5. EXPLORAREA FUNC IONAL HEPATICComplexitatea structurii, precum i multiplele func ii metabolice ale ficatului, explic

dificultatea explor rii func ionale a acestui organ n clinic . Ficatul de ine roluri fundamentale n toate metabolismele, activitatea sa fiind integrat n ansamblul anumitor procese ale ntregului organism. Pe baza func iei sau a reac iei hepatice pe care o investigheaz , Fauvert a clasificat testele de explorare hepatic n: 1. Teste pentru explorarea func iilor metabolice i de detoxifiere (sindrom hepatopriv). 2. Teste pentru explorarea func iei excreto-biliare. 3. Teste pentru explorarea integrit ii celulare (sindrom de citoliz hepatic ). 4. Manifest ri reactive mezenchimale (sindrom inflamator). 5. Explor ri imunologice complementare n scopul detect rii fie a unor anticorpi, fie a unor antigene virale sau de tip oncofetal.

5.1. Teste pentru explorarea func iilor metabolice i de detoxifiere (sindrom hepatopriv) 5.1.1. Explorarea capacit ii de sintez a ficatului5.1.1.1. Explorarea sintezei proteice I. Proteinemia total i frac iunile proteice plasmatice

Proteinele plasmatice sunt sintetizate n cea mai mare parte n ficat, unele n exclusivitate ( albuminele, fibrinogenul, protrombina, etc.), iar globulinele n propor ie de 80%. Determinarea proteinemiei totale are importan doar varia iile foarte ample. Determinarea concentra iei proteinelor serice are ca principiu formarea unui complex colorat n reac ia dintre proteine i ionii de cupru, n mediu alcalin a c rui absorb ie se cite te clinic redus n bolile acute i de scurt durat , valoare avnd

spectrofotometric, la o anumit lungime de und Modific rile cantitative ale unora dintre frac iunile plasmatice au valoare clinic mult mai mare, fiind utile att pentru diagnostic ct i pentru urm rirea evolu iei unor afec iuni.

Albumina, principala frac iune proteic

plasmatic , intervine n reglarea volemiei

i a

schimburilor hidro-electrolitice, ca transportor de acizi gra i, pigmen i, hormoni, medicamente, ca rezerv proteic i surs de aminoacizi pentru sinteza de proteine tisulare.

Metodele de dozare sunt: imunologic , prin IDR i colorimetric . Prin electroforeza pe hrtie, foi de acetat de celuloz , gel de agar, amidon, se stabile te procentual ponderea albuminei n ansamblul proteic (n care albumina reprezint frac iunea cu mobilitatea proteic cea mai mare). Electroforeza proteinelor Principiu: electroforeza reprezint migrarea particulelor nc rcate electric dintr-o solu ie

coloidal , la polul + sau , la trecerea unui curent electric. Folosind un pH alcalin, frac iunile proteice se ncarc cu sarcin negativ Materiale i reactivi: solu ia tampon (pH = 8,6): acid dietilbarbituric (8g), dietilbarbiturat de Na (45g); coloran i: lent (Durrum) albastru de bromfenol (2g), sulfat de Zn (100g), acid acetic glacial (500 ml) rapid (Grassman) albastru de bromfenol (2g), alcool metilic (580 ml), acid acetic glacial (500 ml) - baie de fixare: metanol - b i de sp lare: baia 1 i 2 (acid acetic), baia 3 (acid acetic, acetat de Na) - eluant: NaOH 0,4% (0,1 N) - hrtia Whatman: benzi cu lungimea de 25 cm i l imea de 2 cm - aparatul de electroforez compus din redresor sau alimentator de curent i camera umed Succesiunea opera iilor: 1. ntinderea benzilor i aplicarea probelor de ser; 2. migrarea electroforetic ; 3. fixarea i colorarea benzilor; 4. valorificarea cantitativ . i vor migra spre anod n func ie de greutatea lor molecular .

Tehnica: a/ Banda de hrtie se mbib cu solu ia tampon i excesul se ndep rteaz prin tamponare ntre dou hrtii de filtru; b/ Benzile se introduc n camera umed aprox. 30 minute; c/ Dup ntreruperea curentului electric, se pipeteaz 6-8 l ser de cercetat la 3,5-4 cm de polul negativ al benzii; d/ Dup 10 minute se conecteaz aparatul la curent electric i migrarea se realizeaz n 16 18 ore; e/ Dup migrare, benzile se men in la 80 proteinelor pe band ); f/ Se coloreaz benzile (10 20 minute) i apoi se introduc n solu iile succesive de 1000C pentru 1 2 ore (pentru precipitarea i se conecteaz aparatul la curent electric timp de

decolorare, apoi se usuc la temperatura camerei. Valorificarea cantitativ se poate realize prin dou metode: 1. procedeul direct, de integrare direct a frac iunilor respective cu un integrator. Banda trece prin dreptul unei surse de lumin , spoturile absorb din lumin o cantitate propor ional cu grosimea i se ob ine o diagram ce poate fi descompus prin extrapol ri n curbe Gauss. Sub curba nregistrat frac iunilor respective. apare o integrare care reprezint corespondentul concentra iei

Fig.5. Electroforeza proteinelor; curba de integrare i valorificarea cantitativ direct

Se ridic cte o perpendicular din zona de maxim separare dintre frac iuni (zona cea mai pu in colorat ) pn ntlne te curba de integrare global . Apoi se traseaz pe desen o linie cu lungimea de 100 mm (10 cm) de la por iunea superioar a curbei de integrare pn la linia de baz . Tras m paralele cu abscisa de la punctul de ntlnire al fiec rei perpendiculare pn ntlnim linia de 10 cm. Se m soar cu rigla pe aceast linie distan a n cm pentru fiecare frac iune proteic exprim procentual (albumina A, -1, -2, i -globuline). i apoi se

2. evaluare prin elec ie; se preg te te o serie de 5 eprubete pentru fiecare prob . Se taie benzile (fiecare zon colorat ) i se introduc n eprubeta corespunz toare din seria de 5, n ordinea migr rii: albumine, globulinele alfa 1, alfa 2, beta i gamma. T ierea se face pe zona cea mai pu in colorat dintre frac iuni. Se pipeteaz n fiecare eprubet cte 3 ml NaOH 0,1N. Se astup eprubetele cu dopuri, se agit foarte bine i se las n repaus 1 h. Se citesc extic iile fiec rei frac iuni n cuva de 1 cm, la = 590 nm, contra unui martor care se ob ine prin eluarea unui fragment

liber de pe banda de hrtie de filtru.

Calcul: se face suma extinc iilor (E) celor 5 frac iuni ale unei probe Suma E = EA + E 1 + E 2 + E + E

Se calculeaz procentajul fiec rei frac iuni fa EA x 100/Suma E = A % E 1 x 100/ Suma E =1 globuline

de aceast sum (considernd suma E = %);

% etc.

Electroforeza proteinelor pe folii de acetat de celuloz Aparatur : -camer umed ; -redresor i dispozitiv de fotometrare (densitometru) adaptat pentru folii de acetat de celuloz . Reactivi: -tampon barbiturat pH = 8,6 -amestec colorant i fixator (colorant Ponceau, acid tricloracetic i acid sulfosalicilic); -solu ie de acid acetic 5%; -solu ie de alcool etilic; -folii de acetat de celuloz ; Tehnic : Se umplu cuvele aparatului cu tampon barbiturat i se imerseaz foliile de acetat de celuloz n tampon, timp de 15 min (avndu-se grij s nu se prind bule de aer n mediul de acetat de celuloz ). Se introduc foliile n camera umed i se aplic 0,25 l din serul de analizat. Se d drumul la

curentul electric pentru ob inereea separ rii electroforetice, timp de 20 min. Dup ntreruperea curentului electric se imerseaz foliile de acetat de celuloz n amestecul de colorant i fixator timp de 10 min. Se scot foliile din baia de colorant i se imerseaz n solu ii succesive de acid acetic 5%, dup care se usuc la temperatura camerei i apoi se introduc n solu ia de alcool etilic timp de 5 min. Dup uscare la 400-600C, se fotocolorimetreaz .

Valori normale:Frac iunea Masa molecular Separare pe hrtie i acetat de celuloz 58 - 66% 3 5% 5 9% 6 14% 10 - 20% Separare pe hrtie Concentra ia absolut (g/dl ser) la 7 g/dl proteine totale 3,50 5,50 0,14 0,35 0.35 0,70 0,70 1,05 0,84 1,40

Albumine Alfa1 globuline Alfa2 globuline Beta globuline Gamma globuline

65.000-69.000 45.000-200.000 150.000 Variabil 156.000

49 61% 4 6% 5,25 8,17% 13,5 16,5% 12 - 20%

Proteinemia total adul i: 6,5 8,5 g/dl nou-n scu i: 4,8 7,3 g/dl copii pn la 3 ani: 5,4 8,7 g/dl Raportul albumine/globuline = 1,5 2,5 Capacitatea de legare a albuminelor (albumin-binding capacity) = 91 127% Implica ii clinice: proteine totaleAport alimentar insuficient; Alterarea sintezei i absorb iei proteice (ciroz hepatic avansat , sindrom de malabsorb ie); Pierderi proteice importante (renale, intestinale, cutanate - arsuri); Intensificarea catabolismului proteic (neoplasme, infec ii grave, tireotoxicoze) Paraproteinemie (mielom multiplu); Procese cronice inflamatorii; Colagenoze; Ciroze hepatice

Hipoproteinemie absolut

Hiperproteinemie absolut

albumineDeficit de sintez (afec iuni hepatice severe, analbuminemie