ENZIMELE

În organismele vii se petrec cu o uimitoare uşurinţă, la temperatura joasă şi în soluţie practic

neutră, un număr mare de reacţii pe care chimistul nu le poate efectua în laborator decât lucrând la

temperaturi şi presiuni ridicate, în prezenţă de acizi sau de baze tari, de dizolvanţi neapoşi sau de

catalizatori heterogeni metalici. Printre aceste reacţii se numără atât degradări de molecule (hidrolize şi

oxidări) cât şi sinteza de compuşi cu structură complicată. Înţelegerea mersului acestor reacţii este

importantă, în primul rând pentru cunoaşterea unor fenomene naturale de cea mai mare amploare şi

răspândire, iar în al doilea rând pentru interesul practic pe care îl prezintă. Nu este absurdă speranţa ca , o

dată cunoscut mersul reacţiilor din celulele vii, acestea vor putea fi imitate în laborator şi în industrie sau

chiar dirijate pe căi noi.

S-a recunoscut încă de mult că organismele folosesc, pentru realizarea acestor transformări

chimice, catalizatori organici, conţinuţi în concentraţii mici în celule sau în sucurile secretate de acestea,

cum sunt sucurile digestive, laptele, urina etc.

S-a dat acestor catalizatori numele de fermenţi sau enzime (de la enzyme, literal: "în aluat").

Scurt istoric

Reacţii enzimatice au fost folosite din timpurile cele mai vechi pentru fabricarea vinului, a

oţetului, a berii şi a brânzei. O cercetare sistematică a lor a fost întreprinsă abia în epoca modernă.

În 1713, Reamur a observat dizolvarea cărnii în sucul stomacal al ciorii. De asemenea, fiziologul

Spallanzani (1783) a hrănit animale cu bucăţi de carne învelite în reţele de sârmă şi observat dizolvarea

cărnii in stomac.

Stahl, fondatorul teoriei flagisticului, explica fermentaţia ca un proces în care una din substanţele

prezente transmite "mişcarea sa internă" substanţei care fermentează (1697). În 1680, van Leeuwenhoeck

a observat la microscop celulele drojdiei de bere, dar această descoperire nu a fost luată în seamă timp de

două secole. Lavoisier (1789) a făcut un bilanţ de materiale al fermentaţiei, arătând că oxigenul,

hidrogenul şi carbonul din zahăr se regăsesc în alcoolul şi bioxidul de carbon ce iau naştere.

În cursul sec. al XIX-lea au fost preparate multe extracte de enzime. Astfel, după ce Kirchoff a

observat , în 1820 , că o componentă glutinoasă din bobul de orz încolţit, numit malţ, transformă cantităţi

de amidon mult mai mari decât propria sa greutate, într-un zahăr solubil, maltoza, Dubrunfaut a găsit , în

1

1830, că extractul apos, limpede, de malţ are aceeaşi acţiune solubilizantă asupra amidonului ca malţul

însuşi. Din acest extract, Payen şi Persoz (1833) au izolat, prin precipitarea cu etanol, prima enzimă,

amilaza (fireşte foarte impură), sub forma unui material solid alb, amorf, capabil să solubilizeze o

cantitate de amidon de 2000 de ori mai mare decât propria sa greutate. În 1830, Robiquet şi Boutron-

Chalard au descoperit hidroliza amigdalinei, cu extract de migdale amare, iar în 1837, Liebig şi Wohler

au izolat enzima respectivă, numind-o emulsină. Printre primele enzime izolate (în stare impură) vom mai

menţiona: pepsina din sucul gastric (Schwann, 1836); tripsina, din sucul pancreatic (Kuhne, 1848); lipaza

(Claude Bernard, 1849); invertaza (Mitscherlich, 1841; Berthelot, 1860); ureaza (Musculus, 1882) etc.

Un moment istoric deosebit de important este recunoaşterea clară, de către Berzelius, în 1835, a

caracterului catalitic al reacţiilor enzimatice, precum şi a rolului esenţial pentru viaţa animalelor şi a

plantelor jucat de aceste reacţii.

În anul 1940, cercetătorul american Edward Howell a făcut, în acelaşi domeniu, o şi mai mare

descoperire: cercetând substanţele vitale propriu-zise si anume, ENZIMELE, a dovedit că ele sunt

purtătorii vieţii din orice organism viu, fiind deci şi materia vie din alimentele noastre (asta atâta timp cât

nu sunt distruse prin fierbere).

Este uimitor cum de ştiinţa nu a preţuit corespunzător această descoperire extraordinara şi cum de

nu s-a făcut nici un fel de "publicitate" în favoarea enzimelor, cum făcuse, la vremea lor, pentru vitamine.

Activitatea catalitică a enzimelor

Enzimele sunt, precum s-a mai spus, catalizatori organici, produşi de celula vie, acţionând asupra

anumitor substanţe numite substraturi. În marea lor majoritate, enzimele catalizează reacţia unei substanţe

organice cu un compus anorganic liber sau cedat de alt compus organic (apă, acid fosforic, hidrogen,

oxigen, etc.).

Legile catalizei se aplică fireşte şi la enzime. Enzimele, ca toţi catalizatorii, nu catalizează decât

reacţii termodinamic posibile, decurgând în sensul stabilirii unui echilibru.

Reacţiile enzimatice prezintă însă unele deosebiri caracteristice faţă de reacţiile catalitice

obişnuite, omogene sau heterogene.

Activitatea enzimelor.

Când o reacţie poate fi catalizată atât de o enzimă cât şi de substanţe simple (acizi, baze sau ioni

metalici) se constată de obicei că reacţia enzimatică decurge cu viteză mult mai mare; cu alte cuvinte,

reacţia enzimatică are o energie de activare mult mai mică. Astfel, s-a stabilit că este necesară o

2

concentraţie de ioni de hidrogen de zece milioane de ori mai mare decât de invertază pentru a hidroliza o

anumită cantitate de zaharoză, într-un timp dat, la 370C.

Temperatura optimă a reacţiilor enzimatice.

Viteza reacţiilor enzimatice creşte, ca a celor mai multe reacţii, între molecule covalente, cu

temperatura, potrivit cunoscutei reguli a lui Van't Hoff, şi anume o urcare a temperaturii cu 10 0C,

produce o creştere a vitezei de reacţie cu un coeficient 1,5-3. Creşterea acesta se observă însă numai la

temperaturi relativ joase. O dată depăşită o anumită temperatură optimă, la care viteza este maximă,

aceasta scade, iar la temperaturi mai înalte, reacţia încetează. Fenomenul se explică prin faptul, semnalat

mai sus, că la temperaturi mai înalte enzimele sunt inactivate prin denaturarea componentei proteice. Cele

mai multe enzime devin complet inactive între 50-800C. Temperatura optimă nu poate fi însă exact

definită, căci ea variază în limite largi, cu concentraţia enzimei, cu concentraţia ionilor de hidrogen şi cu

prezenţa diferitelor impurităţi ale preparatului enzimatic sau ale substratului.

Influenţa pH-ului.

După cum a arătat Sorensen (1909), activitatea enzimelor depinde într-o foarte mare măsură de

concentraţia ionilor de hidrogen din soluţie (sau mai corect de activitatea termodinamică a ionilor de

hidrogen, adică de pH-ul soluţiei). Curbele reprezentând variaţia vitezei de reacţie cu pH-ul prezintă de

obicei un maxim pronunţat la un anumit pH, în timp ce la valori ale pH-ului diferind cu ±1 faţă de acest

maxim, viteza de reacţie prezintă valori considerabil mai mici. Din cauza acestei particularităţi, este

necesar ca în cursul reacţiilor enzimatice să se menţină pH-ul optim constant, prin folosirea de tampon.

Specificitatea enzimelor. O anumită enzimă catalizează numai un număr mic de reacţii şi de multe

ori o singură reacţie, spre deosebire de catalizatorii obişnuiţi anorganici (acizi, baze, catalizatori de

hidrogenare etc.) care activează practic toate reacţiile posibile de un anumit tip.

Se disting multe tipuri şi grade de specificitate în acţiunea enzimelor. În primul rând trebuie

menţionată specificitatea stereochimică, care constă în aceea că o enzimă care catalizează reacţia unui

compus optic activ este fără acţiune asupra enantiomerului sau şi în general, asupra izomerilor sterici ai

acestui compus, supuşi acelorşi condiţii.

Vom mai aminti aici dehidrogenaza lactică din muşchi, o enzimă care lucrează în colaborare cu

DPN, şi care dehidrogenează acidul L-lactic la acid piruvic şi hidrogenează acidul piruvic numai la acid

L-lactic, fiind inactivă faţă de acidul D-lactic.

Din alt punct de vedere se disting între o aşa-numită specificitate de reacţie şi o specificitate de

substrat a enzimelor. Prima se referă la reactantul anorganic care ia parte la reacţie: apa în reacţiile de

3

hidroliză, acidul fosforic în reacţiile cu fosforoliză, hidrogenul în reacţiile catalizate de dehidrogenaze,

etc.

Clasificarea enzimelor

Se cunosc în prezent câteva sute de enzime dar, având în vedere complexitatea proceselor chimice

care au loc în organismele vii, nr. enzimelor apărut în natură trebuie să fie mult mai mare.

Structura enzimelor este prea puţin cunoscută pentru a putea servi ca bază a unei clasificări, de

aceea enzimele se clasifică după tipul reacţiilor pe care le provoacă sau după substraturile asupra cărora

acţionează. Numele enzimelor se formează adăugându-se sufixul - ază la nr. reacţiilor provocate sau

substraturilor lor; excepţie fac numele istorice al unor enzime cum ar fi emulsina, pepsina, zimaza, etc.

În clasificarea adoptată aici, enzimele sunt împărţite în cinci clase principale, fiecare divizată în

mai multe subclase (după Hoffmann Ostenhof 1953):

1.Hidrolaze

2.Transferaze

3.Oxido - reductaze

4.Liaze şi sintetaze

5.Izomeraze si racemaze

La drept vorbind aproape toate reacţiile enzimatice sunt reacţii de transfer al unor grupe de atomi

de la un donor la un acceptor. Astfel hidrolizele sunt reacţii de transfer al unor grupe acil, glicozil etc.

cedate de substrat către apă ca acceptor iar reacţiile de oxido-reducere sunt reacţii de transfer de hidrogen

sau electroni; termenul de transferare se foloseşte însă în nomenclatura curentă mai ales pentru

transaminări, transmetilări, transacetilări.

După o clasificare mai nouă (Union of Biochemistry Commission of Enzymes 1961) enzimele

sunt împărţite în şase clase:

1.oxido-reductaze

2.tranferaze

3.hidrolaze

4.liaze

5.izomeraze

6.ligaze (sintetaze)

4

fiecare divizată la rândul ei în mai multe subclase, fiecare enzimă fiind desemnata din patru cifre;

ex: 1111(hidrogenaza alcoolului) este o oxido - reductoză (clasa 1), acţionează asupra grupei CHOH a

donorului (subclasa 1) cu DPN sau TPN ca acceptor (subsubclasa 1) şi este primul termen din această

ultimă subdiviziune.

“Deviza” enzimelor: a face şi a desface continuu substanţe…

Enzimele sunt catalizatori biochimici, specifici vieţii, care asigură desfăşurarea proceselor

metabolice (catabolism şi anabolism). Sunt solubile, macromoleculare, de natură organică, termolabile,

produse de organismul viu, iar activitatea lor specifică faţă de o anumită substanţă sau un anumit tip de

substanţe sau substrat şi sunt dependente de anumite condiţii de mediu: pH, temperatură, prezenţa unor

activatori etc. Enzimele pot fi activatoare sau inhibitoare pentru un anumit proces metabolic, după cum

pot fi şi degradatoare ale unor substanţe (enzime amilolitice, glicolitice, proteolitice etc.), fie în mediul

extracelular (exoenzime) cum sunt cele utilizate în industria fermentativă (pepsina, tripsina etc.).

Fabricarea enzimelor este dificilă şi foarte scumpă, stabilitatea lor este slabă şi pot fi

utilizate o singură dată. Aceste trăsături păreau greu de învins. Cercetările efectuate de microbiologi şi

ingineri biotehnologi, au dus la înţelegerea faptului că enzimele pot constitui “instrumente” cu posibilităţi

deosebite. S-a stabilit că enzimele pot fi produse natural, de diverse microorganisme, de exemplu, de către

levuri (drojdii. Apoi, pentru o folosire rentabilă la scară industrială, după extragere şi purificare, enzimele

sunt fixate, fie prin formarea unei legături chimice între unele substraturi naturale (celuloza, agaroza),

sintetice (polistiren, poliacrilonitric) sau minerale (argila, sticla poroasa), fie prin adsorbţie simplă sau

prin includerea în microcapsule cu pereţi semipermeabili. Stabilizarea şi utilizarea continuă în reactoare

cu substrat fluidizat se poate realiza şi prin fixarea enzimelor pe particule magnetice. Fixate astfel,

enzimele pot fi reciclate deoarece ele se prezintă sub formă solidă şi nu lichidă. În timp ce în stare lichidă

enzimele se denaturează în 24 ore, în urma fixării pot funcţiona câteva luni, fapt care face ca preţul de

cost să scadă sensibil.

După fixare, enzimele împreună cu suporţii, se introduc în bioreactori de diverse

dimensiuni (chiar de zeci de mii de tone)1. Asemenea bioreactori au început să producă. De exemplu, în

reactori enzimatici se produce lactoza din lactoser (partea lichidă care rămâne din lapte după îndepărtarea

coagulului format sub acţiunea fermenţilor; conţine albumina şi globulinele din lapte, precum şi cea mai

mare parte din lactoză şi săruri minerale; lactoza este un dizaharid compus dintr-o moleculă de glucoză şi

una de galactoză, deci lactoza poate fi utilizată pentru producerea glucozei şi galactozei (izomer al

glucozei), precum şi fructoza din glucoză (transformarea în fructoză intensifică dulceaţa). În reactorii în

care au fost introduse două tipuri de molecule (reactori bimoleculari): amoniac şi acid fumaric, enzima

imobilizată, aspartaza, a catalizat acidul aspartic. Reactorii în care sunt introduse enzime cu acţiune

5

secvenţială asigură transformări chimice profunde ale moleculelor substratului conducând la sinteza

dirijată a unor molecule noi, specifice.

Imobilizarea enzimelor pe suporţi insolubili şi folosirea acestora în bioreactori, în flux

continuu, este în curs să devina o tehnologie larg utilizată în domeniile alimetar şi farmaceutic. Aceasta va

avea implicaţii economice şi social-politice dintre cele mai importante, deoarece procedeele enzimatice

pot fi competitive sau complementare proceselor chimice clasice (industriei fermentării). De exemplu, în

S.U.A., transformarea amidonului porumbului de către glucoamilaze în glucoză - fructoză se realizează de

acum în staţie pilot (amidonul este hidrolizat de α-amilază în dextrine şi apoi în maltoză, maltotrioză şi

glucoză, iar β-amilaza eliberează glucoză şi maltoză). Moleculele separate de glucoză în prezenţa unei

glicoizomeraze sunt apoi transformate în fructoză, sub forma unui sirop (cu un conţinut ridicat în

fructoză) cu o putere de îndulcire superioară zaharozei (care este fomată dintr-o glucoză şi fructoză).

Acest suc dulce este foarte potrivit în industriile alimentare, în special în fabricarea băuturilor răcoritoare

(inclusiv Coca-Cola). În prezent, unele cercetări de inginerie genetică întreprinse de societatea

californiană Cetus au drept obiectiv găsirea unei biotehnologii de solidificare a siropului prin cristalizarea

fructozei. Prin generalizarea acestui procedeu, în 1990, S.U.A. a asigurat o jumătate din consumul intern

de zahăr, eliberându-se de necesitatea importului acestui produs. În anii ’70, SUA producea anual aproape

3 milioane de tone de zahăr din porumb. (În SUA, valoarea totală a utilizării industriale a enzimelor ca

valoare adăugată, în 1975, s-a ridicat la aproape 500 milioane dolari).

S-a menţionat că o celulă bacteriană sintetizează circa 2000 enzime, care, de altfel, sunt

prezente în orice celulă vie. Dar, numărul celor cunoscute este mult mai mic, iar al celor folosite industrial

este extrem de redus. Astfel, numărul enzimelor industriale (cu o cifră de afaceri de 200 milioane

dolari/an în SUA) atinge doar cifra 10. Dintre acestea, 4 grupe de enzime reprezintă 80% din comerţ şi

anume: amilazele (α şi β - amilaza, de origine bacteriană; hidrolizează polizaharidele - glucoza, maltoza),

amiloglucozidazele (origine fungică; hidrolizează total amidonul, dextrinele - glucoză, bere, alcool),

proteazele (papaina, bromelaina de origine vegetală; tripsina, pepsina, cheagul de origine animală sau

fungică, proteaze bacteriene şi fungice; hidrolizează peptide, amide sau esteri, caseină, proteine - peptide

sau aminoacizi; limpezirea berii; producerea pâinii, produselor de cofetărie, brânzeturilor,

medicamentelor) şi glucoizomereazele (origine fungică; izomerizarea glucozei în fructoză şi producerea

siropului cu continut ridicat în fructoză). La aceste enzime, larg folosite, se adaugă: pectinaza (origine

fungică; fructe - suc de fructe, vin), celulaze (origine fungică; hidrolizează biomasa, celuloza - glucoza,

alcool), lipaze (origine fungică; hidrolizează gliceride - acizi graşi, gliceroli), invertaza (levuri;

hidrolizeaza zaharoza - glucoza şi fructoza - zahăr invertit), lactaza ( levuri, fungi; hidrolizează lactoza -

glucoza, galactoza - siropuri) şi pancreatina (extrasă din pancreas; acţionează ca o protează + o amilază +

o lipază, reunite; hidrolizează legături peptidice, polizaharidice şi gliceridice - glucoză, aminoacizi, acizi

graşi etc.; utilizări în industria farmaceutică). O ultimă enzimă, dar cu un mare viitor este amino - acilaza,

care asigură producerea α - aminoacizilor.

6

Pe scurt despre aminoacizi: sunt substanţe organice din a căror polimerizare rezultă

proteinele. În structura aminoacizilor intră una sau câteva grupări carboxilice ( -COOH) şi una sau câteva

grupări aminice (-NH2). Sunt sintetizaţi de celule pe seama hexozelor, pentozelor sau acizilor cetonici.

Unii aminoacizi sunt esenţiali pentru organismul animal. Prezenţa acestora în alimente este indispensabilă

deoarece organismul nu îi sintetizează. Asa sunt: lizina, triptofanul, cistina + metionina, histidina,

fenilalanina, treonina, leucina + izoleucina, valina.

Lizina este aşadar un aminoacid esenţial, iar în cereale aproape că lipseşte (în porumbul

obişnuit) sau este prezentă în cantităţi mici (la grâu 2,8 g/100g proteină). Spre deosebire, o leguminoasă,

soia are circa 7% proteină în bob, iar oul de găină 6,97 g/100 g proteină. (Necesarul în 24 de ore al unui

om este de 4,2 g/100 g proteine). Din această cauză furajarea animalelor impune completarea raţiilor cu

leguminoase boabe, mai ales cu soia. Este adevărat că lizina poate fi fabricată şi prin sinteză chimică, dar

aceasta nu poate fi utilizată pentru îmbogăţirea cerealelor şi alimentaţie. Cauza? Sinteza chimică produce

un amestec, în părţi egale, din doi izomeri optici: L-lizina şi D-lizina.

Organismul animal asimilează însă numai L-lizina (levogira), iar celălalt izomer nu. Mai

mult D-lizina la o doză mare devine toxică pentru organism. Această situaţie şi inexistenţa unui procedeu

chimic pentru separarea celor două lizine la scară industrială a făcut ca sinteza chimică a lizinei să nu aibă

efectele economice scontate. Impasul a fost înlăturat prin procedee enzimatice. Astfel, potrivit

procedeului pus la punct de INSA, în Franţa, într-un bioreactor lizina sintetică a fost combinată cu un

reactiv X, asupra căruia a acţionat o enzimă imobilizată. Enzima taie selectiv legătura stabilită între L -

lizină şi reactivul X, dar lasă neschimbat compusul D - lizină - X. Apoi L - lizina este extrasă din reactor,

în timp ce compusul D - lizină - X este supus căldurii pentru ramificare, în vederea reciclării. În acest

mod D - lizina neutralizabilă este transformată n L - lizină. În Europa, singurul producător de lizină este

societatea Eurolizina, instalată la Amiens, Franţa, care lucrează după un brevet japonez. Societatea

produce 7500 tone lizină pe an (în perspectivă 11.000 tone).

După un procedeu similar celui folosit în producerea lizinei, în Japonia se produce L -

metionina (levogira), câte 20 tone în fiecare lună…

Au fost prezentate anterior doar enzimele catalizatoare ale reacţiilor de degradare

(hidrolazele) care permit utilizarea glucidelor, proteinelor, lipidelor în alimentaţie, în medicină, etc. De

asemenea, s-a vorbit despre izomeraze care catalizează rearanjări în sânul moleculei substratului (de

exemplu, în glucoză - C6H12O6, aldohexoza, în fructoză - C6H12O6, cetoglucoza), prin oxidoreducere,

transferuri intramoleculare ş.a.

Există însă şi enzime care catalizează oxidoreducerea - oxidoreductazele (transferaă

electroni de la un donor la un acceptor), altele care catalizează transferul unui grup chimic dintr-o

moleculă în alta - transferaze, liaze şi ligaze. Aceste enzime sunt încă puţin folosite, importanţa lor este

însă deosebită dacă ne gândim că ele pot cataliza oxidarea, dar mai ales reacţiile de sinteză a noi molecule

plecând de la molecule mai simple.

7

Ingineria enzimatică explorează orizonturi noi în diverse direcţii şi, ca urmare, a obţinut

realizări remarcabile în domeniile menţionate deja: farmaceutică, alimentaţie, chimie. Utilizarea

enzimelor este încurajatoare în activiatatea de reducere a reziduurilor si poluanţilor chimici din mediu

(apa) şi din produsele alimentare. Un rol major îl vor avea însă enzimele în energetică: prin tratarea

biomasei cu celulaze, amilaze, amiloglucozidaze se realizează hidroliza celulozei, polizaharidelor,

amidonului şi dextrinei în glucoză - alcool etilic - energie, după cum prin asocierea fotosistemelor

vegetale cu hidrogenaza bacteriană se poate obţine hidrogen - energie.

BIOTEHNOLOGII ALIMENTARE

Biotehnologia alimentară se referă la prelucrarea industrială a diferitelor materii prime cu ajutorul

microorganismelor şi enzimelor proprii sau a unor agenţi biologici (microorganime, enzime) adăugaţi în

scopul realizării unor produse sau a ameliorării unor procese tehnologice.

Rolul biotehnologiei este covârşitor în industria alimentară. În fapt, industria alimentară este o

biotehnologie, deoarece materiile prime agroalimentare sunt produse biologice şi prin urmare conservarea

lor până la consum, în stare proaspătă (cazul fructelor şi legumelor) sau până la industrializare (cazul

tuturor produselor agroalimentare) implică controlul activităţii enzimatice proprii ţesuturilor vegetale şi

animale sau a celor elaborate de microflora de contaminare.

Enzimele proprii ţesuturilor vegetale şi animale sunt esenţiale în transformările pe care le oferă produsele

agroalimentare: maturarea fructelor şi legumelor, cerealelor şi făinurilor sau diferitelor produse

alimentare pe bază de cereale germinate, maturarea brânzeturilor, maturarea cărnii.

Enzimele pot avea însă şi rol deteriorativ cu implicaţii în modificarea caracteristicilor senzoriale şi valorii

nutritive a materiilor prime agroalimentare până la prelucrarea termică a acestora.

De asemenea, rolul microorganismelor este hotărâtor, unele dintre ele având acţiune dăunătoare, altele

având rol esenţial în obţinerea unor produse alimentare datorită acţiunii lor fermentative: produse lactate

acide, brânzeturi, bere, vin, spirt, pâine, salamuri crude, alimente fermentate din cereale şi leguminoase.

Microorganismele intervin şi în fermentarea unor produse vegetale: varza, murături, măsline, castraveţi,

cacao, etc.

Biotehnologiile în industria alimentară s-au dezvoltat impresionant prin folosirea enzimelor exogene

(industria laptelui, berii, spirtului, amidonului, cărnii, sucurilor de fructe, zahărului, panificaţiei, etc.) şi a

culturilor starter (industria berii, laptelui, cărnii, panificaţiei, etc.) La toate acestea trebuie să avem în

vedere obţinerea de metaboliţi secundari (alcool etilic, acetonă, acizi organici, aminoacizi, etc.) prin

folosirea de microorganisme precum şi de biomasă alimentară şi furajeră, etc.

8

Cu ajutorul enzimelor microorganismelor se pot accelera procesele biochimice, se pot perfecţiona

procesele de producţie, se poate îmbunătăţi calitatea produselor alimentare şi se poate mări gradul de

diversificare a producţiei alimentare.

1.3. CULTURI STARTER DE MICROORGANISME

Microorganismele sunt utilizate în industria alimentară pentru:

- Obţinerea de celule (culturi starter = culturi pure) care la rândul lor sunt folosite pentru fermentarea

produselor lactate acide sau brânzeturi, la fabricarea produselor de carne (salamuri crude uscate), produse

tradiţionale vegetale, produse lactate acide, pâine etc. În acest produsele se consumă fie împreună cu

celulele respective fie după îndepărtarea celulelor cum este cazul băuturilor de tipul berii, vinului.

- Obţinerea de biomasă care poate fi utilizată ca ingredient de fermentare (drojdia de panificaţie) sau de

îmbogăţire a unor produse alimentare cu proteine, respectiv ca furaje proteice pentru păsări, peşte,

porcine.

În ceea ce priveşte metodele de cultivare ale microorganismelor se folosesc metode periodice

(discontinui) şi metode continui, în ambele cazuri fiind necesară optimizarea procesului.

Metoda periodică de cultivare a microorganismelor prevede alimentarea continuă a aparatului de

cultivare cu substanţe nutritive şi înlăturarea culturii de microorganisme. În acest fel, se creează condiţii

optime de acumulare a cantităţii necesare de biomasă sau a metaboliţilor. La cultivarea periodică

concentraţia substanţelor nutritive scade, iar cea a celulelor şi metaboliţilor creşte, fapt care conduce la

modificarea cineticii creşterii microorganismelor.

La metoda periodică trebuie să avem în vedere două situaţii şi anume:

- când substratul este inhibitor pentru producţia de biomasă şi metaboliţi;

- când produsul este inhibitor.

Prima situaţie se întâlneşte la obţinerea biomasei de drojdie de panificaţie, represiunea catabolică de către

glucide antrenează şi o producţie de alcool etilic, producţie ce trebuie evitată prin două soluţii şi anume:

evitarea excesului de substrat şi lucru cu cultura “în pat” şi respectiv plasarea unui detector de alcool în

efluentul de gaz (CO2) care permite să se cunoască ce aport de substrat trebuie furnizat.

A doua situaţie se întâlneşte la producţia de culturi lactice a căror dezvoltare este însoţită de acumularea

de acid lactic (bacterii lactice homofermentative) sau acid lactic şi acetic (bacterii lactice

heterofermentative).

9

Soluţia care se impune în acest caz este o dializă a culturii sau centrifugarea substratului cu celule,

celulele fiind apoi reciclate.

Dacă dezvoltarea culturii are loc fără acumularea de metaboliţi, alimentarea cu substrat se poate face la un

debit constant, dar la o concentraţie crescătoare a acestuia, respectiv la o concentraţie constantă a

substratului dar la un debit programat exponenţial.

Metoda continuă, în care caz are loc alimentarea constantă a aparatului de cultivare a microorganismelor

cu substanţe nutritive şi eliminarea neîntreruptă a biomasei sau metaboliţilor. Această metodă poate fi

realizată prin cultivarea de suprafaţă sau de adâncime a microorganismelor.

La fermentarea continuă se are în vedere natura catalizatorului (imobilizat sau nu; sistem eterogen sau nu;

celule incluse, adsorbite, grefate prin covalenţă); gradul de reciclare al celulelor microbiene; gradul de

amestecare a fluidelor în reactorul cu funcţionare continuă.

Creşterea concentraţiei de celule se poate realiza prin: folosirea tehnicilor de membrană sau centrifugarea;

folosirea de celule imobilizate; reciclarea celulelor.

1.3.1. Microorganisme utilizate în industria alimentară

BACTERIILE utilizate în industria alimentară aparţin următoarelor genuri:

Genul Streptococcus Acest gen cuprinde specii de bacterii sub formă de coci sferici sau ovali cu 2,

grupate în diplo sau formă de lanţuri. Sunt Gram pozitive, facultativ anaerobe, neciliate, nesporulate,

unele specii fiind capsulate.

Importanţi pentru industria alimentară sunt:

Streptococii mezofili : Streptococcus lactis (Lactococcus lactis subsp. lactis), Str. cremoris (Lactococcus

lactis subsp. cremoris), Str. diacetilactis (Lactococcus lactis subsp. diacetilactis);

Streptococii termofili: Str. thermophilus.

Aceşti streptococi lactici sunt homofermentativi, produc acid lactic L(+) şi prezintă următoarele activităţi:

- activitate fermentativă: fermentează lactoza şi glucoza;

- activitate proteolitică;

- produc diacetil şi acetoină din acid citric (în principal Str. diacetilactis).

Fermentarea lactozei de către streptococii lactici se face prin transformarea iniţială a acesteia în glucoză

şi galactoză – 6P prin intermediul fosfo--galactozidazei. În continuare, glucoza este apoi fermentată pe

10

calea hexozo – difosfatului în acid lactic, iar galactoza - 6P este utilizată pe calea tagatozei în vederea

producerii unei cantităţi suplimentare de acid lactic (fig. 1.11.).

Figura 1.11. Calea tagatozei de degradare a lactozei de către streptococii lactici

Fermentarea glucozei de către streptococii lactici poate fi făcută pe cale homofermentativă cu

producerea în principal de acid lactic şi pe cale heterofermentativă, în condiţile în care glucoza este

limitată, calea heterofermentativă fiind

calea ribulozei – 5P cu formare de acid acetic, etanol şi acid lactic (fig. 1.12.).

Figura 1.12. Calea homo şi heterofermentativă de degradare a glucozei de către bacteriile lactice

Fermentarea acidului citric cu formare de diacetil, acetoină şi 2,3 butilenglicol este arătată în figura 1.13.

Acelaşi mecanism îl folosesc şi leuconostocii.

11

Figura 1.13. Transformarea citratului de către Str. lactis subsp. diacetilactis şi Leuconostoc

Genul Leuconostoc

Acest gen cuprinde bacterii cu formă sferică, lenticulară, grupate în perechi sau lanţuri, imobile,

asporogene, Gram negative, facultativ anaerobe.

Pentru dezvoltare, leuconostocii au nevoie de vitamine (acid nicotinic, tiamină, biotină) şi zaharuri

fermentescibile. Nu sunt proteolitici şi nu reduc azotaţii. Specii de Leuconostoc formează polimeri

(dextran). Se dezvoltă bine la 20 - 30C.

Genul Leuconostoc cuprinde speciile: Leuconostoc cremoris (citrovorum); Leuconostoc lactis;

Leuconostoc dextranicum; Leuconostoc mezenteroides.

Aceste specii sunt heterofermentative şi se dezvoltă greu în laptele fără adaos de stimulatori. În produsele

lactate, leuconostocii au două funcţii de bază:

- produc compuşi de aromă (diacetil, acetoină);

- produc ochiuri de fermentare prin formare de CO2 în unele tipuri de brânzeturi (Edam, Goude, Tilsit).

Ambele funcţii sunt realizate prin metabolismul citratului, dar leuconostocii produc CO2 şi din lactoză.

Leuconostocii intervin deci în metabolismul glucidelor şi al citratului.

Metabolismul glucidelor Fermentarea glucidelor de către leuconostoci se face pe calea

fosfocetohexozelor, dintr-un mol de hexoză regenerându-se câte un mol de ATP. Genele care codifică

12

etapele iniţiale ale fermentării lactozei (ca de altfel şi ale metabolizării citratului, producerii de proteaze)

sunt localizate în plasmide.

Metabolismul citratului Metabolismul citratului de către leuconostoci este acelaşi ca şi la streptococi cu

menţiunea că leuconostocii produc diacetil şi acetoină la pH scăzut. Acetoina se poate forma pe două căi:

- prin decarboxilarea acetolactatului;

- din diacetil prin intermediul diacetil reductazei, într-o reacţie care necesită NADH sau NADPH.

Această ultimă cale este redusă sau chiar lipseşte în cazul lui Str. diacetilactis, din cauza capacităţii

limitate a acestuia de a produce acetil - CoA, unul din precursorii diacetilului.

Leuconostocii (ca de altfel şi lactobacilii) pot produce la unele brânzeturi unele defecte şi anume:

- crăparea pastei la brânza Cheddar ( defect numit “Blit opennes”);

- apariţia timpurie de gaze la brânza Goude (Str. diacetilactis poate produce şi el defectul de “plutire” a

coagulului, la brânza Cottage).

Aceste defecte se datorează formării de CO2. Pentru a se preveni defectul de “plutire” a coagulului,

brânza Cottage se fabrică cu o cultură care nu conţine Str. diacetilactis, adăugându-se apoi în brânza

obţinută o cultură de Leuconostoc citrovorum cultivată pe lapte cu adaos de citrat sau o cultură

concentrată de Leuconostoc citrovorum.

În afară de industria laptelui, leuconostocii se utilizează şi pentru:

- fermentarea unor produse vegetale (varză, castraveţi, măsline) intervenind în cadrul microflorei

spontane sau sub formă de culturi concentrate;

- fermentarea malolactică a vinurilor;

- producţia de dextran.

În industria laptelui se folosesc culturi lactice care conţin streptococi acidifianţi (Str. lactis şi Str.

cremoris), precum şi bacterii producătoare de aromă şi unele specii de Leuconostoc şi Str. diacetilactis,

ultimul fiind aromatizant şi acidifiant.

Genul Pediococcus. Acest gen aparţine familiei Streptococaceae şi cuprinde bacterii sub formă de coci

perechi sau tetrade. Metabolismul acestor bacterii este predominant fermentativ, homolactic. Se produce

acid lactic racemic (DL) din glucoză, fructoză, manoză. Sorbitolul şi amidonul nu sunt fermentaţi. Multe

specii sunt catalază-negative, dar se întâlnesc şi specii care au activitate catalazică independentă de hem.

Principalele criterii de diferenţiere între diferitele specii de pediococi sunt menţionate în tabelul 3.8:

13

P. acidilacti, în culturi starter, este utilizat pentru obţinerea de produse din carne fermentate la

temperaturi mai ridicate, deoarece are o dezvoltare bună la 42-52C, producând rapid acidul lactic şi deci

scade efectiv pH-ul, produsul obţinut având gust acrişor. Atunci când se utilizează la fermentarea unor

produse de carne la temperatura de 16-27C, producţia de acid lactic este mai lentă şi implicit se pot

dezvolta şi microorganismele care contaminează carnea, durata de fermentaţie fiind mai mare.

P. pentosaceus produce o fermentaţie rapidă când substratul conţine un glucid fermentescibil, temperatura

de fermentare fiind cuprinsă între 15-27C.

Din tabelul de mai sus rezultă că P. pentosaceus este mai eficace în ceea ce priveşte producţia de acid

lactic atât la 26,7C cât şi 29,4C în comparaţie cu P. acidilactici.

Având în vedere că pediococii produc acid lactic şi bacteriocine, ei exercită o acţiune inhibitoare faţă de

microorganismele patogene şi cele de alterare (stafilocici, salmonele, Cl. botulinum, bacili, enterobacterii

gram negative, drojdii).

În produsele de carne fermentate, pediococii pot scade pH-ul de la 5,6 la 4,5-5,2 ceea ce face ca

proteinele să fie aduse aproape de punctul izoelectric fapt ce favorizează sinereza şi deci uscarea

produsului.

Acidul lactic produs contribuie la denaturarea proteinelor din carne ceea ce contribuie la realizarea unei

texturi ferme a produsului finit.

Genul Lactobacillus. Acest gen aparţine familiei Lactobacillaceae. Această familie cuprinde bacterii sub

formă de bastonaşe de lungimi şi grosimi variabile, precum şi cocobacili scurţi, aşezaţi obişnuit în lanţuri

în faza de înmulţire logaritmică.

Sunt asporogene, imobile, Gram pozitive, anaerobe sau facultativ anaerobe. În general sunt catalază -

negative citocrom-oxidază - negative, nu reduc azotaţii, nu lichefiază gelatina. Au activitate proteolitică şi

lipolitică redusă. Glucidele cele mai bine fermentate sunt: lactoza, maltoza, zaharoza (mai ales în faza de

dezvoltare), apoi hexozele (glucoza, fructoza, galactoza).

Culturi starter Temperatura de

incubare, C

Durata, ore pH-ul

P. pentosaceus

P. acidilacti

P. pentosaceus

P. pentosaceus

26,7

26,7

29,4

29,4

20

38

13

28

5,00

5,65

5,00

5,40

14

Pentru dezvoltare necesită substanţe minerale şi toate vitaminele din grupul B. Se dezvoltă bine în mediu

cu pH 5,5-5,8, dar şi la pH 5. Se pot dezvolta în limite largi de temperatură (5-53C), dar temperatura

optimă este cuprinsă între 30 şi 45C.

În funcţie de temperatura optimă de dezvoltare lactobacilii pot fi:

- termofili: L. lactis, L. helveticus, L. bulgaricus, L. acidophilus, temperatura optimă fiind 37 - 45C;

- mezofili: L. casei, L. plantarum, L. brevis etc.; temperatura optimă de dezvoltare fiind 26 - 30C.

Orla Jensen a împărţit genul Lactobacillus în următoarele grupe:

1. grupa Thermobacterium care cuprinde lactobacili homofermentativi termofili: L. lactis, L. helveticus,

L. bulgaricus, L. acidophilus, L. delbrueckii; L. leichmanii;

2. grupa Streptobacterium - care cuprinde lactobacilii homofermentativi mezofili: L. casei, L, plantarum;

3. grupa: Betabacterium - care cuprinde lactobacili heterofermentativi, ce contaminează frecvent

brânzeturile: L fermenti, L. buchneri, L. brevis, L. viridiscens.

Streptobacteriile la rândul lor, au fost clasificate de către unii autori în neacidorezistente şi

acidorezistente.

Lactobacilii neacidorezistenţi produc compuşi aromatici (diacetil, acetoină). Se prezintă sub formă de

bastonaşe de lungimi variabile şi rar formează lanţuri .

Se pot dezvolta la 2 - 15C. Nu se dezvoltă la pH 5,6. Se utilizează în culturi starter la fermentarea

salamurilor crude cu pH = 5,6 - 6,1, produsele având o durată mare de maturare, iar gustul final fiind slab

acrişor dulceag.

Lactobacilii acidorezistenţi au formă de bastonaşe scurte care formează lanţuri.

Se dezvoltă bine la pH 5,0.

Activitatea metabolică a lactobacililor în produsele alimentare fermentate se referă la metabolismul

lactozei, galactozei şi glucozei. Zaharoza este fermentată numai după hidroliza acesteia în glucoză şi

fructoză.

Metabolismul lactozei Pentru a se dezvolta în lapte, lactobacilii homofermentativi hidrolizează lactoza cu

ajutorul -galactozidazei şi/sau - D - fosfogalactozid - galactohidrolazei, aşa cum arată în schema din

figura 1.14.

15

Figura 1.14. Transformarea lactozei în glucoză şi galactoză respectiv glucoza şi galactoza 6P de

către lactobacilii homofermentativi

- D - galactozid - galactohidrolaza este utilizată de Lb. casei iar - galactozidaza este utilizată de

majoritatea lactob deşi aceştia din urmă au şi activitate - D - fosfogalactozid - galactohidrolazică, însă

mai redusă.

L. bulgaricus are -galactozidază activă la pH = 7,0 şi este activată de Mg2+, Mn2+ şi Fe2+. În cele mai

multe cazuri, lactobacilii folosesc mai mult glucoza ca sursă de energie în comparaţie cu lactoza şi

galactoza. Unii lactobacili eliberează în mediu galactoză care se acumulează.

Metabolismul hexozelor După hidroliza lactozei în celulele lactobacililor homofermentativi, hexozele

rezultate sunt metabolizate pe calea Embden - Meyerhof.

Lactobacilii heterofermentativi fermentează hexozele pe calea hexozomonofosfatului, aceşti lactobacili

neavând aldolază şi triozofosfat izomerază care sunt enzime cheie în calea Embden - Meyerhof. Aceasta

este de fapt şi diferenţa dintre cele două grupe de microorganisme, adică lactobacilii homofermentativi

posedă atât aldolază cât şi triozofosfatizomerază, în timp ce lactobacilii heterofermentativi nu posedă

aceste enzime.

Galactoza, rezultată din lactoză, pentru a fi fermentată trebuie mai întâi să fie transformată într-un derivat

fosforilat al glucozei (glucozo-6P), care apoi suferă transformări pe calea Embden - Meyerhof (fig. 1.15.).

16

Figura 1.15. Transformarea galactozei în glucoză-6P de către lactobacili

Activitatea proteolitică. Activitatea proteolitică a lactobacililor contribuie atât la textura cât şi la aroma

unor produse alimentare (produse lactate, produse vegetale fermentate, produse din carne fermentate etc.),

dar şi la eliberarea unor aminoacizi care stimulează creşterea şi activitatea altor bacterii lactice folosite în

culturile starter în amestec cu lactobacilii. Se consideră că activitatea endoproteinazică a lactobacililor

este asociată cu membrana celulelor, iar activitatea exopeptidazică este localizată intracelular. Enzimele

din membrana celulelor produc hidroliza parţială a macromoleculelor proteice, din care se formează

peptide suficient de mici pentru a fi transportate în interiorul celulelor unde se continuă degradarea lor

până la aminoacizi, necesari creşterii (figura 1.16.).

Activitatea proteolitică a lactobacililor este optimă la pH 5,2 - 5,8 şi temperatura de 45 - 50C. La

temperaturi mai mari de 55C activitatea proteolitică este mult redusă datorită termodenaturării enzimei

iar la 70C/1min enzimele sunt complet inactivate.

În cazul laptelui, proteinazele extracelulare ale L. bulgaricus sunt active faţă de -cazeină, apoi în ordine

descrescătoare şi faţă de Қ şi cazeină.

Figura 1.16. Acţiunea endoproteinazelor extracelulare şi a exopetidazelor intracelulare în cazul

lactobacililor

Producerea de compuşi de aromă şi H2O2 Principala contribuţie a lactobacililor este producţia de acid

lactic. În cazul produselor lactate acide, deşi speciile de lactobacili implicate sunt homofermentative,

acestea însă produc şi alţi metaboliţi, printre care produşi volatili ca: acetaldehida, diacetil şi alcool. In

cantitate mai mare fiind produsă acetaldehida. În plus, L. casei produce diacetil din citrat, mai ales atunci

când laptele se suplimentează cu citrat (L. casei nu este însă un producător major de diacetil). Anumiţi

lactobacili produc H2O2 care se acumulează în mediul şi jenează dezvoltarea altora. Acumularea H2O2 în

mediul de cultură este posibilă pentru ca lactobacilii sunt catalază – negativi. Incapacitatea lactobacililor

17

de a distruge metabolic H2O2 explică de ce aceştia nu se dezvoltă bine în condiţii puternic aerobe,

oxigenul fiind toxic pentru lactobacili care nu posedă superoxiddismutază, enzimă care se constituie ca un

sistem de protecţie faţă de toxicitatea oxigenului, cum este cazul altor bacterii.

Acţiunea lactobacililor este îmbunătăţită prin interacţiuni cu alte bacterii lactice. De exemplu, cultura

mixtă formată din L. bulgaricus şi Str. thermophilus este adecvată pentru fabricarea iaurtului, deoarece

cultura mixtă produce mai rapid acid lactic.

Interacţiunea dintre cele două bacterii lactice este benefică din următoarele motive:

- L. bulgaricus produce aminoacizi liberi, în particular histidină, care stimulează producţia de acid lactic

a lui Str. thermophilus;

- Str. thermophilus, pe de altă parte, produce acid formic, care stimulează activitatea lui L. bulgaricus;

- Str. thermophilus, deşi produce o cantitate suficientă şi de CO2 care stimulează dezvoltarea lui L.

bulgaricus, totuşi dezvoltarea acestuia este mai redusă, deoarece Str. thermophilus utilizează mai rapid

anumite substanţe nutritive esenţiale pentru dezvoltarea lui L. bulgaricus. În plus, lactobacilii, în general,

sunt sensibili chiar la niveluri foarte reduse de antibiotice, în comparaţie cu Str. thermophilus ( de aici şi

necesitatea ca laptele să nu conţină urme de antibiotice).

Utilizarea culturilor de lactobacili:

În industria laptelui se utilizează Lactobacillus lactis şi Lactobacillus bulgaricus, singuri sau în amestec

la fabricarea iaurtului, chefirului, cumâsului, brânzei Ementhal, brânzeturilor italiene. Lactobacillus

helveticus este şi el implicat în unele din aceste produse. Lactobacillus acidophilus este folosit la

fabricarea laptelui acidofil, laptelui acidofil nefermentat şi a altor produse acidofile. Lactobacillus casei

se utilizează pentru obţinerea produsului yakult.

În industria cărnii interesează Lactobacillus sake, Lactobacillus curvatus şi în special Lactobacillus

plantarum care se caracterizează prin faptul că nu produce CO2 la fermentarea glucozei dar produce CO2

din gluconat. Riboza este fermentată la acid lactic şi acid acetic. Posedă activitate aldolazică, glucozo - 6P

- dehidrogenazică. Prin fermentaţie lactică se produce acid lactic racemic (DL). Lactobacillus plantarum

este facultativ anaerob, nu produce NH3 din arginină. Poate acidifica laptele şi are temperatura optimă de

dezvoltare la 30 - 35C. Nu necesită pantotenat, tiamină, niacină pentru dezvoltare.

Lactobacillus plantarum ca şi Lactobacillus sake pot descompune acidul gluconic cu formare de acid

acetic ceea ce este dezavantajos în cazul salamurilor la care se foloseşte glucono - delta - lactona ca

acidifiant chimic. Lactobacillus plantarum poate reduce NaNO3 dacă pH-ul mediului este mai mare de 6,0

şi nu există zaharuri fermentescibile în mediul de cultură. Lactobacillus sake şi Lactobacillus curvatus

produc H2O2 în prezenţa O2 atmosferic. Cei doi lactobacili se întâlnesc frecvent în salamurile crude fără

adaos de culturi starter (sunt componenţi ai microflorei spontane a compoziţiei de carne).

18

Alte utilizări Lactobacilii interesează şi în fermentarea măslinelor, verzii, castraveţilor, gogonelelor, în

producerea spirtului şi drojdiei presate în vederea acidifierii plămezilor, la fermentarea unor produse

fermentate din cereale (bragă, cvas), la fabricarea acidului lactic prin fermentare etc.

Genul Micrococcus şi Staphylococcus

Microorganismele din genurile Micrococcus şi Staphylococcus aparţin familiei Micrococaceae care

cuprinde bacterii sub formă de coci. Se pot dezvolta în medii care conţin 15% NaCl.

Pentru industria cărnii interesează anumite specii de micrococi şi stafilococi care sunt folosite pentru:

- capacitatea lor de a reduce azotaţii la azotiţi (contribuie la formarea culorii cărnii sărate în prezenţă de

azotaţi);

- activitatea lor catalazică;

- activitatea de acidificare, proteolitică şi lipolitică.

Dintre speciile de micrococci interesează Micrococcus aurantiacus şi Micrococcus varians.

Pentru industria laptelui, micrococii formează partea principală a populaţiei nelactice din laptele crud şi

respectiv brânzeturile fabricate din laptele crud. Din brânza Cheddar fabricată din lapte crud a fost izolat

Micrococcus freundenreichii, care a fost ulterior utilizat sub formă de cultură pură în scopul accelerării

formării aromei brânzei fabricate din lapte pasteurizat datorită activităţii proteolitice şi lipolitice. Tot în

scopul maturării unor brânzeturi cu pastă presată s-a utilizat un preparat enzimatic şi anume Rulactina ce

conţine o metal-protează cu activitate strict endoproteinazică obţinută din Micrococcus caseolyticus.

Din genul Staphylococcus interesează speciile de stafilococi coagulază-negativi, nepatogeni cum ar fi:

Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xilosus, Staphylococcus simulans.

Combinaţiile de micrococi şi stafilococi sunt eficace pentru activitatea azotat-reductazică şi catalazică. În

aceste combinaţii, Staphylococcus carnosus acţionează mai bine decât micrococii în formarea culorii,

reducând azotaţii la azotiţi şi respectiv azotiţii la oxid de azot, chiar în condiţii de aciditate ridicată a

substratului. Aroma produselor la care este utilizată cultura starter de Staphylococcus carnosus este

superioară.

Genul Streptomyces

Specii din genul Streptomyces pot altera alimentele, producând mirosuri şi gusturi dezagreabile, altele

(puţine la număr) sunt patogene.

Streptomyces griseus senso Hötter este însă inofensiv şi a fost folosit pentru capacitatea sa de a reduce

azotatul la azotit, putându-se dezvolta bine în substraturi care conţin ~ 8% NaCl şi care au pH = 5,8-8,5.

Temperatura optimă de dezvoltare este la 30C. Este catalază – pozitiv având capacitate proteolitică dar

19

nu şi lipolitică. Poate fi asociat cu micrococii şi/sau lactobacilii. În salamurile crude se inoculează la nivel

de 5·103 /g compoziţie.

Genul Propionibacterium

Bacterile din genul Propionibacterium fac parte din familiaPropionibacteriaceae. Bacteriile propionice

fermentează carbohidraţii, piruvatul/lactatul. Bacteriile propionice “tip lapte” sunt: Propionibacterium

freundreichii (cu subspeciile freundreichii, globosum şi shermani), Propionibacterium theonii,

acidipropionici şi jensenii.

Principalii produşi de fermentaţie a bacteriilor propionice sunt CO2, cantităţi mari de acid propionic şi

acetic şi cantităţi mici de acid izovalerianic, formic, succinic, lactic. Toate speciile produc acid lactic din

glucoză. Se dezvoltă foarte bine la 30-37C şi la pH = 7,0.

Producerea de propionat, acetat şi CO2 Lactatul (respectiv piruvatul) este transformat în propionat prin

reacţia:

3CH3-CHOH-COOH 2CH3-CH2-COOH + CH3-COOH + CO2 + H2O

Propionatul, acetatul şi CO2 se formează în proporţie de 2/1/1. Diferitele tulpini de bacterii propionice se

deosebesc între ele prin raportul acid propionic /acid acetic format, o influenţă în acest sens având şi

aciditatea substratului, cantitatea de lactat şi adaosul de carbonat şi succinat.

Producerea de prolină Prolina este considerată ca principalul component care conferă aromă dulceagă

brânzeturilor de tip şvaiţer, prezenţa prolinei fiind asociată cu dezvoltarea bacteriilor propionice la

maturarea brânzeturilor de tip şvaiţer. Se consideră că există trei căi pentru producerea de prolină:

- proteoliza generală;

- hidroliza peptidelor care conţin prolină;

- biosinteza prolinei.

La prima cale se ia în considerare producerea de prolină prin hidroliza cazeinei.

La a doua cale se ia în considerare formarea de prolină din hidrolizatul cazeinic prin acţiunea

peptidazelor (Propionibacterium shermanii posedă imidopeptidază şi proliniminopeptidază intracelulare

cu optim de pH la 5,5-6,0).

La a treia cale se are în vedere biosinteza prolinei din arginină şi mai puţin din acid glutamic, dar calea de

biosinteză este nesemnificativă în raport cu cea de-a doua cale menţionată.

În orice caz, concentraţia de prolină din interiorul celulelor este mai mică decât cea a prolinei din mediul

de cultură .

20

Eliberarea prolinei din peptide coincide cu eliberarea enzimelor celulare în mediu. Bacteriile propionice

singure hidrolizează încet cazeina, dar producerea de prolină în

brânzeturi este sporită prin dezvoltarea anterioară sau concomitentă a bacteriilor lactice. Viteza formării

prolinei la valorile pH şi concentraţia de NaCl atinsă în brânza şvaiţer este temporar încetinită, dar

maturarea prelungită anulează efectele de inhibare ale pH-ului şi concentraţia de NaCl. Se consideră că

ionii de cupru ar inhiba producerea de prolină pe unele căi, această inhibare parţială fiind benefică,

deoarece permite evoluarea altor procese de aromatizare.

Producerea de diacetil şi acetoină Bacteriile propionice pot produce diacetil şi acetoină, cantităţile

formate fiind mai mari la 21C decât la 32 - 37C. Producţia de diacetil este urmată de reducerea acestuia

la acetoină şi 2,3 butilenglicol. Cantitatea de diacetil creşte prin adaos de citrat, piruvat sau glucoză în

mediu de cultură. În culturile mixte de Str. lactis şi bacterii propionice, producţia de diacetil se intensifică

ca o consecinţă a scăderii pH-ului de către streptococi. Bacteriile propionice produc şi alte substanţe care

contribuie la aroma brânzeturilor: aldehidă acetică, aldehidă propionică, alcool etilic, alcool propilic,

dimetilsulfură, acid izovalerianic.

Alte activităţi metabolice Bacteriile propionice pot avea şi activitate proteolitică şi lipolitică.

Bacteriile propionice pot contribui într-o măsură mai mică la activitatea proteolitică din brânza Şvaiţer

prin enzimele proteinazice (~12 enzime) şi peptidazice (~ 7 enzime), dar activitatea proteolitică a

bacteriilor propionice este inferioară bacteriilor lactice (L. bulgaricus, L. helveticus, Str. thermophilus).

Bacteriile propionice pot contribui şi la lipoliza trigliceridelor, eliberând acizi graşi cu lanţ lung, dar

această activitate lipolitică este nesemnificativă.

DROJDIILE, ciuperci unicelulare care se înmulţesc prin înmugurire, mai rar prin sciziparitate şi care

formează ascospori (sunt şi drojdii care nu formează spori, acestea denumindu-se drojdii/false torule şi

micoderme), sunt agenţi tipici ai fermentaţiei alcoolice.

Se prezintă sub formă de celule rotunde sau ovoide (Saccharomyces cerevisiae), eliptice (Saccharomyces

elipsoideus), foarte alungite (Saccharomyces pasteurianus), de forma unei lămâi (Saccharomyces

apiculans), de forma unei sticle (Saccharomyces ludwigii) sau sub formă de cilindru (Pichia).

Dintre drojdii interesează (în sens util) cele aparţinând familiei Saccharomycetaceae, genul

Saccharomyces care cuprinde drojdii alcooligene folosite în industria berii, vinului, pâinii, spirtului,

genul Kluyveromices care fermentează lactoza, genul Debaryomices care se utilizează în industria cărnii.

Mai interesează drojdiile familiei Cryptococcaceae (genurile Candida, Torulopsis) care se folosesc ca

agenţi de fermentare şi producători de biomasă.

21

Utilizări ale drojdiilor

1. Utilizarea pentru fermentarea alcoolică. Pentru fermentaţia alcoolică se folosesc drojdiile adevărate

care aparţin genului Saccharomyces (Meyen) Ress şi care se caracterizează prin aceea că nu formează

micelii tipic, produc 1 - 4 spori, iar puterea de fermentare depăşeşte puterea de respiraţie. Sunt adaptate la

condiţii de anaerobioză şi prin urmare nu formează voaluri la suprafaţă.

După modul de comportare în timpul fermentaţiei drojdiile pot fi:

de fermentaţie superioară care se ridică în cantităţi mari la suprafaţa lichidului de fermentare sub forma

unui strat gros de spumă care se păstrează astfel până la sfârşitul fermentării. După sedimentare aceste

drojdii rar dau un precipitat dens. Au optim de temperatură la 28 - 30C şi fermentează 1/3 din rafinoză.

În categoria drojdiilor de fermentare superioară se încadrează cele care produc fermentarea alcoolică în

cazul obţinerii alcoolului etilic, pâinii şi unele suşe pentru bere (Saccharomyces cerevisiae);

de fermentaţie inferioară care se dezvoltă în lichidul fermentat, nu se ridică la suprafaţă în spumă,

dar formează flocoane şi se sedimentează repede. Au optim la temperatura de 8 - 12 C şi fermentează

complet rafinoza. Drojdiile de fermentare inferioară se folosesc la obţinerea berii, vinului, cidrului

(Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces oviformis, Saccharomyces vini, Saccharomyces uvarum).

Fermentaţia alcoolică produsă de drojdii este influenţată de:

- concentraţia zahărului fermentescibil din mediu;

- temperatură ;

- conţinutul în alcool din substrat;

- felul drojdiei.

Concentraţia favorabilă de zahăr fermentescibil este de 10-15%. Fermentaţia alcoolică se desfăşoară lent

la pH 4-4,5, în mediu alcalin sensul fermentaţiei fiind schimbat.

Viteza maximă de fermentare este la 30C, dar în practică se realizează la 4…28C. Alcoolul pe măsura

acumulării în mediu devine toxic pentru drojdii. Există drojdii care se dezvoltă la 16-18% alcool

(Saccharomyces chevalieri Guilliermond, Saccharomyces oviformis), însă în cele mai multe cazuri

fermentaţia se opreşte la 12-14% (Saccharomyces uvarum, Saccharomyces carlsbergensis,

Saccharomyces vini, Saccharomyces cerevisiae).

Odată cu creşterea temperaturii de fermentare se măreşte toxicitatea alcoolului. Fermentaţia alcoolică este

un proces anaerob. Prin trecerea la aerobioză, drojdiile se înmulţesc rapid şi produc biomasă.

Fermentarea alcoolică nu este o fermentaţie pură. Se mai formează glicerină (8% din totalul zaharurilor

existente în mediu), acid lactic, acid acetic, substanţe acetoinice (acetil metil carbinol = acetoină şi

diacetil), acid malic, acid succinic, acid propionic, acid citramalic, acid dimetilgliceric, alcooli superiori:

22

izobutilic, izoamilic, amilic, care provin din aminoacizii rezultaţi la degradarea substanţelor pectice din

musturi şi plămezi.

Aceşti alcooli superiori se formează prin reacţii de dezaminare şi decarboxilare ale aminoacizilor leucină,

izoleucină şi valină.

Fermentaţia alcoolică se aplică la:

obţinerea alcoolului din produse amidonoase (cartofi, porumb, secară), produse care conţin zaharoză

(sfeclă, melasă), produse care conţin lactoză (zer), produse care conţin glucoză (hidrolizate celulozice,

leşii sulfitice);

obţinerea berii şi vinului, cidrului inclusiv cvas din pâine, rom, whisky;

obţinerea de băuturi fermentate pe bază de cereale şi leguminoase;

obţinerea unor tipuri de produse lactate (chefir);

obţinerea de băuturi fermentate pe bază de zer.

2. Utilizarea pentru obţinerea de biomasă (s-a menţionat anterior);

3. Utilizarea în industria cărnii, în care caz se foloseşte drojdia Debaromyces hansenii care este tolerantă

la NaCl, nu reduce NaNO3 şi necesită oxigen atmosferic pentru dezvoltare.

Se dezvoltă bine în straturile periferice ale salamurilor neafumate sau puţin afumate. Această drojdie are

capacitatea de a consuma oxigenul din pastă şi de a distruge peroxizii produşi de bacteriile lactice. De

regulă, Debaromyces hansenii se foloseşte în combinaţie cu Staphylococcus carnosus şi Lactobacillus

plantarum sau Staphylococcus xilosus şi Lactobacillus sake. Se consideră că prin folosirea drojdiei

menţionate produsele capătă o aromă cu totul deosebită.

4. Utilizarea în industria laptelui La fabricarea brânzeturilor, drojdiile se dezvoltă la suprafaţa

brânzeturilor dar şi în interiorul brânzeturilor cu pastă moale sau cu mucegai în pastă în timpul presării,

zvântării şi maturării, având următoarele acţiuni pozitive:

consumă lactatul şi în acest fel contribuie la neutralizarea pastei, îmbunătăţind prin aceasta consistenţa

şi favorizând implantarea bacteriilor;

produc factori de creştere pentru dezvoltarea bacteriilor;

produc o peliculă de “acoperire” la anumite tipuri de brânzeturi;

produc proteoliză şi lipoliză şi prin urmare contribuie la consistenţa şi aroma brânzei respective;

produc compuşi volatili de aromă.

Dintre drojdii, Candida hansei a fost cultivată în asociaţie cu lactobacili şi Str. thermophilus, favorizând

oxidarea lactatului, scăderea potenţialului de oxidoreducere şi producerea de factori de creştere, precum şi

23

dezvoltarea culturilor starter în care este asociată. Drojdia Candida lipolitica este uneori folosită la

fabricarea brânzeturilor cu mucegai în pastă, datorită faptului că prin lipazele conţinute realizează o

hidroliză a lipidelor din brânză, fapt ce favorizează utilizarea acizilor graşi de către Penicillium în

reacţiile de -oxidare. Drojdia Torulopsis candida găsită pe brânzeturi se dezvoltă bine în medii acide şi

suportă concentraţii de NaCl până la 10%. Drojdia Candida kefir şi alte drojdii din granula de chefir

realizează fermentaţia alcoolică în produsul lactat acid dietetic chefir.

Kluyveromices lactis şi Kluyveromices fragilis se utilizează la obţinerea de lactază care are multe

utilizări. Kluyveromices lactis şi Kluyveromices fragilis se utilizează la obţinerea de biomasă prin

cultivare aerobă pe zer (procedeul Bell - Franţa).

Kluyveromices fragilis şi Candida pseudotropicalis se utilizează pentru obţinerea alcoolului etilic din zer

(procedeul Carbery - Irlanda).

MUCEGAIURILE Pentru industria alimentară interesează clasa Phycomycetes cu următoarele genuri:

Genul Mucor şi Rhizopus aparţinând familiei Mucoraceae.

Aceste mucegaiuri care se întâlnesc pentru diferite produse vegetale şi alimentare, sub formă de colonii

pufoase, au o acţiune fermentativă netă.

Speciile de Mucor şi Rhizopus se folosesc pentru:

- obţinerea unor produse alimentare fermentate în Orientul Îndepărtat, pe bază de cereale şi leguminoase;

- în producţia de spirt prin zaharificarea amidonului (procedeul Amilo care foloseşte Amylomyces rouxi -

Mucor rouxianus);

- în producţia de enzime, în principal amilolitice şi proteolitice.

Din clasa Ascomycetes interesează ordinul Plectascales cu genurile Aspergillus şi Penicillium.

Mucegaiurile din genul Aspergillus se utilizează în:

- producţia de şuncă în SUA şi Spania (mai puţin);

- obţinerea de produse fermentate tradiţionale în Orientul Îndepărtat (ceva mai mult);

- obţinerea de enzime: amilaze, proteaze, enzime pectolitice.

Mucegaiurile din genul Penicillium se utilizează în:

- industria brânzeturilor cu mucegai la suprafaţă şi în pastă (Penicillium camemberti şi Penicillium

roqueforti);

- industria cărnii cu mucegaiuri de acoperire (Penicillium nalgiovensis şi Penicillium exposus);

- obţinerea de enzime amilolitice, proteolitice, pectolitice.

24

În industria cărnii, culturile de spori de mucegai se utilizează pentru maturarea unor şunci, care se

însămânţează cu spori de Penicillium netoxicogen, în special P. nalgiovensis, P. exposum, şi P.

chrysogenum, respectiv Country curred ham şi Jambon Serano, care se însămânţează cu spori de

Aspergillus glaucus şi a unor tipuri de salamuri crude fabricate în România, Italia, Ungaria, Elveţia,

Spania, Franţa, Bulgaria; Austria, Belgia, Germania (şi mai puţin în SUA, Israel, Iugoslavia, Polonia).

În cazul salamurilor crude afumate/neafumate, mucegaiurile de acoperire contribuie la:

- reglarea eliminării apei din produs şi a schimbului de gaze;

- formarea aromei;

- îmbunătăţirea aspectului comercial al produsului.

Aroma este mai evidentă la salamurile cu diametru mai mic. Produsele pot fi livrate cu mucegaiul de

acoperire intact sau după “ periere”. Culoarea miceliului rămas este dependentă de varietatea mucegaiului

folosit: alb-ivorie (preferabilă în Italia); gri (preferabilă în Ungaria); alb-mat (preferabilă în România).

Prin utilizarea culturilor pure de mucegai se suprimă apariţia la suprafaţa salamurilor a mucegaiurilor

toxicogene, în special a celor producătoare de aflatoxine precum şi a mucegaiurilor de “pătare” care

produc spoturi de culoare verde sau neagră.

Penicillium nalgiovensis Se utilizează spori de Penicillium nalgiovensis pentru salamurile crude cu

miceliu alb la suprafaţă. Sporii, în suspensie, se pulverizează la suprafaţa produselor. După 3-4 zile de la

însămânţare se formează

micelii, iar după 5-6 zile de la însămânţare apar corpii de fructificaţie purtători de conidii. Temperatura

optimă de dezvoltare a mucegaiului este de 22-23C.

Penicillium nalgiovensis foloseşte ca substrat nutritiv glucidele dar are şi activitate proteolitică şi

lipolitică. Nu are activitate celulazică şi nu produce micotoxine.

Penicillium expansum se dezvoltă bine la 22C şi umiditatea relativă a aerului este de ~ 82% pentru

sporulare şi ~ 88% pentru germinare. Dezvoltarea bună este la = 92-95%. Sporii pulverizaţi la

suprafaţa batoanelor formează un miceliu pufos în circa 8 zile de la însămânţare, maturizarea deplină

având loc după 30 zile de la însămânţare. Penicillum expansum nu produce micotoxine dacă substratul

conţine proteine cu sulf (cazul pastei salamurilor crude).

În industria laptelui culturile de spori de mucegai se utilizează, aşa cum deja s-a menţionat, la fabricarea

brânzeturilor cu mucegai în pastă cât şi cu mucegai la suprafaţă (brânzeturi cu pastă moale).

Pentru brânzeturile cu mucegai în pastă (Brânza Roquefort, Gorgonzola, Stilton, Gammelost) se utilizează

spori de Penicillium roquefort. Pentru brânzeturile de tip

Camembert se utilizează sporii de la două specii de Penicillium: P. camemberti şi P. caseicolum.

Mucegaiurile dezvoltate în/pe aceste brânzeturi au rol fundamental în:

25

- formarea aromei şi gustului;

- formarea consistenţei;

- definitivarea aspectului, procesele care intervin în formarea aromei şi consistenţei fiind proteoliza,

lipoliza şi -oxidarea acizilor graşi.

Suspensiile de spori se pot adăuga/folosi:

- în laptele destinat brânzeturilor sau amestecarea cu coagulul obţinut în cazul brânzei cu mucegai în

pastă;

- în laptele destinat fabricării brânzei, sau pulverizare la suprafaţa brânzei formate în cazul brânzeturilor

cu mucegai la suprafaţă. Mucegaiurile mai importante pentru industria laptelui sunt:

Penicillium roqueforti Thom se dezvoltă bine la 20-25C şi pH 4,5-7,5. Tolerează concentraţii de 5-8%

NaCl. Are activitate proteolitică, lipolitică şi de -oxidare a acizilor

graşi. Activitatea mucegaiului este stânjenită de prezenţa acidului propionic în brânză, la concentraţii mari

de 30% CO2 în aerul depozitului. Pentru intensificarea formării aromei se recomandă ca lipidele din lapte

să fie în prealabil lipolizate cu esterază pregastrică, astfel ca pe măsură ce mucegaiul sporulează, acizii

graşi liberi să fie -oxidaţi până la metilcetone. P. roqueforti se dezvoltă în canalele şi golurile practicate

în pasta brânzei, sporii formaţi având culoare verde închis care conferă brânzei un aspect marmorat.

Penicillium camemberti şi Penicillium caseicolum Sporii acestor mucegaiuri se utilizează în producţia

brânzeturilor de tip Camembert incluzând Camembert, Brie, Neufchatel, Coulommier, Garré de l’Est,

Olivet.

Penicillium camemberti Thom (Penicillium album) se utilizează la brânzeturile tip Camembert cu pastă

mai untoasă, mai parfumată, de culoare gri - alburie.

Penicillium caseicolum Bainer (Penicillium candidum) se utilizează la brânzeturile de tip Camembert cu

pasta mai compactă, o aromă mai delicată, mai discretă şi de culoare alb - imaculat.

La însămânţare prin pulverizare de spori la suprafaţă a brânzeturilor cu umiditate ~ 55-60% se formează

miceliile de mucegai care consumă din aciditatea pastei, consecinţa fiind creşterea pH-ului începând cu a

12 - a zi, iar după 27 de zile pH-ul rămâne constant.

Mucegaiurile din genul Penicillium au activitate endoproteinazică faţă de - şi cazeină, dar au şi

activitate exopeptidazică importantă, fiind demonstrat faptul că atât P. roqueforti cât şi P. camemberti

sintetizează 2 endopeptidaze (o metal proteinază şi o aspartil proteinază) precum şi două exopeptidaze cu

acţiune carboxi- şi aminopeptidazică, activitatea celor două grupe de enzime fiind relativ echivalentă în

stratul de suprafaţă al brânzeturilor.

Unele specii de Penicillium camemberti pot produce o micotoxinâ (acidul ciclopiazonic, dar activitatea

toxicogenă a mucegaiului este aproape nulă la temperatura tehnologică de maturare a brânzei (14-16C).

26

La brânza Camembert se pot utiliza şi spori de Geotricum candidum care se introduc în lapte. Geotricum

reduce pericolul formării peptidelor amare, inhibă dezvoltarea lui Penicillium, consumă acidul lactic şi

deci contribuie la neutralizarea pastei, având şi acţiune protolitică şi lipolitică.

Brânza Camembert obţinută din lapte pasteurizat cu adaos de Geotricum candidum are o aromă

asemănătoare cu cea a brânzei Camembert tradiţionale, adică fabricată din lapte crud.

1.3.2. Culturi starter

Culturile starter sunt definite ca acele culturi care se obţin plecând de la o cultură pură stoc şi care prin

trecere prin culturi intermediare (pasaje) devin apte de a fi folosite pentru producţia unor alimente

fermentate. Culturile starter pot fi formate numai dintr-un singur microorganism sau din mai multe

microorganisme.

Culturile starter de microorganisme sunt utilizate în vederea:

dirijării unor procese biochimice prin care se asigură produsului un anumit grad de inocuitate (inclusiv

capacitatea de conservare);

asigurării unor însuşiri senzoriale;

asigurării, în unele cazuri, şi a unor însuşiri nutritive.

La folosirea culturilor starter în industria alimentară trebuie să se aibă în vedere următoarele:

să conţină un anumit număr de microorganisme viabile (g/ml) şi un număr cât mai redus de germeni

nedoriţi;

produşii metabolici, primari şi secundari, să nu prezinte pericol pentru sănătatea oamenilor;

să nu conţină şi să nu producă antibiotice care se utilizează în scop terapeutic la oameni;

să aibă o anumită (anumite) activităţi specifice: de producere a acidului lactic, de reducere a azotului

etc;

microorganismele existente în cultură să fie declarate cu numele ştiinţific întreg;

speciile (suşele) noi care se introduc în producţie, trebuie să fie înregistrate la MS şi să fie depozitate în

colecţii cu nomenclator; înainte de utilizare în producţie să fie testate din punct de vedere al inocuităţii în

conformitate cu legislaţia în vigoare;

suşele declarate a fi sigure trebuie controlate la intervale regulate de către institute specializate, în ceea

ce priveşte puritatea lor;

speciile, care pe baza noilor cunoştinţe ştiinţifice au fost recunoscute ca având potenţial patogen sau

toxicogen, trebuie să fie supuse unui control riguros pentru fiecare suşă, realizându-se studii de toxicitate

pe termen lung, de carcinogenitate şi mutagenitate.

Toate cele menţionate trebuie să se constituie ca o obligativitate absolută deoarece:

27

culturile starter se pot consuma în stare vie, odată cu produsul alimentar, aşa cum este cazul produselor

lactate acide, brânzeturilor, salamurilor şi cârnaţilor cruzi, a unor sortimente de bere, a unor produse

vegetale: varză murată, castraveţi muraţi, gogonele murate, măsline verzi;

culturile starter se pot consuma după distrugerea lor, rămânând în produsul alimentar atât ele cât şi

produşii lor de metabolism, aşa cum este cazul brânzei proaspete de vaci şi a iaurtului care au fost

pasteurizate, brânzeturilor topite, produselor de panificaţie etc.;

produşii de metabolism ai culturilor starter se consumă odată cu produsele alimentare, însă

microorganismele sunt eliminate în cea mai mare parte, aşa cum este cazul berii, vinului, alcoolului,

oţetului, acidului citric, acidului lactic etc.

Culturi starter de bacterii lactice

Culturile starter de bacterii lactice sunt folosite în diferite domenii: industria laptelui, cărnii, produselor

vegetale murate, industria vinului, industria panificaţiei, industria sucurilor de fructe şi legume fermentate

etc.

Folosirea culturilor starter de bacterii lactice asigură produselor alimentare în care se introduc un anumit

grad de inocuitate. Această asigurare este realizată deoarece bacteriile lactice produc:

acizi organici, în principal acid lactic, dar şi acid acetic, alcool, CO2;

substanţe bacteriocine eliberate în mediul de cultură;

peroxizi organici (H2O2).

În plus, bacteriile lactice intră în competiţie cu microorganismele patogene şi cele de alterare în ceea ce

priveşte consumul de substanţe nutritive, iar datorită şi acidifierii mediului, consecinţă a acumulării

acizilor organici, bacteriile patogene şi de alterare sunt inhibate în dezvoltarea lor. Dintre bacteriile

patogene sunt inhibate stafilococii, salmonelele, Listeria monocytogenes, Cl. botulinum etc.

Datorită acidităţii se inhibă şi dezvoltarea microflorei cu activitate proteolitică şi decarboxilazică, deci se

formează cantităţi mai reduse de amine biogene, iar în cazul cărnurilor sărate în prezenţă de azotiţi,

datorită acidităţii se favorizează descompunerea mai completă a azotiţilor, deci scade producţia de

nitrozamine, mai ales la produsele care se supun coacerii şi prăjirii.

Culturile starter de bacterii lactice folosite ca atare sau sub formă de produse lactate dietetice acide sunt

benefice pentru sănătatea oamenilor deoarece:

aciditatea lactică favorizează acţiunea pepsinei ce produce hidroliza proteinelor, respectiv coagularea

cazeinei laptelui care este în continuare degradată de tripsina pancreatică;

aciditatea mediului intestinal blochează dezvoltarea microflorei cu activitate patogenă şi favorizează

28

implantarea bifidobacteriilor cu consecinţe pozitive pentru organismul uman (vezi capitolul probiotice).

În legătură cu bacteriocinele, în continuare se fac următoarele precizări:

- bacteriocinele sunt secretate de bacteriile Gram negative;

- bacteriocinele sunt proteine şi activitatea lor dispare prin hidroliza lor de către proteaze;

- bacteriocinele au acţiune bactericidă, dar nizina este şi bacteriostatic. Multe bacteriocine sunt

bacteriostatice la aplicarea lor în produsele alimentare;

- bacteriocinele sunt excretate în mediu în cea mai mare parte; o mică parte rămân în celulele bacteriene;

- bacteriocinele diferă de antibiotice prin natura speciilor şi suşelor producătoare, modalităţile de

producere şi natura lor chimică;

- bacteriocinele secretate de bacteriile lactice din culturile starter sau de protecţie au un spectru de acţiune

relativ limitat în raport cu mai multe specii sau mai multe suşe ale aceleiaşi specii.

- bacteriocinele sunt sensibile la acţiunea enzimelor proteolitice metabolice, ceea ce înseamnă că

ingerarea de produse ce conţin bacteriocine nu modifică microbiota tractului intestinal şi nu va conduce la

riscuri în ceea ce priveşte folosirea de antibiotice comune;

- bacteriocinele sunt stabile la căldură, deci rezistă în laptele pasteurizat la 63 C/30s minimum sau la

72C/15 s; rezistenţa lor termică se datorează structurii moleculare simple (excepţie face helveticina J care

are o structură proteică mai elaborată);

- bacteriocinele sunt stabile la pH neutru sau acid, ceea ce înseamnă că sunt adaptate la condiţiile de

mediu ale bacteriilor producătoare;

- eficacitatea bacteriocinelor în produsele fermentate este limitată de condiţiile de conducere a

fermentaţiei (temperatură, pH, aw)

Culturi starter utilizate in industria laptelui

La obţinerea culturilor starter trebuie să avem în vedere în mod deosebit următoarele:

- mediul de cultură (laptele);

- tratamentul termic aplicat laptelui;

- condiţiile de incubare;

- interacţiunile dintre speciile/tulpinile din cultura starter;

- eventualele infectări cu bacteriofagi;

- instabilitatea culturilor starter de bacterii lactice.

29

De la început, facem precizarea că prin cultură starter înţelegem culturile obţinute din cultura pură stoc

(inoculum) prin diferite pasaje. Culturile starter sunt folosite la fabricarea unor produse lactate acide,

smântână, unt, brânzeturi.

Culturile starter de bacterii lactice utilizate în industria laptelui pot fi clasificate în mezofile şi termofile.

Culturile starter mezofile, care la rândul lor, pot fi clasificate în:

a) Culturi starter singulare (single strain starter) care conţin numai Str. lactis subsp. lactis şi respectiv Str.

lactis subsp. cremoris (Lactococcus lactis şi Lactococcus cremoris) ambii homofermentaticvi care produc

acid lactic (L+) în proporţie de 0,8%. Folosirea acestor culturi starter singulare a apărut ca o necesitate de

a se evita formarea “ochiurilor” de fermentare la unele brânzeturi, “ochiuri” formate în urma producerii

de CO2 de către bacteriile aromatizante.

Culturile starter singulare mezofile prezintă următoarele avantaje:

- se poate utiliza continuu aceeaşi cultură cu activitate relativ constantă şi previzibilă;

- nu este necesară alternarea culturilor, eliminându-se riscul deprecierii acestora de către fagi,

- se folosesc cantităţi mai mici de inoculum pentru obţinerea de cultură primară şi secundară;

- influenţele compoziţionale sezoniere ale laptelui sunt mai reduse;

- se creează condiţii de realizare a unei producţii standardizate de produse lactate de calitate superioară;

- cultura poate fi controlată şi supravegheată din punct de vedere al caracteristicilor sale (sensibilitate la

fagi, producerea de acid lactic, compatibilitatea ei, aglutinarea şi eventual lisogenia).

Culturile starter singulare mezofile prezintă însă următoarele dezavantaje:

- pot fi depreciate de tulpinile producătoare de bacteriocine;

- pot fi depreciate de fagi, deci sunt predispuse la liză fagică;

- pot suferi pierderi de plasmide şi deci pot pierde una sau mai multe din funcţiile lor.

b) Culturi starter multiple mezofile sunt acele culturi care se bazează pe folosirea a 5-6 tulpini

selecţionate, neînrudite pe plan fagic şi cultivate separat până la stadiul de cultură primară sau chiar până

la stadiul de cultură starter de producţie când se amestecă între ele. În aceste condiţii, tulpinile nu se

dezvoltă împreună decât cel mult timp de 10 generaţii, ceea ce face ca nici o tulpină să nu devină

dominantă. Asemenea culturi pot fi folosite mai multe luni în şir fără a-şi pierde capacitatea de acidifiere.

30

c) Culturi starter mezofile mixte Aceste culturi sunt formate, de regulă, din două tipuri de bacterii lactice:

- bacterii lactice acidifiante: Str. lactis sau Str. cremoris;

- bacterii lactice producătoare de aromă: Str. diacetilactis (Lactococcus lactis var. diacetilactis) sau

specii de leuconostoci.

După tipul bacteriilor aromatizante culturile starter mixte mezofile pot fi clasificate în următoarele grupe:

culturi starter mixte tip L care conţin numai specii din genul Leuconostoc: Leuconostoc cremoris

(citrovorum), Leuconostoc dextranicum şi/sau Leuconostoc lactis care sunt toţi heterofermentativi şi

produc acid lactic D(-);

culturi starter mixte de tip D care conţin Str. lactis biov. diacetilactis ca singură specie producătoare de

aromă;

culturi starter mixte tip LD care conţin atât specii de leuconostoci cât şi Str. lactis subsp. diacetilactis ca

producători de aromă.

La folosirea culturilor starter mixte trebuie să avem în vedere că:

- streptococii acidifianţi mezofili homofermentativi produc acid lactic din lactoză;

- leuconostocii, cei heterofermentativi, şi Str. lactis subsp. diacetilactis (homofermentativ) produc

diacetil şi acetoină din citrat, dar produc şi acid lactic, acetic prin fermentarea lactozei şi glucozei;

Culturi starter termofile

Culturile starter termofile pot fi:

acidifiante: Lactobacillus acidophilus;

acidifiante/aromatizante care la rândul lor pot fi constituite din unul sau mai multe specii de lactobacili

şi dintr-o specie de streptococi. În această direcţie amintim:

- cultura starter termofilă pentru iaurt: Lactobacillus bulgaricus şi Str. therrmophilus;

- cultura starter termofilă pentru brânzeturi: Lactobacillus bulgaricus + Lactobacillus lactis +

Lactobacillus helveticus + Str. thermophilus. Această cultură starter se foloseşte la fabricarea

brânzeturilor cu pastă tare şi semitare, deci la care se practică încălzirea a doua a bobului de coagul.

Utilizarea culturilor starter termofile este benefică deoarece:

produc acid lactic deci scad pH-ul laptelui şi determină coagularea acestuia (cazul iaurtului); la

brânzeturi acidifierea favorizează eliminarea zerului din coagul;

31

au activitate proteolitică şi prin urmare contribuie la ameliorarea proprietăţilor reologice şi la aroma

produselor fermentate; ca urmare a activităţii proteolitice rezultă şi aminoacizi din proteine care

stimulează dezvoltarea celorlalte bacterii din culturile starter termofile;

produc şi compuşi de aromă, dar în principal aldehidă acetică, acetonă, precum şi urme de acetoină;

produc şi substanţe cu caracter filant care influenţează vâscozitatea produsului (Str. thermophilus în

cultura pentru iaurt);

produc o serie de bacteriocine (Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei

etc.);

produc H2O2 (Lactobacillus bulgaricus).

Având în vedere cantităţile mari de iaurt ce se fabrică pe plan mondial, este necesar să cunoaştem factorii

care influenţează performanţa optimă a culturilor pentru iaurt. Aceşti factori se referă la:

temperatura de incubare care este de 41 - 42C (apropiată de temperatura optimă de dezvoltare a lui

Lactobacillus bulgaricus ). După 3 ore de incubare se ajunge la ~ 500 mil bacterii/g, raportul dintre L.

bulgaricus şi Str. thermophilus fiind 1/1;

tratamentul laptelui - pasteurizarea influenţează pozitiv dezvoltarea lui L. bulgaricus prin:

- modificarea structurii proteinelor;

- eliminarea parţială a oxigenului şi realizarea unei microaerofilii propice;

- distrugerea inhibitorilor din lapte;

- formarea de acid formic care favorizează dezvoltarea culturii;

disponibilitatea substratului Laptele este un bun substrat dar trebuie arătat că Lactobacillus bulgaricus

are preferinţă faţă de glucoză şi deci ar trebui ca lactoza să fie prehidrolizată la - galactozidaza;

metaboliţi produşi în mediu. Lactobacillus bulgaricus produce H2O2 în mediul de cultură şi deci adausul

de catalază va stimula producţia de acid lactic de către Str. thermophilus care este mai sensibil la H2O2

decât Lactobacillus bulgaricus. Laptele destinat iaurtului nu trebuie să fie agitat prea mult ca să nu

includă aer (oxigen) care ar strica condiţiile de microaerofilie pentru L. bulgaricus şi ar deveni toxic

pentru Str. thermophilus. Lactobacillus bulgaricus se apără de acţiunea oxigenului prin intermediul

manganului intracelular care înlocuieşte acţiunea superoxiddismutazei;

interacţiunile dintre bacterii din cultura pură (inoculum) sau cultura starter. Între cele două

microorganisme există un sinergism deosebit. Lactobacillus bulgaricus produce aminoacizi din cazeină

care sunt necesari dezvoltării lui Str. thermophilus care, la rândul său, favorizează dezvoltarea lui L.

bulgaricus prin producerea de acid formic şi CO2;

32

calitatea laptelui ca substrat de fermentare. Acesta nu trebuie să conţină antibiotice, substanţe

conservante, dezinfectante şi să provină de la animale sănătoase cu maximum 400000 leucocite/ml.

Controlul culturilor starter de bacterii lactice

Controlul culturilor starter implică următoarele determinări:

examenul microscopic care trebuie să arate raportul dintre coci şi bacili, raport care trebuie să se situeze

în limitele 1/1-1,5/1;

activitatea acidifiantă care se urmăreşte prin determinarea acidităţii titrabile atunci când cultura se află

în fază logaritmică. În acest fel se pot pune în evidenţă culturile “rapide” şi “lente” (fast and slow);

rezistenţa la aciditate, ţinându-se seama că Lactobacillus bulgaricus rezistă până la ~ 1,7% aciditate iar

Str. thermophilus până la 0,8%. Rezistenţa la aciditate se urmăreşte prin determinarea supravieţuitorilor

după ce în mediul de cultură se atinge o aciditate critică;

rezistenţa la răcire care este importantă pentru produsele lactate ce se congelează (iaurt, îngheţata de

iaurt). Rezistenţa la răcire se urmăreşte la – 6 - 9C şi apoi la -18C sau - 25C ;

producerea de substanţe filante care constă în măsurarea vâscozităţii pe o probă inoculată de lapte cu

12% s.u., cu adaos de CaCl2 0,012%, incubată 4 ore/37C până ce se atinge un pH de 4,2 - 4,3. Se pot

depista în acest fel culturile filante;

activitatea proteolitică se poate urmări pe o cultură păstrată la 4C la care se determină tirozina sau

aminoacizii liberi prin metoda formol titrimetrică;

activitatea lipolitică se poate determina prin măsurarea indicelui de aciditate din grăsimea culturii

(lapte);

proprietăţile senzoriale se determină la culturile de 24 - 48 ore la 20C (se pot determina şi substanţele

de aromă respectiv diacetilul, acetaldehida, acetoina).

CULTURI STARTER CONCENTRATE DE MICROORGANISME

Definiţie

Culturile starter concentrate sunt definite ca acele culturi dezvoltate în condiţii controlate, concentrate

într-un volum mic şi conservate prin congelare sau uscare în vederea depozitării şi transportului.

33

Culturile concentrate pot fi de bacterii, drojdii, spori de mucegai. În ceea ce priveşte culturile starter

concentrate de bacterii cele mai des utilizate sunt culturile de bacterii lactice. Pe lângă acestea se folosesc

şi alte culturi de bacterii concentrate: micrococi, pediococi, stafilococi, streptomicii, bacterii propionice,

etc.

Culturile concentrate de bacterii pot fi utilizate pentru:

obţinerea culturilor starter de producţie (maiele de producţie);

obţinerea produselor fermentate prin utilizare directă în lapte, compoziţii carnate etc.

Indiferent de domeniul de utilizare, culturile starter concentrate pot fi obţinute prin două procedee:

procedeul de cultivare periodică;

procedeul de cultivare continuă.

Tehnologia de obţinere a culturilor starter concentrate

Tehnologia de obţinere include următoarele operaţii de bază:

inocularea mediului de cultură cu microorganismul din cultura stoc;

incubare pentru multiplicare la nivel maxim;

concentrarea mediului împreună cu celulele sau separarea celulelor, de regulă prin centrifugare şi

resuspendare într-un lichid adecvat,

conservare prin congelare şi uscare;

depozitare în stare congelată şi uscată.

În tehnologia de obţinere a culturilor starter concentrate trebuie ales un mediu de cultură care să asigure

toate substanţele pentru dezvoltarea (multiplicarea) culturii, realizându-se un control riguros al

temperaturii şi menţinerii pH-ului la valori optime.

Pentru eventuala neutralizare a acidităţii se utilizează hidroxid de amoniu şi/sau hidroxid de calciu.

Conservarea prin congelare a concentratului de microorganisme se face în două moduri:

- sub formă lichidă, în care caz, concentratul de bacterii se suspendă într-un antigel solubil în apă

(alcooli polihidrici) care se utilizează în proporţie de 40-50% faţă de concentrat. Congelarea se face la -

40C (de fapt se realizează o subrăcire).

Acest gen de conservare prezintă următoarele avantaje:

se împiedică acţiunea dăunătoare a gheţii asupra celulelor de bacterii;

manipularea concentratului este mai uşoară;

concentratul se poate încălzi până la temperatura de utilizare chiar în timpul manipulării fără ca

celulele să-şi piardă viabilitatea şi activitatea;

34

- congelarea în azot lichid (-196C) în care caz concentratul se amestecă cu un agent crioprotector:

10% glicerol, 7,5% lactoză în cazul bacteriilor lactice.

Pentru culturile starter concentrate de pediococi s-a propus ca la concentrat să se adauge agenţi de

stabilizare cum ar fi: glicerolul, lapte praf degresat, extract de malţ, metalglicerofosfaţi alcalini, glutamat

monosodic, acid glutamic, cistină şi/sau dextran. Amestecul respectiv se introduce în pungi de plastic care

se congelează în azot lichid.

Depozitarea culturilor starter concentrate se poate face:

a) la temperaturi de –20…-40C;

b) la temperatura de -196C (în azot lichid);

- conservarea prin reducerea conţinutului de apă se face prin liofilizare, în care caz concentratul

de bacterii se amestecă cu un suport adecvat (lapte praf degresat, lactoproteine pulbere lactoză, zaharoză)

după care se liofilizează. La liofilizare (faza de desicare secundară) temperatura produsului nu trebuie să

depăşească 40-45C. După liofilizare se face ambalarea sub vid sau în atmosferă de gaz inert.

Depozitarea produselor liofilizate trebuie să se facă la temperaturi scăzute (-18C).

Culturile starter concentrate trebuie să conţină între 2,5·1010 - 5,5·1010 celule viabile-active/ g sau ml.

Utilizarea culturilor starter concentrate de bacterii lactice în industria laptelui

Culturile starter concentrate de bacterii lactice care se folosesc în industria laptelui sunt acelea destinate:

pentru brânza Cheddar, brânzeturi tip italian şi elveţian;

pentru brânza de vaci, smântână, lapte bătut, iaurt.

Avantajele şi dezavantajele folosirii culturilor starter de bacterii lactice în industria laptelui sunt arătate în

tabelul de mai jos.

Avantajele şi dezavantajele folosirii culturilor starter de bacterii acterii lactice:

35

Culturi starter concentrate de bacterii propionice pentru industria laptelui

Mediul de cultură pentru realizarea culturilor starter concentrate de bacterii propionice poate fi laptele

degresat cu adaos de 1% tripticază, 1% extract de drojdie ca sursă de vitamine şi factori suplimentari de

creştere 1% lactat de sodiu; 0,025% KH2PO4; 0,0005% MnSO4. Mediul de cultură se ajustează la pH =

7,0 şi se sterilizează.

Incubarea mediului de cultură inoculat cu bacterii propionice din cultura stoc se face la 32C/3 zile.

Dacă mediul de cultură conţinând bacterii propionice dezvoltate după incubare se utilizează ca o cultură

(maia) de producţie, atunci dezvoltarea bacteriilor propionice se opreşte înainte de coagularea laptelui,

deoarece în stare de coagul, cultura starter se repartizează greu în laptele destinat fabricării brânzeturilor.

Celelalte operaţii de obţinere a culturii starter concentrate de bacterii propionice sunt aceleaşi ca cele

descrise la celelalte tipuri de culturi starter concentrate.

Depozitarea culturilor starter concentrate de bacterii propionice se face la 5 C în care caz celulele îşi

păstrează viabilitatea şi activitatea 8 săptămâni. Depozitarea la 25C poate fi făcută pentru cel mult 2

săptămâni.

Activitatea culturilor poate fi

controlată şi supravegheată înainte de

expediere

Se elimină operaţiile de întreţinere şi

de preparare a maielelor intermediare

(primară, secundară, terţiară)

Se face economie la forţa de muncă

Se pot stabili uşor sistemele de rotaţie

în vederea evitării infecţiei cu

bacteriofagi

Se obţin produse de calitate mai

constantă

Se scurtează procesele tehnologice ale

fabricării produselor prin accelerarea

acidifierii, deoarece se suprimă faza de

dezvoltare logaritmică în laptele de

fabricaţie

Necesită spaţii de depozitare la temperaturi

scăzute atât la producător cât şi la cumpărător

pentru păstrare până la folosire

Concentrarea nu este posibilă la toate culturile

starter

Depozitarea în stare congelată sau uscată, în

funcţie de timp, poate conduce la micşorarea

drastică a numărului de celule viabile

Culturile pot să fie influenţate negativ în ceea ce

priveşte unele plasmide ce codifică anumite

funcţiuni

36

Culturile starter concentrate se adaugă direct în laptele destinat fabricării brânzeturilor (deci nu se mai

folosesc obţinerea de culturi intermediare). X

FOLOSIREA ENZIMELOR ŞI MICROORGANISMELOR LA FABRICAREA LAPTELUI

Industria laptelui utilizează o importantă cantitate de enzime, în special în producerea de

brânzeturi, iar bacteriile lactice sub formă de culturi starter de producţie sau culturi starter concentrate

stau la baza obţinerii produselor lactate fermentate (produsele lactate acide dietetice, produse probiotice),

inclusiv a brânzeturilor. La unele din produsele menţionate se pot utiliza, de asemenea, culturi de bacterii

propionice şi alte bacterii precum şi drojdii sau mucegaiuri.

Enzimele laptelui

Enzimele proprii laptelui sunt acelea care îşi au originea în structurile celulare ale glandei mamare

şi cele de origine sanguină.

Cunoaşterea enzimelor proprii laptelui este importantă deoarece :

- unele dintre ele sunt implicate în aroma şi stabilitatea laptelui şi a produselor lactate (lipaza,

xantinoxidaza, proteaza, fosfataza)

- alte enzime sunt foflosite în diagnosticarea bolilor glandei mamare (catalaza, superoxiddismutaza)

- unle enzime intervin în maturarea brânzeturilor fabricate din laptele nepasteurizat (proteaza

alcalină, proteaza acidă, esterazele), respectiv cele care rezistă pasteurizării (plasmina sau proteaza

alcalină)

Enzimele laptelui pot fi localizate în : fracţiunea solubilă, fracţiunea micelară (cazeina),

membrana globulelor de grăsime, materialul celular. Localizarea enzimelor indică originea lor în

organismul animal (de ex. celulele secretoare ale glandei mamare, sângele).

Proteaza alcalină (plasma sanguină)

Aparţine serin proteazelor şi prezintă o activitate enzimatică de tip tripsinic. Această enzimă este

asociată cu micelele de cazeină. Are activitate maximă la 370C şi la pH = 7,5 - 8. Proteaza alcalină are o

termorezistenţă relativ ridicată : la 700C / 10 min. se păstrează 20% din activitatea enzimatică. Rezistă şi

la tratament UHT (1320C / 2s). Inactivarea completă are loc la 1420C /16s. Este o enzimă de origine

sanguină care ajunge din plasma sanguină, via epiteliumul glandei mamare. Enzima se găseşte în lapte

atât sub formă activă (0,14 - 0,72 mg. / l ), cât şi sub formă inactivă (plasminogen) în concentraţie de 2,7 -

3,7 ori mai mare.

37

Proteaza alcalină degradează preferenţial β - cazeina din care se formează γ1, γ2, γ3 - cazeine,

precum şi proteozo - peptone. Degradează şi αs2 - cazeina. Proteaza alcalină poate hidroliza şi αs1 -

cazeina, conducând la produse cu 4 legături peptidice de tipul arginina - x, şi la produse cu 7 legături

peptidice de tipul Liz -x. Se eliberează astfel 15 peptide, cele hidrofobe fiind insolubile la pH = 4,6.

k - cazeina este cea mai rezistentă la acţiunea proteazei alcaline. Datorită faptului că atât plasmina

cât şi plasminogenul sunt legate de cazeină şi datorită faptului că că rezistă în mare măsură pasteurizării,

enzima va rămâne în coagulul de brânză şi va participa la maturarea brânzeturilor, acţiunea sa crescând o

dată cu creşterea pH-ului brânzei.

Acest lucru este vizibil în cazul brânzei Camembert, unde acţiunea enzimei se intensifică la

sfârşitul maturării, deoarece mucegaiul P. camemberti consumă acidul lactic şi provoacă ridicarea pH-

ului la 6,5 - 7, când activitatea palsminei este optimă. Activitatea enzimei în brânză va fi influenţată şi de

concentraţia în NaCl, temperatura de maturare şi umiditatea brânzei.

Deoarece plasmina rezistă tratamentului UHT (1420C / 3s), ea va produce un defect important în

laptele concentrat sterilizat UHT, gelificarea fiind consecinţa modificării suprafeţei micelelor de cazeină,

ceea ce conduce la asocierea lor în agregate cu formare de gel.

Fosfataza alacalină

Se găseşte în lapte în stare liberă, dar în cea mai mare parte asociată cu membrana globulelor de

grăsime. Descompune majoritatea fosfomonoesterilor, inclusiv esterul fosfoserinic din cazeină, dar

această descompunere este limitată din cauza pH-ului laptelui şi acţiunii inhibitoare exercitate de β -

lactoglobulină. Fosfataza alcalină este folosită ca enzimă de diagnosticare a eficienţei de pasteurizare şi

pentru controlul gradului de agitare al laptelui (agitarea laptelui conduce la eliberarea enzimei din

membrana globulelor de grăsime).

Lipoproteinlipaza

Este o enzimă asociată cu membrana globulelor de grăsime, ea fiind activată de cofactori

termostabili şi inhibată de un inhibitor. Lipoproteinlipaza produce râncezirea lipolitică spontană a

laptelui, momentul apariţiei râncezirii fiind determinat de concentraţia laptelui în enzimă, raportul

activator / inhibitor şi de factorii care promovează eliberarea enzimei din membrana globulelor de

grăsime. Laptele de la sfârşitul perioadei da lactaţie conţine mai multă proteinlipază. Lipoproteinlipaza

are afinitate mai mare pentru acizii graşi cu lanţ lung din structura trigliceridelor sau fosfolipidelor.

Având caracter hidrofil - lipofil, acţionează bine la interfaţa emulsiilor de tipul U / A (cazul laptelui,

smântânii). Poate contribui la maturarea brânzeturilor în condiţiile fabricării acestora din lapte crud sau

termizat (630C / 30s).

38

Esterazele

Cele din laptele de vacă au temperatura optimă la 370C şi pH-ul optim la 8,0. Esterazele din lapte

au caracter lipofil şi au specificitate mai mare faţă de acizii cu lanţ scurt din structura trigliceridelor.

Acţionează mai bine în emulsie de tipul A / U (unt). Pot participa la maturarea brânzeturilor cu mucegai

la suprafaţă (P. camemberti), dacă acestea sunt obţinute din laptele crud sau termizat.

Proteaza acidă

Cea din lapte prezintă activitate maximă la pH = 3,5 - 4,0 şi la 500C şi degradează preferenţial α -

cazeina, comparabil cu chimozima. Enzima poate contribui la maturarea brânzeturilor dacă se foloseşte

lapte nepasteurizat sau termizat (630C - 650C / 30s).

Peptidaza

În lapte s-a pus în evidenţă o dipeptidază care hidrolizează peptidele L-L la pH alcalin (glicil-L-

metionina şi L-alanil-L-metionina).

Peptidele care conţin D-aminoacizi nu sunt hidrolizate. Condiţiile de activitate sunt: temperatura

de 45 - 500C şi pH = 7,8 - 8,3. Enzima poate interveni la maturarea brânzeturilor cu mucegai la suprafaţă

(P. camemberti), în condiţiile în care s-a folosit laptele crud sau termizat (630C / 30s).

Fosfataza acidă

Se găseşte în lapte în stare liberă şi asociată cu membrana globulelor de grăsime şi este implicată

în defosforilarea cazeinei, cauzând creşterea punctului izoelectric, cu influenţă asupra coagulării cu cheag.

Enzima rezistă la pasteurizare normală, iar la sterilizarea UHT poate rămâne activă în proporţie de 20%

din valoarea iniţială, ceea ce provoacă gelificarea laptelui sterilizat UHT la păstrarea acestuia. Fosfataza

acidă poate conduce la desfacerea micelelor de cazeină tocmai datorită defosforilării. Contribuie în mică

măsură la maturarea brânzeturilor, dacă se foloseşte laptele crud la fabricarea acestuia sau dacă se

foloseşte lapte termizat (630C /30s).

Catalaza

Se găseşte în cantitate mare în laptele în laptele colostral sau în laptele mamitic. Catalaza poate fi

produsă în lapte şi de unele bacterii nelactice. Bacteriile lactice producătoare de H2O2 nu produc catalază.

39

În consecinţă, nivelul total de catalază dintr-un lapte va fi determinat de: perioada de lactaţie, prezenţa sau

absenţa bacteriilor nelactice producătoare de catalază, starea de sănătate a animalelor producătoare de

lapte (boala mamitică măreşte nivelul de catalază în lapte). Catalaza din lapte se poate distruge la

pasteurizare joasă (650C / 30 min.).

Reductaza aldehidică

Cunoscută şi sub denumirea de enzima lui Schardinger sau xantinoxidază, reductaza aldehidică are

ca grup prostetic două molecule de flavin - adenin - nucleotid (FAD), doi atomi de molibden şi opt atomi

de fier / moleculă. Este distrusă prin încălzire la 730C / 3 min. sau la 800C / 10s. Enzima se găseşte la

suprafaţa moleculelor de grăsime. Activitatea enzimatică creşte prin încălzirea şi omogenizarea laptelui

precum şi prin activitatea proteolitică şi lipolitică din lapte, deoarece enzima este eliberată din complexe.

Enzima este utilizată ca test pentru determinarea eficienţei pasteurizării.

Glucozidazele (cu excepţia lizozimului)

Sunt reprezentate de β - glucuronoxidază, N - acetil β - D - glucozaminidază, enzime a căror

concentraţie este mărită în cazul laptelui provenit de la animalele cu infecţii ale glandei mamare.

N - acetil β - D - glucozaminidaza este folosită ca enzimă de diagnosticare a laptelui mamitic,

concentraţia mărită a acestei enzime fiind consecinţa uni flux sporit de lecocite sau consecinţa

dezintegrării celulelor ţesutului mamar.

Superoxid dismutaza

Este o enzimă cu acţiune bacteriostatică / bactericidă prezentă în lapte, care produce H2O2,

folosind oxigenul superoxidic produs de bacteriile lactice, în condiţii de anaerobioză. Enzima împiedică şi

oxidarea acizilor graşi nesaturaţi de către oxigenul superoxidic produs de bacteriile lactice, respectiv

oxidarea acizilor graşi prin intermediul xantinoxidazei din lapte, care foloseşte oxigenul superoxidic.

De remarcat că unele bacterii lactice, cum ar fi Lactobacillus plantarum, nu posedă superoxid

dismutază (SOD), dar sunt capabile să îndepărteze superoxidul prin intermediul Mn2+ care se acumulează

în celulă la nivel de 20 - 25 mM. Acest sistem de detoxifiere este prezent şi în P. pentosaceus,

Lactobacillus şi Leuconostoc dar nu şi în Streptococcus şi Lactococcus.

Lactatperoxidaza

40

Este enzima din lapte care se găseşte în cantitatea cea mai mare (10 - 30 mg / l), având acţiune mai

mult bacteriostatică decât bactericidă, acţiune care se manifestă atunci când se formează complexul :

lactat - peroxidază - H2O2 - tiocianat. Acest sistem este activ asupra suşelor de bacterii psihrofile de

alterare din laptele crud precum şi asupra bacteriilor Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium,

Escherichia coli (patogene).

Alte enzime din lapte, cu importanţă mai mare sau mai mică tehnologică, sunt :

Lizozimul

Este o β - polizaharidază care are proprietatea de a hidroliza pereţii celulelor bacteriene, scindând

legăturile β - 1,4 cu eliberare de mucopeptide. Lizozimul este eficace, în special asupra bacteriilor Gram -

pozitive şi mai puţin asupra celor Gram - negative. Lizozimul este o enzimă termosensibilă, fiind puternic

deteriorată la pasteurizarea laptelui. Lizozimul este foarte abundent în laptele uman (30 mg. / 100 ml.),

respectiv de 3000 de ori mai mult decât în laptele de vacă.

Sulhidriloxidaza

Are rol în sinteza celulară şi catalizează transformarea grupărilor -SH în grupări -SS.

Sulfidriloxidaza este legată de membrana globulelor de grăsime şi, aşa cum déjà s-a menţionat,

catalizează oxidarea tiolilor în disulfuri şi H2O2.

2 R - SH + O2 R - S- S - R + H2O2

Apa oxigenată produsă este un agent prooxidant şi poate fi utilizată de lactat - peroxidază în sistemul

lactat - peroxidază - H2O2 - tiocianat.

γ - glutamil transpeptidaze

Este localizată în celulele epiteliale secretorii ale glandei mamare şi trece în lapte, fiind asociată,

în proporţie de 70 - 80%, cu membrana globulelor de grăsime. Pasteurizarea normală conduce la

inactivarea parţială a enzimei.

Glicozil - transferaza

Este implicată în mecanismul de sinteză a lactozei în glanda mamară şi poate trece şi în lapte.

41

Preparate enzimatice folosite în industria laptelui

În industria laptelui s-au propus spre utilizare preparatele enzimatice (în unele ţări se utilizează

déjà ) prezentate în continuare.

Lizozimul din albuşul de ou

Lizozimul se utilizează în industria brânzeturilor, pentru împiedicarea dezvoltării bacteriilor

sporulate aprţinând genului Clostridium şi în special Clostridium tirobutiricum, care pot metaboliza

acidul lactic pe care-l transformă în acid butiric şi cantităţi importante de CO2 şi H2. În afară de gustul

neplăcut produce şi o balonare a acestora, cu formare de găuri mari, neregulate, care pot conduce chiar la

« ruperea » brânzei.

Germenii sunt prezenţi în principal în sol sub formă de spori şi pot contamina furajele însilozate

unde se transformă în forme vegetative şi, de la furaje în lapte, prin intermediul aerului. Laptele devine

déjà « periculos » la un nivel de 200 germeni / l.

Prin adaos de lizozim se realizează liza celulei vegetative şi deci se împiedică dezvoltarea

bacteriilor butirice în lapte. Dacă în lapte ajung spori de Clostridium tirobutiricum, aceştia rezistă la

pasteurizare şi vor rămâne în coagul, deci vor produce balonarea târzie a brânzeturilor.

Lizozimul împiedică însă dezvoltarea lactobacililor şi în special dezvoltarea lui Lactobacillus

helveticus, folosit la fabricarea brânzei Şvaiţer, deci se împiedică acidifierea normală a laptelui

(maturarea). Bacteriile propionice nu sunt inhibate de lizozim.

Glucozoxidaza

Catalizează transformarea glucozei în acid gluconic şi s-a propus a fi utilizată ca antioxidant

enzimatic în produsele bogate în grăsimi (unt, lapte praf cu grăsime). Practic, însă, la aceste produse se

utilizează antioxidanţi chimici sau ambalare sub atmosferă de gaz inert (azot).

Acţiunea glucozoxidazei s-ar manifesta prin aceea că activează lactatperoxidaza (LPS) care

utilizează oxigenul în vederea producerii de H2O2.

Catalaza

Se utilizează în combinaţie cu glucozoxidaza pentru a elimina excesul de H2O2, care rezultă la

acţiunea glucozoxidazei, sau singură pentru a elimina excesul de H2O2, adăugată direct în lapte în scop de

conservare. Apa oxigenată reziduală (rămasă neconsumată), în condiţiile în care nu s-ar folosi şi catalaza,

42

ar schimba caracteristicile senzoriale ale laptelui precum şi valoarea nutriţională a proteinelor prin

oxidarea metioninei.

Surse de catalază sunt ficatul de vită şi culturile de Aspergillus niger şi Micrococcus

lysodeikticus.

Tratamentul laptelui cu H2O2 şi catalază se impune faţă de tratamentul termic (în unele ţări) în

două cazuri :

- când fermele nu dipun de echipament de răcire iar tratamentul termic (pasteurizarea) nu este

fezabil din punct de vedere tehnic (se folosesc ~2 ml. H2O2 33% la 1 litru de lapte). Laptele ajuns la

fabrică trebuie încălzit la 500C / 30 min. apoi este răcit la 350C şi se adaugă catalaza. (< 20 mg. / l).

- când laptele este destinat fabricării brânzeturilor şi se doreşte să se păstreze enzimele proprii

laptelui precum şi bacteriile lactice de contaminare, dar se doreşte să se distrugă cele de alterare, în

special bacteriile coliforme care sunt puţin rezistente la acţiunea H2O2. De remarcat că H2O2 nu contribuie

la distrugerea totală a bacteriilor patogene (Microbacterium tuberculosis, Brucella abortus şi unele specii

de Staphylococcus, precum şi bacteriile sporogene).

Sulfhidriloxidaza

A fost propusă pentru a ameliora gustul de fiert al laptelui tratat UHT, deoarece catalizează

reacţia :

2 RSH + ½ O2 RSSR + H2O

Superoxid dismutaza (SOD)

Împreună cu catalaza au fost propuse pentru inhibarea oxidării lipidelor prin faptul că realizează

catalizarea dismutării anionului superoxidic (O2-) cu formare de apă oxigenată şi oxigen.

2 O2- + 2 H H2O2 + O2

Apa oxigenată formată poate fi degradată de catalază în O2 şi H2O, cu reducerea simultană a unei a

doua molecule de H2O2, sau poate fi degradată de peroxidază la H2O în prezenţa unui donator de H2.

Cea mai mare utilizare a preparatelor enzimatice este în sectorul fabricării brânzeturilor.

BIOTEHNOLOGIA FABRICĂRII BRÂNZETURILOR

43

Biotehnologia fabricării brânzeturilor cuprinde următoarele operaţii:

- controlul laptelui - materie primă

- curăţirea laptelui

- normalizarea laptelui

- pasteurizarea laptelui

- însămânţarea laptelui cu culturi lactice, adaos de CaCl2 şi maturarea acestuia

- închegarea laptelui (coagularea)

- prelucrarea coagulului

- formarea şi presarea brânzeturilor

- sărarea brânzeturilor

- maturarea brânzeturilor

- depozitarea şi condiţionarea brânzeturilor

Dintre operaţiile menţionate, cele cu caracter foarte pronunţat biotehnologic sunt prezentate mai

jos.

1. Însămânţarea laptelui cu culturi lactice, adaosul de CaCl2 şi maturarea acestuia

Prin pasteurizarea laptelui, microflora naturală a acestuia este distrusă, fiind necesară o

însămânţare a laptelui cu culturi de producţie specifice sortimentului de brânză ce se fabrică. Culturile

starter de producţie sunt obţinute din cultura selecţionată sub formă lichidă sau liofilizată, prin pasaje

succesive :

Cultură selecţionată – cultură primară – cultură secundară – cultură de producţie

Microorganismele utilizate în culturile starter de producţie, la fabricarea brânzeturilor, sunt

mezofile sau termofile. Dintre cele mezofile (optimum de temperatură de dezvoltare: 15 - 400C) se

folosesc cele homofermentative: Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris

(produc acid lactic L+); heterofermentative: Lactococcus lactis subsp. lactis biov. diacetilactis (produce

acid lactic L+) şi Leuconostoc cremoris (produce acid lactic L+).

44

Speciile termofile frecvent utilizate (temperatura optimă 30 – 500C) sunt următoarele:

Streptococcus salivarius subsp. thermophillus (produce acid lactic L+), Lactobacillus delbrüecki subsp.

bulgaricus (produce acid lactic L-) şi Lactobacillus helveticus (produce acid lactic DL).

Aceste culturi sunt utilizate în industria brânzeturilor pentru realizarea următoarelor deziderate:

- producţia de acid lactic din lactoză în vederea scăderii pH-ului. Aciditatea finală atinsă ve depinde

de specia folosită, cantitatea de cultură adăugată şi de condiţiile de termostatare (temperatură, timp). Cu

cât pH-ul brânzei este mai scăzut, cu atât mai mult acid lactic rămâne nedisociat şi acţionează ca un

conservant. Bacteriile lactice cresc bine în condiţii de microaerofilie şi în timpul dezvoltării lor scad

potenţialul redox şi, deci, împiedică dezvoltarea bacteriilor aerobe de alterare.

- reglarea sintezei coagulului prin aciditatea produsă de culturile starter în funcţie de parametrii

închegării laptelui

- producerea de aromă (diacetil şi acetoină) precum şi de CO2 din citrat, care contribuie la realizarea

unei structuri « deschise » şi la formarea de ochiuri mici de fermentare pentru anumite brânzeturi. Acest

deziderat este realizat, în principal, de bacteriile lactice heterofermentative. Acidul lactic intervine şi el în

gustul brânzei şi, în plus, prin efectul asupra pH-ului, intervine în determinarea texturii, consistenţei,

elasticităţii şi capacităţii de feliere a brânzei respective.

- producerea de proteinaze şi peptidaze cu rol în maturarea brânzeturilor.

Pentru anumite brânzeturi (Ementhaler) se utilizează şi Propionibacterium shermanii, care

fermentează acidul lactic cu producere de acid propionic, acid acetic şi CO2 care provoacă « desenul »

brânzei (ochiuri mari). Pentru brânzeturile de tip Limburger se utilizează Brevibacterium linens, care

contribuie la maturarea de suprafaţă a brânzei şi formează colonii roşu-orange.

Sporii mucegaiului Penicillium roqueforti se utilizează la fabricarea brânzeturilor cu mucegai în

pastă (Roquefort, Stilton), iar sporii de Penicillium camemberti se utilizează pentru maturarea de

suprafaţă a brânzeturilor de tip Camembert, Brie, etc.

Microflora variază numeric în timp. Astfel, dacă în brânza iniţială se găsesc între 106 şi 107 celule

formatoare de colonii / gr., pe măsură ce maturarea progresează, numărul bacteriilor lactice se reduce, în

funcţie de brânză şi, în principal, în dependenţă de gradul de eliminare al lactozei, de nivelul de NaCl din

brânză şi / sau gradul de autoliză al bacteriilor lactice. Activitatea bacteriilor lactice este inhibată de când

nivelul de NaCl în apa conţinută de brânză este mai mare de 5%.

Cultura starter de bacterii lactice se foloseşte după o prealabilă păstrare la frig (< 100C) de cel

puţin 5-6 ore, în intervalul maxim de 48 de ore de la preparare.

Proporţia de cultură starter de producţie adăugată laptelui destinat fabricării brânzeturilor depinde

de: calitatea laptelui, felul brânzei, activitatea bacteriilor lactice, anotimp. Cultura starter de producţie se

45

foloseşte atâta timp cât nu prezintă semne de degradare: întârziere în coagulare, aciditate scăzută, lipsă de

aromă specifică, impurificare cu alte microorgnisme.

Culturile starter de producţie necorespunzătoare se caracterizează prin:

- aciditate redusă, consecinţa unei însămânţări reduse cu cultură terţiară sau a termostatării la o

temperatură mai joasă decât cea optimă

- aciditate mărită, consecinţa unei însămânţări masive cu cultură terţiară şi a termostatării la o

temperatură mai mare decât cea necesară, respectiv o durată mare de termostatare

- coagulare întârziată, însoţită de acvidifiere lentă cauzată de infectarea culturii cu bacteriofagi sau

datorită prezenţei antibioticelor în laptele folosit ca mediu de cultură

- coagul grunjos şi grosier cu separare de zer, consecinţa unei acidifieri puternice datorită

termostatării la temperatură ridicată

- coagul filant, ca urmare a infectării laptelui cu bacterii intestinale

- cultură gazogenă, datorită infectării acesteia cu bacterii din grupul Coli aerogenes sau cu drojdii

- gust şi miros insuficient exprimat datorită dezvoltării necorespunzătoare a bacteriilor aromatizante

sau datorită pierderii de substanţe de aromă (diacetil şi acetoină), atunci când cultura se păstrează prea

mult la frigider

- gust amar, datorită dezvoltării în cultură a unor bacterii puternic proteolitice

Adaosul de CaCl2 în laptele supus maturării este necesară din următoarele motive:

- restabilirea echilibrului în săruri de calciu pentru a îmbunătăţi coagulabilitatea laptelui pasteurizat

- îmbunătăţirea consumului specific, ca rezultat al obţinerii unui coagul mai ferm şi reducerea

tendinţei de prăfuire a acestuia în timpul prelucrării coagulului în cazan

- evitarea defectelor de structură a bobului şi a caşului, legate de prelucrarea unui coagul moale, cu

slabă putere de contractare şi cu o slabă sinereză

Cantitatea de CaCl2 adăugată este de 10-30 gr. CaCl2 / 100 litri, în funcţie de tipul de pasteurizare

aplicată şi de anotimp. CaCl2 se adaugă sub formă de soluţie 40% (50 ml. sol. / 100 litri lapte). Trebuie

avut în vedere că la adaos de CaCl2 creşte aciditatea laptelui cu circa 10T la un adaos de 50 ml. sol. / 100

litri lapte.

În unele ţări este permisă şi folosirea de :

- substanţe de decolorare a laptelui de vacă

- substanţe de colorare a laptelui pentru unele brânzeturi (Olanda, Bel Paese, Cheddar, etc.), cum ar

fi coloranţii galbeni naturali sau sintetici

46

- Azotat de potasiu (10-30 gr. / 100 litri lapte) pentru împiedicarea dezvoltării bacteriilor Coli

aerogenes, respectiv a bacteriilor sporulate anaerobe (Clostridium butiricum). Azotaţii acţionează după

transformarea lor în azotiţi, care sunt activi în special asupra Clostridiilor.

În ceea ce priveşte maturarea laptelui înainte de coagulare, aceasta este necesară din următoarele

motive:

- mărirea capacităţii de hidratare a proteinelor afectate de pasteurizare

- întărirea globulelor de grăsime

- creşterea uşoară a acidităţii laptelui prin fermentarea parţială a lactozei în acid lactic, aciditate care

împiedică dezvoltarea bacteriilor gazogene

- modificarea stării sărurilor minerale

- eliminarea gazelor din lapte

Poate fi maturat laptele crud sau laptele pasteurizat. Laptele crud poate fi maturat natural sau (12

ore la 150C) în zona de munte, unde încărcătura microbiologică a laptelui este redusă. Laptele crud poate

fi maturat şi prin adaos de cultură de producţie de în proporţie de 0,01%, cu păstrare la 14-160C, timp de ~

12 ore.

Laptele pasteurizat trebuie întotdeauna maturat înainte de închegare.

În acest caz maturarea poate fi:

- de scurtă durată, la o temperatură cu 2-30C mai mare decât temperatura de închegare, timp de 30-

40 min., în care caz aciditatea creşte cu 0,5-1,50T (se adaugă ~ 1% maia de bacterii lactice)

- de lungă durată, când laptele este răcit la 10-120C şi se depozitează maximum 24 ore. Cantitatea

de cultură de bacterii lactice este < 0,3%.

2. Închegarea laptelui

Închegarea laptelui (coagularea) este operaţia de bază la fabricarea brânzeturilor, deoarece se

separă cazeina.

Coagularea laptelui poate fi realizată:

- cu ajutorul acizilor, în care caz se modifică starea coloidală a cazeinei, în sensul că, odată cu

scăderea pH-ului şi cu trecerea unei părţi din din calciul legat de cazeină sub formă de sare de calciu în

zer, are loc destabilizarea micelelor de cazeină care precipită sub formă de acid cazeinic. Coagulul obţinut

este moale, cu conţinut redus de calciu, şi cu aciditate ridicată. Coagularea acidă este aplicată la fabricarea

47

brânzei de vaci, în care caz închegarea (coagularea) are loc sub acţiunea acidului lactic rezultat prin

fermentarea lactozei de către bacteriile lactice.

- coagularea cu ajutorul enzimelor coagulante, în care caz procesul este reprezentat schematic

astfel :

cazeină + enzimă coagulantă paracazeină

paracazeină + săruri de calciu solubile paracazeinat de calciu (insolubil)

Pentru înţelegerea procesului de închegare (coagulare) este necesar să se cunoască proprietăţile

micelelor de cazeină şi mecanismul intim al coagulării laptelui.

Proprietăţile micelelor de cazeină:

Micelele de cazeină au diametrul cuprins între 30 şi 300 nm. (media 150 nm.), şi concentraţia lor

în lapte este de 1012 micele / ml. lapte. Micelele, în ansamblul lor, sunt puternic hidratate (3,5-3,7 gr.

H2O / gr.proteină). Micelele de cazeină sunt formate din subunităţi de cazeină, agregate în submicele.

Factorii care influenţează coagularea laptelui:

- temperatura la care are loc acţiunea cheagului (optimul de temperatură: 40-410C)

- cantitatea de săruri de calciu (la un nivel scăzut de săruri de calciu, se măreşte durasta coagulării,

iar coagulul are consistenţă moale)

- gradul de aciditate al laptelui (viteza de coagulare creşte o dată cu creşterea redusă a acidităţii)

- cantitatea de enzimă coagulantă (care determină viteza coagulării, atunci când concentraţia de

enzimă este în anumite limite)

- compoziţia chimică a laptelui (respectiv un conţinut mai mare de substanţă uscată, care determină

o cantitate mai mare de enzimă coagulantă pentru a obţine coagularea în timpul dorit şi o consistenţă

normală a coagulului)

- tratamentul termic preliminar al laptelui (conduce la prelungirea duratei de coagulare dorită)

- omogenizarea laptelui (scurtează durata de coagulare a laptelui)

Preparate enzimatice folosite la coagularea laptelui :

Coagularea enzimatică a laptelui s-a realizat la început exclusiv cu cheag, însă creşterea producţiei

de brânzeturi pe plan mondial a pus problema unui înlocuitor pentru cheag. Întrucât coagularea laptelui

48

este iniţiată prin scindarea legăturii peptidice dintre fenilalanina 105 şi metionina 106 din k-cazeină,

oricare endopeptidază care este capabilă să producă această hidroliză este un înlocuitor potenţial pentru

cheag (chimozina). Această proprietate hidrolitică-coagulantă nu este suficientă, fiind necesar ca

preparatul enzimatic respectiv să aibă şi o activitate proteolitică nespecifică corespunzătoare, în sensul că

trebuie evitată degradarea intensă a proteinelor la pH-ul natural al laptelui, pentru a nu se distruge zonele

de interacţiune pentru agregarea micelelor. De exemplu, tripsina scindează legătura Phe-105Met 106, dar

nu coagulează laptele, deoarece produce şi o degradare intensă a proteinelor, în special în zonele încărcate

electric pozitiv din lanţul polipeptidic.

O activitate proteolitică intensă determină:

- obţinerea unui coagul moale, friabil, care la prelucrare şi formare se fărâmiţează

- creşterea consumului specific, deoarece peptidele eliberate sub acţiunea proteolitică a preparatului

enzimatic sunt solubile în zer

- formarea unor produşi de hidroliză care imprimă gust amar brânzei

Preparatele enzimatice folosite la coagularea laptelui pot fi clasificate astfel:

- preparate enzimatice de origine animală (cheag sau chimozină, pepsină bovină, pepsină de porc,

pepsină de pasăre)

- preparate enzimatice de origine microbiană care pot fi :

fungice: Renilase (Mucor miehei); Supraren ( Endothia parasitica); Meito (Mucor pusilus).

bacteriene: Milozime (B. polymixa)

Principalele preparate enzimatice de origine animală sunt cheagul şi pepsina.

Cheagul

Este un preparat enzimatic din stomacul glandular de viţel, miel, ied, sacrificaţi în perioada de

alăptare. Se mai numeşte pressure, rennet. Preparatul cheag are ca principiu activ chimozina, însă conţine

şi ceva pepsină, raportul masă chimozină activă / masă pepsină activă > 1,38.

Cheagul industrial se obţine sub formă lichidă sau pulbere.

Cheagul lichid este un lichid gălbui (brun-deschis), opalescent, fără impurităţi, cu gust acrişor,

sărat, cu pH = 3,5 - 4. se livrează în sticle brune sau în ambalaje de palsitc cu capacitatea de 0,5 - 3 litri.

49

Cheagul praf se prezintă ca o pulbere alb-gălbuie, cu miros caracteristic, care se poate dizolva în

apă călduţă (30 - 400C).

La folosirea cheagului în soluţie apoasă trebuie să se aibă în vedere că acesta îşi pierde din

activitate dacă :

- concentarţia enzimei în soluţie este mică

- este prezentă lumina solară sau chiar lumina din încăperi

- soluţia este puternic agitată cu formare de spumă

- temperatura depăşeşte 600C

- soluţia are pH = 6,6 - 7,4.

Stabilitatea enzimei este bună între pH = 5,0 şi 6,0.

Pepsina

Este un preparat enzimatic, care se obţine din mucoasa roşie a stoacului de vită şi mai ales de porc,

unde se găseşte sub formă inactivă de pepsinogen. Trecerea sub formă activă are loc sub influenţa HCl

folosit la extracţia enzimei din mucoasa stomacală roşie. Preparatul mai conţine şi chimozină, raportul

masă chimozină activă / masă pepsină activă > 0,154.

Pepsina coagulează bine numai dacă laptele acidifiat la pH < 6,6. În comparaţie cu cheagul are o

activitate proteolitică mai mare, putând conduce la defecte de gust (gust amar). Se obţine sub formă de

pepsină praf tip L (putere de coagulare 1 : 50.000 sau 1 : 120.000). Pepsina praf are 3% apă, maximum

40% (pentru 1 : 120.000), 58% (1 : 50.000) NaCl şi max. 3,5% lipide.

Preparatele enzimatice fungice

Se prezintă sub formă de pulberi fine, omogene, alb-gălbui, solubile în apă, însă ca acţiune sunt

inferioare enzimelor coagulante de origine animală, în principal cheag.

La folosirea preparatelor enzimatice fungice trebuie să se aibă în vedere:

- creşterea temperaturii de coagulare peste 300C influenţează pozitiv coagularea (deci trebuie să se

ţină seama de sortimentele de brânză cu temperatura de coagulare a laptelui > 300C).

- aciditatea laptelui > 200T influenţează negativ acţiunea enzimelor.

- coagulul obţinut are o durată mai lungă de întărire, consistenţa mao moale, ceea ce favorizează

pierderi de substanţă uscată în zer. Se impune prelungirea duratei de coagulare şi prelucrare a coagulului

cu 10 - 15 min., respectiv creşterea acidităţii laptelui supus închegării şi creşterea temperaturii acestuia.

50

- activitatea proteolitică a enzimelor fungice este mai mare decât a cheagului, în special asupra

proteinelor serice, ceea ce înseamnă pierderi de proteine în zer.

Preparatele enzimatice de origine bacteriană

Au o utilizare mai limitată din următoarele motive:

- au activitate proteolitică mai mare şi din această cauză produc defecte la brânzeturi

- coagulul obţinut este moale, iar pierderile de cazeină şi de grăsime în zer sunt mai mari.

Criterii de determinare a eficienţei enzimelor coagulante

Enzimele trebuie să satisfacă următoarele criterii:

- de performanţă, care se referă la puterea de coagulare, tăria coagului şi caracteristicile acestuia de

la coagulare până la presare, performanţă care este influenţată de aciditate, temperatură, adaos de Ca2+. În

legătură cu acest criteriu, preparatele enzimatice coagulante de natură microbiană se folosesc mai puţin la

fabricarea brânzeturilor cu maturare de lungă durată, pe motivul apariţiei unor defecte de structură,

consistenţă şi aromă (gust amar, astringent9, defecte legate de degradarea cazeinei

- cantitatea de enzimă coagulantă, care trece în zer şi care poate afecta utilizarea acestuia. În

legătură cu acest criteriu, trebuie arătat că reţinerea şi persistenţa enzimelor în brânză determină

degradarea ulterioară a protenelor. Reţinerea cheagului în brânză depinde de pH şi anume creşte odată cu

scăderea pH-ului. Reţinerea enzimelor din Mucor pusillus şi M. miehei nu este influenţată de pH.

Reţinerea pepsinei de porc este asemănătoare cu cea a cheagului, pepsina fiind instabilă la creşterea pH-

ului.

Activitatea proteolitică nespecifică relativ mare a preparatelor enzimatice microbiene este

compensată în mare măsură de gradul scăzut de retenţie în brânză. La prelucrarea zerului trebuie să se

ţină seama de prezenţa enzimelor coagulante, a căror termosensibilitate este în funcţie de pH şi care se

manifestă în ordinea : Mucor miehei > Mucor pusillus > pepsină bovină > Endothia parasitica > pepsină

porc. Stabilitatea la căldură a tuturor preparatelor enzimatice coagulante scade o dată cu creşterea pH-

ului, excepţie făcând cel obţinut din Endothia, care manifestă tendinţă inversă.

Preparatele enzimatice de origine microbiană pot avea şi activitate lipazică şi celulazică, pentru

brânzeturi interesând numai activitatea lipazică, care poate contribui la apariţia unor defecte de aromă.

Enzime coagulante obţinute prin clonare

51

Pe plan mondial s-au obţinut enzime coagulante folosind tehnica clonării, şi anume :

- enzime coagulante produse de E. coli, K. lactis şi A. niger prin fermentare, microorganisme care

au fost în prealabil clonate cu ADN de la bovine, care codifică enzima chimozină (renină, cheag).

Chimozina produsă este la fel ca cea obţinută din stomacul de viţel.

- enzimă coagulantă obţinută prin fermentare cu Aspergillus oryzae, care a fost în prealabil clonat

cu ADN de la Rhizomucor miehei, ADN care codifică la Aspergillus oryzae o enzimă coagulantă ce nu

are activitate proteolitică. Enzima coagulantă obţinută din Aspergillus oryzae, denumită şi « Novoren »

produsă de firma Novo-Nordisk, are o specificitate excepţională faţă de k-cazeină, fără a avea şi activitate

proteolitică.

Retenţia de enzimă Novoren în brânză este de numai 8% în comparaţie cu chimozina de origine

animală, care este reţinută în proporţie de 20%. Novorenul are o slabă acţiune asupra α - cazeinei, aceasta

rămînînd aproape intactă, ceea ce este important pentru textura brânzei. Neavând activitate proteolitică, la

utilizarea Novoren-ului se obţin randamente mai mari în brânză (nu există pierderi semnificative de

cazeină în zer.

52