Enzime pectinolitice de origine microbiana, capitolul6

Enzime pectinolitice de origine microbiană

163

Enzime pectinolitice de origine microbiana

D. Dinu

Universitatea din Bucuresti, Facultatea de Biologie, Spl. Independentei nr. 91-95, Bucuresti

Introducere

Reactiile biochimice, reactii deosebit de complexe si variate, sunt mediate de biocatalizatori cu proprietati remarcabile, cunoscuti sub denumirea de enzime. Capacitatea enzimelor de a creste de pâna la 1014ori viteza unei reactii, conditiile blânde de actiune, specificitatea si posibilitatea de reglare a activitatii, constitue un avantaj major al acestora. Aplicatiile practice ale enzimelor în diferite sectoare de activitate au condus la necesitatea obtinerii în cantitati mari de preparate enzimatice cu diferite activitati catalitice. În productia mondiala de enzime un loc de frunte îl ocupa tehnologiile care vizeaza obtinerea de preparate proteice cu activitate pectinolitica. Dezvoltarea biotehnologiilor care urmaresc gasirea de noi surse de izolare a enzimelor pectinolitice este o consecinta fireasca a implicarii si eficientei acestora în diferite procese. Numeroasele utilizari ale enzimelor pectinolitice în cele mai diverse domenii de activitate - industria alimentara, industria prelucrarii fibrelor naturale, industria farmaceutica, industria chimica - au determinat demararea cercetarilor în vederea obtinerii acestora din surse microbiene. Orientarea catre microorganisme a avut în vedere avantajele oferite de astfel de surse si proprietatile enzimelor pectinolitice de origine microbiana. Larga raspândire, variabilitatea, adaptabilitatea si potentialul de biosinteza al microorganismelor pot fi considerate puncte de plecare pentru noi cercetari consacrate descoperirii si manipularii unor agenti cu proprietati superioare.

1. Pectinele, substraturi ale enzimelor pectinolitice

Substantele pectice reprezinta un grup heterogen de polizaharide cu un continut mare de sarcini negative datorate resturilor de acid galacturonic din structura. Celulele plantelor aflate în diferite stadii de dezvoltare sunt acoperite de un perete extensibil. În structura peretelui celular microfifrilele de celuloza sunt legate necovalent la o matrice alcatuita din hemiceluloze, pectine si proteine structurale. Studiile intreprinse asupra peretilor celulari de provenienta diferita au evidentiat un aranjament caracteristic al principalelor componente ale acestora (Albersheim 1975, Cosgrove 1997, Capita si altii 2001). În acest aranjament, moleculele adiacente de celuloza adera puternic prin legaturi de hidrogen si formeaza agregate cristaline, numite microfibrile de celuloza. Microfibrilele de celuloza sunt principalii determinanti ai rezistentei peretelui celular. Seturile de microfibrile sunt aranjate în straturi sau lamele în structura carora fiecare microfibrila se leaga de vecina sa prin molecule de hemiceluloza. Hemicelulozele sunt

D. Dinu

164

heteropolizaharide care se leaga la suprafata microfibrilelor de celuloza, mai ales prin legaturi de hidrogen. Hemicelulozele ajuta la legarea încrucisata a microfibrilelor într-o retea complexa si previn contactul direct microfibrila-microfibrila. Alaturi de aceasta retea alcatuita din microfibrile celulozice si hemiceluloze, peretele celular contine si o alta retea formata din molecule de pectina legate încrucisat. Pectinele formeaza un gel în jurul retelei celuloza-hemiceluloza si actioneaza ca un material de umplutura care previne agregarea si ruperea acestei retele. Prin intermediul substantelor pectice peretele celular îsi moduleaza porozitatea pentru diferite macromolecule. Datorita sarcinii lor negative, pectinele sunt puternic hidratate si înconjurate de cationi, în special de Ca2+. Substantele pectice se gasesc din abundenta în lamela mijlocie, fiind agenti de cimentare intercelulara prin intermediul legaturilor încrucisate formate între ionii de calciu si catenele pectice din structura a doi pereti adiacenti. Aranjamentul principalelor componente în cadrul unui perete celular primar este prezentat în Figura 1. Substantele pectice sunt macromolecule complexe în structura carora acidul D-galacturonic este componentul principal. Catena polizaharidica centrala are unitatile de α-D-galacturonat legate (1→4) si contine 2-4% unitati de L-ramnoza (aproximativ câte una la 25 unitati galacturonice) legate β-(1→4) si β-(1→2) la resturile de acid galacturonic. Catenele laterale sunt de doua feluri: lungi, alcatuite din acid galacturonic (galacturonani) sau din resturi de L-arabinoza (arabinani) si scurte, alcatuite din resturi de D-galactoza, D-xiloza sau L-fucoza. În structura substantelor pectice au fost evidentiate doua tipuri de regiuni: o regiune “grea“, alcatuita din catene ramnogalacturonanice puternic substituite cu zaharuri neutre si o regiune “usoara“ în structura careia exista, în special, catene homogalacturonanice. Multe din gruparile carboxil din structura resturilor de acid galacturonic sunt esterificate cu metanol. Gradul de esterificare variaza cu sursa biologica si cu agentul utilizat pentru extractia substantelor pectice. Au fost izolate si caracterizate si substante pectice care au câteva din resturile de acid galacturonic acetilate.

Figura 1. Aranjamentul principalilor constituenti ai peretelui celular primar.


165

Gradul de esterificare, proportia de zaharuri neutre si gradul de policondensare sunt principalele elemente ale heterogenitatii substantelor pectice de diferite origini (Dick si altii 1989, MacKinnan si altii 2002). Deesterificarea, proces care se poate realiza chimic sau enzimatic, determina asamblarea macromoleculelor pectice prin intermediul ionilor de Ca2+. Acest proces afecteaza semificativ proprietatile fizico-chimice ale pectinelor, si, implicit, arhitectura peretilor celulari (Braccini si altii 2001, Barnavon si altii 2001, Ralet si altii 2001, Camara si altii 2002) Clasificarea substantelor pectice se face dupa mai multe criterii. Dupa solubilitatea lor în diferite medii, substantele pectice au fost împartite în trei categorii: • substante pectice solubile în apa (pectine înalt metilate sau acizi pectinici); • substante pectice solubile în solutii care complexeaza ionii de calciu ca de exemplu

EDTA, oxalat de amoniu (pectine slab metilate sau acizi pectici); • substante pectice insolubile în apa (protopectinele), considerate o forma nativa a acestor

biomolecule. Insolubilitatea protopectinei se datoreaza atât marimii policondensatului, cât si legaturilor ce o caracterizeaza. În structura protopectinei exista retele complexe de catene poligalacturonice asociate între ele prin legaturi ionice stabilite între un ion bivalent (în special calciu) si doua grupari carboxil. Protopectina se leaga, prin legaturi de hidrogen, de celelalte componente din peretii celulari. Protopectina poate fi solubilizata cu acizi diluati, la cald.

O alta clasificare a substantelor pectice are în vedere gradul de esterificare a gruparilor carboxil din structura. Dupa acest criteriu, substantele pectice au fost împartite în: • pectine înalt metilate (HMP) cu au un grad de metilare de peste 50% • pectine slab metilate (LMP) cu au un grad de metilare de sub 50%. Izolarea si caracterizarea pectinelor din diferite tesuturi vegetale a evidentiat prezenta în peretii celulari a mai multor tipuri de substante pectice. În functie de structura, substantele pectice au fost clasificate de O′Neill (1990) în: • homogalacturonani - catene de resturi de acid galacturonic legate α-(1→4) glicozidic,

metilate sau nemetilate; • ramnogalacturonani de tipul I (RG-I) - o familie de polizaharide înrudite, la care catena de

baza are o structura de forma: →4)-α-D-Galp A-(1→2)- α-L-Rhap-(1→. Aproximativ 50% din resturile de ramnoza din structura sunt substituite la C-4 cu oligozaharide neutre (galactoza, arabinoza si putina fucoza);

• ramnogalacturonani de tipul II (RG-II) - în structura carora unele resturi de acid galacturonic au atasate la C-2 sau C-3 aldo si ceto oligozaharide;

• arabinani, galactani si arabinogalactani, care alcatuiesc catenele laterale a polizaharidelor pectice.

Substantele pectice se gasesc aproape în toate organele plantelor. Aceste polizaharide sunt componentele majore ale peretilor primari ai dicotiledonatelor si monocotiledonatelor. Peretii celulari ai graminaceelor contin cantitati mai mici de substante pectice. Cantitati mari de substante pectice se gasesc în pulpa fructelor carnoase (mere, pere, ananas) precum si în sfecla de zahar. Cantitati importante de substante pectice au fost determinate în diferite deseuri rezultate în industria alimentara (coji de citrice, borhot de sfecla, tarâte de grau, resturi de pulpa de fructe). Prezenta substantelor pectice în aceste deseuri justifica utilizarea acestora ca inductori ai enzimelor pectinolitice microbiene.

D. Dinu

166

2. Clasificarea si nomenclatura enzimelor pectinolitice În general, în categoria enzimelor pectinolitice sunt incluse enzimele care actioneaza asupra homogalacturonanilor si ramnogalacturonanilor. Enzimele pectinolitice cuprind: o esteraza, sapte poligalacturonaze (nume generic preluat dupa Whitaker, 1990) si patru liaze. Dintre acestea numai o parte sunt incluse în Enzyme Nomenclature si au numar de cod. Clasificarea si nomenclatura enzimelor pectinolitice este prezentata în Tabelul 1. Unii cercetatori au inclus α-D-arabinofuranozidaza si endoarabinaza, enzime care actioneaza asupra arabinanilor din structura substantelor pectice, în categoria enzimelor pectinolitice. Majoritatea enzimologilor si microbiologilor nu sunt familiarizati cu aceste doua enzime, enzime care nu au fost incluse în nici un volum din seria Methods in Enzymology. Modul de actiune al principalelor enzime pectinolitice (endopoligalacturonaza, exopoligalacturonaza, endopectat liaza, exopectat liaza, pectin liaza si pectinesteraza) este prezentat în Figura 2. Cercetari recente au evidentiat existenta altor doua enzime implicate în degradarea polimerilor pectici, ramnogalacturonaza si β-1,4-D- galactanaza. Unele tulpini de Aspergillus aculeatus biosintetizeaza o ramnogalacturonaza, enzima care scindeaza legaturile dintre resturile de acid galacturonic si cele de ramnoza din structura ramnogalacturonanilor pectici (Beldman si altii 1996, Hennink si altii 1996). Yamaguchi (1995) a izolat din culturile de Aspergillus niger o endo-β-1,4-D- galactanaza, proteina cu masa moleculara de 32 000 Da, care hidrolizeaza polizaharidele pectice din soia cu eliminare de oligomeri galactozidici si galactoza. O tulpina de Echerichia coli s-a dovedit a fi capabila sa biosintetizeze o pectin acetil esteraza (Shevchik si altii 1997).

3. Surse de izolare ale enzimelor pectinolitice

Enzimele pectinolitice sunt larg raspândite la microorganisme si la plantele superioare. Ele joaca un rol important în procesele de crestere, în plantele superioare permitând elongatia celulelor. Enzimele pectinolitice de origine vegetala sunt implicate în procesele de înmuiere a tesuturilor în timpul maturarii si stocarii. Endopoligalacturonazele, exopoligalacturonazele, pectinesterazele apar, separat sau împreuna, în diferite organe ale plantelor. Din surse vegetale nu au fost izolate proteine cu activitate pectat, sau pectin liazica.

Enzimele pectinolitice au fost separate si caracterizate din: rosii, cirese, piersici, portocale, grepfruit, papaia, mango, soia, in, masline, polen. Prezenta enzimelor pectinolitice a fost semnalata si la insecte. În larvele de Conotrachelus nenuphar a fost semnalata prezenta pectinesterazei, endopoligalacturonazei, pectat liazei si pectin liazei. Aceste enzime sunt eliberate atunci când larvele se hranesc, fiind capabile sa produca o macerare a tesuturilor fructelor si, împreuna cu celulazele, sunt responsabile de caderea prematura a merelor si prunelor infectate de aceste larve. Activitatea poligalacturonazica a fost decelata în saliva plosnitei verde, Schizaphis graminum si în cea a gargaritei orezului, Sitopilulus oryzae.

Un numar mare de agenti patogeni ai plantelor, în special fungi si bacterii, produc enzime pectinolitice. Acestea, împreuna cu alte proteine, trec în mediul interior al gazdei si joaca un rol important în procesele de colonizare si infectare a plantelor. Majoritatea microorganismelor investigate produc cel putin doua tipuri de enzime pectinolitice cu actiune sinergica care formeaza un sistem activ de degradare a polimerilor pectici. Majoritatea enzimelor pectinolitice de origine microbiana sunt inductibile, fiecare tip de enzima având inductori specifici.


167

D. Dinu

168

Figura 2. Modelul unei molecule de pectina si de pectat. Punctele de atac ale enzimelor pectinolitice.

Din clasa fungilor, speciile de Aspergillus sunt cele mai bune producatoare de enzime pectinolitice. Acestea biosintetizeaza în cantitati mari endo si exopoligalacturonaze. Poligalacturonazele de la Aspergillus sp. prezinta forme moleculare multiple cu un determinism genetic diferit (Statilova si altii 1993). Unele Aspergillus sp., ca de exemplu Aspergillus niger, cultivate pe medii corespunzatoare, produc si pectinesteraze, pectat sau pectin liaze (Dinu si altii 1997, Dinu si altii 1998). Alte specii de fungi producatoare de enzime pectinolitice sunt: Botrytis cinerea (ten Have si altii 2001, Rho si altii 2001), Fusarium sp. (Garcia-Marceira si altii 2001, Niture si altii 2001), Penicillium sp. (Chelegatti si altii 2000), Verticillium sp. (James si altii 2001). Diferite specii de bacterii, (Cellovibrio, Clostridium, Erwinia, Lactobacillus, Pseudomonas), produc una sau mai multe tipuri de enzime pectinolitice. Echipamentul pectinolitic al acestora este diferit de cel al fungiilor. Bacteriile si fungii secreta poligalacturonaze si pectinesteraze. Diferenta între cele doua clase constâ în tipul de enzime care actioneaza asupra polizaharidelor pectice prin mecanisme de transeliminare: pectin liazele sunt enzime caracteristice fungilor, iar pectat liazele apar cu precadere la bacterii. Enterobacteria Erwinia chrysanthemi realizeaza degradarea substantelor pectice din peretii celulari ai plantelor invadate prin intermediul mai multor tipuri de enzime: pectin metilesteraza, pectin acetilesteraza, pectat liaza si pectin liaza. Erwinia chrysanthemi se caracterizeaza prin abilitatea de a secreta mai multe izoenzime ale endopectat liazei, izoenzime care au un rol major în procesele de putrezire a plantelor infestate cu aceasta bacterie. De la o tulpina de Erwinia chrysanthemi au fost caracterizate opt endopectat liaze, respectiv PelA, PelB, PelC, PelD, PelE, PelI, PelL si PelZ si o exopectat liaza, PelX. Primele cinci forme apartin familiei 1 de pectat liaze, familie care include pectat liaze bacteriene si pectin liaze fungice, enzime cu structura primara asemanatoare. PelI apartine familiei 2, familie în care sunt încadrate liaze de la Erwinia carotovora. PelL si PelX fac parte din familia 4, iar PelZ din familia 5.


169

Diversificarea biotehnologiilor care utilizeaza enzime pectinolitice si nevoia tot mai mare de preparate enzimatice cu activitate pectinolitica complexa, au determinat gasirea de noi surse microbiene care sa produca astfel de enzime. Aceasta necesitate a determinat extinderea cercetarilor si la drojdii. Cercetari recente au aratat ca unele specii de drojdii, cultivate pe medii care contin substante pectice, sunt producatoare de enzime pectinolitice. Drojdia metilotrofa Candida boidinii biosintetizeaza poligalacturonaza, pectinesteraza, pectin si pectat liaza (Nakagawa si altii 2000), Kluyveromyces marxianus numai poligalacturonaza (Jia si altii 2000), iar unele specii de Saccharomyces - poligalacturonaza, pectinesteraza si pectin liaza (Gomes si altii 2001). Majoritatea enzimelor pectinolitice produse de microorganisme sunt inductibile. Fiecare tip de enzima are inductori specifici. Penicillium frequentans, crescut pe medii în care sursa de carbon a fost pectina, poligalacturonatul de sodiu sau acidul galacturonic, a biosintetizat 11 poligalacturonaze si 3 pectinesteraze. Acelasi microorganism cultivat pe mediu de glucoza a produs 2 poligalacturonaze si o pectinesteraza (Chellegatti si altii 2000). Tehnica DNA recombinat a fost utilizata pentru a obtine tulpini înalt producatoare de enzime pectinolitice. Khahn (1991) a clonat gena care codifica pectinesteraza, a expresat-o la o tulpina salbatica de Aspergillus niger, ceea ce a condus la o crestere de douazeci de ori a activitatii esterazice. Genele care codifica endopoligalacturonaze fungice au fost clonate, secventializate si expresate la drojdii de tipul Saccharomzces cerevisiae si Kluyveromzces marxianus (Jia si altii 2000, Vilanova si altii 2000).

4. Enzimele pectinolitice de origine microbiana: specificitate,

mecanism de actiune, structura, proprietati 4.1. Pectinesterazele Pectinesterazele (EC 3.1.1.11) hidrolizeaza pectinele îndepartând grupari metoxi de la gruparile 6-carboxilice ale resturilor de acid galacturonic. Aceste enzime prezinta specificitate de grup, recunoscând din structura substratului partea D-galacturonica si legatura esterica. Elucidarea specificitaatii manifestate de pectinesteraze s-a realizat prin studii pe pectine modificate chimic. Studiile întreprinse cu pectine în care o parte din gruparile carboxil sunt reduse sau pe metilesterii acidului alginic au aratat imposibilitatea pectinesterazelor de a hidroliza astfel de substraturi. Aceste experimente au evidentiat înalta specificitate a acestor enzime fata de structuri poli-D-galacturonanice. Specificitatea fata de partea alcoolica este mai redusa, pectinesterazele fiind capabile sa hidrolizeze cu viteze mai mici, etil, propil si alil esterii acidului pectinic. Viteza de hidroliza a substratului este influentata si de gradul de policondensare al acestuia, diminuându-se odata cu scaderea acestuia (Rexová-Benková si altii 1976). Mecanismele prin care actioneaza pectinesterazele au fost elucidate pe baza experimentelor întreprinse de Miller si colaboratorii (1971). Studiile în acest sens au fost realizate pe pectina cu grad de policondensare 33 si grad de esterificare 96%. Substratul a fost supus initial actiunii unei exopectat liaze purificata din Clostridium multifermentans, enzima care actioneaza secvential de la capatul reducator. Actiunea liazei asupra substratelor înalt esterificate a fost neglijabila, dar a crescut rapid la aditia unei pectinesteraze purificate din Fusarim oxysporum. În urma acestor experimente, s-a tras concluzia ca, majoritatea actiunii esterazei decurge la capatul reducator al moleculei de pectina. Monitorizarea simultana si continua a celor doua tipuri de activitati pectinolitice a indicat ca 57% din activitatea pectinesterazei din Fusarim oxysporum decurge de la capatul reducator al substratului. Experimente similare întreprinse cu o proteina multienzimatica purificata din Clostridium

D. Dinu

170

multifermentans, care poseda activitate esterazica si exopectat liazica, au aratat ca, în cazul acestui microorganism, deesterificarea pectinei înalt metilate decurge exclusiv de la capatul reducator. Modul de actiune si specificitatea pectinesterazei din Aspergillus niger au fost studiate de Kester si colaboratorii (2000) utilizând oligogalacturonati total metilati cu grade de condensare cuprinse între 2 si 6 (Kester si colaboratorii 2000). Natura produsulor de reactie a fost determinata prin cromatografie de înalta performanta (HPLC) pe anioniti, iar localizarea gruparilor esterice, marcate în prealabil cu 18O , în structura produsilor de reactie a fost posibila prin spectrometrie de masa. Aceste studii au aratat ca pectinesteraza din Aspergillus niger este capabila sa hidrolizeze si digalacturonati total metilati. Enzima hidrolizeaza cu viteza mai mare legaturilre esterice localizate pe resturile de acid galacturonic din interiorul substratului. Dupa hidroliza acestor legaturi sunt eliberate gruparile metilice de la resturile de acid galacturonic de la capetele reducatoare ale oligogalacturonatilor, în timp ce gruparile de la capatul nereducator nu sunt hidrolizate. Unele dintre pectinesterazele microbiene au structura glicoproteica. Rijssel (1993) a izolat un complex pectinolitic din Clostridium thermosaccharolyticum care poseda activitate poligalacturonazica si pectinesterazica. Proteina complexa s-a dovedit a fi o glicoproteina cu resturi de N-acetil galactozamina si galactoza.. Pectinesteraza purificata de Shevchik si colaboratorii (1996a) din Erwinia chrysanthemi s-a dovedit a fi o lipoproteina din membrana externa, cu o secventa palmitat la extremitatea N-terminala. Experimentele de mutageneza dirijata realizate de Duwe (1996) pe pectinesteraza din Aspergillus niger au vizat doua resturi de histidina din structura enzimei. Substituirea restului de histidina din pozitia 137 cu un rest de alanina a avut ca efect pierderea totala a activitatii, în timp ce aceeasi substitutie la histidina din pozitia 188 nu a avut nici un efect. Pe baza acestor rezultate s-a tras concluzia ca restul de histidina din pozitia 137 este esentiala în activitatea catalitica, facând probabil parte din centrul catalitic activ. Markovic (1996) a evidentiat prezenta a sase resturi de histidina în structura pectinesterazei din Aspergillus niger. Tratamentul cu dietilpirocarbonat a aratat o inactivare a enzimei proportionala cu cantitatea de inhibitor. Aceste rezultate au sugerat ca histidina nu face parte din centrul catalitic al acestei enzime, dar este implicata în stabilizarea structurilor de ordin superior. Proprietatile pectinesterazelor de origine microbiana sunt prezentate în Tabelul 2. Cu exceptia enzimei din Clostridium multifermentans,, pectinesterazele de origine microbiana au mase moleculare cuprinse între 27 000 si 48 000 Da. Punctul izoelectric variaza între 3,6 si 7,4, iar pH-urile optime între 4,2 si 9,0. Constantele Michaelis variaza în limite largi, valorile acestora fiind influentate de modul de exprimare a concentratiei substratului. Acidul poligalacturonic este un inhibitor al pectinesterazelor. Datorita acestui fapt, cationii monovalenti (în special Na+ si K+) în concentratii cuprinse între 50 si 100mM, si cationii divalenti (în special Ca2+) în concentratii între 5 si 10mM, provoaca o crestere a activitatii specifice. Schejter (1988) a aratat ca poligalacturonatul de sodiu este un inhibitor competitiv pentru cele doua pectinesteraze din Botridis cinerea, constantele de inhibitie având valori de 2,8 si, respectiv, 0,11 mg/ml.

Manjou (1992) a determinat pentru o pectinesteraza microbiana o constanta de inhibitie a acidului poligalacturonic de 0,44 mg/ml. Studiile sale au aratat ca aceasta inhibitie dispare atunci când esteraza a fost coimobilizata pe suporturi de sticla poroasa cu o endopoligalacturonaza. Un alt inhibitor competitiv al acestor enzime s-a dovedit a fi si metanolul (Maldonado si altii 1994).


171

D. Dinu

172

Pectinesteraza II, izolata de Lim (1983) din culturi de Aspergillus oryzae a fost total inhibata de HgCl2. Alti inhibitori ai pectinesterazelor microbiene s-au dovedit a fi: CuCl2, AlCl3 (Lim si altii 1983, Sakelaris si altii 1989a), iodul (Markovic si altii 1989), reactivi pentru grupari SH de tipul N-etilmaleiimida, p-cloromercuribenzoatul de sodiu, iodacetamida (Lim si altii 1983, Cardello si altii 1995). 4.2. Protopectinazele Degradarea protopectinei a fost atribuita initial actiunii sinergice a pectinesterazei si endopoligalacturonazei si/sau pectin liazei. Studiile întreprinse de Sakai si colaboratorii sai au pus în evidenta capacitatea unor microorganisme de a produce o enzima care solubilizeaza protopectina. Aceasta noua enzima, denumita protopectinaza, degradeaza protopectina cu eliberare de polimeri pectici solubili, fara a produce macerarea tesuturilor plantelor. Cercetarile întreprinse de Sakai si grupul sau asupra acestei enzime, au fost sumarizate si publicate în volumul 161 din seria Methods in Enzymology (Sakai si altii 1988). Protopectinaza a fost purificata si cristalizata de Sakai (1988) din Kluyveromyces fragilis (protopectinaza F), Galactomyces reessii (proto-pectinaza L) si din Trichosporon penicillatum (protopectinaza S). Proprietatile fizice- chimice si cinetice ale acestor enzime sunt prezentate în Tabelul 3. Masele moleculare ale celor trei protopectinaze, estimate prin aceeasi tehnica, au avut valori foarte apropiate. Coeficientii de extinctie la 280nm (E280) au valori apropiate, dar nu identice, datorita diferentelor existente între cele trei protopectinaze la nivelul compozitiei în aminoacizi aromatici. Valorile pI indica ca protopectinaza F este o proteina acida, iar protopectinazele L si S sunt proteine bazice. Toate trei protopectinazele sunt glicoproteine, dar cantitatea de carbohidrati este diferita. Compozitia în aminoacizi, diferita pentru cele trei protopectinaze, are o caracteristica comuna: lipsa metioninei (protopectinaza L) sau prezenta ei în cantitate foarte mica (protopectinazele F si S au un singur rest de metionina în structura). Protopectinazele S si L au la capatul N-terminal un rest de glicina si o secventa identica de 27 resturi de aminoacizi. Datele prezentate în Tabelul 3 arata asemanari la nivelul unora dintre proprietati, mai ales între protopectinazele L si S, enzime care s-au dovedit a fi identice din punct de vedere imunologic. Pentru toate cele trei protopectinaze poligalacturonatul de sodiu s-a dovedit a fi un substrat mai bun decât protopectina de diferite proveniente. Utilizând ca substrate tri-, tetra- si pentagalacturonati, Sakai (1988) a determinat modul de actiune si constantele cinetice pentru cele trei protopectinaze (Figura 3). Rezultatele obtinute au evidentiat o actiune similara a protopectinazelor F, L si S asupra substratelor cu 3 si 4 resturi de acid galacturonic. Hidroliza trigalacturonatului decurge prin îndepartarea unui rest de acid galacturonic de la capatul reducator, iar degradarea tetragalacturonatului decurge prin eliminarea unei molecule de acid galacturonic sau de digalacturonat de la capatul reducator (Figura 3).

Modul de actiune asupra pentagalacturonatului a fost diferit. Astfel, protopectinazele F si S îndeparteaza o molecula de acid galacturonic sau una de digalacturonat de la capatul reducator al moleculei pentagalacturonice, în timp ce protopectinaza L îndeparteaza doar un rest de acid galacturonic din structura acestui oligogalacturonat. Pe baza raportului Vmax / KM , numit coeficient specific, Sakai (1988) a demonstrat ca specificitatea celor trei enzime pentru substrate creste în ordinea tri-, tetra- si penta-galacturonati. În ceea ce priveste actiunea asupra poligalacturonatilor, modul de scindare depinde si de gradul de policondensare. Când cele trei protopectinaze au actionat asupra acidului poligalacturonic, produsii de reactie obtinuti au avut 2-3 resturi de acid galacturonic în structura. Când substratul a fost o pectina cu grad de metilare de 30%, produsii au avut 4-5 resturi de acid galacturonic în structura; utilizarea unei


173

pectine cu grad de metilare de 70% a condus la obtinerea de produsi având între 9 si 15 resturi de acid galacturonic în structura. Pe baza acestor rezultate, Sakai (1988) a sugerat posibilitatea ca aceste enzime sa reactioneze cu protopectina la situsuri care contin trei, sau mai multe resturi de acid galacturonic nemetilate si sa scindeze hidrolitic substratul.

Tabelul 3. Proprietatile protopectinazelor F, L si S

Proprietate F L S Masa moleculara relativa Electroforeza SDS-PAGE Gel-cromatografie Echilibru de sedimentare E280 pI Continut în glucide (%) pH optim Temperatura optima(oC) Termostabilitate (oC) Stabilitate la pH Activitate ( U/mg) Protopectina Poligalacturonat KM (mg/ml) Protopectina Poligalacturonat*

Inhibitori

40 000 33 000 32 800

10,0 5,0 5,9a

5,0 60

pâna la 40 2-8

556

2 050

90 6,6

Hg2+,Hg+,Ag+

Ca2+,Ba2+,Pb2+

40 000 30 000 29 200 11,9

8,4-8,5 5,1b

5,0 55

pâna la 50 3-7

3 940

16 200

50 7,7

Hg2+,Hg+,Ca2+,Ba2+,Co2+

40 000 30 000 29 300

9,2 7,6-7,8

1,7a

5,0 50

pâna la 55 3-7

5 770

21 100

30 9,0

Hg2+,Hg+,Ca2+, Ba2+,Co2+

a determinat ca manoza; b determinat ca ramnoza * Poligalacturonatul utilizat a avut un grad de policondesare de 130. Experimentele realizate de Iguchi (1996) au evidentiat ca, sub actiunea radiatiilor γ se obtin mutante de Trichosporon penicillatum capabile de a produce trei protopectinaze cu proprietati asemanatoare, desemnate ca protopectinazele SE1, SE2 si SE3. Din filtratele culturilor de Bacillus subtilis au fost purificate protopectinaze (protopectinaze C) care nu actioneaza asupra acidului poligalacturonic. Una dintre acestea a avut o masa moleculara de 50 000 Da, pI 5.3 si a prezentat termostabilitate pâna la 70OC. Aceasta enzima a manifestat activitate protopectinazica pe fibre de bumbac si pe protopectina din lamâie, dar si activitate pectat liazica (Takao si altii 2000). Din culturile de Bacillus subtilis au fost izolate alte doua protopectinaze, una cu activitate ramnogalacturonazica (Sakai si altii 1993), iar cealalta cu activitate arabinazica (Sakamoto si altii 1995). Protopectinazele descrise în literatura manifesta specificitate diferita fata de protopectinele de diferite proveniente. Astfel, protopectinaza din Trichosporon penicillatum actioneaza cu viteze diferite asupra protopectinelor din portocale, grapefruit, cartofi, morcovi, pere, piersici (Sakamoto, 1995), si o degradeaza cel mai bine pe cea din cartofi (Nakamura, 1995). Protopectinaza din Bacillus subtilis degradeaza cel mai rapid protopectinele din morcovi (Nakamura, 1995).

Existenta unor enzime capabile sa degradeze protopectina, forma insolubila a polizaharidelor pectice, este contestata de multe cercetari din domeniu. Majoritatatea cercetarilor considera ca degradarea protopectinei se datoreaza actiunii sinergice a poligalacturonazei, pectinesterazei si pectat sau pectin liazei. Aceasta ipoteza se bazeaza pe faptul ca toate enzimele capabile sa actioneze asupra protopectinei izolate si caracterizate pâna în prezent poseda si o a doua functie catalitica. Aceasta a doua functie poate fi, de la caz la caz, poligalacturonazica, pectat liazica, ramnogalacturonazica sau arabinazica.

D. Dinu

174


175

4.3. Endopoligalacturonazele

Endopoligalacturonazele (EC 3.2.1.15) sunt enzime care hidrolizeaza legaturile

glicozidice din structura poligalacturonatilor într-o maniera mai mult sau mai putin întâmplatoare, formând oligogalacturonati. Actiunea acestor enzime determina scaderea pronuntata a vâscozitatii solutiei substratului. Endopoligalacturonazele actioneaza preferential asupra acizilor pectici si a pectinelor slab esterificate. Studiile întreprinse asupra endopoligalacturonazei purificate din Corticium rolfsii au aratat ca aceasta enzima scindeaza, în ordine, acidul poligalacturonic, pectina 67% esterificata si pectina 91% esterificata, cu viteze de 100%, 12% si, respectiv, 1,5%. Utilizarea acizilor pectinici în calitate de substrate a acestor enzime a condus la obtinerea de rezultate neconcludente, în structura acestora existând portiuni de resturi de acid galacturonic neesterificate, portiuni suficient de mari ca sa permita actiunea endopoligalacturonazei. Studiile întreprinse de Chen si colab. (1996) asupra produsilor de reactie obtinuti sub actiunea endopoligalacturonazei din Erwinia carotovora au evidentiat capacitatea acestei enzime de a hidroliza pectinele cu grade de metilare de 16%, 32% si 52%, care au în structura patru resturi adiacente de acid galacturonic. Marimea moleculei substratului este un factor care influenteaza activitatea acestor enzime. Ele actioneaza cu viteza maxima asupra substratelor cu numar mare de resturi de acid galacturonic, cu viteze reduse asupra oligogalacturonatilor si nu scindeaza digalacturonatul. Determinarea produsilor de reactie formati în fazele incipiente ale reactiei a permis diferentierea între endo si exo enzime: endopoligalacturonazele produc oligozaharide diferite si cantitati mici de mono-si digalacturonati, în timp ce exopoligalacturonazele produc mono si digalacturonati în cantitate mare. Lim (1980) a aratat ca endopoligalacturonaza din Rhizopus arrhizus nu produce oligomeri în primele 40 minute de reactie, iar molecule monomere de acid galacturonic apar abia dupadouaore. Elucidarea mecanismului prin care actioneaza aceste enzime s-a realizat în urma analizei produsilor de reactie obtinuti pe substrate polimere si oligomere. Rezultatele obtinute au aratat ca natura produsilor depinde de marimea regiunii de contact dintre substrat si situsul activ, marime care afecteaza constantele cinetice de reactie, KM si Vmax.. Astfel, sub actiunea endopoligalacturonazelor, pentru care marimea substratului este relativ neesentiala în legare, se formeaza cantitati mici de produsi intermediari, iar mecanismul dupa care actioneaza aceste enzime a fost denumit impropriu “single chain attack“. În cazul endopoligalacturonazelor, care se leaga mai puternic de poligalacturonatii cu mase mari decât de cei cu mase mici, concentratia produsilor intermediari este ridicata, mecanismul de actiune fiind denumit “multi-chain attack“. Studiind cinetica reactiei de hidroliza a substratelor sub actiunea endo-poligalacturonazei purificate din Saccharomyces fragilis, Demain (1954) a observat trei etape de reactie. În prima etapa, etapa care decurge rapid, sunt scindate aproximativ 25% din legaturile glicozidice din structura substratului cu eliberarea tetra-, tri- si digalacturonati. În etapa a doua, etapa mult mai lenta, gradul de hidroliza creste la 50%, iar tetragalacturonatii sunt hidrolizati la tri- si monogalacturonati. În ultima etapa, etapa foarte lenta, trigalacturonatii sunt scindati la digalacturonati si acid galacturonic. Pentru a explica diversitatea produsilor rezultati sub actiunea poligalacturonazelor de proveniente diferite, Rexová-Benková (1976) a propus trei modele care sa explice modul de actiune al poligalacturonazelor. Cele trei modele, numite A, B si C, sunt prezentate în Figura 4. Endopoligalacturonazele din Aspergillus niger si cele din Trichoderma reessi urmeaza modelul A, caracterizat prin scindarea tetramerilor la trimeri si acid galacturonic, si prin scindarea extrem de lenta a trimerilor. Modelul B, caracterizat printr-o scindare alternativa a tetramerilor (la trimeri si acid galacturonic sau la doua molecule de digalacturonat) si prin

D. Dinu

176

degradarea rapida a trimerilor, a fost evidentiat la endopoligalacturonazele din rosii. Modelul C, pus în evidenta pentru endo-enzima de la Erwinia carotovora, se deosebeste de celelalte mecanisme printr-o scindare specifica a pentamerilor si a hexamerilor. Având în vedere faptul ca modul de actiune si specificitatea de substrat a enzimelor depinde de natura situsului activ, Rexová-Benková (1976) a considerat ca endopoligalacturonazele care actioneaza dupa unul din cele trei modele au centre catalitice diferite, alcatuite dintr-un numar diferit de subsitusuri.

Studii recente (Bonnin si altii 2001) au evidentiat atacul multiplu asupra substratelor si în cazul endopoligalacturonazei din Fusarium moniliforme. Afinitatea si viteza maxima de reactie cresc cu cresterea lungimii catenei substratului. Situsul catalitic al enzimei este alcatuit din cinci subsitusuri, iar produsii finali de hidroliza ai homogalacturonanilor sunt monomeri si dimeri ai acidului galacturonic.

Stereochimia actiunii hidrolitice a doua endopoligalacturonaze din Aspergillus niger, a fost investigata de Biely (1996a si b) cu ajutorul spectroscopiei 1H-RMN. În mediu de D2O, toti produsii de reactie au avut noul capat reducator în conformatie β, fapt care arata actiunea invertiva a acestor enzime.

Model Substrat Produsi de reactie A O-O-O O-O-O-O O-O-O-O-O O-O-O-O-O-O

O-O + O O-O-O + O O-O-O-O + O O-O-O + O-O O-O-O-O-O + O O-O-O-O + O-O O-O-O + O-O-O

B O-O-O O-O-O-O O-O-O-O-O

O-O + O O-O-O + O O-O + O-O O-O-O-O + O O-O-O + O-O O-O + O-O-O

C O-O-O O-O-O-O O-O-O-O-O O-O-O-O-O-O

O-O + O O + O-O O-O-O + O O-O + O-O O-O-O + O-O O-O-O + O-O-O O-O-O-O + O-O

Figura 4. Posibilitati de actiune a endopoligalacturonazelor pe substraturi mici

(O reprezinta o molecula de acid galacturonic).

Pe baza studiilor de variatie a constantelor cinetice cu pH-ul, Rexová-Benková (1976) a sugerat implicarea în mecanismul de actiune al endopoligalacturonazei din Aspergillus niger a unei grupari carboxil si a unei grupari imidazol protonate a histidinei. Cercetarile intreprinse de Statilova si colab. (1996b) au evidentiat prezenta în structura situsului activ al endopoligalacturonazei de la Aspergillus niger a unui rest de tirozina, rest ionizat la pH 10,5. Studiile de modificare chimica a unor resturi de aminoacizi din structura endopoligalacturonazei din Aspergillus ustus au indicat participarea unui rest de triptofan în legarea substratului si a unui rest de histidina în actul catalitic (Rao si altii 1996 a si b, Niture


177

si altii 2001). Pe baza acestor studii, Rao si colab. (1996b) au presupus ca în mecanismul de actiune al acestei enzime are loc transferul unui singur proton de la restul de histidina la O glicozidic din structura substratului, transfer urmat de hidroliza prin aditia unei molecule de apa. Studiile structurale realizate de Statilová (1998b) au pus în evidenta caracterul glicoproteic al formelor multiple ale poligalacturonazei din Aspergillus niger. În structura celor doua forme majore ale poligalacturonazei sunt prezente resturi de N-acetilgalactozamina si manoza. Si endopoligalacturonaza din Aspergillus aculeatus s-a dovedit a fi o glicoproteina cu o structura secundara în care motivul predominant este β-structura paralela (Cho si altii 2001). Endopoligalacturonazele au fost purificate si caracterizate din mai multe surse microbiene. Proprietatile câtorva endopoligalacturonaze sunt prezentate în Tabelul 4. Aceste enzime au mase moleculare cuprinse între 30 000 si 85 000 Da, pI variind în domeniul 3,7-8,3. Toate endopoligalacturonazele au pH optim acid, cuprins între 3,8 si 5,5. Comparativ cu alte enzime pectinolitice, valorile KM pentru poligalacturonat variaza pe un domeniu destul de îngust, cuprins între 0,14 si 4,7 mg/ml. Efecte inhibitoare asupra endopoligalacturonazelor au urmatoarele substante: • HgCl2, cu o valoare a constantei de inhibitie de 6,8x10-5M (Blanco si altii 1994); • acidul tanic (Liu 1978 , Elegado 1994); • pectina, în concentratii de ordinul 10-3 g/100ml, determina o inhibitie competitiva

(Schejter 1988); • NaCl în concentratie de peste 1o/oo inhiba endopoligalacturonazele din bacteriile marine

(Mountfort 1995); • epicatechina, în concentratii cuprinse între 20-80 µg/ml, inhiba cu 6,5% si respectiv 43%

cele doua endopoligalacturonaze din Colletotrichum gloeosporioides (posibil ca epicatechina sa regleze activitatea endopoli-galacturonazelor fungice în fructele infestate) (Pruski 1989);

• CaCl2 si BaCl2, în concentratii de 5x10-3M, au efect inhibitor datorat precipitarii partiale a acidului poligalacturonic.

4.4. Exopoligalacturonazele

Exopoligalacturonazele (EC 3.2.1.67) hidrolizeaza poligalacturonatii cu eliberarea acidului galacturonic, producând o scadere mai redusa a vâscozitatii solutiei substratului comparativ cu endopoligalacturonazele. Actiunea exopoligalacturonazelor de origine vegetala si microbiana începe de la capatul nereducator al moleculei. Modul de actiune al acestor enzime a fost determinat pe baza observatiilor experimentale care au aratat ca, aceste enzime nu ataca substratele care au la extremitatea nereducatoare un rest de acid galacturonic ∆ 4:5 nesaturat sau un deoxizahar.

În literatura de specialitate au fost descrise si exopoligalacturonaze care ataca substratul la capatul nereducator cu eliberarea digalacturonatului. Astfel de enzime au fost izolate de la Erwinia aroideae si de la unele specii de Pseudomonas si au denumirea corectade poli-(1,4-α-D-galacturonid) digalacturonohidrolaza. Exopoligalacturonazele nu degradeazacomplet poligalacturonatii, activitatea lor depinzând de gradul de policondensare al acestora si de provenienta lor. Astfel, exopoligalacturonaza din Aspergillus tubingensis (Kester si altii 1996 a si b) a fost capabila sa hidrolizeze si oligogalacturonati cu grade de condensare cuprinse între 2 si 7, dar activitatea cea mai mare s-a înregistrat pe poligalacturonati cu mase moleculare mari.

D. Dinu

178


179

D. Dinu

180

Studiile întreprinse de Biely (1996a) au aratat ca exopoligalacturonaza din Aspergillus tubingensis, ca si endopoligalacturonazele din Aspergillus niger, determina modificarea configuratiei la nivelul gruparii reducatoare a produsului de reactie. Proprietatile fizico-chimice au fost stabilite pentru un numar mic de exopoligalacturonaze microbiene. Hara (1984) a izolat doua exopoligalacturonaze din culturile de Aspergillus niger. Exopoligalacturonaza I a avut masa molecularade 66 000 Da, pH optim 3,8, temperatura optima 600C, pI 5,6, KM pentru acid pectic de 20 mg/ml si de 6,5 mg/ml pentru acid digalacturonic. Exopoligalacturonaza II a avut masa molecularade 63 000 Da, pH optim 4,5, temperatura optima 600C, pI 5,8, KM pentru acid pectic 3,85 mg/ml si de 5,0 mg/ml pentru acid digalacturonic. Concentratii de HgCl2, cuprinse între 0,002M si 0,2M, au activat ambele enzime, dar mai ales forma moleculara I. Prezenta a doua exopoligalacturonaze în culturile de Aspergillus niger a fost evidentiatasi de Behere (1993). Ambele forme ale exo-enzimelor au avut pH optim de 5,0, iar valorile KM raportate la poligalacturonatul de sodiu au fost de 0,24% si 0,12%. Exopoligalacturonaza purificatade Heinrichova (1976) din culturi de Aspergillus niger a avut un pH optim de 5,2. Mikhailova (1995) a caracterizat doua exopoligalacturonaze din Aspergillus alliaceus. Exopoligalacturonaza I a avut pH optim 3,5 si temperatura optima 45-500C, iar pentru forma moleculara II acesti parametri au fost 6,8 si 350C. Cele doua exopoligalacturonaze izolate de Devi (1996) de la Aspergillus carbonarius au avut masele moleculare de 61 000 Da si, respectiv 47 000 Da, actionând optim la 430C, respectiv 540C. O alta specie producatoare de exopoligalacturonaza s-a dovedit a fi Aspergillus tubingensis (Kester 1996 a si b). Enzima din aceasta sursa a avut masa de 70 000 Da, pI cuprins între 3,7-4,4, pH optim de 4,2 si KM fata de acidul poligalacturonic de 3,2 mg/ml. Enzima a fost inhibata competitiv de acidul galacturonic (Ki= 0,3mM) si de acidul digalacturonic (Ki= 0,4mM) O tulpina de Fusarium oxysporum s-a dovedit a fi capabila sa produca patru exopoligalacturonaze cu valori pI de 9,3, 7,35, 6,85 si 6,55. Toate cele patru forme ale enzimei au fost inhibate de ionii de calciu (Guevara, 1997). O exopoligalacturonaza a fost purificata pâna la omogenitate din mediul de cultura al unei tulpini de Bacillus (Kobajashi si altii 2001). Enzima a avut o masa moleculara de 45 000 Da, pI 5,8 si o viteza maxima de actiune asupra poligalacturonatului de sodiu la 600C si pH 7,0. Spre deosebire de alte exopoligalacturonaze bacteriene, aceasta exopoligalacturonaza elibereaza doar acid monogalacturonic atunci când actioneaza asupra acidului poligalacturonic, di-, tri,-tetra- si penta –galacturonatilor. Cercetari recente (Antov si altii 2001) au studiat cultivarea microorganismului Polyporus squamosus într-un sistem apos bifazic, polietilen glicol/dextran, în prezenta melasei de sfecla de zahar ca sursa de pectina. În supernatantul mediului de cultura activitatea exopoligalacturonazica s-a dovedit a fi mai mare decât cea decelata în urma cultivarii în sistem monofazic.

Datele prezentate arata necesitatea unor studii mai detaliate asupra aceastei categorii de enzime pectinolitice. Singura proprietate care diferentiaza clar exopoligalacturonazele de oligogalacturonat hidrolaze (enzime prezentate în paragraful 4.5) este preferinta acestora pentru substrate cu mase moleculare mari. 4.5. Oligogalacturonat hidrolazele si oligogalacturonat liazele

Oligogalacturonat hidrolazele si oligogalacturonat liazele sunt enzime pectinolitice cu aplicatii practice reduse si destul de putin studiate.


181

Oligogalacturonat hidrolazele scindeaza legaturile glicozidice de la capatul nereducator al substratului. Aceste enzime difera de exopoligalacturonaze prin faptul ca manifesta activitate specifica mult mai mare fata de oligogalacturonati comparativ cu cea fata de poligalacturonati si pectati. Oligogalacturonat liazele (EC 4.2.2.6) actioneaza asupra oligogalacturonatilor saturati si nesaturati prin trans eliminare, îndepartând monomeri nesaturati de la capatul reducator al acestora. Pentru ambele tipuri de enzime, viteza de reactie descreste rapid cu cresterea gradului de policondensare, fiind de pâna la 400 ori mai mica pe substrate macromoleculare. În Tabelul 5 sunt prezentate tipurile de oligogalacturonaze pectice si specificitatea manifestata de acestea fata de diferite substraturi. Cercetari recente (Heinrichowa, 1992) au evidentiat biosinteza unei D-galacturonan digalacturonohidrolaze de catre Selenomonas ruminantium enzima capabila sa degradeze oligogalacturonati cu grade de condensare cuprinse între 3 si 5. Heinrichowa si colaboratorii (1994) au evidentiat ca Clostridium lochheadii produce un complex de enzime pectinolitice în structura caruia intra o galacturonat digalacturono hidrolaza (EC 3.2.1.82), o oligo-(D-galactoziduronat) liaza (EC 4.2.2.6) si o endopectat liaza (EC 4.2.2.2).

Tabelul 5. Proprietatile câtorva oligogalacturonaze microbiene dupa Whitaker (1990)

Microorganism Substratea,b PH optim

Oligogalacturonat hidrolazeBacillus sp. Bacillus sp

Aspergillus nigerc

Oligogalacturonat liaze Erwinia aroideae Erwinia carotovora Pseudomonas sp.

trimer > tetramer > pentamer > dimer > acid pectic solubil; n-dimer > n-trimer > n-tetramer > n-pentamer; dimer > acid pectic solubil > n-dimer; n-dimer > n-trimer > dimer > trimer > tetramer > acid pectic solubil; n-dimer > dimer > trimer > tetramer > pectat; tetramer >trimer > n-trimer > dimer > n-dimer > acid pectic solubil > pectat;

6,5

6,5

—

7,0

7,2

7,0

asubstratele sunt prezentate în ordinea vitezei cu care sunt scindate; bterminologia utilizata: dimer, trimer, tetramer, pentamer - substrate cu 2, 3, 4, respectiv 5 resturi de acid galacturonic; n-substrate nesaturate cu resturi de acid 4,5 dehidrogalacturonic la capatul nereducator; gradul de policondensare a acidului pectic solubil este de 15-20; c proteina poseda doua tipuri de activitati hidrolazice actionând asupra digalacturonatilor saturati si nesaturati.

D. Dinu

182

4.6. Endopolimetilgalacturonazele

Prezenta endopolimetilgalacturonazelelor (endopectin hidrolaze) la unele microorganisme a fost raportata de o serie de cercetatori; Friedurek (1983), Wick (1982), Reddy (1983), Silley (1985). Toate aceste cercetari nu au reusit sa evidentieze actiunea acestor enzime asupra poligalacturonatului 100% metilat în absenta pectinesterazei si pectin liazei. Datorita acestui fapt, existenta acestui tip de enzime este pusa sub semnul întrebarii. 4.7. Endopectat liazele

Endopectat liazele (EC 4.2.2.2) hidrolizeaza poligalacturonati îndepartând din structura acestora oligogalacturonati ∆ 4:5 nesaturati. Desi endopectat liazele si endopoligalacturo-nazele actioneaza asupra acelorasi tipuri de substrate, endopectat liazele se diferentiaza de endopoligalacturonaze prin patru trasaturi caracteristice:

• sunt biosintetizate numai de microorganisme, în special de bacterii si de fungii patogeni ai plantelor si alimentelor;

• au pH-uri optime alcaline; • prezenta ionilor de calciu este absolut necesara; • scindeaza legaturile glicozidice prin mecanism de trans eliminare, rezultând un

produs de reactie cu o dubla legatura între atomii de carbon 4 si 5 ai galacturonatului.

În general poligalacturonatii si pectinele slab metilate sunt substratele preferate ale endopectat liazelor. Exista totusi diferente de la o enzima la alta. Astfel, endopectat liazele izolate din doua tulpini de Arthrobacter si dintr-o tulpina de Bacillus polymyxa, actioneaza cu viteza cea mai mare asupra acizilor pectinici cu grade de esterificare de 21%, 44% si, respectiv, 26% (Whitaker si altii 1990). Studiile întreprinse de Bruhlmann (1995) au aratat ca endopectat liaza, biosintetizata de o specie nesporulanta de Amycolata, degradeaza poligalacturonatii prin trans eliminare întâmplatoare, produsii intermediari fiind o gama larga de oligogalacturonati 4,5 nesaturati. Acesti produsi intermediari sunt scindati în continuare sub actiunea catalitica a enzimei, produsii finali ai reactiei fiind de tipul dimerilor si trimerilor. Activitatea endoliazica scade cu scaderea lungimii catenei substratelor, majoritatea endopectat liazelor degradând extrem de lent trigalacturonatii si tetragalacturonatii nesaturati. Pe baza acestor constatari experimentale, Rexová-Benková (1976) a propus doua tipuri de mecanisme de actiune diferite (modele A si B). Endopoligalacturonazele care actioneaza dupa modelul A au ca substrate limita trigalacturonatii nesaturati, în timp ce enzimele apartinând modelului B nu pot scinda acesti trimeri nesaturati. Un mod de actiune diferit a fost evidentiat de Preston (1992) în cazul formelor moleculare ale endopectat liazei din Erwinia chrysanthemi. Forma moleculara notata PLa actioneaza prin mecanism random, conducând la formarea mai multor tipuri de produsi, de la dimeri la decameri. Formele PLb si PLc genereaza trimeri si tetrameri printr-o combinatie de mecanisme endolitice si exolitice. Forma PLd produce prioritar dimeri si actioneaza printr-un mecanism endolitic non random. Dintre toate enzimele pectinolitice, endopectat liazele au fost cel mai mult investigate din punct de vedere al structurii. Comparând secventele de aminoacizi ale celor cinci pectat liaze produse de Erwinia chrysanthemi, Tardy (1997) a pus în evidenta existenta a doua familii enzimatice cu proprietati diferite. Prima familie include formele moleculare de tip B si C, forme care pot actiona numai asupra pectinelor slab metilate si au o afinitate de 10 ori mai


183

mare pentru aceste substrate decât endopectat liazele apartinând familiei a doua. Cea de a doua familie include formele A, D si E, forme active si pe substrate al caror grad de metilare ajunge pânala 45%. Studiile de difractie cu raze X au evidentiat prezenta în structurile de ordin superior ale pectat liazelor C si E din Erwinia chrysanthemi, a unui nou tip de domeniu structural care a fost numit β-helix paralel (Yodler si altii 1993a si b). Structura tridimensionala a endopectat liazei C cuprinde numai β-structuri paralele, structuri care sunt pliate într-o spirala rasucita spre dreapta (“large right handed coil“). Divizarea structurii tertiare în elemente de structura secundara a aratat prezenta a trei β-structuri paralele. Doua din aceste structuri sunt pliate una fata de cealalta antiparalel, rezultând o structura de tip β-sandwich, iar cea de a treia este perpendiculara pe acest β-sandwich. Pectat liaza E din Erwinia chrysanthemi a avut o structura tridimensionala asemanatoare cu cea a formei C (Lietzki si altii 1994). Studiile de mutageneza dirijata realizate de Jurnak (1996) au evidentiat ca pectat liazele C si E, proteine similare din punct de vedere al plierii globale, prezinta diferente semnificative în cea ce priveste marimea si configuratia regiunilor “loop“ din structura. În aceste regiuni de tip “loop“ sunt localizate situsurile active ale enzimelor. Studiul structurilor tridimensionale ale endopectat liazelor C si E a evidentiat existenta a doua centre catalitice diferite responsabile pentru activitati diferite (Henrissat si altii 1995). Analiza structurii tridimensionale a pectat liazei din Bacillus subtilis în complex cu calciul, a evidentiat existenta unui domeniu β-helix paralel si a unei regiuni de tip “loop“, între care existao cavitate la nivelul careia ar putea fi localizat situsul catalitic activ. Situsul catalitic activ al acestei enzime are în structura un rest de arginina (Pickersgill si altii 1994). Endopectat liaza din Aspergillus niger are o structura asemanatoare cu cea a pectat liazelor C si E produse de Erwinia chrysanthemi si este o proteina cu doua functii catalitice (Heffron si altii 1995). Studiile de modificare chimica a unor resturi de aminoacizi din structura endopectat liazei biosintetizata de Fusarium moniliforme, au evidentiat implicarea unui rest de tirozina în legarea substratului si a unui rest de lizina (situat în/sau lânga centrul catalitic activ) în mecanismul catalitic (Rao, 1996a). Proprietatile câtorva endopectat liaze microbiene sunt centralizate în Tabelul 6. Aceste enzime se caracterizeaza prin pH-uri optime de actiune situate în domeniul bazic si prin valori KM destul de mici. Studiile întreprinse de Tierny (1994) au evidentiat modificarea proprietatilor pectat liazei de la Bacteroides thetarotaomicron atunci când gena acesteia a fost clonata la Echeria coli. Aspergillus niger, în culturi în faza solida (solid-state fermentation) în care sursa de carbon a fost un amestec de tarâte de grâu si borhot de sfecla, s-a dovedit a fi capabil sa produca doua endopectat liaze cu actiune în domeniul acid de pH. Endopectat liaza I, enzima cu masa de 41 700 Da si KM pentru pectatul de sodiu 6,25 mg/ml, a actionat cu viteza cea mai mare la pH 6,0. Endopectat liaza II, enzima cu masa de 30 200 Da si KM pentru pectatul de sodiu 1,35 mg/ml, a actionat cu viteza cea mai mare la pH 4,8 (Dinu si altii 1998, Dinu 1997).

Endopectat liazele sunt activate de ioni de Ca2+. Studiile de spectrometrie de emisie atomica au aratat ca acest ion este o parte a holoenzimei. Calciul se leaga de proteina la nivelul gruparilor carboxil din structura acesteia, dar prezenta acestui ion nu afecteaza legarea substratului la enzima (Rao si altii 1996a). Ionii de Ba2+, Co2+, Cu2+, Mg2+, Mn2+, Sr2+, Zn2+ nu afecteaza activitatea endopectat liazica (Tardy si altii 1997). Inhibitori ai endopectat liazelor s-au dovedit a fi ionii bivalenti de mercur, EDTA si doi compusi din plante, epicatechina si acidul salicilic (Tardy si altii 1997).

D. Dinu

184


185

4.8. Exopectat liazele Exopectat liazele (EC 4.2.2.9) scindeaza penultima legatura glicozidica din structura poli-D-galacturonatilor cu începere de la capatul reducator al acesteia si elibereaza molecule de acid digalacturonic ∆4:5 nesaturate. Prezenta exopectat liazelor a fost semnalata doar la câteva microorganisme: Clostridium multifermentans, Erwinia aroideae, Erwinia dissolvens, Fusarium culmorum, Streptomyces nitrosporeus (citate dupâ Whitaker 1990). Guevara (1997) a pus în evidenta existenta a doua exopectat liaze la Fusarium oxisporum sp. radicis lycopersici, proteine cu pI de 8,65 si, respectiv, 9,0. pH-ul optim al acestor enzime este cuprins între 8,0 si 9,0. Cu exceptia enzimelor izolate de la speciile de Erwinia, toate celelalte au necesitate absolutapentru ionii de calciu. Exopectat liazele nu manifestapreferintafatade marimea moleculei substratului, poligalacturonatii si oligogalacturonatii, inclusiv trigalacturonatii, fiind degradati cu aproximativ aceeasi viteza. Exopectat liaza din Clostridium multifermentans face parte, alaturi de o pectinesteraza, dintr-o proteina complexa având masa de 400 000 Da. Cele doua enzime din acest complex actioneaza sinergic în degradarea pectinelor (Miller si altii 1970). 4.9. Pectin liazele

Pectin liazele (EC 4.2.2.10) manifesta specificitate pentru substrate înalt esterificate, actiunea lor aleatoare conducând la formarea de oligo-D-galacturonati nesaturati. Majoritatea pectin liazelor purificate si caracterizate sunt de origine fungica. Activitatea acestui tip de liaze este afectata de distributia gruparilor esterificate în catena poli-D-galacturonanica. Studiile realizate pe substrate cu diferite grade de esterificare si cu o distributie diferita a gruparilor esterificate, au aratat o activitate mai mare asupra substratelor deesterificate enzimatic comparativ cu cea manifestata pe substrate deesterificate în mediu alcalin. Pectinele deesterificate enzimatic au o distributie regulata a gruparilor esterice, în timp ce deesterificarea chimica conduce la o distributie statistica a acestor grupari. Pectinele înalt esterificate sunt cele mai bune substrate pentru pectin liaze. Pectatii, amidele acidului pectic si glicilesterii pectinei nu sunt degradati de pectin liaze. Modul de actiune al pectin liazelor (Figura 5) a fost pus în evidenta prin analiza produsilor rezultati în urma scindarii tetra-, penta- si hexa-galacturonatilor.

Substrat Produsi de reactie O-O-O + •-O-O O-O-O-O-O-O O-O + •-O-O-O O-O-O-O-O O-O + •-O-O O-O-O-O O + •-O-O

O – rest de acid galacturonic esterificat • − rest de acid galacturonic esterificat, cu o dubla legatura între C4 si C5

Figura 5. Modul de actiune al pectin liazelor.

D. Dinu

186

Câteva din proprietatile pectin liazelor microbiene sunt prezentate în Tabelul 6. Analiza datelor prezentate în acest tabel arata ca majoritatea pectin liazelor au pH-ul optim în domeniul acid si valori mici ale constantei Michaelis. Aproximativ 10% din pectin liazele izolate si caracterizate s-au dovedit a fi enzime care actioneaza la pH alcalin. O pectin liaza cu afinitate mica este enzima izolata din Penicillium italicum, enzima cu KM mare fata de pectina 86% metilata (15 mg/ml), dar si cu activitate catalitica mare. Afinitatea scazuta a acestei enzime a fost explicata de Alana (1991) prin repulsiile electrostatice care apar între enzima si substrat, ambele fiind încarcate negativ la pH 9,0. Dupa depasirea dificultatilor de formare a complexului enzima-substrat, activitatea catalitica este mare. Proprietatile pectin liazei din Penicillium italicum s-au modificat în urma imobilizarii covalente pe nylon (Alkorta si altii 1996). Cresterea stabilitatii enzimei imobilizate a permis utilizarea acesteia în 12 cicluri de degradare a pectinei. Manifestarea activitatii catalitice a pectin liazelor nu necesita neaparat prezenta ionilor de calciu în mediu (exceptie enzima din Fusarium oxysporum), dar ionii divalenti de calciu, cupru, magneziu, mangan si mercur, în concentratie 2mM, s-au dovedit a fi activatori pentru unele pectin liaze (Lim si altii 1983). Activitatea pectin liazica s-a dovedit a fi inhibata de: acidul p-cloromercuri-fenil-sulfonic, anhidrida maleica, N-etilmaleimida (Manachini si altii1988) si de unii hormoni ai plantelor sau analogi ai acestora. Mikhailova (1994) a aratat ca unele specii de Penicillium produc forme moleculare ale pectin liazelor care difera din punct de vedere al controlului biosintezei. Unele dintre acestea sunt represate de glucoza si depresate prin intermediul AMP ciclic. Fuziunea protoplastilor de la fungii pectinolitici de tipul Aspergillus a condus la obtinerea a patru hibrizi cu activitati endopoligalacturonazice, exopoligalacturonazice si pectin liazice nemodificate (Solis si altii 1997). O bacterie endofilica izolata de pe suprafata sâmburilor de cirese s-a dovedit ca produce o pecin liaza cu actiune optima la 400C si pH 7,9 si o valoare KM fata de pectina de 4,5 mg/ml (Sakiyana si altii 2001).

5. Importanta si utilizarile enzimelor pectinolitice 5.1. Implicatiile enzimelor pectinolitice în fiziologia si patologia plantelor

Conversia protopectinei, substanta parentala, insolubila în apa, la pectina solubila si pectat si, ulterior, la produsii lor de degradare, este un proces cu rol important în maturarea si infectarea plantelor.

La plante, protopectina are rol de adeziv intracelular, transformarea sa în forme solubile determinând o scadere a rigiditatii tesuturilor reflectata prin înmuierea si, ulterior, prin lichefierea materialului plantei. Chiar daca mecanismul acestei conversii nu este pe deplin elucidat, este evident faptul ca în aceste procese un rol major îl au enzimele pectinolitice ale plantelor si ale patogenilor, primele fiind implicate în schimbarile fiziologice, iar celelalte în alterarile patologice.

Paralelismul între cresterea activitatilor pectinesterazice si endopoli-galacturonazice, pe de o parte, si formarea pectinelor solubile în apa, pe de alta parte, paralelism observat în cursul maturarii fructelor,indica o strânsa corelatie între aceste doua procese. În fructele necoapte prezenta endopoligalacturonazei nu a fost depistata, iar activitatea pectinesterazica este foarte mica. Cele doua activitati încep sa creasca, existând o corelatie între cresterea acestora si gradul de coacere. În fructele rosiilor transgenice, la care este expresat un RNA antisens pentru poligalacturonaza, activitatea poligalacturonazica este foarte mica, ajungând pâna la 1% din cea depistata în fructele normale (Langley si altii 1994, Grierson si altii 1994).


187

D. Dinu

188

Expresia unei gene antisens pentru pectinesteraza, a determinat o scadere de 10 ori a activitatii pectinesterazice în rosii (Treman si altii 1994). Rosiile transgenice au unele proprietati modificate, proprietati care sunt exploatate în procesele de stocare si prelucrare a acestora. Enzimele pectinolitice joaca un rol important în interactia micro-organismelor cu plantele superioare, interactie cu efecte multiple asupra tesuturilor plantelor. Câteva dintre aceste efecte sunt:

• macerarea si distrugerea celulelor (Salinas si altii 1995, Federici si altii 2001) • aparitia reactiilor de aparare ale plantei contra patogenului; • peretii celulari devin mai succeptibili la atacul altor polizaharidaze microbiene; • cresterea concentratiei de etilena, hormon care produce caderea fructelor

(Agravante si altii 1991). Bolile plantelor cauzate de patogeni sunt procese complexe la care participa mai multi factori. Mecanismul inducerii patogenicitatii este asociat cu o interactie între patogen si peretele celular polizaharidic al gazdei, interactie care influenteaza productia de enzime care degradeaza peretele celular (Alghisi si altii 1995, Yang si altii 1994). Rolul direct al enzimelor pectinolitice produse de patogen în procesul de infectie este indicat prin:

• capacitatea tuturor patogenilor cunoscuti de a produce enzime pectinolitice (Rodriguezpalenzuela si altii 1991);

• corelatia directa între productia acestor enzime si virulenta observata (Erampalli si altii 1995);

• prezenta enzimelor pectinolitice produse de patogen în tesuturile plantelor infestate (Chilosi si altii 1997).

Productia de enzime pectinolitice, în particular a celor cu mecanism “random“, de catre patogen este una din conditiile esentiale pentru succesul infectiei. Aceste enzime determina o alterare a peretelui celular, facând posibila penetrarea patogenului în plantele gazda. O mutanta de Colletotrichum magna deficitara în secretia extracelulara a pectat liazei s-a dovedit a fi nepatogena, desi acest microorganism este cunoscut ca fiind un patogen major al fructelor de avocado (Wattad si altii 1995). Capacitatea microorganismelor de a produce enzime pectinolitice “in vitro“ nu este o dovada a patogenicitatii lor, unele dintre ele fiind capabile sa produca aceste enzime pe medii sintetice, neavând capacitatea de a le produce “in vivo“. În procesele de infectie un rol important îl are susceptibilitatea sau rezistenta plantei la efectele patogenului (Baayen si altii 1997) Recent, un grup de cercetatori canadieni (Laurent si altii 2000) au reusit sa obtina anticorpi policlonali fata de o pectinesteraza produsa de o gena de la Erwinia chrysanthemi expresata la de E. coli. Acesti anticorpi nu au interactionat cu pectinesterazele fungice sau cu cele produse de plante, cea ce face posibila utilizarea lor în identificarea timpurie a interactiei planta-patogen. La plante au fost puse în evidenta mai multe mecanisme de protectie contra infectiior microbiene. Câteva dintre acestea sunt:

• conversia acidului pectic la pectatul de calciu rezistent la actiunea enzimelor pectinolitice;

• efectul inhibitor asupra enzimelor pectinolitice exercitat de unele substante din plante: acidul cafeic, antocianidinele, epichatechina, compusi fenolici acidul salicilic, zaharoza (Tardy si altii 1997 );

• inhibitia enzimelor pectinolitice de catre hormonii plantelor sau de analogi ai acestora (Chilosi si altii 1997);


189

• biosinteza unor inhibitori proteici naturali ai enzimelor pectinolitice, inhibitori care formeaza complexe cu enzimele pectinolitice si care contraataca actiunea nociva a acestora.

Proteinele cu efect inhibitor asupra poligalacturonazelor microbiene au fost purificate si caracterizate din fructe si vegetale.

Din zmeura necoapta a fost izolata o proteina cu masa moleculara de 38 500 Da, care inhiba necompetitiv doua endopoligalacturonaze produse de Botrytis cinerea si o endopoligalacturonaza din Aspergillus niger (Johnston si altii 1993).

Perele au o glicoproteina cu masa moleculara de 43 000 Da care inhiba diferentiat formele moleculare ale endopoligalacturonazei din Botrytis cinerea (Stotz si altii 1993)

Din seminte germinate de soia a fost izolata o proteina care interactioneaza diferit endopoligalacturonazele din Sclerotinia sclerotiorum si Aspergillus niger (Flavaron si altii 1994).

Fructele de mar a fost pusa în evidenta o proteina heterogena, având grade diferite de glicozilare, care inhiba diferit cele cinci forme ale poligalacturonazelor din Botrytis cinerea (Yao si altii 1995).

Cu ajutorul unui biosensor, Mattei (1997) a aratat existenta unei afinitati diferite între inhibitorul proteic izolat din Phaseolus vulgaris si diferite endopoligalacturonaze obtinute prin mutageneza dirijata din Fusarium moniliforme. Resturile de arginina, lizina si histidina din structura acestui inhibitor joaca un rol esential în interactii cu poligalacturonaza (Federici si altii 2001). Un inhibitor proteic natural al pectinesterazelor a fost izolat si din fructele de kiwi. Inhibitorul s-a dovedit a fi o glicoproteina care este biosintetizata sub forma unui precursor inactiv în fructele necoapte (Giovane si altii 1995, Camardella si altii 2000). Mecanismul prin care aceste proteine inhiba activitatea enzimelor pectinolitice nu este cunoscut. 5.2. Aplicatii biotehnologice ale enzimelor pectinolitice Enzimele pectinolitice, singure sau în amestec cu alti biocatalizatori, sunt utilizate pe scara larga în diferite procese biotehnologice. Enzimele pectinolitice sunt absolut necesare în extractia, clarificarea si depectinizarea sucurilor de fructe (Alkorta si altii 1995, Chang si altii 1995, Meyer si altii 2001). Clarificarea acestora decurge si sub actiunea enzimelor pectinolitice din fructe, dar procesul de autoclarificare este prea lent pentru a fi utilizat la scara industriala. În procesele industriale sunt utilizate preparate concentrate de enzime pectinolitice produse de microorganisme, preparate care realizeaza o degradare rapida a polimerilor pectici. Clarificarea diferitelor sucuri necesita actiunea sinergica a mai multor tipuri de enzime pectinolitice. Astfel, sucurile de mere au fost clarificate rapid prin combinarea activitatilor endopoligalacturonazice (din Aspergillus niger) si pectinesterazice (din Aspergillus oryzae). Exopoligalacturonazele nu au avut efecte în astfel de procese, aceste enzime fiind adsorbite în proportie destul de mare pe protopectina din mere (Hara si altii 1986). Sucurile de grapefruit, sucuri mai rezistente în procesele care implica degradarea polimerilor pectici, au fost clarificate cu ajutorul unei pectin liaze izolate din Aspergillus sojae (Ishii si altii 1973). Clarificarea sucurilor de citrice, sucuri cu pH foarte acid a putut fi realizata prin actiunea combinata a pectinesterazei ce se gaseste în aceste sucuri si a poligalacturonazei din Corticium rolfesii. Poligalacturonaza biosintetizata de Corticium rolfesii are o utilitate deosebita, deoarece ea actioneaza la un pH foarte scazut - 2,5 -, pH la care reactia enzimatica se desfasoara în conditii apropiate de cele aseptice (Tagawa si altii 1988).

D. Dinu

190

Actiunea combinata a enzimelor pectinolitice, celulazelor si hemicelulazelor poate conduce la lichefierea fructelor (Grassin si altii 1996) Enzimele pectinolitice sunt utilizate în procesele de vinificatie, mai ales pentru obtinerea vinurilor din soiuri de struguri bogate în substante pectice (Colagrande si altii 1994). Extractia aromelor si a pigmentilor vegetali se poate face cu ajutorul acestor enzime (Solehah si altii 1994) În procesele tehnologice care urmaresc prelucrarea boabelor de cafea în vederea obtinerii cafelei instant, utilizarea enzimelor pectinolitice s-a dovedit a fi eficienta (Vükari si altii 1993). Enzimele pectinolitice au fost utilizate pentru macerarea fructelor si vegetalelor, pentru obtinerea alimentelor pentru sugari si a piureurilor (Recourt si altii 1996, Dijkvan si altii 1996). Înmuierea mai rapida a fibrelor vegetale s-a realizat cu ajutorul enzimelor pectinolitice (Brumaro si altii 1993, Baracat-Pereira si altii 1993). O serie de studii au evidentiat îmbunatatirea calitatii tesaturilor atunci când fibrele de bumbac au fost tratate cu un amestec de hemicelulaze si pectinaze (Csizer si altii 2002, Sawado si altii 2001). Amestecuri de enzime pectinolitice din surse microbiene au fost utilizate în prelucrarea biomasei vegetale (Kravtchenko si altii 1993). Prin intermediul acestor enzime se realizeaza astfel curatirea mediului si reciclarea resurselor naturale. Deseurile rezultate în urma prelucrarii citricelor sunt bogate în glucide, fapt care permite utilizare lor pentru producerea furajelor. Tratarea acestor deseuri cu pectinesteraze microbiene are ca rezultat formarea pectatului de calciu concomitent cu aparitia asa numitului “fenomen de coagulare“. Acest fenomen usureaza îndepartarea apei, realizându-se si o economie de combustibil în procesele de uscare. Pectinesteraza din Penicillium felutatum a fost utilizata de catre Aizenberg (1996) pentru producerea pectinelor slab metilate, substante cu aplicatii în medicina si în producerea hranei pentru diabetici. Viteza cu care amidonul din plante este hidrolizat sub actiunea glucoamilazei produse de Aspergillus niger a fost crescuta în prezenta unui amestec de endopoligalacturonaza si pectinesteraza obtinut din specii de Rhizopus (Chitradon si altii 1996).

Multe procese biotehnologice folosite în industria alimentara se utilizeaza, alaturi de alte tipuri de enzime pectinolitice, pectinesteraza. Actiunea pectinesterazei conduce la eliberarea de metanol, substanta toxica pentru organismele animale. În acest sens au fost efectuate teste toxicologice pe diferite animale. Administrarea orala, timp de 13 zile, a unei cantitati de 10 g preparat proteic cu activitate pectinesterazica /kg corp, nu a afectat greutatea, semnele vitale, comportamentul sau parametrii biochimici ai sobolanilor (Lissau si altii 1998). Cu toate acestea, efectele fiziologice si nutritionale produse sub actiunea metanolului trebuie avute în vedere. Izolarea protoplastilor din plante necesita prezenta enzimelor pectinolitice, a celulazelor si hemicelulazelor (Ruesink si altii 1988). Lacours (1994) a aratat ca enzimele pectinolitice pot fi utilizate în caracterizarea taxonomica a speciilor de Gremmenniela. Castaldo (1996) a pus la punct o metoda enzimatica pentru dozarea concentratiilor de pectina cu ajutorul enzimelor pectinolitice. În aceasta tehnica, acidul D-galacturonic, rezultat din degradarea pectinelor sub actiunea pectinesterazei si a endopoligalacturonazei, este transformat în lactona sub actiunea unei glucuronolacton oxidaze. Acest proces este însotit de o scadere a absorbantei la 340 nm, scadere datorata oxidarii NADPH, cofactor al oxidazei. O metoda asemanatoare de determinare a concentratiei pectinelor din fructe si vegetale a fost pusa la punct de Yoskioka (1992).


191

Enzimele pectinolitice au fost întrebuintate si în sinteza acidului ascorbic (Kulbe si altii 1987). În acest sens, pectina din mere a fost convertita, sub actiunea pectinesterazei si endopoligalacturonazei, la acid D-galacturonic. Acidul galacturonic recuperat din hidrolizat prin electrodializa, a fost convertit la acid 2-ceto-L-galacturonic. Ciclizarea catalitica, acida sau bazica, a cetoacidului a condus la obtinerea acidului ascorbic. Studii recente (Ruiz-Teran si altii 2001) au aratat o extractie de 3 ori mai eficienta a glucovanilinei (substanta din care se obtine vanilina) din pastaile de mazare în prezenta enzimelor pectinolitice. Bibliografie 1. Agravante, J., Matsui, T., Kitagawa, H. (1991). Changes in pectin methylesterase,

polygalacturonase and pectic substances of ethanol and ethylene trated bananas during ripening. Nippon Skokukim Kogyo Gakkaishi, 38 , 127-132.

2. Aizenberg, V.L., Syrchin, S.A., Sedina, S.A., Shinkarenko, L.N., Demchenko,P.I., Vitte, P.N. (1996). Properties of pectinesterase from Penicillium fellutanum Biourge and new development in pectin applications. Prog. Biotechnol., 14 [ Pectins and pectinases], 947-954.

3. Alaña, A., Llama, M., Serra, J. (1991). Purification and some properties of the pectin lyase from Penicillium italicum. FEBS Lett., 280, 335-340.

4. Albersheim, P., Killias, U. (1962). Studies relating to the purification and properties of pectin transeliminase. Arch. Biochem.Biophys., 97, 107-115.

5. Albersheim, P. (1975). The wall of growing plants cells. Scientific American, 3, 81-95. 6. Alghisi, P., Favaron, F. (1995). Pectin degrading enzymes and plant parasite interactions.

Eur. J. Plant Pathol., 101, 365-375. 7. Alkorta, I., Garbisu, C., Llema, M.J., Serra, J.L. (1996). Immobilization of pectin lyase

from Penicillium italicum by covalent binding to nylon. Enzyme Microb. Technol., 18, 141-146.

8. Antov, M.G., Pericin, D.M., Dimic, G.R. (2001). Cultivation of Polyporus squamosus for pectinase production in aqueous two-phase system containing sugar beet extraction waste. J. Biotechnol., 91, 83-87.

9. Baayer, R.P., Schofffellmmeer, E.A.M., Toet, S., Elgersma, D.M. (1997). Fungal polygalacturonase activity reflects susceptibility of carnation cultivars to Fusarium wilt. Eur. J. Plant Pathol.,103, 15-23.

10. Barnavon, L., Doco, T., Terrier, N., Ageorges, A., Romieu, C., Pellerin, P. (2001). Involvement of pectin methyl-esterase during the ripening of grape berries: partial cDNA isolation, transcript expression and changes in the degree of methyl-esterification of cell wall pectins. Phytochemistry, 58, 693-701.

11. Baracat-Perreira, M.C., Santas, V.M.C., Fernandes de Aranjo,E., Olzany, S.D. (1993). Partial caracterization of Aspergillus fumigatus polygalacturonases for the degumming of natural fibers. J. Ind. Microbiol., 11, 139-140.

12. Barnby, F.M., Morpeth, F.F., Pyle, D.L. (1990). Polygalacturonases production by anaerobic fermentation of Klyveromyces maxianus. Enzyme Microb. Technol., 12, 891-897.

13. Beldman, G., Mutter, M., Searle-van Leeuwen, M.J.F., Van Den Broek, L,A.M., Schols, H.A., Voragen, A.G.J. (1996). New enzymes active towards pectic structures. Prog. Biotechnol., 14, [Pectins and pectinases],231-245.

14. Behere, A., Satyanarayan, V., Padwal-Desai, S.R. (1993). Separation and limited characterization of three polygalacturonases of Aspergillus niger. Enzyme Microb.Technol., 15, 158-161.

D. Dinu

192

15. Biely, P., Benen, J.A.E., Kester H.C.M., Heinrichova, K., Visser, J. (1996a). Srereochemistry of hydrolysis of glycosidic linkage by three Aspergillus polygalacturonases. Prog. Biotechnol., 19, 706-710.

16. Biely, P., Benen, J.A.E., Heinrichova, K., Kester H.C.M., Visser, J. (1996b). Inversion of configuration during hydrolysis of α-1,4-galacturonidic linkage by three Aspergillus polygalacturonases. FEBS Lett., 323, 249-255.

17. Blanco,P., Sieira, C., Diaz, A., Villa, T.G. (1994). Production and partial characterization of an endopolygalacturonase from S. Cerevisiae. Can.J. Microbiol., 40, 974-977.

18. Bonnin, E., Le Goff, A., Korner, R., Van Alebrek, G.W., Christensen, T.M., Voragen, A.G., Thibault, J. (2001). Study of the mode of action of endopolygalacturonase from Fusarium moniliforme. Biochem. Biophys. Acta, 1526, 301-309.

19. Braccini, I., Perez, S. (2001). Molecular basis of Ca 2+-induced gelation in alginates and pectins: the egg box model revisited. Biomacromolecules, 2, 1089-1096.

20. Bruhlmann, F. (1995). Purification and characterization of an extracellular pectate lyase from Amycolata sp. Appl. Environ. Microbiol., 61, 3580-3585.

21. Brumaro, M.H.N., Coelho, J.L.C., De Aranjo, E.F., Silva, D.A. (1993). Pectin lyase of P. griseoroseum related of deguming of ramie. J. Rev.Microbiol., 24, 175-178.

22. Camara Hurtado, M., Greve, L.C., Labavitch, J.M. (2002). Changes in cell wall pectins accompanying tomato (Lycopersicon esculentum Mill) paste manufacture. J. Agric. Food Chem., 50, 273-278.

23. Camardella, L., Carratore, V., Servillo, L., Giovane, A., Balestieri, C. (2000). Kivi protein inhibitor pectin methylesterase amino acid sequence and structural importance of two disulfide bridges. Eur. J. Biochem., 267, 1561-1565.

24. Capita, N.C., Defernez, M., Findlay, K., Wells, B., Shoue, D.A., Catchpole, G., Wilson, R.H., McCann, M.C. (2001). Cell wall aehitecture of the elongating maize coleoptide. Plant Physiol., 127, 551-565.

25. Cardello, L., Lourenco, E.J. (1995). Inhibitors of pectinesterases. Aliment. Nutr., 6, 25-37. 26. Chellegatli, M.A., Kawano, C.Y., Said, S., Fonseca, M.J. (2000). Sequential synthesis and

secretion of pectinases by penicillium frequentans. J.Basic Microbiol., 40, 319-326. 27. Chen, E.M.W., Mort, A.J, Andrews, J., (1996). Nature of sites hydrolyzable by

endopolygalacturonase in partially esterified homogalacturonans. Carbohydr. Polym., 29, 129-136.

28. Chilosi, G., Magro, P. (1997). Pectin lyase and polygalacturonase isoenzymes production by Botrytis cinerea during the early stages of infection on different host plants. J. Plant Pathol., 78, 61-69.

29. Chitradon, L., Poonpairoj, P., Mahakahan, P., Kitpreechavanich, V., Lotong, N. (1996). Pectinases from Rhizopus sp. efficient in enhancing the hydrolyzation of raw cassaya starch: purification and characterization. Prog. Biotechnol., 14 [Pectins and pectinases], 715-722.

30. Cho, S.W., Lee, S., Shin, W. (2001). The X-ray structure of Aspergillus aculeatus polygalacturonase and a modeled structure of the polygalacturonase-octopolygalacturonate complex. J.Mol.Biol., 311, 863-878

31. Colagrande, o., Silva, A., Fumi, M.D. (1994). Recent applications of biotechnology in wine production. Biotechnol. Prog., 10, 2-18.

32. Cooke, R.D., Ferber, E.M., Kanagasabapathy, H. (1976). Purification and characterization of polygalacturonase from a commercial Aspergillus niger preparation. Biochim. Biophys. Acta, 452, 440-44.

33. Cosgrove D.J. (1997). Assembly and enlargement of the primary cell wall in plants. Annu.Rev.CellDev.Bio., 13, 171-201


193

34. Crotti, L.B., Jorge, J.A., Terezi, H.T., Polizeli, M.L.T. (1996). Purification and characterization of galactase induced pectinase from the exo 1-mutant strain of Neurospora crassa. Prog. Biotechnol., 14 [Pectins and pectinases], 787-792.

35. Csiszar, E., Losonczi, A., Szabacs, G., Ruszuals, I., Reicher, J. (2001). Enzymes and chelating agent in cotton pretreatment. J. Biotechnol., 89, 271-279.

36. Demain, A.L., Phaff, H.J. (1954). J. Biol. Chem., 210 , 381-393, citati dupã Rexová-Benková, L., Marcovic, O. (1976). Pectic enzymes. In Advancces in carbohydrate chemistry and bichemistry, editori Tripton, R.S. si Horton, D., vol. 33, pag. 347.

37. Devi, N.A., Rao, A.G. (1996). Fractionation, purification and preliminary characterization of polygalacturonase from Aspergillus carbonarius. Enzyme Microb. Technol., 18, 59-65.

38. Dick, A.J. (1989). Cell wall metabolism in ripening fruit. Part II. Characterization of pectic polysaccharides solubilized during softening of Bartlett pear fruit. Plant Physiol.,89, 1394-1400.

39. Dijkvan, C. (1996). Pectins and pectolytic enzymes in relation to development and processing of green beans (Phaaseolus vulgaris L ). Prog. Biotechnol., 19, 399-404.

40. Dinu, D., Dumitru, I.F. (1997). Isolation and partial characterization of a pectinesterase from Aspergillus niger. Roum. Biotechnol. Lett., 2, 489-494.

41. Dinu, D., Dumitru, I.F. (1998). Studies concerning the purification and properties of pectate lyase isolated from Aspergillus niger. Roum. Biotechnol. Lett., 3, 23-29.

42. Dinu, D. (1999). Pectic enzymes produced by Aspergillus niger MIUG 16 in solid-state fermentation on wheat bran and beet draft.. Roum. Biotechnol. Lett., 4, 287-293.

43. Di Pietro, A., Roncero, M.J.G. (1996). Purification and characterization of a pectate lyase from Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici produced on tomato vascular tissue. Physiol. Mol. Plant Pathol., 49 , 177-185.

44. Duwe, B., Kha, N.G., Nguyen, Q. (1996). Site-directed mutagenesis of the active site of pectin methylesterase from Aspergillus niger RH 5344. Biotechnol. Lett., 18, 621-626.

45. Elegado, F.B., Fujio, Y. (1994). Purification and some properties of endopolygalacturonase from Rhizopus sp LKN. World J. Microbiol. Biotechnol., 10, 256-259.

46. Elumalai, R.P., Mahadevan, A. (1995). Characterization of pectate lyase produced by Pseudomonas marginalis and cloning of pectate lyase genes. Physiol. Molec. Plant Pathol., 46, 109-119.

47. Errampalli, D., Kohn, L.M. (1995). Comparison of pectic zymograms produced by produced by different clones of Sclerotinia sclerotiorum in culture. Phytopathology, 85, 292-296.

48. Federici, l., Caprari, C., Mattei, B., Sanno, C., Matteo, A., De Lorenzo, G., Cervone, F., Tsernoglou, D. (2001). Structural requirements of endopolygalacturonase for interaction with PGIP (polygalacturonase-inhibiting protein). Proc. Natl. Acad. Sci., 98, 13425-13430.

49. Fiedurek, J., Ilczuk, L. (1983). Acta Alimentaria Polonica, 9, 89-92, citat din Chemical Abstract, vol. 101, 166843f (1984).

50. Flavaran, f., Davidio, R., Porcedder, F., Alghidi, P. (1994). Purification and characterization of a soybeen polygalacturonase inhibiting protein. Planta, 195, 80-87.

51. Förster, H. (1988). Pectinesterases from Phytophthora infestans. In Methods in Enzymology, vol. 161, pag. 335-350.

52. Garcia-Maceira, F.I., Di Pietro, A., Huertes-Gonzalez, M.D., Ruiz-Roldau, M.I. (2001). Molecular characterization of an endopolygalacturonase from Fusarium oxysporum expressed during early stages of infection. Appl. Envirom. Microbiol. 67, 2191-2196.

D. Dinu

194

53. Gardner, J.M., Kado, C.I. (1976). Polygalacturonic acid transeliminase in osmotic shock fluid of Erwinia rubrifaciens: characterization of the purified enzyme and its effect on plant cells. J. Bacteriol., 127, 451-460.

54. Giovane, A., Balestieri, C., Quagliuolo, L., Castaldo, C., Servillo, L. (1995). A glycoprotein inhibitor of pectin methylesterase in kiwi fruits. Purification by affinity chromatography and evidence of a ripening related precursor. Eur. J. Biochem., 233, 926-929.

55. Gomes, S., Simon, G., Belarbi, A. (2001). Regulation of the expression of endopolygalacturonase gene PGU 1 in Saccharomices. Yeast, 18, 423-432.

56. Grassin, C., Fauquembergue, P. (1996). Application of pectinases in beverages. Prog. Biotechnol., 14, [Pectins and pectinases],453-462.

57. Guevara, M.A., Gonzales J.M.T., Estevez, P. (1997). Multiple forms of pectic lyase and polygalacturonase from Fusarium oxysporum f. sp. Radicis lycopersici: regulation of their synthesis by galacturonic acid. Can. J. Microbiol., 43, 245-253.

58. Hang, Y.D., Woodams, E.E. (1994). Production of fungal polygalacturonase from apple pomace. Food Sci . Technol., 27, 194-197.

59. Hara, T., Lim, J.Y., Fujio, Y. (1984). Purification and some properties of exo-polygalacturonase from Aspergillus niger cultured in the medium containg Satsuma mandarin peel. Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 31, 581-586.

60. Hara, T., Fujio, Y., Ueda, S. (1986). Clarification of apple with polygalacturonase of Aspergillus niger and pectinesterase of Aspergillus oryzae ang their protopectin adsorption and degradation behaviour. Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 33, 336-341.

61. Heinrichová, K., Rexová-Benková, L. (1976). Purification and characterization of an exo-D-galacturonase of Aspergillus niger. Biochim. Biophys. Acta, 422, 349-356.

62. Heinrichová, K., Dzurova, M., Rexová-Benková, L. (1992). Mechanism of action of D-galacturonan digalacturonohydrolase of Selenomonas ruminatium on oligo-galactosiduronic acids. Carbohydr. Res., 235, 269-280.

63. Heinrichová, K., Stachova, M. (1994). Pectinolytic enzymes of Clostridium lochheadii. Biologia (Bratislava), 49, 813-818.

64. Hennink, A., Ham, H., van Oort, M.G. (1996). Production, characterization and application of rhamnogalacturonase. Prog. Biotechnol., 14 [ Pectins and pectinases], 485-494.

65. Henrissat, B., Heffron, S.E., Yoder, M.D., Lietzke, S., Yurnak, F. (1995). Functional implications of structure-based sequence alignment of proteins in the extracellular pectate lyase superfamily. Plant Physiol., 107, 963-976.

66. Iguchi, K., Kishida, M., Sakai, T. (1996). Purification and characterization of three extracellular protopectinases with polygalacturonase activities from Trichosporon penicillatum. Biosci. Biotechnol. Biochem., 60, 603-607.

67. James, J.., Dubery, A. (2001). Inhibition of polygalacturonase from Verticillium dahliae by a polygalacturonase inhibiting protein from cotton. Phytochemistry, 52, 149-156.

68. Jia, J., Wheals, A. (2000). Endopolygalacturonase genes and enzymes from Saccharomices cerevisiae and Kluyveromyces maxianus. Curr. Genet., 38, 264-270.

69. Johnston, D.J., Rammanathan, V., Williamson, B. (1993). A protein from immature raspberry fruits which inhibits endopolygalacturonase from Botrytis cinerea and other microorganisms. J. Exp. Bot., 44, 971-976.

70. Jurnak, F., Kita, N., Garrett, M., Heffron, S.E., Scavetta, R., Boyd, C., Keen, N. (1996). Functional implications of the three-dimensional structures of pectate lyases. Prog. Biotechnol., 14, [Pectins and pectinases], 295-308.

71. Joyce, A.M., Fogarty, W.M. (1975). Proc.Soc. Gen. Microbiol., 3, 79-89, citati dupa Whitaker, J.R. (1990). Microbial pectolytic enzymes. In Microbial enzymes and


195

biotechnology (editia a 2 a), editori Fogarty, W.M. si Kelly, C., Elsevier Applied Science, London, pag. 157.

72. Kester, H.C.M., Kustters-van-Someren, M.A., Margo, A., Mueller, Y., Visser, J. (1996a). Primary structure and characterization of an exopoligalacturonase from Aspergillus tubingensis. Eur. J. Biochem., 240, 738-746.

73. Kester, H.C.M., Kustters-van-Someren, M.A., Muller, Y., Visser, J. (1996b). The exo-polygalacturonase from Aspergillus tubingensis: characterization and cloning of the gene. Prog. Biotechnol., 14 [ Pectins and pectinases], 817-823.

74. Kester. H.C.M., Benen, J.A., Visser, J., Orlando, R., Bermann, C., Magaud, D., Anker, D., Douthean, A. (2000). Tandem mass spectrometric analysis of Aspergillus niger pectin methylesterase: mode of action on fully methylesterified oligogalacturonates. Biochem. J., 349(part 2), 469-474.

75. Khahn, O.N., Ruthamski, E., Leidinger, K. (1991). Characterization and expression of a genomic pectin methylesterase-encoding gene in Aspergillus niger. Gene, 106, 717-720.

76. Kobajaschi, T., Higoki, N., Yajima, N., Suzumatsu, A., Hagilava, H., Kawai, S., Ito, S. (2001). Purification and properties of a galacturonic acid realising exopoligalacturonase from a strain of Bacillus. Biosci. Biotechnol. Biochem., 65, 842-847.

77. Koller, A., Neukom, H. (1969). Research on the degradation mecanism of a purified polygalacturonase from Aspergillus niger. Eur. J. Biochem., 7, 485-489.

78. Konno, H. (1988). Endopectate lyase from Erwinia aroideae. In Methods in Enzymology, editori Wood, W.A. si Kellogg S.T., vol. 161, pag. 381-385.

79. Kravtchenko, T.P., Penci, M., Voragen, A.G.J., Pilnik, W. (1993). Enzymic and chemical degradation of some industrial pectins. Carbohydr. Polym., 20, 195-205.

80. Kulbe, K.D. (1987). Enzymatic synthesis of L-ascorbic acid via D-uronic acids membrane-reactor integrated recovery of D-galacturonic acid from pectin hydrolysates. Ann. N.Y.Acad. Sci., 506, 543-551.

81. Lacours, N., Toti, L., Sieber, T.N., Petrini, O. (1994). Pectic enzyme patterns as a taxonomic tool for characterization of Gremmennielo sp. Isolates. Can. J. Bot., 74, 891-896.

82. Laangley, K.R., Martin,A., Stenning, R., Murray, A.J., Hobson, G.E., Schuch, W., Bird, C.R. (1994). Mecanical and optical assessment of the ripening of tomato fruit with reduced polygalacturonase activity. J. Sci. Food Agric., 66, 547-554.

83. Laurent, F., Kotoujansky A., Berteau, Y. (2000). Overproduction in E.Coli of pectin methylesterase from Erwinia chrysanthemi 3937: one-step purification, bichemical characterization, and production of polyclonal antibodies. Can. J. Microbiol., 46, 474-480.

84. Lietzki, S., Yader, K., Jurnak, F. (1994). The three-dimensional structure of pectate lyase E, a plant virulance factor from Erwinia chrysanthemi. Plant Physiol., 106, 849-862.

85. Lim, Y.K., Yamasaki, Y., Suzuki, Y., Ozawa, J. (1980). J. Agric.Biol., 44, 473-476, citati dupã Whitaker, J.R. (1990). Microbial pectinolytic enzymes. In Microbial enzymes and biotechnology (editia a 2 a), editori Fogarty, W.M. si Kelly, C., Elsevier Applied Science, London, pag. 151.

86. Lim, J.Y., Fujio, Y., Ueda, S. (1983). Purification and characterization of pectinesterase and pectin lyase from Aspergillus oryzae A-3. J. Appl. Biochem., 5, 91-98.

87. Lissau, B.G., Pedersen, P.B., Petersen, B.R., Budolfsen, G. (1998). Safety evaluation of a funga pectinesterase enzyme preparation and the use in food. Food Addit. Contam., 15, 627-636.

88. Liu, Y.K., Luh, B.S. (1978). Purification and characterization of endopolygalacturonase from Rhizopus arrhizus. J. Food Sci., 43, 721-726.

D. Dinu

196

89. MacKinnen, J.M., Jardine, W.G., O′Kennedy, N., Renard, C.M., Jarvis, M.C. (2002). Pectin methyl and nonmethyl esters in potato cell walls. J. Agric. Food Chem., 50, 342-346.

90. MacMillan, J.D., Phaff, H.J. (1966). Exo-polygalacturonase lyase from Clostridium multifermentans. In Methods in enzymology, editori Neufeld, E.F. si Ginsburg, V., Academic Press, vol. VIII, pag 632- 645.

91. Maldonado, M.C., Shasser de Sad, A.M., Callieri, D.A.S. (1994). Purification and characterization of pectinesterase produced by a strain of Apergillus niger. Curr. Microbiol. 28, 193-196.

92. Maldonado, M.C., Shasser de Sad, A.M. (1998). Production of pectinesterase and polygalacturonase by Aspergillus niger in submerged and solide state systems. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 20, 34-38.

93. Manachini, P.L. (1988). Pectic enzymes from Aureobasidium pullulans LV 10. Enzyme Microbiol. Technol., 10, 682-685.

94. Manjou, A., Ibarro, J.L., Romaro, C., Canovas, M. (1992). Properties of pectinesterase and endo-D-polygalacturonase coimmobilized in a porous glass support. Appl. Biochem. Biotechnol., 32, 19-31.

95. Marcovic, O. (1989). Biologia (Bratislava), 44, 1185-1189, citat din Chemical abstracts, vol. 113, 147666g (1990).

96. Marcovic, O., Stovicková, J., Joernvall, H. (1996). Modification of tomato and Aspergillus niger pectinesterase with diethyl pyrocarbonate.. Protein Chem., 15, 127-130.

97. Martel, M.B., Letoublon, R., Fevre, M. (1998). Purification and characterization of two endopolygalacturonase secreted during the early stages of the saprophytic growth of Sclerotinia Sclerotiorum. FEMS Microbiol. Lett., 158, 133-138.

98. Mattei, B., Salvi, G., Caprari, C., Lorrenzo, G., Crescenzi, V., Cervone, F. (1996). Analysis of interaction between PGIP from Phaseoleus vulgaris L anf fungal endopolygalacturonase using biosensor technology. Prog. Biotechnol., 14 [ Pectins and pectinases],775-782.

99. Mayer, A.S., Koser, C., Adler-Nissen, J. (2001). Efficiency of enzymatic and other alternative clarification and fining treatments and haze in chery. J. Agric. Food Chem., 49, 3644-3650.

100. Mc Millan, G.P., Idnston, D.I., Perombelon, M.C. (1992). Purification to homoganity of extracellular polygalacturonase and isoenzymes of pectate lyase of Erwinia carotovora, subs. atroseptica by column chromatography. J. Appl. Bacteriol., 73, 83-86.

101. Mikhailová, R.V., Sapunová, L.I, Lobanok, A.G. (1994). Biosynthesis of pectin lyases in Penicillium adametzi, Penicillium citricum, Penicillium janthinellum. Word J. Microbiol. Biotechnol., 10, 457-461.

102. Mikhailová, R.V., Sapunová, L.I, Lobanok, A.G. (1995). The three polygalacturonases constitutively synthesized by Aspergillus alliaceus. World J. Microbiol. Biotechnol., 11, 330-332.

103. Miller, L., Macmillan, J.D. (1970). Mode of action of pectic enzymes. II. Further purification of exopolygalacturonate lyase and pectinesterase from Clostridium multifermentans. J. Bacteriology., 102, 72-78.

104. Miller, L., Macmillan, J.D. (1971). Purification and pattern action of pectinesterase from Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum. Biochemistry, 10, 570-576.

105. Mountfort, D.O., Atkinson,M. (1995). Evidence for the role of Na+ ang galacturonic acid in the regulation of polygalacturonase production by marine anaerobe Eubacterium sp. Strain P-1. Botanica Marina, 38, 195-201.


197

106. Nakagawa, T., Miyaji, T., Yurimoto, H., Sakai, H., Kato, N., Tomizuko, N. (2000). A methylotrophic pathway participates in pectin utilization by Candida boidimii. Appl. Envirom. Microbiol., 66, 4253-4257.

107. Nakamura, T., Hours, R.A., Sakai, T. (1995). Enzymatic maceration of vegetables with protopectinases. J.Food Sci., 60, 468-472.

108. Nikaidou, N., Naganuno, T., Kamio, Y., Izaki, K. (1995). Production, purification, and properties of a pectin lyase from Pseudomonas marginalis N 6301. Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 320-324.

109. Niture S.K., Pant, A., Kuma, A.R. (2001). Active site characterization of the single endopolygalacturonase produced by F. moniliforme NCIM 1276. Eur. J. Biochem., 268, 832-840.

110. O’Neill, M., Albersheim, P., Darvill, A. (1990). The pectic polysaccharides of primary cell wall. În Methods in Enzymology, vol. 2, pag. 415-441.

111. Pickersgill, R., Jenkins, J., Nasser, H., Robert-Boudouy, J. (1994). The structure of Bacillus subtilis pectate lyase in complex with calcium. Nat. Struct. Biol., 1, 712-723.

112. Pitkanen, K., Heikinheimo, R., Pakkanen, R. (1992). Purification and characterization of Erwinia chtysanthemi B 374 pectin methylesterase produced by Bacillus subtilis. Enzyme Microb. Technol., 14, 832-836.

113. Preston, J.F., Rice, J.D., Jugan,O., Keen, N.T. (1992). Differential depolymerization mechanisms of pectate lyases secreted by Erwinia chrysanthemi EC 16. J. Bacteriol., 174, 2039-2042.

114. Prusky, D. (1989). Purification and characterization of an endopolygalacturonase produced by Colletotrichum gloeosporioides. Physiol. Mol. Plant Pathol., 35, 121-133.

115. Ralet, M-C, Dronnet, V., Buchholt, H.C. Thibault, J-F. (2001). Enzymatically and chemically de-esterfied lime pectins: characterization, polyelectrolyte behaviour and calcium binding properties.. Carbohydr. Res., 336, 117-125.

116. Rao, M., Narsimha, K., Asha, A., Pant, A. (1996a). Role of lysine, tryptophan and calcium in the β-elimination activity of a low molecular-mass pectate lyase from Fusarium moniliforme. Biochem. J., 319, 159-164.

117. Rao, M., Narsimha, K., Asha, A., Pant, A. (1996b). Implication of tryptophan anh histidine in the active site of endo-polygalacturonase from Aspergillus ustus: elucidation of the reaction mechanism. Biochim. Biophys Acta, 1296, 167-176.

118. Recourt, K., Stolle-Smith, T., Laats J.M., Beekhuizan, J.G., Eddelaan, C.E.M., Voragen, A.G.J., Wichers, H.I. (1996). Pectins and pectolytic enzymes in relation to development and processing of green beans (Phaseolus vulgaris L). Prog. Biotechnol.,

19, 399-404. 119. Reddy, S.R., Reddy, S.M. (1983). Comp. Physiol. Ecol., 8, 69, citati dupa Whitaker,

J.R. (1990). Microbial pectolytic enzymes. În Microbial enzymes and biotechnology (editia a 2 a), editori Fogarty, W.M. si Kelly, C., Elsevier Applied Science, London, pag. 155.

120. Reignault, P., Mercier, M., Bompeix, G., Boccara, M. (1994). Pectin methylesterase from Botrytis cinerea: physiological, biochemical and immunochemical studies. Microbiology., 140, 3249-3255.

121. Rexová-Benková, L., Marcovic, O. (1976). Pectic enzymes. In Advancces in carbohydrate chemistry and bichemistry,editori Tripton, R.S. si Horton, D., vol. 33, pag. 323-381.

122. Rexová-Benková, L., Mracková, M. (1978). Active groups of extracellular endo-D-galacturonase of Aspergillus niger derived from pH effect on kinetic data. Biochim. Biophys. Acta, 523, 162-169.

D. Dinu

198

123. Rho, E., Park, H.J., Kim, M.O., Chung, Y.R., Lee, C.W. (2001). Expression of exopolygalacturonase in Botrytis cinerea. FEMS Microbiol. Lett., 201, 105-109.

124. Rijssel, M., Geewig, J.G., Hansan,A.T.(1993). Isolation and characterization of an extracellular glycosylated protein complex from Clostridium thermossaccharolyticum with pectic methylesterase and polygalacturonate hydrolases activities. Appl. Environ. Microbiol., 59, 828-836.

125. Rodriguezpalenzuela, P., Burr, T.J., Collmer, A. (1991). Polygalacturonase is a vitulence factor in A. grobacterium tumefianas. J. Bacteriol., 173, 6547-6552.

126. Rombouts, F.M., Pilnik, W. (1980). Pectic enzymes.În Economic microbiology:enzymes and bioconversion, editor Ros, A.H., Academic Press, New York, vol. 5, pag. 227-282.

127. Ruiz-Teran, F., Perez-Amador, I., Lopez-Munguia, A. (2001). Enzymatic extraction and transformation of glucovanillin to vanillin from vanilla green pods. J. Agric. Chem., 49, 5207-5209.

128. Sakai, T. (1988). Protopectinase from yeasts and yeasts like fungus. In Methods in enzymology (Biomass, Part B ), editori Wood, W.A. si Kellogg, S.T., Academic Press, vol. 161,pag. 366-373.

129. Sakai, T., Sakamoto, T., Hallaert, J., Vandamme, E.J. (1993). Pectin, pectinase and protopectinase: production, properties, and applications. Adv. Appl. Microbiol. 39, 213-290.

130. Sakellaris, G. (1989a). Production, purification and characterization of extracellular pectinesterase from Lactobacillus plantarum Biotechnol. Appl. Biotechnol., 11, 503-507.

131. Sakellaris, G. (1989b). Purification and characterization of an extracellular polygalacturonaase from Lactobacillus plantarum strain B A 11. J.Appl. Bacteriol., 67, 77-85.

132. Sakiyama, C.C., Paula, E.M., Pereira, P.C., Borges, A.C., Silva, D. (2001). Characterization of pectin lyase produced by an endophylic strain isolated from cofee cherries. Lett. Appl. Microbiol., 33, 117-121.

133. Salinas, J., Verhoeff, J. (1995). Microscopical studies of the infection on gerbera flowers by Botrytis cinerea. J. Plant Pathology, 101, 377-386.

134. Sawada, K., Ueda, M. (2001). Enzyme processing of textiles in reverse micellar solution. J. Biotechnol., 89, 263-269.

135. Schejter, A., Marcus, L. (1988). Isozymes of pectinase and polygalacturonase from Botrytis cinerea Pers. In Methods in enzymology (Biomass, Part B ), editori Wood, W.A. si Kellogg, S.T., Academic Press, vol. 161,pag. 366-373.

136. Shanley, N.A., Van den Broek, L.A.M., Voragen, A.G.J., Coughlan, M.P. (1993a). Izolation and characterization of an endopolygalacturonase from phanerochaete chrysosporium. J. Biotechnol., 28, 179-197.

137. Shanley, N.A., Van den Broek, L.A.M., Voragen, A.G.J., Coughlan, M.P. (1993b). Physicochemical and catalytic properties of three endopolygalacturonase from Penicillium pinophilum. J. Biotechnol., 28, 199-218.

138. Shevchik, V.E., Condemine, G., Hugouvieux-Cotte-Pattat, N., Robert-Boudouy, J. (1996a). Characterization of pectin methylesterase B, an outer membrane lipoprotein of Erwinia chrysanthemi 3937. Mol. Microbiol., 19, 455-466.

139. Shevchik, V.E., Condemine, G., Hugouvieux-Cotte-Pattat, N., Robert-Baudouy, J. (1996b). Pectin methylesterase B of Erwinia chrysanthemi, the first pectinase characterized as a membrane lipoprotein. Prog. Biotechnol., 14, [Pectins and pectinases], 837-844.

140. Shevchik, V.E., Hugouvieux-Cotte-Pattat, N. (1997). Identification of a bacterial pectin acetyl esterase in Echerichia coli 3937. Mol. Microbiol. 24, 1285-1301.


199

141. Silley, P. (1985). A note on pectolytic enzymes of Lachnospira multiparus. J. Appl. Bacteriol., 58, 145-149.

142. Solehah, A., Balaumani, K.D., Amizo, M.A. (1994). Enzymes for improved extraction and stabilization of colour and flavour of orange juice. J. food Sci. Technol., 31, 508-510.

143. Solis, S., Flores, M.E., Huitron, C. (1997). Improvement of pectinase production by interspecific hybrids of Aspergillus strains. Lett. Microbiol., 24, 77-81.

144. Statilová, E., Markovic, O., Skrovinová, D., Jörnavall, H. (1993). Pectinase of Aspergillus sp. polygalacturonase: multiplicity, divergence, and structural patterns linking fungal, bacterial and plant polygalacturonases. J. Protein Chem., 12, 15-22.

145. Statilová, E., Breierová, E., Vadkertiová, R. (1996a). Candida boidinii-a new found producer of pectic enzymes complex. Prog. Biotechnol., 14, [Pectins and pectinases], 453-462.

146. Statilová, E., Dzurová, M., Markovic, O., Jörnavall, H. (1996a). An essential tyrosine rezidue of Aspergillus polygalacturonase. FEBS Lett., 382, 140-146.

147. Statilová, E., Mislovicová, D., Kacuraková, M., Machová, E., Kolarová, M., Markovic, O., Jörnavall, H. (1998b). The glycoprotein character of multiple forms of Aspergillus polygalacturonases. J. Protein Chem., 17, 173-179.

148. Stotz,H.V., Powell, A.L.T., Damon, S.E., Greve, L.C., Bennett, A.B., Labavitch, J.M. (1993). Molecular characterization of a polygalacturonase from Pyrus communis L. cv. Bartlett. Plant Physiol., 102, 130-138.

149. Stotz,H.V., Contos, J.A., Powell, A.L.T., Bennett, A.E., Labavitch, J.M. (1994). Structure and expression of an inhibitor of fungal polygalacturonases from tomato. Plant Mol. Biol., 25, 607-617.

150. Tagawa, K., Kaji, A. (1988). Polygalacturonase from Corticium rolfsii. In Methods in enzymology (Biomass, Part B ), editori Wood, W.A. si Kellogg, S.T., Academic Press, vol. 161,pag. 361-365.

151. Takao, M., Nakaniwa, T., Yoshikawa, K., Terashita, T., Sakai, T. (2001). Purification and characterization of thermostable pectate lyase with protopectinase activity from thermophillic Bacillus sp. TS 47. Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 2360-2367.

152. Tierny, Y., Bechat, M., Joncquiert, J-C., Dubourguier, H-C., Guillaume, J. (1994). Molecular cloning and expression in Escherichia coli og genes encoding lyase and pectin methylesterase activities from Bacteroides thetarotaomicron. J. Appl. Bacteriol., 76, 592-602.

153. ten-Have, A., Breuil, W.O., Wublen, J., Visser, J., van Kar, J. (2001). Botrytis cinerea endopolygalacturonase genes are differentially expressed in various plant tissues. Fungal Genet. Biol., 33, 97-105.

154. Treman, D,M., Handa, A.K. (1994). Reduction of pectin methylesterase activity modifies tissue integrity and cation levels in ripening tomato fruits. Plant Physiol., 106, 429-436.

155. Ueda, S., Fujio, Y., Liu, J.V. (1982). Pectic enzymes from Aspergillus oryzae. J. Appl. Biochem., 4, 524-535.

156. Vilanova, M., Blanco, P., Cortes, S., Villa, T.G., Siliro, C. (2000). Use a PGU 1 recombinat saccharomyces cerevisiae strain in oenological fermentations. J. Appl. Microbiol., 89, 876-883.

157. Vucari, L, Tenkanen, M, Buchert, J., Rathrö, M., Barley, M., Linko, M. (1993). In bioconversion of forest and agricultural plant residues, editor Saddler, J.N., International Oxford, pag. 131-182.

158. Wattad, C., Freeman, S., Dinoor, A., Pruski, D. (1995). Colletotrichum magna is deficient in extracellular secretion of pectate lyase. Mol. Plant-Microbe Interact., 8, 621-626.

D. Dinu

200

159. Whitaker, J.R. (1990). Microbial pectolytic enzymes. In Microbial enzymes and biotechnology (editia a 2 a), editori Fogarty, W.M. si Kelly, C., Elsevier Applied Science, London, pag. 133-176.

160. Yamaguchi, F., Inoue, S., Hatanaka, C. (1995). Purification and properties of endo-1,4-D-galacturonase from Aspergillus niger. Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 1742-1744.

161. Yang, H.A., Zhou, J., Sivasithamparam, H., Tommerup, I.C., Barton, J.E., Obrien, P.A. (1994). Genetic variability in pectic enzymes of Rhizoctonia solarii isolates causing bare-patch disease of cereals. J. Phytopathology, 141, 259-266.

162. Yao, C., Conway, W.S., Sams, C.E. (1995). Purification and characterization of a polygalacturonase produced by Penicillium expansum in apple fruit. Phytopathology, 86, 1160-1166.

163. Yoder, M.D., Keen, N.T., Jurnak, F. (1993a). New domain motif of the structure of pectate lyase C, a novel secreted plant virulance factor. Science, 260, 1903-1907.

164. Yoder, M.D., Lietzke,S.E., Jurnak, F. (1993b). Unusual structural features in the parallel β-helix in pectate lyases. Structure, 1, 241-251.

165. Yoskioka, S., Ukedo, H., Matsunuoto, K., Osajimo, Y. (1992). Enzymatic determination of pectin and related lower-molecular weight compounds in fruits and vegetables using polygalacturonase, pectinesterase, glucuronolactone reductase and ascorbat axidase. Nippon Skokukin Kogyo, 39, 821-826.

Date post:	01-Jul-2015
Category:	Documents
Upload:	malina1709
View:	109 times
Download:	7 times

Enzime pectinolitice de origine microbiana, capitolul6

Documents