Camelia ALBU BIRSAN1, Eugenia TEODOR 1,
1. Centrul de Bioanaliza, Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Stiinte Biologice, Bucuresti
"Bioanaliza versus Biotehnologia" – decembrie 2007
INTRODUCERE
In ultimii ani termenul de probiotic se foloseste pentru adefini preparate microbiene vii, care consumate,amelioreaza sau vindeca unele boli, actionand prinmodificarea echilibrului gastro-intestinal, prinschimbarea metabolismului si interactia cu micro-organismele prezente in intestin. Acizii organicirezultati in procesele ce au loc la cultivarea bacteriilorlactice au diverse roluri, astfel incat este importantacuantificarea lor in obtinerea unor tulpini lactice cu rolprobiotic.
Scopul acestei lucrari este elaborarea unei metode deanaliza prin HPLC cu detectie UV a acizilor organicirezultati din cultivarea unor bacterii lactice.
"Bioanaliza versus Biotehnologia" – decembrie 2007
MATERIALE SI METODE
acid acetic (Fluka), acid lactic (Fluka), acid fenillactic(Sigma), acid hidroxifenillactic (Sigma); toti ceilalţi reactivi, au fost de puritate analitica sau pentruuz cromatografic;
sistem HPLC SHIMADZU:-pompa LC-20AD sp Pump,-coloana TEKNOKROMA, Nucleosil 100 C18 10 μm 25 x 0.46,-degasor DGU-20As Degasser,-CTO-20AC Column oven,-detector SPD-M20A diode array detector-software LC solution;
"Bioanaliza versus Biotehnologia" – decembrie 2007
ANALIZA HPLC
lungimea de unda a fost aleasa, in functie de spectrul deabsorbtie, de 210 nm.;
faza mobila a constat in 25 mM KH2PO4 89% si metanol 11%,pH de 3,5;
s-a folosit un gradient pentru debitul fazei mobile;
analizele au fost realizate la 250C;
timpul total de analiza a unei probe a fost de 45 de minute.
"Bioanaliza versus Biotehnologia" – decembrie 2007
In experimentele noastre am adaptat o metoda, care sapermita determinarea simultana a acizilor organici de tip acidacetic, acid lactic, dar si a derivatilor aromatici ai acidului lactic,acidul fenillactic si hidroxi-fenillactic, ce apar in urma cresteriisi dezvoltarii unor bacterii lactice.
REZULTATE SI DISCUTII
Fig. 1. Cromatogramele pentru amestecul de acizi organici (concentratia acizilor este de 100 mg/mL (A) si 25 mg/mL (B)) (coloana TEKNOKROMA, Nucleosil
100 C18 10 μm 25x 0,46 cm).
A B
"Bioanaliza versus Biotehnologia" – decembrie 2007
Tabelul 1. Unele caracteristici de performanta ale metodei cromatografice dezvoltate pentru analiza acizilor organici.
AnalitTimp de retentie
Domeniul de liniaritate a răspunsului
Ecuaţia curbei de etalonare R2
Acid lactic tR1 = 5.2
1 m
g/m
L-1
00
mg
/mL
Y = 22468.18 X C -9275.911 0,9998
Acid acetic tR2 = 6.2 Y = 1255.024 X C + 35429.45 0,9997
Acid hidroxifenillactic
tR3 = 16.7 Y = 26497.71 X C - 13586.58 0,9998
Acid fenillactic tR4 = 34.4 Y = 34164.93 X C -26537.15 0,9997
"Bioanaliza versus Biotehnologia" – decembrie 2007
Fig. 2. Cromatogramele obtinute pentru probele de microorganisme (diluate de 10 ori) (coloana TEKNOKROMA, Nucleosil 100 C18, 10 μm, 25x 0,46 cm).
GM3GM2
GM10 VL 43
"Bioanaliza versus Biotehnologia" – decembrie 2007
Tabelul 2. Caracteristicile determinate cromatografic pentru acizi organici continuti
in supernatante (Lactobacillus paracasei (Y), Lactobacillus plantarum (GM1, GM2,
GM3, VL21), Enterococcus faecium (GM6, GM8, GM10, VL43, VL47)).
Proba AnalitTimp de retentie
Concentratie mg/mL Proba
AnalitTimp de retentie
Concentratie mg/mL
Y
Ac. lactic 4,8 11,2
GM8
Ac. lactic 4,8 3,1Ac. acetic 5,9 1031,2 Ac. acetic 5,9 308,3
Ac. hidroxifenillactic 15,5 256,3 Ac. hidroxifenillactic 15,6 3599,5Ac.fenillactic - - Ac.fenillactic - -
GM1
Ac. lactic 4,8 21,6
GM10
Ac. lactic 4,8 196,2
Ac. acetic 6,2 2707,6 Ac. acetic 6 875,4Ac. hidroxifenillactic 15,6 171,4Ac. hidroxifenillactic 15,6 237,2
Ac.fenillactic - -Ac.fenillactic 34 19,6
GM2
Ac. lactic 5 423,1
VL 43
Ac. lactic 5,3 782,5
Ac. acetic 6 1180,7 Ac. acetic 6,2 329,3
Ac. hidroxifenillactic 15,8 452,6Ac. hidroxifenillactic 15,6 156,6Ac.fenillactic 33,9 15,7 Ac.fenillactic - -
GM3
Ac. lactic 5 227,9
VL 21
Ac. lactic 4,9 13Ac. acetic 6,1 810,7 Ac. acetic 5,9 1138,3
Ac. hidroxifenillactic 15,6 115,9 Ac. hidroxifenillactic 15,5 245,6
Ac.fenillactic - -Ac.fenillactic 33,8 13,4
GM6
Ac. lactic 4,8 216,1
VL 47
Ac. lactic 4,7 5,7
Ac. acetic 5,8 2005,8Ac. acetic 6 1161Ac. hidroxifenillactic 15,6 226,4 Ac. hidroxifenillactic 15,5 329,1
Ac.fenillactic 33,6 8,9 Ac.fenillactic - -
"Bioanaliza versus Biotehnologia" – decembrie 2007
CONCLUZII
Metoda de separare si cuantificare HPLC pentru aciziorganici din probe microbiologice este simpla, relativrapida, sensibila (limita de detectie este de 0,7–0,9 mg/mL)si permite o determinare simultana a acizilor organicirezultati din cresterea unor microorganisme. Ea a fostaplicata cu bune rezultate pe probe reale provenite de labacterii lactice.
"Bioanaliza versus Biotehnologia" – decembrie 2007
Lucrare a fost finantata din cadrul contractului BIOTECH CEEX 9/2005
VA MULTUMESC PENTRU ATENTIE!
"Bioanaliza versus Biotehnologia" – decembrie 2007