Metode analitice n

biochimie

Partea I

Cromatografie

Gheorghe Stoian

2

CUPRINS

Cromatografia - prezentare general ................................................................................. 7 Istoric ................................................................................................................................ 7

Clasificarea metodelor cromatografice ............................................................................. 9

CAPITOLUL I ................................................................................................................ 10

1. Aspecte teoretice ale cromatografiei de eluie pe coloan .......................................... 10 1.1 Diluia analitului ....................................................................................................... 11 1.2. Cromatogramele ....................................................................................................... 11

1.3 Efectele vitezelor de migrare i a limii zonei asupra rezoluiei cromatografice ..... 11 1.4 Viteza de migrare a solulor ..................................................................................... 12 1.4.1 Constantele de distribuie ....................................................................................... 13 1.4.2 Timpul de retenie .................................................................................................. 13 1.4.3. Relaia dintre timpul de retenie i constanta de distribuie ................................... 14 1.4.4 Viteza de migrare a solutului: factorul de retenie ................................................. 15 1.5 Vitezele relative de migrare. Factorul de selectivitate .............................................. 16

1.5.1. mprtierea zonei i eficiena coloanei ................................................................ 16 1.5.2 Forma peak-urilor cromatografice.......................................................................... 17

1.6. Metode de descriere a eficienei coloanei ................................................................ 18 1.6.1. Definiia nalimii talerului .................................................................................... 18 1.6.2. Evaluarea experimental a lui H i N .................................................................... 19 1.7. Variabilele cinetice care afecteaz mprtierea zonei cromatografice .................... 21 1.7.1. Efectul vitezei de curgere a fazei mobile .............................................................. 21

1.8. Relaia dintre nlimea talerului i variabilele coloanei .......................................... 22 1.8.1 Termenul (A) .......................................................................................................... 23

1.8.2. Termenul de difuzie longitudinal (B/u) ............................................................... 24 1.8.3. Coeficienii de transfer de mas CS i CM ............................................................. 24 1.8.4. Termenul de transfer de mas n faza staionar (CSu). ........................................ 25 1.8.5. Termenul de transfer de mas n faza mobil (CMu). ............................................ 25 1.9. Efectul vitezei fazei mobile asupra termenilor ecuaiei van Deemter ...................... 25 1.10. Metode de reducere a mprtierii zonei cromatografice ....................................... 26 1.11. Optimizarea performanelor coloanei cromatografice ............................................ 27 1.11.1. Rezoluia coloanei ............................................................................................... 27 1.11.1.1. Efectul factorilor de retenie i selectivitate asupra rezoluiei cromatografice . 28 1.11.1.2. Efectul rezoluiei asupra timpului de retenie ................................................... 29 1.11.1.3. Variabilele care afecteaz performanele unei coloane cromatografice ........... 30 1.11.1.3.1. Variaia lui N ................................................................................................. 30 1.11.1.3.2. Variaia n H .................................................................................................. 32 1.11.1.3.3. Variaia n factorul de retenie ....................................................................... 32 1.11.1.3.4. Variaia n factorul de selectivitate ................................................................ 34 1.11.2.Trena cromatografic ........................................................................................... 35 1.11.3. Problema general a eluiei ................................................................................. 38 1.12. Sumarul celor mai importante definiii i relaii n cromatografie ......................... 39 1.13. Aplicaii ale cromatografiei .................................................................................... 39 1.13.1. Analize calitative ................................................................................................. 39

1.13.2. Analize cantitative ............................................................................................... 41

1.13.2.1. Analize bazate pe nlimea peak-ului .............................................................. 41 1.13.2.2. Analize bazate pe aria peak-ului ...................................................................... 41

1.13.2.3. Calibrri i standarde ........................................................................................ 41 1.13.2.3.1. Metoda cu standard intern ............................................................................. 42

1.13.2.3.2. Metoda de normalizare a ariei ....................................................................... 42

Capitolul II ...................................................................................................................... 44

3

Cromatografia de partiie ................................................................................................ 44 2.1. Cromatografia de partiie cu faz legat ................................................................... 44 2.1.1. Tipuri de suporturi utilizate n cromatografia cu faz legat ................................. 45 2.1.2. Developarea n cromatografia de partiie .............................................................. 46 2.1.3. Selecia coloanei n separrile prin cromatografie de partiie ............................... 47 2.1.3.1. Selecia fazei mobile n cromatografia de partiie .............................................. 47 2.1.3.2. Efectul triei solventului asupra factorilor de retenie ........................................ 48 2.1.3.3. Efectul fazei mobile asupra selectivitii. ........................................................... 50 2.1.3. Aplicaii ale cromatografiei de partiie .................................................................. 51 2.1.3.1. Formarea unor derivai ai probei ........................................................................ 52 2.2. Cromatografia de excluziune molecular ................................................................. 53 2.2.1. Suporturi n cromatografia de gel filtrare .............................................................. 54

2.2.2. Aspecte teoretice ale cromatografiei de excluziune molecular ............................ 59 2.2.2.1. Curbele de selectivitate ...................................................................................... 65

2.2.2.2. Rezoluia de separare n cromatografia de excluziune molecular..................... 68 2.2.2.3. Volumul probei i dimensiunile coloanei ........................................................... 71 2.2.2.4. Selecia suportului cromatografic ....................................................................... 72 2.2.3. Aplicaii ale cromatografiei de excluziune molecular ......................................... 74 2.2.3.1.Separri de grup .................................................................................................. 82 2.2.3.2. Fracionarea cu rezoluie nalt a macromoleculelor .......................................... 84 2.2.3.3. Determinarea masei moleculare prin analize de distribuie ................................ 85 2.2.3.4. Gel filtrarea ca treapt final de purificare a proteinelor .................................... 86 2.3. Cromatografia planar lichid-lichid ......................................................................... 88 2.3.1. Cromatografia pe strat subire ............................................................................... 89 2.3.1.1. Suporturi cromatografice.................................................................................... 90

2.3.1.2. Aplicarea probei ................................................................................................. 90

2.3.1.3. Dezvoltarea plcii cromatografice...................................................................... 91 2.3.1.4. Localizarea analitului pe suportul cromatografic ............................................... 93

2.3.1.5. Performanele suporturilor de cromatografie pe strat subire ............................. 94 2.3.1.5.1. Factorul de retardare (ntrziere) ..................................................................... 94

2.3.1.5.2. Factorul de retenie .......................................................................................... 95 2.3.1.5.3. Variabilele care influeneaz factorul de retenie ............................................ 96 2.3.1.5.4. nlimea talerului cromatografic n cromatografia pe strat subire ................ 96 2.3.1.6. Aplicaii ale cromatografiei pe strat subire ....................................................... 97 2.3.1.6.1. Autentificarea unei substane prin utilizarea unei standard. ............................ 97 2.3.1.6.2. Cromatografia planar bidimensional. .......................................................... 98 2.3.1.6.3. Analize cantitative ........................................................................................... 99

2.3.1.6.4. Cromatografia planar n laboratorul clinic .................................................... 99 2.3.1.6.4.1. Aplicarea probei ......................................................................................... 101

2.3.1.6.4.2. Echilibrarea tancului cromatografic ........................................................... 101

2.3.1.6.4.3. Cromatografierea (developarea) ................................................................. 102

2.3.1.6.4.4. Evaluarea calitativ i cantitativ ............................................................... 102 2.3.1.6.4.5. Validarea rezultatelor ................................................................................. 103

2.3.1.6.5. Cromatografia cantitativ pe strat subire...................................................... 104 2.3.1.6.6. Aplicaii ale cromatografiei planare n laboratorul clinic .............................. 105 2.3.1.6.6.1. Aminoacizi ................................................................................................. 105

2.3.1.6.6.2. Acizi biliari................................................................................................. 105

2.3.1.6.6.3.Carbohidrai................................................................................................. 106 2.3.1.6.6.4. Lipide ......................................................................................................... 106

2.3.1.6.6.5. Fosfolipide ................................................................................................. 107

2.3.1.6.6.6. Porfirine ..................................................................................................... 109

2.3.1.6.6.7. Prostaglandine ............................................................................................ 109

2.3.1.6.6.8. Hormoni steroizi ......................................................................................... 110

4

2.3.1.6.6.9. Ali compui de interes clinic ..................................................................... 111 2.3.1.6.7. Studii de biodisponibilitate ............................................................................ 112

2.3.1.6.8. Aplicaii moderne ale cromatografiei planare ............................................... 113 2.3.1.6.8.1. Studiul interaciilor lipidprotein pe membrane, cu un lipid imobilizat. .. 114 2.3.1.6.8.2. Imunocolorarea membranelor de difluorur de poliviniliden. .................... 115 2.3.1.6.8.3. TLC blotting n purificarea complexelor lipidice ....................................... 116

2.3.1.6.8.4. Analize TLC blotting/MS ........................................................................... 116

2.3.1.6.8.5. Analize de legare ale microorganismelor pe membrane cu lipid imobilizat116

2.3.1.6.8.6. Studii alee interaciei lipid-protein pe membrane, cu lipid imobilizat ...... 117 2.3.2. Cromatografia pe hrtie ....................................................................................... 117

2.2.4. Gel-filtrarea pe strat subire................................................................................. 121 2.4. Cromatografia cu faz invers pe coloan ............................................................. 123 2.4.1. Principiul separrii n cromatografia de nalt rezoluie cu faz invers ............. 123 2.4.2. Coloane n cromatografia de nalt rezoluie cu faz invers .............................. 124 2.4.2.1. Suportul mpachetat ......................................................................................... 125

2.4.2.2. Faze legate ........................................................................................................ 125

2.4.2.3. Mrimea particulei ........................................................................................... 126 2.4.2.4. Mrimea porilor ............................................................................................... 126 2.4.2.5. Dimensiunile coloanei ...................................................................................... 126

2.4.3. Faza mobil ......................................................................................................... 127 2.4.3.1. Componentul organic al fazei mobile .............................................................. 130

2.4.3.2. Aditivi minori la faza mobil ........................................................................... 131 2.4.3.3. Eluia n gradient .............................................................................................. 131 2.4.4. Caracteristicile i mecanismul separrii prin cromatografie cu faz invers ....... 132 2.4.4.1. Mecanismul separrii polipeptidelor prin cromatografie cu faz invers ......... 133 2.5. Cromatografia cu perechi de ioni ........................................................................... 134

2.5.1. Controlul factorului de reteniei .......................................................................... 135 2.5.2. Alegerea condiiilor cromatografice .................................................................... 135 Capitolul III ................................................................................................................... 137

Cromatografia de adsorpie ........................................................................................... 137 3.1. Selecia solventului n cromatografia de adsorpie ................................................. 139 3.1.1. Tria solventului.................................................................................................. 139 3.1.2. Alegerea sistemelor de solveni ........................................................................... 139 3.2.3. Aplicaii ale cromatografiei de adsorbie ............................................................ 140 3.2. Cromatografia pe hidroxiapatit ............................................................................. 143 3.2.1. Concepte teoretice de baz n cromatografia pe coloane de hidroxilapatit ........ 143 3.2.2. Mecanismul legrii proteinelor la hidroxiapatit ................................................ 144 3.2.3. Separarea proteinelor pe suporturi de hidroxiapatit ........................................... 146 3.2.4. Aplicaii ale cromatografiei pe hidroxiapatit ..................................................... 148 3.3. Cromatografia de interacie hidrofob. .................................................................. 151 3.4. Cromatografie de adsorbie tiofilic ....................................................................... 155 3.5. Cromatografia de schimb ionic .............................................................................. 158

3.5.1. Echilibrul de schimb ionic................................................................................... 159

3.5.2. Factorul de capacitate a unui schimbtor de ioni ................................................ 162 3.5.3. Capacitatea schimbtorului de ioni ..................................................................... 163 3.5.5. Grupri schimbtoare de ioni .............................................................................. 164 3.5.6. Suporturi de schimbtori de ioni ......................................................................... 165 3.5.6.1. Schimbtori de ioni pe baz de dextran ............................................................ 166 3.5.6.2. Schimbtori de ioni pe baz de celuloz .......................................................... 167 3.5.6.3. Schimbtori de ioni pe baz de agaroz ........................................................... 170 3.5.7. Selecia gruprii schimbtoare de ioni ................................................................ 171 3.5.7.1. Determinarea condiiilor de start n cromatografia de schimb ionic ................ 173 3.5.7.1.1. Punctul izoelectric ......................................................................................... 173

5

3.5.7.1.2. Curbele electroforetice de titrare ................................................................... 174

3.5.7.1.3. Alegerea triei schimbtorului de ioni .......................................................... 175 3.5.7.1.4. Selecia tamponului i a triei ionice ............................................................. 175 3.5.8. Aplicaii anorganice ale cromatografiei de schimb ionic .................................... 175 3.5.9. Aplicaii organice i biochimice ale cromatografiei de schimb ionic .................. 175 3.6. Cromatografia de afinitate ...................................................................................... 177

3.6.1. Condiii de eluie n cromatografia de afinitate ................................................... 180 3.6.1.1. Eluia prin modificarea pH-ului ....................................................................... 181 3.6.1.2. Eluia prin modificarea triei ionice ................................................................. 181 3.6.1.3. Eluia prin competitivitate ................................................................................ 181 3.6.1.4. Eluia prin reducerea polaritii eluentului ....................................................... 181 3.6.1.5. Eluia cu ajutorul agenilor chaotropi ............................................................... 181 3.6.1.1.6. Eluia n gradient i n trepte ......................................................................... 182 3.6.1.7. Viteza de curgere .............................................................................................. 182

3.6.2. Componenentele mediului afin ........................................................................... 182

3.6.2.1. Matricea cromatografic. ................................................................................. 184 3.6.2.2. Ligandul ........................................................................................................... 185

3.6.2.3. Braele de orientare spaial ............................................................................. 186 3.6.3. Aspectele cinetice ale separrii prin cromatografie de afinitate .......................... 188 3.6.3.1. Eluia neselectiv prin modificarea constantei de disociere ............................. 188 3.6.3.2. Eluia selectiv sau competitiv ....................................................................... 189 3.6.3.3. Procesele cinetice de adsorbie i de desorbie ................................................. 192 3.6.4. Proiectarea mediilor afine ................................................................................... 193

3.6.4.1. Alegerea matricei cromatografice .................................................................... 194

3.6.4.2. Alegerea metodei de cuplare: ........................................................................... 195

3.6.4.2.1. Cuplarea ligandului prin intermediul gruprii amino .................................... 195 3.6.4.2.2. Suporturi activate cu bromcian...................................................................... 196

3.6.4.2.3. Cuplarea liganzilor mici prin intermediul gruprilor amino sau carboxil ..... 201 3.6.4.2.4. Cuplarea prin intermediul gruprilor hidroxi, amino sau tiol ........................ 202 3.6.4.2.4.1. Matricele epoxi-activate ............................................................................. 202

3.6.4.2.5. Cuplarea liganzilor prin intermediul gruprilor tiol ...................................... 203 3.6.4.2.5.1. Matrix-uri tiopropil activate .................................................................... 203 3.6.4.2.6. Cuplarea liganzilor prin intermediul altor grupri funcionale ..................... 204 3.6.4.3. Liganzi naturali versus liganzi sintetici ............................................................ 206

3.6.4.3.1. Liganzi naturali specifici de grup .................................................................. 207

3.6.5. Detecia direct a analitului prin cromatografie de afinitate ............................... 212 3.6.6. Extracia de afinitate ........................................................................................... 214 4.2. Cromatografia covalent ........................................................................................ 258 4.2.1. Cromatografia covalent prin interschimb Tiol-Disulfur .................................. 258 4.2.1.1. Alegerea matricei mixt disulfuric ................................................................. 259 4.2.1.1.1. Alegerea agentului de tiolare ......................................................................... 260

4.2.1.1.2. Alegerea conjugatului polimer-tiol ............................................................... 261

4.2.1.2. Aplicaii ale cromatografiei covalente prin interschimb tiol-disulfur ............. 263 4.2.1.2.1. Separarea unor proteine plasmatice prin cromatografie pe tiol-Sepharose. .. 264

4.2.1.2.2. Obinerea unor tiol peptide prin cromatografie covalent. ............................ 266 4.2.1.2.3. Studii asupra rolului gruprilor sulfhidril n structura unor enzime. ............. 268 4.2. Cromatografia covalent pe baza interaciei arsen- tiol-proteine 4.2.1. Pregtirea probei pentru cromatografiere ............................................................ 273 4.2.2. Aplicaii ale comatografiei covalente pe baza interaciei arsen- tiol-proteine ..... 274 4.2.3. Cromatografia covalent pe suport de agaroz activat cu organomercurice...... 276 4.2.3.1. Aplicaii ale cromatografiei pe geluri agaroz-organomercurice. .................... 277 4.3. Cromatografia covalent pe suport boronat ........................................................... 278 4.3.1. Interacii boronat-analit ....................................................................................... 278

6

4.3.1.1. Interacii Primare .............................................................................................. 278 4.3.1.2. Interacii secundare .......................................................................................... 279 4.3.1.2.1. Interacii hidrofobe ........................................................................................ 279 4.3.1.2.2. Interacii ionice.............................................................................................. 280 4.3.1.2.3. Legturile de hidrogen .................................................................................. 280 4.3.1.2.4. Interacii coordinative ................................................................................... 280 4.3.2. Liganzi boronat i suporturi cromatografice ....................................................... 280 4.3.2.1. Liganzi boronat ................................................................................................ 281

4.3.2.2. Suporturi solide ................................................................................................ 282

4.3.3. Aplicaii ale cromatografiei de afinitate cu ligand boronat ................................. 283 4.3.3.1. Carbohidrai ..................................................................................................... 283 4.3.3.2. Nucleozide, nucleotide i acizi nucleici ........................................................... 284 4.3.3.3. Glicoproteine i enzime .................................................................................... 285 4.3.3.4. Diverse molecule mici ...................................................................................... 288

3.8. Cromatografia de afinitate cu ion de metal imobilizat ........................................... 215

3.8.1. Utilizarea diferenelor de afinitate n interacia protein ion metalic ............... 216 3.8.1.1. Principii i metode ............................................................................................ 216 3.8.1.2. Ioni metalici utilizai n mod comun n IMAC ................................................. 216 3.8.1.3. Factorii care contribuie la legtura proteinmetal .......................................... 218 3.8.1.4. Chelatori de metale i matrix-uri polimerice de chelare ................................... 219 3.8.1.5. Factorii care guverneaz adsorbia i desorbia proteinelor ............................. 223 3.8.1.5.1. Structura chelatului i ionii de metal ............................................................. 223 3.8.1.5.1.2. Faza mobil: pH-ul, tria ionic i capacitatea de tamponare .................... 223 3.8.1.5.3. Aditivi i dezlocuitori de proteine ................................................................. 224 3.8.1.2. Cromatografia de afinitate cu metal imobilizat ca tehnic preparativ ............ 225 3.8.1.2.1. Avantajele i dezavantajele cromatografie de afinitate cu metal imobilizat.. 225 3.8.1.2.2 Purificarea proteinelor fuzionate cu secvene polihistidinice ori cu alte situsuri de

legare a metalului ................................................................................................................ 227

3.8.1.2.1.3. Purificarea unor proteine naturale care conin un situs de legare a metalului228 3.8.1.2.4. Cromatografia de afinitate pentru ion de metal: aplicaii industriale ............ 229 3.8.1.2.5. Utilizarea cromatografiei de afinitate pentru ion de metal n conjunctie cu alte tehnici

cromatografice .................................................................................................................... 230

3.8.1.2.5.1. Secvenele terminale cu afinitate pentru metal: avantaje i aplicaii .......... 230 3.8.1.2.5.2. Limitele i dificultile inseriei secvenei de afinitate .............................. 232 3.8.1.2.5.3. Alte aplicaii ale afinitii secvenelor polipeptidice fa de metal ............. 233 3.9. Cromatografia cu ioni de argint inclui .................................................................. 236 3.9.1. Principiul i mecanismul cromatografiei cu ioni de argint inclui ...................... 236 3.9.1.1. Cromatografia pe strat subire cu ioni de argint inclui.................................... 239 3.9.1.1.1. Acizi grai ..................................................................................................... 239 3.9.1.1.2. Triacilgliceroli ............................................................................................... 241

3.10. Cromatografia cu faz staionar chiral .............................................................. 242 3.10.1. Faze staionare chirale ....................................................................................... 242 3.10.1.1. Utilizatarea unor antibiotice ca faze staionare chirale ................................... 251 3.10.1.1.1. Ansamicine .................................................................................................. 251

3.10.1.1.2. Glicopeptide ................................................................................................ 252

3.10.1.1.3. Polipeptide i aminoglicozide ..................................................................... 253 3.10.1.1.4. Antibiotice macrociclice utilizate n separri chirale .................................. 254 3.10.1.2. Matrix-uri utilizate n separri de enantiomeri ............................................... 256 Glosar de termeni utilizai n cromatografie .................................................................. 290

7

CROMATOGRAFIA - PREZENTARE GENERAL

ISTORIC

Cromatografia reprezint procesul de separare a unor substane chimice prin partiia lor ntre dou medii. Un mediu, sau o faz, este staionar, n timp ce a doua este mobil; prima este solid sau lichid n timp ce a doua faz este lichid sau gazoas. Substanele care sunt n curs de separare vor fi distribuite ntre faza staionar i cea care se deplaseaz. Substanele diferite sunt distribuite n grade diferite i sunt astfel, separate unele de altele. Procesul, care poate fi att analitic ct i preparativ a avut i continu s aib un impact mare n cercetarea biochimic. Cromatografia furnizeaz mijloacele de separare a unor compui ce sunt foarte asemntori, care mai nainte nu era posibil s fie analizai prin alte metode. n unele cazuri, pot fi separai izomeri chimici similari.

Botanistul rus Mihail Semenovici Tsvett (1872-1919) este curent creditat ca

descoperitor a cromatografiei. n 1906 Tswett a publicat un articol, n revista de

specialitate Berichte der deutschen botanischen Gesellschaft n care descrie separarea

unor pigmeni vegetali pe un tub ngust de sticl, umplut cu carbonat de calciu. Pigmenii de diferite culori au fost astfel separai de pe carbonat prin eluie cu eter de petrol.

Mult mai devreme, totui, s-a descris un proces cromatografic de ctre Plinius cel Btrn (23-79 dup Cristos) n Historia Naturalis, descrie un proces egiptean (ca. 500 nainte de Cristos) de separare a unor pigmeni prin depunerea soluiei lor pe un material celulozic, precum papirusul. Aceast tehnic poate fi considerat a fi foa rte aproape de cromatografia pe hrtie. n 1855 chimistul german F. F. Runge descrie

cromatografia pe hrtie i include ilustraii ale cromatogramelor n lucrarea sa, Der Bildunystrieb der Stoffe.

Aceste metode au fost tratate cu mic atenie pn la anunarea, n 1931 de ctre Richard Kuhn i Edgar Lederer a separrii a dou componente din carotenul cristalizat, privit pn n acel moment drept un singur compus chimic, prin cromatografie de adsorbie.

Mihail Semenovici Tsvett (1872-1919)

8

Explozia real n utilizarea cromatografiei a nceput totui n 1941 odat cu publicarea teoriei cromatografiei de partiie de ctre Archer John Porter Martin i Richard Laurence Millington Synge, urmat de descrierea cromatografiei pe hrtie de ctre R. Consden, A. H. Gordon i A. J. P. Martin. Cromatografia pe hrtie (PC), prin care se separ compui prin trecerea unui solvent printr-o bucat de hrtie de filtru pe care s-a aplicat proba, s-a dezvoltat rapid n anii 50 alturi de cromatografia gaz-lichid (GLC), prin care se separ compui gazoi sau volatili pe o coloan ngust umplut cu un adsorbent. Cromatografia n strat subire (thin-layer chromatography, TLC), prin care se separ compui prin trecerea unui solvent printr-un strat subire de o grosime submilimetric, ntins pe un suport precum placa de sticl a fost dezvoltat n anii 60. Cromatografia lichid de nalt performan (high performance liquid chromatography, HPLC), tehnic care se separ compui prin introducerea probei ntr-o coloan ngust ncrcat cu adsorbent i forarea eluiei sale prin presiune a fost dezvoltat n deceniul al aptelea. Cromatografia pe hrtie i mai ales cea n strat subire sunt nc utilizate, fiind deseori preferate cromatografiei gaz-lichid i cromatografiei lichide de nalt performan din cauza marii lor puteri n separarea efectiv, cu echipamente ieftine i costuri sczute.

Principala aplicaie a cromatografiei este cea de separare a unor amestecuri de compui n scopuri analitice sau preparative. Procesul de cromatografie poate de asemenea servi la identificarea, izolarea, purificarea i cuantificarea unor compui individual separai. n plus, aceste procese cromatografice pot fi aplicate n determinarea omogenitii unor substane chimice, determinarea structurii moleculare, determinarea produilor de reacie i a proceselor care le nsoesc.

Dup cum s-a artat, cromatografia cuprinde un grup important i diversificat de metode care permit cercettorului separarea unor componeni foarte apropiai (nrudii) dintr-un amestec complex de substane (de componente), multe dintre aceste separri nefiind posibile prin alte tehnici. n toate separrile cromatografice proba este transportat ntr-o faz mobil, care poate fi un gaz, un lichid sau un fluid n stare supercritic. Aceasta faz mobil este forat s traverseze o faz nemiscibil, faz staionar, care se gsete ntr-o coloan sau pe o suprafa solid. Cele dou faze sunt alese n aa fel nct proba s se distribuie ntre faza mobil i cea staionar n proporii diferite. Componentele care sunt mai puternic reinute de ctre faza staionar se vor mica i vor curge mai lent cu faza mobil. Din contr, componentele uor legate de ctre faza staionar vor traversa aceast faz mai rapid. Drept consecin a acestor diferene n mobilitate, componentele probei se vor separa n benzi ori zone discrete, care pot fi analizate calitativ i/sau cantitativ.

Termenul de migrare utilizat n cromatografie reprezint o descriere generic a micrii moleculelor n cromatografie i el nu trebuie confundat cu migrarea unei specii ionice sub aciunea unui cmp electric, fenomen care va fi abordat n detaliu ntr-un alt volum.

9

CLASIFICAREA METODELOR CROMATOGRAFICE

Metodele cromatografice pot fi clasificate innd cont de dou criterii. Prima clasificare este bazat pe metoda fizic prin care fazele mobil i staionar vin n contact. Astfel, n cromatografia pe coloan, faza staionar este reinut ntr-un tub ngust, prin care faza mobil este forat s treac. n cromatografia planar, faza staionar este depus pe un suport, n interstiiile unui material poros (de tipul hrtiei de filtru, ca exemplu). n acest caz, faza mobil se mic prin faza staionar datorit forei capilare, sub influena forei gravitaionale. Se poate remarca c echilibrele care apar n cazul celor dou tipuri de cromatografii au baze teoretice apropiate, teoriile dezvoltate n cazul uneia dintre cele dou metode putnd fi formalizate asemntor i uor adaptate la cealalt tehnic cromatografic.

Tabelul 1.1 Clasificare metodelorde cromatografie pe coloan

Clasificarea general Metod

specific

Faza staionar Tipul de echilibru

Cromatografie lichid (LC) (faza mobil este un lichid)

Lichid -

lichid, sau partiie Lichid adsorbit pe

un solid

Partiie ntre dou lichide nemiscibile

Faz lichid legat

Specii organice

legate la o suprafa solid

Partiie ntre lichid i suprafaa legat

Lichid - solid,

sau adsorbie Solid Adsorbie

Schimbtor de ioni

Excluziune

molecular

Rini schimbtoare de ioni

Lichid n

interstiiile unui polimer solid

Schimb ionic

Partiie/sitare

Cromatografia de gaze

(GC) (faza mobil este un gaz) Gaz-lichid Lichid adsorbit pe

un solid

Partiie ntre gaz i lichid

Faza gazoas, legat

Specii organice

legate la suprafaa solid

Partiie ntre gaz i suprafaa legat

Gaz - solid Solid Adsorbie Cromatografia de fluide

supercritice (SFC) (faza mobil este un fluid supercritic)

Specii organice

legate la o suprafa solid

Partiie ntre fluidul supercritic i suprafaa legat

O clasificare mult mai fundamentat a metodelor cromatografice se bazeaz pe tipul fazelor mobile i staionare i tipul de echilibru stabilit n transferul soluturilor ntre cele dou faze. Tabelul 1.1 prezint cele trei categorii generale de cromatografie: cromatografie lichid, gaz cromatografia i cromatografia de fluide supercritice. Dup denumirea fiecreia, fazele mobile n cele trei tehnici sunt lichide, gazoase ori de lichide supercritice. Dup cum se observ n tabel, o serie de metode specifice cromatografice se pot mpri n una dintre primele dou categorii.

Este demn de remarcat ca numai cromatografia lichid, se poate realiza att n coloane ct i pe suprafee planare; gaz cromatografia i cromatografia de fluide supercritice, pe de alt parte sunt restricionate la cromatografia de coloan, care conine faza mobil.

10

CAPITOLUL I

1. ASPECTE TEORETICE ALE CROMATOGRAFIEI DE ELUIE PE COLOAN

n figura 1.1 este prezentat schematic modul prin care dou substane, notate A i B sunt separate prin cromatografie de eluie pe o coloan, cu faz mobil lichid. Eluia implic splarea, trecerea speciilor (substanelor A i B, n spe) prin coloan, la adugarea continu de solvent (faz mobil) proaspt. Dup cum se observ, o poriune unic de prob este introdus la captul superior al coloanei (timpul to n figura 1.1), dup care componentele probei se distribuie independent, ntre cele dou faze.

Figura 1.1. Reprezentarea schematic a unui proces cromatografic de separare a unui amestec de dou componente, A i B prin cromatografie de eluie prin coloan (a). Semnalul

nregistrat de ctre un detector (b) n funcie de evoluia eluiei prin coloana prezentat n panelul a.

Introducerea unui volum adiional de faz mobil (de eluent) foreaz volumul de solvent care conine o parte a probei s coboare prin coloan, unde, se stabilete o nou partiie ntre faza mobil i cea staionar (timpul t1). Simultan cu aceasta se stabilete o nou partiie ntre solventul proaspt (faza mobil nou adugat) i faza staionar la locul iniial de adugare a probei.

Adugarea unor noi volume de solvent va avea ca efect coborrea moleculelor de solut spre captul de jos al coloanei printr-o serie continu de transferuri ntre faza mobil i cea staionar. Cum micarea solutului se poate realiza numai prin intermediul fazei mobile, viteza medie cu care zona (banda) solutului migreaz n josul coloanei depinde de fracia

11

de timp n care solutul este reinut de ctre aceast faz. Aceast fracie este mic pentru componenta mai puternic reinut de ctre faza staionar (compusul B, din figur) i este mare n cazul n care retenia n faza mobil este mai adecvat (componenta A). n mod ideal, diferenele rezultate n vitezele diferite conduc la separarea componentelor dintr-un amestec n benzi sau zone localizate de-a lungul coloanei (timpul t3 din figur). Izolarea i deci separarea speciilor A i B este urmarea trecerii unei cantiti suficiente de faz mobil prin coloan i care conduce la o separare individual de zone clar distribuite ce pot fi colectate ori detectate (timpii t3 i t4 din figur).

1.1 DILUIA ANALITULUI

Figura 1.1 ilustreaz o caracteristic important a procesului de separare, denumit diluia analitului fenomen care nsoete aproape ntotdeauna separrile cromatografice. Astfel, mrimea zonei originale care conine analiii din figur este notabil mai mic dect cele dou zone care conin componentele A i B i care ajung n zona detectorului. Acest fenomen semnificativ de diluare se manifest odat cu separarea componentelor i din aceast cauz, detectorii utilizai pentru separarea analiilor trebuie adesea s prezinte o sensibilitate mai mare dect cea care ar fi dorit dac procesul de separare nu ar fi necesar.

1.2. CROMATOGRAMELE

Dac un detector care rspunde la o modificare de concentraie a solutului este plasat la captul terminal al coloanei iar semnalul su este reprezentat grafic n funcie de timp (sau de volumul de faz mobil adugat) se obin o serie de peak-uri, prezentate n figura 1b. Asemenea reprezentri grafice poart numele de cromatograme, care sunt utilizate att n cromatografia analitic ct i n cea preparativ. Poziia peak-urilor pe axa timpului poate servi la identificarea componentelor din prob, aria fiecruia conducnd la determinarea cantitativ a fiecrui component.

1.3 EFECTELE VITEZELOR DE MIGRARE I A LIMII ZONEI ASUPRA REZOLUIEI CROMATOGRAFICE

Figura 1.2 arat profilurile concentraiilor soluilor A i B la dou etape diferite de eluie: o etap timpurie (momentul t1) i o etap spre final (momentul t2) prezentate in coloana cromatografic din figura 1.1. Se poate observa c poziiile benzilor A i B prezentate n profilurile de concentraie par a fi n ordine invers fa de cromatograma prezentat n figura 1.1 (b).

Figura 1.2. Profilurile de concentraie ale benzilor de analii A i B, la timpi diferii de migrare le-a lungul coloanei prezentate n figura 1. Timpii t1 i t2 sunt indicai n figura 1.

12

Diferena rezult din faptul c n figura 1.1 (b) abcisa reprezint distana de-a lungul coloanei, n timp ce n figura 1.2 reprezint timpul. n plus, n figura 1.1 (b), frontul peak-ului este reprezentat n partea dreapt, n timp ce trena sa este prezentat n partea stng. Revenind la figura 1.2, se poate spune ca specia B este mai puternic reinut i din aceast cauz componentul B ntrzie mai mult pe coloan pe parcursul migrrii. Aceast ntrziere n coborre conduce la creterea distanei dintre cele dou zone. La acelai interval de timp, are loc aceeai lrgire a zonelor celor dou componente, fenomen ce scade eficiena coloanei cromatografice. Cum lrgirea zonei este inevitabil, se pot alege condiiile n aa fel ca acest fenomen s se manifeste ct mai lent odat cu separarea benzilor. Astfel, dup cum se observ i n figura 1.1, o separare complet i de aici o rezoluie bun, se realizeaz adesea n condiiile n care lungimea coloanei este suficient de mare.

Figura 1.3 prezint dou metode de mbuntire a separrii n cazul unui amestec ipotetic de dou componente (1.3 a). n figura 1.3 b condiiile au fost modificate astfel nct primul component se deplaseaz mai repede n josul coloanei cu vitez mai mare n timp ce al doilea se deplaseaz mai ncet.

Figura 1.3. Ilustrarea a dou metode de mbuntire a separrii cromatografice a dou componente: (a) cromatograma original cu cele dou peak-uri suprapuse; mbuntirea separrii prin (b) creterea separrii benzilor cromatografice i (c) prin scderea mprtierii benzii cromatografice.

n al treilea panel (c) al figurii 1.3 vitezele de mprtiere a celor dou zone au fost micorate. Ambele metode conduc la o separare mai distinct a celor dou componente. Variabilele i factorii care influeneaz viteza de migrare relativ a tonelor de solut prin faza staionar vor fi prezentate n detaliu.

1.4 VITEZA DE MIGRARE A SOLULOR

Eficiena unei coloane cromatografice n separarea a doi solui depinde, n parte, de vitezele relative cu care cei doi compui sunt eluai. Aceste viteze sunt determinate de magnitudinea constantelor de echilibru ale reaciei prin care soluii se distribuie independent ntre faza mobil i cea staionar.

13

1.4.1 CONSTANTELE DE DISTRIBUIE

Adeseori, echilibrele de distribuie implicate n cromatografie sunt descrise de ctre ecuaii care implic transferul unui analit ntre fazele mobil i staionar. Astfel, pentru speciile A de solut se poate scrie urmtorul echilibru al procesului de adsorbie-desorbie:

Constanta de echilibru, K, pentru aceast reacie este numit constant de distribuie, raport de partiie sau coeficient de partiie Comisia de Nomenclatur Analitic a IUPAC pentru cromatografie recomand utilizarea termenului de constant de distribuie, Kc n loc de vechiul termen n loc de vechiul termen de coeficient de partiie sau raport de partiie, K. n lucrarea de fa, se va utiliza n continuare termenul de constant de distribuie dar simbolul utilizat este K. n literatura de specialitate ambii termeni sunt nc utilizai. Constanta K este definit conform formulei:

K=CMCS

1.1( )

unde CS reprezint concentraia molar a solutului din faza staionar iar CM este concentraia molar din faza mobil. n mod ideal, K este constant n tot domeniul de concentraii al solutului; iar CS este proporional cu CM. Tipul de cromatografia n care se aplic ecuaia (1.1) poart denumirea de cromatografie linear iar rezultanta ei este caracterizat printr-o simetrie de tip Gauss a peak-urilor i a timpilor de retenie, parametrii care sunt independeni de cantitatea de analit supus analizei. n general, studiile teoretice se limiteaz la o astfel de cromatografie linear.

1.4.2 TIMPUL DE RETENIE

Figura 1.4 reprezint generic o cromatogram pentru o prob ce conine un singur analit. Timpul necesar probei de a parcurge distana dintre momentul inoculrii pn la detecia semnalului su de detector este numit timp de retenie, fiind simbolizat prin tR. Peak-ul prezentat n partea din stnga cromatogramei este dat de speciile care nu sunt

reinute de ctre coloan. Adesea, proba sau faza mobil conine specii ce nu sunt reinute n pe parcursul migrrii pe coloan. Astfel de specii care nu interacioneaz cu faza staionar sunt de real folos n identificarea peak-ului analitului de interes.

Figura 1.4. O cromatogram tipic pentru dou componente prezente

ntr-un amestec. Peak-ul mic din

stnga reprezint o specie care nu este reinut pe coloan i a crei semnal apare la detector aproape

imediat dup ce eluia a fost nceput.

Astfel, timpul su de eluie (tM) este aproximativ egal cu timpul necesar

fazei mobile s treac prin coloan.

Afaz mobil Afaz stationar

14

Timpul necesar speciilor nereinute s ajung la detector se noteaz cu tM i se numete timp mort. Viteza de migrare a speciilor nereinute este n acelai domeniu cu viteza de micare a moleculelor fazei mobile.

Viteza linear medie de migrare a solutului ( ) este dat de relaia:

unde L este lungimea coloanei mpachetate.

n mod similar, viteza medie linear de micare a unei molecule de faz mobil (u) este dat de relaia:

unde tM reprezint timpul mort, timpul necesar pentru ca o molecul medie de faz mobil s treac prin coloan. De exemplu, dac o coloan are un volum total de 100 ml iar faza staionar ocup 40 ml, rezult c faza mobil ocup un volum de 60 ml. Dac faza mobil curge cu o vitez de 5 ml/min, se poate calcula c sunt necesare 12 minute pentru ca faza mobil s traverseze coloana, de la injector la detectorul situat la captul terminal al coloanei. Uneori, tM poate fi determinat prin identificarea unui mic peak la nceputul

cromatogramei, rezultat dintr-o uoar diferen dat de solventul care provine din faza mobil ce conine proba adugat. De asemenea tM poate fi determinat prin msurarea timpului de eluie a unei probe care nu este reinut absolut de loc de ctre faza staionar. n cazul unei rini schimbtoare de ioni cationice, pentru a se determina tM, se poate utiliza o protein cu sarcin negativ.

Se notabil de artat c exist i ali factori precum lungimea i diametrul tubului care conecteaz injectorul i detectorul la coloan care pot afecta valorile tM.

Practic, considernd o coloan mpachetat de 25 cm lungime, cu un diametru interior

de 1 cm, volumul total al coloanei este de 19,6 ml (V= r2 L = 3,14 0,52 25cm). Dac faza mobil ocup 60% din volumul coloanei, volumul spaiului gol, care definete timpul mort este egal cu 11,8 ml. El reprezint volumul spaiului gol, denumit void volume = V0

1.4.3. RELAIA DINTRE TIMPUL DE RETENIE I CONSTANTA DE DISTRIBUIE

n scopul prezentrii relaiei dintre timpul de retenie al solutului i constanta sa de distribuie, se poate exprima viteza de migrare drept o fracie a vitezei fazei mobile:

Aceast fracie este egal cu numrul mediu de moli de solut din faza mobil, la un moment dat, raportat la numrul de moli totali de solut din coloan, conform urmtoarei relaii:

=LtR

(1.2)

(1.3)tL

=uM

= u X fractia de timp petrecut de solut n faza mobil

moli de solut din faza mobil= u X numr total de moli de solut

15

Numrul total de moli de solut din faza mobil este egal cu concentraia molar a solutului din faza mobil, cM, multiplicat cu volumul acestei faze, VM.

n mod similar, numrul de moli de solut din faza staionar este dat de produsul concentraiei cS de solut din faza staionar, multiplicat cu volumul su din aceeai faz, VS.

Astfel se poate scrie:

Prin substituirea ecuaiei 1.1 n aceast ecuaie se obine viteza de migrare a solutului ca funcie de constanta de distribuie i ca funcie de volumele fazelor staionare i mobile:

Cele dou volume pot fi estimate prin metode specifice fiecrui tip de cromatografie.

1.4.4 VITEZA DE MIGRARE A SOLUTULUI: FACTORUL DE RETENIE

Factorul de retenie, sau factorul de capacitate reprezint un parametru important care este general utilizat n descrierea vitezelor de migrare a soluturilor pe coloan. Pentru un solut A, factorul de retenie kA este definit ca:

unde KA reprezint constanta de distribuie a speciei A. Comisia IUPAC de Nomenclatur Analitic recomand denumirea de factor de retenie

k', ns denumirea de factor de capacitate este nc utilizat n literatura de specialitate. Prin substituia ecuaiei 1.5 n ecuaia 1.4 rezult:

n scopul de a defini modalitatea prin care se poate determina kA dintr-o cromatogram, se vor substitui ecuaiile 1.2 i 1.3 n ecuaia 1.6, ceea ce conduce la:

Prin rearanjarea acestei ecuaii se obine:

16

Dup cum se observ n figura 1.4, tR i tM sunt uor de obinut dintr-o cromatogram. n condiiile unui factor de retenie pentru un solut mult mai mic dect unitatea, eluia se realizeaz mai rapid i din aceast este dificil a se determina timpii de retenie cu acuratee. n condiiile n care factorul de retenie este de ordinul zecilor (de exemplu 20 sau 30), timpii de eluie devin anormal de mari. Ideal, separarea se efectueaz n condiiile unor factori de retenie cuprini ntre 2 i 10.

1.5 VITEZELE RELATIVE DE MIGRARE. FACTORUL DE SELECTIVITATE

Factorul de selectivitate al unei coloane () pentru dou specii, A i B este definit prin formula:

unde KB reprezint constanta de distribuie a speciei B, mai puternic reinut pe

coloan, n timp ce KA reprezint constanta de distribuie a speciei A, mai puin reinut pe

coloan, i mai rapid eluat de pe aceasta. Prin definiie, este ntotdeauna mai mare dect unitatea.

Prin substituirea ecuaiei 1.5 i a ecuaiei analoage pentru solutul B n ecuaia 1.9 se obine, dup la rearanjare, relaia de legtur ntre factorul de selectivitate pentru cei doi solui i factorii lor de retenie:

unde k'B i k'A reprezint factorii de retenie ai solutului B, respectiv A. Substituia n ecuaia 1.8 pentru cei doi solui din ecuaia 1.10 conduce la o expresie ce permite

determinarea experimental lui dintr-o cromatogram:

n capitolele urmtoare se va arta cum se pot utiliza factorii de selectivitate i retenie, la rezolvarea problemelor referitoare la caracterizarea unei coloane cromatografice.

1.5.1 MPRTIEREA ZONEI I EFICIENA COLOANEI

Teoria dinamic, sau teoria cinetic a cromatografiei explic cu succes n termeni cantitativi formele peak-urilor cromatografice i efectele diverselor variabile implicate n lirea acestor peak-uri. O discuie detailat a acestei teorii se bazeaz pe mecanismul de repartiie aleatorie, putndu-se da o imagine calitativ a zonelor cromatografice i care

17

conduce la analiza modului de mprtiere a zonelor n condiiile deplasrii moleculelor de solut de-a lungul unei coloane. nelegerea acestor fenomene au ca rezultat identificarea variabilelor ce conduc la creterea eficienei coloanei i la reducerea mprtierii zonelor cromatografice.

1.5.2 FORMA PEAK-URILOR CROMATOGRAFICE

Examinarea peak-urilor dintr-o cromatogram (figurile 1.1 i 1.4) sau a benzilor pe coloan (figura 1.2) relev o similaritate a erorilor normale, repartiia realizndu-se dup un profil Gaussian, care sunt obinute n condiiile reprezentrii grafice a valorilor determinate funcie de frecvena repartiiei a acestora. n unele cazuri, peak-urile cromatografice nu sunt lineare, manifestnd o coad (tren) sau un front. n primul caz, trena peak-ului care apare n dreapta cromatogramei este prelung, n timp ce frontul acestuia este abrupt. n cel de-al doilea caz, forma cromatogramei este inversat, adic frontul este prelung n timp ce trena este extrem de scurt. Cauza comun a apariiei frontului sau a trenei o reprezint existena unei constante de distribuie neliniare. Frontul apare de asemenea n cazul elurii unei cantiti mari de prob pe coloan. Distorsiunile de acest fel sunt nedorite deoarece conduc la separri de proast calitate i la timpi de eluie cu reproductibilitate sczut. n abordarea teoretic se consider ca fenomenul de front sau coad cromatografic este absent sau minim.

Dup cum se cunoate, curbele de erori normale pot fi raionalizate prin asumarea faptului c incertitudinea asociat cu orice msurtoare singular reprezint nsumarea unui numr mult mai mare de erori mici, individuale nedetectabile i de repartiii ntmpltoare, fiecare dintre acesta avnd o probabilitate egal, pozitiv sau negativ. Cea mai comun manifestare a acestor incertitudini este reprezentat de anularea uneia de ctre cealalt, ceea ce conduce la o valoare medie. Cu o mic probabilitate, nsumarea poate conduce la un rezultat mai mare sau mai mic dect media. Drept consecin, distribuia valorilor este simetric, n jurul valorii medii. n mod similar, forma Gaussian a unei zone cromatografice ideale poate fi atribuit combinrii aditive a micrilor ntmpltoare a moleculelor de solut n zona cromatografic.

Este instructiv, n primul rnd, s considerm comportamentul unei molecule de solut, care n timpul migrrii, trece prin mii de transferuri ntre faza staionar i cea mobil. Timpul petrecut n fiecare faz de transfer este deosebit de neuniform, depinznd de ctigul accidental de energie termic din mediul nconjurtor pentru a realiza un transfer reversibil, n cealalt faz. Astfel, n unele cazuri, timpul de edere ntr-o faz dat, poate fi tranzitoriu, n timp ce n alte faze perioada poate fi relativ mai lung. Reamintim c molecula este eluat numai n timpul ederii sale n faza mobil, iar ca rezultat, migrarea sa n josul coloanei este total neuniform. Din cauza timpilor variabili de edere, viteza medie cu care moleculele individuale se mic relativ n faza mobil variaz n mod considerabil. Anumite particule individuale traverseaz mai rapid n virtutea includerii lor accidentale n faza mobil, majoritatea timpului de eluie. Altele, din contr, pot prezenta ntrzieri datorit includerii lor n faza staionar, timp mai ndelungat dect timpul mediu de eluie. Consecina acestor procese aleatoare are ca efect o mprtiere simetric a vitezelor n jurul valorii medii, iar acesta reprezint comportamentul mediu al moleculei.

Limea benzii componentului separat crete odat cu coborrea lui de-a lungul coloanei, datorit faptului c o cretere a timpului de eluie permite manifestarea unei mai mari mprtieri. Astfel, limea zonei este n relaie direct cu timpul de edere n coloan i n relaie invers cu viteza de curgere a fazei mobile.

18

1.6. METODE DE DESCRIERE A EFICIENEI COLOANEI

n msurarea cantitativ a eficienei unei coloane cromatografice n general sunt utilizai doi termeni nrudii: (1) nlimea talerului teoretic, H i (2) numrul de talere teoretice, N. Cei doi parametrii sunt asociai prin ecuaia:

N = L/H (1.12)

unde L reprezint lungimea coloanei mpachetate (dat de obicei n centimetrii). Eficiena coloanelor cromatografice crete cu numrul de talere teoretice: cu ct numrul de talere teoretice este mai mare i nlimea talerului teoretic devine mai mic. Sunt ntlnite diferene enorme n eficiena unei coloane, datorit diferenelor dintre tipul de coloan i fazele mobil, respectiv staionar, utilizate. n mod curent, eficiena unei coloane n termen de numr de talere teoretice, poate varia ntre cteva sute pn la mii, iar domeniul nlimii talerelor variind ntre zecimi pn la miimi de centimetrii sau mai mici.

Introducerea termenilor de nlime a talerului i a numrului de talere este datorat studiilor teoretice ale lui Martin i Synge care au tratat coloana cromatografic similar coloanei de distilare, unde au loc o multitudine de procese discrete dar continue, n straturi

nguste, denumite talere teoretice. S-a considerat c la nivelul fiecrui taler, are loc un echilibru ntre faza mobil i cea staionar. Micarea solutului n josul coloanei a fost apoi tratat ca o treapt de transfer ntre faza mobil n echilibru i urmtorul taler situat mai jos.

Teoria talerului teoretic a fost aplicat cu succes la forma Gaussian a peak-urilor cromatografice i la viteza de migrare a solutului de-a lungul coloanei cromatografice. Ea a fost n final abandonat totui, deoarece nu a reuit sa rspund la explicarea modului de mprtiere a zonei. Cu toate acestea, termenii originali utilizai la descrierea eficienei unei coloane au fost pstrai n teoria vitezei de migrare. Aceast nomenclatur este uneori neadecvat din cauza tendinei de a perpetua mitul prezenei unor talere n coloana cromatografic, la nivelul crora se realizeaz echilibrul ntre faze. De fapt, starea de echilibru, nu se realizeaz niciodat deoarece faza mobil este ntr-o permanent i constant micare.

1.6.1 DEFINIIA NALIMII TALERULUI

Dup cum se cunoate, limea curbei Gaussiene este ntr-o relaie direct cu variana

2, sau cu deviaia standard , a unei msurtori. Cum benzile cromatografice sunt n general considerate a avea astfel de form, este convenabil s definim eficiena unei coloane n termen de varian pe unitate de lungime a coloanei. Astfel, nlimea talerului, H, este dat de relaia:

Aceast definiie a nlimii talerului este ilustrat n figura 1.5. Dup cum se observ, coloana este mpachetat pe o distan de L centimetrii, n lungime (panelul a).

19

Figura 1.5. Rperezentarea grafic

a definiiei talerului teoretic. H = 2/ L

n partea superioar a figurii (panelul b) este reprezentat schematic, distribuia moleculelor de-a lungul colanei cromatografice mpachetate, n momentul n care analitul

prsete coloana (acesta este din punct de vedere al timpului, timpul de retenie, tR).

Modelul curbei este Gaussian, iar localizrile parametrilor L-l i L + l sunt indicate prin linie punctat vertical.

De notat faptul c L este dat n centimetrii, iar variana, 2, este explicitat n centimetrii ptrai iar H reprezint o distan linear, exprimat n centimetrii (ecuaia 1.13).

nlimea talerului poate fi gndit ca o poriune de coloan, situat la captul

terminal care conine fracia de analit situat ntre L-l i L. Cum aria, n domeniul normal de eroare a curbei este limitat de , fiind de aproximativ 68% din aria total, nlimea talerului prin definiie conine aproximativ 34% din analit.

1.6.2 EVALUAREA EXPERIMENTAL A LUI H I N

Figura 1.6 reprezint o cromatogram tipic n funcie de timp. Variana peak-ului de solut poate fi obinut printr-un procedeu grafic simplu, i are ca unitate de msur secunde

la ptrat, fiind n mod uzual notat cu 2, pentru a o distinge de 2, care are ca unitate de

msur centimetrii ptrai. Cele dou deviaii standard, i sunt legate prin relaia:

unde L/tR reprezint viteza linear medie l solutului, exprimat n centimetrii pe secund.

Figura 1.6 ilustreaz modul simplu de aproximare al lui i dintr-o cromatogram obinut experimental. Tangentele punctelor de inflexiune de pe cele dou pri ale peak-ului cromatografic sunt prelungite pn la intersectarea lor i se formeaz astfel un triunghi

20

cu baza pe axa timpului a cromatogramei. Aria acestui triunghi reprezint aproximativ 96% din aria total a peak-ului.

Figura 1.6. Determinarea deviaiei

standard, , din peak-ul

cromatografic: W = 4.

n evaluarea statistic, se consider c aproximativ 96% din aria peak-ului Gaussian este inclus n interiorul suprafeei cu o aproximaie de plus sau minus dou deviaii

standard (2) din valoarea sa maxim. Astfel, intercepiile artate n figura 1.6 se

manifest la aproximativ 2 din maximum, iar W = 4, unde W este mrimea bazei triunghiului. Substituind aceast relaie n ecuaia 1.14 i rearanjnd termenii, rezult:

Substituia acestei ecuaii de deviaie standard () n ecuaia nlimii talerului (ecuaia 1.13) conduce la:

Prin substituia formulei 1.16 n formula 1.12 urmat de rearanjarea termenilor, se obine formula de calcul al numrului de talere teoretice, N:

n continuare, N poate fi calculat din msurarea, la dou momente de timp, tR i W; iar pentru a obine H, lungimea coloanei mpachetate trebuie s fie de asemenea cunoscut..

O alt metod de aproximare a lui N, i care este considerat de ctre unii practicieni mai sigur, necesit determinarea a W1/2 (jumtate din limea bazei peak-ului), Iar numrul de talere este dat de formula:

21

Numrul de talere i nlimea talerului sunt general utilizate n literatur i n caracterizarea unor coloane produse de ctre firmele de specialitate, ca msur a performanei acestora. Din cauza faptului c aceti parametrii sunt semnificativi n compararea a dou coloane, este esenial ca ei s fie determinai pentru acelai compus.

1.7 VARIABILELE CINETICE CARE AFECTEAZ MPRTIEREA ZONEI CROMATOGRAFICE

Dup cum s-a artat, mprtierea zonei cromatografice este consecina unei rate finite de procese de transfer de mas care se produc n timpul migrrii solutului, de-a lungul unei coloane cromatografice. O parte dintre aceste viteze sunt controlabile, prin ajustarea unor

variabile experimentale, care permit astfel creterea calitii separrii. Tabelul 1. 2 prezint parametrii cei mai importani care concur la rezoluia cromatografic. Efectele lor asupra eficienei coloanei vor fi discutate n continuare.

Tabelul 1.2. Parametrii variabili care afecteaz eficiena unei coloane.

Parametrul variabil Simbol

ul

Unitatea de msur uzual

Viteza linear a fazei mobile U cm s-1 Coeficientul de difuzie n faza mobil* DM cm

2 s-1 Coeficientul de difuzie n faza staionar * DS cm

2 s-1 Factorul de retenie (ecuaia 1.8) k' mrime adimensional Diametrul particulelor mpachetate DP cm

Grosimea nveliului de lichid de pe faza staionar

Df cm

*crete cu creterea temperaturii i scderea vscozitii

1.7.1 EFECTUL VITEZEI DE CURGERE A FAZEI MOBILE

Magnitudinea efectelor cinetice asupra eficienei coloanei depinde n mod clar de lungimea timpului n care faza mobil este n contact cu faza staionar, care, la rndul ei, este depinde de viteza de curgere a fazei mobile. Din aceast cauz, studiile referitoare la eficiena unor coloane sunt n general axate pe determinarea lui H (prin intermediul ecuaiilor 1.17 sau 1.18 i a ecuaiei 1.12) ca funcie de viteza fazei mobile, u. Aceste date sunt exemplificate de cele dou curbe din figura 1.7, una caracteriznd cromatografia de lichide, n timp ce a doua este reprezentativ cromatografiei de gaze.

Ambele curbe prezint un minim al nlimii talerului teoretic, H (ceea ce semnific o eficien maxim) la viteze mici de curgere. Aceast valoare minim din cromatografia

lichid se manifest n general la viteze de curgere care sunt asemntoare celei de cromatografie de gaze i deseori sunt att de mici nct nu sunt sesizabile n

condiiile normale de operare.

22

Figura 1.7. Efectul vitezei de curgere a fazei mobile asupra nlimii talerului teoretic n cazul (a) cromatografiei de lichide i (b) gaz cromatografiei.

Teoria vitezei de mprtiere a zonei cromatografice descrie cu acuratee i predicioneaz forma diagramei H n funcie de u, grafic denumit adesea diagrama van Deemter dup numele descoperitorului ei. Dup cum se observ n figura 1.7, vitezele de curgere pentru cromatografia lichid sunt semnificativ mai mici dect cele utilizate n cazul celei gazoase.

Din aceast cauz, separrile n gaz cromatografie sunt mai rapide dect cele de cromatografie lichid. Mai mult, dup cum arat figura, nlimea talerului teoretic a unei coloane de cromatografie lichid are un alt ordin de magnitudine fiind mult mai mic fa de cel ntlnit n cazul coloanelor utilizate n cromatografia de gaze. Din aceast cauz, nu este practic a se utiliza coloane de cromatografie lichid care sunt mai lungi de 25-50 cm (datorat presiunii picturilor), n timp ce coloanele de gaz cromatografie pot fi de 50 de metrii sau mai lungi.

n consecin, numrul total de talere i astfel eficiena total a coloanei sunt n general superioare n cazul coloanelor de gaz cromatografie. n acest fel, o prim comparaie ntre gaz cromatografie i cea lichid arat c prima metod este capabil de separri mai rapide i de mai mare eficien.

1.8. RELAIA DINTRE NLIMEA TALERULUI I VARIABILELE COLOANEI

n cursul ultimilor 40 de ani, au fost elaborate nenumrate studii teoretice i experimentale avnd ca scop dezvoltarea relaiilor cantitative care descriu efectul variabilelor prezentate n tabelul 1.2, asupra nlimii talerului pe diverse tipuri de coloane. Au fost astfel elaborate o serie de expresii matematice referitoare la relaia dintre nlimea talerului i parametrii variabili ai coloanei care, aplicate practic, au avut grade diferite de succes. Aparent nici una dintre ele nu a rezolvat n totalitate i nu au putut s explice interaciile fizice complexe care conduc la lirea zonei cromatografice. O serie dintre aceste teorii, cu toat imperfeciunile lor au fost des utilizate i au condus la creterea performanei coloanelor cromatografice.

O astfel aproximare matematic a comportamentului coloanelor cromatografice este ecuaia van Deemter, care poate fi scris n forma:

H = A + B/u + Cu = A + B/u + (CS + CM)u (1. 19)

unde H este nlimea talerului dat n centimetrii, u este viteza linear a fazei mobile dat n centimetrii pe secund, n timp ce A, B, i C sunt coeficieni referitori la fenomenele de curgere pe multiple ci, difuzie longitudinal i transfer de mas ntre faze. Dup cum

23

se observ n ecuaia 1.19, coeficientul C poate fi desfcut n doi coeficieni: unul (CS), n relaie cu faza staionar, iar cellalt, (CM), relativ la faza mobil.

Studii teoretice ulterioare au artat c ecuaia van Deemter este destul de exact n explicarea eficienei coloanei cromatografice. Ecuaia van Deemter conine termeni direct i invers proporionali precum i termeni independeni fa de viteza fazei mobile.

n continuare se vor examina variabilele care afecteaz cei patru termeni ai ecuaiei 1.19, A, B/u, CSu, CMu, termeni identificai n tabelul 1.3.

1.8.1 TERMENUL (A)

mprtierea zonei se manifest n parte datorit multitudinii de ci de curgere pe care moleculele (sau ionii) le pot gsi i urma prin coloana mpachetat. Dup cum se observ n figura 1.8, lungimea acestor ci pot diferi semnificativ, astfel, timpul de reziden n coloan pentru moleculele aceleai specii este de asemenea variabil. Moleculele de solut pot astfel atinge captul colanei ntr-un interval de timp care conduce la mprtierea zonei. Acest efect, denumit n acelai timp difuzie n vrtej este direct proporional cu diametrul particulelor cu care se mpacheteaz coloana cromatografic i este prezentat n coloana a treia din tabelul 1.3.

Tabelul 1.3. Procesele cinetice care contribuie la mprtierea zonei cromatografice.

Procesul Termenul din ecuaia

1.19

Relaia de legtur cu coloana cromatografic* i proprietile

analitului

Cile de curgere multiple A A = 2dP Difuzia longitudinal B/u B/u = 2DM / u Transferul de mas din i

nspre faza staionar lichid CSu CSu = (fs(k')d

2f / DS)/ u

Transferul de mas n faz mobil

CMu (CMu = fM(k')d2P / DM)/ u

*u, DS, DM, df, dp, k' sunt definite n tabelul 1.2.

fjx) = funcie de x.

, : constante care depind de calitatea mpachetrii coloanei cromatografice. B: coeficientul de difuzie longitudinal. CS, CM: coeficieni de transfer n faza staionar, respectiv n gaza mobil.

mprtierea prin curgere pe canale multiple poate fi parial compensat de difuziunea ordinar, care rezult n condiiile n care moleculele sunt transferate printr-un curent ce urmeaz o cale sau alta. Dac viteza de curgere este foarte mic, un numr mare de asemenea transferuri se realizeaz iar fiecare molecul n micarea sa n josul coloanei urmeaz o alt cale de curgere, pierznd timpi diferii pe fiecare direcie de curgere.

Drept consecin, viteza cu care fiecare dintre molecule se mic n josul coloanei tinde sa se apropie de medie. Se poate spune c, la viteze mici ale fazei mobile moleculele nu sunt semnificativ

dispersate prin natura cilor multiple a mpachetrii.

Figura 1.8. Modalitatea de eluie a dou molecule printr-o coloan cromatografic. Se poate nota c distana

24

parcurs de molecula 2 este mai mare dect cea parcurs de ctre molecula 1. Astfel, molecula 2 va

ajunge la punctul B mai trziu dect molecula 1.

La viteze moderate sau mari, totui, nu este timp suficient necesar pentru ca difuzia medie sa s realizeze iar mprtierea zonei se manifest datorit lungimilor diferite ale cilor de curgere.

1.8.2. TERMENUL DE DIFUZIE LONGITUDINAL (B/U)

.Difuzia longitudinal n cromatografia pe coloan este un proces de mprtiere a benzii n care soluii difuzeaz dintr-un centru de concentrare spre zone mai diluate, n faa i n spatele zonei cromatografice, unde se manifest n sensul i n contra direciei de curgere a fazei mobile. Dup cum se observ n a doua ecuaie din tabelul 1.3, termenul de difuzie longitudinal este direct proporional cu coeficientul fazei mobile DM, constant

egal cu viteza de migrare sub un gradient egal cu o unitate. Constanta este denumit factor obstructiv fiind n relaie cu mpiedicarea difuziei longitudinale de ctre modul de mpachetare al coloanei. Astfel, n cazul coloanelor mpachetate valoarea aceste constante

este de aproximativ 0,6 n timp ce pentru coloane nempachetate valoarea sa este egal cu unitatea.

Contribuia difuziei longitudinale este invers proporional cu viteza fazei mobile. Aceast relaie nu este surprinztoare dac avem n vedere c analitul este n coloan pentru o perioad mai mic la viteze de curgere nalte. n cazul unor viteze mari de curgere, difuzia de la centru bandei spre margini se manifest mai redus cu ct timpul de staionare este mai mic. Pantele negative la viteze de curgere sczute prezentate n cele dou grafice din figura 1.7 i sunt consecine ale difuziei longitudinale. Se poate nota c efectul este mai puin pronunat n cromatografia de lichide din cauza faptului c aceti coeficieni de difuzie n lichide au ordine de magnitudine mai mici dect cei gsii n cazul gazelor. De fapt, pentru cele mai multe lichide, factorul B/u se apropie de zero n relaie cu ceilali termeni din ecuaia 1.19. Astfel, minimul artat n figura 1.7a nu este uneori observat.

1.8.3. COEFICIENII DE TRANSFER DE MAS CS I CM

Necesitatea celor doi coeficieni de transfer de mas CS i CM din ecuaia 1.19 apare datorit faptului c echilibrul dintre fazele mobil i staionar se stabilete deosebit de lent n coloana cromatografic deoarece ea opereaz ntotdeauna n condiii de neechilibru. n consecin, moleculele de analit aflate n partea frontal a benzii cromatografice sunt preluate n fa, nainte de a avea timp pentru a se echilibra n faza staionar i astfel s fie reinute de aceast faz. n mod similar echilibrul nu se stabilete la marginea situat la trena benzii iar moleculele de analit sunt prsite ndrtul fazei staionare, datorit micrii rapide a fazei mobile.

25

mprtierea benzii din cauza efectelor de transfer de masa se manifest din cauza faptului c o multitudine de cureni de curgere ai fazei mobile din coloan i stratul care nconjoar faza staionar au dimensiuni finite. n consecin, este necesar un timp pentru ca moleculele de solut aflate la interfa s difuzeze dintr-o faz n interiorul celelalte faze. Acest timp de lag rezult din persistena condiiilor de neechilibru de-a lungul coloanei cromatografice. De altfel, dac vitezele de transfer de mas dintre cele dou faze ar fi infinite, fenomenul de mprtiere a zonelor cromatografice nu s-ar manifesta.

Se poate nota c extensia benzii cromatografice produs att de mprtierea longitudinal ct i de transferul de mas depinde de viteza de difuzie a moleculelor de analitul n timp ce direcia difuziei n cele dou cazuri este diferit. mprtierea longitudinal apare din tendina moleculelor de a se ndrepta ntr-o direcie paralel curgerii, n timp ce mprtierea datorat transferului de mas se manifest din tendina moleculelor de a difuza ntr-un plan perpendicular cu direcia de curgere. Drept consecin, gradul de mprtiere longitudinal este n relaie invers cu viteza de curgere. Pentru mprtierea datorat transferului de mas, din contr, cu ct faza mobil se mic mai repede, cu att timpul necesar ajungerii la echilibru este mai redus. Astfel, dup cum arat ultimii doi termeni ai ecuaiei 1.19, efectul transferului de mas asupra nlimii talerului este direct proporional cu viteza linear, u, de micare a fazei mobile.

1.8.4. TERMENUL DE TRANSFER DE MAS N FAZA STAIONAR (CSU).

Ecuaia a treia din tabelul 1.3, arat c n condiiile n care faza staionar este un lichid imobilizat, coeficientul de transfer de mas este proporional cu o funcie complex, fs(k') a factorului de retenie k', este direct proporional cu ptratul grosimii filmului de pe particulele suport df i este invers proporional cu coeficientul de difuzie, DS a solutului n film. Efectele acestei relaii pot fi nelese prin imaginarea modului prin care aceti factori influeneaz frecvena medie prin care moleculele de analit care ajung la interfa sunt transferate n faza mobil. De exemplu, n funcie de grosimea filmelor, moleculele trebuie s traverseze n medie o distan mai mare sau mai mic pentru a atinge suprafaa; n cazul coeficienilor de difuzie mai mici, ele vor traversa mai ncet. Consecina ambilor factori este o vitez sczut de transfer de mas i o cretere a nlimii talerului.

1.8.5. TERMENUL DE TRANSFER DE MAS N FAZA MOBIL (CMU).

Dup cum arat ecuaia a patra din tabelul 1.3, coeficientul de transfer din faza mobil CM este o funcie complex, f(k') a factorilor de retenie k', fiind proporional cu ptratul diametrului particulelor din coloana mpachetat dp i invers proporional cu coeficientul de difuzie din faza mobil, DM.

1.9. EFECTUL VITEZEI FAZEI MOBILE ASUPRA TERMENILOR ECUAIEI VAN DEEMTER

n figura 1.9 este nfiat modul de reprezentare a ecuaiei van Deemter n cazul unui set de date experimentale. n acest experiment, analitul eluat a fost reprezentat de acetatul

de benzil aflat ntr-o soluie de hexan, care conine acetat de etil. Punctele situate pe curba de deasupra reprezint valorile experimentale n timp ce curba cu linie continu este reprezentarea grafic a ecuaiei van Deemter.

26

Figura 1.9. Diagrama van Deemter pentru o coloan de cromatografie lichid, mpachetat. Punctele de pe curba

superioar sunt date experimentale. Contribuiile diverilor termeni de viteze sunt artai pe curbele situate mai jos: A, efectul datorat cilor multicanal de curgere; B/u, difuzia longitudinal; Cu, transferul de mas dintre

cele dou faze.

Curbele de sub aceast reprezentare arat contribuia efectului de curgere prin canale multiple, difuzia longitudinal i efectele combinate ale transferului de mas.

1.10. METODE DE REDUCERE A MPRTIERII ZONEI CROMATOGRAFICE

Diametrul particulelor care compun coloana i diametrul coloanei reprezint dou variabile importante controlabile care afecteaz eficiena unei coloane cromatografice. Efectul diametrului particulelor este demonstrat prin datele experimentale prezentate n

figura 1.10 n timp ce pentru a beneficia de avantajul datorat diametrului coloanei, n

ultimii ani au fost introduse n practica cromatografic coloane din ce n ce mai nguste. n condiiile n care faza mobil este gazoas, viteza de difuziune lateral poate fi

redus apreciabil prin scderea temperaturii i astfel a coeficientului de difuzie DM. n consecin, scderea nlimii talerului este dependent de temperaturi joase. Acest efect este n general nesemnificativ n cazul cromatografiei lichide din cauza faptului c difuzia este lent, astfel c termenul de difuzie longitudinal are un efect mic asupra nlimii talerului.

Figura 1.10. Efectul dimensiunilor particulelor asupra nlimii talerului. Numerele din dreapta

reprezint diametrul particulelor.

27

La fazele staionare lichide, grosimea stratului de lichid adsorbit poate fi minimalizat deoarece CS din ecuaia 1.19 este proporional cu ptratul acestei variabile, df (ecuaia a treia din tabelul 1.3).

1.11. OPTIMIZAREA PERFORMANELOR COLOANEI CROMATOGRAFICE

O coloan cromatografic este optimizat prin variaia experimental a condiiilor, pn cnd componentele amestecului sunt separate n mod clar, ntr-un timp minim.

Optimizarea experimentelor are ca scop (1) reducerea mprtierii zonei cromatografice ori (2) alterarea vitezelor de migrare ale componentelor din amestecul de separat. Dup cum s-a artat, mprtierea zonei este crescut prin aceleai variabile cinetice care conduc la creterea nlimii talerelor coloanei cromatografice. Pe de alt parte, vitezele de migrare, pot fi modificate prin schimbarea acelor variabile care afecteaz factorii de retenie i selectivitate ai soluilor.

1.11.1. REZOLUIA COLOANEI

Rezoluia, RS a unei coloane cromatografice conduce la msurarea cantitativ a abilitii sale n separarea a doi analii. Semnificaia acestui termen este ilustrat n figura 1.11, care prezint cromatogramele a dou specii moleculare, A i B, pe trei coloane ce posed rezoluii diferite. Rezoluia unei coloane este definit ca:

unde toi termenii din partea dreapt ai ecuaiei apar n figur. Este evident din figura 1.11 c o rezoluie de 1,5 conduce la o separare practic

complet a celor dou componente, n timp ce o rezoluie de 0,75 nu. La o rezoluie de 1, zona A conine aproximativ 4% din specia B, iar zona B conine o cantitate similar din solutul A. La o rezoluie de 1,5, suprapunerea este de aproximativ 0,3%.

Rezoluia pentru o faz staionar dat poate fi crescut prin lungirea coloanei, astfel crescnd numrul de talere. Consecina nefavorabil la adugarea de talere o reprezint creterea timpului necesar separrii cromatografice.

28

Figura 1.11. Separrile la trei rezoluii diferite. n aceast figur, relaia a doua din formula 20: RS =

2Z/(WA + WB).

1.11.1.1. Efectul factorilor de retenie i selectivitate asupra rezoluiei cromatografice Este foarte util a se dezvolta o relaie matematic ntre rezoluia unei coloane i factorii

de retenie, kA i kB, a factorului de selectivitate , i numrul de talere, N, care alctuiesc o coloan cromatografic n cazul a doi solui.

Considernd c cei doi solui, A i B au timpi de retenie apropiai unul de cellalt, se poate aproxima c:

WA = WB W

Astfel, ecuaia 1.20 poate fi scris sub forma:

Ecuaia 1.17 permite exprimarea lui W n termeni de (tR)B i N, care pot astfel substituii n ecuaia anterioar, rezultnd:

29

Substituind ecuaia 1.8 i rearanjnd-o, se obine exprimarea lui RS n termeni de factori de retenie pentru A i B, dup cum urmeaz:

n continuare prin eliminarea kA din aceast ecuaie prin substituia ecuaiei 1.10, rezult:

Adesea este necesar a se calcula numrul de talere teoretice necesar pentru s stinge o rezoluie dorit. O exprimare a acestei cantiti este obinut prin rearanjarea ecuaiei 1.21 ceea ce conduce la:

Formele simplificate ale ecuaiilor 1.21 i 1.22 sunt uneori ntlnite n condiiile n care acestea se aplic unor perechi de solui ale cror constante de distribuie sunt aproape

similare, motiv pentru care separarea lor este dificil. Astfel, dac KA KB, se urmeaz

ecuaia 1.5 astfel nct kA kB = k' i din ecuaia 9, - 1. Cu aceste aproximaii, ecuaiile 1.21 i 1.22 se reduc la:

unde k' reprezint media dintre kA i kB.

1.11.1.2. Efectul rezoluiei asupra timpului de retenie nainte de a considera n detaliu semnificaia celor patru ecuaii derivate mai sus, este

util s se dezvolte o ecuaie care s prezinte caracteristicile de performan a unei coloane, adic timpul necesar pentru o complet separare a solutului A de solutul B. n mod clar, ceea ce este dorit n cromatografie este o rezoluie posibil nalt n cel mai scurt timp posibil. Din nefericire, aceste dou proprieti nu pot fi maximalizate n aceleai condiii, motiv pentru care totdeauna trebuie gsit un compromis.

Timpul pentru desvrirea separrii este determinat de viteza vB a solutului care se mic mai lent este dat de ecuaia 2. Aceasta este:

30

Combinnd aceast expresie cu ecuaiile 1.6 i 1.12, rezult, dup rearanjare:

unde (tR)B este timpul necesar pentru a aduce peak-ul B la captul colanei n condiiile

n care viteza fazei mobile este u. n cazul n care ecuaia de mai sus este combinat cu ecuaia 1.22 i rearanjnd termenii, rezult:

1.11.1.3. Variabilele care afecteaz performanele unei coloane cromatografice

Ecuaiile 1.21 i 1.25 sunt semnificative deoarece servesc drept ghid n alegerea condiiilor care sunt potrivite pentru a fi urmate de utilizatorul cromatografiei pentru a atinge ntr-un timp determinat scopul propus cu rezultate clare.

n cercetarea condiiilor optime pentru o separare dorit trebuie avut n vedere c

parametrii fundamentali, , k' i N (sau H) pot fi ajustai mai mult sau mai puin

independent. Astfel, parametrii i k' pot fi variai mai simplu prin varierea temperaturii sau a compoziiei fazei mobile. Utilizarea unui alt tip de mpachetare a coloanei reprezint o modalitate mai puin convenabil. Dup cum s-a artat, este posibil a se modifica N prin schimbarea lungimii coloanei ori de a modifica H prin modificarea vitezei de curgere a

fazei mobile, a mrimii dimensiunilor particulelor de mpachetare, a vscozitii fazei mobile (prin modificarea DM sau DS), i a grosimii filmului de lichid adsorbit coninut n faza staionar (Tabelul 3).

1.11.1.3.1. Variaia n numrul de talere, N O cale evident de cretere a rezoluiei o reprezint creterea numrului de talere din

coloan (ecuaia 1.21). Dup cum se observ din exemplul 1, care urmeaz aceast cale, metoda este mai puin economic din punct de vedere al timpului necesar pentru a finaliza separarea n afara cazului n care creterea n N este realizat mai degrab prin reducerea n H dect prin lungirea coloanei.

Exemplu: Substanele A i B au fost gsite a avea timpii de retenie de 16,40 i respectiv 17,63

minute pe o coloan de 30,0 centimetrii. O specie nereinut trece prin coloan ntr-un interval de timp de 1,30 min. Limile peak-urilor (la baz) pentru A i B sunt de 1,11 respectiv 1,21 minute. Calculai: (a) rezoluia coloanei, (b) media numrului de talere din coloan, (c) nlimea talerului, (d) lungimea coloanei necesare pentru a atinge o rezoluie de 1,5 (e) timpul necesar pentru a elua substana B pe coloana mai lung, i (f) nlimea talerului necesar pentru o rezoluie de 1,5 pe coloana original de 30 centimetrii n timpul de retenie dat.

Substituind n ecuaia 1.20 rezult c:

31

(a)

(b) Ecuaia 1.17 permite calculul lui N. Astfel,

i

n continuare se calculeaz numrul mediu de talere:

(c)

(d) k' i nu se modific odat cu creterea lui N i L. Astfel, substituind N 1 i N2 n ecuaia 1.21 i diviznd-o pe una fa de cealalt, rezult:

unde indicii 1 i 2 se refer la lungimea coloanei originale i a coloanei mai lungi. Substituind valorile corespunztoare pentru N1, (Rs)1 i (Rs)2 se obine:

de unde:

32

substituind n ecuaia 12 rezult: L = N x H = 6,9 x 10

3 x 8,7 x 10

3 cm = 60 cm

(d) substituind (Rs)1 i (Rs)2 n ecuaia 25, dup reducere, se obine:

i astfel (tR)2 = 35 minute. Deci, pentru a obine o cretere a rezoluiei la 1,5, este necesar un timp de eluie

aproximativ dublu.

(f) Substituind H1 i H2 n ecuaia 1.25, i reducnd una cu cealalt, se obine:

unde indicii 1 i 2 se refer la nlimea talerului original i respectiv noul taler. Dup rearanjare rezult:

Astfel, pentru a avea o rezoluie de 1,5 ntr-un interval de timp de 17,63 minute pe o coloan de 30 cm, nlimea talerului trebuie s fie la jumtatea celui iniial.

1.11.1.3.2. Variaia n nlimea talerului, H n exemplul 1(f), se observ c o mbuntire semnificativ a rezoluiei poate fi

realizat fr nici un cost de timp suplimentar dac nlimea talerului se reduce. Tabelul relev variabilele care pot fi manipulate pentru a ajunge la acest rezultat. Se poate nota c scderea mrimii particulelor de mpachetare a coloanei conduce la o mbuntire marcant a lui H. Pentru faze mobile lichide, unde B/u este neglijabil, reducerea nlimii talerului poate fi de asemenea realizat prin reducerea vscozitii solventului, mrindu-se astfel coeficientul fazei mobile.

1.11.1.3.3. Variaia n factorul de retenie Adesea, o separare poate fi mbuntit semnificativ prin manipularea factorului de

retenie, kB. creterea lui kB crete n general rezoluia (crescnd ns timpul de eluie).

33

Pentru a determina domeniul optim al valorilor pentru kB, este necesar a scrie ecuaia 1.21 n forma:

i ecuaia 1.25 sub forma:

unde Q i Q' conin restul de termeni ai celor dou ecuaii. Figura 1.12 este o reprezentare grafic RS/Q ori (tR)B/Q' n funcie de kB, considernd c Q i Q' rmn aproximativ constante. Se vede clar c valorile lui kB mai mari de 10 nu trebuie alese deoarece ele conduc la o mic cretere n rezoluie dar cu o cretere marcant a timpului necesar separrii. Valoarea minim a timpului de eluie se manifest la o valoare a kB de aproximativ 2. Astfel, n multe cazuri, valoarea optim a kB se stabilete lund n calcul att rezoluia ct i timpul necesar separrii, adic ntr-un domeniu cuprins ntre 1 pn la 5.

Figura 1.12. Efectul factorului de rezoluie kB asupra rezoluiei RS i a timpului de eluie (tR)B. Se consider c Q i Q rmn constante la variaia factorului kB.

n mod uzual, cea mai simpl cale de cretere a rezoluiei de separare o reprezint optimizarea lui k'. Pentru faze mobile gazoase, k' poate deseori crescut prin creterea temperaturii.

Pentru fazele mobile lichide, schimbarea compoziiei solventului permite deseori manipularea lui k' obinndu-se astfel separri superioare. Efectele dramatice produse prin schimbarea solventului este ilustrat prin exemplul prezentat n figura 1.13.

Figura 1.13. Efectul variaiei solventului asupra separrii cromatografice. Analii: (1) 9,10-antraquinon; (2) 2-metil-9,10-antraquinon; (3) 2-etil-9,10-antraquinon; (4) 1,4-dimetil-9,10-antraquinon; (5) 2-t-butil-9,10-antraquinon.

34

Se observ c o mic modificare a rapoartelor metanol/ap conduce de la separri cromatografice nesatisfctoare (a i b) la unele unde fiecare peak al oricrui

component este bine separat (c i d). n multe scopuri, cromatograma artat n (c) pare a fi cea mai bun dup cum arat raportul dintre rezoluia adecvat n intervalul de timp.

1.11.1.3.4. Variaia n factorul de selectivitate

n condiiile n care atinge unitatea, optimizarea lui k' i creterea lui N nu sunt suficiente pentru a produce o separare satisfctoare a doi solui, ntr-un timp rezonabil. Sub aceste circumstane, trebuie identificat o posibilitate de cretere a factorului de

selectivitate , cu meninerea lui k' ntr-un domeniu optim de 1-10. n acest context sunt posibile o serie de opiuni de lucru. Astfel, scderea oportunitii n perspectiva i avantajul (comoditii) aceste opiuni includ: (1) schimbarea compoziiei fazei mobile, inclusiv schimbarea pH-ului; (2) schimbarea temperaturii coloanei; (3) schimbarea

compoziiei fazei staionare; (4) utilizarea unor efecte specifice, chimice. Un exemplu de utilizare a opiunii (1) a fost raportat n cazul separrii anisolului

(C6H5OCH3) de benzen. Cu o faz mobil coninnd un amestec metanol:ap 50%, k'

pentru cei doi solui a fost raportat de 4,5 i respectiv 4,7, n timp ce a fost egal cu numai 1,04. nlocuirea fazei apoase cu una care ca coninut 37% tetrahidrofuran a condus

la k' de 3,9 i 4,7 i la o valoare de 1,20. Dac suprapunerea celor dou peak-uri a fost semnificativ n primul caz, n cel de al doilea caz suprapunerea a fost neglijabil.

Pentru separri care implic acizi sau baze