Slide 1

Curs 3 Spectroscopia de fluorescentaLuminiscenta este emisia de radiatie luminoasa, care apare in urma revenirii moleculelor de pe nivele electronice excitate in starea fundamanetala.

In functir de natura starii excitate luminicenta se clasifica in:FluorescentaFosforescentaChemiluminiscenta - excitatia este cauzata de reactii chimice

In starile excitate de singlet, electronul din orbitalul excitat este in pereche (in opozitie de spin) cu al doilea electron din orbitalul fundamental. In consecinta, revenirea la starea fundamentala este permisa de regulile de spin si se produce rapid prin emisia unui foton. Rata de emisie a fluorescenta este tipic 108 s-1, astfel incat timpul de viata al fluorescentei este de 10 ns (10 x 10-9 s).

Fosforescenta este emisia de lumina din starea de triplet excitat, in care electronul din orbitalul excitat are aceeasi orientare de spin ca si electronul din starea fundamentala. Tranzitiile catre nivelul fundamental sunt interzise si rata de emisie este lenta (103 la 10 s-1), astfel incat timpul de viata al fosforescentei este de msec la sec.Introducere in fluorescenta

Procesele care se produc intre absorbtia si emisia luminii sunt ilustrare de diagrama Jablonski simplificata.

Nivelele electronice singlet fundamental, primul si al doilea singlet sunt reprezentate in diagrama Jablonski. Pentru fiecare dintre aceste nivele electronice poate exista un numar de nivele energetice vibrationale.

Din aceasta diagrama sunt eliminate pentru inceput, procese de tipul: stingerea fluorescentei; transferul energetic; interactiile cu solventul.

Tranzitiile intre stari sunt reprezentate prin linii verticale, pentru a ilustra natura instantanee a absorbtiei luminii.

Tranzitiile se produc intr-un timp de aprox. 10-15 sec, un timp prea scurt pentru o deplasare semnificativa a nucleelor. Acesta este principiul Frank-Condon.

Spectre de fluorescentaSpectrele de emisie sunt foarte variabile functie de:Structura chimica a fluoroforului Solventul in care este dizolvat. Spectre de fluorescentaDiagrama Jablonski simplificata

La temperatura camerei, energia termica nu este adecvata pentru a popula semnificativ starile excitate vibrationale. Absorbtia si emisia se produc cel mai adesea pentru molecule cu energie vibrationala mica. Cea mai mare diferenta energetica intre starile excitate S0 si S1 este prea mare pentru popularea S1 datorita energiei termice. Din acest motiv, se utilizeaza lumina si caldura pentru a induce fluorescenta.

Dupa absorbtia luminii, se produc mai multe procese:Un flourofor este de obicei excitat la un nivel vibrational fie din S1 fie din S2.Doar in cazuri foarte rare, moleculele in faze condensate se relaxeaza rapid la nivelul vibrational cel mai mic S1. Acest proces se numeste conversie interna si se produce de obicei in 10-12 sec sau mai putin. Avand in vedere ca timpul de viata al fluorescentei este in jurul valorii de 10-8 sec, conversia interna este deja terminata cand incepe emisia. emisia fluorescenta rezulta in general din echilibrarea termica a starilor excitate.Spectre de fluorescentaProcese: absorbtie conversie interna (IC) fluorescenta intersystem crossing (ISC) fosforescenta fluorescenta intarziata tranzitie triplettriplet relaxare vibrationala

Timpi caracteristici:absorptie: 10-15 sRelaxare vibrationala: 10-12-10-10 sintersystem crossing: 10-10-10-8 sinternal conversion: 10-11-10-9 sTimpul de viata al starii excitate: 10-10-10-7 s (fluorescenta)Timpul de viata al starii excitate :10-6 s (fosforescenta)

Fluorescenta - emisia unui foton in timpul relaxarii de la S1 la S0.Deoarece cu foarte putine exceptii (emisia de fluorescenta pentru azulena are loc de pe S2, iar pentru indol are loc simultan de pe S1 si S2) emisia de fluorescenta apare de pe S1 pe S0, ea nu depinde de lungimea de unda absorbita (presupunand ca o singura specie exista in stare fundamentala)

Tranzitia 0-0 este de obicei aceeasi pentru absorbtie si pentru fluorescenta.

Spectrul de fluorescenta este localizat la lungimi de unda mai mari (numere de unda mai mici) decat spectrul de absorbtie (legea Stokes).

Uneori spectrul de absorbtie se suprapune partial peste spectrul de fluorescenta (la temperatura camerei un numar mic de molecule se pot afla pe un nivel vibrational mai mare dect cel fundamental.

La temperatura joasa aceasta suprapunere dispare.Deplasarea StokesDeplasarea Stokes (exprimata in numere de unda) = diferenta dintre pozitia maximului de absorbtie si pozitia maximul de fluorescenta. = a - f Daca momentul de dipol a unei molecule fluorescente este mai mare in starea excitata decat in starea fundamentala, deplasarea Stokes creste odata cu polaritatea solventului.

Detectia speciilor fluorescente este mai usoara daca deplasarea Stokes este mai mare.

Lungimea radiatiei emise este mai mare deoarece energia este mai mica E = h c/l

Conversia interna reprezinta tranzitie neradiativa intre doua stari electronice de aceeasi multiplicitate.

Acest proces este urmat de o relaxare vibrationala neradiativa catre cel mai de jos nivel vibrational al starii electronice excitate. Excesul de energie vibrationala poate fi transferat solventului in timpul ciocnirii moleculelor excitate cu moleculele solventului din jur.

Cand o molecula este excitata pe un nivel de energie mai mare decat cel mai jos nivel al starii electronice excitate, relaxarea vibrationala (conversie interna daca nivelul de singlet excitat este mai mare decat S1) determina molecula excitata sa ajunga la nivelul vibrational cu v = 0 al starii de singlet S1 ntr-un timp de ordinul 10-13-10-11 s.

Este posibila si conversia interna de la S1 la S0, doar ca este mai putin eficienta decat conversia de la S2 la S1 datorita diferentei de energie mult mai mare intre S1 si S0. De la S1 la S0 pot sa apara tranzitii neradiative.Fluorescenta steady-state - spectroscopia de fluorescentailuminare constanta a probei si inregistrarea spectrelor de emisie sau de excitare

spectrele prezinta dependenta intensitatii functie de lungimea de unda

forma si intensitatea spectrelor ne ofera informatii despre starea probei studiata

In functie de mediul in care se afla un fluorofor isi poate modifica spectrul de emisie (creste/scade in intensitate, isi modifica pozitia maximului)

Factori ce influenteaza fluorescentaA. Randamentul cuantic (Quantum Yield)Cu cat randamentul cuantic este mai mare, cu atat este mai usor de observat un compus fluorescent (in special o sonda fluorescenta).Randamentul de fluorescenta este raportul dintre numarul de fotoni emisi (pe parcursul intregului timp de radiatie) si numarul de fotoni absorbiti.

B. Structura:AromaticaAtomii grei decresc fluorescentaStructurile rigide se manifesta mai puternicFluorescenta creste cand moleculele adera la suprafata

C. Temperatura si efectul de solventFluorescenta creste odata cu scaderea temperaturiiSolventii ce contin atomi grei descresc fluorescenta dar cresc fosforescenta

Instrumente de masuraInstrumente de masura

Instrumente de masura- surse de lumina

Instrumente de masura- surse de lumina

Instrumente de masura- rezolutia de culegere a spectrului

Instrumente de masura- format L si format T

Format LInstrumente de masura- format L si format TFormat T

Stingerea fluorescentei

Stingerea fluorescentei - aplicatii

F0/F=1+kSV[Q] ecuatia Stern-Volmer

KSV

PBS 0.014 mM-1Liposomes 0.007 mM-1 Quenching of Trp emission by H2O2DMPC 40 M, [indolicidin]/[DMPC]: 1/200 Stern Volmer equation:

I0/I = 1+KSVx[Q]Anizotropia fluorescentei. Polarizarea fluorescentei

Anizotropia fluorescentei

Anizotropia fluorescenteir = (I I ) / (I + 2I )

LipidT tranzitie ( oC )DMPC22.5DPPC39.6Anisotropy of DPH emission

Anisotropy of DPH emissionLipidT ( oC )DMPC22.5 DMPC+10% Chol29 DMPC+25% Chol30

Anisotropy of DPH emissionLipidT ( oC )DPPC39.7 DPPC+10% Chol39.1 DPPC+25% Chol42.1 Fluorescenta aminoacizilor aromatici

Dependenta spectrelor de fluorescenta de pH

Dependenta spectrelor de fluorescenta de solvent

Changes in Trp emission spectrum in presence of liposomes:DMPC 40 M, [indolicidin]/[DMPC]: 1/200 FRET fluorescence resonance energy transfer

dD-A < ~10nmFRET fluorescence resonance energy transfer

FRET fluorescence resonance energy transfer

FRET fluorescence resonance energy transfer

FRET fluorescence resonance energy transfer

FRET eficienta FRET E = 1-I/I0

FRET donor: triptofan; acceptor TMA-DPH

FRET donor: triptofan (gramicidina); acceptor TMA-DPH

FRET donor: triptofan (gramicidina); acceptor TMA-DPH

FRET donor: triptofan (OmpF); acceptor TMA-DPH

FRET donor: triptofan (OmpF); acceptor TMA-DPH

DonorAcceptorEnergy transfer

Energy transfer between Trp and DPHDMPC 40 M, [indolicidin]/[DMPC]: 1/200 Time- resolved spectroscopySpectroscopia rezolvata in timp (time-resolved spectroscopy) studiul proceselor dinamice in materiale si compusi chimici prin intermediul tehnicilor de spectroscopie. Cel mai adesea, procesele studiate se produc in urma iluminarii unui material, dar in principiu tehnica poate fi aplicata oricarui proces care conduce la o modificare a proprietatilor unui material. Cu ajutorul laserilor in pulsuri, este posibil sa studiem procesele care se produc intr-o scala de timp mai mica de 109 sec. Fluorescenta time-resolvedmasoara scaderi (decays) ale intensitatii fluorescentei sau ale anizotropiei functie de timp;

proba este expusa la pulsuri de lumina, durata fiecarui puls fiind mai mica decat timpul de scadere al probei;

scaderea intensitatii e inregistrata cu ajutorul unui sistem de detectare de mare viteza care permite inregistrarea intensitatii sau a anizotropiei pe o scala a timpului de ns.

Pentru un fluorofor care prezinta un singur timp de scadere , scaderea intensitatii e data de formula

Iar daca este timpul de corelare a rotatiei, atunci scaderea anizotropiei este data de:

Biomoleculele prezinta insa scaderi multi-exponentiale datorate:

Unui numar mai mare de cromofori (ex: proteinele);

Comportamentului diferit in functie de mediul in care se afla;

Transfer de energie;

Existenta unor molecule care sting fluorescenta;

Existenta mai multor forme de organizare a proteinelor (monomeri multimeri).Avantajele TRF fata de spectroscopia de fluorescenta in stare stationara:

-deosebeste mai bine intre starile fluoroforilor din proba (fiecare stare este caracterizata de t propriu si de ponderea acestuia in proba);

-se deosebeste mai usor intre stingerea statica si cea dinamica;(stingerea statica nu afecteaza t intrucat sunt inregsitrati doar fluoroforii nestinsi, in cazul stigerii dinamice intreaga populatie de fluorofori este afectata astfel incat se remarca o scadere a t mediu);

-FRET se analizeaza foarte bine prin TRF;E = 1-tDA/tD-etc.Modalitati de masurare a timpului de viata:-frequency domain TRF

Modalitati de masurare a timpului de viata:-frequency domain TRF

Modalitati de masurare a timpului de viata:-time domain TRF

idealpracticSchema TRF

Metoda de detectare a fotonilor rezolutie mare sensibilitate mare (un foton) mediere rapida datorita ratei de repetitie de ordinul MHz

Convolutie-deconvolutie

Sursele de luminaLampi cu descarcare in gaz (Mercur, Deuteriu, Xenon): consum mare de putere si disipare de caldura, produce un spot mare in proba, policromatice (300 - 800 nm) folosite in general pt steady-state;

LED-uril: putere mica, banda spectrala mica (10-100 nm), pulsuri scurte (sub ordinul ns) cu o rata de repetitie mare de la 40 pana la 100 MHz;

Laserul Ti:Safir: - putere mare, pulsuri scurte, rata de repetitie mare, banda spectrala mare ;

Laserul supercontinuu (cu lumina alba): cuprinde lungimi de unda de la 400 la 2000 nm, pulsuri scurte, rata de repetitie e fixa.

Detectori pt TRFPhoto-Multiplier Tube ( PMT): castig mare (106 sau mai mlt), sensibilitate mare;

Micro-Channel Plate PMT (MCP-PMT): placa cu sute de canale paralele, canalele au un diametru de 10 m si sunt invelite cu un material conductor; prezinta un castig mare (peste 106); asigura pulsuri rapide;

Avalanche Photodiode (APD): amplificare liniara de la 1 la 500, regiunea activa 0,1 10 mm;

Single-Photon APD (SPAPD): fotonul genereaza o avalansa in interiorul diodei, dezavantajul fiind ca dupa fiecare foton circuitul de stingere trebuie sa readuca la normal dioda; poate fi folosit doar pt numararea de fotoni;

Camere CCD: prezinta acelasi fotocatod ca si PMT prezentand o sensibilitate de detectie asemanatoare.

62

NATA (N-acetil-L-triptofanamida) prezinta o singura exponentiala de scadere (proteina cu un singur triptofan)

L(tk) este IRF functia de raspuns a instrumentului - depinde de forma pulsului de excitare si de cum este detectat de instrument

Scaderi multi-exponentiale

Amestec de indol cu p-terphenyl

Cele 2 substante prezinta timpi de viata distincti: p-terphenyl 0.93 ns

indolul 3.58 ns

Anizotropia

Ribonucleaza T1

Anizotropia monomer/tetramer

Imunoglobulina E (legatura dansil-lisina)

Modificarea anizotropiei Melitinei in urma asocierii cu alte molecule

Bibliografie:

Principles of Fluorescence Spectroscopy

Joseph Lakowicz