1

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE

„GR. T. POPA” IAŞI

FACULTATEA DE MEDICINĂ GENERALĂ

REZUMAT TEZĂ DE DOCTORAT

ROLUL MICOTOXINELOR

HEPATOTOXICE ÎN ETIOPATOGENIA

BOLILOR HEPATICE CRONICE (CIROZĂ

HEPATICĂ, HEPATOCARCINOM)

CONDUCĂTOR: PROF. DR. ANCA TRIFAN

DOCTORAND: HUŢANAŞU ILIE CĂTĂLIN

IAŞI 2011

2

Introducere

România se află primul loc în Europa la mortalitate prin

ciroză hepatică cu 538 decese/100.000 locuitori (exceptând Federaţia

Rusă) şi pe unul din primele locuri din lume1. Acest lucru se

datorează în principal prevalenţei crescute a infecţiilor virale B şi C

şi consumului important de alcool pe cap de locuitor, unde România

ocupă locul 2 în Europa (după Republica Moldova) 2. Aproximativ

10% din totalul cirozele hepatice au o etiologie neprecizată, fiind

excluse infecţia virală, consumul de toxice (dintre care alcoolul

ocupă primul loc) şi autoimunitatea. În aceste cazuri, ciroza se

produce aparent fără factori de risc, evoluţia şi prognosticul lor

nedeosebindu-se însă de cea a formelor clasice. În acest context, se

impune căutarea altor factori de risc pentru boala hepatică cronică,

care să explice măcar în parte etiopatogenia acestor cazuri, foarte

numeroase în cazul ţării noastre.

Având în vedere tropismul recunoscut al AFB1 pentru ţesutul

hepatic, precum şi repetatele evidenţe de contaminare a alimentelor

de pe piaţa locală şi europeană, abordarea unei posibile relaţii între

consumul de alimente contaminate şi boala hepatică cronică este

perfect justificată. Aceasta cu atât mai mult cu cât obiceiurile

alimentare specifice ţării noastre includ consumul pe scară largă a

unor alimente cu risc maxim de contaminare, dintre care pe primul

loc se află porumbul şi derivatele sale. Noile obiceiuri alimentare

„importate” includ de asemenea consumul unor alimente cu risc

maxim de contaminare precum cafeaua şi produsele înrudite sau

alunele de pământ şi alte fructe oleaginoase.

Toate aceste considerente fac din aflatoxine, şi în particular

din AFB1, un important factor de risc pentru boala hepatică cronică

în zona noastră, care poate acţiona atât singur cât şi în combinaţie cu

ceilalţi factori binecunoscuţi (alcoolul şi virusurile). Este de

menţionat că prezenţa AFB1 în sângele pacienţilor a fost deja

raportată. În Taiwan, zonă considerată de risc maxim pentru

3

contaminarea cu micotoxine a alimentelor, aceasta a fost prezentă la

20,9% dintre participanţi la studiu, independent de prezenţa VHB, la

pacienţii fără ciroză 3.

Carcinomul hepatocelular (CHC) este a 5-a tumoră malignă din lume

ca frecvenţă, cu o incidenţă anuală de circa 550.000 cazuri şi o

mortalitate similară. Ultimele statistici arată o incidenţă în creștere,

fiind a 3-a cauză de mortalitate prin cancer şi prima cauză de deces la

pacientul cirotic4. Principalii agenţi etiologici ai CHC sunt

reprezentaţi de ciroză hepatică (CH)5, VHC, VHB, aflatoxina B1,

steato-hepatita non-alcoolică şi hiperinsulinismul6. Tratamentul CHC

este eficient doar în fazele incipiente ale bolii, însă cei mai mulţi

pacienţi sunt diagnosticaţi tardiv, când mijloacele terapeutice cu viză

curativă sunt depăşite 7.

AFB1 este considerată un factor etiologic principal în unele

zone ale lumii (Asia de Sud-Est şi Africa Sub-sahariană), numeroase

studii evidențiind rolul etiopatogenic cert al acestei micotoxine, atât

singură, cât şi în combinaţie cu VHB 8. Deşi ţara noastră nu face

parte din arealul considerat propice pentru dezvoltarea fungilor

toxigeni din genul Aspergillus în culturi (între 400 latitudine nordică

şi sudică), există multiple rapoarte ale prezenţe micotoxinelor în

produse vegetal de uz animal9 sau uman

10. Mare parte din hrana

populaţiei din mediul rural este produsă în propriile gospodării, fiind

apoi consumată sau comercializată fără o verificare micotoxicologică

prealabilă.

Având în vedere cultivarea extensivă a plantei care constituie

unul dintre cele mai bune substraturi pentru dezvoltarea Aspergillus

flavus – porumbul, precum şi aptul că aproape 50% din populaţie

trăieşte în mediul rural, este evidentă posibilitatea contaminării

recoltelor (în timpul culesului, dar mai ales în timpul păstrării) şi

ingestiei de cantităţi semnificative de micotoxine, cu un posibil

impact negativ asupra stării de sănătate a populaţiei.

Studiul retrospectiv prezentat în capitolul I arată o creştere

semnificativă, de circa 75% a numărului de cazuri diagnosticate în

IGH Iaşi în decursul a numai 3 ani.

Toate acestea impun efectuarea de cercetări pentru clarificarea

rolului aflatoxinelor în etiopatogenia hepatocarcinomului în ţara

4

noastră, cu atât mai mult cu cât există previziunea creșterii

semnificative a numărului de cazuri în următorii ani.

Luând în considerare studiile experimentale pe animale, studiile

de biologie moleculară efectuate pe tumorile hepatice rezecate de la

om şi studiile epidemiologice existente la acel moment privitoare la

micotoxine, Agenţia Internaţională pentru Cercetarea Cancerului

(IARC) a declarat încă din 1993 micotoxinele ca fiind sigur

cancerigene sau potenţial cancerigene după cum urmează11

:

- există dovezi suficiente pentru a declara carcinogenetice

pentru oameni mixturile de aflatoxinele întâlnite în natură

(AFB1+AFB2+AFG1+AFG2) (Grup 1),

- există dovezi suficiente pentru a declara carcinogenetică

pentru oameni AFB1 (Grup 1),

- există dovezi suficiente în experimentele pe animale pentru a

declara carcinogenetice pentru animale mixturile de

aflatoxine întâlnit în natură (AFB1+AFB2+AFG1+AFG2)

precum şi aflatoxinele B1, G1 şi M1,

- există date limitate în experienţele pe animale privind

carcinogenicitatea AFB2,

- datele obţinute din experimentele pe animale privind

carcinogenicitatea AFG2 sunt inadecvate,

concluzionând:

1. Aflatoxinele întâlnite în natură sunt carcinogenetice

pentru om (Grup 1).

2. AFM1 este posibil carcinogenetică pentru om (Grup

2A).

3. STC este un posibil carcinogen pentru oameni (Grup

2B).

5

PARTEA PERSONALA

Capitolul 1

Studiu observaţional descriptiv longitudinal al

etiologiei carcinomului hepatocelular în Nord-Estul

României

Scop. Scopul acestui studiu a fost de a determina principalele

etiologii ale cazurilor de CHC înregistrate în IGH în decursul

ultimilor 3 ani: VHB, VHC, infecțiile combinate (B+C şi B+D) şi

consumul de alcool. În paralel, s-au urmărit ponderea cazurilor de

CHC care nu au avut ca substrat ciroza hepatică, precum şi procentul

de cazuri la care nu a fot identificat un factor clar de risc pentru CHC

(dintre cele enumerate mai sus).

Material şi metodă. Studiul a fost realizat retrospectiv,

utilizând baza de date DRG ale cazurilor internate în IGH Iaşi între 1

ianuarie 2008 şi 31 decembrie 2010.

Au fost cuprinşi în studiu toţi pacienţii cu internare în regim

normal externaţi în perioada menţionată, în număr de 19.550, la care

s-a verificat în baza de date diagnosticul de externare (conform

raportării DRG). Având în vedere adresabilitatea deosebită a IGH

Iaşi, majoritatea pacienţilor (58,2%) au fost din judeţele limitrofe şi

40,3% au fost din judeţul Iaşi, lotul fiind reprezentativ pentru

populaţia regiunii studiate. Mediul urban a fost mai bine reprezentat,

de aici provenind 60% dintre pacienţi; raportul femei:bărbaţi a fost

de 1,12.

Au fost selectați pacienţii care prezentau în diagnosticul

principal sau între diagnosticele secundare la externare codul

hepatocarcinomului (C22.0), care au fost analizaţi mai departe în

vederea stabilirii agentului etiologic al bolii şi prezenţei cirozei

hepatice. Verificarea s-a făcut urmărind codurile specifice ale

virusurilor hepatitice B (B18.1) şi C (B18.2) sau ale infecţiilor

combinate: B+C (B18.7) şi B+D (B18.0). Prezenţa cirozei hepatice

6

s-a verificat urmărind codurile de diagnostic ale acesteia, atât pentru

etiologia alcoolică (K70) cât şi pentru etiologia virală (K74).

Datele au fost prelucrate utilizând SPSS v. 13, iar rezultatele

au fost exprimate procentual.

Rezultate şi discuţii. Din totalul de 18970 de pacienţi

internaţi în perioada 01.01.2008 – 31.12.2010, au fost externaţi cu

diagnosticul de CHC un număr de 849 de cazuri, reprezentând 4,47%

din totalul patologiei internate în IGH Iaşi. Numărul de cazuri a avut

o evoluţie crescătoare, de la 188 în 2008, la 339 în 2009 şi 322 în

2010.

Cea mai frecventă etiologie a CHC s-a dovedit a fi VHC,

prezent în 30,62% din totalul cazurilor. Se remarcă creșterea

ponderii VHC ca agent etiologic al CHC de-a lungul perioadei

studiate, de la 28,2% în 2008 la 34,16% în 2010 (Fig. 2).

Ciroza hepatică apărută pe fondul cirozei hepatice alcoolice a

fost următoarea cauză de CHC, fiind înregistrată în 22,05% din

cazuri, urmată de VHB şi asocierea consumului de alcool cu infecţia

virală B sau C, fiecare cu câte 17,43%.

Ponderea asocierii alcool+virus a crescut în 2009-2010 faţă

de 2008, în paralel cu scăderea etiologiei alcoolice, ca unic

determinant al procesului carcinogenetic, care a reprezentat a 2-a

cauză ca frecvenţă depistată pentru pacienţii noştri în perioada

menţionată. De menţionat este faptul că atunci când alcoolul a fost

singurul agent etiologic al CHC, acesta s-a dezvoltat întotdeauna pe

un proces de ciroză etanolică preexistent.

VHB a reprezentat o etiologie aflată într-o scădere relativă,

de la 19,7% în 2008 la 15,2% în 2010, deşi numărul absolut de cazuri

a prezentat o tendinţă de creştere, pe fondul creşterii numărului total

de cazuri de CHC.

Din totalul cazurilor de CHC înregistrate, 18,73% nu au

prezentat un proces precursor de ciroză hepatică, procent care

corespunde cu datele din literatură (10-20% din cazurile de hepatom

apar pe ficat necirotic), aproximativ 50% din aceste cazuri fiind

însoţite de prezenţa unei infecţii virale cronice B sau C.

7

Celelalte 50%, reprezentând 9,89% din totalul cazurilor de

hepatocarcinom înregistrate între 2008-2010 în IGH Iaşi au fost

caracterizate de absenţa unui proces de ciroză hepatică sau a altui

agent etiologic cunoscut, numărul acestora fiind în creştere.

Procentul de cazuri fără o etiologie certă depăşeşte net raportările din

literatură (5-6% pentru pacienţii fără ciroză12

), probabil datorită

lotului studiat – pacienţi internaţi într-un centru terţiar de

gastroenterologie, la care probabilitatea depistării hepatomului este

mult peste cea a clinicilor obişnuite.

În acest context, numărul mare de bolnavi cu

hepatocarcinom, o tumoră de o malignitate şi agresivitate

recunoscută, cu incidenţa egală cu mortalitatea, impune cercetarea

implicării aflatoxinelor ca agent etiologic.

Concluzii

1. Cazurile de carcinom hepatocelular au reprezentat 4,34%

din totalul patologiei diagnosticate în IGH Iaşi în perioada

1 ianuarie 2008 – 31 decembrie 2010, cu o tendinţă clară

de creştere.

2. Cea mai frecventă etiologie a fost reprezentată de VHC,

responsabil de circa 1/3 din cazurile diagnosticate.

3. Ciroza alcoolică este mai frecvent implicată în etiologia

CHC în populaţia studiată decât VHB.

4. Procentul de CHC dezvoltat pe ficat necirotic este

important, dar se înscrie în datele din literatură.

5. Circa 10% din cazurile de hepatocarcinom diagnosticate

sunt de etiologie neprecizată.

8

Capitolul 2

Model experimental de intoxicaţie acută şi cronică

cu aflatoxină B1 şi sterigmatocistină la pui

Scop. Scopul acestei etape a constat în evidenţierea

modificărilor clinice şi histologice induse de ingestia micotoxinelor

studiate.

Materiale şi metodă. Loturile de animale. S-au folosit pui broiler (Gallus gallus) în

vârstă de 4 săptămâni, cu greutate iniţială cuprinsă între 500-550 g.

Motivul alegerii acestora l-a constituit faptul că sunt varianta cel mai

frecvent folosită pentru producţia de carne la nivel industrial,

rezultatele obţinute la această rasă având astfel cea mai mare

importanţă practică. Puii au fost ţinuţi în incinte special amenajate, în

condiţii de mediu relativ constate: temperatură de 20-250C, umiditate

de 40-60%, expunere indirectă la lumina naturală timp de 12 ore/zi.

Hrana a constat din furaje specifice, de provenienţă şi calitate

verificate; apa a fost administrată ad libitum pe parcursul

experimentului.

Substanţe folosite. S-au folosit soluţii de AFB1 şi STC în

concentraţie cunoscută:

- AFB1 cristalină (Aldrich 856207), Sigma-Aldrich, SUA,

reconstituită în soluţie de metanol în concentraţie de 200 μg/ml. În

scopul diminuării expunerii animalelor folosite la doze semnificative

de metanol, soluţia de AFB1 a fost diluată suplimentar cu apă

distilată, fiind administrat un volum total de 5 ml de soluţie.

- STC cristalină (Sigma S3255, puritate peste 98%, CSS), Sigma-

Aldrich, SUA, reconstituită în soluţie de metanol în concentraţie de

900 μg/ml. În scopul diminuării expunerii animalelor folosite la doze

semnificative de metanol, soluţia de STC a fost diluată suplimentar

cu apă distilată, fiind administrat un volum total de 5 ml de soluţie.

- Metanol, apă distilată.

Microscopia optică. Prelevarea fragmentelor de ţesut s-a făcut

după analiza macroscopică a piesei. Acolo unde a fost cazul, s-a

9

prelevat din zonele care prezentau modificări macroscopice

evidente. Din fiecare organ studiat, s-au prelevat cel puţin 3

fragmente (mai multe, dacă existau multiple zone cu modificări

macroscopice sugestive). Fixarea s-a făcut în soluţie de

glutaraldehidă, fragmentele fiind ulterior înglobate în blocuri de

parafină. Secţionarea s-a făcut cu un microtom SL 45, dotat cu lame

Tisue-Tek Accu-Edge (secţiuni cu grosimea de 5 microni), iar

fixarea s-a făcut cu soluţie de fucsină bazică. S-au folosit coloraţii

multiple, în funcţie de parametrii urmăriţi: hematoxilină-eozină, PAS

(pentru glicogen), Gram (pentru bacterii), impregnaţie argentică

(pentru reticulină), iar examinarea s-a făcut cu un microscop optic

Olympus BX41 în lumină artificială.

Microscopia electronică. Imaginile de microscopie

electronică au fost obţinute folosind un microscop electronic de

scanare EDAX QANTA 200, utilizându-se următorii parametri:

- Putere de rezoluție:

- 3,0 nm pentru imagini cu electroni secundari (imagini in toate

cele trei moduri de funcționare);

- 4,5 nm pentru imagini cu electroni retrodifuzaţi;

- Tensiune de accelerare: 200 V – 30 kV;

- Mărire: 400.000X (mărire maximă 1.000.000X).

Secţiunile au fost pregătite cu ajutorul unui ultramicrotomului

LKB Ultratom III la o grosime de 500Ǻ, cu dimensiuni maxime de

3/4 cm (suprafaţa maximă 1200 mm2).

Protocolul studiului. Distribuția puilor s-a făcut în 5 loturi:

1. Lot 1 (martor) – 12 pui, la care s-au administrat 5 ml apă

distilată.

2. Lot 2 – 12 pui, la care s-au administrat 0,01 ml din soluţia AFB1

în metanol (200μg/ml), diluată în 5 ml de apă distilată; doza

totală zilnică a fost de 2 μg.

3. Lot 3 – 12 pui, la care s-au administrat 0,1 ml din soluţia AFB1

în metanol (200μg/ml), diluată în 5 ml de apă distilată; doza

totală zilnică a fost de 20 μg.

4. Lot 4 – 12 pui, la care s-au administrat 0,01 ml din soluţia STC în

metanol (900μg/ml), diluată în 5 ml de apă distilată; doza totală

zilnică a fost de 9 μg.

10

5. Lot 5 – 12 pui, la care s-au administrat 0,1 ml din soluţia STC în

metanol (900μg/ml), diluată în 5 ml de apă distilată; doza totală

zilnică a fost de 90 μg.

Administrarea substanţelor s-a făcut pe cale orală (prin intubare)

şi a fost zilnică, între orele 8 şi 9 dimineața. Dozele folosite pentru

reproducerea intoxicaţiei cronice au fost de 2 μg/kgc de AFB1 şi de

9 μg/kgc de STC, conform modelelor experimentale descrise anterior 13,14

, în timp ce pentru producerea efectelor acute s-au administrat

doze de 10 ori mai mari: 20 μg/kgc de AFB1 şi 90 μg/kgc de STC.

Durata administrării a fost de 3 săptămâni, cu menţiunea că

decesul a 4 pui din lotul cu intoxicaţie acută cu AFB1 în doză de 20

μg/kgc/zi s-a produs în prima săptămână. Toţi puii au fost sacrificaţi

la final, cu prezervarea ficatului, unor părţi din tubul digestiv

(stomac, intestin subţire, intestin gros), rinichilor şi pancreasului.

Examene efectuate:

- Cântărirea (înainte, în timpul şi după administrarea

micotoxinelor).

- Monitorizarea stării clinice şi a comportamentului general.

- Examene histologice şi bacteriologice la puii decedaţi – pentru a

exclude o altă cauză de deces.

- Examene histopatologice în microscopie optică ale tubului

digestiv, ficatului, pancreasului, rinichiului.

- Examene în microscopie electronică, pe probele de ţesut hepatic.

Analiza statistică a rezultatelor. Datele numerice (greutatea

puilor) au fost introduse într-o bază de date alcătuită în IBM SPSS

Statistics v.19. Rezultatele au fost exprimate ca media ± deviaţie

standard (DS), iar diferenţele între loturi au fost comparate folosind

testul t-Student; valoarea p<0.05 a fost considerată cu semnificaţie

statistică. Corelaţia dintre rezultatele obţinute a fost stabilită prin

testul Pearson, fiind considerate semnificative valori ale

coeficientului de corelaţie (r) peste aflate între intervalele -1 – -0.3 şi

0.3 – 1. Corelaţia pozitivă a fost considerată slabă pentru r=0,3-0,5,

medie pentru r=0.5-0.7 şi puternică la r>0.7; valori corespondente au

fost considerate şi pentru corelaţia negativă. Pentru compararea

frecvențelor cu care un eveniment intervine, s-a folosit testul Fisher-

exact, valoarea p<0.05 fiind considerată semnificativă statistic.

11

Rezultate şi discuţii.

Greutatea medie a puilor. Toţi cei 60 de pui au fost cântăriţi

iniţial, distribuţia pe loturi fiind efectuată astfel încât greutatea medie

iniţială să nu prezinte diferenţe semnificative între loturi. Greutatea

medie iniţială a puilor a fost cuprinsă între 519,42±14,28 g şi

524,33±18,9 g, fără diferenţe semnificative statistic la compararea

loturilor între ele: p>0.05, în toate cazurile (tabelul 1).

Greutatea medie a puilor intoxicaţi cu micotoxine a înregistrat la

sfârşitul celor 21 de zile de administrare valori care au oscilat între

423 g şi 602 g, comparativ cu lotul martor care a cântărit în medie

635 g; au rezultat diferenţe negative semnificative la puii intoxicaţi,

cu limite de variaţie cuprinse între 33-212 g/pui.

Puii din lotul martor au crescut semnificativ în greutate în medie

cu 113,75 g în cele 3 săptămâni ale experimentului, creştere aflată în

limite normale pentru rasa de pui şi vârsta iniţiale (p=10-15

). Creştere

ponderală s-a înregistrat şi în loturile cu doze mici de micotoxine:

- lotul 2 – creştere medie de 45,5 g, înalt semnificativă statistic

(p=10-6

);

- lotul 4 – creştere medie de 65,5 g, înalt semnificativă statistic

(p=10-10

).

Creşterea a fost proporţională cu greutatea iniţială, valorile

iniţiale şi finale ale masei corporale prezentând o corelaţie pozitivă

medie pentru lotul 1 şi 4 (r=0.59, respectiv r=0.65), şi puternică

pentru lotul 2 (r=0.72).

Rezultatele obţinute arătă că un nivel mic de intoxicaţie zilnică

nu stopează creşterea în greutate a puilor, care îşi continuă

dezvoltarea morfologică, dar la un nivel suboptimal. Comparaţia cu

lotul martor arată o scădere de 11,03% a progresului ponderal la lotul

cu 2 μg/kgc/zi de AFB1 (p=10-10

) şi cu 7,56% la lotul cu 9 μg/kgc/zi

de STC (p=10-8

). Rezultatele sunt comparabile cu datele din

literatură, care apreciază o scădere a progresului ponderal la puii cu

intoxicaţie cronică cu micotoxine de circa 10% 15

.

Loturile de pui care au primit doze mari de micotoxine au

prezentat scădere ponderală faţă de începutul experimentului, pe

fondul unei reduceri semnificative a ingestiei de furaje, iar unii dintre

puii care au primit AFB1 în doză de 20 μg/kgc/zi au şi decedat.

12

Aceasta a fost semnificativă pentru toate aceste loturi, atât faţă de

martor, cât şi faţă de greutatea iniţială:

- lotul 3 – scădere a ponderală cu 13,5% faţă de greutatea iniţială,

proporţională cu acesta (corelaţie pozitivă puternică, r=0.81);

- lotul 5 - scădere a ponderală cu 7,51% faţă de greutatea iniţială,

de asemenea proporţional cu acesta (r=0.82).

Rezultatele demonstrează efectul metabolic profund al dozelor

mari de micotoxine, ca şi mortalitatea de 25% determinată de AFB1

în doze mari (crescută comparativ cu martorul, dar nesemnificativă

statistic; test Fisher-exact, p=0.09), observată şi în epidemiile

înregistrate la om. Se confirmă astfel că şi la pui, ca şi la om,

sensibilitatea la acţiunea AFB1 este individuală, animalele

reacţionând complet diferit la toxină (de la păstrarea unei stări

generale bune şi o scădere uşoară în greutate, la deces după numai 2

administrări).

Monitorizarea stării clinice şi a comportamentului general.

Puii cărora li s-au administrat cantităţi mici de AFB1 (2 μg/kgc)

şi STC (9 μg/kgc) şi nu au prezentat pe parcursul experimentului

modificări ale stării generale.

Puii din loturile care au primit doze mari de aflatoxină (20

μg/kgc) şi sterigmatocistină (90 μg/kgc) au acuzat o stare evidentă de

suferinţă, observată chiar după prima administrare în cazul AFB1 şi

după câteva zile, la anumiţi indivizii din lotul care a primit

sterigmatocistină. Semnele clinice s-au caracterizat prin apatie,

somnolenţă, adinamie, astazii şi ataxii, cifoză, horiplumaţie

(pierderea luciului penelor, care au devinit mate). La toţi puii lotului

cu 20 μg/kgc aflatoxină B1, s-a observat absenţa totală a apetitului,

ingluvia fiind complet lipsită de furaje. Un alt semn clinic evident

caracteristic a fost lipsa de vioiciune şi a mobilităţii puilor. După

câteva zile de la administrarea celor două micotoxine, modificările

clinice s-au accentuat, puii preferau decubitul şi acuzau sindrom de

imobilitate, stare de prostraţie, cu reducerea până la abolire a funcţiei

de relaţie. După 48 de ore de la prima administrare de AFB1, un pui

a murit, apoi un altul la 36 de ore, un al treilea după 6 zile şi încă

unul după 7 zile. Mortalitatea a fost înregistrată numai la puii care au

13

fost intoxicaţi cu AFB1 în doză de 20 μg/kgc, şi nu a depins de

greutatea lor de la iniţierea experimentului. La puii decedaţi în prima

săptămână, s-au efectuat examenul histopatologic şi bacteriologic a

multiple organe (os, ficat, cord, măduvă osoasă), care nu au

evidenţiat prezenţa microorganismelor aerobe mezofile, astfel încât

decesul s-a datorat ingestiei de aflatoxină.

Experimentul a demonstrat că a existat un grad accentuat de

heterogenitate al indivizilor din toate loturile care au ingerat

micotoxine, unii dintre aceşti decedând rapid iar alţii supravieţuind

toată perioada. După cum s-a observat şi în practica zilnică

(zootehnie), nu există semne clinice evidente în cazul ingestiei

dozelor mici de micotoxine, consecinţele acestora fiind mult mai

subtile şi manifestându-se pe termen lung: deficit de creştere

ponderală, care va duce în cele din urmă la scăderea marcată a

productivităţii (principalul scop al creşterii puilor broiler, folosiţi în

experiment, este cel al producţiei de carne).

Examene histopatologice în microscopie optică. Semnele

clinice severe manifestate de puii cărora li s-au administrat AFB1 şi

STC în doze mari au fost expresia unor leziuni grave caracteristice,

de distrofie grasă hepatică şi renală care se întâlneşte constant în

intoxicaţia cu micotoxine hepato-nefrotoxice.

Examenul macroscopic efectuat la necropsia puilor a evidenţiat

hipotrepsia acestora (severă la cei cu dozele mari de micotoxine),

distrofie grasă hepato-renală şi o accentuată supradimensionare a

glandelor suprarenale.

Modificările morfopatologice induse experimental prin

administrarea orală de aflatoxină B1, au fost evidente, unele

caracteristice, iar intensitatea lor s-a diferenţiat în funcţie de doză şi

perioada de ingerare a substanţei toxice. Rezultatele obţinute în cazul

intoxicaţiei puilor de carne cu doza de 2 μg/kgc aflatoxină B1, au

arătat că substanţa s-a comportat ca un compus toxic care a afectat în

primul rând ţesuturile cu care a venit în contact. În urma

administrării micotoxinelor, s-a constatat o activare a secreţiei de

mucus la nivelul mucoasei digestive, evidentă prin creşterea

numărului şi dimensiunilor celulelor caliciforme de la nivelul

14

intestinului. Această modificare, cel mai probabil o încercare de

adaptare a mucoasei la prezenţa toxicului, a avut drept scop probabil

scăderea absorbției acestuia şi s-a instalat încă din primele zile de

administrare, fiind prezentă şi la puii decedaţi prematur din lotul 3.

Ulterior, această tulburare, predominant fiziologică, s-a complicat cu

o inflamaţie catarală la acest nivel, constatându-se creşterea

numărului de polimorfonucleare şi mononucleare din mucoasă şi

submucoasă. Infiltratul inflamator mixt, a avut intensităţi variabile şi

a interesat în special proventriculul şi duodenul.

Cel mai afectat organ a fost ficatul, leziunile induse fiind distrofia

grasă a hepatocitelor şi vacuolizarea acestora, prin apariţia de

depozite lipide de mari dimensiuni, care au împins nucleul spre

periferie. S-a mai constatat prezenţa în citoplasmă a unui material

eozinofil depozitat în cantităţi variabile, care în coloraţie PAS s-a

dovedit a fi glicogen. Nemaifiind utilizat în arderea lipidelor şi

neputând fi exteriorizat (transportul transmembranar este profund

afectat în intoxicaţie cu AFB1), glicogenul a fost depozitat în

citoplasma celulelor hepatice. Modificările de degenerescenţă grasă

au fost întâlnite şi la nivelul rinichilor, deşi într-o măsură mai mică

decât în ficat. La puii decedaţi în prima săptămână, degenerarea

hepato-renală a fost foarte accentuată, iar la nivelul ficatului s-a

constatat un extins proces de necroză, cu relativ puţine elemente

inflamatorii şi colapsul reţelei de reticulină (evidenţiat prin coloraţia

Gomori). Cel mai probabil, cauza decesului a fost insuficienţa

hepatică fulminantă, care a avut ca substrat histopatologic necroza

extinsă a parenchimului hepatic.

În următoarele două săptămâni experimentale, tabloul lezional

hepatic a prezentat o creştere a elementelor inflamatorii, predominant

mononucleare, dar şi un important proces de fibrogeneză care a

favorizat instalarea în timp a fibrozei hepatice, evidenţiată prin

coloraţia van Gieson. Deşi degenerarea grasă şi necroza

caracterizează leziunile histologice induse de intoxicaţia acută cu

AFB1, la puii supravieţuitori s-a observat într-o proporţie importantă

acest proces de fibrogeneză accelerată, succesiunea inflamaţie –

necroză – fibroză fiind caracteristică la toate speciile animale,

inclusiv la om. Această constatare ridică problema unei eventuale

15

intervenţii patogenice a intoxicaţiei acute cu aflatoxine şi la alte

specii animale, care să contribuie pe termen lung la procesul

cirogenetic.

La nivelul pancreasului, s-a constatat o uşoară creştere în volum

pe seama degenerescenței grăsoase, dar fără aspecte inflamatorii sau

sugestive pentru fibroză la examenul microscopic. Modificările

induse au părut a avea predominant consecinţe funcţionale, fiind

dependente de doza administrată. La dozele mici de (AFB1 2 μg/kgc

şi STC 9 μg/kgc), s-a înregistrat diminuarea secreţiei celulare, fiind

observată diminuarea numărului şi dimensiunilor veziculelor

excretorii de la polul apical, alături de apariţia unor vacuole de natură

lipidică, de dimensiuni şi formă variabile. Efectul a fost invers la

dozele mari, care au declanşat o creştere a activităţii secretorii, cu

reducerea cantitativă şi numerică a vacuolelor citoplasmatice din

celulele acinoase.

Trebuie subliniat că nici una dintre modificările histologice

hepatice constatate nu sunt specifice intoxicaţiei cu micotoxine, orice

toxic hepatic şi unii agenţi infecţioşi fiind capabili să le reproducă.

Această constatare îndepărtează posibilitatea identificării unui

marker histopatologic specific de intoxicaţie cu AFB1, dar subliniază

posibilitatea ca această să acţioneze împreună cu alţi factori, toxine

sau virusuri, pentru producerea aceleiaşi consecinţe: fibroza hepatică.

Sterigmatocistina, ca precursor al aflatoxinei B1, este mai puţin

toxică decât aceasta, şi din acest motiv efectele biologice pe care le

manifestă faţă de organele afectate sunt mai puţin severe. În general,

modificările produse de doza de 90 μg/kgc au fot similare cu cele

determinate de AFB1 în doza de 20 μg/kgc, dar mai atenuate, mai

ales la nivelul componentei de necroză şi fibroză hepatică.

Examenul probelor de ţesut hepatic în microscopie

electronică. Deşi în microscopia optică erau evidente doar leziuni

„obişnuite” de steatoză hepatică, imaginile obţinute în microscopia

electronică au demonstrat că chiar şi dozele mici de micotoxine sunt

capabile să provoace dezintegrarea citoplasmei la marea majoritate a

hepatocitelor, cu distrugerea organitelor celulare, dar fără a afecta

structura nucleului. Imaginile electronomicroscopice au evidenţiat

16

aspectul spongios al citoplasmei hepatocitelor datorat vacuolelor

lipidice, variabile ca dimensiuni şi formă. Organitele celulare s-au

distins cu dificultate în structura citoplasmei, iar schiţa conţinutului

lor a fost foarte greu de observat. Numărul de mitocondrii a fost

crescut, ca şi dimensiunile lor, uneori constituindu-se adevărate

„megamitocondrii”. Reticulul endoplasmic a fost mai puţin afectat de

substanţele toxice ingerate, iar aparatul Golgi a fost redus ca

dimensiuni.

La administrarea de doze mari de AFB1, aceleaşi vacuole au fost

observate şi în structura nucleilor, care au etalat modificări

ireversibile, ei fiind surprinşi adesea omogenizaţi şi în diferite faze

de necrobioză.

Doze mici de sterigmatocistină (9 μg/kgc) au produs în structura

ficatului modificări asemănătoare celor observate la puii care au

ingerat 2 μg/kgc aflatoxină. Citoplasma celulelor hepatice a

prezentat o structură dezintegrată, în care s-a observat un număr

sporit de mitocondrii, ce au avut şi un volum considerabil mai mare

constituindu-se în adevărate megamitocondrii. Sterigmatocistina

administrată în doze mari (90 μg/kgc ), a produs modificări mult mai

severe la nivelul hepatocitelor; s-a observat un proces accentuat de

dezintegrare a citoplasmei, cu formarea de vacuole lipidice şi

creşterea numerică şi dimensională a mitocondriilor. În marea lor

majoritate, nucleii au fost surprinşi în necrobioză.

Aceste profunde modificări structurale explică tulburările

funcţionale ale ficatului, simptomatologia gravă şi decesul unor pui

le-au prezentat pe tot parcursul experimentului.

Se poate afirma că cele două micotoxine acţionează oarecum

identic, la doze similare. Pe fondul unor tulburări metabolice severe,

ele au determinat profunde modificări structurale gastrointestinale,

renale, şi mai ales hepatice. Chiar dacă acestea au fost caracteristice,

anomaliile induse au cuprins atât citoplasma cât şi nucleul,

compromiţând funcţia şi viabilitatea celulelor.

17

Concluzii. 1. Dozele mici de micotoxine au ca efect compromiterea

procesului de creştere al puilor, acesta desfăşurându-se

suboptimal.

2. Dozele mari din micotoxinele administrate afectează grav

dezvoltarea puilor, ducând la hipotrepsie generalizată, cu

inversarea procesului de creştere.

3. Sensibilitatea indivizilor la acţiunea AFB1 este variabilă, rata

deceselor înregistrate în rândul animalelor de experienţă fiind

similară cu cea observată în epidemiile umane de aflatoxicoză

acută.

4. La nivelul tubului digestiv şi pancreasului, modificările

induse sunt uşoare, având predominant un caracter funcţional.

5. AFB1 şi STC determină leziuni de degenerescenţă grasă la

nivelul ficatului şi rinichiului, iar în doză mare produc

necroză hepatică semnificativă şi activează mecanismele

fibrogenetice, ducând la fibroză semnificativă.

6. Dezintegrarea citoplasmei, cu alterarea structurii şi funcţiilor

organitelor celulare apar chiar şi după administrarea de doze

mici de micotoxine.

7. Dozele mari de micotoxine alterează grav şi ireversibil

funcţia celulară, determinând necrobioza nucleilor şi moartea

celulară.

Capitolul 3

Evaluarea gradului de ingestie al micotoxinelor

prin metoda chestionarului alimentar

Scop. Stabilirea frecvenței consumului alimentelor cu risc

major de contaminare directă (cele în care se dezvoltă fungii

toxigeni) şi a celor cu risc de contaminare indirectă (produse de

origine animală) la un lot de pacienţi fără afectare hepatică (martor),

cu ciroză hepatică (CH) şi cu carcinom hepatocelular (CHC). Având

18

în vedere obiceiurile alimentare diferite şi accesul total diferit la

alimente de calitate verificată ale locuitorilor din mediul urban faţă

de cei din mediul rural, s-a urmărit în mod special identificarea

profilului de risc în funcţie de mediul de provenienţă.

Materiale şi metodă. Loturile de studiu. În studiu au fost incluşi 166 de

participanţi, internaţi în Institutul de Gastroenterologie şi

Hepatologie (IGH) Iaşi în perioada octombrie 2007 – februarie 2010.

Selecţia participanţilor s-a făcut pe baza criteriilor de includere şi

excludere, în ordinea internării în clinică. Toţi participanţii au semnat

consimțământul informat de participare la studiu şi au completat

chestionarul de frecvenţă alimentară, după care s-a recoltat sânge şi

urină pentru determinarea probelor biologice.

Toţi participanţii la studiu au primit un formular de

informare succintă asupra originii micotoxinelor, efectului

acestora asupra stării de sănătate şi unele sfaturi pentru evitarea

intoxicaţiei cronice.

Criteriile de includere au fost următoarele:

1. semnarea consimțământului informat

2. absenţa modificărilor importante în stilul de alimentaţie în

ultimul an;

3. stabilirea gradului de afectare hepatică, prin investigaţii

specifice, efectuate în clinică;

4. investigarea completă a funcţiei hepatice şi a etiologiei

afecțiunii hepatice (pentru participanţii cunoscuţi cu CH sau

CHC);

5. completarea corectă şi completă a CFA.

Criteriile de excludere au fost reprezentate de:

1. lipsa unei stadializări corecte a bolii hepatice (care ar fi dus la

dificultăţi de încadrare a pacienţilor în loturile de studiu);

2. declararea unor modificări importante în stilul de alimentaţie,

efectuate în ultimul an;

3. patologie asociată care ar fi determinat dificultăţi în

completarea corectă a chestionarului (boli asociate cu

tulburări ale memoriei).

19

Pe baza criteriilor de excludere, 18 pacienţi care au completat

iniţial chestionarul alimentar şi cărora li s-au recoltat probe biologice

au fost excluşi din studiu, datorită prezenţei afectării hepatice cronice

care nu a putut şi încadrată ca CH sau CHC, făcând imposibilă

încadrarea lor ulterioară în grupele de pacienţi urmărite. La acești pacienţi, nu s-au realizat determinările de micotoxine în lichidele

biologice.

Cei 166 de participanţi rămaşi au fost încadraţi în 3 loturi, după

cum urmează (Fig.1):

1. Lotul 1 (martor) – 55 de participanţi (30M, 25F), la care

examenul clinic, investigaţiile imagistice (ecografia abdominală) şi

biologice (parametrii funcţiei hepatice şi markerii virali) au exclus

prezenţa afectării hepatice. Internarea în spital a fost motivată de alte

patologii, fără legătură cu funcţia hepatică.

2. Lotul 2 (CH) – 58 de participanţi (34M, 24F), la care

diagnosticul de CH a fost stabilit pe baza criteriilor:

- anamnestice – decelarea unui factor etiologic (virus, consum

important de alcool), existenţa diagnosticului anterior de CH

(stabilit în IGH sau într-o altă clinică de specialitate);

- clinice – semne de etilism cronic (eritroză facială, hipertrofie

parotidiană bilaterală, contractură Dupuytren), semne cutanate

(icter, steluţe vasculare, eritroză palmară, circulaţie colaterală),

hepatomegalie, splenomegalie, edeme, prezenţa complicaţiilor

cirozei (ascită, encefalopatie hepatică, hemoragie digestivă

superioară, etc);

- imagistice – aspect ecografic nodular al ficatului, semne de

hipertensiune portală, ascită, etc.

- biologice – prezenţa sindroamelor hepatopriv, colestatic, de

hiperreactivitate mezenchimală, hepatocitolitic; evidenţierea

hipersplenismului hematologic; markeri virali pozitivi; indicatori

biologici ai consumului cronic exagerat de alcool (creşterea

izolată a GGT, macrocitoză, raport TGO:TGP>2), probe

biologice specifice pentru excluderea hemocromatozei, bolii

Wilson, deficitului de α1-antitripsină, hepatitei autoimune, etc.

3. Lotul 3 (CHC) – 53 de participanţi (34M, 19F), la care

diagnosticul de CHC a fost stabilit pe baza criteriilor:

20

- anamnestice – diagnosticul anterior de CH (bine argumentat),

decelarea unui factor etiologic cunoscut (virus, alcool),

degradarea recentă a stării clinice la un cirotic anterior

compensat, etc.

- clinice – semne de CH, prezenţa complicaţiilor cirozei recent

instalate, fără un factor precipitant identificabil, apariţia durerii

abdominale, anorexia, scăderea ponderală, prezenţa trombozelor

venoase, etc.

- imagistice – semne de hipertensiune portală, semne de

decompensare a funcţiei hepatice, tromboza venei porte sau a

venelor suprahepatice, nodul hepatic evidenţiat ecografic, la care

2 metode imagistice au evidenţiat hipervascularizaţia de timp

arterial, cu wash-out rapid în faza venoasă);

- biologice – prezenţa sindroamelor de afectare hepatică cronică;

markeri virali pozitivi; creşterea α-fetoproteinei serice (AFP);

probe biologice specifice pentru excluderea hemocromatozei,

bolii Wilson, deficitului de α1-antitripsină, hepatitei autoimune,

etc.

Fig. 1. Structura loturilor de pacienţi

Chestionarul de frecvenţă alimentară. Având în vedere

scopul prezentului studiu – evaluarea aportului alimentar de

micotoxine ca factor de risc în patologia umană, chestionarul de

frecvenţă alimentară cu caracter retrospectiv s-a impus ca fiind

singura metodă viabilă de lucru, datorită multiplelor avantaje pe care

le oferă:

21

- evaluează obiceiurile alimentare pe o perioadă lungă de

timp, necesar pentru ca expunerea la cantităţi mici de

micotoxine să determine alterarea stării de sănătate;

- alimentele posibil contaminate cu micotoxine îndeplinesc

toate condiţiile necesare includerii lor într-un CFA;

- prezenţa micotoxinelor în alimentul finit nu depinde de

modul de preparare al acestuia (care nu este relevat printr-

un CFA);

- permite combinarea datelor de ordin calitativ cu cele de

ordin cantitativ.

Cercetarea extensivă a datelor din literatură nu a dus la

identificarea nici unui model de chestionar alcătuit cu scopul de a

verifica gradul de ingestie a micotoxinelor, care să fie validat

anterior.

Chestionarul administrat pacienţilor a fost unul de tip

calitativ şi a urmărit depistarea obiceiurilor alimentare ale

participanţilor în cursul anului precedent, fiind excluşi pacienţii care

au relatat iniţial modificări semnificative ale dietei în această

perioadă. Întrebările au fost alcătuite în funcţie de grupele de

alimente şi de probabilitatea contaminării acestora cu micotoxine,

fiind grupate după cum urmează:

- alimente cu risc mare de contaminare, în care s-a demonstrat

posibilitatea dezvoltării speciilor de Aspergillus producătoare de

AFB1: porumb şi derivate, condimente, cafea, fructe oleaginoase

(nuci), fructe uscate, cereale, seminţe uleioase uscate;

- alimente cu risc mediu de contaminare, în care micotoxinele

ajung indirect sau sub formă de metaboliţi: carne şi produse din

carne, lactate, ouă.

Chestionarul a urmărit tipul de alimente consumate (calitativ)

şi a cuprins 23 de întrebări cu răspuns unic (de tip „complement

simplu”), structurate pe două domenii:

- referitoare la alimentele cu risc major de contaminare – 11

întrebări;

- referitoare la alimentele cu risc mediu de contaminare – 12

întrebări.

22

Întrebările aparţinând celor două domenii au fost intercalate.

Au existat 6 variante de răspuns (A-E), astfel structurate încât să

releve o diferenţă netă:

- răspunsurile A, B şi C au relevat un consum frecvent (de la

câteva prize pe zi la minim o priză la două zile);

- răspunsurile C, D şi E au relevat un consum rar, de maxim

1-2 prize pe săptămână.

Răspunsul din categoria A-C a fost considerat ca semnificând

un consum frecvent, iar răspunsul din categoria D-F a fost considerat

ca semnificând un consum rar.

Analiza statistică a rezultatelor. Rezultatele înregistrate au

fost introduse într-o bază de date alcătuită în IBM SPSS Statistics

v.19. Semnificaţia statistică a diferenţelor constatate s-a verificat prin

testul χ2 fără corecţie Yates sau testul Fisher-exact (în funcţie de

numărul de cazuri implicate), iar valoarea p<0.05 a fost considerată

cu semnificaţie statistică. Pentru compararea valorilor numerice s-a

folosit testul t-Student, valoarea p<0.05 fiind considerată cu

semnificaţie statistică.

Rezultate şi discuţii.Vârsta medie a pacienţilor din lotul

martor a fost de 52,4±7,6 ani, fără diferenţe semnificative faţă de

pacienţii din lotul cu CH, care au avut o vârstă medie de 54,6±7,1 ani

(p=0.13). Vârsta medie a pacienţilor din lotul cu CHC a fost de

57,8±8 ani, semnificativ mai mare decât în lotul martor (p=0.005)

sau în lotul cu CH (p=0.01).

Din totalul de 166 de participanţi şi 1826 de răspunsuri culese

cu ajutorul chestionarului la întrebările specifice, un procent de

19,87% dintre participanţi au declarat un consum frecvent de

alimente cu risc major de contaminare.

Analizând rezultatele CFA, s-a constatat că în lotul martor s-a

înregistrat cel mai important consum de alimente cu risc maxim de

contaminare, de 22,81% (Fig. 2), în vreme ce alimentele cu risc

mediu ce decontaminare au fost consumate frecvent de circa 50%

dintre pacienţii lotului martor. Acest rezultat este explicabil prin

faptul că un număr important de alimente cu risc major de

23

contaminare (fructele oleaginoase, provenite numai din import;

fructele uscate; semințele uleioase uscate; condimentele de tipul boia

de ardei, paprika, turmeric etc.) nu fac parte din alimentaţia uzuală a

populaţiei, mai ales a celei din mediul rural.

Pacienţii din lotul cu CH au prezentat un nivel similar de

consum frecvent al alimentelor cu risc maxim de contaminare, de

18,97%, fără o diferenţă semnificativă statistic faţă de primul lot,

p=0.09. Ca şi în cazul acestuia, aproximativ 50% au declarat un

consum frecvent de alimente cu risc mediu de contaminare,

alimentele din acest grup fiind în general de origine animală.

Pacienţii din lotul cu hepatocarcinom au consumat alimente

predispuse la contaminarea cu micotoxine cu o frecvenţă de 20,5%,

situându-se între lotul martor şi cel cu CH, dar fără diferenţe statistic

semnificative faţă de aceştia. În acelaşi timp însă, au consumat în

proporţia cea mai mare alimente cu risc mediu de contaminare

aproximativ, 2/3 declarând un consum frecvent al acestora; diferenţa

este înalt semnificativă statistic, atât faţă de lotul martor (p=10-6

), cât

şi faţă de pacienţii cirotici (p=10-4

) (Fig. 6). Aceste diferenţe

importante sunt cel mai probabil efectul prezenţei bolii, confirmând

faptul că prezenţa unei afecţiuni hepatice cronice cunoscute are drept

efect o schimbare a stilului alimentar al pacienţilor. În marea

majoritate a cazurilor, hepatomul s-a dezvoltat pe o ciroză hepatică

preexistentă, care evolua la pacienții respectivi de o perioadă mai

îndelungată.

Cum pentru cei mai mulţi pacienţi ideea de „regim alimentar”

echivalează cu reducerea cantităţii de sare şi creşterea consumului de

vegetale proaspete, este posibil ca mulţi dintre componenţii lotului cu

CHC să fi adoptat o astfel de dietă. Neprezentând nici un risc pentru

contaminarea cu aflatoxine, fructele şi legumele verzi nu au fost

cuprinse în chestionarul administrat pacienţilor. Datele obţinute din

chestionarul alimentar sunt sintetizate în Fig. 2 şi Fig. 3, şi nu

confirmă un rol semnificativ al aportului alimentar de micotoxine,

care să intervină semnificativ în procesul de carcinogeneză hepatică.

24

Fig. 5. Evoluţia frecvenţei consumului de alimente cu Fig. 6. Evoluţia frecvenţei consumului de alimente cu

risc mediu de contaminare la cele trei loturi risc major de contaminare la cele trei loturi

Nu s-au constatat diferenţe semnificative legate de sexul

participanţilor între tipul de alimente consumate, la nici unul dintre

loturi.

La nivelul întregului lot de pacienţi, au existat diferenţe

importante între mediul rural şi cel urban, care nu s-au menţinut însă

la analiza pe loturi (datorită numărului mai mic de subiecţi analizaţi).

Astfel, pacienţii din mediul urban au declarat în proporţie de 57% un

consum de alimente de provenienţă animală (cu risc mediu de

contaminare), comparativ cu cei din mediul rural (50,3%), diferenţa

fiind înalt semnificativă statistic, p=0.0035 (Fig. 7). În opoziţie,

pacienţii din mediul rural au prezentat un consum semnificativ mai

mare de alimente cu risc major de contaminare decât cei din mediul

urban (Fig. 8). Acest fapt poate fi explicat prin particularităţile

culinare specifice celor două zone (cel mai probabil printr-un consum

mai mare de porumb şi derivate – mămăligă, în mediul rural), dar

reprezintă şi o informaţie foarte utilă în vederea instituirii unor

măsuri active de depistare şi combatere a contaminării cu micotoxine

a alimentelor.

Cea mai importantă problemă legată de acurateţea datelor

colectate printr-un chestionar de frecvenţă alimentară este

dependenţa de memoria pacientului. De asemenea, exprimarea

subiectivă a pacientului privind modul său de alimentaţie, precum şi

p=0.17

%

%

25

o serie întreagă de alţi factori de moment (stresul indus de spitalizare,

dispoziţia de moment, gradul de afectare a stării generale determinat

de boala de bază, modul de interacţiune cu personalul medical etc.)

pot influenţa răspunsurile date de pacienţi, crescând gradul de

incertitudine al datelor declarate.

În ceea ce priveşte chestionarul folosit în acest studiu, există

doi importanţi factori de eroare: aproximarea cantităţii de toxine

ingerate (nu cunoaştem ce cantitate de alimente presupus

contaminate s-a consumat şi care era gradul lor de contaminare) şi

însăşi incertitudinea prezenţei contaminării alimentelor consumate.

Metoda are însă şi avantajul că se bazează pe determinarea

obiceiurilor alimentare ale pacientului – iar acestea au tendinţa să fie

stabile în timp. Corelată cu patologia existentă, prezenţa sau absenţa

altor factori de risc şi eventual nivelul de micotoxine în sângele

pacienţilor, se poate dovedi utilă pentru aprecierea globală a stilului

de alimentaţie ca factor de risc pentru patologia urmărită.

Concluzii. 1. Consumul frecvent de alimente cu risc maxim de contaminate cu

micotoxine a fost declarat de 1 din 5 participanţi.

2. CFA nu a confirmat un rol important al micotoxinelor în

producerea hepatocarcinomului, frecvenţa consumului de

alimente cu risc major de contaminare fiind medie la aceşti

pacienţi.

3. Prezenţa bolii hepatice cronice are un impact important asupra

stilului de alimentaţie al pacienţilor.

4. Produsele de origine animală, care au un risc mediu de

contaminare cu micotoxine, sunt consumate mai frecvent în

mediul urban.

5. Pacienţii din mediul rural au un consum semnificativ crescut de

alimente cu risc maxim de contaminare faţă de cei din mediul

urban.

26

Capitolul 4

Determinarea micotoxinelor in produse biologice

provenitede la pacienți cu ciroză hepatică

Scop. Identificarea prezenţei şi dozarea concentraţiei AFB1 şi

STC în produsele biologice (sânge şi urină) provenite de la pacienţi

diagnosticaţi cu ciroză hepatică. În cazul prezenţei acestora, s-au

urmărit corelaţia cu nivelul AFP şi al enzimelor hepatice de citoliză

şi colestază.

Materiale şi metodă.

Loturile de studiu. Studiul a fot efectuat pe un lot de 58 de

pacienţi cirotici, care a fost comparat cu un lot de control de 55 de

pacienţi fără afectare hepatică. Participanţii a studiu au fost recrutaţi

dintre pacienţii internaţi în Institutul de Gastroenterologie şi

Hepatologie (IGH) Iaşi în perioada octombrie 2007 – februarie 2010.

Selecţia participanţilor s-a făcut pe baza criteriilor de includere şi

excludere, în ordinea internării în clinică. Toţi participanţii au semnat

consimțământul informat de participare la studiu, după care li s-a

recoltat sânge şi urină pentru determinarea probelor biologice.

Toţi participanţii la studiu au primit un formular de

informare succintă asupra originii micotoxinelor, efectului

acestora asupra stării de sănătate şi unele sfaturi pentru evitarea

intoxicaţiei cronice.

Criteriile de includere au fost următoarele:

6. semnarea consimțământului informat

7. absenţa modificărilor importante în stilul de alimentaţie în

ultimul an;

27

8. stabilirea gradului de afectare hepatică, prin investigaţii

specifice, efectuate în clinică;

9. investigarea completă a funcţiei hepatice şi a etiologiei

afecțiunii hepatice (pentru participanţii cunoscuţi cu CH sau

CHC);

10. completarea corectă şi completă a CFA.

Criteriile de excludere au fost reprezentate de:

4. lipsa unei stadializări corecte a bolii hepatice (care ar fi dus la

dificultăţi de încadrare a pacienţilor în loturile de studiu);

5. declararea unor modificări importante în stilul de alimentaţie,

efectuate în ultimul an;

6. patologie asociată care ar fi determinat dificultăţi în

completarea corectă a chestionarului (boli asociate cu

tulburări ale memoriei).

Pe baza criteriilor de excludere, 18 pacienţi cărora li s-au recoltat

iniţial probe biologice au fost excluşi din studiu, datorită prezenţei

afectării hepatice cronice, dar care nu a putut şi încadrată ca CH. La

acești pacienţi, nu s-au realizat determinările de micotoxine în

lichidele biologice.

Structura celor 2 loturi a fost următoarea (Fig.1):

1. Lotul 1 (martor) – 55 de participanţi (30M, 25F), la care

examenul clinic, investigaţiile imagistice (ecografia abdominală) şi

biologice (parametrii funcţiei hepatice şi markerii virali) au exclus

prezenţa afectării hepatice. Internarea în spital a fost motivată de alte

patologii, fără legătură cu funcţia hepatică.

2. Lotul 2 (CH) – 58 de participanţi (34M, 24F), la care

diagnosticul de CH a fost stabilit pe baza criteriilor:

- anamnestice – decelarea unui factor etiologic (virus, consum

important de alcool), existenţa diagnosticului anterior de CH

(stabilit în IGH sau într-o altă clinică de specialitate);

- clinice – semne de etilism cronic (eritroză facială, hipertrofie

parotidiană bilaterală, contractură Dupuytren), semne cutanate

(icter, steluţe vasculare, eritroză palmară, circulaţie colaterală),

hepatomegalie, splenomegalie, edeme, prezenţa complicaţiilor

cirozei (ascită, encefalopatie hepatică, hemoragie digestivă

superioară etc);

28

- imagistice – aspect ecografic nodular al ficatului, semne de

hipertensiune portală, ascită etc.

- biologice – prezenţa sindroamelor hepatopriv, colestatic, de

hiperreactivitate mezenchimală, hepatocitolitic; evidenţierea

hipersplenismului hematologic; markeri virali pozitivi; indicatori

biologici ai consumului cronic exagerat de alcool (creşterea

izolată a GGT, macrocitoză, raport TGO:TGP>2), probe

biologice specifice pentru excluderea hemocromatozei ereditare,

bolii Wilson, deficitului de α1-antitripsină, hepatitei autoimune

etc.

Determinarea parametrilor biologici. Recoltarea probelor

biologice s-a efectuat în dimineaţa primei zile de spitalizare, odată cu

probele biologice recoltate pentru evaluarea obişnuită a pacientului

internat. Recoltarea s-a făcut „a jeun”, practic la maxim două ore de

la internare, astfel încât rezultatele dozărilor micotoxicologice să

ofere detalii privind ingestia de micotoxine anterioară internării, şi nu

cea petrecută în timpul spitalizării.

De la toţi pacienţii au fost recoltate 20 ml de sânge periferic

pe EDTA şi 100 ml de urină în recipient steril. Determinările

biologice uzuale au fost efectuate în cadrul laboratorului de analize

medicale SYNEVO Iaşi, acreditat RENAR, probele determinate fiind

următoarele:

- enzimele de citoliză hepatică (TGP, TGO) şi de colestază

(FA, GGT) – folosind metoda chimiei umede, pe analizor Hitachi;

- AFP – folosind ca metodă de dozare

electrochemiluminiscenţa pe analizor Modular E 170;

- markerii virali hepatici (Ac VHC, Ag HBs, Ac HBc, Ac

VHD) – determinaţi prin electrochemiluminiscenţă pe analizor

Modular E 170, cu confirmarea rezultatelor slab pozitive sau

echivoce prin metoda Imunoblot (Western blotting).

Determinarea micotoxinelor. Detecţia micotoxinelor în

sângele şi urina pacienţilor s-a efectuat prin metoda HPLC,

considerată la momentul actual standardul de aur pentru

determinările cantitative ale micotoxinelor în substraturi variate.

Determinările s-au efectuat în cadrul laboratorului de cromatografie

29

al Facultăţii de Farmacie a Universităţii de Medicină şi Farmacie

„Gr. T. Popa” Iaşi.

Probele de sânge recoltate au fost centrifugate la temperatura

camerei folosind o centrifugă de tip Nahita 2600 6x15ml, timp de 15

minute la 4000 rotaţii/minut. Plasma a fost apoi separată în eprubete

sterile şi păstrată la temperatura de – 200C până la efectuarea

determinărilor propriu-zise. Probele de urină au fost congelate la –

200C, până la efectuarea determinărilor micotoxicologice.

Principiile metodei de lucru au fost descrise detaliat în partea

generală, în cele ce urmează fiind prezentate materialele folosite şi

aspectele specifice al determinărilor efectuate pe produse biologice.

Materiale folosite:

- balanţă analitică XA 110;

- baie de ultrasunete Ultra-Sonic RA-U3;

- micro-seringă Hamilton;

- cromatograf de lichide HP 1090 Series II, echipat cu detector cu

multidiode UV-VIS şi detector

de fluorescenţă;

- coloană cromatografică Zorbax C18 (150 x 4,6 mm; 5 μm);

- standard aflatoxină B1 şi sterigmatocistină (Sigma-Aldrich);

- coloane SPE C18 (Lida, Manufacturing Corp.);

- hârtie de filtru cantitativă (Schleicher & Schuell MicroScience);

- acetonitril (puritate HPLC, gradient grade, Riedel de Haën);

- cloroform (puritate HPLC, Sigma Aldrich);

- metanol Chromasolv R (puritate HPLC, Riedel de Haën)

- acid acetic glacial 99,99% (Sigma-Aldrich);

- sulfat de sodiu (A.C.S. Reagent, Sigma-Aldrich);

- apă (puritate HPLC, Merck);

- fază mobilă, reprezentată de un amestec acetonitril:apă:acid acetic

în raport de 99:99:2.

Tehnica de lucru. Probele de analizat au fost reprezentate de

5 ml de plasmă şi 50 ml de urină, care au fost procesate în mai multe

etape:

- datorită provenienţei probei de analizat (lichid biologic, cu un bogat

şi variat conţinut organic, în mare majoritate proteine), s-a procedat

la o etapă intermediară – precipitarea proteinelor cu acetonitril,

30

urmată de purificarea produsului rezultat (extragerea resturilor de

acetonitril) care s-a făcut cu izo-octan pur;

- extracţia s-a efectuat utilizând un amestec de cloroform:bicarbonat

de Na 3% (raport 80:20) cu care proba rezultată din purificare se

mixează, fiind apoi filtrată prin hârtie de filtru cantitativă;

- purificarea s-a făcut prin trecerea filtratului prin coloana SPE C18,

precondiţionată prin spălarea succesivă cu metanol (4 ml) şi,

respectiv, apă distilată (4 ml);

- micotoxinele au fost apoi eluate de pe coloană, prin spălarea cu un

volum de 4 ml de metanol, la o viteză de 2 ml/min;

- faza organică obţinută se evaporă la sec, iar reziduul obţinut se reia

cu un volum de 1 ml de fază mobilă (amestec acetonitril:apă:acid

acetic în raport de 99:99:2) şi se supune analizei HPLC.

Pentru analiza HPLC s-a utilizat cromatograful de lichide tip

HP 1090 Series II, echipat cu detector cu multidiode UV-VIS şi

detector de fluorescenţă cu detecţie simultană în UV la 251 nm

(excitaţie la 228 nm şi emisie la 423 nm) prevăzut cu o coloană C18

tip Zorbax (15 cm x 4,5 mm, 5 µm). Volumul probei de analizat

injectate a fost de 20 µl, iar debitul fazei mobile a fost de 0,7 ml/min.

În paralel, s-au lucrat probe îmbogăţite cu cantităţi cunoscute

de AFB1 şi STC, pentru stabilirea randamentului de extracţie.

Validarea rezultatelor a necesitat parcurgerea unor etape

intermediare, cu atât mai necesare cu cât probele supuse analizei erau

lichide biologice, a căror compoziţie este extrem de variată şi

complexă.

Determinarea specificităţii metodei pentru detectarea

AFB1 şi STC. În acest scop, s-au analizat mai multe probe conţinând

soluţii de AFB1 şi STC în concentraţii cunoscute, solventul fiind

reprezentat de faza mobilă utilizată în determinările ulterioare

(amestec acetonitril:apă:acid acetic în raport de 99:99:2).

Scopul acestei etape a constat în demonstrarea absenţei

interferențelor cromatografice din partea fazei mobile, precum şi

determinarea timpului de retenţie pentru cele două micotoxine în

condiţiile folosite.

31

Cromatogramele înregistrate folosind doar faza mobilă nu au

prezentat picuri de retenţie a componentelor folosite, demonstrând

astfel utilitatea acesteia.

S-a trecut apoi la trasarea curbelor pentru micotoxinele

studiate în stare pură şi în concentraţii cunoscute, pentru a se stabili

timpul de retenţie al acestora.

S-au folosit soluţii standard de AFB1 şi de STC în

concentraţie de 4 ng/ml (Sigma-Aldrich), celelalte condiţii fiind

similare cu cele efectuate pentru studiul probelor (injectare de 20 µl,

debit de 0,7 ml/min). Cromatogramele obţinute au evidenţiat picuri

clare date de cele două micotoxine, timpul de retenţie al AFB1 fiind

de 12 min (Fig. 2), iar pentru STC – de 6 minute (Fig. 3).

Pe parcursul studiului s-au folosit soluţii standard ale

micotoxinelor. Deşi acestea sunt recunoscute ca structuri stabile din

punct de vedere chimic, datorită păstrării lor timp mai îndelungat la

temperatura camerei, s-a considerat necesar verificarea stabilităţii

acestora în soluţiile folosite.

Soluţiile standard au fost desfăcute şi păstrate la temperatura

camerei timp de 10 zile. Proba a fost supusă analizei HPLC prin

metoda descrisă mai sus iniţial şi în zilele 2, 3 şi 10 de păstrare, cu

verificarea ratei de regăsire a acesteia în soluţie.

Aria picului înregistrat de soluţia standard de AFB1 şi STC

sunt redate în tabelele 1 şi 2.

Aria medie de detecţie a AFB1 pe parcursul perioadei

urmărite a fost de 32,45 mm2, cu o deviaţie standard de 1,3379 şi o

deviaţie standard relativă de 4,1230%, mult sub limita de 10%,

considerată variaţie nesemnificativă. Aria medie de detecţie a STC

pe parcursul perioadei urmărite a fost de 35,7 mm2,deviaţia standard

fiind de 0,7958 şi o deviaţie standard relativă de 1,1562%, de

asemenea mult sub limita admisă.

S-a demonstrat astfel stabilitatea soluţiei de AFB1 şi STC în

condiții de păstrare la întuneric şi la temperatura camerei, pentru cel

puţin 10 zile de la deschiderea recipientului original.

Linearitate, limita de detecţie şi limita de cuantificare

Pentru studiul linearității au fost analizate şase serii de soluţii,

pentru fiecare cromatogramă a fost calculată aria picului

32

corespunzător AFB1 şi STC, iar valoarea ariei medie a fost

reprezentată grafic funcţie de concentraţie. Prin analiză statistică au

fost calculate ecuaţia dreptei de regresie, coeficientul de corelaţie (r)

şi eroarea standard de regresie (SE). Folosind panta dreptei de

regresie şi eroarea standard a acestei drepte s-au calculat valorile

limitei de detecţie şi a limitei de cuantificare.

Figura 4. Dreapta de calibrare a AFB1

Deoarece cantitatea de AFB1 din probe este mică, ecuaţia

curbei de calibrare a fost calculată pentru concentraţii cuprinse între

9,765625 şi 39,0625 ng/ml. După calculul statistic s-a obţinut ecuaţia

curbei de calibrare:

Arie pic = panta x concentraţia + 7,325

Valoarea coeficientului de corelaţie (r) este 0,9983 iar eroarea

standard a curbei de regresie (SE) este 1,3229431474665. Folosind

aceste valori s-au calculat limita de detecţie (LD) şi limita de

cuantificare (LQ) cu formulele (1) şi (2):

(1) LD = 3 x SE/panta = 3,69 ng/ml

(2) LQ = 10 x SE/panta = 12,31 ng/ml.

Folosind o metodologie similară, pentru STC s-au obţinut:

(1) LD = 1,71 ng/ml

(2) LQ = 5,13 ng/ml.

Precizia şi exactitatea. Prima etapă în determinarea preciziei

o reprezintă studiul preciziei sistemului. Astfel, o soluţie AFB1 de

concentraţie de 20 ng/ml a fost analizată de cinci ori.

33

Deviaţia relativă standard (RSD %) a fost calculată ca fiind

8,6912%, valoare corespunzătoare pentru concentraţii în probă de

ordinul ng, ceea ce indică precizia metodei folosite.

Precizia şi exactitatea metodei au fost determinate prin

calcularea valorii medii a 3 determinări la trei concentraţii diferite în

jurul valorii de interes – 39.0625 ng/ml, 19.53125 ng/ml şi respectiv,

9.765625 ng/ml (concentraţia urmărită ± 50%). Întregul experiment a

fost realizat în zile diferite, de către altă persoană, cu scopul de a

obţine informaţii despre robusteţea metodei. Utilizând ecuaţia curbei

de calibrare şi ariile picurilor au fost calculate concentraţiile pentru

fiecare probă. A fost determinată regăsirea ca procent din valoarea

concentraţiei teoretice, regăsirea medie şi precizia metodei exprimată

prin deviaţia standard relativă din regăsirea calculată.

După prelucrarea statistică a ambelor seturi de determinări a

rezultat o valoare de 16,9629 % a deviaţiei standard relative ceea ce

demonstrează precizia metodei, regăsirea medie fiind de 99,2% (pe

intervalul 61,6 – 126,1%), ceea ce demonstrează exactitatea metodei.

Determinarea preciziei determinării STC a fost făcută

analizând o soluţie de STC de concentraţie 10 ng/ml de cinci ori,

rezultând o deviaţie relativă standard de 7,7602%, corespunzătoare

pentru nivelul de concentraţie testată.

Pentru precizia şi exactitatea metodei de determinare, s-a

folosit aceeaşi procedură ca şi pentru AFB1, determinându-se de câte

trei ori, în 2 zile diferite, de către persoane diferite, ariile picurilor

unor probe de concentraţii cunoscute, la STC fiind folosite soluţii de

11,8553 ng/ml ±50% (respectiv, 5,92675 ng/ml şi 17,78295 ng/ml).

După prelucrarea statistică a ambelor seturi de determinări a

rezultat o valoare de 12,6819 % a deviaţiei standard şi o regăsire

medie de 99,4% (pe intervalul 72,7 – 118,5%); precizia şi exactitatea

metodei au fost astfel determinate ca fiind corespunzătoare.

Analiza statistică a rezultatelor. Datele au fost introduse

într-o bază de date alcătuită în IBM SPSS Statistics v.19. Rezultatele

au fost exprimate ca media ± deviaţie standard (DS), iar diferenţele

între loturi au fost comparate folosind testul t-Student; valoarea

p<0.05 a fost considerată cu semnificaţie statistică. Corelaţia dintre

rezultatele obţinute a fost stabilită prin testul Pearson, fiind

34

considerate semnificative valori ale coeficientului de corelaţie (r)

peste aflate între intervalele -1 – -0.3 şi 0.3 – 1. Corelaţia pozitivă a

fost considerată slabă pentru r=0,3-0,5, medie pentru r=0.5-0.7 şi

puternică la r>0.7; valori corespondente au fost considerate şi pentru

corelaţia negativă. Pentru compararea frecvențelor cu care un

eveniment intervine, s-a folosit testul Fisher-exact sau χ2 cu corecţie

Yates, valoarea p<0.05 fiind considerată semnificativă statistic.

Rezultate şi discuţii.

Etiologia cirozei hepatice. Etiologia CH a fost reprezentată

în principal de VHC - 18 cazuri, urmată de combinaţia virus şi alcool

- 16 cazuri (5 VHB şi 11 VHC), alcool - 12 cazuri şi VHB - 8 cazuri

(Fig. 5). În 4 cazuri (7%), etiologia cirozei nu a putut fi determinată,

pacientul infirmând un consum semnificativ de alcool şi nefiind

detectate alte etiologii posibile. În aceste cazuri, investigaţiile

paraclinice nu au confirmat hepatita autoimună, hemocromatoza

ereditară, boala Wilson sau deficitul de α1-antitripsină. Un pacient

era în tratament cronic de 2 ani cu Amiodaronă 200 mg/zi pentru

fibrilaţie atrială paroxistică (redusă chimic), fără a exista evidenţe

între boala hepatică cronică, decelată anterior iniţierii tratamentului

antiaritmic, şi prezenţa fibrozei hepatice. În cazul celorlalţi pacienţi,

anamneza a exclus consumul unor medicamente sau alte toxice

hepatice cu posibilă implicare în etiologia cirozei.

Fig. 5. Etiologia CH la pacienţii din lotul de studiu

Frecvenţa detectării micotoxinelor în produsele biologice

la cele 2 loturi. În lotul martor, din cele 210 probe biologice

analizate, 14 (6,66%) au fost testate pozitive, reprezentând: 6 probe

de sânge cu AFB1, 4 probe de sânge cu STC şi 4 probe de urină cu

STC. AFB1 nu a fost detectată în urina lotului martor.

În lotul cu CH, au fost detectate pozitiv 28 de probe de sânge

(22 pentru AFB1 şi 6 pentru STC) şi 26 de probe de urină (10 pentru

35

AFB1 şi 16 pentru STC) din totalul de 232 de probe analizate

(23,27%).

Verificarea semnificaţiei statistice a diferenţelor s-a făcut prin

testul Fisher-exact (datorită numărului mic de probe pozitive), iar

rezultatele constatate au relevat că diferenţele sunt înalt semnificative

statistic (Tabelul 6), cu excepţia AFB1 în sânge, la care numărul

probelor depistate pozitiv în ambele loturi a fost egal.

Tabelul 6. Semnificaţie statistică a diferenței între numerele de probe

pozitive la cele 2 loturi (test Fisher-exact)

Lot AFB1s STCs AFB1u STCu Total

M 6 4 0 4 14

CH 6 22 10 16 54

p 0.9225 0.0002 0.0013 0.0067 <0.0001 AFB1s=AFB1 în sânge; AFB1u=AFB1 în urină;

STCs=STC în sânge; STCu=STC în urină;

În concluzie, numărul de probe depistate pozitiv în lotul cu

CH este semnificativ mai mare la pacienţii cu CH decât la martor, în

majoritatea situaţiilor.

Nivelul AFP înregistrat la cele 2 loturi. Valoarea

considerată normală de către laborator pentru AFP prin metodă

folosită (electrochemiluminiscenţă) a fost de sub 7 ng/ml. Pacienţii

din lotul martor au avut o valoare medie de 4,42±3,25 ng/ml,

încadrându-se sub acest prag. Pacienţii din lotul cu CH au avut o

valoare a AFP ușor crescută, de 12,63±22,49 ng/ml (dar cu mari

variaţii între pacienţi, cea mai mare valoare înregistrată fiind de

155,3 ng/ml), diferenţa fiind înalt semnificativă statistic.

Tabel 7. Nivelele enzimelor hepatice (UI/L ± STDEV) şi AFP (ng/ml ± STDEV) la cele două loturi

TGP TGO FA GGT AFP

M 28,21±23,23 33,06±24,02 142,51±70,42 47,78±30,73

4,42±3,25

36

CH 70,32±56,02 85,60±67,54 172,25±95,80 157,52±262,4

12,63±22,49

t-

Test 0.0000 0.0000 0.0319 0.0013

0.0042

Nivelul de micotoxine înregistrat la cele 2 loturi.

Concentraţia maximă de AFB1 în sânge a fost de 8,33 ng/ml la lotul

martor, şi de 25,68 ng/ml la lotul cu CH. Pentru STC, s-au înregistrat

valori maxime în sânge de 3,8 ng/ml la lotul martor şi de 2,81 ng/ml

la lotul cu CH (dar frecvenţa probelor pozitive în acest lot a fost mult

mai mare decât la martor).

În urină, AFB1 nu a fost detectată în primul lot, iar la cirotici

a avut o concentraţie maximă de 13,77 ng/ml. STC a fost detectată în

sângele a 4 pacienţi din lotul martor şi 16 din lotul cu CH, unde a

prezentat o valoare maximă de 39,06 ng/ml.

Valorile medii ale AFB1 şi STC au fost mai mari la lotul de

cirotici faţă de lotul martor în toate cazurile, cu semnificaţie statistică

în cazul STCs (p=0.0037) şi AFB1u (p=0.0029) (Tabelul 8).

Tabelul 8. Valorile înregistrate pentru AFB1 şi STC la loturile de studiu Lot

AFB1s STCs AFB1u STCu

Ma

rto

r

Media

(ng/ml) 0,8420 0,0140 0,0000 0,0049

STDEV 2,4369 0,0719 0,0000 0,0249

CH

Media (ng/ml)

1,6777 0,6265 1,2016 1,0531

STDEV 5,506002 1,665573 3,177855 5,288908

t-Test (p) 0,151933 0,003757 0,002983 0,072264

Corelaţia dinte enzimele hepatice şi nivelul micotoxinelor

S-a încercat stabilirea unor corelaţii între concentraţiile de

micotoxine dozate în lichidele biologice ale pacienţilor şi unii

parametri ai funcţiei hepatice, n scopul verificării unor eventuale

interdependenţe. S-a efectuat testul de corelaţie Pearson, care nu a

relevat existenţa vreunei corelaţii semnificative statistic a AFB1 sau

STC cu enzimele hepatice sau de colestază, atât la lotul martor

(Tabel 9), cât şi la cel cu ciroză hepatică (Tabel 10).

37

După cum se observă din tabele, în aproape toate cazurile

indicele de corelaţie r nu depășește valoarea ±0,3, indicând absenţa

unei corelaţii statistic semnificative. Acest lucru indică absenţa unui

rol important al micotoxinelor determinate în sânge şi urină la

pacienţii studiaţi cu sindroamele hepatice de citoliză şi colestază, pe

care aparent nu le influenţează. Singura excepţie o reprezintă

corelaţia pozitivă slabă dintre TGO şi STC urinară la pacienţii cu CH

(r=0.3872), care ar indica o corelaţie pozitivă slabă între aceşti 2

parametri, fără însă a fi susţinută de alte date.

Corelaţia dintre nivelul micotoxinelor şi nivelul AFP

Ca şi nivelul AFB, concentraţia de micotoxine este mai mare

la pacienţii cu CH comparativ cu martorul, valorile fiind semnificativ

statistice pentru ambii parametri. Având în vedere că efectul

carcinogenetic hepatic este clar demonstrat pentru AFB1, s-a

verificat existenţa unei posibile conexiuni între prezenţa acesteia şi

AFP – marker biologic larg utilizat ca indicator al procesului de

proliferare malignă hepatică.

Tabelele 11 şi 12 redau relaţia existentă între aceşti parametri,

ca rezultat al testului de corelaţie Pearson.

Tabelul 11. Analiza statistică a valorilor AFP în raport cu AFB1 şi STC la lotul martor

AFP AFB1s AFB1u STCs STCu

Media (ng/ml) 4,42 0,8420 0,0140 0,0000 0,0049

STDV 3,25 2,4369 0,0719 0,0000 0,0249

Corelaţie (r) -0,003 #DIV/0!* 0,1010 -0,0011 *parametru nedeterminabil, datorită absenţei AFB1 în urină la lotul martor

Tabelul 5 Analiza statistică a valorilor AFP în raport cu AFB1 şi STC la lotul cu CH

AFP AFB1s AFB1u STCs STCu

Media (ng/ml) 12,63 1,6777 0,6265 1,2016 1,0531

STDV 22,49 5,506002 1,665573 3,177855 5,288908

Corelaţia (r) -0,1603 -0,1603 -0,0597 0,03959

38

După cum se observă, nu există o corelaţie între nivelul de

micotoxine serice şi urinare şi nivelul AFP, atât la lotul martor cât şi

la lotul de pacienţi cirotici.

Concluzii. 1. Principalele etiologii ale cirozei hepatice au fost VHC, alcoolul şi

asocierea acestuia cu hepatita cronică virală.

2. Tehnica HPLC poate fi adaptată pentru determinarea AFB1 şi

STC din produse biologice.

3. AFB1 şi STC au fost detectate în stare pură în lichidele biologice

la aproape un sfert din cazurile de CH studiate.

4. Frecvenţa detectării micotoxinelor a fost semnificativ mai mare

la pacienţii cirotici comparativ cu martorul.

5. Enzimele de citoliză hepatică şi de colestază, precum şi AFP,

sunt semnificativ mai mari la pacienţii cirotici studiaţi decât la

pacienţii din lotul martor.

6. Nu există corelaţii semnificative între enzimele hepatice sau AFP

şi nivelul de micotoxine detectate la toţi participanţii la studiu.

CAPITOLUL 5

Determinarea micotoxinelor in produse biologice

provenite de la pacienți cu carcinom hepatocelular

Scop. Identificarea prezenţei şi dozarea concentraţiei AFB1 şi

STC în produsele biologice (sânge şi urină) provenite de la pacienţi

diagnosticaţi cu CHC, precum şi verificarea existenţei unei corelaţii

ale acestora cu nivelul AFP şi al enzimelor hepatice de citoliză şi

colestază.

Materiale şi metodă.

Loturile de studiu. Studiul a fot efectuat pe un lot de 53 de

pacienţi cu CHC, care a fost comparat cu un lot de control de 55 de

39

pacienţi fără afectare hepatică. Participanţii a studiu au fost recrutaţi

dintre pacienţii internaţi în Institutul de Gastroenterologie şi

Hepatologie (IGH) Iaşi în perioada octombrie 2007 – februarie 2010.

Selecţia participanţilor s-a făcut pe baza criteriilor de includere şi

excludere, în ordinea internării în clinică. Toţi participanţii au semnat

consimțământul informat de participare la studiu, după care li s-a

recoltat sânge şi urină pentru determinarea probelor biologice.

Toţi participanţii la studiu au primit un formular de informare

succintă asupra originii micotoxinelor, efectului acestora asupra stării

de sănătate şi unele sfaturi pentru evitarea intoxicaţiei cronice.

Criteriile de includere şi de excludere au fost similare cu cele

pentru lotul cu CH, fiind prezentate anterior (pag. 29).

Structura celor 2 loturi a fost următoarea:

1. Lotul 1 (martor) – 55 de participanţi (30M, 25F), la care

examenul clinic, investigaţiile imagistice (ecografia abdominală) şi

biologice (parametrii funcţiei hepatice şi markerii virali) au exclus

prezenţa afectării hepatice. Internarea în spital a fost motivată de alte

patologii, fără legătură cu funcţia hepatică.

2. Lotul 2 (CHC) – 53 de participanţi (34M, 19F), la care

diagnosticul de CHC a fost stabilit pe baza criteriilor:

- anamnestice – diagnosticul anterior de CH (bine argumentat),

decelarea unui factor etiologic cunoscut (virus, alcool),

degradarea recentă a stării clinice la un cirotic anterior

compensat, etc.

- clinice – semne de CH, prezenţa complicaţiilor cirozei recent

instalate, fără un factor precipitant identificabil, apariţia durerii

abdominale, anorexia, scăderea ponderală, prezenţa trombozelor

venoase, etc.

- imagistice – semne de hipertensiune portală, semne de

decompensare a funcţiei hepatice, tromboza venei porte sau a

venelor suprahepatice, nodul hepatic evidenţiat ecografic, la care

două metode imagistice au evidenţiat hipervascularizaţia de timp

arterial, cu wash-out rapid în faza venoasă;

- biologice – prezenţa sindroamelor de afectare hepatică cronică;

markeri virali pozitivi; creşterea α-fetoproteinei serice (AFP);

probe biologice specifice pentru excluderea hemocromatozei,

40

bolii Wilson, deficitului de α1-antitripsină, hepatitei autoimune,

etc.

Determinarea parametrilor biologici.

Recoltarea probelor biologice şi parametrii evaluaţi au fost

identici cu cei folosiţi pentru determinările din capitolul anterior,

fiind descrise în detaliu (pag. 30-31).

Determinarea micotoxinelor.

Detecţia micotoxinelor în sângele şi urina pacienţilor s-a

efectuat prin metoda HPLC, în cadrul laboratorului de cromatografie

al Facultăţii de Farmacie a Universităţii de Medicină şi Farmacie

„Gr. T. Popa” Iaşi.

Materialele folosite, metodele de calibrare şi tehnica de lucru

au fost identice cu cele folosite la lotul cu CH, fiind descrie în detaliu

anterior (pag. 31-36).

Analiza statistică a rezultatelor. Datele au fost introduse

într-o bază de date alcătuită în IBM SPSS Statistics v.19. S-au folosit

testul t-Student; testul Pearson, testul Fisher-exact şi testul χ2 cu

corecţie Yates; valoarea p<0.05 a fost considerată semnificativă

statistic.

Rezultate şi discuţii. Etiologia hepatocarcinomului. Etiologia CH a fost

reprezentată în principal de VHC - 17 cazuri, urmată de combinaţia

virus şi alcool - 15 cazuri (7 VHB şi 8 VHC), alcool - 10 cazuri şi

VHB - 10 cazuri (Fig. 5). În 2 cazuri (4%), etiologia CHC nu a putut

fi determinată, apariţia tumorii înregistrându-se la pacienţi fără CH

diagnosticată anterior şi care nu prezentau semne clinio-biologice de

ciroză nici la internarea pe parcursul căreia a fost diagnosticat

hepatomul. S-au efectuat investigaţiile paraclinice complexe, care nu

au confirmat hepatita autoimună, hemocromatoza ereditară, boala

Wilson sau deficitul de α1-antitripsină. Anamneza riguroasă a exclus

41

consumul semnificativ de alcool, de medicamente sau alte toxice

hepatice cu posibilă implicare în etiologia cirozei.

Frecvenţa detectării micotoxinelor în produsele biologice

la cele 2 loturi. În lotul martor, din cele 210 probe biologice

analizate, 14 (6,66%) au fost testate pozitive, reprezentând: 6 probe

de sânge cu AFB1, 4 probe de sânge cu STC şi 4 probe de urină cu

STC. AFB1 nu a fost detectată în urina lotului martor.

În lotul cu CHC, au fost detectate pozitiv 70 de probe de

sânge (33,01%) din totalul de 212 probe analizate, cel mai frecvent

fiind detectată STC în sânge (28 de probe pozitive) şi în urină (17

probe), urmată de AFB1 urinară (15 probe) şi serică (10 probe).

Verificarea semnificaţiei statistice a diferenţelor s-a făcut prin

testul Fisher-exact rezultatele constatate au relevat că diferenţele sunt

înalt semnificative statistic (Tabelul 6), cu excepţia AFB1 în sânge,

la care numărul diferenţa a fost nesemnificativă.

Tabelul 6. Semnificaţie statistică a diferenței între numerele de probe pozitive

la cele 2 loturi (test Fisher-exact)

Lot AFB1s STCs AFB1u STCu Total

M 6 4 0 4 14

CHC 10 28 15 17 70

p 0.2868 <0.0001 <0.0001 0.0014 <0.0001 AFB1s=AFB1 în sânge; AFB1u=AFB1 în urină;

STCs=STC în sânge; STCu=STC în urină;

În concluzie, numărul de probe depistate pozitiv în lotul cu

CHC este semnificativ mai mare decât la martor, în majoritatea

situaţiilor.

Nivelul enzimelor hepatice înregistrate la cele 2 loturi

Valorile considerate normale de laborator pentru

determinările enzimelor de citoliză hepatică au fost: TGP < 40 UI/L

şi TGO < 40 UI/L. Pacienţii din lotul martor au prezentat o valoare

medie normală a transaminazelor, în timp ce pacienţii cu hepatom au

prezentat o creştere importantă a acestor valori peste valoarea

normală, diferenţele fiind semnificative statistic (Tabelul 7). Gradul

42

de dispersie a fost însă foarte accentuat, fapt evidenţiat printr-o

valoare crescută a STDEV comparativ cu media.

De asemenea, pacienţii cu CHC au prezentat nivele

semnificativ mai mari ale FA şi GGT comparativ cu lotul martor,

ambele enzime de colestază fiind semnificativ mai crescute decât

valoarea considerată normală de către laborator: FA = 40 – 129 UI/L;

GGT<61 UI/L (Tabel 7).

Nivelul AFP înregistrat la cele 2 loturi. Valoarea

considerată normală de către laborator pentru AFP prin metodă

folosită (electrochemiluminiscenţă) a fost de sub 7 ng/ml. Pacienţii

din lotul martor au avut o valoare medie de 4,42±3,25 ng/ml,

încadrându-se sub acest prag. Pacienţii din lotul cu CHC au avut o

valoare a AFP mult crescută, media fiind de 1123,94±2020,31 ng/ml.

Diferenţa faţă de martor este înalt semnificativă statistic (p<0.0001).

De remarcat că AFP a înregistrat valori de peste 200 ng/ml,

considerate actual diagnostice pentru CHC, în prezenţa unei tumori

hepatice decelabile ecografic, doar în 27 de cazuri (51%), fapt care

confirmă sensibilitatea insuficientă a determinării AFP ca unic

marker tumoral hepatic.

Tabel 7. Nivelele enzimelor hepatice (UI/L ± STDEV) şi AFP (ng/ml ± STDEV) la cele două loturi

TGP TGO FA GGT

AFP

M 28,21±23,23 33,06±24,02 142,51±70,42 47,78±30,73 4,42±3,25

CHC 93,85±91,74 134,49±73,86 194,50±151,84 282,76±265,72 1123,94±2020,31

t-Test 0.0000 0.0000 0.0001 0.0000

0.0000

Nivelul de micotoxine înregistrat la cele 2 loturi

Concentraţia maximă de AFB1 în sânge a fost de 8,33 ng/ml

la lotul martor, şi de 126,93 ng/ml (!) la lotul cu CHC. Cea mai mare

concentraţie s-a înregistrat la un pacient cu hepatocarcinom dezvoltat

pe un ficat cu CH compensată, infectat cronic cu VHB. Pentru STC,

s-au înregistrat valori maxime în sânge de 3,8 ng/ml la lotul martor şi

de 2,02 ng/ml la lotul cu CHC, frecvenţa probelor pozitive pentru

STC la pacienţii cu CHC fiind cea mai mare dintre toţi pacienţii luați în studiu (28 probe pozitive de sânge, 17 de urină).

43

În urină, AFB1 nu a fost detectată în primul lot, iar dintre

pacienţii cu hepatom, s-a înregistrat o concentraţie maximă de 56,39

ng/ml. În total, STC a fost detectată în urina a 17 pacienţi din lotul

cu CHC, unde a prezentat o valoare maximă de 9,39 ng/ml.

Valorile medii ale AFB1 şi STC au fost mai mari la lotul de

pacienţi cu hepatom faţă de lotul martor în toate cazurile, diferenţa

fiind semnificativă statistic (Tabelul 8).

Tabelul 8. Valorile înregistrate pentru AFB1 şi STC la loturile de studiu

Lot AFB1s STCs AFB1u STCu

Marto

r

Media

(ng/ml) 0,8420 0,0140 0,0000 0,0049

STDE

V 2,4369 0,0719 0,0000 0,0249

CHC

Media

(ng/ml) 13,52605 0,453332 6,203066 0,9963

STDE

V 37,2658 0,626671 16,49542 2,749464

t-Test (p) 0,006631 <0.000001 0,003132 0,004337

Corelaţia dinte enzimele hepatice şi nivelul micotoxinelor

La lotul martor, indicele de corelaţie r nu depășește valoarea

±0,3, indicând absenţa unei corelaţii statistic semnificative. La lotul

cu CHC apar corelaţii semnificative multiple ale enzimelor de

citoliză hepatică şi colestază cu valorile micotoxinelor, cele mai

multe dintre ele fiind însă slabe (r = 0,03 – 0,5). Enzimele de citoliză

hepatică de corelează negativ cu valorile AFB1 serice, în timp ce

GGT se corelează negativ cu micotoxinele urinare. Singura corelaţie

puternică este între FA şi AFB1s (r=0,69), dar FA se corelează

negativ cu STCs. În general, se observă corelaţii negative ale

transaminazelor cu micotoxinele, sugerând că prezenţa acestora este

mai importantă la pacienţii la care transaminazele sunt mai mici

(posibil, cu un stadiu avansat al bolii hepatice, pacienţii respectivi

fiind diagnosticaţi cu CHC pe CH).

Corelaţia dintre nivelul micotoxinelor şi nivelul AFP. Ca

şi nivelul AFB, concentraţia de micotoxine este mai mare la pacienţii

cu CHC comparativ cu martorul, valorile fiind semnificativ statistice

pentru ambii parametri. Având în vedere că efectul carcinogenetic

44

hepatic este clar demonstrat pentru AFB1, s-a verificat existenţa

unei posibile conexiuni între prezenţa acesteia şi AFP – marker

biologic larg utilizat ca indicator al procesului de proliferare malignă

hepatică (Tab. 11 şi 12). Tabelul 11. Analiza statistică a valorilor AFP în raport cu AFB1 şi STC la lotul martor

AFP AFB1s AFB1u STCs STCu

Media (ng/ml) 4,42 0,8420 0,0140 0,0000 0,0049

STDV 3,25 2,4369 0,0719 0,0000 0,0249

Corelaţie (r) -0,003 #DIV/0!* 0,1010 -0,0011 *parametru nedeterminabil, datorită absenţei AFB1 în urină la lotul martor

Tabelul 12. Analiza statistică a valorilor AFP în raport cu AFB1 şi STC la lotul cu CHC

AFP AFB1s AFB1u STCs STCu

Media 1002,0900 14,3400 0,4200 7,3100 1,1500

STDV 1519,2700 37,8504 0,5980 17,5033 2,9261

Corelaţie (r) -0,3020 0,8402 -0,3643 0,9429

Dacă la lotul martor nu există nici o corelaţie semnificativă

între AFP şi micotoxine, la pacienţii cu CHC toate valorile obţinute

sunt corelate cu aceasta. Astfel, se observă că micotoxinele serice se

corelează semnificativ (deşi slab) cu AFP, demonstrând că la

pacienţii la care aceasta este crescută, prezenţa lor în sânge ar scădea.

Cum pacienţii cu AFP crescută tind să aibă u funcţie hepatică mai

alterată (se cunoaşte că valoare AFP este corelată cu dimensiunile

CHC), este posibil ca această scădere a lor în sânge să fie consecinţa

alterării funcţiei hepatice, cu preluare hepatică şi metabolizare

scăzută la acest nivel. O altă posibilă interpretare a rezultatelor ar fi o

legătură directă între nivelul crescut de micotoxine urinare şi

creşterea AFP, respectiv contribuţia aflatoxinelor, ingerate în

cantităţi semnificative (deoarece pot fi găsite integrale în urină, fără a

fi complet transformate la primul pasaj hepatic) la procesul

carcinogenetic hepatic. Prezenţa acestor toxine puternice în cantităţi

semnificative în sângele pacienţilor la internarea în spital, deci

practic după ingestia de alimente la domiciliu, ridică problema

45

existenţei unu grad foarte înalt de contaminare a acestor pacienţi

posibil cu rol în generarea bolii hepatice cronice.

Concluzii. 1. Principalele etiologii ale hepatocarcinomului au fost VHC,

alcoolul şi asocierea acestuia cu hepatita cronică virală.

2. Tehnica HPLC poate fi adaptată pentru determinarea AFB1 şi

STC din produse biologice la pacienţii cu CHC, contribuind

la precizarea etiopatogeniei bolii.

3. AFB1 şi STC au fost detectate în stare pură în lichidele

biologice la peste 1/3 din cazurile de CHC studiate, într-o

proporţie mult crescută faţă de lotul martor.

4. Enzimele de citoliză hepatică şi de colestază, precum şi AFP,

sunt semnificativ mai mari la pacienţii cu hepatocarcinom

studiaţi decât la pacienţii din lotul martor.

5. Există unele corelaţii semnificative între enzimele hepatice şi

nivelul de micotoxine detectate pacienţii cu CHC, dar sunt

slabe şi inconsistente.

6. Există o asociere clară între creşterea AFP şi prezenţa masivă

a micotoxinelor în urină la pacienţii cu CHC.

7. Este posibilă existenţa unui important deficit de metabolizare

hepatică a AFB1 şi STC la pacienții cu CHC.

CONCLUZII FINALE

1. Potenţialul carcinogenetic hepatic al aflatoxinei B1 este clar

demonstrat

2. O proporţie semnificativă din cirozele hepatice şi

hepatocarcinoame nu au o etiologie bine precizată

3. VHC a fost cea mai frecventă etiologie a cirozei şi

hepatocarcinom

4. Circa 10% din cazurile de hepatocarcinom diagnosticate sunt

de etiologie neprecizată.

46

5. Dozele mici de micotoxine compromit procesul de creştere al

animalelor de experienţă

6. AFB1 şi STC în doză mare produc necroză hepatică

semnificativă şi activează mecanismele fibrogenetice, ducând

la fibroză semnificativă.

7. Dezintegrarea citoplasmei, cu alterarea structurii şi funcţiilor

organitelor celulare apar chiar şi după

8. Consumul frecvent de alimente cu risc maxim de contaminate

cu micotoxine a fost declarat de 1 din 5 participanţi.

9. CFA nu a confirmat un rol important al micotoxinelor în

producerea hepatocarcinomului

10. Profilul de risc al pacienţilor este diferit, în funcţie de mediul

d provenienţă

11. Tehnica HPLC poate fi adaptată pentru determinarea AFB1

şi STC din produse biologice.

12. AFB1 şi STC au fost detectate în stare pură în lichidele

biologice la aproape un sfert din cazurile de CH şi CHC

studiate.

13. Frecvenţa detectării micotoxinelor a fost semnificativ mai

mare la ciroze şi hepatocarcinoame comparativ cu martorul.

14. Există o asociere clară între creşterea AFP şi prezenţa masivă

a micotoxinelor în urină la pacienţii cu CHC.

15. Este posibilă existenţa unui important deficit de metabolizare

hepatică a AFB1 şi STC la pacienții cu CHC.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. 1

http://www who int/healthinfo/global_burden_disease/en/

(accesat în mai 2011)

2. 2http://www.who.int/substance_abuse/publications/global_alcohol_

report/profiles/rou.pdf (accesat în mai 2011)

3. 3 Yu MW, Lien JP, Liaw YP, Chen CJ. Effects of multiple risk

factors for hepatocellular carcinoma on formation of aflatoxin B1-

DNA adducts. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention

1996; 5:613-619

47

4. 4

El-Serag HB, Rudolph KL. Hepatocellular carcinoma:

epidemiology and molecular carcinogenesis. Gastroenterology

2007; 132:2557–2576

5. 5 Singal A, Volk ML, Waljee A et al. Meta analysis: surveillance

with ultrasound for early stage hepatocellular carcinoma in patients

with cirrhosis. Aliment Pharmacol Ther 2009; 30:37–47

6. 6 Mulcahy N. Diabetes is the leading cause of attributable cases of

hepatocellular carcinoma.

http://www.medscape.com/viewarticle/720925

(accesat în mai 2011)

7. 7 Chen CH, Hu FC, Huang GT et al. Applicability of staging

systems for patients with hepatocellular carcinoma is dependent on

treatment method: analysis of 2010 Taiwanese patients. Eur J

Cancer 2009; 45:1630–1639

8. 8 Wu HC, Wang Q, Yang HI et al. Aflatoxin B1 exposure, hepatitis

B virus infection and hepatocellular carcinoma in Taiwan. Cancer

Epidemiol Biomarkers Prev. 2009; 18(3):846-853

9. 9 Miron L et al. Micotoxinele hepatonefro-toxice (aflatoxine,

ochratoxinele, sterigmatocistina, citrinina) factori de risc pentru

sănătatea omului şi a animalelor; studii epidemiologice,

morfoclinice şi de strategie preventivă. Raport final proiect CEEX

147/2006 (anul finalizării: 2008); pag. 3-5

10. 10 Bulea D, Şpac A, Dorneanu V. HPLC determination of

ochratoxin A in roasted coffee beans. Fungi & Mycotoxins 2008;

2(1):157-163

11. 11 International Agency for Research on Cancer (IARC). Some

Naturally Occurring Substances: Food Items and Constituents,

Heterocyclic Aromatic Amines and Mycotoxins. IARC

Monographs evaluation of carcinogenic risks to human 1993; 56:

245-540

12. 12 Fattovich G, Troffolini T, Zagni I, Donato F. Hepatocellular

carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors.

Gastroenterology 2004;127:S35–S50

13. 13 Yarru LP, Settivari LS, Antoniou E, Ledoux DR, Rottinghaus

GE. Toxicological and gene expression analysis of the impact o

aflatoxin B1 on hepatic function of male broiler chicks. Molecular,

cellular and developmental biology 2008; 88:360-371

48

14. 14

Devegowda G, Ravikiran D. Mycotoxins and eggshell quality:

cracking the problem. World Mycotoxin Journal 2008; 1(2): 203-

208

15. 15 Jones FT, Hagler WH, Hamilton PB. Association of low levels of

aflatoxin in feed with productibility losses in commercial broiler

operations. Poultry Science 2010; 61:861-868