UNIVERSITATEA “VASILE ALECSANDRI” DIN BACĂUFACULTATEA DE INGINERIE

SPECIALIZAREACoSAMIB

Metode de separare, purificare și valorificare a

acidului clorogenic din boabe verzi de cafea Robusta

Masterand,Andreea Madălina BORTĂ

Coordonator,Prof. univ. dr. chim. Adriana FÎNARU

2013

Sumar executiv

Proiectul prezintă metodele de separare și purificare a acidului clorogenic din boabele verzi de cafea Robusta utilizând cele mai moderne tehnici.

Proiectul este structurat în trei parți. Prima parte prezintă descrierea sursei vegetale care are influnența cea mai mare asupra calității compusului de extras. Ușurarea sau îngreunarea metodelor de separare are loc în funcție de natura materiei prime, de parametrii de procesare, de compușii (alții decât acidul clorogenic) ce pot da reacții secundare sau de metodele de pregătire (ce pot deteriora compusul dorit, astfel încât caliatate acestiua scade). În vederea obținerii acidului clorogenic s-a ales ca materie primă boabele de cafea verzi Robusta fiind printre plantele cu cel mai mare conținut în acid clorogenic. Deasemenea în acest capitol s-au caracterizat și solvenții de extracție alegându-se pe baza avantajelor și dezavantajelor solventul cu cel mai bun randament de extracție și cel mai puțin nociv. A doua parte cuprinde caracteristicile produsului finit, importanța acestuia în diverse industrii, efectele negative și pozitive ce trebuie cunoscute înainte de consum, precum și studiile și cercetările realizate pe acest polifenol. Partea a treia prezintă descrierea variantelor posibile de separare și purificare, avantaje și dezavantaje, solvenții utilizați precum și rezultatele unor experimente din literatura de specialitate.

Proiectul se încheie cu prezentare posibilităților de valorificare în diferite industrii a compusului obținut.

2

Cuprins

Capitolul 1. Sursa vegetală.....................................................................................................................4

Boabele verzi de cafea Robusta..........................................................................................................4

Capitolul 2. Substanța activă..................................................................................................................8

Acidul clorogenic...................................................................................................................................8

Rolul acidului clorogenic...................................................................................................................8

Capitolul 3. Metode de separare și purificare a acidului clorogenic.......................................................9

Metode clasice de extracţie.................................................................................................................9

Metode moderne de extracţie...........................................................................................................11

Rezultate și discuții..........................................................................................................................13

Cromatografia...................................................................................................................................14

HPLC-DAD..................................................................................................................................14

HPLC- X5....................................................................................................................................15

Capitolul 4. Valorificarea acidului clorogenic......................................................................................17

Concluzii..............................................................................................................................................18

Bibliografie..........................................................................................................................................19

3

Capitolul 1. Sursa vegetală

Boabele verzi de cafea Robusta

Boabele de cafea Robusta fac parte din genul Coffea descris științific de către Carl Linnaeus la mijlocul secolului al XVIII-lea. Marele naturalist a stabilit numele științific și a încadrat genul în familia Rubiaceae. Robusta este o specie alogamă, cu creștere rapidă și rezistență la intemperii și la boli, în special la boala cauzată de ciuperca Hemilea vastatrix. Originea a fost stabilită în regiunea subsahariană din centrul și vestul Africii, care cuprinde Guineea și nordul Sudanului. Prima plantă a fost colecționată în anul 1890, de Lomani, un tributar al Fluviului Congo și în jurul anului 1900, a fost transferată din Zair, via Bruxelles, spre Java, de unde a fost introdusă și în alte teritorii. Este cultivată la altitudini de circa 600 m, pe terenuri umede și în pădurile tropicale din regiunile tropicale ale Africii Centrale și de Vest, din Indonezia, India, și Brazilia, unde coloniștii francezi au introdus-o în secolul al XIX-lea. În ultimii ani producțiile de cafea robusta din Vietnam au depășit cantităţile obținute în Brazilia, India, Indonezia, această din urmă devenind cel mai mare exportator de cafea Robusta. Planta are sistem radicular superficial, dar partea aeriană se dezvoltă ca un arbust robust sau ca un arbore cu înălțimea de până la 10 m. Ramificațiile se arcuiesc spre sol, în formă de umbrelă. Înflorește din anul al 2-lea de la plantare, după care, pe durata fiecărui an, formarea florilor și înflorirea sunt continue [1].

Fructele (Figura 1) se coc după 10-11 luni de la înflorire. Boabele sunt de culoare brun-deschis până la brun-roșiatic, mici, fine, cu formă ovală, mai mici decât cele de C. arabica și de calitate medie. Robusta este specia cu cel mai ridicat conținut de cafeină: de 2 ori mai mare decât C. arabica. Specia este diploidă și autosterilă. Fertilizarea florilor se face cu polen străin. Recoltarea fructelor se efectuează în diferite luni ale anului și la atingerea maturităţii complete. Recoltarea se face manual, prin culegerea fructelor de pe ramuri sau prin scuturarea plantelor cu ajutorul prăjinilor. În cazul scuturării plantelor, fructele pot fi colectate pe prelate, folii de plastic, rogojini sau direct pe sol dar în acest caz, fructele trebuie spălate.

Producția constantă se obține începând cu vârsta de 5 ani a plantelor. O plantă de C. robusta produce între 0,6 și 2 kg semințe. După recoltare, în câteva zile, fructele se prelucrează în vederea extragerii semințelor. Întârzierea prelucrării cauzează fermentarea pulpei și deteriorarea calității boabelor. Este nevoie de circa 5 kg de fructe pentru a obține 1 kg semințe [1]. Conținutul de acid clorogeni este mai mare în boabele de cafea verzi

4

Figura 1. Fructe de cafea Robusta

comparativ cu boabele toastate (Tabel 1) ceea ce denotă faptul că acest compus este sensibil la temperaturi ridicate.

Tabelul 1. Compoziția chimică a boabelor de cafea verzi/toastată Robusta [2]

Componente Boabe verzi% Boabe toastate%

Alcaloizi (cafeina) 2,2 2,4

Trigonelina 0,7 1,7

Minerale 4,4 4,7

Acizi: clorogenici alifatici

101

3,81

Zaharuri: zaharoză reducătoare polizaharide

40,4-

00,337

Lignină 3 3

Pectine 2 2

Proteine 11 7,5

Aminoacizi liberi 0,8 0

Lipide (ulei de cafea) - 11

Produşi de condensare - 25

Substanţe volatile, altele - 0,7-0,8

Cafeina este un alcaloid din grupa purinelor

și unul dintre cei mai vechi stimulenți naturali folosiți de om. Formula chimică a cafeinei (C8H10N4O2) este descoperită de către Pfaff și Justus von Liebig în anul 1832, iar formula structurală a fost descoperită în 1895 de Hermann Emil Fischer [1]. După nomenclatura IUPAC, denumirea cafeinei este 1,3,7-trimetil-2,6-purindion sau, pe scurt, 1,3,7-trimetilxantina. Structura cafeinei (Figura 2) constă dintr-un inel dublu, care la exterior are o serie de substituenți, în centru fiind nucleul purinic. [1]

Cafeina stimulează ușor sistemul nervos și cardiovascular, afectează creierul, reduce oboseala, crește gradul de energie. De asemenea crește ritmul cardiac, fluxul sanguin, rata respiratorie și rata metabolică pentru mai multe ore. Consumul de cafeină a peste 600 mg/zi (aproximativ șase cești de cafea), poate provoca nervozitate, transpirații, pierderea tonusului, stomac deranjat, anxietate și insomnie. Chiar și atunci când este întrerupt consumul de cafeină simptomele persistă puternic 24-48 ore și încep să scadă progresiv pe parcursul unei săptămâni. Pentru a minimiza simptomele de sevraj, se recomandă reducerea aportului de cafeină treptat. Cafeina împiedică transportul facil al ovulului de la ovare către uter. De mulți ani, se cunoaște despre cafea că îngreunează procesul reproductiv, dar nu era cunoscut mecanismul prin care cafeina acționează asupra fertilității. Pentru obținerea acestor rezultate

5

Figura 2. Structura cafeinei [2]

s-au efectuat studii pe aproximativ 10 femei, iar cercetările au arătat că un consum mai mare de patru cești de cafea zilnic reduce șansele de concepție cu aproape 25%. [1].

În Tabelul 2 sunt prezentate proprietățile fizico-chimice, senzoriale și solubilitatea cafeinei în diferiţi solvenți.

Tabel 2. Proprietățile și solubilitatea cafeinei[2].

Proprietăți senzoriale Proprietăți fiziceSolubilitate în diferiți

solvențiProprietăți chimice

aspect: pulbere fină,

omogenă, fără

aglomerări

punct de topire:

238 °C

apă la temperatura ambiantă:

21,76 g/L

apă la temperatura de 80 °C:

181,82 g/L

formează cristale

cu o moleculă de

apă

culoare: albă, uniformă

în întreaga masămasa moleculară:

194,19 g/mol

etanol la temperatura

ambiantă: 15,15 g/L

etanol la temperatura de 60

°C: 45,45 g/L

formează

precipitate cu

reactivi ce conțin

metale

gust și miros: specifice

plăcute, bine exprimate,

gust amar, fără miros

străin

densitate:

1,23 g/mL

acetonă: 20 g/L

cloroform: 181,82g/L

bazicitatea cafeinei

este mai mică decât

bazicitatea xantinei

Trigonelina (Figura 3) este o substanţă naturală din grupa alcaloizilor piridinici, a cărei denumire provine de la denumirea ştiinţifică a unei Fabaceae schinduful (Trigonela foenum-graecum). În organismul uman, trigonelina inhibă acidul nicotinic (niacina) din sânge, având tendinţa de neutralizare sau eliminare a previtaminei PP. Deşi este uşor pelagrogenă, trigonelina prezintă şi efecte favorabile asupra organismului uman, prin proprietăţile antistreptococice, diuretice şi depurative. Sursele bogate în trigonelină sunt: boabele de schinduf, seminţele imature sau nepregătite termic al altor leguminoase (boabele de fasole şi mazăre verde, arahidele neprăjite), boabele neprăjite de cafea. În boabele mature de schinduf, soia, fasole, mazăre, linte, în cafeaua prăjită, precum şi în arahidele coapte şi prăjite, trigonelina nu dispare în întregime ci, în cantitate modestă, însoţeşte acidul nicotinic, care predomină, astfel de surse fiind indicate în alimentaţia sănătoasă. Ca o consecinţă a nivelului ridicat de trigonelină, se cere precauţie la consumul de mazăre verde şi evitarea boabelor imature de fasole din alimentaţie (tecile verzi ale păstăilor de fasole în schimb sunt foarte sănătoase), seminţe care până la coacere, de altfel, conţin şi alte principii toxice. [3]

6

Figura 3. Structura

trigonelinei [2]

Minerale Printre cele mai imporatante minerale din boabele verzi de cafea enumerăm potasiu,

calciu, magneziu, fosfați și sulfați, iar 40% din conținutul de minerale găsit într-o ceașcă de cafea este compus din potasiu. [3]

Lignina este un derivat fenolic, asigură rezistența peretelui celular și are rol în apărarea față de diferiți agenți patogeni. Este insolubilă în apă şi solvenţi organici obişnuiţi, solubilă fiind în bisulfit de calciu la cald. Lignina este hidrolizată de acizii minerali şi de o enzimă specifică hadromază produsă de unele bacterii şi ciuperci. [3]

PectineleSunt compuşi macromoleculari coloidali, de natură poliglucidică neomogenă, care se

găsesc în majoritatea sau probabil în toate ţesuturile vegetale, în special în fructele, tulpinile şi rădăcinile plantelor.

Pectinele reprezintă un produs fiziologic normal al organismului vegetal, constituind cimentul intermediar care alcătuieşte lamela pectică ce sudează celulele în complexe tisulare sau fac parte din membrana celulară propriu-zisă respectiv reprezintă constituenţi citoplasmatici. Elementul de bază, precursorul biogenetic îl reprezintă D-glucoza, provenită din ciclul fotosintezei şi care fie, conduce prin izomerizare la galactoză şi mai departe la galactane, fie prin intermediul acidului glucuronic, la acid galacturonic.

În boabele verzi de cafea predomină conţinutul de pectină insolubilă sub denumirea de protopectină. Macromoleculele protopectinei sunt formate din resturi ai acidului poligalacturonic, parţial ramificate din resturi de L- arabinoză și D- galactoză. [3]

Importanță și utilizare

În Franța amestecul de 70% Robusta și 30% Arabica se comercializează cu denumirea de cafea tradițională. Robusta este folosită în lucrările de ameliorare pentru a îmbunătăți caracteristicile altor specii cu privire la creștere și înflorire, productivitate, dimensiunea și forma bobului, calitatea cafelei, rezistența la boli și uscăciune. Boabele prăjite au aromă distinctivă de pământ, savoarea puternică devine agreabilă în amestec, căruia îi dă tărie și modelare [1].

Ambalarea și depozitarea

Ambalarea fructelor se face de obicei în saci din fibre naturale (iută) care permit schimburile de gaze și nu alterează boabele. Se folosesc saci cu capacitate de 60 kg care se depozitează în camere uscate, prevăzute cu rafturi. Depozitele moderne sunt prevăzute cu instalații de condiționare a aerului. După prăjire, cafeaua se împachetează și se depozitează în condiții care să nu altereze prospețimea gustului: containere etanșe și ținute în spații uscate, fără lumină și la temperaturi scăzute. Factorii naturali care afectează calitatea cafelei sunt: aerul, umezeala, căldura și lumina.

Sacii și pungile la care gura este îndoită sunt o alternativă pentru păstrare pe durată scurtă, pentru că în aceste ambalaje aerul poate intra. Mult mai bune sunt ambalajele cu valvă care blochează pătrunderea aerului [1].

7

Capitolul 2. Substanța activă

Acidul clorogenic

Acidul clorogenic sau acidul 5-orto-cafeol-quinic (Figura 4), cu formula chimică C16H18O9

este un ester a acidului cafeic cu acidul quinic. Face parte din clasa compușilor polifenolici și a fost descoperit prima dată în boabele de cafea în 1837 de către Robiquet și Boutron. Acidul clorogenic este un important intermediar biosintetic realizând biosinteza ligninei în plantă.[4]

Caracteristicile unui produs sunt foarte importante în deciziile producătorilor sau cumpărătorilor deoarece influențează în mod direct orice proces tehnologic de prelucrare asupra acestuia. În Tabelul 3 sunt prezentate proprietățile fizico, chimice, senzoriale și solubilitatea acidului clorogenic în diferiţi solvenți.

Tabel 3. Proprietățile și solubilitatea acidului clorogenic[5].

Proprietăți senzorialeProprietăți

fizice

Solubilitate în diferiți

solvențiProprietăți chimice

aspect: pulbere fină,

omogenă, fără

aglomerări

punct de topire:

207-209 °C

apă la temperatura de

60 °Csalefiază în prezența

electroliților

culoare: albă, uniformă

în întreaga masămasa moleculară:

354,31 g/mol

alcooli, acetonă prin reacția cu

FeCl3dă culoare

verde

gust și miros: specifice,

bine exprimate, gust și

miros astringent.densitate:

1,28 g/mL

insolubil în eteri,

benzen, cloroform

Rolul acidului clorogenic

Acidul clorogenic este foarte important datorită activităților antioxidante, anti-diabetice, anti-hiperglicemice și anti-virale pe care le are asupra organismului uman, de aceea iși găsește cu ușurință aplicabilitate în diverse industrii. Printre cele mai importante roluri enumerăm:

acționeaza ca filtru solar; încetinește oxidarea produselor alimentare; inhibă creșterea microbilor; contribuie la anihilarea radicalilor liberi; inhibă eliberarea de glucoză în sânge; scade semnificativ a tensiunii arteriale. [6,7]

8

Figura 4. Structura acidului clorogenic

Capitolul 3. Metode de separare și purificare a acidului clorogenic

Pentru a obține acidul clorogenic din boabele verzi de cafea s-au elaborat și aplicat o serie de metode, fiecare prezentând anumite avantaje și dezavantaje. Pentru obținerea acidului clorogenic se ține cont în primul rând de alegerea materialului vegetal (să aibă conținutul cel mai mare de acid clorogenic), dar și de ușurința de procurare precum și de normele pe care trebuie să le îndeplinească.

Procedeul principal de obținere a acidului clorogenic este extracția cu solvenți iar solvenții utilizați pentru extracția acidului clorogenic sunt clasificați în:

solvenți anorganici: apa;solvenți organici: etanol, metanol, acetonă, glicerol.

În funcție de natura produsului vegetal, a solventului utilizat, de condițiile de extracție și procedeele de izolare și purificare putem clasifica metodele de extracție după cum urmează:

a) Metode clasice de extracție extracția la cald; extracția Soxhlet; percolarea;

b) Metode modernă de extracția extracția presurizată;extracția cu fluide supercritice;extracția cu ultrasunete;extracția asistată de microunde;

c) Metode de purificare cromatografie; distilare; adsorbție pe rășină de tip X-5.

Metode clasice de extracţie

Extracția la caldPentru procesul de extracție la cald se utilizează boabe de cafea verde neprăjite.Acestea se scufundă mai întâi în clorură de metil pentru îndepărtarea alcaloizilor

(cafeina și trigonelina) apoi boabele sunt cufundate în apă fierbinte eliberând acidul clorogenic. Apa împreună cu acidul clorogenic este trecută printr-un filtru de carbon pe care se reține doar acidul clorogenic, iar apa este reutilizată pentru o nouă extracție. Printre avantaje se menționează faptul că se poate utiliza oricare solvent enumerat anterior diferența fiind temperatura la care se va efectua extracția. Procedeul conduce la recuperarea a 10-20% din acidul clorogenic existent în sursele vegetale. [8]

9

Extracția Soxhlet [9]

Extractorul Soxhlet, a fost utilizat de către chimişti pentru extracţia compuşilor chimici dintr-o probă solidă încă de la mijlocul secolului al XIX-lea. În extractor se introduce solidul care conţine substanţele de interes.

Proba solidă (boabe de cafea) este introdusă mai întâi într-un cartuş de hârtie de filtru. Dispozitivul este prevăzut cu un vas pentru solvent şi două tuburi laterale de sticlă care fac legătura între extractor şi vasul cu solvent organic. Tubul pentru circulaţia vaporilor este cuprins între partea superioară a vasului cu solvent şi partea superioară a extractorului în care se introduce cartuşul cu proba. Tubul pentru recircularea solventului organic leagă şi el cele două părţi componente; începe de la baza extractorului, se continuă până la jumătatea corpului extractorului şi apoi coboară brusc şi intră în vasul cu solvent.

Extractorul Soxhlet reprezentat în Figura 4 lucrează în cicluri. Solventul fierbe în vas şi se formează vapori care ajung la condensator unde condensează, iar condensul curge peste şi prin probă şi se colectează la partea inferioară. În acest moment solventul va conţine o concentraţie mică de acid clorogenic extras din probă. Nivelul lichidului creşte simultan în “camera” de extracţie şi în tubul lateral de recirculare. Când tubul se umple, sub acţiunea gravitaţiei, lichidul se scurge rapid înapoi în vasul cu solvent, acesta fiind sfârşitul unui ciclu. Avantajul acestei metode în ușurința de realizare la nivel de laborator, dar și în ușurința de recuperare a solventului. Dezavantajul rezidă din puritatea mică a extractului.

Extracția prin percolareEste un procedeu de extracție în care solventul (apa, alcool, acetonă), adăugat treptat,

străbate încet, sub acțiunea gravitației, un strat de produs vegetal mărunțit, antrenând principiile active cedate de produsul vegetal prin osmoză sau prin dizolvare. Este operația care dă cele mai bune rezultate. Se execută în vase cilindrice sau conice prevăzute cu orificii de scurgere și de reglare a debitului denumite percolatoare.

Această extracție urmărește epuizarea progresivă a produsului vegetal (boabe cafea) prin scurgerea lentă, regulată și repetată a unui solvent adecvat. Boabele de cafea aduse la un grad de diviziune convenabilă se plasează într-un vas de formă aproape cilindrică, cu un tub de scurgere la partea inferioară, după care se toarnă porţiuni de solvent. Solventul traversează boabele pe direcție verticală, exercitând capacitatea de extracție asupra straturilor succesive de produs vegetal, până ajunge la saturare. Lichidul coboară datorită gravitație și presiunii coloanei de lichid de deasupra, deși forțele capilare tind să-l rețină.

10

Figura 4. Aparat Soxhlet

Când cantitatea de solvent nu este suficient de mare, acesta îmbibă produsul și fiind reținut de forțele capilare nu ajunge la orificiul din partea inferioară a percolatorului. Prin adăugarea atentă a unei porțiuni de solvent, acesta deplasează porțiunea inițială absorbită și îi ia locul fiind apoi înlocuită la rândul său de o altă porțiune proaspată de solvent. În acest timp porțiunea de lichid saturat în principii active se scurge și este culeasă, constituind percolatul. Toate aceste procese durează aproximativ 24 ore.

Percolarea prezintă avantaje deoarece permite o epuizare superioară a produsului vegetal comparativ cu celelalte metode de laborator prin împrospătarea cu solvent pur, ceea ce face posibilă o extracție practic totală [9].

Metode moderne de extracţie

Extracția presurizatăExtracţia accelerată cu solvent este o tehnică de extracţie din probe solide sau

semisolide cu solvenţi lichizi obişnuiţi, care utilizează temperaturi şi presiuni ridicate pentru a creşte eficienţa procesului de extracţie. Această extracție poate înlocui extracția Soxhlet sau alte tipuri de extracții pentru că are ca și bază creșterea vitezei de extracţie și deci crește randamentul extracției. [10]

Etapele de lucru sunt, în general, următoarele:introducereaprobei în celula de extracţie;umplerea celulei cu solvent;aducerea celulei la presiunea şi temperatura corespunzătoare;menţinerea probei la temperatura şi presiunea prestabilite;pomparea solventului în celula cu probă;purjarea solventului din celulă cu gaz inert;

Avantajele acestui tip de extracţie sunt:este o tehnică de extracţie mai rapidă decât alte tehnici convenţionale de extracţie;necesită cantităţi mai mici de solvent;deoarece materialul după extracţie este uscat, se poate repeta extracţia cu acelaşi

solvent sau cu alţi solvenţi de polaritate crescătoare. [10]

Extracția cu ultrasunete

Ultrasunetele au fost descoperite înainte de primul război mondial. În anii 1938-1940, au început să fie folosite pentru construirea tuburilor electronice de putere mare. În 1970 ultrasunetele s-au utilizat pentru uscarea diferitelor produse. Pentru utilizarea ultrasunetelor raţional şi cu eficienţă sporită este necesară cunoaşterea bazelor ştiinţifice ale propagării ultrasunetelor în diferite medii, efectele lor la interacţiunea cu aceste medii, efecte care pot fi utilizate în diferite operaţii tehnologice.Viteza ultrasunetelor este viteza cu care se propagă unda prin mediu, chiar dacă particulele individuale vibrează numai în jurul propriilor lor medii, fără deplasarea aparentă a materiei. Viteza ultrasunetelor nu trebuie confundată cu viteza particulei, care reprezintă viteza instantanee a unei particule care vibrează intr-un punct

11

mediu. Influenţa ultrasunetelor asupra extracţiei solid-lichid are la bază efecte termice, succesive, structurale ale cavitaţii. Prin tratarea cu ultrasunete a sistemului solid-lichid, avantajele extracției sunt: creşterea randamentului extracţiei, scaderea duratei de extracţie, micşorarea consumului de energie termică, iar procesul are loc la temperaturi scăzute. [11]

Extracția cu fluide supercriticeÎn domeniul extracţiei, unde se folosesc cantităţi mari de solvenţi organici, ar trebui

redusă cantitatea acestora şi unii chiar ar trebui înlocuiţi. O alternativă nepoluantă este considerată aplicarea extracţiei cu fluide supercritice și subcritice. Punctul critic al unei substanţe pure este definit ca cea mai înaltă temperatură şi presiune la care substanţa există în echilibru lichid-vapori. La temperaturi şi presiuni mai mari decât acest punct se formează un fluid omogen numit fluid supercitic, iar la temperaturi și presiuni inferioare se formează fluide subcritice. Ceea ce face ca fluidele supercritice să fie considerate solvenţi atractivi, este faptul că densitatea gazelor devine mult mai mare la presiuni ridicate, în timp ce vâscozitatea şi difuzivitatea au valori apropiate de cele la presiune atmosferică. Aceste proprietăţi fac ca mobilitatea şi puterea de solvatare să fie unice. De aceea, fluidele supercritice sunt candidaţi foarte buni pentru extracţia unor substanţe active de origine vegetală, şi nu numai. [12]

În plus, fluidele supercritice pot avea proprietăţi chiar surprinzătoare faţă de fluidele din care provin şi pe care le cunoaştem în condiţii normale de presiune şi temperatură. Pentru extracția acidului clorogenic se pot utiliza apa, etanol, metanol sau acetonă.

Extracția asistată de microunde

Extracția asistată de microunde este o tehnică relativ recentă, care utilizează energia microundelor pentru a încălzi solventul și proba în vedere creșterii ratei transferului de masă dintre substanțele dizolvate din matricea probei și solvent, contribuind la trecerea mai ușoară a acestora în solvent. Avantajul acestei tehnici constă în timpul redus de extracție, în condițiile folosirii unui consum redus de energie și solvent și cu o eficiență de extracție ridicată. Solvenții polari precum acetona, metanolul, diclorometanul se încălzesc rapid sub influența micoundelor, în schimb solvenții nepolari nu pot fi încălziți prin acțiunea microundelor, deoarece neavând moment de dipol nu absorb radiația de microunde. MAE se aplică probelor solide, care sunt introduse într-un solvent organic sau amestec de solvenți organici și apoși, și apoi iradiat sistemul pentru un interval scurt de timp (0,5-10 min). După răcirea sistemului soluția de supernatant (extractul) este decantat, iar matricea solidă este spălată de câteva ori cu solventul utilizat, care se adaugă extractului. În cazul utilizării solvenților nepolari se adaugă un solvent polar până în 10%. MAE se poate aplica la presiune atmosferică și la punctul de fierbere a solventului (în sistem deschis când pierderea de solvent se evită prin condensarea vaporilor și revenirea în extractor) sau la presiune ridicată (presiunea din sistem crește în timpul extracției). [13]

Extracția asistată de microunde este un proces care utilizează energia microundelor alături de solvent pentru a extrage acidul clorogenic din boabele verzi de cafea Robusta.

12

Creșterea temperaturii și a presiunii cauzează migrarea selectivă a acidului clorogenic, obținând extracte bogate în aceste compus într-un timp relativ scurt comparativ cu metoda convențională. Prin utilizarea microundelor se reduce atât cantitatea de solvent cât și timpul de extracție.

Boabele verzi de cafea Robusta sunt degresate cu hexan timp de 8h într-un sistem de extracție Soxhlet. Boabele degresate sunt măcinate și supuse extracției cu alcooli sau apă utilizând microundele. Extractul obținut este separat și apoi analizat în vederea gradului de puritate. Separarea acidului clorogenic de alcool are loc prin evaporarea solventului într-un rotavapor la 500C și la presiune scăzută.

Cantitatea de acid clorogenic este analizată cu spectrofotometru UV. Etanolul, metanolul și apa au fost selectați din studii recente pentru extracția acidului clorogenic din boabele verzi de cafea cu ajutorul microundelor. Condițiile de extracție au fost: 2, 5, 10 min; 400, 600, 800 W; 300C, 500C, 700C. [12]

Rezultate și discuții [12]

Tabel 5. Influența parametrilor asupra randamentului extracției [14]Parametri variabili

Parametri constanți

Variabilele η extracției asistate de microunde %

% acid clorogenic

Solvent 5 min; 500C; 800 W

Metanol

Etanol

Apă

9,05

8,95

18,1

46,41

55,31

61,9

Extract apos

Timp

500C; 800 W 2 min

5 min

10 min

17,2

17,5

17,1

35,28

38,57

37,24

Temperatură 5 min; 800 W 300C

500C

700C

900C

17,6

18,1

17,6

16,8

37,89

44,88

38,35

37,92

Puterea de iradiere 5 min; 500C 400 W

600 W

800 W

15,4

17,8

18,2

30,52

32,68

46,13

1. Efectul duratei de radiație a microundelor

13

Cantitatea maximă de acid clorogenic obținut în extract apos la 800 W cu durate de timp diferite a fost aproximativ 17,5%. Extracția asistată de microunde timp de 5 min s-a dovedit a fi cea mai eficientă, obținându-se randament maxim. Odată cu creșterea timpului peste 5 min s-a observat o stagnare a randamentului ceea ce înseamnă că, creșterea timpului de radiație nu influențează în mod pozitiv cantitatea de acid clorogenic.

Cercetătorii Pan, Niu și Liu (2003), au stabilit că nivelul maxim al extracției are loc între 4-5 min. [14]

2. Efectul temperaturii asupra eficienței MAETemperatura de extracție este deasemenea foarte importantăpentru izolarea acidului

clorogenic din boabele de cafea. Experimentul s-a realizat la 4 temperaturi diferite: 30, 50, 70 și 900C. S-a observat că randamentul maxim de extracție are loc la temperatura de 500C.

Creșterea temperaturii peste această valoare nu a condus la o creștere a randamentului ci din contra, creșterea temperaturii duce la scăderea cantității de acid clorogenic extras. [14]

3. Efectul puterii de radiație a microundelor asupra extracțieiValorile stabilite pentru extracția acidului clorogenic au fost 400W, 600W și

800W.Extracția asistată de microunde a fost stabilită la o temperatură de 500C și o durată de 5 min. S-a observat că randamentul extracției crește odată cu creșterea puterii de radiație devenind maxim la 800W. În cazul experimentul de față, analiza randamentului peste această valoare nu a mai putut fi realizată datorită limitării echipamentului. Randamentul extracției a fost maxim atunci când s-a folosit ca solvent apa (61,9%) timp de 5 min la 800 W comparativ cu alcoolii. Motivul este reprezentat de faptul că polaritatea și constanta dielectrică este mult mai mare în cazul apei. Rezultatele întregului experiment sunt reprezentate în tabelul 5.[14]

Cromatografia

HPLC-DAD

Cromatografia de înaltă performanță cuplată cu un detector fotodiodă (DAD), a fost utilizată pentru determinarea acidului clorogenic dintr-un preparat medicinal chinezesc.

Compusul țintă a fost extras cu succes utilizând o soluție de metanol 80% timp de 15 min utilizând baia de ultrasunete.

HPLC-DAD s-a dovedit a fi o metodă rapidă de detectare a constituienților din surse naturale, DAD fiind un detector care poate oferi informații abundente asupra structurii compusului facilitând identificările structurele a compușilor neidentificați. Acestă metodă a poate fi cu succes aplicată și în cazul determinării acidului clorogenic din boabele verzi de cafea Robusta.

Boabele sunt măcinate și supuse extracției cu apa cu ajutorul ultrasunetelor timp de 24 de ore. Absorbanța extractelor obținute au fost înregistrate cu ajutorul unui spectrofotometru JASCO/2005 pentru a se stabili care este concentrația totală de compuși fenolici (semnalul

14

caracteristic fiind la 280 nm). Extractul obținut astfel este supus analizei, utilizând un cromatograf HPLC SHIMADZU, echipat cu o pompă solvent binară, un degazor, cuptor pentru coloană și detectorul fotodiodă (DAD). Se poate utiliza o coloană cromatografică de tip SUPELCOLOSIL LC-18, 5 µm, 25x4,6 mm la o temperatură de 300C. Faza mobilă este formată din 2 solvenți: solventul A (metanol:acid acetic:apă bidistilată 10:1:88) și solventul B (metanol:acid acetic:apă bidistilată 90:3:7). Separarea durează 30 ore, iar ordinea eluției este în funcție de timpii de retenție astfel că pentru acidul clorogenic s-a stabilit un timp de 13,15 min. S-a observat ca timpul de retenție depinde de solvenții din faza mobilă, astfel ca pentru o faza mobilă compusă din acetonitril și acid fosforic, timpul de retenție a acidului clorogenic scade la 2,45 min. [15]

O metodă pentru determinarea conținutului de acid clorogenic este utilizarea unei coloane de tip DIONEX P680 echipată cu un detector UV-Vis și o coloană C18 DIKMA (250x4,6 mm, 5 µm). Debitul la ieșirea din coloană a fost stabilit la 1 mL/min. În cazul acidului clorogenic, lungimea de undă a fost 322 nm, faza mobilă fiin constituită din metanol 30% în soluție apoasă. Rezultatele HPLC au arătat că, curbele de calibrare cu care se lucrează au liniaritate bună în intervalul 17,6-1760 mg/L. Liniile de regresie pentru acidul clorogenic au fost y= 0,9749x-1,3322, unde y este zona de vârf a acidului clorogenic, iar x este concentrația de acid clorogenic (mg/L). [15]

HPLC- X5

Pentru separarea și purificarea polifenolilor s-au ales 8 rășini macroporoase a căror proprietăți sunt prezentate în tabelul de mai jos. Capacitatea de adsorbție și desorbție a rășinii de tip X5 este cea mai ridicată comparativ cu celelalte. Cum acest tip de rășină s-a dovedit a fi cea mai avantajoasă s-a ales pentru separarea și purificarea acidului clorogenic. Extractul apos este introdus într-o coloană de sticlă (45x600mm), umplută cu rășină X5 la un debit de curgere de 1Bv/h. În acest fel acidul clorogenic este adsobit în porii rășinii. După adsorbție, 2 Bv de apă distilată au fost utilizate pentru a spăla sorbantul de impurități. Se utilizează o soluție de etanol 30% ca stripant pentru separarea acidului clorogenic de alți polifenoli la un debit de curgere de 2 Bv/h. Eluații sunt colectați la intervale de 0,5 Bv, iar concentrația de acid clorogenic din soluția de desorbție se determină prin HPLC. Fracțiunile colectate sunt supuse uscării sub vid rezultțnd pulberea de acid clorogenic. [16]

Tabel 6. Proprietășile rășinilor macropoaroaseTip rășină Suprafața

specifică (m2/g)

Diametrul mediu al porilor (Å)

Polaritate Capacitate de adsorbție (mg/g)a

Rația de desorbție (%)a

X5 500-600 290-300 Non-polar 53,8 82,9

D4020 540-580 100-105 Non-polar 45,7 72,4

D101 480-520 200-300 Non-polar 45,3 72,6

15

LS-305 400-500 150-250 polar 45,7 54,2

LS-46D 400-500 150-250 polar 42,8 56,1

NKA-9 250-290 155-165 polar 51,2 78,3

NKA-2 160-200 145-155 polar 50,4 74,2

AB-8 480-520 130-140 polar 45,2 70,2

Capitolul 4. Valorificarea acidului clorogenic

16

Industria alimentară Azi, noi studii arată că acidul clorogenic este mai mult decât un antioxidant natural

pentru că are proprietatea de a întârzia oxidarea produselor alimentare menținându-le proaspete mai mult timp. Ca antioxidant, acid clorogenic ajută la menținerea proaspătă a aromelor și valorilor nutriționale ale alimentelor, care sunt alterate, atunci când grăsimile și uleiurile din ele sunt oxidate. Acest acid prezintă cea mai remarcabilă activitate antioxidantă comparativ cu antioxidanții sintetici, este utilizat pe scară largă în industria alimentară pentru a inhiba creșterea microbilor și prelungi timpul de depozitare a produselor alimentare.[3]

Industria cosmeticăAntioxidanții reprezintă o materie primă importantă pentru industria sănătății și a

cosmeticelor. Acest fapt s-a bazat pe o teorie veche de 50 de ani. În 1956, cercetătorii au ajuns la concluzia că procesul de îmbătrânire este provocat de o anumită distrugere moleculară, o consecință a formelor reactive ale oxigenului, denumite superoxizi sau "radicali liberi", care circulă prin organism. Acest proces este numit stres oxidativ. După mai multe analize, specialiștii au ajuns la concluzia că acidul clorogenic contribuie la anihilarea acestor radicali liberi, reducând distrugerile moleculare pe care ei le provoacă. [4]

Industria farmaceuticăStudii științifice au demonstrat că acidul clorogenic inhibă eliberarea de glucoză în

sânge. Atunci când glucoza intră în sânge după consumul de alimente sau băuturi, ficatul eliberează insulina iar aceasta stochează excesul de glucoză sub formă de grăsimi. Prin administrarea de acid clorogenic are loc încetinirea absorbției glucozei în sânge și implicit absorbția grăsimilor. Datorită acestei acțiuni ficatul metabolizează grăsimile mult mai repede.

Un alt studiu a fost realizat de cercetătorii japonezi care în anul 2005 au realizat un test cu privire la efectele acidului clorogenic asupra persoanelor cu hipertensiune arterială ușoară, folosind un placebo pentru unii participanți și acidul clorogenic extras din boabe verzi de cafea pe alții. Rezultatele au arătat în cazul celei de-a doua categorii de participanți o scădere

semnificativă a tensiunii arteriale și nu s-au înregistrat efecte secundare negative.[3]

Concluzii

17

Importanța acestui studiu este justificată de posibilitățile variate de valorificare ale acidului clorogenic: în industria farmaceutică, cosmetică și alimentară.

Dintre metodele de extracție ale acidului clorogenic descrise în literatura de specialitate s-a constatat că extracţia asistată de microunde prezintă cele mai multe avantaje.

Extracția asistată de microunde pentru izolarea compușilor polifenolici a fost considerată o alternativă de succes a extracției tradiționale solid-lichid. În prezent studiile au fost focalizate pe extracția acidului clorogenic, cafeinei și a altor compuși polifenolici din boabe verzi de cafea Robusta. S-a stabilit în cazul acidului clorogenic că parametri extracției pentru randament maxim sunt conform tabelului 5, 500C, 5 min, 800 W. Cu această metodă extractul obținut conține 32- 62% acid clorogenic. După separarea compusului din matricea vegetală, metodele de purificare cele mai avantajoase la nivel de laborator sunt metoda HPLC-DAD și HPLC-X5, aducând acidul clorogenic la puritatea necesară permisă pentru a putea fi valorificat.

Bibliografie

[1] Tomescu, A. :Cafeaua, Ed. Cramen, București, 2010;18

[2] Clarke, RJ., Macrae, E.: Coffee Chemistry, Vol.1, Ed. Elsevier Applied Science, London, 1985;

[3]***Farmacopeea Română, ed. a X-a, Ed. Medicală, Bucuresti, 1993;[4] C.J:Dillard, J.Bruce German, J.Sci.Food Agric. 80 (2000) 1744-1756;[5] Vinson,J., Su,X., Zubik,L., Bose, P.; Phenol antioxidant quantity and quality in foods.

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49 (2002), 5315-5321;[6] http://www.chlorogenic-acid.com/En-Post/chlorogenic-acid-in-the-food-industry; [7] http://www.chlorogenic-acid.com/En-Post/Chlorogenic-acid-application-in-cosmetics; [8] Romualdo, V.: Encyclopedia of Chemical Technology, 1993, 37 (3), 416-420;[9] Soxhlet, F.: Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes, Ed. Polytechnisches,

1879;[10] Berger, S., Dieter S.: Classics in Spectroscopy-Isolation and Structure Elucidation of

Natural Products, Ed. Wiley-VCH, 1991;[11] Ayaz A. Memon, Najma Memon, Muhammad I. Bhanger: Separation and Purification

Technology, 76 (2010) 179-183;[12] Rohit Upadhyay, K. Ramalaskshmi, L.Jagan Mohan Rao: Microwave-assisted extraction

of chlorogenic acids from green coffe beans. Food Chemistry, 130 (2012) 184-188;[13] Rahoma, S., Mohameda, G.: The Use of Supercritical Fluid Extraction, Ed. WMRC,

iunie, 2002;[14] Pan, X., Niu, G., Liu, H.: Microwave-assisted extraction of tea polyphenols and tea

caffeine from green tea leaves. Chemical Engineering and processing, 42 (2003), 129-133.[15] Lijun Sun, Yurong Guo, Chengcheng Fu, Jingjing Li, Zhuo Li: Simultaneous separation

and purification of total polyphenols, chlorogenic acid and phlorizin from thinned young apples. Food chemistry, 136 (2013) 1022-1029;

[16] Li Yang, Qinghua Yan, Haizhen Mo, Xiaomin Li, Qing Wang: Determination of chlorogenic acid, baicalin and forsythin in shuanghuanglian preparations by HPLC-DAD, 4 (2012) 1361-1363.

19