UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE

GR.T.POPA IAŞI

FACULTATEA DE FARMACIE

SIMONA ALEXANDRINA PINTEA (ARDELEAN)

TEZĂ DE DOCTORAT

Conducător ştiinţific

Prof. Univ. Dr. NĂSTASE VICTOR

2011

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE

GR.T.POPA IAŞI

FACULTATEA DE FARMACIE

SIMONA ALEXANDRINA PINTEA (ARDELEAN)

SSTTUUDDIIII EEXXPPEERRIIMMEENNTTAALLEE AALLEE UUNNOORR NNOOII

SSUUBBSSTTAANNŢŢEE TTEENNSSIIOOAACCTTIIVVEE UUTTIILLIIZZAATTEE

ÎÎNN UUNNEELLEE PPRREEPPAARRAATTEE FFAARRMMAACCEEUUTTIICCEE TEZĂ DE DOCTORAT

Conducător ştiinţific

Prof. Univ. Dr. NĂSTASE VICTOR

IAŞI

2011

CUPRINS

I. DATE DE LITERATURĂ 1. GENERALITĂŢI REFERITOARE LASUBSTANŢELE TENSIOACTIVE ……………… .. 6 1.1. Introducere şi definiţii ......................... .. 6 1.2. Proprietăţile agenţilor de suprafaţă înfuncţie de structura lor .............................................. .. 8 2. MECANISME DE ACŢIUNE ŞICLASIFICAREA TENSIOACTIVILOR ............... 12 2.1. Aspecte generale ...................................... 12 2.2. Tensioactivi din produsele farmaceutice 14

2.3. Clasificarea tensioactivilor ....................... 15

3. DETERMINAREA CALITATIVĂ ŞICANTITATIVĂ A SUBSTANŢELORTENSIOACTIVE ............................................... 18 3.1. Metode analitice calitative ....................... 18

3.2. Metode analitice cantitativ........................

19

4. METODE DE EVALUARE A TOXICITĂŢII TENSIOACTIVILOR. LEGISLAŢIE ......................

22

4.1. Aspecte generale ...................................... 224.2. Consideraţii privind legislaţia

referitoare la produse cosmetice şi tensioactivi / surfactanţi ....................................................................

28

II. CERCETĂRI PERSONALE Motivarea şi obiectivele cercetării ............................ 335. METODE MODERNE FOLOSITE PENTRUSTUDIUL TENSIOACTIVILOR ............................. 38

5.1. Principalele protocoale INVITTOXfolosite ca metode alternative pentru testareanocivităţii tensioactivilor ........................................... 38

5.2. Metode non-invazive folosite pentru testarea acţiunii tensioactivilor la nivel cutanat ...... 50

5.3. Baze de date ............................................ 59

6. FOLOSIREA TENSIOACTIVILOR PENTRUOBŢINEREA UNOR FORMULĂRIFARMACEUTICE ŞI TESTAREA ACESTORA ... 67

6.1. Difuzia prin membrană şi folosireacelulelor Franz ............................................................ 67

6.2. Evaluarea practică a cedării unuiprincipiu activ prin celule Franz echipate cumembrane de celuloză şi piele de şobolan ............... 75

6.3. Analiza reologică şi de nocivitate a unorformulări semisolide cu diferite tipuri detensioactivi ............................................................. 77

7. EVALUAREA NOCIVITĂŢIITENSIOACTIVILOR PRIN FOLOSIREA DEMETODE NON-INVAZIVE ..................................... 94

7.1. Aspecte generale ..................................... 947.2. Materiale şi metode ................................. 967.3. Rezultate şi discuţii ................................ 007.4. Concluzii ....................................... 09

8. APLICAREA TESTELOR INVITTOXPENTRU EVALUAREA UNOR TENSIOACTIVICLASICI ŞI MODERNI ............................... 10

8.1. Aspecte introductive ................................ 108.2. Materiale şi metode ................................. 138.3. Rezultate .............................................. 178.4. Concluzii ............................................. 42

9. FOLOSIREA SURFACTANŢILOR ÎNSINTEZA DE NANOCAPSULE POLIETER-URETANICE UTILIZATE ÎN TRANSPORTULTRANSDERMIC ....................................................... 43

9.1. Aspecte introductive ................................ 439.2. Microscopia electronică de scanare

(SEM) ........................................................................... 459.3. Calorimentria de scanare diferenţială

(DSC) ............................................................................ 499.4. Materiale şi metodă ................................. 539.5. Rezultate şi discuţii ................................ 56

10. TESTAREA UNOR NANOCAPSULE CUTENSIOACTIVI PRIN METODE NON-INVAZIVE PE MODEL ANIMAL ..................... 68

10.1. Condiţii de determinare ........................ 6810.2. Determinări tewametrice ....................... 6910.3. Determinări pH-metrice ........................ 7210.4. Determinări sebumetrice ...................... 7510.5. Determinări mexametrice ..................... 7810.6. Determinări corneometrice ................... 8410.7. Concluzii ................................................ 87

CONCLUZII GENERALE .................................. 88BIBLIOGRAFIE ........................................................ 92

6

CERCETĂRI PERSONALE

Motivarea şi obiectivele cercetării Tensioactivii sau surfactanţii sunt cunoscuţi

pentru influenţa asupra multor membrane biologice,

incluisv asupra pielii. Acest aspect va duce la

modificarea calităţilor pielii, a integrităţii acesteia şi

implicit la modificarea activităţii terapeutice locale sau/şi

sistemice. Din grupul de tensioctivi lauril sulfatul de

sodiu (LSS) prezintă o importanţă deosebită prin faptul

că modifică foarte mult calităţile membranelor biologice

şi în special ale pielii. Folosirea surfactanţilor pentru

facilitarea absorbţiei cutanate este utilă mai ales în cazul

soluţiilor, loţiunilor şi gelurilor pentru care rezistenţa la

suprafaţa pielii este redusă şi tensioactivul grăbeşte

penetrarea cutanată. În aceste cazuri se ţine seama şi de

faptul că tensioactivii modifică sau interacţionează cu

unele componente ale stratului cutanat. După un timp

scurt se stabileşte starea de echilibru.

Pielea este un organ intens studiat datorită

expunerii frecevente la factori de mediu, produse

cosmetice etc. Creşterea aspectelor patologice ce se pot

produce la nivelul pielii a accelerat nevoia de studiu pe

modele experimentale [Franz, T.J., 1978; Wester, R.,

7

1992; Michaels, A., 1975]. LSS difuzează între straturile

lipidice ale pielii şi fluidizează acest dublu strat. Pe lîngă

această tulburare a echilibrului şi integrităţii pielii este

cunoscut faptul că acesta produce şi fenomene nocive de

tip iritare cutanată, pierdere de apă transdermică mai ales

ca rezultat al legării de keratina intracelulară. LSS este

considerat „modelul de aur” al iritării cutanate şi un

compus de referinţă pentru studiul nocivităţii cutanate.

Nu în toate cazurile folosirea tensioactivilor ionici

(anionici şi cationici) determină penetrarea cutanată cea

mai intensă. Studii recente aplicate pentru Metotrexat au

arătat că aceştia sunt avansaţi de un al tensioactiv,

Transcutolul. Un aspect important este acela că pe lângă

tensioactivi, ca agenţi de penetrare se folosesc şi acizi

graşi, alcooli graşi şi solvenţi organici.

Surfactanţii reprezintă o categorie de substanţe auxiliare,

care pot fi folosite atât în produsele farmaceutice şi cât şi

în cele cosmetice, impunandu-se clar necesitatea unor

analize de calitate şi siguranţă, inclusiv compuşii

tensioactivi non-ionici [Franz, T.J., 1975]. Deşi

tensioactivii sunt componente auxiliare, acestea au rol

important, contribuind la obţinerea mai multe forme

8

farmaceutice (emulsii, baze de unguent, emulsie etc.)

[Franz, T.J., 1975; Franz, T.J., 1978].

În categoria compuşilor tensioactivi intră şi grupul celor

non-ionici ei fiind foarte importanţi pentru persoanele cu

pielea sensibilă încadrabile în tipul 1 sau 4 de

hipersensibilitate. Din acest grup de compuşi sunt foarte

utilizaţi polisorbaţii sau tweens şi mai exact polisorbaţii

20 şi 80. Este bine cunoscută capacitatea lor iritativă

foarte scăzută, dar pentru o mai bună înţelegere este

necesară observarea lor detaliată. Diverse forme cu

amestecuri de agenţi tensioactivi au fost, de asemenea,

foarte dezvoltate pentru efectele lor anti-iritante [Wester,

R., 1992; Franz, T.J., 1975]. Polisorbaţii 20 şi 80 sunt

utilizaţi în formularea unor produse bioterapice pentru

două caracteristici: prevenirea adsorbţiei de suprafaţă şi

ca stabilizatori faţă de agregarea proteică.

Analiza modernă a formelor cu agenţi tensioactivi

este justificată pe de-o parte prin utilizarea lor extinsă în

produsele cosmetice şi pe de altă parte prin includerea

unei mulţimi de măsurători uşor realizabile [Michaels,

A., 1975; Franz, T.J., 1975]. O comparaţie între compuşi

poate fi, de asemenea, utilă în privinţa aplicaţiilor pe care

le realizează. Deoarece acestea nu intră în categoria

9

substanţelor periculoase testele pe animale nu sunt

justificate din punct de vedere etic în timp ce testarea

umană este chiar dezirabilă.

Folosirea metodelor noninvazive pentru analiza

tensioactivilor şi produselor cu conţinut de tensioactivi

face posibilă detectarea rapidă a nocivităţii acestora.

Unele dintre cele mai cunoscute aparate sunt cele care

determină pierderea de apă transdermică, iritarea cutanată

sau cantitatea de hemoglobină locală, pigmentul melanic,

pH-ul, hidratarea generală a pielii etc. Cele mai

cunoscute aparate în acest sens sunt: TEWA-metrul,

Dermaspectrometrul, Cromametrul, Mexametrul, Skin-

pH metrul, Corneometrul, Sebumetrul etc. Informaţiile

furnizate de astfel de măsurători definesc calitatea

organului cutanat prin prezentarea calităţii stratului

cornos (corneometrie), a pierderii de apă transdermică

(TEWA-metrie) şi a modificării pigmentării şi a

eritemului local (mexametria). Mexametrul este un

spectrofotometru de reflexie de bandă îngustă proiectat să

măsoare şi să cuantifice eritemul (hemoglobina) şi

melanina ca zone pigmentate. Aplicabilitatea sa pe teren

cosmetic se extinde în studiile recente la tulburări la

hiperpigmentare şi este considerat suficient de sensibil

10

pentru a detecta mici diferenţe de culoare a pielii. Un alt

aspect important este faptul că oferă posibilitatea de

reproductibilitate [Shah, V, 1993; Smith, E.W., 1992].

Metodele de testarea la nivel cutanat sunt diverse

cum ar fi testarea in vitro pe diverse linii celulare,

testarea in vivo pe animale de experienţă şi testarea pe

om. Aceste metode la rândul lor trec printr-o permanentă

analiză şi modernizare. Testarea pe animale pentru

produsele cosmetice este limitată. Aceste metode trebuie

să fie fidele şi reproductibile. Expunerea excesivă la

agenţi fizici şi de mediu a pielii favorizează implicit

apariţia fenomenelor de fotoîmbătrânire. Intervenţia

asupra organului cutanat prin intermediul unor factori

agresivi de mediu cum ar fi formulările cu tensioactivi,

expunerea excesivă la radiaţii UV etc sunt aspecte care

preocupă cercetările actuale. Multe evaluări se pot face

pe model uman [Corbo, M., 1993]. Toxicitatea

compuşilor tensioactivi poate genera un răspuns

fiziologic, pot stimula iritaţia şi implică schimbări

obiective (roşeaţă locală şi edem) ori senzaţii subiective

(prurit şi durere). Chiar şi date recente mai ales

referitoare la studii preclinice finale arată că determinări

variate de siguranţă a produselor apelează la testele pe

11

animalul de experienţă datorită similitudinii evaluării. Cu

toate acestea sunt susţinute intens metodele alternative

dintre care utimele teste INVITTOX dezvoltă metode pe

celule sanguine, ou embrionat etc. [Vinardell, M.P.,

2008].

Un număr mare de persoane folosesc o serie de

creme şi unguente mai ales cu scop cosmetic. Cu toate

acestea nu s-a testat impactul folosirii lor după sau în

timpul expunerii la UV cunoscut fiind faptul că în

compoziţie au o serie de factori cu potenţial nociv

(tensioactivi etc). Acest aspect este corelat cu procentul

de cancere cutanate care apar chiar dacă expunerea

intensivă la UV a fost redusă cu un anumit timp înainte.

Cercetarea doreşte să scoată în evidenţă modificarea

calităţii pielii în prezenţa unui compus antioxidant prin

metode de studiu non invazive de tipul: corneometrie,

TEWA-metrie şi mexametrie [Shah, V., 1993; Smith,

E.W., 1992; Gallagher, S.J., 2003].

În acest context modele in vivo pe animale de

tipul şoarecilor sau şobolanilor sunt uşor de obţinut cu

observaţii profunde până la nivel molecular şi pot genera

rezultate bine corelate cu studiul pe om.

12

Prezentul studiu îşi propune să analizeze tocitatea

unor surfactanţi comuni şi utilizarea lor pe modele

experimentale în special de tip non-invaziv. Acestea se

referă la studii de evaluare toxicologică. Datele

prezentate doresc să sublinieze posibilitatea de evaluare a

tensioactivilor în formule aplicate pe piele umană.

Metodele de studiu se referă la tehnici non-invazive ce se

aplică la nivel cutanat şi la noi metode acceptate pentru

studiul nocivităţii ca teste INVITTOX: studiul pe celulele

sanguine (red blood cell test RBC) – INVITTOX

protocol nr. 37 şi cel pe ou embrionat (membrana

corioalantoidiană) – testul INVITTOX protocol nr. 96.

Datele prezentate doresc să sublinieze posibilitatea de

evaluare a tensioctivilor în formule aplicate pe piele

umană. Pentru conturarea mai detaliată a datelor legate

de aplicaţiile tensioctivilor s-a folosit utilizarea acestora

pentru formularea unor nanocapsule observând şi

diferenţierea aspectului lor datorită tipului de surfactant.

13

Principalele obiective fixate în cadrul tezei de

doctorat 1. Analiza unor formulări farmaceutice semisolide cu

tensioactivi. Compararea unor formulări cu tensioactivi

diferiţi.

2. Studiul nocivităţii tensioctivilor la nivelul organului

cutanat prin metode non-invazive. Teste aplicate pe piele

umană şi de animal de experienţă.

3. Interpretarea nocivităţii unor tensioactivi cu ajutorul

ultimelor teste alternative INVITTOX. Aplicaţii pe

hematii şi ou embrionat.

4. Studiul influenţei cedării unui principiu activ în funcţie

de tipul de tensioaciv. Aplicaţii prin folosirea cedării prin

celule Franz şi membrană sintetică şi obţinută din piele

de şobolan.

5. Aplicaţiile tensioactivilor în formularea unor

nanocapsule. Diferenţierea în funcţie de tipul de

tensioactiv.

14

6.3. Analiza reologică şi de nocivitate a unor

formulări semisolide cu diferite tipuri de tensioactivi

6.3.2. Material şi metodă

Citirile reologice s-au făcut cu Rheotestul RV-

MLV la 25 ºC. Indicele de saponificare s-a determinat

conform F.R.X, urmat de o validare statistică a valorilor

(6).

Formulele produsului semisolid care s-a folosit

pentru testarea tensioactivilor 2 % au fost preluate şi

adaptate dintr-un formular cosmetic (7). Procedeul de

preparare a formulărilor semisolide a fost prin încălzirea

celor două faze (apoasă şi uleioasă-faza grasă) la o

temperatură de aproximativ 70 ºC şi mixarea acestora.

Tensioactivul se solubilizează în faza apoasă. Cele două

faze se amestecă până la răcire şi solidificare.

Pentru determinarea capacităţii de întindere s-au

folosit aceleaşi 3 formule conform tabelului. Capacitatea

de întindere s-a determinat cu ajutorul extensometrului

Pozo Ojeda şi Sune Arbusa. Se ia în calcul diametrul

cercului ocupat de 1 g unguent în urma presării cu o

placă de sticlă (diametrul de 11 cm) care cântăreşte 54,5

grame (G0). La intervale de 1 minut se aşează pe placa

15

superioară a extensometrului greutăţi în ordine

crescândă: 50 g (G1), 100 g (G2), 150 g (G3) şi 200 g

(G4). Se citeşte apoi diametrul cercurilor formate prin

întinderea unguentului. Se calculează apoi suprafeţele

(π.r2) care se notează cu S0, S1, S2, S3 şi S4. Pe baza

acestor tipuri de rezultate se trasează curbele

extensometrice.

Tabelul 13. Formulele cosmetice analizate - pentru 100 g

bază

Ingredient Formula 1 Formula 2 Formula 3

Laurilsulfat de sodiu - - 0,5; 1; 1,5; 2

Tween 20 - 0,5; 1; 1,5; 2 -

Laurat de sucroză

D1216

0,5; 1; 1,5; 2 - -

Alcool cetilic 8 8 8

Unt de cacao 7 7 7

Vaselină 20 20 20

Soluţie conservantă 65 65 65

Pentru testarea curbelor de curgere se foloseşte formula:

16

unde τ este tensiunea tangenţială (Pa), z este contanta

cilindrului şi α ete valoarea citită pe cadran (forţa pe care

semisolidul o opune rotaţiei).

Pentru aprecierea vâscozităţii se foloseşte formula:

unde η este vâscozitatea dinamică (Pa .s), τ este tensiunea

tangenţială (Pa), iar D reprezintă gradientul de viteză (1/s

sau s-1).

Curbele de curgere şi reogramele ţin cont de aceşti

parametrii.

Pentru testarea nocivităţii s-a apelat la 3 grupuri de

voluntare a câte 5 persoane cu vârsta cuprinsă între 20-30

de ani care au fost instruite în ceea ce priveşte testul şi nu

au prezentat alte patologii care să interfere cu rezultatul

final. De asemenea nu s-a constatat nici hipersensibilitate

cutanată.

6.3.3. Rezultate şi discuţii

Analize reologice ale formule studiate au relevat

următoarele aspecte prezentate în figurile 25-31.

17

18

19

20

21

22

Aspectul pielii la trei loturi de voluntari după aplicare patch-ului cu formulele de analizat şi concentraţia de tensioactiv maximă de 2 % timp de 24 ore.

23

Tensioactivii sau surfactanţii, sunt compuşi amfifili care

formează monostraturi orientat pe interfeţe şi prezintă

concentraţii mai mari de echilibru la interfeţe decât cele

existente într-o soluţie vrac. Ele prezintă mai multe

caracteristici, inclusiv cele detergente, de spumare, de

udare, de emulsifiere, de solubilizare şi de dispersare.

Aceşti agenţi sunt o parte integrantă a sistemelor de

formulare disperse pentru medicamente şi produse

cosmetice şi pot întegra caracteristicile de stabilitate

fizică pentru aceste sisteme. În general, aceştia sunt

responsabili pentru proprietăţile reologice ale unei noi

formule de uz dermatocosmetologic [Rieger, M.M.,

1988; Garg, A., 2002]. Caracterizările reologice pentru

produsele semisolide farmaceutice şi cosmetice

furnizează informaţii importante pentru a facilita

producţia şi prelucrarea acestora. Astăzi, cei mai mulţi

producători, pot conta pe rezultatele reologice pentru a

dezvolta produse favorizate pentru client. Prin urmare, o

aparatură având un reometru fiabil şi şi date reologice

pertinente şi bine interpretate, devin absolut necesare

pentru producătorii actuali din domeniul farmaceutic şi

cosmetic. Rezultatele obţinute indică faptul că

formulările semisolide oferă avantaje potenţiale şi reale,

24

reprezentând un vehicul performant pentru dezvoltarea şi

pregătirea preparatelor dermofarmaceutice şi cosmetice

meritând investigaţii suplimentare şi în perioadele

viitoare.

Într-un alt studiu care trebuie amintit primele observaţii

cu privire la potenţialul iritativ al unor formulări

semisolide au fost evaluări vizuale. Acestea sunt

prezentate în figura 40. Primele imagini au arătat

rezultatele patch testelor principale, iar al doilea analiza

Proderm. Aşa cum este prezentat în figurile 39 şi 40,

agentul cel mai nociv este Tween 80, dar textura pielii şi

aspectul vizual nu sunt foarte importante ca şi efectele

secundare negative observabile. Probele au fost aplicate

concentraţiile maxime de tensioactiv (respectiv 10 %).

25

6.3.4. Concluzii

Lauril sulfatul de sodiu este tensioactivul care

determină cele mai bune proprietăţi reologice (curgere,

vâscozitate) comparativ cu ceilalţi doi însă şi lauratul de

sucroză duce la formulări calitative reologic. În schimb

laurilsulfatul de sodiu va determina o nocivitate extrem

de severă comparativ cu ceilalţi tensioactivi.

7. EVALUAREA NOCIVITĂŢII

TENSIOACTIVILOR PRIN FOLOSIREA

DE METODE NON-INVAZIVE

Tensioactivii sunt printre cele mai frecvente şi

versatile elemente constitutive care se regăsesc în

numeroase medicamente topice, produse cosmetice,

26

agenţi pentru curăţat, săpunuri şi şampoane. Surfactanţii

sunt aplicaţi în diverse produse ca şi aditivi din cauza

suprafeţei lor şi a activităţilor de interfaţă. Astfel,

concentraţiile utilizate în preparatele comerciale ar trebui

să evite reacţiile adverse cum ar fi iritarea tegumentară

sau oculară precum şi ale tipuri de patologii secundare

uzului lor. Din acest motiv, căutarea de noi tensioactivi

non-iritanţi este de mare interes şi necesită dezvoltarea

unor studiile de pre-formulare. Pentru a exista asigurarea

că preparatele / formulările sunt inofensive din punct de

vedere dermic şi ocular, este necesar să se studieze

potenţialul iritativ al tensioactivilor prin determinarea

toxicităţii lor.

7.2. Materiale şi metode

S-au utilizat bandaje ocluzive, materiale de fixare

şi siringi. Conform Declaraţiei de la Helsinki studiile au

păstrat toate datele de confidenţialitate. De asemenea

obiectivele studiului au ţintit aspecte esenţiale de ordin

ştiinţific. Înaintea începerii studiului toţi subiecţii au fost

detaliat informaţi despre ceea ce urmează să aibă loc în

cadrul studiului în cel mai mic detaliu. Pentru studiul de

faţă s-au selectat voluntari Caucazieni, care au acceptat în

27

mod liber să participe la cercetare, clinic sănătoşi.

Criteriile de excludere s-au referit la boli dermatologice

care pot interfera cu evaluarea finală, starea de

graviditate, participarea la alte studii simultan, tatuaje,

arsuri şi escare în zonele de studiu. Numărul total de

voluntari a fost 25 de sex feminin subdivizate în grupuri

de 5. De asemenea participanţii vor fi excluşi din grup

dacă:

- nu urmează îndeaproape instrucţiunile;

- se îmbolnăvesc sau suferă traumatisme pe

parcursul studiului;

- nu mai doresc să continue studiul în mod

deliberat.

Descrierea testului

Metodologia de testare constă în următoarele

etape: o anumită cantitate de produs (2 ml) se aplică cu o

seringă de 2 ml pe un bandaj ocluziv; bandajul ocluziv

impregnat cu produsul cosmetic este aplicat pe pielea

umană (umăr sau partea superioară a spatelui); simultan,

patch-urile placebo (niciun fel de substanţe active) şi cele

ce realizează controlul pozitiv (lauril sulfat de sodiu),

sunt aplicate pe piele; cele trei tipuri de probe sunt

28

codificate şi aplicate aleatoriu de către investigator, într-

un trial tip „single blind”; bandajul ocluziv este menţinut

24 de ore fără nici o umiditate, observându-se orice

eventuale efecte secundare; după 24 de ore bandajul

ocluziv este detaşat de pe piele şi produsul este spălat

fără nicio manevră de frecare; toate efectele adverse

tegumentare (eritem, uscăciune, edem), sunt evaluate cu

ajutorul scorurilor COLIPA, menţionate anterior; orice

reacţie este observată imediat şi după 30 de minute, o

oră, 24 şi 48 de ore de la îndepărtarea bandajului ocluziv;

evaluarea a fost realizată de către personal specializat şi

în aceleaşi condiţii luminozitate. Pentru patch-uri au fost

folosite: bandaje ocluzive, materiale adezive pentru

fixarea bandajelor, seringi şi hârtie. Studiile au fost

realizate respectându-se principiile etice ale Declaraţiei

de la Helsinki cu privire la testarea pe subiecţi umani,

incluzând confidenţialitatea cu privire la toate

înregistrările şi documentele.

Aspectul pielii a fost analizat cu ajutorul patch-

testelor şi confirmat de analiza 41 Proderm cu un

dispozitiv Proderm (figura 5).

29

Evaluarea potenţialului toxic / iritativ pentru produsele

cosmetice testate este efectuat vizual - roşeaţa şi / sau

uscăciunea a pielii este evaluată pe o scală în

conformitate cu scorurile COLIPA (tabelul 14).

Transportul transepidermic constă în traversarea

stratului cornos intact (SC). Există două posibilităţi de

trecere: intracelulară şi intercelulară (prin şi printre

30

corneocite). Modul de trecere depinde coeficientul de

partiţie k al substanţei active: substanţele hidrofile

preferă modul intracelular de traversare în timp ce

substanţele lipofile aleg calea intercelulară, în acelaşi

timp, existând molecule care pot utiliza ambele căi.

Această metodă reprezintă o evaluare indirectă a

integrităţii stratului hidrofilic responsabil pentru funcţia

de barieră a pielii. Există o difuzie continuă a apei din

corpul uman spre stratul cornos şi de acolo la mediul

inconjurator. Nivele mici de apă transepidermică

evaporată înseamnă o funcţie mai bună a pielii ca barieră

şi o pierdere mai mică a gradului de umezire naturală.

Funcţia de barieră este uşor perturbată de probleme

mecanice sau chimice. Măsurătorile de tip TEWL vor fi

efectuate numai după utilizarea produselor cu ajutorul

bandajelor ocluzive timp de 24 de ore. Acest tip de

testare au reprezentat o metodă neinvazivă de analiză a

pielii, într-un trial „single blind”. Formula semisolidă

pregătită pentru testele TEWL a fost comparată cu una

similară la care s-a ajuns folosindu-se un extract din

scoarţa uscată de mesteacăn, 1g / 100 g cremă (vezi

tabelul 15). Această formulă s-a dovedit a avea o

31

activitate de protecţie tegumentară [Urşica, L., 2005;

Morell, J.L.P., 1996].

7.3. Rezultate şi discuţii

Primele observaţii cu privire la potenţialul iritativ

al acestor formulări semisolide au fost evaluări vizuale.

Principalele teste au fost: eritemulul, descuamarea şi

edemul. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 17.

32

33

34

35

36

37

38

Observaţia principală în acest studiu preliminar

este că soluţia tensioactivului anionic este formularea cea

mai dăunătoare pentru piele. Aşa cum este prezentat în

literatura de specialitate tensioactivul laurilsulfat de sodiu

este considerat „modelul de aur” pentru testele de iritare.

Deşi acest aspect este clar, ar putea fi important să se

analizeze ce tip de formulare a produs tulburările cele

mai evidente şi care este importanţa diferitelor

39

concentraţii asupra afecţiunilor induse pielii. Datele

referitoare la aceşti compuşi sunt elementare deoarece ei

se aplică cu o frecvenţă considerabilă pe piele. Aspectele

legate de pirderea de apă transdermică subliniază

discuţiile prezentate şi arată că o perioadă scurtă şi

permanentă de aplicare de laurilsufat de sodiu în doze

mici determină o importantă nocivitate pe piele.

Starea de hidratare a pielii este influenţată de factori externi, cum ar fi creme, loţiuni, soluţii şi evaluarea reală arată diferenţele în ceea ce priveşte tipul de agent tensioactiv şi formularea utilizată

Observaţiile cele mai importante în această direcţie sunt legate de nocivitatea laurilsulfatului de sodiu pentru ambele formulări dar mai uşoară pentru crema neionică. Formulările semisolide influenţează starea de hidratare, după o perioadă scurtă de timp de aplicare permanentă. Parametrul cu o influenţă scăzută se referă la valorile melaninei pentru toate tipurile de formulări. Chiar dacă este detectabil prin acelaşi dispozitiv, Mexametrul, eritemul este intens influenţat de agentul tensioactiv anionic. Acest comentariu poate fi corelat cu aspectul vizual al pielii (figura 43) pentru un test cu plasture pe o piele sensibilă indică faptul că la o concentraţie mai mică de agent tensioactiv anionic (5 %) se produc modificări

40

importante externe (scorul eritemului 2). Analizele privind agenţii tensioactivi aplicaţi pe piele sunt justificate mai ales prin utilizarea lor frecventa. Acest lucru poate fi motivul pentru care ştiinţa a dezvoltat noi tendinţe in analiza de toxicitate a tensioactivilor, cum ar fi membrana de ou embrionat-corioalantoidiană (HET-CAM) testul sau testele in vitro (fibroblaşti etc.). Aceste evaluări vor finaliza testele non-invazive de apariţie a hemoragiei, a lizei şi a coagulării. 7.4. Concluzii

Polisorbaţii pot fi consideraţi ingrediente sigure mai evident în formulările semisolide. Polisorbat 20 este un compus foarte protectiv care poate fi aplicat în produsele pentru o piele sensibilă. Aplicaţiile pe termen lung pentru polisorbaţi reprezintă o procedură sigură.

Concentraţiile mai mari de tensioactivi cum ar fi compuşii neionici sunt sigure pentru piele şi aspectul nociv nu prezintă semnificaţie. Chiar şi compuşii non-ionici introduşi în formulările cosmetice semisolide care nu sunt toxice necesită testări de siguranţă din cauza aplicării lor pe termen lung şi a utilizării acestora în produse pentru pielea sensibilă sau în diverse separări biologice.

41

8. APLICAREA TESTELOR INVITTOX PENTRU EVALUAREA UNOR

TENSIOACTIVI CLASICI ŞI MODERNI

Evaluarea potentialului iritativ al unor

surfactanti prin metode in vitro şi in vivo

Curăţenia / igiena este o veche necesitate iar

surfactanţii au fost folosiţi de către omenire în acest scop

încă din vremuri străvechi.

Tensioactivii sunt molecule amfotere şi conţinând

o jumătate hidrofilă şi una lipofilă care să le permită să

interacţioneze cu atât moleculele polare cât şi cu cele

nepolare. Tensioactivii sunt, în general, clasificate în

funcţie de aceste proprietăţi sau pe baza constituţiei lor

chimice. În funcţie de încărcătura lor, ei sunt clasificaţi

ca tensioactivi anionici, neionici, cationici sau amfoteri.

Datorită proprietăţilor amfotere aceştia pot fi folosiţi ca

agenţi de curaţare, spumare, umectare, emulgatori etc.

Atunci când sunt aplicaţi pe piele, ei pot

interacţiona cu structuri tegumentare, în special cu

componentele lipidice şi proteice. Deşi tensioactivii

utilizaţi în produsele care se îndepărtează sunt în general

bine toleraţi, ei prezintă un risc pentru dezvoltarea

dermatitei iritative de contact.

42

Potenţialul iritativ este extrem de dependent de

concentraţia de substanţă, precum şi de pH-ul

compoziţiei realizat în cadrul formulării [Rhein, L.D.,

1986; Baranda, L., 2002]. Datorită capacităţii de a

emulsiona şi de a reduce tensiunea superficială a apei,

tensioactivii pot elimina lipidele din piele în timpul

procesului de spălare. Prin urmare, efectele dermice

iritante majore se manifestă în special în uscarea şi

asprirea pielii, iar în cazuri rare, pot fi induse chiar

leziuni mai severe.

Există mai multe metode utilizate cu regularitate a

diferenţia detergenţii, în ceea ce priveşte potenţialul lor

de iritaţie şi pentru ai clasifica din punct de vedere al

riscurilor profesionale. Testul Draize de iritare oculară a

fost standardul de aur mulţi ani pentru testarea iritării

ochilor. Având în vedere preocuparea pentru bunăstarea

animalelor şi limitarea utilizării lor în experimentele de

laborator, au fost dezvoltate metode alternative cum ar fi

testul pe celule roşii din sânge, testul pe membrana

corioalantoidiană de ou de găină (test HET-CAM) şi teste

ce folosesc modele de ţesut ocular, toate pentru a evalua

potenţialul iritativ al membranelor mucoase / oculare

indus de tensioactivi şi alte substanţe. Iritaţia dermică

43

este adesea evaluată la om utilizând testarea cu patch-uri

epicutanate (ECT; testul one-time plasture ocluziv), în

timp ce testele tip camera de săpun (SCT) pot fi utilizate

pentru a evalua iritarea secundară expunerii ocluzive

repetate la surfactant.

Scopul acestui studiu a fost de a evalua

comparabilitatea rezultatelor testului prin diferite metode.

Pentru a evita inconsecvenţele dependente de lot,

potenţialul iritativ pentru 18 tensioactivi a fost evaluat

folosind aceeaşi soluţie stoc pentru agenţii tensioactivi în

cadrul fiecărui studiu.

Când etichetarea se face în conformitate cu

clasificarea riscului profesional, substanţele sunt, în

general, testate nediluate şi la pH-ul pe care îl deţin

materiile prime depozitate. Acest lucru nu reflectă

condiţiile incluse în produsele de igienă personală, cum

ar fi şamponul, în care nivelul pH-ului, de obicei, variază

de la pH 5-8. Prin urmare, în acest studiu de

compatibilitate a soluţiilor tensioactive evaluarea s-a

făcut la un pH care este relevant pentru acest tip de

produs de consum. Excepţie au fost cazurile de limitare a

metodei printr-un pH specific, când testarea a fost

efectuată cu produse adaptate la un pH de 6,5.

44

Potenţialul iritativ ocular al tensioactivilor a fost

studiat cu ajutorul a trei sisteme de testare in vitro care în

prezent sunt utilizate ca alternative la studiile pe animale

şi anume testul RBC şi testul HET-CAM.

8.2. Materiale şi metode

Soluţiile de Laurilsulfat de sodiu (SDS), Tween 20

şi Tween 60 au fost în concentraţie de 5 %. Ele au fost

oferite de către departamentul de tehnologie farmaceutică

al UMFT. O soluţie tip vehicul control a fost pregătită

pentru aplicarea pe CAM; reactivul pur a fost diluat cu

apă distilată (1:10, v / v). SDS a fost administrat în CAM

iar ca model de control pozitiv s-a folosit o soluţie de 1

mg / ml în apă distilată.

Testul HETCAM

Această investigaţie biologică este folosită pentru a

evalua potenţialul iritativ ocular pentru orice substanţă de

testat, măsurată prin abilitatea sa de a induce toxicitate la

nivelul vascular pe membrana corioalantoidiană de pui

[Ribatti, D., 2008]. Biotestului HET-CAM a fost realizat

ca urmare a recomandărilor ICCVAM publicate în

noiembrie 2006 în apendicele G şi adaptate la condiţiile

laboratorului nostrum [Kishore, A.S., 2008].

45

Animale şi tratament

Şoareci tip CD1 Nu / Nu au fost achiziţionaţi de la

firma Charles River (Sulzfeld, Germania), 4 şoareci /

grup. Din săptămâna 8 pe zona dorsală a fost aplicată

soluţia testată: grupul A. martorul-doar solvent (apă);

grupul B. soluţie SLS de 5 %; grupul C - Tween 20 5 %

şi grupul D soluţia de Tween 60 5 %, de câte 2 ori / zi

fiecare. Rezultatele finale au fost înregistrate şi

centralizate după 30 de zile. Protocolul de muncă a urmat

toate normele de sănătate animală preconizate NIAH-

National Institute of Animal Health: animalele au fost

menţinute în timpul experimentului în condiţii standard:

12 ore ciclul lumină-întuneric, hrană şi apă libidum,

temperatură de 24 °C, umiditate peste 55 %.

Măsurătorile mexametrice au fost efectuate cu

ajutorul unui dispozitiv de cercetare de la Courage-

Khazaka, un mexametru tip MX18 (Courage-Khazaka

Electronic, Köln, Germania). Pentru măsurători, oarecii

au fost anesteziaţi cu ketamină şi xilazină. Timpul de

măsurare continuă a fost de 20 de secunde.

Protocolul a urmărit observaţiile cu privire la

statusul hemoglobinei (respectiv apariţia eritemului).

Dispozitivul a fost aplicat pe zonele afectate cel mai

46

evident şi a fost menţinut pe piele timp de 20 de secunde.

Datele au fost înregistrate de softul specific al

dispozitivului tip Mexametru MX18 şi apoi exprimate în

unităţi. Toate datele au fost prelucrate ca valori măsurate

iniţiale şi finale pe aceeaşi zonă

Compuşii testaţi şi reactivii

Toate tensioactivii utilizaţi, cu excepţia lauril

sulfatului de sodiu (SDS), au fost obţinuţi de la Cognis

Deutschland GmbH & Co. KG (Germania). O descriere a

acestor tensioactivi poate fi găsită în tabelul 19. Aceleaşi

soluţii stoc au fost utilizate pentru toate testele (12 % AS;

pH 6,5).

47

48

8.3. Rezultate

Soluţii stoc identice (12 % AS; pH 6,5) au fost

utilizate pentru toate testele în scopul evitării variaţiilor

în rezultatele testelor din cauza diferenţelor induse de

proprietăţile intrinseci ale produsului testat.

Atât concentraţia de substanţă activă (AS) cât şi

pH-ul joacă un rol major în provocarea reacţiilor iritante,

pH-ul şi AS % fiind ajustate în conformitate cu tabelul

20, în funcţie de metoda utilizată înainte de testare. Cu

excepţia a ECT, toate testele au fost efectuate în aceeaşi

lună.

49

Unele dintre probe au fost testate în ECT în aceeaşi

lună în timp ce alte probe au fost testate două luni mai

târziu. Testele au fost effectuate „dublu-orb” şi, după caz

randomizat.

Testul RBC

Testul celulelor sanguine roşii este un test pe bază

de celule fotometrice şi a fost dezvoltat pentru a evalua

reacţiile iniţiale celulare care au loc în procesele de

iritaţie oculară determinate de tensioactivi şi de produse

pe bază de surfactanţi. Principiul testului RBC este

evaluarea tulburărilor membranare şi a denaturării

proteinelor cauzate de agenţii tensioactivi. În acest scop,

deteriorarea membranei celulare este evaluată cu ajutorul

cantităţii de hemoglobină care se scurge în supernatant

precum şi de modificările conformaţiei proteinelor care

sunt evaluate prin denaturarea hemoglobinei. Deoarece

pH-ul fiziologic al sângelui este 7,4, toate soluţiile au fost

ajustate la acest pH pentru a evita modificări ale

potenţialului iritativ numai din cauza pH-ului.

Coeficientul H50 / DI este utilizat ca o măsură de

clasificare a iritaţiei oculare în analogie cu testul Draize

de iritaţie oculară.

50

Surfactanţii Dehyton MC, Gluadin WQ, Dehyton

ML, Plantacare 2000, Plantacare 818, Gluadin WK, şi

Plantapon LC7 au fost clasificaţi ca nefiind iritanţi în

timp ce tensioactivii Plantapon LC7, Gluadin WK şi

Plantapon 818 au fost încadraţi cel mai puţin iritanţi.

Tensioactivii PGFAC-S, Plantapon ACG 50, 138

Plantapon LGC, şi Plantacare 1200 au fost clasificaţi ca

fiind uşor iritanţi, tensioactivii Plantapon SB3, Dehyton

DC şi Dehyton PK45 au fost clasificaţi ca fiind moderat

iritanţi şi tensioactivii Texapon S K14, Texapon ALS,

Texapon K12 G şi Texapon N70 au fost clasificaţi ca

iritanţi.

Testul HET-CAM

Testul HET-CAM a fost aplicat conform

protocolului ICCVAM descris anterior de către

Spielemann si Liebsch (INVITTOX 1992). Acesta se

bazează pe observarea membranei corioalantoide după

aplicarea probelor de analizat şi ţine cont de avantajul

ţesutului biologic folosit – reţeaua vasculară sanguină, de

a reacţiona prompt în contact cu compuşii analizaţi.

Membrana corioalantoidă a embrionului de pui de

găină este observată continuu timp de 5 minute după

aplicarea soluţiilor de analizat. Metoda a putut fi folosită

51

în cazul tuturor probelor, acestea fiind transparente.

Momentul apariţiei primului semn de hemoragie, liză

vasculară (vase fantomă) sau coagulabilitate este notat în

secunde şi folosit pentru a calcula indicele de iritabilitate;

severitatea reacţiilor generate a fost de asemenea

evaluată.

Rezultatele sunt prezentate în figura 48 şi în tabelul 20.

52

53

54

55

Analizând rezultatele obţinute se observă diferenţa

existentă între probele control şi cele de analizat. Se

remarcă reacţia severă produsă de către lauril sulfatul de

sodiu (SDS); toxicitatea acestuia este confirmată şi de

efectul produs la aplicarea a 0,3 ml de soluţie 1 % la

nivelul membranei corioalantoide; decesul embrionului a

survenit în decurs de 20 de minute. În afara specimenului

tratat cu SDS toate celelalte au supravieţuit până a doua

zi.

Din seria de compuşi analizaţi se remarcă şi

Cremophor A6; în decursul celor 5 minute de observare a

evoluţiei plexului vascular în contact cu soluţia aplicată

au fost remarcate numeroase zone cu microhemoragii; de

56

asemenea în urma evaluării aspectului macroscopic al

membranei la o zi după aplicarea probelor, Cremophor

A6 este singura probă care determină distrugerea în

totalitate a membranei corioalantoide (figura 51).

Dintre moleculele analizate nici una nu a fost lipsită

în totalitate de potenţial iritativ. Următorii compuşi au

fost evaluaţi ca agenţi surfactanţi cu reacţie iritativă

foarte uşoară: Cremophor A25, Abril EM 90, Isolan GI

34. Sucrose ester, Cremophor RH 40, Cremophor EL şi

Labrasol au indicat un potenţial iritativ uşor. Compusul

cu cel mai ridicat potenţial iritativ încadrat în categoria

efect moderat spre sever a fost Cremophor A6. Acest

efect a fost confirmat şi prin distrucţia structurii

membranei evocată în figura 51.

Rezultatele arată o mare diferenţă între controlul

pozitiv, SDS şi cele două substanţe tensioactive testate

57

Tween 20 şi Tween 60. SDS induce tulburări majore la

nivel vascular pe membrana corioalantoidină; după

aplicarea de 0,3 ml de soluţie (1 mg / ml), o zonă întinsă

a fost afectată de numărul mare de microhemoragii,

moartea modelului fiind înregistrată după 20 de minute

de la contactul cu soluţia de SDS. Celelalte exemplare au

avut o viabilitate mai bună, rezistând până a doua zi.

Cele două soluţii de tensioactivi evaluate nu au

produs reacţii iritative severe pe plexul capilar al CAM

tratate. Ambele au prezentat semne de microcoagulare.

Soluţia de Tween 20 a indus o reacţie generalizată şi mai

severă, care a apărut mai târziu, explicând în acest fel

existenţa celei mai mici valori a scorului iritativ. De

asemenea, nu a existat nici un semn de liza, vasodilataţia

şi hemoragia uşoară au apărut doar la sfârşitul timpului

de observare. În ceea ce priveşte soluţia Tween 60, au

existat câteva domenii de microcoagulare şi de liză

vasculară, dar care au fost înregistrate mai devreme,

inducând un scor iritativ mai mare, chiar dacă severitatea

reacţiei a fost clasificată ca fiind uşoară.

Experimentele in vivo susţin teoria iritativă pentru

aspectele observate pe imaginile macroscopice ale

compuşilor testaţi (figura 52). Cel mai iritativ compus

58

este unul de referinţă SLS, dar, de asemenea, cei

nonionici (Tweens) au dezvoltat reacţii iritante şi de

tegument uscat (figurile 52 şi 53).

59

9. FOLOSIREA SURFACTANŢILOR ÎN SINTEZA DE NANOCAPSULE POLIETER-

URETANICE UTILIZATE ÎN TRANSPORTUL TRANSDERMIC

9.4. Materiale şi metodă

În sinteza nanocapsulelor polieter-uretanice se

utilizează o componentă hidroxilică (diol, poliol sau cel

mai frecvent amestecul lor), o componentă izocianică (un

semiprepolimer izocianic pe bază de lisin-diizocianat),

solvent şi surfactanţi. Componenta hidroxilică este

formată dintr-un amestec de dioli cu mase moleculare

mici ca 1,2-etilenglicol, 1,4-butandiol, respectiv

polietilenglicol cu masa moleculară 200. Componenta

izocianică este un semiprepolimer pe bază de lisin-

diizocianat; se utilizează varianta cu semiprepolimer

pentru a evita problemele de omogenizare datorate

diferenţelor de vâscozitate dintre cele doua componente.

Se foloseşte acetona ca solvent şi diferiţi surfactanţi.

60

61

62

63

9.5. Rezultate şi discuţii

Complecşii de incluziune sunt analizaţi prin

calorimetria de scanare diferenţială în scopul detectării

unei modificări ale proprietăţilor termice comparativ cu

substanţele pure. În cazul încorporării nanocapsulelor,

are loc o deplasare a punctelor lor de topire, fierbere şi

sublimare sau chiar dispariţia acestora.

Analiza prin calorimetrie de scanare diferenţială a

fost realizată cu un aparat Mettler Toledo DSC 821 tip

Star, versiunea 6.0 (Mettler Inc., Schwerzenbach,

Elveţia), cu o viteză de încălzire de 5 ºC / min şi o viteză

de curgere a argonului de 167 ml / min (10 l / h). Masa

probei s-a situat între 2-5 mg iar intervalul de

temperatură a fost între 25-300 ºC.

64

Curbele DSC nu prezintă pic-uri, substanţa având

caracter amorf, iar descompunerea substanţei are loc în

jurul temperaturii de 280 ºC. În cazul produşilor testaţi cu

65

HPBCD se constată dispariţia pic-ului endoterm (220 ºC)

şi apariţia unor pic-uri puternic endoterme în jurul valorii

de 260 ºC, care probabil atestă topirea întregii probe la

această valoare de temperatură. Nu poate fi exclusă şi o

descompunere a probei, însoţită de o eventuală reacţie

între cei doi compuşi.

Morfologia particulelor a fost examinată utilizând

microscopul de scanare electronică Hitachi 2400S

(Hitachi Scientific Ltd, Japonia). S-a utilizat un aparat de

acoperire în strat subţire (Bio-Rad SC 502, VG

Microtech, Anglia) pentru a induce o conductivitate

electrică a suprafeţei eşantionului. Presiunea aerului a

fost de 1,3-13,0 mPa. Forma şi morfologia de suprafaţă

ale unor compuşi formaţi din nanocapsule şi ale

complecşilor lor obţinuţi prin tehnica uscării prin

pulverizare sunt prezentate în figurile urmatoare.

Imaginile microscopice au fost înregistrate cu o mărire de

10.000 x a probei, astfel încât să fie vizibilă atât imaginea

de ansamblu cât şi o imagine cât mai detaliată a

particulelor substanţelor respective.

În cazul produşilor analizaţi se constată existenţa

unor cristale prismatice, de dimensiuni diferite, cu

suprafaţă netedă; nanostructurile se prezintă ca şi cristale

66

de diferite dimensiuni, neregulate. În ceea ce priveşte

cele două formule implicate în obţinerea complecşilor de

incluziune menţionaţi, se constată o diferenţă

semnificativă în morfologia particulelor: unele se

prezintă sub forma unor cristale tridimensionale, de

dimensiuni neregulate iar RAMEB este format din

particule sferice, fisurate, netede. În cazul complecşilor

obţinuţi prin tehnica uscării prin pulverizare se constată o

modificare remarcabilă a morfologiei substanţelor.

Produşii SD au o natură amorfă, cu particule sferice,

unele parţial fisurate, cu o suprafaţă netedă. Se observă

de asemenea agregarea acestor particule sferice.

În consecinţă, morfologia şi dimensiunea particulelor

produşilor SD sunt fundamental diferite de cele ale

substanţelor iniţiale, fiind imposibilă evidenţierea

cristalelor individuale (planurile de clivaj cristalografice)

ale diureticelor sau β-CD. Aceste observaţii conduc la

estimarea existenţei unei singure faze în produşii SD şi

deci la formarea unui complex de incluziune.

67

68

69

70

71

72

73

74

75

10. TESTAREA UNOR NANOCAPSULE CU TENSIOACTIVI PRIN METODE NON-

INVAZIVE PE MODEL ANIMAL

În cadrul experimentului de determinare a

modificărilor apărute la suprafaţa pielii în tratamente cu

medicamente înglobate în nanocapsule de tip polieter-

uretanic s-au avut în vedere următoarele:

- au fost utilizaţi în experiment 30 şoricei C57BL6j

împărţiţi în 10 loturi (3 şoricei / lot);

- şoriceii au fost epilaţi cu o zi înainte de a începe

aplicarea şi determinările, respectiv cu o zi înaintea

aplicării şi determinărilor din săptămânile 4 şi 8;

- a fost aplicată de fiecare dată o cantitate de 200 μL

emulsie de nanocapsule în acetonă (conc = 0.01 % w/w);

- pe martor s-au aplicat câte 200 μL acetonă;

- valorile au fost determinate după 30 minute de la

aplicarea pe piele;

- în tabele şi grafice sunt prelucrate valorile medii

ale fiecărui lot de 3 şoricei;

- loturile au fost notate conform tabelului I in funcţie

de surfactanţii utilizaţi în sinteza nanocapsulelor

poliuretanice.

76

77

78

79

80

81

82

83

10.7. Concluzii

În cazul valorilor determinate pe loturile de şoareci supus

acestui experiment, s-a observat că aplicarea de emulsii care

conţin nanocapsule nu modifică parametrii studiaţi.

84

CONCLUZII GENERALE 1. Surfactanţii sau compuşii cu activitate tensioactivă pot

genera schimbări importante la nivelul organului cutanat.

Studiul lor necesită reevaluare mai ales datorită faptului

că pot fi parte componentă a unor produse cu utilizarea

frecventă şi aceasta impune monitorizarea nocivităţii lor.

În plus noile concepte despre tensioctivi nu se referă la

excluderea lor ci la reevaluarea lor. Calitatea produselor

cu tensioctivi este incontestabilă mai ales în ceea ce

priveşte formulările în care ei au rol de emulgator.

2. Metodele moderne de studiu ale surfactanţilor permit o

investigare direct pe pielea umană pentru a prevedea

nocivitatea lor. Cu toate acestea pentru o detaliere a

acţiunii lor de ansamblu în produse dermatologice sau

alte produse finite se impune studiul complex pe

organisme in vivo (animale de experienţă, embrionii de

pui etc).

3. Studiul tensioactivilor se efectuează în cercetările

actuale prin metode non-invazive. TEWA-metria,

corneometria, Mexametria sunt numai câteva din aceste

metode aplicate pentru testarea organului cutanat.

85

4. Compuşii anionici de tipul laurilsulfatului de sodiu par

a fi extrem de nocivi pentru piele chiar şi la doze reduse.

Acest aspect este uşor observabil mai ales dacă sunt

aplicaţi sub formă de soluţii. Nocivitatea compuşilor

anionici se manifestă în primul rând prin modificarea

aspectului pielii prin iritaţie şi edem (patch test). Un alt

aspect detectabil în urma aplicării compuşilor tensioactivi

îndeosebi anionici este modifcarea statusului hidric al

pielii.

5. Cu toate că despre compuşii anionici se vehiculează în

diverse moduri ideea de nocivitate ei nu pot fi înlocuiţi şi

ignoraţi în produsele şi formulările finite datorită calităţii

conferită acestor formulări. Demonstrarea detaliată în

actualul material a posibilităţilor detaliate, diferite şi

reproductibile de evaluare a

produselor cu tensioactivi ajută la soluţionarea problemei

de testare şi elucidare a nocivităţii versus aplicabilitate.

6. Compuşii neionici nu sunt lipsiţi complet de intervenţii

în ceea ce priveşte modificarea calităţii pielii. Acest

aspect demonstrat prin diversele formulări cu tensioactivi

86

(formulări semisolide, nanocapsule) conduce din nou la

ideea testării pe cât posibil prin tehnici non-invazive a

formulărilor cu aceşti compuşi.

7. Compuşii de tipul surfactanţilor nu modifică sesizabil

melanina, dar cu ajutorul Mexametrului se pote detecta

modificarea hemoglobinei locale (eritemul). În plus

influenţează şi pierderea de apă transdermică şi statusul

hidric al pielii.

8. Parametrii de tipul apei transdermice şi hemoglobinei

locale sunt importanţi în expresia nocivităţii locale a unor

compuşi aplicaţi topic, inclusiv în cazul emulgatorilor.

9. Studiul toxicităţii surfactanţilor prin metode moderne

este de actualitate mai ales în ceea ce priveşte frecvenţa

utilizării lor, îndeosebi în produse cosmetice. Aplicarea

tehnicilor INVITTOX poate fi o soluţie importantă

pentru aprecierea exactă a nocivităţii acestora.

10. Un număr mare de studii au fost efectuate pentru a

găsi teste care să înlocuiască nevoia de animale de

experienţă în testele de siguranţă pentru ochi şi piele.

87

Testul pe piele de şoarece, care este un test fidel pentru

corp în totalitatea lui, poate fi corelat cu testul CAM. O

baterie de teste ar trebui să fie stabilite, pentru că nici un

test unic nu poate îndeplini toate cerinţele de evaluare a

riscurilor; s-ar putea utiliza o metodă in vitro şi o parte

din aceste teste ar putea fi teste simple pe ouă embrionate

sau pe pielea animalelor utilizate ca şi tehnici non-

invazive de măsurare.

11. Tensioactivii pot servi la producerea unor formulări

farmaceutice importante şi moderne. Ei sunt

indispensabili pentru unele formulări semisolide, mai ales

cele de pe piaţa dermocosmetică.

12. Aplicarea tensioactivilor moderni care prezintă

nocivitate scăzută poate fi o soluţie în ceea ce priveşte

reducerea potenţialului nociv ce poate fi exercitat de

acest tip de compuşi.

13. Tensioactivii clasici utilizaţi în formulări individual

sunt iritanţi şi sensibilizanţi pentru piele chiar şi la doze

reduse de 1-2 %. Combinarea acestora cu principii care

88

să protejeze organul cutanat ajută la diminuarea efectelor

nocive locale.

14. Tensioactivii pot influenţa cedarea in vitro a

principiului activ, fie că este vorba de membrană

celulozică fie că membrana de cedare este pielea de

şobolan.

15. Nanocapsulele sunt formulări moderne care în unele

variante de formulare apelează la tensioctivi. Tipul

acestora poate influenţa structura lor şi caracteristicile

formei finite dar nu într-un mod accentuat.

16. Testarea nanocapsulelor cu tensioactivi pe pielea

animalelor de experienţă prin metode rapide non-

invazive arată nocivitatea redusă a acestora.

17. Noile tendinţe în domeniul studiilor compuşilor cu

potenţial nociv se referă la posibilitatea de a-i utiliza în

continuare cu reglementări foarte clare.

89

PROPUNERI ŞI RECOMANDĂRI 1. Folosirea tensioactivilor în formulări farmaceutice

trebuie făcută echilibrat. Aceasta va avea în calcul ideea

de folosire a acestora în doze reduse sau folosirea unor

substanţe asociate care să reducă nocivitatea locală.

2. Aplicaţiile tensioactivilor pot fi extinse pe domenii

variate, inclusiv în ceea ce priveşte formularea de

nanocapsule. Aceste formulări se pot executa cu doze

mici de surfactant şi sunt lipsite de efecte nocive

marcante.

3. Aplicarea testelor INVITTOX este o soluţie facilă şi

detaliată a prezentării nocivităţii unui tensioactiv.

4. Testele INVITTOX se pot corela între ele şi apoi cu

altele de altă natură pentru a aprecia detaliat toxicitatea

tensioactivilor chiar şi la doze reduse.

5. Se recomandă testarea şi monitorizarea atentă a

formulărilor cu tensioactivi mai ales dacă sunt de tip

anionic.

6. Pentru evaluarea tensioactivilor şi formulărilor

acestora este indicată folosirea de metode non-invazive

90

(Mexametrie, TEWAmetrie etc.) care vor reda rapid şi

exact degradarea cutanată.

7. Se recomandă folosirea unor tipuri de tensioctivi care

conferă putere de penetrare similară atunci când se

testează cedarea principiului activ prin membrană

celulozică sau piele de animal.

8. Tensioactivii moderni trebuie luaţi în calcul ca variante

de compuşi cu rol de emulgator sau penetrant lipsiţi de o

nocivitate remarcabilă.

ELEMENTELE DE ORIGINALITATE Prin prezentul material se reliefează elemente de

originalitate care pot fi după cum urmează:

1. Se prezintă studii de toxicitate corelate pe pielea

umană şi studii implementate pe animale de experienţă

care apelează la tehnici moderne de analiză şi investigare.

2. Teza propune abordarea tehnicilor moderne de testare

a compuşilor nocivi şi a tensioactivilor, testele

INVITTOX dintre care s-a selectat testul pe ou embrionat

şi testul pe eritrocite care s-a aplicat pe un număr extins

91

de tensioactivi din categorii diferite. Mulţi dintre aceştia

sunt de ultimă generaţie.

3. Teza subliniază implementarea tehnicilor non-invazive

moderne ca metode de studiu al calităţii organului

cutanat.

4. Formularea de nanocapsule cu diferiţi tensioactivi,

implicit de ultimă generaţie subliniază elementul cel mai

important şi nou al materialului în lucru.

5. Nanocapsulele obţinute prin metode de sinteză actuale

au fost investigate prin metode moderne de analiză pe

animale de experienţă.

6. Studiul are un caracter concluziv în ceea ce priveşte

analiza tensioactivilor între aplicabilitate şi nocivitate.

92

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. Addicks, W.J.; Flynn, G.L.; Weiner, N.

Validation of a flow-through diffusion cell for use

in transdermal research. Pharm. Res. 1987, 4,

337–341.

2. Ai R, Dahl JE, Morisbak E, Polyzois GL.

Irritation and cytotoxic potential of denture

adhesives. Gerondol 2005; 22:177–183.

3. Al-Bawab, A.; Friberg, S.E., Some pertinent

factors in skin care emulsions. Adv. Colloid

Interf. Sci. 2006, 123–126, 313–322.

4. Baranda L. et al.: Correlation between pH and

irritant effect of cleansers marketed for dry skin,

Int. Journ of Dermatol., vol. 41 (8), Aug., p. 494,

2002;

5. Barany E, Lindberg M, Loden M. Biophysical

characterization of skin damage and recovery

after exposure to different surfactants. Contact

Dermat 1999; 40:98–103.

6. Barany, E., 2000. Human in vivo skin irritancy

testing. In: Loden, M., Maibach, H.I. (Eds.), Dry

Skin and Moisturizers. CRC Press LLC, Boca

Raton, pp. 243–250.

93

7. Barry, B.W.; Grace, A.J., Sensory Testing of

Spreadability: Investigation of Rheological

Conditions Operative During Application of

Topical Preparations, J. Pharm. Sci. 1972,61 (3),

335–341.

8. Bellomo, R.; Ronco, C. An Introduction to

continuous renal replacement therapy. In Atlas of

Hemodialysis; Bellomo, R., Baldwin, I., Ronco,

C., Thomas, G., Eds.; Bailliere Tindall: London,

UK, 2001; Volume 1, pp. 1–10.

9. Benassi L, Bertazzoni G, Magnoni C et al.

Decrease in toxic potential of mixed tensides

maintained below the critical micelle

concentration: an in vitro study. Skin Pharmacol.

Appl Skin Physiol 2003; 16: 156–164.

10. Bonferoni, M.C.; Rossi, S.; Ferrari, F.; Caramella,

C. A modified Franz diffusion cell for

simultaneous assessment of drug release and

washability of mucoadhesive gels. Pharm. Dev.

Tech. 1999, 4, 45–53.

11. Breton, P.J., 1999. From microns to nanometers:

early landmarks in the science of scanning

94

electron microscope imaging. Scanning Microsc.

13-1, 1–6.

12. Budai P, Varnagy L, Fejes S et al. Irritative

effects of some pesticides and a technical

component on tissue structure of the

chorioallantoic membrane. Commun Agric Appl

Biol Sci 2004; 69: 807–809.

13. Capitanul, A.; Luzy, A. P. ;Esdaile,D. ; et al.,

Comparison of the human skin grafted onto nude

mouse model with in vivo and in vitro models in

the prediction of percutaneous penetration of

three lipophilic pesticides, Regul. Toxicol. Pharm.

, 2007, 47: 274-287.

14. Caracciolo P.C., de Queiroz A.A.A., Higa O.Z.,

Buffa F., Abraham G.A., 2008, Acta

Biomaterialia, 4, 976-988;

15. Chattaraj, S.C.; Kanfer, I. Release of acyclovir

from semisolid dosage forms: a semi-automated

procedure using a simple plexiglass flow-through

cell. Int. J. Pharm. 1995, 125, 215–222.

16. Chenoweth, D.E.; Cheung, A.K.; Henderson,

L.W. Anaphylatoxin formation during

95

hemodialysis: Effects of different dialyzer

membranes. Kidney Int. 1983, 24, 764–769.

17. Chilcott R, Barai N, Beezer A, Brain S, Brown

M, Bunge A, et al. Inter- and intra-laboratory

variation of in vitro diffusion cell measurements:

an international multi-centre study using

quasistandardised methods and materials. J Pharm

Sci. 2005;94:632–8.

18. Clement, P.; Laugel, C.; Marty, J.-P. Influence of

three synthetic membranes on the release of

caffeine from concentrated w/o emulsions. J.

Controlled Release 2000, 66, 243–254.

19. 1997, (123-124), 169-182.

20. Corbo, M.; Schultz, T.W.; Wong, G.K.; van

Buskirk, G.A. Development and validation of in

vitro release testing methods for semisolid

formulations. Pharm. Tech. 1993, 9, 112–128.

21. Crisante F., Francolini I., Bellusci M., Martinelli

A., D‟Ilario L., Piozzi A., 2009, European

Journal of Pharmaceutical Sciences, 36, 555-564;

22. Cronin, M.T.D.; Dearden, J.C.; Moss, G.P.;

Murray-Dickson, G. Investigation of the

mechanism of flux across human skin in vitro by

96

quantitative structure-permeability relationship.

Eur. J. Pharm. Sci. 1998, 7, 325–330

23. De Fine Olivarius, F.; Agner, T.; Menne, T., Skin

barrier function and dermal inflammation. An

experimental study of transepidermal water loss

after dermal tuberculin injection compared with

SLS patch testing. Br. J. Dermatol. 1993, 129,

554–557.

24. Debbasch C, Ebenhahn C, Dami N et al. Eye

irritation of low-irritant cosmetic formulations:

correlation of in vitro results with clinical data

and product composition. Food Chem Toxicol

2005; 43: 155–165.

25. Diembeck W, Beck H, Benech-Kieffer F,

Courtellemont P, Dupuis J, Lovell W, et al. Test

guidelines for in vitro assessment of dermal

absorption and percutaneous penetration of

cosmetic ingredients. Food Chem Toxicol.

1999;37:191–205.

26. Djabari Z, Bauza E, Dal Farra C et al. The HET-

CAM test combined with histological studies for

better evaluation of active ingredient innocuity.

Int J Tissue React 2002; 24: 117–121

97

27. Duggin, G., Softening Skin with Emollient

Ingredients, Manufacturing Chemist 1996, 67 (6),

27–31.

28. Eccleston, G.M., Functions of mixed emulsifiers

and emulsifying waxes in dermatological lotions

and creams, Colloids and Surfaces A:

Physicochemical and Engineering Aspects

29. Edresi, S.; Baie, S., In-vitro and in-vivo

evaluation of a photo-protective kojic dipalmitate

loaded into nano-creams. Asian Journal of

Pharmaceutical Sciences 2010, 5 (6), 251-265.

30. Eun HC, Suh DH. Comprehensive outlook of in

vitro tests for assessing skin irritancy as

alternative to Draize tests. J Dermatol Sci 2000;

24: 77–91.

31. FDA-SUPAC-SS. Guidance for Industry.

SUPAC-SS Non-sterile Semisolid Dosage Forms.

Scale-up and Postapproval Changes: Chemistry,

Manufacturing and Controls. In vitro

ReleaseTesting and In Vivo Bioequivalence

Documentation 1997; pp. 19–24.

32. Fernandez A.M., Abraham G.A., Valentin J.L.,

San Roman J., 2006, Polymer, 47, 785-798;

98

33. Franz, T.J. Percutaneous absorption. On the

relevance of In vitro data. J. Invest. Dermatol.

1975, 64, 190–195.

34. Franz T. The finite dose technique as a valid in

vitro model for the study of percutaneous

absorption. Curr Probl Dermatol 1978;7:58–68.

35. Friend, D.; Catz, P.; Heller, J.; Okagaki, M.

Transdermal delivery of Levonorgestrel

IV:Evaluation of membranes. J. Pharm. Sci.

1989, 78, 477–481.

36. Fluhr, J.W.; Kuss, O.;Diepgen, T.; Lazzerini, S.;

Pelosi, A.; Gloor,M.; Berardesca, E.,Testing for

irritation with a multifactorial approach:

comparison of eight noninvasive measuring

techniques on five different irritation types, Br. J.

Dermatol. 2001,145, 696–703.

37. Frum Y, Eccleston GM, Meidan VM. Evidence

that drug flux through synthetic membranes is

assocated with normally distributed permeability

coefficients. Eur J Pharm Biopharm.

2007;67:434–9.

38. Gallagher, S.J.; Trottet, L.; Carter, T.P.; Heard,

C.M. Effects of membrane type and liquid/liquid

99

phase boundary on in vitro release of Ketoprofen

from gel formulations. J. Drug target. 2003, 11,

373–379.

39. Garg, A.; Aggarwal, D.; Garg, S.; Singla, A.

K.Spreading of Semisolid Formulations An

Update,Pharmaceutical Technology 2002, 9,84-

105.

40. Gettings SD, Lordo RA, Hintze KL et al. The

CTFA Evaluation of Alternatives Program: An

evaluation of in vitro alternatives to the Draize

primary eye irritation test. (Phase III) surfactant

based formulations. Food Chem Toxicol 1996; 34:

79–117.

41. Gogolewski S., 1996, ‚Biomedical

polyurethanes”. In: Arshady R., editor. „Desk

reference of functional polymers. Syntheses and

applications”, American Chemical Society,

Washington – DC, 657-698;

42. Goldstein, J., et al., 2003. Scanning Electron

Microscopy and X-ray Microanalysis, 3rd ed.

Plenum Press, New York.

43. Guan J., Sacks M.S., Beckman E.J., Wagner

W.R., 2004, Biomaterials, 25, 85-96;

100

44. Hagino S, Itagaki H, Kato S et al. Quantitative

evaluation to predict the eye irritancy of

chemicals: Modification of chorioallantoic

membrane test by using trypan blue. Toxicol In

Vitro 1991; 5: 301–304.

45. Hagino S, Itagaki H, Kato S, Kobayashi T.

Further evaluation of the quantitative

chorioallantoic membrane test using trypan blue

stain to predict the eye irritancy of chemicals.

Toxicol In Vitro 1993; 7: 35–39.

46. Haguenau, F., Hawkes, P.W., Hutchison, J.L.,

Satiat-Jeunemaıˆtre, B., Simon, G.T., Williams,

D.B., 2003. Key events in the history of electron

microscopy. Microsc. Microanal. 9, 96–138.

47. Hawkes, P., 2004. Recent advances in electron

optics and electron microscopy. Ann. Fondation

Louis de Broglie 29-1 .

48. Henning A, Schaefer UF, Neumann D. Potential

pitfalls in skin permeation experiments: influence

of experimental factors and subsequent data

evaluation. Eur J Pharm Biopharm. 2009;72:324–

31.

101

49. Herh, P.; Tkachuk, J.; Wu, S.; Bernzen, M.;

Rudolph B.,The rheology of pharmaceutical and

cosmetic semisolids,American Laboratory 1998,

1, 12-14.

50. Herzinger T, Korting HC, Maibach HI.

Assessment of cutaneous and ocular irritancy: a

decade of research on alternatives to animal

experimentation. Fundam Appl Toxicol 1995; 24:

29–41.

51. Hong J.H., Jeon H.J., Yoo J.H., Yu W.-R., Youk

J.H., 2007, Polymer Degradation and Stability,

92, 1186-1192;

52. Imokawa, G., Surfactant-induced depletion of

ceramides and other intercellular lipids:

implication for the mechanism leading to

dehydration of the stratum corneum, Exog.

Dermatol. 2004,3, 81–98.

53. Jiang X., Li J., Ding M., Tan H., Ling Q., Zhong

Y., Fu Q., 2007, European Polymer Journal, 43,

1838-1846;

54. Jones, D.S.; Woolfson, A.D.; Brown, A.F.,

Texture, Viscoelastic, and Mucoadhesive

Properties of Pharmaceutical Gels Composed of

102

Cellulose Polymers, Int. J. Pharm. 1997,151,

223–233.

55. Joy, D.C., 1991. The theory and practice of high-

resolution scanning electron microscopy.

Ultramicroscopy 37, 216–233.

56. Kajs T. M. ,Gartstein V Review of the

instrumental assessment of skin: Effects of

cleansing products J. Soc.Cosmet. Chem.

1991,42, 249-271

57. Khan G, Frum Y, Sarheed O, Eccleston GM,

Meidan VM. Assessment of drug permeability

distribution in two different model skins. Int J

Pharm. 2005;303:81–7.

58. Kishore A S, Surekha P A, Sekhar P V R et al.

Chorioallantoic Membrane Bioassay: An In Vitro

Alternative to Draize Eye Irritation Test for

Pesticide Screening. International Journal of

Toxicology 2008; 27: 449-453.

59. Kobayashi, Y.; Iwai,L.; Akutsu, N.; et al.,

Increased carbonyl protein levels in the stratum

corneum of the face during winter, Int. J.

Cosmetic. Sci., 2008, 30, 35-40.

103

60. Kogan, A.; Garti,N., Microemulsions as

transdermal drug delivery vehicles. Adv. Colloid.

Interfac., 2006, 123-126, 369-385.

61. Kónya, M.; Sorrenti, M.; Ferrari F.; et al., Study

of the microstructure of o/w creams with thermal

and rheological methods, Journal of Thermal

Analysis and Calorimetry 2003, 73, 623-632.

62. Michaels A, Chandrasekaran SK, Francis W,

Meredith M. Drug permeation through human

skin: theory and in vitro experimental

measurement. A I Ch E J. 1975;21:985–96.

63. Morell, J.L.P.; Claramonte, M.D.C.; Vialard, A.P.

Validation of a release diffusion cell for topical

dosage forms. Int. J. Pharm. 1996, 137, 49–55.

64. Oatley, C.W., 1982. The early history of the

scanning electron microscope. J. Appl. Phys. 53

(2).

65. *** OECD, 2008. Guideline for the Testing of

Chemicals, Draft Proposal for a New Guideline:

In vitro Skin Irritation: Human Skin Model Test.

Available at: http://www.oecd.org/ searchResult /

0,3400,en-2649-201185-1-1-1-1-1,00.html.

104

66. Otto, A.; Plessis, J.; Wiechers, J.W., Formulation

effects of topical emulsions on transdermal and

dermal delivery. International Journal of

Cosmetic Science, 2009, 31, 1–19.

67. Park J.-H., Allen M.G., Prausnitz M.R., 2005,

Journal of Controlled Release, 104, 51-66;

68. Pellett, M.A.; Castellano, S.; Hadgraft, J.; Davis,

A.F. The penetration of supersaturated solutions

of piroxicam across silicone membranes and

human skin in vitro. J. Control. Release 1997, 46,

205–214.

69. Prausnitz M.R., Mitragotri S., Langer R., 2004,

Nat. Rev. Drug. Discov., 3, 115-124;

70. Sanchez L, Mitjans M, Infante MR et al.

Determination of interleukin-1_ in human NCTC

2544 keratinocyte cells as a predictor of skin

irritation from lysine-based surfactants. Toxicol

Lett 2006; 167: 40–46.

71. Santerre J.P., Woodhouse K., Laroche G., Labow

R.S., 2005, Biomaterials, 26, 7457-7470;

72. Santoyo, S.; Arrelano, A.; Ygartua, P.; Martin, C.

In vitro percutaneous absorption of piroxicam

105

through synthetic membranes and abdominal rat

skin. Pharm. Acta. Helv. 1996, 71, 141–146.

73. Savic, S.; Weber, C.,; Savic, M.M.; Muller-

Goymann, C., Natural surfactant-based topical

vehicles for two model drugs: Influence of

different lipophilic excipients on in vitro/in vivo

skin performance. International Journal of

Pharmaceutics 2009, 38, 220–230.

74. Sivak, W.N., Zhang J., Petoud S., Beckman E.J.,

2010, Acta Biomaterialia, 6, 144-153;

75. Schaefer H., Redelmeier T.E., 1996, „Skin

Barrier: Principles of Percutaneous Absorption”,

Karger, Basel, 12-18;

76. Shah, V.P.; Elkins, J.S.; Lam, S.Y.; Skelly, J.P.

Determination of in vitro drug release from

hydrocortisone creams. Int. J. Pharm. 1989, 53,

53–39.

77. Shah, V.; Elkins, J.; Hanus, J.; Noorizadeh, C.;

Skelly, J. In vitro release of Hydrocortisone from

topical preparations and automated procedure.

Pharm. Res. 1991, 8, 55–59.

106

78. Tatai L., Moore T.G., Adhikari R., Malherbe F.,

Jayasekara R., Griffiths I., Gunatillake A., 2007,

Biomaterials, 28, 5407-5417;

79. Teichmann, A.;Heuschkel,S.;Jacobi,U.; et al.,

Comparison of stratum corneum penetration and

localization of a lipophilic model drug applied in

an O/W microemulsion and an amphiphilic

cream, Eur. J. Pharm. Biopharm., 2007, 67, 699-

706.

80. Thakker, K.D.; Chern, H. Development and

validation of in vitro release tests for semisolid

dosage forms - case study. Disso. Tech. 2003, 10,

10–15.

81. Twist, J.; Zatz, J. Membrane - solvent - solute

interaction in a model permeation system. J.

Pharm. Sci. 1988, 77, 538–540.

82. Twist, J.N.; Zatz, J.L. Influence of solvents on

paraben permeation through idealized skin model

membranes. J. Soc. Cosmet. Chem. 1986, 37,

429–444.

83. Uchiyama T., Watanabe J., Ishihara K., 2002,

Journal of Membrane Science, 208, 39;

107

84. Ueda, C.T.; Shah, V.P.; Derdzinski, K.; Ewing,

G.; Flynn, G.; Maibach, H.; Marques, M.;

Rytting, H.; Shaw, S.; Thakker, K.; Yacobi, A.

Topical and Transdermal Drug Products.

Pharmacopeial Forum. 2009, 35, 750–764.

85. Urşica L, C.Dehelean, C. Peev, V.Vlaia,

G.Coneac- Formulation and quality evaluation of

some topical semisolid preparations containing

dried extract of birch tree, Recent Developments

in Pharmaceutical Analysis, Sept.2005 pp.207.

86. Van Ruissen, F.; Carroll, Le, M.; Van der Valk,

J.M.; Schalkwijk, J., Differential effects of

detergents on keratinocyte gene expression. J.

Invest. Dermatol. 1998, 110, 358–363.

87. Vinardell MP, Garcıa L. The quantitive

chlorioallantoic membrane test using trypan blue

stain to predict the eye irritancy of liquid

scintillation cocktails. Toxicol In Vitro 2000; 14:

551–555.

88. Vinardell MP., Mitjans M. Alternative Methods

for Eye and Skin Irritation Tests: An Overview. J

Pharm Sci 2008; 97:46–59.

108

89. Vinardell MP, Rimbau V, Mitjans M. Potential

eye irritation of some „„biodegradable‟‟ liquid

scintillation cocktails determined in vitro. Food

Chem Toxicol 2004; 42:1287–1290.

90. Vinardell MP, Mitjans M. The chorioallantoic

membrane test as a model to predict the potential

human eye irritation induced by commonly used

laboratory solvents. Toxicol In Vitro 2006; 20:

1066–1070.

91. Welin-Berger, K.; Neelissen, J.A.M.;

Bergenstahl, B. The effect of rheological

behaviour of a topical anaesthetic formulations on

the release and permeation rates of the active

compound. Eur. J. Pharm. Sci. 2001, 13, 309–

318.

92. Wester R, Maibach H. Review: percutaneous

absorption of drugs. Clin Pharmacokinet.

1992;23:253–66.

93. Williams, A.C.; Barry, B.B., Penetration

enhancers, Adv. Drug Deliv. Rev. 2004,56, 603–

618

94. Wu, S.T.; Shiu, G.K.; Simmons, J.E.; Bronaugh,

R.L.; Skelly, J.P. In vitro release of nitroglycerin

109

from topical products by use of artificial

membranes. J. Pharm. Sci. 1992, 81, 1153–1156.

95. Zorin, S.; Kuylenstierna, F.; Thulin, H. In vitro

test of Nicotine's permeability through human

skin. Risk evaluation and safety aspects. Am.

Occup. Hyg. 1999, 43, 405–413.

110