteriofagilorintermediul bacteriofagilor
2.3 Elemente genetice transpozabile2.3 Elemente genetice transpozabileBarbara Mc Clintock, 1931, 1952, 1983(gene Barbara Mc Clintock, 1931, 1952, 1983(gene
săltăreţe)săltăreţe)•Fragmentele de inserţie (IS)Fragmentele de inserţie (IS)
fragmente mici de ADN fragmente mici de ADN (fac parte in mod (fac parte in mod normal din plasmid/cromozom)normal din plasmid/cromozom) cu limite structurale bine precizatecu limite structurale bine precizate se pot integra repetat în mai multe situsuri dintr-un se pot integra repetat în mai multe situsuri dintr-un genom. genom. Transpozoni (Tn)Transpozoni (Tn)Constau in 2 ISConstau in 2 IS conţin şi alte gene decât cele ce codifica transpoziţiaconţin şi alte gene decât cele ce codifica transpoziţia
TranspozazăABCDEFG GFEDCBA
IS ISGene de rezistenţă
IS ISGene de rezistenţă
II. Variabilitatea la bacteriiII. Variabilitatea la bacterii
Este o latură a geneticii -importantă în Este o latură a geneticii -importantă în medicina practică medicina practică
MutaţiaMutaţia Transfer de material geneticTransfer de material genetic
1. Mutaţia1. Mutaţia Modificări spontane ale genomuluiModificări spontane ale genomului (modificări ale (modificări ale
secvenţei de nucleotide din genă)produse de : raze X, secvenţei de nucleotide din genă)produse de : raze X, UV, agenţi alchilanţi, etc.UV, agenţi alchilanţi, etc. PunctiformăPunctiformă –afectează 1 nucleotid–afectează 1 nucleotid Inserţia Inserţia (adăugare a sute de nucleotide)(adăugare a sute de nucleotide) DeleţiaDeleţia (pierdere ) (pierdere )
Asigură: Asigură: rezistenţa la chimioterapice, rezistenţa la chimioterapice, structură antigenică modificată, structură antigenică modificată, pierderea unor receptori specifici pentru bacteriofagi, pierderea unor receptori specifici pentru bacteriofagi, pierderea capacităţii de sinteză a unui metabolitpierderea capacităţii de sinteză a unui metabolit
Dpdv medical: Dpdv medical: one-stepone-step:rezistenţa bruscă la AB:rezistenţa bruscă la ABmulti-stepmulti-step:bacteria devine rezistentă prin mutaţii succesive:bacteria devine rezistentă prin mutaţii succesive
--2. Transferul de material 2. Transferul de material
genetic genetic
2.1 Transformarea 2.1 Transformarea : : Reprezintă transferul de material Reprezintă transferul de material
genetic de la o celulă donor la una genetic de la o celulă donor la una receptor sub forma de ADN pur, receptor sub forma de ADN pur, eliberat fie prin liza celulei donor, fie eliberat fie prin liza celulei donor, fie prin extracţie chimică prin extracţie chimică
1928 – Fred1928 – Frederick erick Griffith. Griffith.
2. 2. Transferul de material Transferul de material geneticgenetic
se petrece nu numai între tulpinile aceleiaşi specii, ci şi între specii diferite
stare de competenţă - se modifică structura peretelui celular, care devine mai poros, încărcat electropozitiv, favorizând legarea ADN-lui străin
are loc în medii unde trăiesc mai multe specii bacteriene(colon) şi sunt puse în libertate cantităţi mai mari de de ADN
Se practică azi în tehnici de inginerie genetică
2.2 Transducţia : transfer de gene cromozomiale de la o celulă bacteriană la alta, mediat de bacteriofagi
2.2.1.Transducţia generalizată este mediată de fagii virulenţi, litici, care după pătrunderea în celula bacteriană se multiplică şi determină liza celulei gazdă. în timpul lizei celulei bacteriene cromozomul acesteia se fragmentează ocazional: un fragment cu o dimensiune apropiată de cea a genomului fagic, în locul genomului fagic. se integrează în capsida bacteriofagului aceşti fagi pot pătrunde în alte celule bacteriene injectîndu-le ADN-ul, ce provine de fapt din genomul celulei donoare. ADN-ul se va integra în cromozomul celulei receptoare prin recombinare, conferindu-i acesteia caractere noi:
rezistenţa la chimioterapice, proprietăţi ce ţin de patogenitatea bacteriei etc
Transducţia specializată: mediată de fagii temperaţi. După pătrunderea în celula bacteriană a ADN-lui bacteriofagului temperat, acesta se inseră în cromozom prin recombinare sub forma de profag În anumite condiţii are loc un proces de derepresie şi genomul bacteriofagic părăseşte cromozomul bacterian devenind din nou autonom si iniţiază un ciclu litic când părăseşte cromozomul bacterian poate detaşa din acesta un fragment de ADN care va rămâne legat de genomul bacteriofagic bacteriofagul va putea intra în altă celulă integrându-se în cromozomul acesteia tot sub forma de profag. Fragmentul provenit de la prima celulă bacteriană poate să codifice diferite caractere
rezistenţa la antibiotice, secreţia unor enzime, toxine etc., ce se vor manifesta fenotipic la noua bacterie gazdă.
2.3 Conjugarea2.3 Conjugarea
transferul de material genetic de la o transferul de material genetic de la o bacterie donoare la una receptoare printr-bacterie donoare la una receptoare printr-un proces de împerechereun proces de împerechere, ce se realizează , ce se realizează prin prin contactul direct contactul direct dintre cele două celule.dintre cele două celule.
Prin conjugare se pot transmite plasmide, Prin conjugare se pot transmite plasmide, precum şi gene cromozomiale (prin intermediul precum şi gene cromozomiale (prin intermediul factorului F+factorului F+)) ..
Factorul F+ poate fi situat pe:• plasmid –transfer conditionat de existenta genelor tra, responsabile de sinteza sex-pilului si transferul plasmidului• sau pe cromozom-transfer de gene cromozomale. Aceste celule , care au factorul F integrat in cromozom, numite Hfr (frecenta mare a recombinarii genelor de la celula donoare cu cele de la celula receptoare).
Conjugarea la BGN
F+ F+ Hfr
F+
F- F+
F-
F+
F+
F+
F+
Hfr
F- Hfr
F-
Hfr
F-Hfr
F-
Transferul prin conjugare a plasmidelor la bacilii gram negativi-
condiţionată de prezenţa genelor de transfer tra
incepe cu sinteza sex-pilului care va adera de receptori specifici prezenţi pe peretele celular al bacteriei receptoare
apoi - replicarea de transfer a plasmidului o catenă parentală de ADN va rămâne în celula
donor, iar a doua va trece în celula receptoare, pe tiparul lor sintetizându-se catene complementare.
Dpdv medical importante sunt plasmidele conjugative de rezistenţă R. Proprietăţi: spectrul de gazde: circulă între specii diferite. Acest transfer are loc şi în laborator şi în macroorganism. (s-a descris transferul de plasmide de la bacilul coli nepatogen la salmonele sau shigelle. Nu s-a observat însă transferul plasmidelor de la BGN la BGP);
• determinanţii de rezistenţă “R”: caracteristici pentru plasmidele conjugative sunt determinanţii de rezistenţă multipli. S-au evidenţiat astfel la tulpinile izolate din spital plasmide ce au factori de rezistenţă faţă de toate chimioterapicele uzuale (ampicilina, cefalosporine, streptomicina, tetraciclina, cloramfenicol, kanamycina, gentamicina, sulfonamide).
. Conjugarea la bacterii gram-pozitive
• procese de împerechere şi la bacteriile gram-pozitive • Streptococcus, Streptomyces, Clostridium
• celula receptoare produce un peptid cu mol. mică (GM=1000 daltoni) care determină sinteza unor substanţe proteice de agregare de către celula donoare cu afinitate pentru unele substanţe adezive de pe suprafaţa receptorului• se produce astfel o legătură strînsă între receptor şi donor cu formarea unei punţi intercelulare care permite transferul de material genetic.
2.4. Transpoziţia• integrarea într-un genom al unui elemente genetic transpozabil din aceeaşi moleculă de ADN sau din alta prezentă în aceeaşi celulă . •Clasa I-transpoziţia se face pe baza translocării conservative(secvenţa se mută de la donor la receptor fără reduplicarea Tn)
•IS au în jur de 1000 baze şi fac parte în mod normal din cromozom sau plasmide
•sunt prezente în mai multe copii şi flancate la cele 2 capete ale aceleiaşi baze, dar în ordine inversă•Nu conferă caracter nou celulei-pot produce modificări în expresia genelor
•Tn compuşi = 2 Is şi delimitează determinanţi de rezistenţă sau alte caractere
•Clasa II•Clasa III
•Inserţia oricărei gene între două elemente transpozabile face posibilă transferul ei prin recombinare neomologă, în aceeaşi celulă pe o moleculă de ADN neînrudită structural. •Astfel, prin transpoziţie se pot produce deleţii, inversii, transpuneri de determinanţi genetici de pe un plasmid pe altul sau chiar fuzionarea stabilă a unor repliconi compleţi, de pildă a două plasmide.•Evoluţia rezistenţei la antibiotice a bacteriilor nu poate fi concepută astăzi fără fenomenul de transpoziţie.•Mecanismele transpoziţiei sunt responsabile de formarea plasmidelor cu multirezistenţă, prin inserarea succesivă pe un plasmid a determinanţilor genetici de rezistenţă situaţi între două elemente transpozabile de pe alte plasmide.
IntegroniiIntegronii
Definitie:Definitie: sisteme de captura si sisteme de captura si expresie a genelor sub forma de casete. expresie a genelor sub forma de casete.
Casetele sunt elemente mobile capabile sa fie integrate sau excizate printr-un mecanism de recombinare specifica, mediat de o integraza.
IntegroniiIntegronii StructuraStructura: incapabili de autoreplicare, : incapabili de autoreplicare,
integronii sunt purtati pe cromozom sau integronii sunt purtati pe cromozom sau plasmid, sau pot fi vehiculati printr-un element plasmid, sau pot fi vehiculati printr-un element transpozabiltranspozabil.
Sunt constituiti dintr-o regiune 5' inclusiv o gena intI care codeaza o integraza , un site de atasament attI si un promotor.
IntegroniiIntegronii Exista mai multe clase de integroni
definite in functie de natura genelor care codifica integraza.
Trei dintre ele (clasele 1, 2 ,3) sunt bine caracterizate si sunt implicate in diseminarea rezistentei la antibiotice.
IntegroniiIntegronii
Integronii difera de transpozoni prin mai multe caracteristici: Casetele nu contin gene care sa codifice proteinele responsabile de mobilitatea lor, recombinaza este prezenta pe partea imobila a integronuluiCasetele nu sunt flancate la extremitati de secvente repetitive
Au fost descrise peste 60 de casete implicate in rezistenta la antibiotice sau antiseptice :
Studii epidemiologice demonstreaza Studii epidemiologice demonstreaza raspandirea integronilor de clasa 1 la raspandirea integronilor de clasa 1 la diferite bacterii Gram-négative : diferite bacterii Gram-négative : Entérobacterii, Pseudomonas, Vibrio, Entérobacterii, Pseudomonas, Vibrio, Acinetobacter, Campylobacter. Acinetobacter, Campylobacter.
Ingineria genetică•Existenţa Existenţa vectorilor (plasmide, bacteriofagivectorilor (plasmide, bacteriofagi şi în şi în ultimul timp descoperirea existenţei unor ultimul timp descoperirea existenţei unor transpozonitranspozoni ce ce se pot transmite de la o celulă bacteriană la alta) permite se pot transmite de la o celulă bacteriană la alta) permite transferul de gene celulei bacterienetransferul de gene celulei bacteriene,, ceea ce ceea ce consituie baza ingineriei genetice.consituie baza ingineriei genetice.•Bacteria preferată a ingineriei genetice este Bacteria preferată a ingineriei genetice este E.coliE.coli,, care care în mod natural nu este capabilă de transformare, dar în mod natural nu este capabilă de transformare, dar căreia căreia prin clonare i s-au introdus în genom cei mai prin clonare i s-au introdus în genom cei mai diverşi determinanţi genetici provenind de ladiverşi determinanţi genetici provenind de la organisme organisme îndepărtate filogenetic, cum sunt îndepărtate filogenetic, cum sunt omul şi animalele.omul şi animalele. •Prin această tehnică se introduc în genomul bacterian Prin această tehnică se introduc în genomul bacterian gene care codifică sinteza unor substanţe ca, de exemplu, gene care codifică sinteza unor substanţe ca, de exemplu, interferoni, insulină, STHinterferoni, insulină, STH etc., a căror obţinere pe cale etc., a căror obţinere pe cale chimică ar fi fie imposibilă, fie foarte costisitoarechimică ar fi fie imposibilă, fie foarte costisitoare.
Au permis apariţia unei noi discipline: diagnosticul molecular – reprezentând utilizarea probelor de acizi nucleici în diagnosticul bolilor boli infecţioase, neoplasme, boli ereditare
O altă aplicaţie : amprenta ADN - permite diferenţierea indivizilor prin utilizarea unor fragmente minuscule de ţesut sau probe de sânge
