1

Raport ştiinţific

privind implementarea proiectului

in perioada octombrie 2011 – decembrie 2015

Titlu proiect: Explorarea minim invazivă a angiogenezei în canerul de pancreas prin metode

imagistice şi moleculare (Angio-PAC)

Director: Prof. Univ. Dr. Adrian Săftoiu

Etapa 1:

Crearea bazei de date şi a protocolului de lucru

Etapa 2:

Crearea bazei de date şi a protocolului de lucru

Includerea pacienţilor cu cancer pancreatic (CE-EUS, 3D-EUS, EUS-FNA, EUS-

TCB)

Includerea pacienţilor cu cancer pancreatic (colectarea de ţesut pancreatic

post rezecţie chirurgicală)

Etapa 3:

Studiul in timp real al micromediului tumoral

Studiul angiogenezei si al celulelor stem in cancerul pancreatic prin

imunohistochimie si microdisectie laser

Etapa 4:

Continuarea evaluării angiogenezei și celulelor stem la pacienții cu cancer de

pancreas prin imunohistochimie și microdisecție laser

Evaluarea angiogenezei și celulelor stem la pacienții cu cancer de pancreas

prin metode genetice

Evaluarea și integrarea biostatistică a datelor

2

Crearea bazei de date şi a protocolului de lucru

Pe parcursul acestei etape a fost completată baza de date în format electronic şi

protocolul de lucru, necesar pentru evaluarea minim invazivă a pacienţilor cu cancer de

pancreas. Au fost de asemenea definitivate criteriile de includere şi excludere.

Baza de date a fost completată pentru toţii pacienţii incluşi în studiu şi conţine toate

rezultatele explorărilor efectuate. Înregistrările explorărilor imagistice sunt stocate în format

digital pentru analiza computerizată ulterioară.

Includerea pacienţilor cu cancer pancreatic (CE-EUS, 3D-EUS, EUS-FNA, EUS-

TCB)

Toţi pacienţii şi-au dat consimţământul scris pentru examinarea ecoendoscopică,

efectuarea anesteziei, colectarea de probe biologice şi folosirea datelor rezultate din

investigaţii în scopuri ştiinţifice.

Endoscopia Ultrasonografică (EUS) s-a efectuat iniţial în mod convenţional în scală

gri, prin examinarea cu atenţie din duoden şi stomac a capului, corpului şi cozii de pancreas

(Figura 1a).

S-a efectuat, de asemenea, examinarea în mod Doppler color şi Power Doppler

pentru a vizualiza vasele tumorale şi cele din vecinătate, pentru a stadializa boala şi a aprecia

rezecabilitatea. S-a menţinut o imagine stabilă centrată pe aria de interes, în general cu

tumora în centrul imaginii şi unul dintre vasele mari (Figura 1b).

3

Figura 2a – Adenocarcinom de cap de pancreas,

imaginea standard în modul de examinare cu contrast şi

index mecanic scăzut

Figura 2b – Adenocarcinom de cap de pancreas –

formaţiune hipocaptantă după injectarea substanţei de

contrast (faza arterială, 10 secunde)

Figura 1 – Adenocarcinom de cap de pancreas

(1a – imagine EUS în scală gri; 1b –mod Doppler evidenţiind contactul formaţiunii cu vena splenică)

Pentru examinarea cu substanţă de contrast (CE-EUS) şi index mecanic scăzut,

ecograful a fost comutat în modul de examinare dedicat, afişând astfel imaginea cu contrast

în partea stână a ecranului şi imaginea în scală gri în partea din dreapta (Figura 2a).

Selectarea indexului mecanic (MI - 0,2) şi a gain-ului a fost urmată de injectarea în bolus a

substanţei de contrast de generaţia a 2-a (Sonovue 2,4 ml) şi înregistrarea în format digital a

examinării (Figura 2b).

4

După înregistrarea fazei arteriale şi a celei venoase (aprox. 120 secunde), sistemul a

fost din nou setat pe mod EUS standard şi s-au efectuat examinări în moduri Doppler Color şi

Power Dopple, dar după administrarea substanţei de contrast (cu index mecanic crescut).

Pentru o examinare mai fidelă a formaţiunii tumorale şi a relaţiilor spaţiale cu vasele

înconjurătoare au fost realizate în continuare înregistrări în mod 3D (3D-EUS), atât cu index

mecanic crescut prin examinare în mod Doppler (Figura 3a) cât şi scăzut (Figura 3b) .

Figura 3 – Adenocarcinom de cap de pancreas, examinare tri-dimensională pentru o mai bună apreciere a relaţiei cu vasele trunchiului celiac (3a – reconstrucţie 3D în mod Doppler ; 3b –

reconstrucţie 3D în mod cu index mecanic scăzut)

5

În continuare, pentru un diagnostic de certitudine s-a efectuat colectarea de material

biologic din formaţiunea tumorală

examinată. Această tehnică s-a realizat fie

prin puncţie fină aspirativă ghidată

ecoendoscopic (PFA-EUS) fie prin puncţie

cu ac histologic (Figura 4). Puncţia

aspirativă este ghidată prin examinare cu

ecoendoscopul cu vedere longitudinală,

inclusiv în mod power Doppler (pentru a

evita puncţionarea vaselor şi hemoragie

consecutivă). După ce s-a fixat leziunea

(dacă este posibil prin angulare în UP) s-a

introdus acul pe porţiunea proximală a

canalului de biopsie şi s-a montat prin înfiletarea mânerului acului la nivelul capătului

proximal al canalului de biopsie. S-a avansat capătul acului până ce acesta apare în câmpul

ecoendoscopic, moment în care se fixează poziţia cu ajutorul şurubului de pe mâner. Ulterior

s-a avansat vârful acului în interiorul leziunii, s-a extras stiletul şi s-a fixat seringa în care s-a

creat vid (facilitându-se astfel sucţiunea permanentă). S-au executat un număr de 3 până la 6

pasaje prin mişcări de avansare şi retragere după care s-a extras acul de puncţie. Conţinutul

acului a fost descărcat pe mai multe lame de sticlă pe care s-au realizat frotiuri colorate, o

parte din conţinutul puncţionat a fost colectat pentru obţinerea de blocuri celulare şi o altă

parte a fost imersată în stabilizator ARN şi congelată la -80⁰ C. Tehnica de recoltare cu ac

histologic (Figura 4b) a fost asemănătoare. Din produsul obţinut, o parte a fost imersat în

formol pentru analiză anatomopatologică şi o altă parte, de asemenea în stabilizator ARN

pentru analizele genetice din etapele viitoare.

Diagnosticul final de cancer pancreatic s-a bazat bazat pe o combinaţie de informaţii

obţinute prin testele imagistice (inclusiv PFA şi confirmare citologică a malignităţii), urmărire

timp de cel puţin 6 luni prin examinări repetate clinice, ecografice sau computer

tomografice, respectiv laparotomie cu examen histopatologic. Pacienţii diagnosticaţi cu

pancreatită cronică pseudotumorală au fost urmăriţi minim 6 luni prin ecografie

transabdominală, CT şi/sau ecoendoscopie cu PFA, pentru excluderea diagnosticului de

malignitate.

Figura 4 – Adenocarcinom de cap de pancreas - puncţie

aspirativă cu ac histologic (procore) de 19 G

6

Algoritm clinic de evaluare și management al pacienților cu mase pancreatice și

puncție fină negativă

A fost studiat un lot suplimentar de pacienți evaluați ecoendoscopic cu punctie fină

aspirativa si citologie negativă. Obiectivul acestui studiu a fost elaborarea unui algoritm clinic

diagnostic bazat pe EUS la pacienții cu citologie negativa folosind elastografia și

ecoendoscopia cu substanta de contrast.

În această analiză retrospectivă a datelor colectate prospectiv am inclus 50 de

pacienți consecutivi cu mase pancreatice focale care au fost evaluați ecoendoscopic: 19

pacienti cu cancer pancreatic (CP) și 31 de pacienți cu pancreatită cronică pseudotumorală

(PC). Acesti pacienti reprezinta 38,46% din cei 130 de pacienți cu mase pancreatice (cu

excepția tumorilor neuroendocrine) evaluați. EUS-PFA a fost pozitivă în 80,81% dintre

pacienții cu cancer pancreatic, cu sensibilitate bună și acuratețe mare (85.38%) această

metodă având și o specificitate excelentă (100%).

Pacienții cu tumori neuroendocrine au fost excluși din acest studiu. Diagnosticul final

a fost stabilit prin repetarea EUS cu PFA și frotiuri pozitive, după rezecțiachirurgicală (la

pacienții cu tumori rezecabile) și de urmărirea pacienților pe parcursul unui an. În cazul

maselor cu suspiciune ridicată de cancer pancreatic, EUS-PFA a fost repetată după 1 lună.

Elastografia și ecoendoscopia cu contrast au fost efectuate secvențial la toți pacienții în

timpul aceleiași examinări EUS.

Ecoendoscopia cu elastografie în timp real (RTE-EUS)

Informațiile elastografice au fost studiate într-o regiune de interes (ROI) care a fost

setată manual și care a inclus atât țesutul studiat cât și țesut înconjurător. Pentru a aprecia

elasticitatea țesuturilor, s-a alocat o valoare pentru fiecare grad de elasticitate (pe o scară de

la 1 la 255), fiecare dintre acestea având un corespondent de culoare. Informațiile sono-

elastografice sunt prezentate suprapus pe imaginea convențională în scală gri. Sistemul este

configurat pentru a utiliza o hartă de culoare (roșu-verde-albastru). În cazul în care se

examineaza zonele de țesut dur acestea sunt colorate cu albastru închis, zonele de tesut cu

duritate intermediară cu zone verzi, tesutul semisolid cu galben iar țesutul moale este

marcat cu roșu. Compresia traductorului nu este de obicei necesară, pentru că bătăile

cardiace sau mișcările respiratorii pot înlocui comprimarea manuală. Pentru a obține

măsurători semi-cantitative am folosit histograme calculate pe regiunile de interes. Valoarea

7

cut-off ale histogramei a fost de 175. O valoare a histogramei mai mare de 175

caracterizează masele tumorale de duritate mare.

Ecoendoscopia cu substanță de contrast (CEH-EUS)

După o exminare EUS inițială în modul power Doppler, se administrează intravenos

un bolus de 4,8 ml de SonoVue. Examinarea în faza arterială (de obicei, la 15-20 de secunde)

s-a efectuat fie în modul cu index mecanic mare (de obicei modul power-Doppler), precum și

cu index mecanic scăzut cu armonici. Prin urmare, tumorile au fost considerate izo /

hipervasculare vs hipovasculare comparativ cu țesutul pancreatic înconjurător (evaluarea

calitativă). Mai mult decât atât, evaluarea cantitativă folosind un plug-in dezvoltat de Centrul

IT de la Universitatea de Medicină și Farmacie, Craiova a fost posibilă prin măsurarea

indicelui de vascularizație power Doppler. Procentul de pixeli color în interiorul tumorii a fost

calculat pe un film cu durata de 10 de secunde în faza venoasă. Pentru examinarea cu index

mecanic scăzut filmele au fost examinate cantitativ cu un software specializat (Vuebox,

Bracco Diagnostics inc., Italia). Aceasta a asigurat o analiză mai obiectivă a vascularizației

tumorale.

Analiza statistică

Sensibilitatea, specificitatea, valoarea predictivă pozitivă, valoarea pozitivă negativă și

acuratețea acestor metode au fost calculate separat pentru fiecare metoda (RTE-EUS și CEH-

EUS). Ulterior, acești parametri au fost calculați pentru metodele combinate. Am selectat

două grupuri de pacienti: cu aspect elstografic moale / mixt și cu aspect dur. Ulterior s-a

efectuat examinarea cu contrast. Acești pacienți reprezintă o categorie greu de gestionat:

tratamentul chirurgical versus follow-up. Astfel, am considerat necesar să se găsească un

algoritm bazat pe parametrii furnizați de EUS în timp real. Acest algoritm se bazează pe

evaluarea maselor pancreatice utilizând elastografia pentru caracterizarea durității țesutului,

urmată de examinarea cu contrast. Astfel, decizia clinică variază în funcție de examinarea

prin ambele metode: intervenție chirurgicală, urmărire sau repetarea puncției fine aspirative

ghidată ecoendoscopic. Analiza unui tabel de contingență 2x2 a fost realizat pentru datele de

tip categoric iar valoarea lui p a fost obținută utilizând testul exact al lui Fisher în timp ce

testul t a fost utilizat pentru date continue. Valoarea lui p sub 0,05 a fost considerată

semnificativă statistic.

Rezultate

Studiul a inclus 50 pacienți consecutivi cu mase pancreatice focale: 19 pacienți cu

cancer pancreatic cancer și 31 pacienți cu pancreatită cronică, toți cu PFA ghidata EUS

8

negativă. Vârsta medie a pacienților a fost de 54.28 ani, cu stdv de 11.35, 7 femei și 43

bărbați. Caracteristicile pacienților sunt redate în tabelul următor.

Chronic pancreatitis N=31

Pancreatic cancer N=19

P value

Age (y) 50.58 (stdv 11.41) 60.31 (stdv 8.43) 0.0023 (Unpaired t test)

Sex male/female – no. 31/0 12/7 0.0005 (Fisher's exact test)

Elastography (soft-mixed/hard)

24/7 1/18 <0.0001 (Fisher's exact test)

Vascularity (hyper/hypo) 25/6 2/17 <0.0001 (Fisher's exact test)

Majoritatea tumorilor au fost localizate la nivelul capul pancreasului (45), doar 5 fiind

la nivelul corpului. În acest set de pacienti cu EUS-PFA negativă nu a existat nicio tumora

situată în coada de pancreas. Conform rezultatelor noastre, majoritatea tumorilor maligne

pancreatice au fost dure, cu model albastru în elastografie (Figura 5) în timp ce masele

pseudotumorale din pancreatita cronica au avut aspect moale sau mixt (Figura 6).

Figura 5. Aspect elastografic dur la un pacient cu cancer de pancreas

Figura 6. Aspect elastografic mixt la un pacient cu pancreatită cronică

Valoarea medie a histogramei în elastografie fost 166.79 (stdv 25.75). Pentru

cancerul pancreatic valoarea mediană a elastografiei fost semnificativ mai mare, de 187.35

(stdv 13.18), comparativ cu pancreatita cronică pseudotumorală (p <0.001).

Valorile medii ale histogramei in formațiunile pancreatice evaluate

Diagnosis Pancreatic cancer Chronic pancreatitis

Mean 187.35 155.03

Stdv 13.18 23.81

N 19 31

P value <0.001

9

Evaluarea calitativă cu substanță de contrast a permis clasificarea maselor

pancreatice în hipovasculare (majoritatea tumorilor maligne) și hipervaculare (majoritatea

pancreatitelor cronice pseudotumorale) (Figurile 7 și 8).

Figura 7. Tumoră malignă hipovasculară Figura 8. Pancreatită cronică pseudotumorală hipervasculară

Conform rezultatelor noastre, această metodă a avut rezultate bune pentru

diferențierea între masele pancreatice maligne si benigne. Sensibilitatea, specificitatea și

acuratețea RTE-EUS pentru diagnosticul de malignitate au fost: 97,74%, 77,42% și respectiv

84% iar pentru CEH-EUS rezultatele au fost similare: 89,47%, 80,65% și respectiv 84%.

Ulterior, am selectat 25 de pacienti cu aspect moale / mixt în elastografie pentru

evaluarea secvențială folosind EUS cu contrast. Sensibilitatea CEH-EUS pentru detectarea

pancreatitei cronice în acest subset de pacienti a fost bun (75%), în timp ce specificitatea a

fost de 100%, cu o acuratețe de 76%. Nu au existat rezultate fals pozitive, iar valoarea

predictivă pozitivă a acestei metode a fost de 100%.

Acuratețea, sensibiltatea și specificitatea ecoendoscopiei cu contrast (pattern hipervascular) la pacienții cu aspect elastografic moale sau mixt

Rezultate (%) 95% CI

Sensibilitate 75.00 53.28 % to 90.16 %

Specificiate 100.00 16.55 % to 100.00 %

Valoare predicitivă negativă 14.29 2.37 % to 57.77 %

Valoare predictivă pozitivă 100.00 81.32 % to 100.00 %

Acuratețe 76.00%

Mai mult decât atât, rezecțiile chirurgicale inutile pot fi evitate la pacienții cu PFA

ghidate-EUS negative cu aspect elastografic mixt / moale și la cei cu mase iso/hipervasculare

la încărcarea cu contrast. Acești pacienți ar putea fi incluși într-un program de urmărire. Pe

10

de altă parte, s-a desprins un lot 25 de pacienti cu aspect dur în elastografie. La acești

pacienți, CEH-EUS a avut o specificitate excelentă (100%) și o acuratețe foarte bună (93%), în

timp ce sensibilitatea a fost de 89.47% pentru diagnosticul de cancer de pancreas. Nu exista

cazuri cu rezultate fals pozitive .

Acuratețea, sensibilitatea și specificitatea EUS cu contrast (pattern hipovascular) la pacienții cu

aspect dur în elastografie.

Resultate (%) 95% CI

Sensibilitate 89.47 66.82 % to 98.39 %

Specificiate 100.00 58.93 % to 100.00 %

Valoare predicitivă negativă 77.78 40.06 % to 96.53 %

Valoare predictivă pozitivă 100.00 80.33 % to 100.00 %

Acuratețe 93.00%

Astfel, această metodă permite detectarea pacienților care ar trebui direcționați

pentru intervenție chirurgicală.

Există o minoriate de pacienți (20%) care nu pot fi incluși clar într-un grup: pacienții

cu aspect elastogarfic dur și pattern hipervascular și pacienții cu elastogramă moale/mixtă și

pattern hipovascuar. Repetarea PFA-EUS la acești pacienți devine obligatorie înaintea luării

unei decizii. În acord cu aceste rezultate, am schițat un protocol clinic pentru evaluarea

secvențială a pacienților cu mase pancreatice. (Figura 9).

11

Figura 9. Algoritm clinic de evaluare si management al pacienților cu mase pancreatice.

12

Includerea pacienţilor cu cancer pancreatic (colectarea de ţesut pancreatic

post rezecţie chirurgicală)

Pacienţii la care diagnosticul s-a realizat într-un stadiu rezecabil (<20%) au fost

propuşi pentru intervenţie chirurgicală (duodenopancreatectomie). Echipa de chirurgi a fost

înştiinţată despre studiul la care participă pacientul şi şi-au dat acordul pentru recoltarea de

ţesut pancreatic tumoral. Produsul biologic a fost recoltat în recipiente cu formol şi în

recipiente conţinând soluţie de stabilizare ARN, acestea fiind ulterior congelate la -80⁰ C.

Studiul in timp real al micromediului tumoral

Endomicroscopia confocală laser (CLE) a fost propusă ca o nouă metodă de

examinare care permite studiul microscopic in vivo al mucoasei gastrointestinale în timpul

endoscopiei. Avantajul major constă în obţinerea unor imagini histologice in vivo, cu detalii

asupra structurilor celulare și vasculare, care fac posibil diagnosticul imediat pentru diferite

leziuni şi tipuri de țesuturi. Din punct de vedere tehnic există un sistem dedicat de

endomicroscopie (eCLE, Pentax; Tokio, Japonia) și un sistem de miniprobe flexibile ce pot fi

trecute prin canalul de lucru al unui endoscop obișnuit (pCLE, Cellvizio, Mauna Kea

Technology, Paris, Franța), principiul examinării fiind similar: generarea unei raze laser cu

lungime de unde de 488 nm care este direcționată către țesutul țintă, iar semnalul

recapturat este reprezentat sub forma unor secţiuni optice tisulare.

Potențialul CLE a fost explorat în patologii diverse ale tractului gastrointestinal,

demonstrând acuratețe înaltă în diagnosticul leziunilor premaligne şi maligne pe baza

evaluării în timp real a aspectelor vasculare și tisulare.

Sistemul cu miniprobe (pCLE) este alcătuit dintr-o probă-cateter compusă dintr-un

fascicol de fibre optice conectate la un micro-obiectiv, o unitate de scanare laser și un

software de control şi achiziţie. O gamă largă de miniprobe a fost proiectată pentru diferite

proceduri endoscopice și aplicații la nivelul tractului gastrointestinal superior și inferior cu

diferite dimensiuni și parametri optici. Endomicroscopia a depășit recent indicațiile luminale

prin dezvoltarea unei noi miniprobe de dimensiuni submilimetrice care poate fi avansată sub

ghidaj ecoendoscopic printr-un ac de puncție fina aspirativă de 19G. Această tehnică de

13

endomicroscopie ghidată EUS (nCLE) oferă posibilitatea obținerii detaliilor microscopice

pentru leziunile identificate la nivelul organelor solide adiacente tractului gastrointestinal,

altfel greu accesibile pentru prelevarea de biopsii. Fezabilitatea tehnicii a fost demonstrată

în studii clinice care au vizat în principal leziunile chistice pancreatice și care au condus la

obținerea unor criterii descriptive pentru diagnosticul acestora. A fost raportat însă doar un

număr limitat de cazuri de tumori solide pancreatice examinate prin nCLE.

Prin urmare, în această etapă a proiectului am urmărit evaluarea în timp real a

micromediului tumoral în leziunile solide pancreatice și a ganglionilor limfatici utilizând

examinarea endomicroscopiei pe ac sub ghidaj ecoendoscopic (EUS-nCLE). În același timp am

urmărit demonstrarea fezabilității și evaluarea siguranței acestei noi tehnici de examinare.

Acest studiu a inclus prospectiv pacienți cu mase tumorale pancreatice în cele două

centre implicate: Centrul de Cercetare în Gastroenterologie și Hepatologie, UMF din Craiova,

România și Departamentul de Endoscopie, Unitatea de Gastroenterologie, Spitalul

Universitar Herlev, Copenhaga, Danemarca. Criteriile de includere a pacienților au fost:

vârsta peste 18 ani, prezența unei tumori pancreatice cu indicație pentru efectuarea puncției

fine aspirative (PFA) ghidate EUS, acordarea consimțământului informat pentru efectuarea

procedurii, fiind excluși pacienții cu contraindicație pentru PFA-EUS, cu alergie la substanța

de contrast utilizată sau cei la care nu a putut fi obținut consimțământul.

Pentru aceste proceduri a fost utilizată o miniprobă proiectată pentru a fi introdusă

printr-un ac de PFA de 19G în leziunile de interes (AQ-Flex 19™, Cellvizio; Mauna Kea

Technology, Paris, France), având un diametru de 0,85 mm, o rezoluție laterală de 3,5 µm și

câmpul optic de 325 µm. Examinarea EUS a fost efectuată cu ajutorul ecoenedoscoapelor

liniare (Pentax EG 3870 UTK, Hamburg, Europe sau Olympus GF-UCT180, Tokyo, Japan)

cuplate la sistemele de ultrasonografie compatibile, urmărind examinarea completă a

pancreasului cu descrierea caracteristicilor tumorale (ecostructură, dimensiuni, prezența

invaziei vasculare). A fost notată de asemenea prezența ganglionilor regionali și a

eventualelor metastaze hepatice.

14

Figura 10 - Miniproba pentru endomicroscopie (AQ-Flex 19™, Cellvizio). B. Miniproba AQ-Flex 19™ vizualizată în imaginea ecoendoscopică la nivelul unei tumori pancreatice

Miniproba de endomicroscopie a fost preîncărcată într-un ac de puncţie fină

aspirativă de 19G, după îndepărtarea stiletului, fixată în poziția adecvată la vârful acului şi

avansată în interiorul tumorilor după identificarea acestora prin ecoendoscopie (Figura 5B).

Examinarea endomicrosopică a început după administrarea substanţei de contrast

(fluoresceină 10%, 2,5 - 5 ml, i.v.), salvând secvenţele video pentru analiză ulterioară. Pentru

confirmarea diagnosticului, după achiziționarea secvențelor nCLE, s-a practicat PFA-EUS cu

examen citologic și microhistologie pe blocuri celulare.

Diagnosticul final s-a bazat bazat pe PFA şi confirmarea citologică a malignităţii,

coroborat cu informaţiile obţinute prin testele imagistice și urmărire timp de cel puţin 6 luni

prin examinări repetate clinice, ecografice sau computer tomografice.

În perioada noiembrie 2012 - iulie 2013 au fost incluși 20 pacienți cu vârsta medie de

66 ani (41-85 ani), fiind examinate 19 tumori pancreatice și 3 ganglioni limfatici. Examinarea

EUS-nCLE a fost posibilă în toate cazurile, reuşind avansarea miniprobei la nivelul tumorilor şi

achiziția de secvenţe reprezentative, fără a se înregistra reacții adverse în timpul examinării

sau la urmărirea pacienților timp de 30 zile.

Diagnosticul final al leziunilor examinate a fost malign în 13 cazuri (o tumoră

neuroendocrină pancreatică malignă și 12 adenocarcinoame pancreatice) și benign în 7

cazuri, reprezentate de pancreatite cronice pseudotumorale.

Elementele întâlnite frecvent la EUS-nCLE au fost reprezentate de agregate celulare

întunecate (n=12), identificate cel mai frecvent în cazul leziunilor maligne. Benzile gri, subțiri

au fost descrise atât în cazurile benigne cât și in cele maligne, reprezentând cel mai probabil

benzi de fibroză. Figurile 11, 12 și 13 ilustrează aspecte nCLE reprezentative suprinse la

nivelul leziunilor pancreatice benigne și maligne, dar și în cazul ganglionilor examinați.

15

Figura 11 - Secvențe nCLE înregistrate la nivelul leziunilor benigne în care pot fi observate structuri întunecate lobulare, dispuse regulat, reprezentând acinii pancreatici (A, B), uneori

distanțate prin prezența țesutului conjunctiv abundent (B), dar și benzi negre, subțiri, probabil benzi de fibroză în pancreatita cronică (C)

Figura 12 - Imagini nCLE surprinse într-un caz de adenocarcinom pancreatic în care se observă vase mari, dilatate (A), cu fluoresceină în cantități crescute şi prezenţa unor agregate

întunecate reprezentând grupuri de celule maligne (B, C).

16

Figura 13 - Imagini nCLE înregistrate la nivelul ganglionilor limfatici. A - ganglion benign cu celule mici, inflamatorii. B - agregate întuncate de celule maligne observate într-un caz de metastază ganglionară cu leziune primitivă reprezentată de un adenocarcinom colonic

Ținând cont de numărul mic de pacienți examinați și de indisponibilitatea secțiunilor

histopatologice, în cele mai multe cazuri având la dispoziție doar aspecte de citopatologie, a

fost însă dificilă stabilirea unor corelații ferme între structurile observate la examinarea nCLE

și cele de histopatologie.

Ca urmare a acestui studiu putem afirma că examinarea tumorilor pancreatice prin

EUS-nCLE este fezabilă din punct de vedere tehnic, fără a fi grevată de complicații. Această

nouă metodă imagistică permite evaluarea în timp real a micromediului tumoral, cu

obținerea unor detalii de ordin microscopic care ar putea permite pe viitor obținerea unui

diagnostic histopatologic în timp real și inițierea rapidă a terapiei adecvate fiecărui pacient.

Sunt necesare însă studii suplimentare pentru validarea criteriilor diagnostice şi stabilirea

rolului real al metodei în examinarea pacienţilor cu cancer pancreatic.

Studiul angiogenezei si al celulelor stem in cancerul pancreatic prin

imunohistochimie si microdisectie laser

Pe parcursul acestei etape s-a desfășurat studiul imunohistochimic în scopul

caracterizării relației dintre procesul de angiogeneză și nișa de celule stem tumorale (CSC),

pe contingentul de material anatomopatologic colectat până în prezent (adenocarcinoame

pancreatice cu diferite grade de diferentiere).

Datele din literatură arată că citoarhitectonica adenocarcinomului pancreatic este

organizată și susținută pe baza existenței celulelor stem pancreatice tumorale, eliminarea

acestei populații de celule fiind o țintă atractivă în scopuri terapeutice (Wei et al., 2011).

La ora actuala nu există un consens în ceea ce privește strategiile de identificare și

izolare a CSC datorită complexității lor fenotipice și dificultăților tehnice întâlnite (Lee et al.,

2008; Matsuda et al., 2012). Mai multe molecule, in general glicoproteine membranare, au

fost propuse ca biomarkeri ai celulelor stem: CD44, CD24, EpCAM (Epithelial Cellular

17

Adhesion Molecule), ALDH1A1 (Aldehyde Dehydrogenase 1-A1), or CXCR4 (Wei et al., 2011;

Lee et al., 2008; Matsuda et al., 2012). Datorita însă specificității relativ scazute pentru

populația de celule stem chiar si globală (normală și tumorală), a devenit evident ca acest

deziderat nu se poate atinge decat prin procedee de imunofenotipare multiplă simultană

(Matsuda et al., 2012).

În studiul de față am urmărit caracterizarea populației de celule CD44+/CD24+,

precum și raportul acestora cu rețeaua vasculară de neoformație.

CD44 este o glicoproteină membranară implicată în proliferarea, diferențierea, și

migrarea celulară, în procesele de semnalizare intercelulară si de angiogeneză (Lesley and

Hyman, 1998). Experimentele pe animale au arătat că blocarea CD44 prin anticorpi specifici,

oligonucleotide antisens, și proteine solubile reduc semnificativ activitatea malignă a

diferitelor linii celulare neoplazice, subliniind potențialul terapeutic al agenților anti-CD44.

Este dovedit că CD44 promovează metastazarea, rezistența le terapie și împiedică apoptoza

în celulele tumorale (Naor et al., 1997).

CD24 este o sialoproteină membranară puternic glicozilată cu masa moleculară de

35-60 kDa exprimată în limfocitele B, T, keratinocite, fiind supraexprimată în multe tipuri de

cancer (Kristiansen et al., 2003; Zheng et al., 2011). Datorită glicozilării sale accentuate, se

pare ca funcția sa principală este de a media interacțiunile dintre celule si respectiv celule-

matrice extracelulară, fiind implicată în proceul de metastazare (Lee et al., 2010; Kristiansen

et al., 2003). A fost identificată și ca ligand alternativ pentru P-selectine, o clasă de receptori

de adeziune situați pe plachetele sanguine si pe celulele endoteliale, această interacțiune

facilitând trecerea celulelor tumorale în fluxul sanguin în procesul de metastazare (Zheng et

al., 2011; Myung et al., 2011).

CD105 (Endoglina) este o proteină transmembranară cu masa moleculară de 95 kDa,

exprimată în celulele vasculare endoteliale umane. Expresia sa crește în celulele endoteliale

în angiogeneză, si numeroase studii au indicat o asociere semnificativă a creșterii densității

vaselor CD105+ cu un prognostic rezervat în diferite neoplasme (Brewer et al., 2000; Li et al.,

2003).

După stabilirea grading-ului și stadiului tumoral prin integrarea datelor clinice si

histopatologice, s-a trecut la carcacterizarea individulală a markerilor propuși, precum și

studiul lor simultan prin technici de imunohistochimie simplă și dublă cu detecție enzimatică.

Pe surt, anticorpii primari direcționați împortiva CD44, CD24 si CD105 au fost detectați

individual cu ajutorul unui sistem de detecție polimeric specific speciei anticorpului primar,

18

polimeri conjugati cu peroxidază (HRP), detecția propriu-zisă fiind efectuată apoi cu DAB.

Evaluarea simultană a fost necesară pentru caracterizarea populației de celule

CD44+/CD24+, si s-a facut prin detecție secvențială cu polimeri direcționați către specia

fiecărui anticorp primar, polimerii fiind conjugați fie cu HRP fie cu fosfatază alcalină (AP).

Detecția s-a efectuat cu DAB pentru HRP si cu Fast Red pentru AP, cele două semnale

distincte permițînd analiza separată dar corelată a expresiei celor doi markeri, aceasta fiind

singura combinație larg utilizată și în scopul identificării semnalelor de colocalizare. În plus,

acelasi algoritm de dublă marcare s-a utilizat și pentru CD24 si CD105, dat fiind rolul CD24 în

facilitarea transcitozei trans-endoteliale a celulelor tumorale.

În țesutul pancreatic normal, CD44 are o expresie predominat membranară în multe

din celulele epiteliale acinare, si mult mai puțin intensă la nivel citoplasmatic. În marea

majoritate a cazurilor, insulele Langerhans sunt negative, insă mici variații pot apărea.

Celulele ductale nu exprimă acest marker (Takada et al., 1994a; Takada et al., 1994b).

În adenocarcinoamele pancreatice, expresia CD44 crește ca intensitate și arie de

imunomarcare în masa tumorală, un număr mult mai mare de celule fiind marcate,

comparativ cu acinii normali (Takada et al., 1994a; Takada et al., 1994b).

CD24 are o expresie membranară redusă în celulele acinare pancreatice normale,

epiteliul ductal fiind constant negativ pentru acest marker, numărul de celule pozitive fiind în

general sub 5% (Zhu et al., 2012).

În adenocarcinomul pancreatic, în schimb, expresia CD24 a fost observată în peste

70% din celulele tumorale, cu pattern atât membranar cât și citoplasmtic. Expresia a fost

crescută în special în tumorile cu grading crescut și stadiu avansat, confirmând potențialul

agresiv al celulelor CD24+ (Zhu et al., 2012).

Endoglina a fost exprimată la nivelul celulelor endoteliale ale vaselor mici de tipul

capilarelor în țesuturile tumorale colectate de la toți pacienții, precum și la nivelul

endoteliului vaselor limfatice. În țesutul pancreatic normal, CD105 nu a fost prezent la

nivelul endoteliilor vaselor de sânge și limfatice. Pacienții cu stadii avansate ale bolii au avut

o densitate a vaselor CD105+ crescută (Yoshitomi et al., 2008). Suntem în curs de evaluare

morfometrică a gradului de proximitate al celulelor CD24+ fata de endoteliile CD105+.

Technica de microdisecție laser

Microdisecția laser reprezintă standardul de aur în prelevarea țintită de țesut, făcând

posibilă selectarea câtorva celule de interes sau chiar a unei singure celule dintr-un

19

compartiment tisular heterogen, cu o precizie de 3-5 µm (Emmert-Buck et al., 1996; Kihara

et al., 2005).

Metodologia de lucru a utilizat sistemul achiziționat recent în Centrul de Cercetare

din Craiova: SISTEM MICRODISECTIE OLYMPUS - mmi SmartCut Plus montat pe un microscop

inversat Olympus CKX41/CKX31, și echipat cu softul aferent de control al platanului

motorizat, al laserului UV si al sistemului de colectare in tuburi speciale cu adeziv.

In acest sens, secțiunile destinate microdisecției laser au fost colectate, după taierea

din blocul de parafină, pe lame speciale mmi cu membrane de plastic montate pe o rama

metalica. Imunocolorarea dublă CD44/CD24 a decurs la fel ca și pentru technica clasica

secvențială în lumină transmisă, cu finalizarea marcajelor cu 3,3-diamino-benzidină (DAB) si

Fast Red. Lamele au fost acoperite temporar pentru evaluare și arhivare cu un mediu pe

bază de glicerol. Imediat inaintea disecției propriu-zise, lamelele au fost date jos de pe lame,

iar sectiunile uscate în aer. La un obiectiv de 20×, cu ajutorul instrumentelor de marcare din

softul mmi SmartCut, am selectat ariile de imunomarcaj dublu, alegând în total 40 de astfel

de câmpuri de maximă colocalizare pentru fiecare lamă în parte. Laserul UV a secționat apoi

automat ariile desemnate, iar intreg tesutul selectat a fost preluat in flacoane speciale de 1,5

ml cu pelicula adezivă, care ulterior au fost înaintate spre arhivare si prelucrare

departamentului de Genetica Medicală. Materialul astfel obținut va fi procesat pentru

analiză genomică prin qRT-PCR.

Evaluarea angiogenezei și celulelor stem la pacienții cu cancer de pancreas

prin metode genetice

Numărul total de pacienți cu patologie pancreatică incluși în studiu a fost de 168.

Patologia pancreatică a fost reprezentată de pancreatita acută (n=110), pancreatită cronică

(n=25), neoplasm de pancreas (n=33). Lotul control a fost alcătuit din pacienți care nu

prezintă patologie pancreatică (n=232).

Activităţile de cercetare genetică au fost realizate în cadrul Laboratorului de Genetică

Moleculară din cadrul Centrului de Cercetare în Gastroenterologie şi Hepatologie Craiova,

care dispune de toate echipamentele necesare activităţilor de identificare a polimorfismelor

genetice investigate.

Pacienților din loturile de studiu și martor li s-a recoltat sânge pe anticoagulant

(EDTA) necesar studierii polimorfismelor.

20

Recoltarea probelor şi materialul biologic

În ceea ce priveşte pacienţii din lotul cu patologie pancreatică, materialul biologic

a fost reprezentat de sânge (aproximativ 2,5 - 5 ml de sânge venos) recoltat pe EDTA şi

menţinut la 4°C până în momentul izolării ADN -ului. În cazul subiecţilor din lotul de

control, materialul biologic a fost sângele venos recoltat pe EDTA. Probele au fost codificate

cu litere şi numere acordate în ordinea recoltării.

Identificarea polimorfismelor genetice

Protocolul de identificare a polimorfismelor genetice a inclus următoarele etape:

izolarea ADN-ului genomic din sânge,

evaluarea spectofotometrică,

identificarea variantelor alelice prin tehnica Real Time PCR cu sonde TaqMan,

interpretarea rezultatelor.

Izolarea ADN-ului genomic din sângele periferic

Pentru izolarea ADN-ului genomic din probele de sânge recoltate de la pacienţii din

lotul de studiu, precum şi de la subiecţii din lotul control, am utilizat kit-ul Wizard® Genomic

DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI), respectând protocolul producătorului.

Această metodă cuprinde patru etape principale. Prima etapă este liza celulelor şi a

nucleilor acestora: această etapă presupune liza hematiilor, urmată de liza leucocitelor şi a

nucleilor acestora. Următoarea etapă este opţională şi constă în utilizarea RN-azelor pentru

digestia ARN-ului. Proteinele eliberate din celule sunt ulterior îndepărtate prin precipitare cu

săruri; acestea precipită proteinele, dar menţin ADN-ul genomic, cu greutate mare, în

soluție. În pasul următor, ADN-ul este concentrat şi desalizinat prin precipitare în

izopropanol. În etapa finală are loc spălarea cu etanol, deshidratarea şi rehidratarea ADN-

ului.

Determinarea concentraţiei şi purităţii ADN-ului

Concentraţia şi puritatea probelor de ADN au fost determinate folosind

spectrofotometrul Eppendorf Biophotometer. Măsurătorile s-au efectuat în volum de 50 μL

probă ADN; înregistrarea absorbanţelor s-a efectuat la următoarele lungimi de undă: 230,

260 si 280 nm.

Concentraţia s-a determinat după formula:

Concentrația μg/mL=A260 x 40 x Factorul de diluţie

Puritatea s-a determinat prin calcularea fracţiilor 260/280 şi 260/230.

Probele de o puritate acceptată trebuie să aibă valori mai mari sau egale cu:

21

a. 260/280 = 1.8 (o valoare mai mică a raportului 260/280 indică o posibilă contaminare cu

proteine);

b. 260/230 = 1.7 (o valoare mai mică a raportului 260/230 indică o posibilă contaminare cu

săruri, guanidină, carbohidrati, peptide, fenoli sau alţi compuşi aromatici).

Tehnica Real Time PCR cu sonde TaqMan pentru identificarea polimorfismelor

mononucleotidice

Tehnica Real Time PCR cu sonde TaqMan este o metodă modernă în care, spre

deosebire de metoda convenţională, fragmentul amplificat sau ampliconul este vizualizat

concomitent cu desfăşurarea procesului de amplificare. Această monitorizare în ―timp real‖

a procesului de amplificare este posibilă prin marcarea cu molecule fluororescente a

primerilor, probelor sau ampliconului.

Metoda convenţională - reacţia de polimerizare în lanţ - reprezintă copierea repetitivă

a unor secvenţe din ADN-ul dublu catenar. Importanţa acestei reacţii derivă din capacitatea

sa de a multiplica in vitro o secvenţă ADN ţintă şi astfel, de a genera o cantitate mare a

acelei secvenţe într-o scurtă perioadă de timp.

PCR implică prezenţa a doi primeri oligonucleotidici, a căror lungime medie este

cuprinsă între 17-30 nucleotide. Cei doi primeri flanchează secvenţa ADN ţintă şi au

secvenţe complementare cu cele două catene de ADN (catene sens şi antisens). Primerul

catenei sens se va împerechea, prin intermediul unor interacţiuni între bazele

complementare, cu catena antisens şi va iniţia sinteza unei noi catene sens. Simultan,

primerul antisens se va lega de catena sens a secvenţei ţintă şi va iniţia sinteza unei noi

catene antisens. Reacţia de polimerizare în lanţ este împărţită în trei etape separate, fiecare

având loc la temperaturi diferite.

Ciclul PCR denaturare - ataşare primeri - extensie este repetat de 40-50 ori

pentru a obţine o amplificare satisfăcătoare a secvenţei ADN specifice.

Tehnologia Real Time PCR utilizează o sondă cu un dublu marcaj fluorescent, numită

sondă TaqMan. TaqMan Real Time PCR cuantifică acumularea în timpul etapelor de

amplificare exponenţială ale reacţiei de polimerizare în lanţ, a unui produs marcat

fluorescent. Reacţia este similară cu reacţia PCR convenţională, dar se desfăşoară în timp

real, într-un real time termocycler care permite măsurarea moleculelor fluorescente în

tuburi PCR.

Diferenţa dintre cele două tipuri de reacţie este reprezentată de amestecul de

reacţie. Acesta va avea în compoziţie sonda TaqMan. Sonda conţine două tipuri de

22

fluorofori, care sunt părţile fluorescente ale proteinei reporter (Green Fluorescent Protein –

GFP, folosită adesea ca fluorofor). Sonda TaqMan are ataşat la capătul 5’ fluoroforul reporter

(R), iar la capătul 3’ fluoroforul quencher (Q). Emisia fluorescentă a reporter-ului se află sub

influenţa quencher-ului. În timp ce sonda este ataşată sau neataşată la ADN-ul

complementar şi înainte ca polimeraza să acţioneze, fluoroforul quencher (Q) (de obicei,

marcat cu o culoare cu lungime de undă lungă, spre exemplu roşu) reduce fluorescenţa

de la fluoroforul reporter (R) (de obicei, marcat cu o culoare cu lungime de undă scurtă,

spre exemplu verde). Acest lucru se face prin utilizarea transferului energiei fluorescente de

rezonanţă. Rezultatul constă în inhibarea emisiei fluorescenţei unui colorant de către un

altul fără emisie de protoni.

În momentul în care sonda TaqMan se leagă la ADN-ul complementar după

denaturarea şi răcirea reacţiei, primerii se ataşează la ADN.

Apoi Taq ADN polimeraza adaugă nucleotide şi îndepărtează (degradează) sonda

TaqMan ataşată la ADN-ul complementar. Are loc separarea quencherului de reporter,

permiţând reporterului să emită energie, fluorescenţă .

În urma acţiunii Taq ADN polimerazei reporterul fluorescent este înlăturat din

structura sondei. Departe de quencher, reporterul emite semnal luminos în raport cu

cantitatea de ampliconi sintetizată.

Aceasta este apoi cuantificată cu ajutorul unui computer. Frecvent, numărul de

cicluri al reacţiei este de 40-50 ori. Prin urmare, fluorescenta depistată prin Real Time PCR

este direct proporţională cu numărul de fluorofori eliberaţi şi cantitatea de ADN

complementar prezent în PCR.

Utilizarea a două sonde TaqMan în amestecul de reacţie, una pentru alela wild-

type şi alta pentru alela mutantă, permite aplicarea acestei tehnici în identificarea

polimorfismelor genice, în special cele mononucleotidice.

Protocolul de lucru pentru evidenţierea polimorfismelor unui singur nucleotid (SNP

– single nucleotide polymorphisms) impune folosirea TaqMan® Universal Master Mix şi

TaqMan® SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems, Foster City, CA) specifici pentru

fiecare dintre polimorfismele studiate. TaqMan® Genotyping Assays genotipează

polimorfismul unui singur nucleotid (SNP) prin utilizarea activităţii 5’ nucleazice pentru

amplificarea şi detectarea alelelor SNP specifice în probe de ADN genomic. TaqMan® SNP

Genotyping Assays este alcătuit din:

- primeri sens şi antisens specifici pentru amplificarea secvenţei de interes;

23

- două sonde TaqMan® MGB; fiecare sondă este alcătuită din:

un colorant reporter legat la capătul 5’ al sondei;

colorantul VIC® care detectează secvenţa alelei 1;

colorantul 6FAM™ care detectează secvenţa alelei 2;

un ligand la scobitura mică a ADN (MGB – minor groove binder), care creşte

temperatura de topire (Tm) fără a creşte lungimea sondei;

un colorant non-fluorescent de anihilare a reporterului (nonfluorescent

quencher) localizat la capătul 3’ al sondei.

Genotiparea celor două variante alelice într-o secvenţă ţintă de ADN este posibilă

datorită prezenţei semnalelor ambelor sonde în reacţie. Astfel este posibilă identificarea

prezenţei sau absenţei SNP-urilor pe baza schimbării fluorescenţei coloranţilor asociaţi

sondelor. Prezenţa unui singur semnal fluorescent este interpretată ca fiind stare

homozigotă, fie pentru alela 1, fie pentru alela 2 respectiv. Prezenţa semnalelor

fluorescente pentru ambii coloranţi semnifică starea de heterozigozitate.

Corelaţia dintre colorantul fluorescent şi genotip:

Fluorescenţă Rezultat

Numai fluorescenţa colorantului VIC Homozigozitate pentru alela 1

Numai fluorescenţa colorantului FAM Homozigozitate pentru alela 2

Semnale fluorescente pentru ambii

coloranţi

Heterozigozitate pentru alelele 1 şi 2

TaqMan Universal Master Mix conţine ADN polimeraza AmpliTaq Gold, UP (Ultra Pure),

deoxiribonucleotid trifosfaţi (dNTPs), referinţă pasivă ROX™, precum şi componente tampon

optimizate pentru sensibilitate, precizie, specificitate şi duplicitate.

ADN polimeraza AmpliTaq Gold, UP (AmpliTaq Gold® DNA Polymerase, UP) este o

formă modificată chimic a ADN polimerazei AmpliTaq. Etapa de incubare termică necesară

pentru activarea enzimei asigură faptul că activarea enzimei are loc numai la temperaturi la

care ADN-ul este complet denaturat. În momentul adăugării enzimei la amestecul de reacţie

la temperatura camerei, enzima inactivă nu este capabilă să extindă primerii. ADN

polimeraza AmpliTaq Gold, UP este identică cu ADN polimeraza AmpliTaq Gold, dar este

purificată pentru a îndepărta ADN-ul bacterian al organismului gazdă.

Reacţia PCR exploatează activitatea 5’ exonucleazică a ADN polimerazei AmpliTaq®

Gold, UP (Ultra Pure) de a cliva sonda TaqMan® în timpul PCR. În timpul reacţiei, clivarea

24

sondei separă colorantul reporter de colorantul de anihilare, producând o fluorescenţă

crescută a reporterului.

Creşterea fluorescenţei are loc numai în cazul în care ţinta amplificată este

complementară cu sonda. Astfel, semnalul fluorescent generat prin amplificarea prin PCR

indică alela prezentă în probă.Pentru ident icarea polimorfismelor mononucleotidice s-a

utilizat sistemul Real Time ViiA7 (Applied Biosystem). Interpretarea rezultatelor s-a realizat

cu softul sistemului – ViiA™ 7 Software v1.0 şi a opţiunii Allelic Discrimination. Reacţiile s-au

desfăşurat în plăci cu 384 de godeuri, volumul total per reacţie a fost 5 μl: 2.5 μl ADN au

fost transferaţi în 2.5 μl amestec de reacţie compus din: Universal Master Mix (Applied

Biosystems, Foster City, CA şi TaqMan® SNP Genotyping Assays 40x (Applied Biosystems,

Foster City, CA).

Condiţii de ciclare pentru sistemul Real Time PCR ViiA7:

Etapa Precitire Activarea AmpliTaqGold, UP

PCR Post-citire

Păstrare Ciclul (45 de cicluri)

Denaturare Ataşare/Extindere

Durata 30 sec 10 min 15 sec 90 sec 30 sec

Temperatura 60oC 95oC 92oC 60oC 60oC

Rezultatele analizei clinice și paraclinice a loturilor de studiu

Pentru prelucrarea datelor s-au folosit programul Microsoft Excel (Microsoft Corp.,

Redmond, WA, USA), împreună cu suita XLSTAT pentru MS Excel (Addinsoft SARL, Paris,

Franţa) şi programul IBM SPSS Statistics 20.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA).

Informaţiile obținute au fost stocate în fişiere Microsoft Excel, fiind apoi prelucrate

statistic, în vederea analizării relaţiilor dintre datele clinice și paraclinice ale pacienților.

Prelucrarea secundară a datelor - analiza descriptivă a lotului în funcţie de diferiţi

parametri, calcularea parametrilor statistici fundamentali, media şi deviaţia standard, a

raportului lor, numit coeficient de variaţie, reprezentarea lor grafică - a fost efectuată cu

programul Excel, cu ajutorul comenzilor Pivot Tables, Functions-Statistical, Chart şi a

modulului Data Analysis. Pentru realizarea testelor statistice complexe (testul Chi pătrat,

testul Student, testul ANOVA) s-au folosit comenzi din modulul XLSTAT sau au fost efectuate

cu ajutorul programului SPSS.

Pentru caracterizarea datelor numerice folosite în cadrul studiilor efectuate pentru

lucrarea de faţă, am folosit următorii indicatori statistici: media aritmetica si deviația

standard, raportul lor – coeficientul de variație

25

Media aritmetică a unei serii de valori este indicatorul care arată tendinţa centrală a

seriei de valori şi, de obicei, reprezintă valoarea în jurul căreia sunt situate majoritate

datelor. Este un indicator simplu şi în acelaşi timp foarte sintetic, fiind un foarte bun indiciu

al valorii în jurul căreia se grupează datele. Se notează cu litera m sau, dacă seria de valori

este notată cu o majusculă ca X sau Y, media se notează cu X sau Y . Formula este cea

cunoscută:

Xx x x

nmn

1 2 .........

Media este indicatorul care arată tendinţa centrală a seriei de valori şi, de obicei,

arată unde tind să se aglomereze datele. De cele mai multe ori, valorile din serie sunt situate

în majoritate în apropierea mediei, iar o mai mică parte din ele sunt situate mult în stânga

sau în dreapta mediei.

Deviaţia sau abaterea standard este parametrul fundamental folosit pentru caracterizarea

împrăştierii unei serii de valori şi reprezintă rădăcina pătrată a dispersiei. Se notează cu şi

are formula:

D sau 1

)(.......)()( 222

21

n

XxXxXx n

Acest indicator se exprimă cu aceeaşi unitate de măsură ca şi valorile din seria

considerată şi este un indicator foarte fidel al împrăştierii seriei. Deviaţia standard nu are

dezavantajele dispersiei, adică unitatea de măsură este aceeaşi cu a valorilor din serie şi are

o valoare comparabilă cu abaterile individuale de la medie.

Coeficientul de variaţie - este raportul dintre deviaţia standard şi medie, atunci când

media este diferită de 0. C.V. se exprimă în procente.

Aprecierea cu ajutorul coeficientului de variaţie se face mai ales atunci când două serii

de valori au medii mult diferite şi deviaţiile standard pot să nu ne dea o indicaţie suficient de

utilă.

Coeficientul de variaţie este cel mai fidel indicator al împrăştierii unei serii statistice,

dar are şi el un inconvenient, este cu atât mai fidel cu cât mediile sunt mai depărtate de 0.

La medii foarte apropiate de 0 îşi pierde din fidelitate şi nu este indicat să fie folosit.

Acest lucru se întâmplă mai ales atunci când valorile din serie sunt şi negative şi pozitive şi

când, din acest motiv, media poate fi aproape de 0.

26

În cazul în care dorim să analizăm diferențele existente între date numerice, pentru

două sau mai multe loturi de subiecți, se folosesc testele Student sau ANOVA, care compară

valorilor medii ale datelor.

Pentru compararea valorilor obținute pentru diferite categorii de pacienți din cadrul

unui singur lot, am utilizat fie testul t al lui Student, când existau doar două subgrupuri, fie

testul ANOVA, când existau mai multe subgrupuri.

Testul t al lui Student pentru comparare mediilor a 2 loturi, propune doua ipoteze

statistice:

ipoteza H0 (sau ipoteza de nul): diferenţa între medii este întâmplătoare

ipoteza H1: diferenţa între medii este semnificativă statistic

Rezultatul p al testului reprezintă probabilitate de a face o eroare dacă se respinge

ipoteza H0 a testului, rezultat furnizat ca un număr între 0 şi 1. Dacă p este mai mic decât

0.05 respingem ipoteza H0, de nul, şi admitem că este adevărată ipoteza H1.

Interpretarea valorilor lui p se face, ca la orice test statistic, astfel:

- p < 0.05, diferenţa între cele două medii este semnificativă (S, încredere 95%).

- p < 0.01, diferenţa între cele două medii este semnificativă (S, încredere 99%).

- p < 0.001, diferenţa între cele două medii este înalt semnificativă (HS, încredere

99.9%).

- p > 0.05, diferenţa între cele două medii este nesemnificativă (NS).

Testul ANOVA (Analysis of Variance) este un procedeu de analiză a varianţei unei

variabile numerice, sub influenţa unei variabile de grupare. Prin ANOVA se compară medii

pentru trei şi mai multe subpopulaţii (loturi) definite de variabila de grupare (variabila

independentă).

Această metodă permite extensia analizei realizate prin testul t, aplicabil asupra a

două medii, la situaţii în care variabila independentă (variabila de grupare) prezintă trei şi

mai multe categorii (niveluri) pentru a verifica dacă sunt diferenţe semnificative între

populaţiile din care s-au extras eşantioanele observate.

În analiza variaţiei considerând un singur factor cauză se formulează următoarele 2

ipoteze:

- ipoteza nulă H0: x,¯ 1=x,¯ 1=.....x,¯ k unde x – parametrul considerat, x,¯ - media

- ipoteza alternativă H1: cel puţin valorile a doi parametri sunt diferite între ele.

27

În cazul în care rezultatul testului ANOVA este semnificativ statistic putem continua

analiza prin testele „post hoc” Tuckey HSD sau Fisher LSD, pentru a identifica perechile de

categorii între care există diferențe semnificative.

În cazul parametrilor care nu sunt reprezentaţi prin date numerice, continue sau

discrete, pentru a analiza legaturile existente intre factori, nu putem calcula coeficienţii de

corelaţie obișnuiți, Pearson sau Spearman. În cazul datelor ordinale sau nominale trebuie să

apelăm la teste care analizează tabelele de incidenţă (contingenţă) generate prin aplicarea

încrucişata („cross tabulation”) a unor perechi de factori, pentru a identifica legăturile dintre

categoriile acelor variabile.

Testul Chi pătrat este un test statistic ce arată dacă există vreo legătură (influență

reciprocă) între doi factori. El a fost folosit pentru a interpreta tabelele de incidenţă generate

prin aplicarea încrucişată („cross tabulation”) a perechilor de factori urmăriţi in acest studiu.

La testul chi pătrat de testare a dependentei ( χ2 ) s-a calculat rezultatul testului

pentru datele din tabelele de incidenta, rezultat care a fost comparat cu valoarea prag care

indica o dependenta semnificativa (prag de 95% sau 99%) sau o dependenta înalt

semnificativa (prag de 99.9%) intre cei doi factori de clasificare. Valoarea lui χ2 se calculează

prin formula:

n

i i

ii

E

EO

1

2

2 |)(|

,

unde O - frecventa observata, E - frecventa teoretica

Ipotezele testate sunt:

H0 (ipoteza nula) – cei doi factori sunt independenți;

Ha (ipoteza alternativa) – exista o asociere (dependenta) intre cei doi factori.

Am folosit următoarea interpretare a valorilor lui p, furnizate direct de programul cu

care se realizează prelucrarea statistica a datelor, prin aplicarea testului de mai sus:

p < 0.05, rezultat semnificativ (S, încredere 95% că exista o asociere intre factori);

p < 0.01, rezultat semnificativ (S, încredere 99% că exista o asociere intre factori);

p < 0.001, rezultat înalt semnificativ (HS, încredere 99,9% că exista o asociere intre

factori);

p > 0.05, rezultat nesemnificativ (NS, încrederea de a considera ca exista o

dependenta intre factorii studiați este mai mica de 95%, deci eroarea de a respinge

ipoteza ca factorii sunt independenți este mai mare de 5%, prag considerat prea

mare

28

Rezultatele evaluărilor genetice de la nivelul: INOS si VEGFR2

Genotip iNOS AA AG GG Total

Studiu 6 (3.57%) 50 (29.76%) 112 (66.67%) 168 (100.00%)

Martor 11 (4.74%) 63 (27.16%) 158 (68.10%) 232 (100.00%)

Total 17 (4.25%) 113 (28.25%) 270 (67.50%) 400 (100.00%)

Analizând prevalența genotipurile iNOS în lotul de studiu și lotul martor, am constatat

că nu există diferențe semnificative între cele două loturi, rezultatul testului Chi pătrat fiind

p=0,749>0,05

Genotip VEGFR2 AA AG GG Total

Studiu 37 (22.02%) 88 (52.38%) 43 (25.60%) 168 (100.00%)

Martor 68 (29.31%) 127 (54.74%) 37 (15.95%) 232 (100.00%)

Total 105 (26.25%) 215 (53.75%) 80 (20.00%) 400 (100.00%)

p Chi pătrat 0.749013246 NS

29

p Chi pătrat 0.036774322 S

În schimb, genotipurile VEGFR2 se intâlnesc în proporții semnificativ diferite în cele

două loturi, rezultatul testului Chi pătrat fiind p=0,036<0,05. În lotul de studiu varianta GG

este intâlnită la mai mult de 25% dintre pacienți, în timp ce în lotul martor se regăsește la

doar 16%. În concluzie, putem afirma că poate exista o asociere între prezența genotipului

GG al VEGFR2 și patologia pancreatică.

Scor Ranson

Genotip iNOS 3-4 5-7 >7 Total

AA 1 1 1 3

AG 6 20 5 31

GG 18 44 14 76

Total 25 65 20 110

30

p Chi pătrat 0.861899722

Nu am putut obiectiva diferențe semnificative în ceea ce privește gravitatea

pancreatitei acute, cuantificată prin scorul Ranson, cauzate de genotipul iNOS identificat la

pacienții analizați, rezultatul testului Chi pătrat fiind p=0,861>0,05 – nesemnificativ din punct

de vedere statistic.

Scor Balthazar

Genotip iNOS B C D E Total

AA 1 1 1 0 3

AG 6 14 9 2 31

GG 18 36 17 5 76

Total 25 51 27 7 110

31

p Chi pătrat 0.894164273

Nu am putut obiectiva diferențe semnificative în ceea ce privește gravitatea

pancreatitei acute, cuantificată prin scorul Balthazar, cauzate de genotipul iNOS identificat la

pacienții analizați, rezultatul testului Chi pătrat fiind p=0,894>0,05 – nesemnificativ din punct

de vedere statistic.

Clasificarea Atlanta

Genotip iNOS P.A. ușoară P.A. moderat severă P.A. severă Total

AA 1 1 1 3

AG 6 20 5 31

GG 18 45 13 76

Total 25 66 19 110

32

p Chi pătrat 0.861352378

Nu am putut obiectiva diferențe semnificative în ceea ce privește gravitatea

pancreatitei acute, în funcție de clasificarea Atlanta, cauzate de genotipul iNOS identificat la

pacienții analizați, rezultatul testului Chi pătrat fiind p=0,861>0,05 – nesemnificativ din punct

de vedere statistic

Scor Ranson

Genotip VEGFR2 3-4 5-7 >7 Total

AA 4 13 5 22

AG 15 37 8 60

GG 6 15 7 28

Total 25 65 20 110

33

p Chi pătrat 0.678852356

Nu am putut obiectiva diferențe semnificative în ceea ce privește gravitatea

pancreatitei acute, cuantificată prin scorul Ranson, cauzate de genotipul VEGFR2 identificat

la pacienții analizați, rezultatul testului Chi pătrat fiind p=0,678>0,05 – nesemnificativ din

punct de vedere statistic.

Scor Balthazar

Genotip VEGFR2 B C D E Total

AA 4 11 4 3 22

AG 15 28 17 0 60

GG 6 12 6 4 28

Total 25 51 27 7 110

34

p Chi pătrat 0.13658336

Nu am putut obiectiva diferențe semnificative în ceea ce privește gravitatea

pancreatitei acute, cuantificată prin scorul Balthazar, cauzate de genotipul VEGFR2

identificat la pacienții analizați, rezultatul testului Chi pătrat fiind p=0,136>0,05 –

nesemnificativ din punct de vedere statistic.

Clasificarea Atlanta

Genotip VEGFR2 P.A. ușoara P.A. moderat severă P.A. severă Total

AA 4 13 5 22

AG 15 38 7 60

GG 6 15 7 28

Total 25 66 19 110

35

p Chi pătrat 0.540782079

Nu am putut obiectiva diferente semnificative în ceea ce privește gravitatea

pancreatitei acute, în funcție de clasificarea Atlanta, cauzate de genotipul VEGFR2 identificat

la pacienții analizați, rezultatul testului Chi pătrat fiind p=0,540>0,05 – nesemnificativ din

punct de vedere statistic.

Genotip iNOS

Diagnostic AA AG GG Total

Neoplasm 2 (6.06%) 7 (21.21%) 24 (72.73%) 33 (100.00%)

Pancreatită acută 3 (2.73%) 31 (28.18%) 76 (69.09%) 110 (100.00%)

Pancreatită cronică 1 (4.00%) 12 (48.00%) 12 (48.00%) 25 (100.00%)

Total 6 (3.57%) 50 (29.76%) 112 (66.67%) 168 (100.00%)

36

p Chi pătrat 0.192731839 - NS

Deși există anumite diferențe procentuale în ceea ce privește repartiția cazurilor cu

diagnostice diferite (neoplasm, pancreatită acută și pancreatită cronică) în funcție de

genotipul iNOS identificat, aceste diferențe nu au însemnătate statistică, rezultatul testului

Chi pătrat fiind peste limita maximă, p=0,192>0,05

Genotip VEGFR2

Diagnostic AA AG GG Total

Neoplasm 8 (24.24%) 16 (48.48%) 9 (27.27%) 33 (100.00%)

Pancreatită acută 22 (20.00%) 60 (54.55%) 28 (25.45%) 110 (100.00%)

Pancreatită cronică 7 (28.00%) 12 (48.00%) 6 (24.00%) 25 (100.00%)

Total 37 (22.02%) 88 (52.38%) 43 (25.60%) 168 (100.00%)

37

p Chi pătrat 0.905007 - NS

Nu am remarcat diferențe de repartiție pentru cazurile cu diagnostice diferite

(neoplasm, pancreatită acută și pancreatită cronică) în funcție de genotipul VEGFR2

identificat, lucru obiectivat și prin rezultatul testului Chi patrat, care a fost nesemnificativ

statistic - p=0,905>0,05.

Evaluarea angiogenezei la pacienții cu cancer pancreatic prin metode genetice –

implicația prognostică a VEGFR1 și VEGFR2 în cancerul pancreatic.

Obiectivele studiului. Material și metodă

Studiul de față are ca obiectiv îmbunătățirea cunoștințelor în ceea ce privește rolul

ecoendoscopiei în evaluarea neoplasmului pancreatic, evaluarea expresiei genetice a

receptorilor VEGFR1 și VEGFR2 și identificarea factorilor prognostici în cancerul pancreatic.

Studiul este unul prospectiv și s-a efectuat pe o perioadă de 4 ani (ianuarie 2011 –

decembrie 2014), în Centrul de Cercetare în Gastroenterologie și Hepatologie din cadrul

UMF Craiova. Au fost incluși în studiu 108 pacienți, individualizați în 3 loturi: lotul I (cancer

pancreatic, n=68), loturile martor (lotul II - pancreatită cronică, n=20 și lotul III - pancreas

normal ecoendoscopic, n=20). După îndeplinirea criteriilor de includere în studiu, pacienții

au fost examinați ecoendoscopic (în mod standard, Doppler, cu contrast, elastografie). La

38

finalul ecoendoscopiei s-au prelevat probe prin PFA pentru examenul citologic, iar o parte

din probe au fost stocate în laboratorul de genetică, unde ulterior, s-a determinat prezența

expresiilor genetice VEGFR1 și VEGFR2. Înaintea examinării și după explicarea avantajelor și a

posibilelor complicații asociate cu ecoendoscopia, pacienţii şi‐au dat consimţământul scris

pentru examinarea ecoendoscopică, efectuarea anesteziei, colectarea de probe

biologice/citologice şi folosirea datelor rezultate din investigaţii în scopuri ştiinţifice. Toți

pacienții au fost atent urmăriți și prin consultarea bazei de date a Serviciului de Evidentă a

Populației s-a determinat supraviețuirea pacienților cu cancer pancreatic incluși în studiu.

Rezultatele examinărilor au fost structurate într-o bază de date, într-un fișier

Microsoft Excel (din pachetul de programe Microsoft Office 2010 professional) pentru a fi

ulterior prelucrate statistic, utilizând programul Microsoft Excel (Microsoft Corp., Redmond,

WA, USA) şi programul IBM Statistic Package for the Social Sciences (SPSS), versiunea 20.0

(IBM Corporation, Armonk, NY, USA).

Inițial s-a realizat statistica descriptivă a loturilor de pacienți: frecvență, valoarea cea

mai mică, valoarea cea mai mare, valoarea medie, valoarea mediană, deviație standard,

coeficientul de variație, eroarea standard a unei medii, intervalul de încredere 95%.

Ulterior, s-a utilizat analiza univariată, analiza unui tabel de contingență cu testul chi-

pătrat, unde, am calculat p-ul de semnificație statistică (considerând valoarea p < 0,05

semnificativă statistic) iar la final am realizat un model de regresie Cox. Prin regresia Cox se

estimează efectul unui anumit parametru statistic, dintre cei analizați, asupra unui anumit

eveniment (considerat eveniment final sau end-point). Deoarece în cadrul analizei privind

evoluția pacienților, pentru studiul de față, există corelații multiple între variabilele

explicative introduse în modelul Cox, am folosit metoda de analiză Backward, prin care, în

mai mulți pași, se elimină variabilele care nu contribuie în mod semnificativ la model,

rămânând, în final, doar acele variabile care explica cel mai bine relația cu evenimenul final

analizat (statusul de nerezecabilitate, supraviețuirea la 6 luni, supraviețuriea la 12 luni și

mortalitatea pacienților cu cancer pancreatic).

Rezultate

Caracteristici demografice

Pacienții cu cancer pancreatic au avut o vârstă medie de 62,51 ani în momentul

diagnosticului. Predomină sexul masculin și proveniența urbană a acestora iar distribuția pe

grupe de vârstă evidențiază că 63% din pacienți fac parte din grupa de vârstă 60 – 79 ani.

39

Astfel, peste un sfert din pacienții cu adencoarcinom pancreatic incluși în studiu aparțin

grupei de vârstă, mediului de proveniență și sexului mai sus menționate.

Figura 14 Repartiția pacienților cu cancer pancreatic în funcție de vârstă, sex și mediu de proveniență

Caracteristici ecoendoscopice

Tumorile pancreatice diagnosticate au avut o dimensiune medie de 34 mm diametru

și localizare preponderent cefalică. Se observă ca ecoendoscopia standard are o acuratețe de

80,5% în diagnosticul cancerului de pancreas, cu o sensibilitate excelentă (97,1%) și o

specificitate de doar 21,1%. Rezultatele studiului demonstrează că PFA are o acuratețe de

81%, o sensibilitate de 77,6% și specificitate (100%) și valoare predictivă pozitivă (100%)

excelente în diagnosticul adenocarcinomului pancreatic. PFA are, însă o valoare predictivă

negativă modestă, 22% din cazurile de cancer pancreatic având rezultat citologic fals negativ.

La acest grup de pacienți, EUS aduce beneficii diagnostice evidente. Astfel, la examinarea

convențională și elastografică, toți pacienții au aspect sugestiv de malignitate (formațiune

hipoecogenă, respectiv, de consistență dură). De asemenea CE-EUS are o specificitate de

91% în diagnosticarea malignității la pacienții cu PFA negativă.

40

Stadializare și stabilirea rezecabilității

EUS reprezintă cea mai bună metodă de stadializare loco-regională în cancerul

pancreatic. Astfel, majoritatea (67%) pacienților se aflau în stadiile III și IV de evoluție în

momentul diagnosticului, doar aproximativ 1 pacient din 5, îndeplinind criteriile de

operabilitate.

Figura 15 Rezecabilitatea tumorală la pacienții cu cancer pancreatic, în momentul diagnosticării

Valoarea diagnostică a EUS_standard, EUS_Doppler, EUS_contrast, elastografiei și PFA-EUS, în cancerul pancreatic

Parametru

statistic

EUS

standard

EUS

Doppler

EUS

contrast

Elastografie PFA -

EUS

Sensibilitate 97,1% 79,4% 91,1% 93,9% 77,6%

Specificitate 21,1% 90,0% 81,3% 90,9% 100%

Acuratețe 80,5% 81,8% 88,9% 93,2% 81,0%

VPP 81,5% 96,4% 94,4% 96,9% 100%

VPN 66,7% 56,3% 77,2% 83,3% 44,4%

41

Rezultate genetice

În ceea ce privește prezența expresiilor genetice, 90% din probele de țesut malign

analizate au prezentat expresie genetică VEGFR1, 65% VEGFR2, iar 60% din cazuri au

prezentat ambii receptori.

Figura 16 Prezența expresiei genetice a VEGFR1 și VEGFR2 la pacienții cu cancer pancreatic

Supraviețuirea pacienților cu cancer pancreatic

Din totalul pacienților cu cancer pancreatic urmăriți, 89,7% au decedat pe perioada

studiului. Supraviețuirea medie a fost de 9 luni, cu o rată de supraviețuire la 6 luni de 74%

și la 12 luni de 29%. Supraviețuirea este direct influențată de stadiul de evolutiv, fiind de 12

luni pentru stadiul I și de doar 6 luni pentru stadiul IV. Prezența expresiei genetice VEGFR1 și

VEGFR2 influențează, de asemenea, supraviețuirea. Astfel, pacienții cu VEGFR1 prezent au

supraviețuire medie de 7,22 luni comparativ cu cei cu VEGFR1 negativ (17,25 luni). Situația

este valabilă și pentru VEGFR2 pozitiv (5,96 luni) față de VEGFR2 negativ (12,42 luni).

42

Figura 17 Supraviețuirea pacienților cu cancer pancreatic în funcție prezența expresiei genetice a VEGFR1 și VEGFR2

Figura 18 evidențiază curbele de supraviețuire Kaplan – Meier pentru pacienții cu

expresie VEGFR1 prezentă vs. expresie VEGFR1 absentă (p=0,017). Se observă de asemenea

diferențe semnificative ale curbelor de supraviețuire la pacienții cu VEGFR2 prezent

comparativ cu VEGFR2 absent (p<0,001), cât și între pacienții cu coexpresie VEGFR1/VEGFR2

în raport cu absența coexpresiei (p<0,001).

Overall Comparisons

Chi-Square df Sig.

Log Rank (Mantel-

Cox) 5,704 1 ,017

43

Figura 18 Curba de supraviețuire Kaplan – Meier, funcție de expresia VEGFR1

Overall Comparisons

Chi-Square df Sig.

Log Rank (Mantel-

Cox) 16,970 1 ,000

Figura 19 Curba de supraviețuire Kaplan – Meier, funcție de expresia VEGFR2

Overall Comparisons

Chi-Square df Sig.

Log Rank (Mantel-

Cox) 23,226 1 ,000

Figura 20 Curba de supraviețuire Kaplan – Meier, funcție de coexpresia VEGFR1/VEGFR2

44

Factori de prognostic ai evoluției pacienților cu cancer pancreatic

Modelul de regresie Cox

Deoarece în cadrul analizei privind supraviețuirea, pentru studiul de față, există

corelații multiple între variabilele explicative introduse în modelul Cox, am folosit metoda de

analiză Backward, prin care, în mai mulți pași, se elimină variabilele care nu contribuie în

mod semnificativ la model, rămânând, în final, doar acele variabile care explică cel mai bine

relația cu evenimenul analizat (statusul de nerezecabilitate, supraviețuirea la 6 luni,

supraviețuriea la 12 luni și mortalitatea pacienților cu cancer pancreatic.

Este important de precizat, că este posibil ca unii parametri, care nu prezintă corelații

individuale cu evenimentul final, sa aibă valori semnificative în modelul de regresie Cox, sau,

invers, ca unii parametri care apar ca având corelații individuale semnificative să nu apară în

model, datorită multicoliniarității, adică datorită corelațiilor puternice existente între

variabilele introduse în evaluarea modelului, ajungându-se la situații în care efectul real

produs de o anumită variabilă să fie „mascat” de valorile unei alte variabile, cu care aceasta

se corelează semnificativ.

Evaluarea parametrilor implicați în statusul de nerezecabilitatea tumorală

Statusul de nerezecabilitate se corelează individual, statistic cu: aspectul hipoecogen

la examinarea ecoendocopică standard, cu prezența expresiei VEGFR1, cu stadializarea

avansată (inclusiv cu fiecare din categoriile T3-T4, N1 și M1), cu invazia tumorală, cu decesul

pacienților și cu supraviețuirea pacienților mai puțin de 12 luni de la diagnostic. De

asemenea există o slabă asociere cu sexul masculin al pacienților, localizarea tumorală

cefalică și cu supraviețuirea sub 6 luni. Analiza modelului de regresie Cox, folosind ca

parametrii de intrare, sexul pacienților, aspectul ecoendoscopic standard, localizarea

tumorală și expresia VEGFR1, validează ca factor predictiv pentru statusul inoperabil,

prezența expresiei genetice a VEGFR1.

45

Regresie Cox pentru analiza factorilor predictivi pentru statusul de nerezecabilitate tumorală

Figura 21 Curba de regresie Cox pentru analiza factorilor predictivi pentru statusul de nerezecabilitate tumorală

Evaluarea parametrilor implicați în supraviețuirea la 6 luni

Supraviețuirea pacienților sub 6 luni de la momentul diagnosticării se asociază

individual cu PFA pozitivă și cu invazia tumorală locală. Există de asemenea o slabă corelație

cu prezența invaziei ganglionare și cu statusul de nerezecabilitate. Din analiza modelului Cox,

unde s-au utilizat ca și parametrii de intrare PFA, statusul ganglionar, invazia tumorală,

statusul de rezecabilitate și coexpresia VEGFR1/VEGFR2, s-a constatat că prezența

coexpresiei VEGFR1/VEGFR2 reprezintă un factor predictiv pentru supraviețuirea

pacienților sub 6 luni de la diagnosticare.

46

Regresie Cox pentru analiza factorilor predictivi pentru supraviețuriea la 6 luni a pacienților cu cancer pancreatic.

Figura 22 Curba de regresie Cox pentru analiza factorilor predictivi pentru supraviețurea la 6 luni a pacienților cu cancer pancreatic.

Evaluarea parametrilor implicați în supraviețuirea la 12 luni

Din analiza univariată, reiese că supraviețuirea sub 12 luni a pacienților cu cancer

pancreatic se corelează individual, cu stadiul avansat de evoluție al bolii (stadiile III și IV),

stadializarea T3-T4, statusul de nerezecabilitate, prezența expresiei genetice a VEGFR1,

VEGFR2 și coexpresia VEGFR1/VEGFR2. Introducând parametrii cu semnificație statistică din

analiza univariată, într-un model de regresie Cox, se observă că prezența expresiei genetice

47

a VEGFR1 și VEGFR2, respectiv coexpresia VEGFR1/VEGFR2, sunt factori predictivi ai

supraviețuirii sub 12 luni din momentul diagnosticului.

Regresie Cox pentru analiza factorilor predictivi pentru supraviețuriea la 12 luni a pacienților cu cancer pancreatic.

Figura 23 Curba de regresie Cox pentru analiza factorilor predictivi pentru supraviețurea la 12 luni a pacienților cu cancer pancreatic.

48

Evaluarea parametrilor implicați în mortalitatea pacienților cu cancer pancreatic

Decesul pacienților se asociază cu mediul de proveniență urbană, cu stadiul avansat

de evoluție al bolii (stadiul III și IV), cu categoria T3-T4, cu prezența adenopatiilor (N1), cu

statusul de nerezecabilitate și cu expresia genetică a VEGFR2 și coexpresia VEGFR1/VEGFR2.

Parametrii semnificativi din punct de vedere statistic sunt introduși într-un model de

regresie Cox, ce urmează 6 pași, ultima etapă evidențiind parametrul cu cea mai importantă

implicație prognostică. Astfel, coexpresia VEGFR1/VEGFR2 reprezintă factorul cu cea mai

mare implicație prognostică în decesul pacienților cu cancer pancreatic.

Regresie Cox pentru analiza factorilor predictivi pentru decesul pacienților cu cancer pancreatic.

49

Figura 24. Curba de regresie Cox pentru analiza factorilor predictivi pentru decesul pacienților cu cancer pancreatic.

Discuții

Studiul de față, confirmă datele din literatura de specialitate, și subliniază că VEGFR1

joacă un rol important în progresia tumorală (prin promovarea migrării și invaziei celulare)

fiind factor predictiv al evoluției spre statusul de nerezecabilitate și al supraviețuirii

pacienților cu cancer pancreatic sub 12 luni de la diagnostic. Studiile publicate relatează că

VEGFR-2 este cel mai important receptor în evaluarea angiogenezei în cancerul pancreatic.

Expresia VEGFR-2 în celulele tumorale se corelează semnificativ cu invazia tumorală în

țesuturile înconjurătoare și cu prognosticul negativ. Prezenta lucrare confirmă că VEGFR2

este un factor predictiv al supraviețuirii sub 12 luni din momentul diagnosticului. Mai mult,

coexpresia celor doi receptori ai VEGF, reprezintă factorul cu cea mai mare implicație

prognostică negativă, în ceea ce privește supraviețuirea la 6 luni și mortalitatea pacienților

cu cancer pancreatic.

Cancerul pancreatic este, așadar, unul dintre cele mai devastatoare tipuri de cancer.

Ecoendoscopia rămâne examenul gold-standard de management al cancerului

pancreatic, realizând diagnosticul, stadializarea și stabilirea rezecabilității cu acuratețea cea

mai mare. Progresele tehnologice sunt departe de a fi stagnat. Descoperirile din ultimul timp

au evoluat până la posibilitatea de a obține imagini de biopsie optică în timp real de la

nivelul formațiunilor solide pancreatice vizualizate ecoendoscopic (endomicroscopie laser

confocală). Progresele în ceea ce privește rata de supraviețuire, sunt lente, dar ele există.

50

Însuși studiul de față, raportează o rată de supraviețuire, la 1 an, ușor crescută (29%) față de

rezultatele publicate până în prezent (25%). Așadar continuarea studiilor pentru

descoperirea unor noi alternative diagnostice și terapeutice este vitală. Având în vedere

implicația VEGF și a receptorilor acestuia în angiogeneza cancerului pancreatic, terapia anti-

angiogenică trebuie sa reprezinte piatra de temelie a tratamentului cancerului pancreatic.

Astfel, lupta cu această patologie, nu este în totalitate pierdută și în consecință, nu trebuie

abandonată. În Marea Britanie aproximativ 4300 de pacienți cu cancer pancreatic încă trăiau

la finalul anului 2006, după 10 ani de la diagnostic. Din acest motiv, speranțe de a prelungi

supraviețuirea acestor pacienți, încă mai există, iar eforturile trebuind concentrate, în egală

măsură, pe prevenția primară, diagnosticarea precoce, acuratețea stadializării preoperatorii

și pe îmbunătățirea opțiunilor terapeutice.

51

Diseminarea rezultatelor cercetării

o Articole publicate în reviste cotate ISI

o Karstensen JG, Cârţână T, Klausen PH, Hassan H, Popescu CF, Săftoiu A,

Vilmann P. Endoscopic ultrasound-guided needle-based confocal laser

endomicroscopy: a pilot study for use in focal pancreatic masses. Pancreas.

2015 Jul;44(5):833-5. doi: 10.1097/MPA.0000000000000345. No abstract

available. PMID: 26061561

o Săftoiu A, Vilmann P, Dietrich CF, Iglesias-Garcia J, Hocke M, Seicean A, Ignee

A, Hassan H, Streba CT, Ioncică AM, Gheonea DI, Ciurea T. Quantitative

contrast-enhanced harmonic EUS in differential diagnosis of focal pancreatic

masses (with videos). Gastrointest Endosc. 2015 Jul;82(1):59-69. doi:

10.1016/j.gie.2014.11.040. Epub 2015 Mar 16. PMID: 25792386

o Popescu A, Săftoiu A. Can elastography replace fine needle aspiration?

Endoscopic Ultrasound. 2014 Apr; 3(2): 109-17. doi: 10.4103/2303-

9027.123009

o Gheonea DI, Streba CT, Ciurea T, Săftoiu A. Quantitative low mechanical index

contrast-enhanced endoscopic ultrasound for the differential diagnosis of

chronic pseudotumoral pancreatitis and pancreatic cancer. BMC

Gastroenterol. 2013 Jan 3; 13: 2

o Angelescu R, Burada F, Angelescu C, Gheonea DI, Iordache S, Mixich F, Ioana

M, Săftoiu A. Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and Epidermal

Growth Factor Receptor in Pancreatic Ductal Adenocarcinomas,

Neuroendocrine Tumours and Chronic Pancreatitis. Endoscopic Ultrasound.

2013 Apr; 2(2): 86-91

o Costache MI, Iordache S, Karstensen JG, Săftoiu A, Vilmann P. Endoscopic

ultrasound-guided fine needle aspiration: from the past to the future. Endosc

Ultrasound. 2013 Apr; 2(2): 77-85. doi: 10.4103/2303-9027.117691.

o Iordache S, Angelescu R, Filip MM, Costache MI, Popescu CF, Gheonea DI,

Saftoiu A. Power Doppler endoscopic ultrasound for the assessment of

pancreatic neuroendocrine tumors. Endoscopic Ultrasound. 2013; 2(2): 150-

155

o Săftoiu A, Dietrich CF, Vilmann P. Contrast-enhanced harmonic endoscopic

ultrasound. Endoscopy. 2012 Jun; 44(6): 612-7. doi: 10.1055/s-0032-1308909

52

o Articole publicate în reviste indexate în BDI

o Padureanu V, Streata I, Ioana M, Surlin V, Georgescu EF, Marginean C, Saftoiu

A. Determination of iNOS-2087A>G Polymorphism in Acute Pancreatitis

Patients. Current Health Sciences Journal. 2014; 40(4): 249-252.

o Vilmann P, Seicean A, Săftoiu A. Tips to overcome technical challenges in EUS-

guided tissue acquisition. Gastrointest Endosc Clin N Am. 2014 Jan;24(1):109-

24. doi: 10.1016/j.giec.2013.08.009. Review.

o Padureanu V, Iordache S, Ioana M, Saftoiu A. Gene polymorphisms and

susceptibility to pancreatic disorders. Current Health Sciences Journal. 2014;

40(Suppl. 3): 17-20.

o DI Gheonea, CT Streba, T Cârţână, A Săftoiu. Pancreatic Cancer – Advanced

EUS Imaging: Real-Time EUS Elastography. Video Journal and Encyclopedia of

GI Endoscopy. 2013;1(2):573-575

o A Săftoiu, DI Gheonea, T Cârţână, C Streba. Advanced Endoscopic Ultrasound

Imaging: Contrast-Enhanced Endoscopic Ultrasound (Low MI, High MI),

Including 3D Techniques in Pancreatic Imaging. Video Journal and

Encyclopedia of GI Endoscopy.2013;1(2):534-536

o MI Costache, A Săftoiu, DI Gheonea. Detection and Characterization of Solid

Pancreatic Lesions (Contrast-Enhancement, Elastography, EUS-Guided Fine

Needle Aspiration). Video Journal and Encyclopedia of GI Endoscopy.

2013;1(2):Pages 545-547

o Costache MI, Ioana M, Iordache S, Ene D, Costache CA, Saftoiu A. VEGF

expression in pancreatic cancer and other malignancies: a review of the

literature. Rom J Intern Med. 2015, 53, 3, 199-208.

o Lucrări prezentate la congrese internaţionale (cu rezumat indexat în reviste cotate

ISI)

o Andrada Seicean, Anca Moldovan-Pop, Adrian Saftoiu, Costin T. Streba,

Simona Vultur, Cristian Tefas, Teodora Mocan, Marcel Tantau. Contrast

Enhanced Endoscopic Ultrasound Increases the Diagnostic Accuracy of the

Fine Needle Aspiration in Pancreatic Masses. Digestive Disease Week,

Chicago, USA, AB442 GASTROINTESTINAL ENDOSCOPY Volume 79, No. 5S :

2014

53

o John G. Karstensen, Tatiana Cartana, Pia Klausen, Hazem Hassan, Daniel Pirici,

Dan Ionut Gheonea, Carmen F. Popescu, Jane P. Hasselby, Adrian Saftoiu,

Peter Vilmann. Pitfalls in the Interpretation of Pancreatic Endoscopic

Ultrasound Guided Needle Confocal LASER Endomicroscopy. Digestive Disease

Week, Chicago, USA, AB433-434 GASTROINTESTINAL ENDOSCOPY Volume

79, No. 5S : 2014

o John G. Karstensen, Tatiana Cartana, Hazem Hassan, Dan Ionut Gheonea,

Carmen F. Popescu, Dorte Linnemann, Adrian Saftoiu, Peter Vilmann. Needle-

Based Confocal LASER Endomicroscopy Examination of Pancreatic Masses.

Digestive Disease Week, Orlando, USA, AB411 GASTROINTESTINAL

ENDOSCOPY Volume 77, No. 5S : 2013

o Dan Ionut Gheonea, Costin T. Streba, Ana Maria Ioncica, Tudorel Ciurea,

Adrian Saftoiu. Diagnosis of Focal Pancreatic Masses by Quantitative Low

Mechanical Index Contrast-Enhanced Endoscopic Ultrasound (EUS). Digestive

Disease Week, San Diego, USA, AB205 GASTROINTESTINAL ENDOSCOPY

Volume 75, No. 4S : 2012

o Adrian Saftoiu, Romania; Julio Iglesias-García; Peter Vilmann; Cristoph

Dietrich; Michael Hocke; Costin Teodor Streba; Dan-Ionut Gheonea; Florin

Gorunescu; Tudorel Ciurea. Artificial neural networks analysis of contrast

enhanced harmonic endoscopic ultrasound in differential diagnosis of focal

pancreatic masses. Preliminary results of an european multicenter study. 20th

United European Gastroenterology Week, Amsterdam, The Netherlands,

GUT, Volume 61, Suppl. 3: A45: 2012

o DI Gheonea, CT Streba, S Iordache, L. Streba, T Ciurea, A Saftoiu. Diagnostic

value of combined quantitative contrast-enhanced harmonic endoscopic

ultrasound and endoscopic ultrasound elastography in pancreatic focal

masses. 20th United European Gastroenterology Week, Amsterdam, The

Netherlands, ENDOSCOPY, Volume 44, No 1; A93: 2012

o Sevastita Iordache, Madalin-Ionut Costache, Vlad Padureanu, Dan-Ionut

Gheonea, Carmen Florina Popescu, Radu Angelescu, Adrian Saftoiu. Power

Doppler EUS in assessment of pancreatic neuroendocrine tumors. 20th United

European Gastroenterology Week, Amsterdam, The Netherlands,

ENDOSCOPY, Volume 44, No 1; A93: 2012.

54

o Premii

o National Scholar Award 2012, 20th United European Gastroenterology Week,

Amsterdam, The Netherlands pentru lucrarea Diagnostic value of combined

quantitative contrast-enhanced harmonic endoscopic ultrasound and

endoscopic ultrasound elastography in pancreatic focal masses.

Director proiect,

Prof. Univ. Dr. Adrian Săftoiu