+ All Categories
Home > Documents > Culturi starter de microorganisme

Culturi starter de microorganisme

Date post: 05-Aug-2015
Category:
Upload: petraru-alexandra
View: 896 times
Download: 6 times
Share this document with a friend
Description:
Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice
of 66 /66
___________________________________________________________________________ _______________ BIOTEHNOLOGIA OBTINERII PREPARATELOR ENZIMATICE. CULTURI STARTER DE MICROORGANISME 1. BIOTEHNOLOGII ALIMENTARE – DEFINIŢIE. OBIECTUL BIOTEHNOLOGIEI Biotehnologia este o ştiinţă complexă, ce se caracterizează prin utilizarea integrată a biochimiei, microbiologiei, biologiei celulare şi a ingineriei genetice. (fig. 1). Figura 1. Biotehnologia este aplicată in diverse domenii, cum ar fi: agricultură, industria alimentară, producţie industrială, mediu şi medicină. Biotehnologia alimentară se referă la prelucrarea industrială a diferitelor materii prime cu ajutorul microorganismelor şi enzimelor proprii sau a unor agenţi biologici (microorganime, enzime) adăugaţi în scopul realizării unor produse sau a ameliorării unor procese tehnologice. Rolul biotehnologiei este covârşitor în industria alimentară. În fapt, industria alimentară este o biotehnologie, deoarece materiile prime agroalimentare sunt produse biologice şi prin urmare conservarea lor până la consum, în stare proaspătă (cazul fructelor şi legumelor) sau până la industrializare
Transcript
Page 1: Culturi starter de microorganisme

__________________________________________________________________________________________

BIOTEHNOLOGIA OBTINERII PREPARATELOR ENZIMATICE. CULTURI STARTER DE MICROORGANISME

1. BIOTEHNOLOGII ALIMENTARE – DEFINIŢIE. OBIECTUL BIOTEHNOLOGIEI

Biotehnologia este o ştiinţă complexă, ce se caracterizează prin utilizarea integrată a biochimiei, microbiologiei, biologiei celulare şi a ingineriei genetice. (fig. 1).

Figura 1.Biotehnologia este aplicată in diverse domenii, cum ar fi: agricultură, industria

alimentară, producţie industrială, mediu şi medicină.Biotehnologia alimentară se referă la prelucrarea industrială a diferitelor

materii prime cu ajutorul microorganismelor şi enzimelor proprii sau a unor agenţi biologici (microorganime, enzime) adăugaţi în scopul realizării unor produse sau a ameliorării unor procese tehnologice.

Rolul biotehnologiei este covârşitor în industria alimentară. În fapt, industria alimentară este o biotehnologie, deoarece materiile prime agroalimentare sunt produse biologice şi prin urmare conservarea lor până la consum, în stare proaspătă (cazul fructelor şi legumelor) sau până la industrializare (cazul tuturor produselor agroalimentare) implică controlul activităţii enzimatice proprii ţesuturilor vegetale şi animale sau a celor elaborate de microflora de contaminare.

Enzimele proprii ţesuturilor vegetale şi animale sunt esenţiale în transformările pe care le oferă produsele agroalimentare: maturarea fructelor şi legumelor, cerealelor şi făinurilor sau diferitelor produse alimentare pe bază de cereale germinate, maturarea brânzeturilor, maturarea cărnii.

Enzimele pot avea însă şi rol deteriorativ cu implicaţii în modificarea caracteristicilor senzoriale şi a valorii nutritive a materiilor prime agroalimentare până la prelucrarea termică a acestora.

Page 2: Culturi starter de microorganisme

De asemenea, rolul microorganismelor este hotărâtor, unele dintre ele având acţiune dăunătoare, altele având rol esenţial în obţinerea unor produse alimentare datorită acţiunii lor fermentative: produse lactate acide, brânzeturi, bere, vin, spirt, pâine, salamuri crude, alimente fermentate din cereale şi leguminoase.

Microorganismele intervin şi în fermentarea unor produse vegetale: varza, murături, măsline, castraveţi, cacao, etc.

Biotehnologiile în industria alimentară s-au dezvoltat impresionant prin folosirea enzimelor exogene (industria laptelui, berii, spirtului, amidonului, cărnii, sucurilor de fructe, zahărului, panificaţiei, etc.) şi a culturilor starter (industria berii, laptelui, cărnii, panificaţiei, etc.) La toate acestea trebuie să avem în vedere obţinerea de metaboliţi secundari (alcool etilic, acetonă, acizi organici, aminoacizi, etc.) prin folosirea de microorganisme precum şi de biomasă alimentară şi furajeră, etc.

Cu ajutorul enzimelor microorganismelor se pot accelera procesele biochimice, se pot perfecţiona procesele de producţie, se poate îmbunătăţi calitatea produselor alimentare şi se poate mări gradul de diversificare a producţiei alimentare.

2. PREPARATE ENZIMATICE2.1. Aspecte generaleEnzimele sunt din punct de vedere structural proteine constituite din

aminoacizi, iar din punct de vedere funcţional acţionează ca nişte biocatalizatori biologici care au rolul de a permite realizarea unor reacţii cu o viteză mărită.

Enzimele sunt utilizate drept catalizatori în condiţiile în care există şi catalizatori chimici, deoarece prezintă următoarele avantaje:

1. Au capacitatea de a cataliza reacţiile chimice în condiţii blânde de temperatură, pH, presiune. Aceasta permite un consum mai redus de energie şi nu necesită echipamente scumpe rezistente la coroziune.

2. Enzimele sunt catalizatori specifici, deseori stereoselective, care nu conduc la obţinerea de produşi de reacţie secundari nedoriţi. În aceste condiţii nu sunt necesare cheltuieli mari privind rafinarea şi purificarea produsului ce urmează a fi fabricat.

3. Comparativ cu procesele chimice, enzimele sunt din punctul de vedere al mediului compuşi biodegradabili care nu necesită costuri semnificative de epurare.

4. Anumite enzime nu sunt limitate numai la acţiunea în mediul apos, putând acţiona şi la interfaţa dintre două faze, apă: solvent organic sau apă:ulei etc. Totuşi există şi o serie de dezavantaje:

- au stabilitate limitată;- de cele mai multe ori sunt utilizate industrial o singură dată.

2.2.Clasificarea enzimelor. Enzimele se clasifică conform sistemului stabilit de Comisia de Enzime a

Uniunii Internaţionale de Biochimie (1979). Conform acestei clasificări există 6 clase principale grupate conform cu reacţiile pe care le catalizează astfel:

Page 3: Culturi starter de microorganisme

1. Oxidoreductaze care catalizează reacţii de oxidoreducere, transfer de atomi de hidrogen, oxigen sau electroni;

2. Transferaze care catalizează transferul unei grupări de pe o moleculă pe alta;3. Hidrolaze ce catalizează scindarea hidrolitică (implică apa) a legăturilor

chimice covalente;4. Liaze, care catalizează scindarea legărutilor chimice altfel decât prin hidroliză

sau oxidare;5. Izomeraze ce catalizează rearanjarea structurală a moleculelor;6. Ligaze sau sintetaze care catalizează formarea de noi legături te tip C-N, C-

O, C-C, C-S, cu consumare de ATP.

2.3. Utilizări ale enzimelor în industrie:Principalele domenii în care enzimele şi-au găsit utilizări sunt:

- Fabricarea unor produse prin transformarea enzimatică a amidonului;- La fabricarea altor produse alimentare : produse lactate, bere, sucuri, vin, panificaţie;- În compoziţia detergenţilor;- Industria textilă, hârtiei şi a furajelor pentru animale;- Sinteza catalitică a unor substanţe chimice;- Analiza alimentelor, diagnoză chimică şi terapie;- Inginerie genetică;

Biotehnologia preparatelor enzimatice este un domeniu de bază al biotehnologiei, având drept scop studierea tehnicilor de obţinere a preparatelor enzimatice folosind materii prime de origine animală, vegetală şi microbiană, sub formă liberă sau imobilizată pentru a fi folosite ca agenţi biologici în industria alimentară, industria furajelor, industria textilă, detergenţilor, farmaceutică, cosmetică, chimică, etc. Prin utilizarea preparatelor enzimatice, tehnologiile tradiţionale se transformă în biotehnologii, devenind mai eficiente şi mai puţin poluante. În figura 2. este prezentată ponderea de utilizarea a preparatelor enzimatice în diferite ramuri.

Amidon; 30

Detergenti; 35

Produse lactate; 5

Distilate; 5

Bere; 4

Sucuri, vinuri; 10

Morarit, panificatie; 5

Alte domenii; 6

Figura 2. Ponderea utilizării preparatelor enzimatice

Page 4: Culturi starter de microorganisme

Aşa cum se observă din datele de mai sus, cea mai mare pondere o are utilizarea în industria alimentară, urmată de industria detergenţilor.

În figura 3. sunt prezentate principalele tipuri de preparate enzimatice produse pe plan mondial. Cea mai mare pondere o au preparatele de proteaze urmate de amilaze.

Proteaze de coagulare; 5

Amilaze bcteriene; 10

Amilaze fungice; 18

Glucozizomeraze; 14

Alte enzime; 4Pectinaze; 10

Proteaze fungice; 4

Proteaze bacteriene; 35

Figura 3. Principalele tipuri de preparate enzimatice.

2.4. Tipuri de preparate enzimatice. Preparatele enzimatice se comercializează sub diverse forme şi grade de

purificare:Preparate enzimatice solide:1. Preparate enzimatice brute, sub formă de pulbere, obţinute prin uscarea şi măcinarea mediului fermentat;2. Preparate sub formă cristalizată, enzime pure utilizate preponderent în chimia analitică şi ingineria genetică;3. Preparate liofilizate, care sunt enzime purificate în amestec cu substanţe crioprotectoare, care sunt urcate în vacum la temperaturi de -20......-50C.

Preparate enzimatice lichide1. Preparate enzimatice brute, formă sub care se livrează enzimele extracelulare (eliberate de către microorganisme în mediul de cultură în timpul fermentaţiei).2. Preparate parţial purificate, în care se adaugă conservanţi pentru a le mări stabilitatea în timp.

Page 5: Culturi starter de microorganisme

2.5. Surse de enzimePreparatele fabricate la scară industrială folosesc trei tipuri de surse: ţesuturi

animale şi vegetale sau microorganisme.Sursele animale sunt reprezentate de subprodusele din industria cărnii (ficat,

pancreas, inimă, rinichi, creier, mucoasă stomacală şi intestinală). Utilizarea acestr surse este pe scară din ce în ce mai redusă, fiind înlocuite de sursele microbiene, deoarece sursele animate prezintă o serie de dezavantaje, cum ar fi: producţia limitată, apariţia unor boli cum ar fi encefalopatia spongiformă la bovine. Principalele enzime de origine animală care se obţin sub formă de preparate sunt chimozină (renina) care se extrage din stomacul de miel sau viţei care se utilizează pentru coagularea laptelui la fabricarea brânzeturilor. O altă enzimă este -amilaza pancreatică care are utilizări în industria farmaceutică.

Sursele vegetale sunt reprezentate de seminţe(germinate sau negerminate), rădăcini, fructe, sevă, latexuri, frunze. Utilizarea surselor vegetale pentru obţinerea preparatelor enzimatice ridică o serie de probleme, cum ar fi: prezenţa unor substanţe potenţial dăunătoare sănătăţii omului (ex. Compuşii fenolici) sau a unor compuşi toxici de comtaminare. Aceste dezavantaje face ca sursele de origine vegetală să fie destul de puţin utilizate. Principalele enzime obţinute din surse vegetale sunt.- papaina, protează obţinută din latexul fructelor de Caryca Papaia. Enzima este utilizată pentru tenderiyarea cărnii sau în industria berii;- ficina, protează obţinută din latexul fructului de smochin (Ficus carica), utilizată pentru degradarea proteinelor miofibrilare.- bromelina, protează obţinută din sucul de ananas ( Ananas comosus ), folosită pentru hidroliya proteinelor colagenice.

Alte enzime de origine vegetală sunt lipoxigenaza din soia şi complexul enzimatic din malţ ( amilaze, proteaze, glucanaze). Preparatele enzimatice ale acestor enzime nu sunt purificate, fiind sub formă de făină de soia sau de malţ.

Microorganismele reprezintă principala sursă pentru obţinerea de preparate enzimatice. Avantajele utilizării microorganimelor constau în:- microorganismele se pot obţine în cantităţi mari (biomasă) prin cultivare în instalaţii speciale pe medii de cultură ieftine (tărâţă de grâu, extract de porumb, melasă, şroturi de soia sau floarea soarelui, zer),- ciclul de dezvoltare al microorganismelor este foarte scurt faţă de cel al plantelor sau animalelor;- producţia de enzime de către microorganisme poate fi mărită prin selectarea şi utilizarea de tulpini mutante, înalt performante (productive) şi prin stabilirea condiţiilor optime fizice şi chimice pentru producerea de enzime;- proprietăţile enzimelor şi specificitatea de acţiune diferă cu natura microorganismelor producătoare, astfel industrial se pot obţine preparate care corespund întocmai scopului dorit.- preparatele enzimatice obţinute pot avea activităţi diferite cu predominanţa unei activităţi.

Page 6: Culturi starter de microorganisme

2.6.Tehnologii de obţinere a preparatelor enzimaticeTehnologia de obţinere a preparatelor enzimatice implică operaţiile indicate în

schema prezentată în fig. 4. din care rezultă ca preparatele enzimatice pot fi obţinute sub formă de:- preparate enzimatice brute-uscate;- preparate enzimatice brute – lichide concentrate;- preparate enzimatice purificate – concentrate, respectiv şi uscate.

Figura 4. Schema tehnologică generală de obţinere a preparatelor enzimatice

Procesele biotehnologice de obţinere a preparatelor microbiene sunt complexe, realizarea lor presupune parcurgerea a trei etape:1. Pregătirea mediului de cultură, prin prelucrarea mecanică şi fizico chimică a materiilor prime ce intră în compoziţia mediului de cultură (fermentativ). Această etapă presupune operaţii de dozare, mărunţire, solubilizare, sterilizare etc.2 Etapa biologică care constă în obţinerea culturilor starter intermediare şi a culturii de producţie, urmată de etapa fermentativă prorpiu-zisă.

Page 7: Culturi starter de microorganisme

3. Etapa de separare, purificare şi standardizare a enzimelor.

A. Pregătirea mediului de culturăMaterii prime utilizate pentru fabricarea mediilor de cultură.

Materiile prime trebuie să asigure principalii nutrienţi microorganismelor în vederea dezvoltării lor în timpul fermentaţiei.

Surse de carbon. Principala sursă de carbon (sursă de energie) pentru microorganisme o constituie glucidele, sub formă de glucoză, fructoză, galactoză care sunt uşor asimilabile, în timp ce maltoză, zaharoza şi lactoza sunt asimilate doar dacă microorganismele posedă enzime capabile să le transforme în monoglucide. Poliglucidele pot fi utilizate doar de către microorganismele apte să sitetizeze enzimele care să le hidrolizeze extracelular în monoglucide capabili să difuzeze prin membrana celulară.

Ca surse de carbon în reţetele mediilor industriale se folosesc urmatoarele: - Melasele care provin de la rafinarea zahărului.- Extractul de porumb, este reprezentat de extractul obţinut din industria amidonului după ce suferă o concentrare până la 50% S.U. - Leşiile sulfitice provin din industria hârtiei ca urmate a transformării masei lemnoase în pulpă celulozică sub acţiunea bisulfitului de calciu.

Surse de azot. Azotul din mediul de cultură are rol anabolic, participând la biosinteza proteinelor structurale, a enzimelor şi acizilor nucleici.

Principalele surse de azot sunt:- azot anorganic: amoniac, săruri de amoniu, sulfatul de amoniu, forfatul acid de diamoniu, - azot organic: hidrolizate proteice de cazeină, soia, carne etc.

Surse de ioni anorganici. Pentru dezvoltarea microorganimelor în timpul procesului de fermentaţie este necesară prezenţa ionilor anorganici, aceştia reprezintă circa 8% din substanţa urcată a a celulelor microbiene. Principalii ioni anorganici care trebuie să fie prezenţi în mediul de cultură sunt: macronutrienţii (azot, fosfor, sulf, potasiu, şi magneziu) şi micronutrienţii (sodiu, calciu, clor, fier, cobalt, zinc, molibden, cupru, mangan, nichel şi seleniu).

Surse de factori de creştere. Factorii de creştere sunt compuşi organici a căror prezenţă în mediul de cultură este necesară în cantităţi mici, având un rol catalitic sau structural pentru microorganisme. Factorii de creştere includ vitaminele, purine, pirimidine, nucleotide şi nucleozide, aminoacizi, acizi graşi, steroli şi poliamide.Principalele vitamine necesare ca factori de creştere sunt: biotina, acid pantotenic, acidul nicotinic, tiamina.

Tratamentul termic al mediilor de cultură. Pentru buna desfăşurare a procesului de fermentaţie este necesară cultivarea microorgnimelor pe un mediu de cultură steril pentru a preveni contaminarea. Sterilizarea mediului de cultură se poate realiza direct în bioreatorul în care se realizează fermentaţia sau într-un vas sub presiune separat, ulterior fiind transferat în bioreactor.

Page 8: Culturi starter de microorganisme

B. Etapa biologică.Obţinerea culturilor starter de producţiePentru producerea enzimelor, fermentaţiile industriale se desfăşoară în

volume de 150 – 250 de mc de mediu, motiv pentru care trebuie pregătită o cantitate suficientă de inocul. Cultura folosită drept inocul trebuie să fie în faza exponenţială de creştere. La microorganismele care au viteză de creştere redusă, se recomandă să se folosească o cantitate mai mare de inocul, pentru a se reduce durata iniţieirii fermentaţiei. Cultura starter de producţie trebuie să conţină celule active, adaptate la mediul industrial pentru ca fermentaţia să se declanşeze rapid. În cazul fermentaţiilor desfăşurate pe mediul solid, pentru care se utilizează inocule sporifere se recomandă să se asigure prin inoculare concentraţii de 105-106 spori pe g mediu, iar în cazul celor submerse cultura starter de producţie să fie de circa 10% din mediul de cultură.

Figura 5. Schema bloc de obţinere a preparatelor enzimatice microbiene brute

Page 9: Culturi starter de microorganisme

Tehnici de fermentaţiePentru producţia de preparate enzimatice de origine microbiană se

poate aplica două tehnici de bază :Fermentaţia de suprafaţă în care se utilizează un mediu solid pe care

se cultivă microorganismul (de regulă un mucegai filamentos). Această tehnică are avantajul că mediul de cultură va deveni un mediu bogat în activitate enzimatică ;

Fermentaţia de submersă, în care mediul este lichid ce se află într-un reactor unde toţi parametrii fermentaţiei sunt perfect controlaţi. Această ultimă tehnică este superioară primei metode din punct de vedere tehnologic şi biochimic.

Dintre speciile de microorganisme ce se folosesc menţionăm următoarele : Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Mucor miehei, Saccharomyces cerevisiae, Endothia parasitica, Penicillium emersonii, Kluyveromyces lactis, Bacillus amylolichefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Actinoplanes missouriens, Klebsiella planicola.

La sfârşitul fermentaţiei microorganismul trebuie distrus cu condiţia păstrării intacte a activităţii enzimatice.

Microorganismele cultivate pot produce enzime extracelular sau intracelular. În funcţie de tipul acestora variază şi procedeul de extracţie. În ceea ce priveşte tipurile de culturi submerse, ne putem situa în unul din următoarele cazuri:

Procedeul nealimentat, în care caz toate ingredientele mediului de fermentare sunt pregătite în fermentator la pH-ul şi temperatura dorită înainte de a introduce inoculum. După introducerea inoculum, fermentaţia principală începe şi finalizarea ei se urmăreşte prin prelevarea de probe, în mod steril, care arată :- creşterea microorganismelor (biomasă, vâscozitatea mediului) ;- concentraţia în enzimă (activitatea enzimatică a mediului) ;- consumul de glucide ;- nivelul de proteine.

La procedeul nealimentat se pot monta diferiţi senzori care arată :- pH-ul – care se poate regla prin adaus de baze sau acid ;- temperatura – care se poate regla prin debitul de circulaţie al apei reci în mantaua fermentatorului sau în serpentina din interiorul fermentatorului ;- nivelul de spumă – care se poate combate cu un antispumant aflat într-un rezervor ataşat fermentatorului;- presiunea – care se reglează prin supape care se deschid la presiuni de 1 până la 3 bar ;- coeficientul respirator QR – care se măsoară prin cantitatea de CO2 produsă faţă de cantitatea de oxigen consumată ;- nivelul de oxigen consumat, pornind de la analiza efluenţilor.

Page 10: Culturi starter de microorganisme

Procedeul alimentat, în care se începe cu un volum de 10 – 30% de substrat în care se introduce inoculum, după care fermentatorul se alimentează cu restul de mediu, după care oprirea fermentaţiei se face după un anumit timp fixat experimental. Acest procedeu se aplică în cazul în care sinteza enzimelor ar fi reprimată de concentraţiile ridicate într-unul din nutrienţii mediului de cultură sau în cazul când creşterea microorganismelor, în funcţie de concentraţia în unul din componenţii mediului, ar provoca creşterea vâscozităţii, care trebuie să fie reglată în timp. Alimentarea fermentatorului poate fi repetată de mai multe ori efectuându-se sutiraje (evacuări) programate, dar întotdeauna trebuie lăsat în fermentator un volum de 30%, care serveşte în acest caz drept cultură de productie.

Procedeul continuu necesită alimentarea continuă a fermentatorului cu mediu şi folosirea unei culturi concentrate de microorganisme. În acest caz, bioreactorul (fermentatorul) de dezvoltare a celulelor este cuplat cu o unitate de micro sau ultrafiltrare. În figura 1.9. se arată schiţa unei astfel de instalaţii formată dintr-un bioreactor cuplat cu o unitate de ultrafiltrare la care există şi posibilitatea de a recicla biomasa.

Avantajele unui astfel de procedeu sunt următoarele :-se poate detoxifica mediul de cultură prin eliminarea produsului de inhibare ;-celulele reciclate devin perfuzate ;-cantitatea de mediu de cultură care se introduce în bioreactor este controlată de cantitatea de permeat care traversează membrana de ultrafiltrare ;-celulele au posibilitatea de a se dezvolta până la concentraţii relativ mari ( 300 g substanţă uscată/l, în cazul drojdiilor) ;-aceste concentraţii mari de celule se constituie ca o barieră eficace faţă de contaminarea exterioară ;-retenatul poate fi evacuat şi el periodic, fiind constituit din biomasă care conţine enzime intracelulare, după care este trecut la prelucrare ulterioară (extracţie) ;-permeatul de la ultrafiltrare, care conţine enzime nu mai are celule microbiene şi poate fi, deci, stocat sau dirijat direct la o operaţie în aval de purificare sau concentrare.

Neajunsurile acestui procedeu de obţinere a biomasei şi enzimelor sunt următoarele :-membranele trebuie să fie rezistente la sterilizarea cu vapori de apă şi la igienizare cu substanţe chimice ;-costurile energetice sunt destul de ridicate;-mediul de cultură poate fi colmatant pentru membrana de ultrafiltrare;-chiar la densităţi mari de celule, la sfârşitul ciclului de dezvoltare este posibilă o oarecare liză a celulelor, ceea ce face necesară o purjare a bioreactorului prin unitatea de ultrafiltrare, fapt care conduce la micşorarea vârstei medii a celulelor care rămân în sistem.

Page 11: Culturi starter de microorganisme

O variantă a procedeului continuu de obţinere a biomasei/ enzimelor constă în folosirea bioreactorului cu membrană.

C. Etapa de separare a enzimelorExtracţia. La procedeul discontinuu (nealimentat) şi cel alimentat, după

terminarea fermentaţiei se separă partea solidă insolubilă (celule şi produse insolubile) de partea lichidă care conţine enzimele, separare care se poate face prin centrifugare, filtrare frontală sau microfiltrare. Soluţia sterilă obţinută este apoi ultrafiltrată pentru a concentra enzimele. În cazul în care enzimele sunt destinate a intra în compoziţia unui preparat comercial lichid, ultrafiltratul se stabilizează cu polioli (sorbitol, glicerol) şi/sau săruri (NaCl, MgSO4), respectiv se adaugă bacteriostatici alimentari (benzoat, sorbat, ascorbat).În cazul în care enzima (enzimele) intră în compoziţia unui preparat comercial pulbere, ultrafiltratul se suplimentează cu un suport şi se usucă prin atomizare (suplimentarea se face cu amidon, dextrine). Înainte de atomizare mai poate fi realizată o filtrare sterilă.

Pentru a obţine şi enzimele intracelulare, biomasa din fermentator, separată de partea lichidă, este supusă lizei. Liza poate fi realizată chiar de enzimele proprii microorganismelor ce alcătuiesc biomasa, fie prin folosirea de preparate exogene, cum ar fi lizozimul din albuşul de ou, preparate enzimatice exogene complexe de natură bacteriană care conţin chitinază, mananază, -1,6–glucanază, proteaze, câteodată în combinaţie cu adaosul de metabisulfit.În cazul în care enzima este periplasmică, un şoc osmotic este suficient pentru a elibera enzimele. Se poate realiza şi o liză mecanică (folosire de presiuni mari de 600 – 1000 bar, urmată de detenta brutală) Se pot folosi şi ultrasunetele cu frecvenţe mai mari de 20 MHz pentru liza celulelor şi deci pentru eliberarea enzimelor intracelulare. Odată eliberate, enzimele intracelulare sunt supuse operaţiilor aplicate şi enzimelor extracelulare.

Preparatele enzimatice se comercializează de regulă sub formă de pulbere, de microgranule, precum şi sub formă lichidă.

Preparatele enzimatice sub formă de pulbere sunt formulate cu un suport cum ar fi amidonul, maltodextrinele, zahărul, sarea. La aceste preparate se controlează granulometria, umiditatea ( 6%). Suportul trebuie să nu fie higroscopic pentru a se evita formarea de cocoloaşe. În preparatele comerciale pulbere sau lichide, conţinutul de enzimă este redus raportat la suport şi de aceea cantitatea de preparat comercial este mult mai mare, în comparaţie cu nivelul de enzimă conţinut.

În ceea ce priveşte preparatele comerciale microgranulate, acestea se obţin dintr-un ultrafiltrat care se amestecă cu un suport (sare, amidon solubil, maltodextrine etc.). Cantitatea de substrat este astfel calculată încât să se obţină titrul enzimatic dorit în microgranule. Amestecul respectiv este pulverizat împreună cu un agent liant care reprezintă 0,1% până la 0,5% faţă de masa suportului. Picăturile pulverizate sunt uscate într-un turn de uscare, cu aer la 70 - 90C.

Page 12: Culturi starter de microorganisme

Preparatele comerciale lichide sunt formulate în general cu polioli (gliceroli, sorbitol) care se utilizează în proporţie de 20 – 50% faţă de preparatul lichid. La aceste formulări se adaogă o substanţă bacteriostatică (de exemplu benzoat de sodiu în proporţie de 0,1 – 0,2%).

2.7. Enzime imobilizateImobilizarea unei enzime (sau a unui sistem multifuncţional) înseamnă

legarea sau fixarea acesteia de un suport care trebuie să îndeplinească următoarele condiţii :-să fie insolubil în apă ;-să asigure păstrarea proprietăţilor catalitice ale enzimelor, respectiv specificitatea de acţiune ;-să asigure acţiunea enzimei la un pH şi temperatură optime, apropiate de cele ale enzimelor libere (neimobilizate).

Avantajele imobilizării enzimelor sunt următoarele : creşterea stabilităţii enzimei, ca proteină şi ca activitate catalitică. Această stabilitate este în legătură cu diminuarea gradului de libertate al macromoleculei, ceea ce are consecinţă asupra variaţiilor de conformaţie a enzimei (se diminuează aceste variaţii). Imobilizarea conduce şi la creştere a concentraţiei locale a protein-enzimei care are un efect stabilizant; se poate lucra în flux continuu din punct de vedere al catalizei enzimatice, dar şi din punct de vedere al reglării automate a parametrilor de lucru; enzima nu pătrunde în substratul ce se tratează în cursul catalizei enzimatice; se poate modula micromediul în care acţionează enzima imobilizată (concentraţie substrat, încărcarea suportului cu enzimă, grupările hidrofile); refolosirea treptată a enzimei, deci cu aceeaşi cantitate de enzimă se poate transforma o cantitate mai mare de substrat; se poate lucra în sistem semicontinuu sau continuu, putându-se automatiza procesul, ceea ce asigură un control riguros al parametrilor de lucru; are loc o creştere a vitezei de lucru, prin controlul riguros al vitezei fluxului de substrat şi al concentraţiei acestuia; se poate stopa reacţia enzimatică la momentul dorit şi se evită trecerea enzimei în produsul transformat; costurile globale de producţie sunt mai mici în comparaţie cu procedeele în care se folosesc enzime libere; se pot folosi şi enzime care nu sunt trecute în liste GRAS (Generally Reconized as Safe);

Există şi dezavantaje, cum ar fi: costuri privind imobilizarea; pierderi ale activităţii enzimatice, o investiţie iniţială în utilaje mai mare,

Page 13: Culturi starter de microorganisme

un proces mai complex din punct de vedere tehnic şi o supraveghere mai atentă; utilizarea numai a unor substraturi solubile.

Aspecte teoretice privind enzimele imobilizate.În cazul enzimelor imobilizate se observă un comportament cinetic diferit faţă

de cel al enzimelor libere, solubile. Activitatea enzimatică scade ca urmare a imobilizării. Acest lucru se datorează schimbărilor conformaţionale ale enzimei după imobilizare. O astfel de modificare apare în primul rând în cazul legării covalente a enzimelor de suport. Un alt aspect este influenţa mediului, în cazul enzimelor imobilizate acesta este diferit de cel apos. Astfel, grupările funcţionale acide

La imobilizare, în funcţie de enzimă şi catalizator se poate vorbi de :- randament de fixare care reprezintă cantitatea efectivă de enzimă imobilizată în raport cu cantitatea de enzimă introdusă în procesul de imobilizare :

enzimă fixată pe suport = · 100

enzimă utilizată

- randament de activitate care reprezintă activitatea reziduală a enzimei imobilizate:

Activitatea (E0) după fixare · 100Activitatea (E’0) înainte de fixare

Factorii critici care trebuie luaţi în consideraţie la folosirea enzimelor imobilizate

Aceşti factori se referă la :- eficienţa economică a imobilizării determinate de : costul enzimei, costul suportului, costul tehnicii de imobilizare ;- activitatea enzimei imobilizate care este influenţată de : tehnica de imobilizare; caracteristicile materialului suport, viteza de difuzie a substratului la enzimă şi a produsului (lor) de transformare ;- caracteristicile substratului ce trebuie transformat ;- stabilitatea enzimei care trebuie menţinută activă un timp cât mai îndelungat - contaminarea microbiologică a sistemului enzimă/suport în timpul utilizării reactorului respectiv.

Page 14: Culturi starter de microorganisme

Figura 6. Metode de imobilizare a enzimelor

Metode de imobilizare a enzimelora) Metode fizice, la care enzima se leagă de un suport prin intermediul

legăturilor slabe sau relativ puternice (legături Van der Waals, legături de hidrogen, interacţiuni proteină – proteină, legături ionice).Imobilizarea în cadrul metodelor fizice poate fi :- prin adsorbţie pe suporturi organice : amidon, colagen, Sepharoză modificată, polistiren modificat, răşini schimbătoare de ioni (DEAE celuloză, DEAE Sephadex, carboximetil-celuloză, Amberlit, Dowex 50 etc.) ;- prin adsorbţie pe suporturi minerale : alumină, argilă (bentonită, montmonirolită etc.), ceramică, hidroxiapatită, sticlă poroasă sau silice poroasă, titanit (punţi metalice cu TiCl4). Adsorbţia se realizează prin contactul dintre o soluţie apoasă de enzimă cu suportul solid şi va fi influenţată de : pH, tipul de solvent utilizat pentru solubilizarea enzimei, puterea ionică, calitatea enzimei, temperatura şi durata de contact a enzimei cu suportul. Practic imobilizarea se face prin amestecul dintre soluţia de enzimă şi suport într-un reactor cu agitator sau prin trecerea soluţiei de enzimă într-o coloană în care suportul este menţinut sub forma unui pat. Adsorbţia enzimei de suport poate fi îmbunătăţită prin ataşarea de suport a unor cofactori, cum ar fi piridoxal-fosfatul sau lanţuri cu grupări hidrofile.

Adsorbţia este influenţată de raportul dintre suprafaţa şi volumul suportului, mărimea particulelor, raportul dintre grupările hidrofile şi hidrofobe.

Page 15: Culturi starter de microorganisme

Avantajele şi dezavantajele imobilizării prin adsorbţie

AvantajeSimplicitate în execuţie (incubarea enzimei cu suportul, agitare câteva minute, enzima care rămâne în soluţie fiind eliminată prin spălare).Absenţa reacţiilor chimice (numai dacă nu se formează punţi metalice).Posibilitatea de regenerare a complexului enzimă/suport.

DezavantajeStabilizare slabă.Riscul de desorbţie a enzimei de către : fluxul de substrat, variaţie lejeră de pH, forţa ionică, temperatură

-prin includere într-un suport, în care caz se pot include şi microorganisme. Includerea poate fi făcută în gel, microincapsulare, includere în fibre.

Avantajele şi dezavantajele imobilizării enzimelor prin incluziune

AvantajeReacţiile de polimerizare sau gelificare sunt bine cunoscuteReacţiile chimice dintre suport şi enzimă sunt limitate (enzima este inclusă în geluri naturale)Se poate aplica la toate enzimele (chiar şi la amestec de enzime)Se pot folosi suporturi cu forme diferite : filme, fibre, bile.Riscul de “evadare” a enzimei este redus prin reticularea suportului după imobilizare

DezavantajeAnumite polimerizări necesită agenţi denaturanţi sau radicaliciSe pun probleme de transfer de masă (inaccesibilitatea unor substraturi la enzimă)Riscul de evadare al enzimei prin microporiProprietăţile mecanice ale gelurilor sunt nesatisfăcătoare

Avantajele şi dezavantajele imobilizării enzimelor prin incluziune

b) Metode chimice de imobilizare, în care caz imobilizarea se face prin intermediul legăturilor covalente de suporturi insolubile, care posedă grupări reactive sau care pot fi activate prin diferite reacţii chimice. Se poate realiza imobilizarea şi prin copolimerizarea enzimelor cu un monomer reactiv şi legarea încrucişată (Cross-linking) sau reticulară intra şi intermoleculară a enzimelor de un suport prin intermediul unui reactiv multifuncţional.

Page 16: Culturi starter de microorganisme

La legarea prin legături covalente, imobilizarea poate fi făcută : prin fixare de un suport insolubil, dar trebuie să se ţină seama de gruparea funcţională care poate reacţiona cu protein-enzima şi de caracteristicile fizico-chimice ale suportului. Adesea este necesar să se creeze, pe cale chimică, funcţii reactive pe suport; prin coreticulare utilizând agenţi bi- sau polifuncţionali. Cel mai mult utilizată pentru reticulare este glutaraldehida.

Avantajele şi dezavantajele legării enzimelor de suport prin legături covalente

AvantajeStabilitate mărită datorită faptului că legăturile covalente sunt cele mai puternice dintre toate legăturile menţionate anteriorVarietatea mare a suporturilor : sticlă, silice, ceramică, celuloză, polimeri sintetici etc.Posibilitatea de a efectua imobilizarea în prezenţa unui substrat pentru a se evita inactivarea (protecţia situsului activ).

DezavantajeTrebuie realizate reacţii chimice, adesea complexeEtapa de activare a suportului este lungăRandamentul de fixare este 100%Există riscul modificării chimice a enzimei (pierdere de activitate)Este necesar ca enzima să fie purificată în prealabilInvestiţia (costul) este importantă

Suporturi de imobilizare comercialeSuporturile comerciale cele mai des utilizate pentru imobilizarea

enzimelor sunt:- polizaharide : agaroză, celuloză şi derivaţi, alginaţi, carageenani, dextrani ;- poliacrilamide utilizate sub formă de bile ;- polistiren (bile şi tuburi) ;- silicea şi sticla poroasă.

2.8. Condiţiile de inocuitate pe care trebuie să le îndeplinească preparatele enzimaticeNumăr total de germeni (NTG), maximum 5.104/g ;Coliformi, maximum 30/g ;Escherichia coli – absent/ 25 g ;Salmonella – absent/ 25 g ;Activitate antibiotică de origine microbiană – absentă ;

Page 17: Culturi starter de microorganisme

Aflatoxina B1, ochratoxină A, sterigmatocistină, toxina T – 2 (zearalenona) în cazul preparatelor de origine microbiană – absente ;Metale grele :-arseniu 3 mg/Kg ;-plumb 10 mg/Kg ;-alte metale grele 40 mg/Kg (exprimată la Pb).

3. CULTURI STARTER DE MICROORGANISME

Microorganismele sunt utilizate în industria alimentară pentru:- Obţinerea de celule (culturi starter = culturi pure) care la rândul lor sunt folosite pentru fermentarea produselor lactate acide sau brânzeturi, la fabricarea produselor de carne (salamuri crude uscate), produse tradiţionale vegetale, produse lactate acide, pâine etc. În acest produsele se consumă fie împreună cu celulele respective fie după îndepărtarea celulelor cum este cazul băuturilor de tipul berii, vinului.- Obţinerea de biomasă care poate fi utilizată ca ingredient de fermentare (drojdia de panificaţie ) sau de îmbogăţire a unor produse alimentare cu proteine, respectiv ca furaje proteice pentru păsări, peşte, porcine. În ceea ce priveşte metodele de cultivare ale microorganismelor se folosesc metode periodice (discontinui) şi metode continui, în ambele cazuri fiind necesară optimizarea procesului.

Metoda periodică de cultivare a microorganismelor prevede alimentarea continuă a aparatului de cultivare cu substanţe nutritive şi înlăturarea culturii de microorganisme. În acest fel, se creează condiţii optime de acumulare a cantităţii necesare de biomasă sau a metaboliţilor. La cultivarea periodică concentraţia substanţelor nutritive scade, iar cea a celulelor şi metaboliţilor creşte, fapt care conduce la modificarea cineticii creşterii microorganismelor.

La metoda periodică trebuie să avem în vedere două situaţii şi anume:- când substratul este inhibitor pentru producţia de biomasă şi metaboliţi;- când produsul este inhibitor.

Prima situaţie se întâlneşte la obţinerea biomasei de drojdie de panificaţie, represiunea catabolică de către glucide antrenează şi o producţie de alcool etilic, producţie ce trebuie evitată prin două soluţii şi anume: evitarea excesului de substrat şi lucru cu cultura “în pat” şi respectiv plasarea unui detector de alcool în efluentul de gaz (CO2) care permite să se cunoască ce aport de substrat trebuie furnizat.

A doua situaţie se întâlneşte la producţia de culturi lactice a căror dezvoltare este însoţită de acumularea de acid lactic (bacterii lactice homofermentative) sau acid lactic şi acetic (bacterii lactice heterofermentative).

Soluţia care se impune în acest caz este o dializă a culturii sau centrifugarea substratului cu celule, celulele fiind apoi reciclate.

Dacă dezvoltarea culturii are loc fără acumularea de metaboliţi, alimentarea cu substrat se poate face la un debit constant, dar la o concentraţie crescătoare a

Page 18: Culturi starter de microorganisme

acestuia, respectiv la o concentraţie constantă a substratului dar la un debit programat exponenţial.

Metoda continuă, în care caz are loc alimentarea constantă a aparatului de cultivare a microorganismelor cu substanţe nutritive şi eliminarea neîntreruptă a biomasei sau metaboliţilor. Această metodă poate fi realizată prin cultivarea de suprafaţă sau de adâncime a microorganismelor.

La fermentarea continuă se are în vedere natura catalizatorului (imobilizat sau nu; sistem eterogen sau nu; celule incluse, adsorbite, grefate prin covalenţă); gradul de reciclare al celulelor microbiene; gradul de amestecare a fluidelor în reactorul cu funcţionare continuă.Creşterea concentraţiei de celule se poate realiza prin: folosirea tehnicilor de membrană sau centrifugarea; folosirea de celule imobilizate; reciclarea celulelor.

3.1. Microorganisme utilizate în industria alimentară

BACTERIILE utilizate în industria alimentară aparţin următoarelor genuri:Genul Streptococcus Acest gen cuprinde specii de bacterii sub formă de

coci sferici sau ovali cu 2, grupate în diplo sau formă de lanţuri. Sunt Gram pozitive, facultativ anaerobe, neciliate, nesporulate, unele specii fiind capsulate.Importanţi pentru industria alimentară sunt:

Streptococii mezofili : Streptococcus lactis (Lactococcus lactis subsp. lactis), Str. cremoris (Lactococcus lactis subsp. cremoris), Str. diacetilactis (Lactococcus lactis subsp. diacetilactis);

Streptococii termofili: Str. thermophilus.Aceşti streptococi lactici sunt homofermentativi, produc acid lactic L(+) şi

prezintă următoarele activităţi:- activitate fermentativă: fermentează lactoza şi glucoza;- activitate proteolitică;- produc diacetil şi acetoină din acid citric ( în principal Str. diacetilactis).

Fermentarea lactozei de către streptococii lactici se face prin transformarea iniţială a acesteia în glucoză şi galactoză – 6P prin intermediul fosfo--galactozidazei. În continuare, glucoza este apoi fermentată pe calea hexozo – difosfatului în acid lactic, iar galactoza – 6P este utilizată pe calea tagatozei în vederea producerii unei cantităţi suplimentare de acid lactic (fig. 7.).

Page 19: Culturi starter de microorganisme

Figura 7. Calea tagatozei de degradare a lactozei de către streptococii lactici

Fermentarea glucozei de către streptococii lactici poate fi făcută pe cale homofermentativă cu producerea în principal de acid lactic şi pe cale heterofermentativă, în condiţile în care glucoza este limitată, calea heterofermentativă fiind calea ribulozei – 5P cu formare de acid acetic, etanol şi acid lactic (fig. 8.).

Figura 8. Calea homo şi heterofermentativă de degradare a glucozei de către bacteriile lactice

Page 20: Culturi starter de microorganisme

Fermentarea acidului citric cu formare de diacetil, acetoină şi 2,3 butilenglicol este arătată în figura 9. Acelaşi mecanism îl folosesc şi leuconostocii.

Figura 9. Transformarea citratului de către Str. lactis subsp. diacetilactis şi Leuconostoc

Genul Leuconostoc Acest gen cuprinde bacterii cu formă sferică, lenticulară, grupate în perechi sau lanţuri, imobile, asporogene, Gram negative, facultativ anaerobe.

Pentru dezvoltare, leuconostocii au nevoie de vitamine (acid nicotinic, tiamină, biotină) şi zaharuri fermentescibile. Nu sunt proteolitici şi nu reduc azotaţii. Specii de Leuconostoc formează polimeri (dextran). Se dezvoltă bine la 20-30C.

Genul Leuconostoc cuprinde speciile: Leuconostoc cremoris (citrovorum); Leuconostoc lactis; Leuconostoc dextranicum; Leuconostoc mezenteroides.

Aceste specii sunt heterofermentative şi se dezvoltă greu în laptele fără adaos de stimulatori. În produsele lactate, leuconostocii au două funcţii de bază: - produc compuşi de aromă (diacetil, acetoină); - produc ochiuri de fermentare prin formare de CO2 în unele tipuri de brânzeturi (Edam, Goude, Tilsit).

Ambele funcţii sunt realizate prin metabolismul citratului, dar leuconostocii produc CO2 şi din lactoză. Leuconostocii intervin deci în metabolismul glucidelor şi al citratului.

Metabolismul glucidelor. Fermentarea glucidelor de către leuconostoci se face pe calea fosfocetohexozelor, dintr-un mol de hexoză regenerându-se câte un mol de ATP. Genele care codifică etapele iniţiale ale fermentării lactozei (ca de altfel şi ale metabolizării citratului, producerii de proteaze) sunt localizate în plasmide.

Page 21: Culturi starter de microorganisme

Metabolismul citratului. Metabolismul citratului de către leuconostoci este acelaşi ca şi la streptococi cu menţiunea că leuconostocii produc diacetil şi acetoină la pH scăzut. Acetoina se poate forma pe două căi:

- prin decarboxilarea acetolactatului;- din diacetil prin intermediul diacetil reductazei, într-o reacţie care necesită

NADH sau NADPH. Această ultimă cale este redusă sau chiar lipseşte în cazul lui Str. diacetilactis, din cauza capacităţii limitate a acestuia de a produce acetil- CoA, unul din precursorii diacetilului.

Leuconostocii (ca de altfel şi lactobacilii) pot produce la unele brânzeturi unele defecte şi anume: - crăparea pastei la brânza Cheddar ( defect numit “Blit opennes”);- apariţia timpurie de gaze la brânza Goude (Str. diacetilactis poate produce şi el defectul de “plutire” a coagulului, la brânza Cottage).

Aceste defecte se datorează formării de CO2. Pentru a se preveni defectul de “plutire” a coagulului, brânza Cottage se fabrică cu o cultură care nu conţine Str. diacetilactis, adăugându-se apoi în brânza obţinută o cultură de Leuconostoc citrovorum cultivată pe lapte cu adaos de citrat sau o cultură concentrată de Leuconostoc citrovorum.

În afară de industria laptelui, leuconostocii se utilizează şi pentru:- fermentarea unor produse vegetale (varză, castraveţi, măsline) intervenind în cadrul microflorei spontane sau sub formă de culturi concentrate;- fermentarea malolactică a vinurilor;- producţia de dextran.

În industria laptelui se folosesc culturi lactice care conţin streptococi acidifianţi (Str. lactis şi Str. cremoris), precum şi bacterii producătoare de aromă şi unele specii de Leuconostoc şi Str. diacetilactis, ultimul fiind aromatizant şi acidifiant.

Genul Pediococcus. Acest gen aparţine familiei Streptococaceae şi cuprinde bacterii sub formă de coci perechi sau tetrade. Metabolismul acestor bacterii este predominant fermentativ, homolactic. Se produce acid lactic racemic (DL) din glucoză, fructoză, manoză. Sorbitolul şi amidonul nu sunt fermentaţi. Multe specii sunt catalază-negative, dar se întâlnesc şi specii care au activitate catalazică independentă de hem.

Principalele criterii de diferenţiere între diferitele specii de pediococi sunt menţionate în tabelul 10.

P. acidilacti, în culturi starter, este utilizat pentru obţinerea de produse din carne fermentate la temperaturi mai ridicate, deoarece are o dezvoltare bună la 42-52C, producând rapid acidul lactic şi deci scade efectiv pH-ul, produsul obţinut având gust acrişor. Atunci când se utilizează la fermentarea unor produse de carne la temperatura de 16-27C, producţia de acid lactic este mai lentă şi implicit se pot dezvolta şi microorganismele care contaminează carnea, durata de fermentaţie fiind mai mare.

P. pentosaceus produce o fermentaţie rapidă când substratul conţine un glucid fermentescibil, temperatura de fermentare fiind cuprinsă între 15-27C.Tabel 10. Criterii de diferenţiere între diferitele specii de pediococi

Page 22: Culturi starter de microorganisme

Culturi starter Temperatura de incubare, C

Durata, ore pH-ul

P. pentosaceusP. acidilactiP. pentosaceusP. pentosaceus

26,726,729,429,4

20381328

5,005,655,005,40

Din tabelul de mai sus rezultă că P. pentosaceus este mai eficace în ceea ce priveşte producţia de acid lactic atât la 26,7C cât şi 29,4C în comparaţie cu P. acidilactici.

Având în vedere că pediococii produc acid lactic şi bacteriocine, ei exercită o acţiune inhibitoare faţă de microorganismele patogene şi cele de alterare (stafilocici, salmonele, Cl. botulinum, bacili, enterobacterii gram negative, drojdii).În produsele de carne fermentate, pediococii pot scade pH-ul de la 5,6 la 4,5-5,2 ceea ce face ca proteinele să fie aduse aproape de punctul izoelectric fapt ce favorizează sinereza şi deci uscarea produsului.

Acidul lactic produs contribuie la denaturarea proteinelor din carne ceea ce contribuie la realizarea unei texturi ferme a produsului finit.

Genul Lactobacillus. Acest gen aparţine familiei Lactobacillaceae. Această familie cuprinde bacterii sub formă de bastonaşe de lungimi şi grosimi variabile, precum şi cocobacili scurţi, aşezaţi obişnuit în lanţuri în faza de înmulţire logaritmică.

Sunt asporogene, imobile, Gram pozitive, anaerobe sau facultativ anaerobe. În general sunt catalază –negative citocrom-oxidază –negative, nu reduc azotaţii, nu lichefiază gelatina. Au activitate proteolitică şi lipolitică redusă. Glucidele cele mai bine fermentate sunt: lactoza, maltoza, zaharoza (mai ales în faza de dezvoltare), apoi hexozele (glucoza, fructoza, galactoza).

Pentru dezvoltare necesită substanţe minerale şi toate vitaminele din grupul B. Se dezvoltă bine în mediu cu pH 5,5-5,8, dar şi la pH 5 . Se pot dezvolta în limite largi de temperatură (5-53C), dar temperatura optimă este cuprinsă între 30 şi 45C.

În funcţie de temperatura optimă de dezvoltare lactobacilii pot fi: - termofili: L. lactis, L. helveticus, L. bulgaricus, L. acidophilus, temperatura optimă fiind 37-45C; - mezofili: L. casei, L. plantarum, L. brevis etc.; temperatura optimă de dezvoltare fiind 26-30C.

Orla Jensen a împărţit genul Lactobacillus în următoarele grupe:1. grupa Thermobacterium care cuprinde lactobacili homofermentativi termofili: L. lactis, L. helveticus, L. bulgaricus, L. acidophilus, L. delbrueckii; L. leichmanii;2. grupa Streptobacterium – care cuprinde lactobacilii homofermentativi mezofili: L. casei, L, plantarum;

Page 23: Culturi starter de microorganisme

3. grupa: Betabacterium – care cuprinde lactobacili heterofermentativi, ce contaminează frecvent brânzeturile: L fermenti, L. buchneri, L. brevis, L. viridiscens.Streptobacteriile la rândul lor, au fost clasificate de către unii autori în neacidorezistente şi acidorezistente.

Lactobacilii neacidorezistenţi produc compuşi aromatici (diacetil, acetoină). Se prezintă sub formă de bastonaşe de lungimi variabile şi rar formează lanţuri .

Se pot dezvolta la 2-15C. Nu se dezvoltă la pH 5,6. Se utilizează în culturi starter la fermentarea salamurilor crude cu pH = 5,6 – 6,1, produsele având o durată mare de maturare, iar gustul final fiind slab acrişor dulceag.

Lactobacilii acidorezistenţi au formă de bastonaşe scurte care formează lanţuri. Se dezvoltă bine la pH 5,0.

Activitatea metabolică a lactobacililor în produsele alimentare fermentate se referă la metabolismul lactozei, galactozei şi glucozei. Zaharoza este fermentată numai după hidroliza acesteia în glucoză şi fructoză.

Metabolismul lactozei. Pentru a se dezvolta în lapte, lactobacilii homofermentativi hidrolizează lactoza cu ajutorul -galactozidazei şi/sau -D–fosfogalactozid– galactohidrolazei, aşa cum arată în schema din figura 11.

Figura 11. Transformarea lactozei în glucoză şi galactoză respectiv glucoza şi galactoza 6P de către lactobacilii homofermentativi

-D-galactozid–galactohidrolaza este utilizată de Lb. casei iar -galactozidaza este utilizată de majoritatea lactobacililor (L. bulgaricus, L. lactis, L. helveticus etc.), deşi aceştia din urmă au şi activitate -D–fosfogalactozid–galactohidrolazică, însă mai redusă.

L. bulgaricus are -galactozidază activă la pH = 7,0 şi este activată de Mg2+, Mn2+ şi Fe2+. În cele mai multe cazuri, lactobacilii folosesc mai mult glucoza ca sursă de energie în comparaţie cu lactoza şi galactoza. Unii lactobacili eliberează în mediu galactoză care se acumulează.

Metabolismul hexozelor. După hidroliza lactozei în celulele lactobacililor homofermentativi, hexozele rezultate sunt metabolizate pe calea Embden – Meyerhof.

Page 24: Culturi starter de microorganisme

Lactobacilii heterofermentativi fermentează hexozele pe calea hexozomonofosfatului, aceşti lactobacili neavând aldolază şi triozofosfat izomerază care sunt enzime cheie în calea Embden – Meyerhof. Aceasta este de fapt şi diferenţa dintre cele două grupe de microorganisme, adică lactobacilii homofermentativi posedă atât aldolază cât şi triozofosfatizomerază, în timp ce lactobacilii heterofermentativi nu posedă aceste enzime.

Galactoza, rezultată din lactoză, pentru a fi fermentată trebuie mai întâi să fie transformată într-un derivat fosforilat al glucozei (glucozo-6P), care apoi suferă transformări pe calea Embden – Meyerhof (fig. 12.).

Figura 12. Transformarea galactozei în glucoză-6P de către lactobacili

Activitatea proteolitică. Activitatea proteolitică a lactobacililor contribuie atât la textura cât şi la aroma unor produse alimentare (produse lactate, produse vegetale fermentate, produse din carne fermentate etc.), dar şi la eliberarea unor aminoacizi care stimulează creşterea şi activitatea altor bacterii lactice folosite în culturile starter în amestec cu lactobacilii. Se consideră că activitatea endoproteinazică a lactobacililor este asociată cu membrana celulelor, iar activitatea exopeptidazică este localizată intracelular. Enzimele din membrana celulelor produc hidroliza parţială a macromoleculelor proteice, din care se formează peptide suficient de mici pentru a fi transportate în interiorul celulelor unde se continuă degradarea lor până la aminoacizi, necesari creşterii (figura 13.).

Activitatea proteolitică a lactobacililor este optimă la pH 5,2- 5,8 şi temperatura de 45-50C. La temperaturi mai mari de 55C activitatea proteolitică este mult redusă datorită termodenaturării enzimei iar la 70C/1min enzimele sunt complet inactivate.

În cazul laptelui, proteinazele extracelulare ale L. bulgaricus sunt active faţă de -cazeină, apoi în ordine descrescătoare şi faţă de Қ şi cazeină.

Page 25: Culturi starter de microorganisme

Figura 13. Acţiunea endoproteinazelor extracelulare şi a exopetidazelor intracelulare în cazul lactobacililor

Producerea de compuşi de aromă şi H2O2 . Principala contribuţie a lactobacililor este producţia de acid lactic. În cazul produselor lactate acide, deşi speciile de lactobacili implicate sunt homofermentative, acestea însă produc şi alţi metaboliţi, printre care produşi volatili ca: acetaldehida, diacetil şi alcool. In cantitate mai mare fiind produsă acetaldehida. În plus, L. casei produce diacetil din citrat, mai ales atunci când laptele se suplimentează cu citrat (L. casei nu este însă un producător major de diacetil). Anumiţi lactobacili produc H2O2 care se acumulează în mediul şi jenează dezvoltarea altora. Acumularea H2O2 în mediul de cultură este posibilă pentru ca lactobacilii sunt catalază – negativi. Incapacitatea lactobacililor de a distruge metabolic H2O2 explică de ce aceştia nu se dezvoltă bine în condiţii puternic aerobe, oxigenul fiind toxic pentru lactobacili care nu posedă superoxiddismutază, enzimă care se constituie ca un sistem de protecţie faţă de toxicitatea oxigenului, cum este cazul altor bacterii.

Acţiunea lactobacililor este îmbunătăţită prin interacţiuni cu alte bacterii lactice. De exemplu, cultura mixtă formată din L. bulgaricus şi Str. thermophilus este adecvată pentru fabricarea iaurtului, deoarece cultura mixtă produce mai rapid acid lactic.

Interacţiunea dintre cele două bacterii lactice este benefică din următoarele motive:- L. bulgaricus produce aminoacizi liberi, în particular histidină, care stimulează producţia de acid lactic a lui Str. thermophilus;- Str. thermophilus, pe de altă parte, produce acid formic, care stimulează activitatea lui L. bulgaricus;- Str. thermophilus, deşi produce o cantitate suficientă şi de CO2 care stimulează dezvoltarea lui L. bulgaricus, totuşi dezvoltarea acestuia este mai redusă, deoarece

Str. thermophilus utilizează mai rapid anumite substanţe nutritive esenţiale pentru dezvoltarea lui L. bulgaricus. În plus, lactobacilii, în general, sunt sensibili chiar la niveluri foarte reduse de antibiotice, în comparaţie cu Str. thermophilus ( de aici şi necesitatea ca laptele să nu conţină urme de antibiotice).

Page 26: Culturi starter de microorganisme

Utilizarea culturilor de lactobacili: În industria laptelui se utilizează Lactobacillus lactis şi Lactobacillus bulgaricus, singuri sau în amestec la fabricarea iaurtului, chefirului, cumâsului, brânzei Ementhal, brânzeturilor italiene. Lactobacillus helveticus este şi el implicat în unele din aceste produse. Lactobacillus acidophilus este folosit la fabricarea laptelui acidofil, laptelui acidofil nefermentat şi a altor produse acidofile. Lactobacillus casei se utilizează pentru obţinerea produsului yakult. În industria cărnii interesează Lactobacillus sake, Lactobacillus curvatus şi în special Lactobacillus plantarum care se caracterizează prin faptul că nu produce CO2 la fermentarea glucozei dar produce CO2 din gluconat. Riboza este fermentată la acid lactic şi acid acetic. Posedă activitate aldolazică, glucozo – 6P – dehidrogenazică. Prin fermentaţie lactică se produce acid lactic racemic (DL).

Lactobacillus plantarum este facultativ anaerob, nu produce NH3 din arginină. Poate acidifica laptele şi are temperatura optimă de dezvoltare la 30-35C. Nu necesită pantotenat, tiamină, niacină pentru dezvoltare.

Lactobacillus plantarum ca şi Lactobacillus sake pot descompune acidul gluconic cu formare de acid acetic ceea ce este dezavantajos în cazul salamurilor la care se foloseşte glucono – delta – lactona ca acidifiant chimic. Lactobacillus plantarum poate reduce NaNO3 dacă pH-ul mediului este mai mare de 6,0 şi nu există zaharuri fermentescibile în mediul de cultură. Lactobacillus sake şi Lactobacillus curvatus produc H2O2 în prezenţa O2 atmosferic. Cei doi lactobacili se întâlnesc frecvent în salamurile crude fără adaos de culturi starter (sunt componenţi ai microflorei spontane a compoziţiei de carne). Alte utilizări Lactobacilii interesează şi în fermentarea măslinelor, verzii, castraveţilor, gogonelelor, în producerea spirtului şi drojdiei presate în vederea acidifierii plămezilor, la fermentarea unor produse fermentate din cereale (bragă, cvas), la fabricarea acidului lactic prin fermentare etc.

Genul Micrococcus şi Staphylococcus. Microorganismele din genurile Micrococcus şi Staphylococcus aparţin familiei Micrococaceae care cuprinde bacterii sub formă de coci. Se pot dezvolta în medii care conţin 15% NaCl.

Pentru industria cărnii interesează anumite specii de micrococi şi stafilococi care sunt folosite pentru:- capacitatea lor de a reduce azotaţii la azotiţi (contribuie la formarea culorii cărnii sărate în prezenţă de azotaţi);- activitatea lor catalazică;- activitatea de acidificare, proteolitică şi lipolitică.

Dintre speciile de micrococci interesează Micrococcus aurantiacus şi Micrococcus varians.

Pentru industria laptelui, micrococii formează partea principală a populaţiei nelactice din laptele crud şi respectiv brânzeturile fabricate din laptele crud. Din brânza Cheddar fabricată din lapte crud a fost izolat Micrococcus freundenreichii, care a fost ulterior utilizat sub formă de cultură pură în scopul accelerării formării aromei brânzei fabricate din lapte pasteurizat datorită activităţii proteolitice şi

Page 27: Culturi starter de microorganisme

lipolitice. Tot în scopul maturării unor brânzeturi cu pastă presată s-a utilizat un preparat enzimatic şi anume Rulactina ce conţine o metal-protează cu activitate strict endoproteinazică obţinută din Micrococcus caseolyticus.

Din genul Staphylococcus interesează speciile de stafilococi coagulază-negativi, nepatogeni cum ar fi: Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xilosus, Staphylococcus simulans.

Combinaţiile de micrococi şi stafilococi sunt eficace pentru activitatea azotat-reductazică şi catalazică. În aceste combinaţii, Staphylococcus carnosus acţionează mai bine decât micrococii în formarea culorii, reducând azotaţii la azotiţi şi respectiv azotiţii la oxid de azot, chiar în condiţii de aciditate ridicată a substratului. Aroma produselor la care este utilizată cultura starter de Staphylococcus carnosus este superioară.

Genul Streptomyces. Specii din genul Streptomyces pot altera alimentele, producând mirosuri şi gusturi dezagreabile, altele (puţine la număr) sunt patogene. Streptomyces griseus senso Hötter este însă inofensiv şi a fost folosit pentru capacitatea sa de a reduce azotatul la azotit, putându-se dezvolta bine în substraturi care conţin ~ 8% NaCl şi care au pH = 5,8-8,5. Temperatura optimă de dezvoltare este la 30C. Este catalază – pozitiv având capacitate proteolitică dar nu şi lipolitică. Poate fi asociat cu micrococii şi/sau lactobacilii. În salamurile crude se inoculează la nivel de 5·103 /g compoziţie.

Genul Propionibacterium. Bacterile din genul Propionibacterium fac parte din familia Propionibacteriaceae. Bacteriile propionice fermentează carbohidraţii, piruvatul/lactatul. Bacteriile propionice “tip lapte” sunt: Propionibacterium freundreichii (cu subspeciile freundreichii, globosum şi shermani), Propionibacterium theonii, acidipropionici şi jensenii.

Principalii produşi de fermentaţie a bacteriilor propionice sunt CO2, cantităţi mari de acid propionic şi acetic şi cantităţi mici de acid izovalerianic, formic, succinic, lactic. Toate speciile produc acid lactic din glucoză. Se dezvoltă foarte bine la 30-37C şi la pH = 7,0.

Producerea de propionat, acetat şi CO2 . Lactatul (respectiv piruvatul) este transformat în propionat prin reacţia: 3CH3-CHOH-COOH 2CH3-CH2-COOH + CH3-COOH + CO2 + H2O

Propionatul, acetatul şi CO2 se formează în proporţie de 2/1/1. Diferitele tulpini de bacterii propionice se deosebesc între ele prin raportul acid propionic /acid acetic format, o influenţă în acest sens având şi aciditatea substratului, cantitatea de lactat şi adaosul de carbonat şi succinat.

Producerea de prolină . Prolina este considerată ca principalul component care conferă aromă dulceagă brânzeturilor de tip şvaiţer, prezenţa prolinei fiind asociată cu dezvoltarea bacteriilor propionice la maturarea brânzeturilor de tip şvaiţer. Se consideră că există trei căi pentru producerea de prolină:- proteoliza generală;

Page 28: Culturi starter de microorganisme

- hidroliza peptidelor care conţin prolină;- biosinteza prolinei.

La prima cale se ia în considerare producerea de prolină prin hidroliza cazeinei.

La a doua cale se ia în considerare formarea de prolină din hidrolizatul cazeinic prin acţiunea peptidazelor (Propionibacterium shermanii posedă imidopeptidază şi proliniminopeptidază intracelulare cu optim de pH la 5,5-6,0).

La a treia cale se are în vedere biosinteza prolinei din arginină şi mai puţin din acid glutamic, dar calea de biosinteză este nesemnificativă în raport cu cea de-a doua cale menţionată.

În orice caz, concentraţia de prolină din interiorul celulelor este mai mică decât cea a prolinei din mediul de cultură .

Eliberarea prolinei din peptide coincide cu eliberarea enzimelor celulare în mediu. Bacteriile propionice singure hidrolizează încet cazeina, dar producerea de prolină în brânzeturi este sporită prin dezvoltarea anterioară sau concomitentă a bacteriilor lactice. Viteza formării prolinei la valorile pH şi concentraţia de NaCl atinsă în brânza şvaiţer este temporar încetinită, dar maturarea prelungită anulează efectele de inhibare ale pH-ului şi concentraţia de NaCl. Se consideră că ionii de cupru ar inhiba producerea de prolină pe unele căi, această inhibare parţială fiind benefică, deoarece permite evoluarea altor procese de aromatizare.

Producerea de diacetil şi acetoină . Bacteriile propionice pot produce diacetil şi acetoină, cantităţile formate fiind mai mari la 21C decât la 32-37C.

Producţia de diacetil este urmată de reducerea acestuia la acetoină şi 2,3 butilenglicol. Cantitatea de diacetil creşte prin adaos de citrat, piruvat sau glucoză în mediu de cultură. În culturile mixte de Str. lactis şi bacterii propionice, producţia de diacetil se intensifică ca o consecinţă a scăderii pH-ului de către streptococi.

Bacteriile propionice produc şi alte substanţe care contribuie la aroma brânzeturilor: aldehidă acetică, aldehidă propionică, alcool etilic, alcool propilic, dimetilsulfură, acid izovalerianic.

Alte activităţi metabolice. Bacteriile propionice pot avea şi activitate proteolitică şi lipolitică.

Bacteriile propionice pot contribui într-o măsură mai mică la activitatea proteolitică din brânza Şvaiţer prin enzimele proteinazice (~12 enzime) şi peptidazice (~ 7 enzime), dar activitatea proteolitică a bacteriilor propionice este inferioară bacteriilor lactice (L. bulgaricus, L. helveticus, Str. thermophilus).Bacteriile propionice pot contribui şi la lipoliza trigliceridelor, eliberând acizi graşi cu lanţ lung, dar această activitate lipolitică este nesemnificativă.

DROJDIILE, ciuperci unicelulare care se înmulţesc prin înmugurire, mai rar prin sciziparitate şi care formează ascospori (sunt şi drojdii care nu formează spori, acestea denumindu-se drojdii/false torule şi micoderme), sunt agenţi tipici ai fermentaţiei alcoolice.

Page 29: Culturi starter de microorganisme

Se prezintă sub formă de celule rotunde sau ovoide (Saccharomyces cerevisiae), eliptice (Saccharomyces elipsoideus), foarte alungite (Saccharomyces pasteurianus), de forma unei lămâi (Saccharomyces apiculans), de forma unei sticle (Saccharomyces ludwigii) sau sub formă de cilindru (Pichia).

Dintre drojdii interesează (în sens util) cele aparţinând familiei Saccharomycetaceae, genul Saccharomyces care cuprinde drojdii alcooligene folosite în industria berii, vinului, pâinii, spirtului, genul Kluyveromices care fermentează lactoza, genul Debaryomices care se utilizează în industria cărnii. Mai interesează drojdiile familiei Cryptococcaceae (genurile Candida, Torulopsis) care se folosesc ca agenţi de fermentare şi producători de biomasă.

Utilizări ale drojdiilor1. Utilizarea pentru fermentarea alcoolică Pentru fermentaţia alcoolică se folosesc drojdiile adevărate care aparţin genului Saccharomyces (Meyen) Ress şi care se caracterizează prin aceea că nu formează micelii tipic, produc 1-4 spori, iar puterea de fermentare depăşeşte puterea de respiraţie. Sunt adaptate la condiţii de anaerobioză şi prin urmare nu formează voaluri la suprafaţă.După modul de comportare în timpul fermentaţiei drojdiile pot fi:

de fermentaţie superioară care se ridică în cantităţi mari la suprafaţa lichidului de fermentare sub forma unui strat gros de spumă care se păstrează astfel până la sfârşitul fermentării. După sedimentare aceste drojdii rar dau un precipitat dens. Au optim de temperatură la 28…30C şi fermentează 1/3 din rafinoză. În categoria drojdiilor de fermentare superioară se încadrează cele care produc fermentarea alcoolică în cazul obţinerii alcoolului etilic, pâinii şi unele suşe pentru bere (Saccharomyces cerevisiae);

de fermentaţie inferioară care se dezvoltă în lichidul fermentat, nu se ridică la suprafaţă în spumă, dar formează flocoane şi se sedimentează repede. Au optim la temperatura de 8…12C şi fermentează complet rafinoza. Drojdiile de fermentare inferioară se folosesc la obţinerea berii, vinului, cidrului (Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces oviformis, Saccharomyces vini, Saccharomyces uvarum).

Fermentaţia alcoolică produsă de drojdii este influenţată de:- concentraţia zahărului fermentescibil din mediu;- temperatură ;- conţinutul în alcool din substrat;- felul drojdiei.

Concentraţia favorabilă de zahăr fermentescibil este de 10-15%. Fermentaţia alcoolică se desfăşoară lent la pH 4-4,5, în mediu alcalin sensul fermentaţiei fiind schimbat.

Viteza maximă de fermentare este la 30C, dar în practică se realizează la 4…28C. Alcoolul pe măsura acumulării în mediu devine toxic pentru drojdii. Există drojdii care se dezvoltă la 16-18% alcool (Saccharomyces chevalieri Guilliermond, Saccharomyces oviformis), însă în cele mai multe cazuri fermentaţia se opreşte la 12-14% (Saccharomyces uvarum, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces vini, Saccharomyces cerevisiae).

Page 30: Culturi starter de microorganisme

Odată cu creşterea temperaturii de fermentare se măreşte toxicitatea alcoolului. Fermentaţia alcoolică este un proces anaerob. Prin trecerea la aerobioză, drojdiile se înmulţesc rapid şi produc biomasă.

Fermentarea alcoolică nu este o fermentaţie pură. Se mai formează glicerină ( 8% din totalul zaharurilor existente în mediu), acid lactic, acid acetic, substanţe acetoinice (acetil metil carbinol = acetoină şi diacetil), acid malic, acid succinic, acid propionic, acid citramalic, acid dimetilgliceric, alcooli superiori: izobutilic, izoamilic, amilic, care provin din aminoacizii rezultaţi la degradarea substanţelor pectice din musturi şi plămezi.

Aceşti alcooli superiori se formează prin reacţii de dezaminare şi decarboxilare ale aminoacizilor leucină, izoleucină şi valină.

Fermentaţia alcoolică se aplică la: obţinerea alcoolului din produse amidonoase (cartofi, porumb, secară), produse care conţin zaharoză (sfeclă, melasă), produse care conţin lactoză (zer), produse care conţin glucoză (hidrolizate celulozice, leşii sulfitice); obţinerea berii şi vinului, cidrului inclusiv cvas din pâine, rom, whisky; obţinerea de băuturi fermentate pe bază de cereale şi leguminoase; obţinerea unor tipuri de produse lactate (chefir); obţinerea de băuturi fermentate pe bază de zer.2. Utilizarea pentru obţinerea de biomasă (s-a menţionat anterior);3. Utilizarea în industria cărnii, în care caz se foloseşte drojdia Debaromyces hansenii care este tolerantă la NaCl, nu reduce NaNO3 şi necesită oxigen atmosferic pentru dezvoltare.

Se dezvoltă bine în straturile periferice ale salamurilor neafumate sau puţin afumate. Această drojdie are capacitatea de a consuma oxigenul din pastă şi de a distruge peroxizii produşi de bacteriile lactice. De regulă, Debaromyces hansenii se foloseşte în combinaţie cu Staphylococcus carnosus şi Lactobacillus plantarum sau Staphylococcus xilosus şi Lactobacillus sake. Se consideră că prin folosirea drojdiei menţionate produsele capătă o aromă cu totul deosebită. 4. Utilizarea în industria laptelui La fabricarea brânzeturilor, drojdiile se dezvoltă la suprafaţa brânzeturilor dar şi în interiorul brânzeturilor cu pastă moale sau cu mucegai în pastă în timpul presării, zvântării şi maturării, având următoarele acţiuni pozitive: consumă lactatul şi în acest fel contribuie la neutralizarea pastei, îmbunătăţind prin aceasta consistenţa şi favorizând implantarea bacteriilor; produc factori de creştere pentru dezvoltarea bacteriilor; produc o peliculă de “acoperire” la anumite tipuri de brânzeturi; produc proteoliză şi lipoliză şi prin urmare contribuie la consistenţa şi aroma brânzei respective; produc compuşi volatili de aromă.

Dintre drojdii, Candida hansei a fost cultivată în asociaţie cu lactobacili şi Str. thermophilus, favorizând oxidarea lactatului, scăderea potenţialului de oxidoreducere şi producerea de factori de creştere, precum şi dezvoltarea culturilor starter în care este asociată. Drojdia Candida lipolitica este uneori folosită la fabricarea

Page 31: Culturi starter de microorganisme

brânzeturilor cu mucegai în pastă, datorită faptului că prin lipazele conţinute realizează o hidroliză a lipidelor din brânză, fapt ce favorizează utilizarea acizilor graşi de către Penicillium în reacţiile de -oxidare. Drojdia Torulopsis candida găsită pe brânzeturi se dezvoltă bine în medii acide şi suportă concentraţii de NaCl până la 10%. Drojdia Candida kefir şi alte drojdii din granula de chefir realizează fermentaţia alcoolică în produsul lactat acid dietetic chefir.

Kluyveromices lactis şi Kluyveromices fragilis se utilizează la obţinerea de lactază care are multe utilizări. Kluyveromices lactis şi Kluyveromices fragilis se utilizează la obţinerea de biomasă prin cultivare aerobă pe zer (procedeul Bell – Franţa).

Kluyveromices fragilis şi Candida pseudotropicalis se utilizează pentru obţinerea alcoolului etilic din zer (procedeul Carbery –Irlanda).

MUCEGAIURILE Pentru industria alimentară interesează clasa Phycomycetes cu următoarele

genuri:Genul Mucor şi Rhizopus aparţinând familiei Mucoraceae. Aceste

mucegaiuri care se întâlnesc pentru diferite produse vegetale şi alimentare, sub formă de colonii pufoase, au o acţiune fermentativă netă.

Specii de Mucor şi Rhizopus se folosesc pentru: - obţinerea unor produse alimentare fermentate în Orientul Îndepărtat, pe bază de cereale şi leguminoase;- în producţia de spirt prin zaharificarea amidonului (procedeul Amilo care foloseşte Amylomyces rouxi – Mucor rouxianus); - în producţia de enzime, în principal amilolitice şi proteolitice.

Din clasa Ascomycetes interesează ordinul Plectascales cu genurile Aspergillus şi Penicillium.

Mucegaiurile din genul Aspergillus se utilizează în:- producţia de şuncă în SUA şi Spania (mai puţin);- obţinerea de produse fermentate tradiţionale în Orientul Îndepărtat (ceva mai mult);- obţinerea de enzime: amilaze, proteaze, enzime pectolitice.

Mucegaiurile din genul Penicillium se utilizează în:- industria brânzeturilor cu mucegai la suprafaţă şi în pastă (Penicillium camemberti şi Penicillium roqueforti);- industria cărnii cu mucegaiuri de acoperire (Penicillium nalgiovensis şi Penicillium exposus);- obţinerea de enzime amilolitice, proteolitice, pectolitice.

În industria cărnii, culturile de spori de mucegai se utilizează pentru maturarea unor şunci, care se însămânţează cu spori de Penicillium netoxicogen, în special P. nalgiovensis, P. exposum, şi P. chrysogenum, respectiv Country curred ham şi Jambon Serano, care se însămânţează cu spori de Aspergillus glaucus şi a unor tipuri de salamuri crude fabricate în România , Italia, Ungaria, Elveţia, Spania,

Page 32: Culturi starter de microorganisme

Franţa, Bulgaria; Austria, Belgia, Germania (şi mai puţin în SUA, Israel, Iugoslavia, Polonia).

În cazul salamurilor crude afumate/neafumate, mucegaiurile de acoperire contribuie la:- reglarea eliminării apei din produs şi a schimbului de gaze;- formarea aromei;- îmbunătăţirea aspectului comercial al produsului.

Aroma este mai evidentă la salamurile cu diametru mai mic. Produsele pot fi livrate cu mucegaiul de acoperire intact sau după “ periere”. Culoarea miceliului rămas este dependentă de varietatea mucegaiului folosit: alb-ivorie (preferabilă în Italia); gri (preferabilă în Ungaria); alb-mat (preferabilă în România).

Prin utilizarea culturilor pure de mucegai se suprimă apariţia la suprafaţa salamurilor a mucegaiurilor toxicogene, în special a celor producătoare de aflatoxine precum şi a mucegaiurilor de “pătare” care produc spoturi de culoare verde sau neagră.

Penicillium nalgiovensis Se utilizează spori de Penicillium nalgiovensis pentru salamurile crude cu miceliu alb la suprafaţă. Sporii, în suspensie, se pulverizează la suprafaţa produselor. După 3-4 zile de la însămânţare se formează micelii, iar după 5-6 zile de la însămânţare apar corpii de fructificaţie purtători de conidii. Temperatura optimă de dezvoltare a mucegaiului este de 22-23C.

Penicillium nalgiovensis foloseşte ca substrat nutritiv glucidele dar are şi activitate proteolitică şi lipolitică. Nu are activitate celulazică şi nu produce micotoxine.

Penicillium expansum se dezvoltă bine la 22C şi umiditatea relativă a aerului este de ~ 82% pentru sporulare şi ~ 88% pentru germinare. Dezvoltarea bună este la = 92-95%. Sporii pulverizaţi la suprafaţa batoanelor formează un miceliu pufos în circa 8 zile de la însămânţare, maturizarea deplină având loc după 30 zile de la însămânţare. Penicillum expansum nu produce micotoxine dacă substratul conţine proteine cu sulf (cazul pastei salamurilor crude).

În industria laptelui culturile de spori de mucegai se utilizează, aşa cum deja s-a menţionat, la fabricarea brânzeturilor cu mucegai în pastă cât şi cu mucegai la suprafaţă (brânzeturi cu pastă moale).

Pentru brânzeturile cu mucegai în pastă (Brânza Roquefort, Gorgonzola, Stilton, Gammelost) se utilizează spori de Penicillium roquefort. Pentru brânzeturile de tip Camembert se utilizează sporii de la două specii de Penicillium: P. camemberti şi P. caseicolum.

Mucegaiurile dezvoltate în/pe aceste brânzeturi au rol fundamental în:- formarea aromei şi gustului;- formarea consistenţei;- definitivarea aspectului, procesele care intervin în formarea aromei şi consistenţei fiind proteoliza, lipoliza şi -oxidarea acizilor graşi.

Suspensiile de spori se pot adăuga/folosi:- în laptele destinat brânzeturilor sau amestecarea cu coagulul obţinut în cazul brânzei cu mucegai în pastă;

Page 33: Culturi starter de microorganisme

- în laptele destinat fabricării brânzei, sau pulverizare la suprafaţa brânzei formate în cazul brânzeturilor cu mucegai la suprafaţă. Mucegaiurile mai importante pentru industria laptelui sunt:

Penicillium roqueforti Thom se dezvoltă bine la 20-25C şi pH 4,5-7,5. Tolerează concentraţii de 5-8% NaCl. Are activitate proteolitică, lipolitică şi de -oxidare a acizilor graşi. Activitatea mucegaiului este stânjenită de prezenţa acidului propionic în brânză, la concentraţii mari de 30% CO2 în aerul depozitului. Pentru intensificarea formării aromei se recomandă ca lipidele din lapte să fie în prealabil lipolizate cu esterază pregastrică, astfel ca pe măsură ce mucegaiul sporulează, acizii graşi liberi să fie -oxidaţi până la metilcetone. P. roqueforti se dezvoltă în canalele şi golurile practicate în pasta brânzei, sporii formaţi având culoare verde închis care conferă brânzei un aspect marmorat.

Penicillium camemberti şi Penicillium caseicolum Sporii acestor mucegaiuri se utilizează în producţia brânzeturilor de tip Camembert incluzând Camembert, Brie, Neufchatel, Coulommier, Garré de l’Est, Olivet.

Penicillium camemberti Thom (Penicillium album) se utilizează la brânzeturile tip Camembert cu pastă mai untoasă, mai parfumată, de culoare gri – alburie.

Penicillium caseicolum Bainer (Penicillium candidum) se utilizează la brânzeturile de tip Camembert cu pasta mai compactă, o aromă mai delicată, mai discretă şi de culoare alb – imaculat.

La însămânţare prin pulverizare de spori la suprafaţă a brânzeturilor cu umiditate ~ 55-60% se formează miceliile de mucegai care consumă din aciditatea pastei, consecinţa fiind creşterea pH-ului începând cu a 12 –a zi, iar după 27 de zile pH-ul rămâne constant.

Mucegaiurile din genul Penicillium au activitate endoproteinazică faţă de - şi cazeină, dar au şi activitate exopeptidazică importantă, fiind demonstrat faptul că atât P. roqueforti cât şi P. camemberti sintetizează 2 endopeptidaze (o metal proteinază şi o aspartil proteinază) precum şi două exopeptidaze cu acţiune carboxi- şi aminopeptidazică, activitatea celor două grupe de enzime fiind relativ echivalentă în stratul de suprafaţă al brânzeturilor.

Unele specii de Penicillium camemberti pot produce o micotoxinâ (acidul ciclopiazonic, dar activitatea toxicogenă a mucegaiului este aproape nulă la temperatura tehnologică de maturare a brânzei (14-16C).La brânza Camembert se pot utiliza şi spori de Geotricum candidum care se introduc în lapte. Geotricum reduce pericolul formării peptidelor amare, inhibă dezvoltarea lui Penicillium, consumă acidul lactic şi deci contribuie la neutralizarea pastei, având şi acţiune protolitică şi lipolitică. Brânza Camembert obţinută din lapte pasteurizat cu adaos de Geotricum candidum are o aromă asemănătoare cu cea a brânzei Camembert tradiţionale, adică fabricată din lapte crud.

3.2. Culturi starterCulturile starter sunt definite ca acele culturi care se obţin plecând de la o

cultură pură stoc şi care prin trecere prin culturi intermediare (pasaje) devin apte de a fi folosite pentru producţia unor alimente fermentate. Culturile starter pot fi formate numai dintr-un singur microorganism sau din mai multe microorganisme.

Page 34: Culturi starter de microorganisme

Culturile starter de microorganisme sunt utilizate în vederea: dirijării unor procese biochimice prin care se asigură produsului un anumit grad de inocuitate (inclusiv capacitatea de conservare); asigurării unor însuşiri senzoriale; asigurării, în unele cazuri, şi a unor însuşiri nutritive.

La folosirea culturilor starter în industria alimentară trebuie să se aibă în vedere următoarele: să conţină un anumit număr de microorganisme viabile (g/ml) şi un număr cât mai redus de germeni nedoriţi; produşii metabolici, primari şi secundari, să nu prezinte pericol pentru sănătatea oamenilor; să nu conţină şi să nu producă antibiotice care se utilizează în scop terapeutic la oameni; să aibă o anumită (anumite) activităţi specifice: de producere a acidului lactic, de reducere a azotului etc; microorganismele existente în cultură să fie declarate cu numele ştiinţific întreg; speciile (suşele) noi care se introduc în producţie, trebuie să fie înregistrate la MS şi să fie depozitate în colecţii cu nomenclator; înainte de utilizare în producţie să fie testate din punct de vedere al inocuităţii în conformitate cu legislaţia în vigoare; suşele declarate a fi sigure trebuie controlate la intervale regulate de către institute specializate, în ceea ce priveşte puritatea lor; speciile, care pe baza noilor cunoştinţe ştiinţifice au fost recunoscute ca având potenţial patogen sau toxicogen, trebuie să fie supuse unui control riguros pentru fiecare suşă, realizându-se studii de toxicitate pe termen lung, de carcinogenitate şi mutagenitate.

Toate cele menţionate trebuie să se constituie ca o obligativitate absolută deoarece: culturile starter se pot consuma în stare vie, odată cu produsul alimentar, aşa cum este cazul produselor lactate acide, brânzeturilor, salamurilor şi cârnaţilor cruzi, a unor sortimente de bere, a unor produse vegetale: varză murată, castraveţi muraţi, gogonele murate, măsline verzi; culturile starter se pot consuma după distrugerea lor, rămânând în produsul alimentar atât ele cât şi produşii lor de metabolism, aşa cum este cazul brânzei proaspete de vaci şi a iaurtului care au fost pasteurizate, brânzeturilor topite, produselor de panificaţie etc.; produşii de metabolism ai culturilor starter se consumă odată cu produsele alimentare, însă microorganismele sunt eliminate în cea mai mare parte, aşa cum este cazul berii, vinului, alcoolului, oţetului, acidului citric, acidului lactic etc.

Culturi starter de bacterii lacticeCulturile starter de bacterii lactice sunt folosite în diferite domenii: industria

laptelui, cărnii, produselor vegetale murate, industria vinului, industria panificaţiei, industria sucurilor de fructe şi legume fermentate etc.

Page 35: Culturi starter de microorganisme

Folosirea culturilor starter de bacterii lactice asigură produselor alimentare în care se introduc un anumit grad de inocuitate. Această asigurare este realizată deoarece bacteriile lactice produc: acizi organici, în principal acid lactic, dar şi acid acetic, alcool, CO2; substanţe bacteriocine eliberate în mediul de cultură; peroxizi organici (H2O2).

În plus, bacteriile lactice intră în competiţie cu microorganismele patogene şi cele de alterare în ceea ce priveşte consumul de substanţe nutritive, iar datorită şi acidifierii mediului, consecinţă a acumulării acizilor organici, bacteriile patogene şi de alterare sunt inhibate în dezvoltarea lor. Dintre bacteriile patogene sunt inhibate stafilococii, salmonelele, Listeria monocytogenes, Cl. botulinum etc.

Datorită acidităţii se inhibă şi dezvoltarea microflorei cu activitate proteolitică şi decarboxilazică, deci se formează cantităţi mai reduse de amine biogene, iar în cazul cărnurilor sărate în prezenţă de azotiţi, datorită acidităţii se favorizează descompunerea mai completă a azotiţilor, deci scade producţia de nitrozamine, mai ales la produsele care se supun coacerii şi prăjirii.

Culturile starter de bacterii lactice folosite ca atare sau sub formă de produse lactate dietetice acide sunt benefice pentru sănătatea oamenilor deoarece: aciditatea lactică favorizează acţiunea pepsinei ce produce hidroliza proteinelor, respectiv coagularea cazeinei laptelui care este în continuare degradată de tripsina pancreatică; aciditatea mediului intestinal blochează dezvoltarea microflorei cu activitate patogenă şi favorizează implantarea bifidobacteriilor cu consecinţe pozitive pentru organismul uman (vezi capitolul probiotice).

În legătură cu bacteriocinele, în continuare se fac următoarele precizări:- bacteriocinele sunt secretate de bacteriile Gram negative; - bacteriocinele sunt proteine şi activitatea lor dispare prin hidroliza lor de către proteaze;- bacteriocinele au acţiune bactericidă, dar nizina este şi bacteriostatic. Multe bacteriocine sunt bacteriostatice la aplicarea lor în produsele alimentare;- bacteriocinele sunt excretate în mediu în cea mai mare parte; o mică parte rămân în celulele bacteriene;- bacteriocinele diferă de antibiotice prin natura speciilor şi suşelor producătoare, modalităţile de producere şi natura lor chimică;- bacteriocinele secretate de bacteriile lactice din culturile starter sau de protecţie au un spectru de acţiune relativ limitat în raport cu mai multe specii sau mai multe suşe ale aceleiaşi specii. - bacteriocinele sunt sensibile la acţiunea enzimelor proteolitice metabolice, ceea ce înseamnă că ingerarea de produse ce conţin bacteriocine nu modifică microbiota tractului intestinal şi nu va conduce la riscuri în ceea ce priveşte folosirea de antibiotice comune;- bacteriocinele sunt stabile la căldură, deci rezistă în laptele pasteurizat la 63C/30s minimum sau la 72C/15 s; rezistenţa lor termică se datorează structurii moleculare simple (excepţie face helveticina J care are o structură proteică mai elaborată);

Page 36: Culturi starter de microorganisme

- bacteriocinele sunt stabile la pH neutru sau acid, ceea ce înseamnă că sunt adaptate la condiţiile de mediu ale bacteriilor producătoare;- eficacitatea bacteriocinelor în produsele fermentate este limitată de condiţiile de conducere a fermentaţiei (temperatură, pH, aw)

Culturi starter utilizate in industria laptelui

La obţinerea culturilor starter trebuie să avem în vedere în mod deosebit

următoarele:

- mediul de cultură (laptele);

- tratamentul termic aplicat laptelui;

- condiţiile de incubare;

- interacţiunile dintre speciile/tulpinile din cultura starter;

- eventualele infectări cu bacteriofagi;

- instabilitatea culturilor starter de bacterii lactice.

De la început, facem precizarea că prin cultură starter înţelegem culturile obţinute din cultura pură stoc (inoculum) prin diferite pasaje. Culturile starter sunt folosite la fabricarea unor produse lactate acide, smântână, unt, brânzeturi.Culturile starter de bacterii lactice utilizate în industria laptelui pot fi clasificate în mezofile şi termofile.

Culturile starter mezofile, care la rândul lor, pot fi clasificate în:a) Culturi starter singulare (single strain starter) care conţin numai Str. lactis subsp. lactis şi respectiv Str. lactis subsp. cremoris (Lactococcus lactis şi Lactococcus cremoris) ambii homofermentaticvi care produc acid lactic (L+) în proporţie de 0,8%. Folosirea acestor culturi starter singulare a apărut ca o necesitate de a se evita formarea “ochiurilor” de fermentare la unele brânzeturi, “ochiuri” formate în urma producerii de CO2 de către bacteriile aromatizante.

Culturile starter singulare mezofile prezintă următoarele avantaje:- se poate utiliza continuu aceeaşi cultură cu activitate relativ constantă şi previzibilă;- nu este necesară alternarea culturilor, eliminându-se riscul deprecierii acestora de către fagi,- se folosesc cantităţi mai mici de inoculum pentru obţinerea de cultură primară şi secundară;- influenţele compoziţionale sezoniere ale laptelui sunt mai reduse;- se creează condiţii de realizare a unei producţii standardizate de produse lactate de calitate superioară;- cultura poate fi controlată şi supravegheată din punct de vedere al caracteristicilor sale (sensibilitate la fagi, producerea de acid lactic, compatibilitatea ei, aglutinarea şi eventual lisogenia).

Culturile starter singulare mezofile prezintă însă următoarele dezavantaje:- pot fi depreciate de tulpinile producătoare de bacteriocine;- pot fi depreciate de fagi, deci sunt predispuse la liză fagică;- pot suferi pierderi de plasmide şi deci pot pierde una sau mai multe din funcţiile lor.

Page 37: Culturi starter de microorganisme

b) Culturi starter multiple mezofile sunt acele culturi care se bazează pe folosirea a 5-6 tulpini selecţionate, neînrudite pe plan fagic şi cultivate separat până la stadiul de cultură primară sau chiar până la stadiul de cultură starter de producţie când se amestecă între ele. În aceste condiţii, tulpinile nu se dezvoltă împreună decât cel mult timp de 10 generaţii, ceea ce face ca nici o tulpină să nu devină dominantă.

Asemenea culturi pot fi folosite mai multe luni în şir fără a-şi pierde capacitatea de acidifiere.c) Culturi starter mezofile mixte Aceste culturi sunt formate, de regulă, din două tipuri de bacterii lactice:- bacterii lactice acidifiante: Str. lactis sau Str. cremoris;- bacterii lactice producătoare de aromă: Str. diacetilactis (Lactococcus lactis var. diacetilactis) sau specii de leuconostoci.

După tipul bacteriilor aromatizante culturile starter mixte mezofile pot fi clasificate în următoarele grupe: culturi starter mixte tip L care conţin numai specii din genul Leuconostoc: Leuconostoc cremoris (citrovorum), Leuconostoc dextranicum şi/sau Leuconostoc lactis care sunt toţi heterofermentativi şi produc acid lactic D(-); culturi starter mixte de tip D care conţin Str. lactis biov. diacetilactis ca singură specie producătoare de aromă; culturi starter mixte tip LD care conţin atât specii de leuconostoci cât şi Str. lactis subsp. diacetilactis ca producători de aromă.

La folosirea culturilor starter mixte trebuie să avem în vedere că:- streptococii acidifianţi mezofili homofermentativi produc acid lactic din lactoză;- leuconostocii, cei heterofermentativi, şi Str. lactis subsp. diacetilactis (homofermentativ) produc diacetil şi acetoină din citrat, dar produc şi acid lactic, acetic prin fermentarea lactozei şi glucozei;

Culturi starter termofileCulturile starter termofile pot fi: acidifiante: Lactobacillus acidophilus; acidifiante/aromatizante care la rândul lor pot fi constituite din unul sau mai multe specii de lactobacili şi dintr-o specie de streptococi. În această direcţie amintim:- cultura starter termofilă pentru iaurt: Lactobacillus bulgaricus şi Str. therrmophilus;- cultura starter termofilă pentru brânzeturi: Lactobacillus bulgaricus + Lactobacillus lactis + Lactobacillus helveticus + Str. thermophilus. Această cultură starter se foloseşte la fabricarea brânzeturilor cu pastă tare şi semitare, deci la care se practică încălzirea a doua a bobului de coagul.

Utilizarea culturilor starter termofile este benefică deoarece: produc acid lactic deci scad pH-ul laptelui şi determină coagularea acestuia (cazul iaurtului); la brânzeturi acidifierea favorizează eliminarea zerului din coagul; au activitate proteolitică şi prin urmare contribuie la ameliorarea proprietăţilor reologice şi la aroma produselor fermentate; ca urmare a activităţii proteolitice rezultă şi aminoacizi din proteine care stimulează dezvoltarea celorlalte bacterii din culturile starter termofile;

Page 38: Culturi starter de microorganisme

produc şi compuşi de aromă, dar în principal aldehidă acetică, acetonă, precum şi urme de acetoină; produc şi substanţe cu caracter filant care influenţează vâscozitatea produsului (Str. thermophilus în cultura pentru iaurt); produc o serie de bacteriocine (Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei etc.); produc H2O2 (Lactobacillus bulgaricus).

Având în vedere cantităţile mari de iaurt ce se fabrică pe plan mondial, este necesar să cunoaştem factorii care influenţează performanţa optimă a culturilor pentru iaurt. Aceşti factori se referă la: temperatura de incubare care este de 41-42C (apropiată de temperatura optimă de dezvoltare a lui Lactobacillus bulgaricus ). După 3 ore de incubare se ajunge la ~ 500 mil bacterii/g, raportul dintre L. bulgaricus şi Str. thermophilus fiind 1/1; tratamentul laptelui – pasteurizarea influenţează pozitiv dezvoltarea lui L. bulgaricus prin:- modificarea structurii proteinelor;- eliminarea parţială a oxigenului şi realizarea unei microaerofilii propice;- distrugerea inhibitorilor din lapte;- formarea de acid formic care favorizează dezvoltarea culturii; disponibilitatea substratului Laptele este un bun substrat dar trebuie arătat că

Lactobacillus bulgaricus are preferinţă faţă de glucoză şi deci ar trebui ca lactoza să fie prehidrolizată la -galactozidaza; metaboliţi produşi în mediu. Lactobacillus bulgaricus produce H2O2 în mediul de cultură şi deci adausul de catalază va stimula producţia de acid lactic de către Str. thermophilus care este mai sensibil la H2O2 decât Lactobacillus bulgaricus. Laptele destinat iaurtului nu trebuie să fie agitat prea mult ca să nu includă aer (oxigen) care ar strica condiţiile de microaerofilie pentru L. bulgaricus şi ar deveni toxic pentru Str. thermophilus. Lactobacillus bulgaricus se apără de acţiunea oxigenului prin intermediul manganului intracelular care înlocuieşte acţiunea superoxiddismutazei; interacţiunile dintre bacterii din cultura pură (inoculum) sau cultura starter. Între cele două microorganisme există un sinergism deosebit. Lactobacillus bulgaricus produce aminoacizi din cazeină care sunt necesari dezvoltării lui Str. thermophilus care, la rândul său, favorizează dezvoltarea lui L. bulgaricus prin producerea de acid formic şi CO2; calitatea laptelui ca substrat de fermentare. Acesta nu trebuie să conţină antibiotice, substanţe conservante, dezinfectante şi să provină de la animale sănătoase cu maximum 400000 leucocite/ml.

Controlul culturilor starter de bacterii lacticeControlul culturilor starter implică următoarele determinări:

examenul microscopic care trebuie să arate raportul dintre coci şi bacili, raport care trebuie să se situeze în limitele 1/1-1,5/1;

Page 39: Culturi starter de microorganisme

activitatea acidifiantă care se urmăreşte prin determinarea acidităţii titrabile atunci când cultura se află în fază logaritmică. În acest fel se pot pune în evidenţă culturile “rapide” şi “lente” (fast and slow); rezistenţa la aciditate, ţinându-se seama că Lactobacillus bulgaricus rezistă până la ~ 1,7% aciditate iar Str. thermophilus până la 0,8%. Rezistenţa la aciditate se urmăreşte prin determinarea supravieţuitorilor după ce în mediul de cultură se atinge o aciditate critică; rezistenţa la răcire care este importantă pentru produsele lactate ce se congelează (iaurt, îngheţata de iaurt). Rezistenţa la răcire se urmăreşte la – 6 - 9C şi apoi la -18C sau -25C ; producerea de substanţe filante care constă în măsurarea vâscozităţii pe o probă inoculată de lapte cu 12% s.u., cu adaos de CaCl2 0,012%, incubată 4 ore/37C până ce se atinge un pH de 4,2-4,3. Se pot depista în acest fel culturile filante; activitatea proteolitică se poate urmări pe o cultură păstrată la 4C la care se determină tirozina sau aminoacizii liberi prin metoda formol titrimetrică; activitatea lipolitică se poate determina prin măsurarea indicelui de aciditate din grăsimea culturii (lapte); proprietăţile senzoriale se determină la culturile de 24-48 ore la 20C (se pot determina şi substanţele de aromă respectiv diacetilul, acetaldehida, acetoina).

CULTURI STARTER CONCENTRATE DE MICROORGANISME

DefiniţieCulturile starter concentrate sunt definite ca acele culturi dezvoltate în condiţii

controlate, concentrate într-un volum mic şi conservate prin congelare sau uscare în vederea depozitării şi transportului.

Culturile concentrate pot fi de bacterii, drojdii, spori de mucegai. În ceea ce priveşte culturile starter concentrate de bacterii cele mai des utilizate sunt culturile de bacterii lactice. Pe lângă acestea se folosesc şi alte culturi de bacterii concentrate: micrococi, pediococi, stafilococi, streptomicii, bacterii propionice etc.

Culturile concentrate de bacterii pot fi utilizate pentru: obţinerea culturilor starter de producţie (maiele de producţie); obţinerea produselor fermentate prin utilizare directă în lapte, compoziţii

carnate etc.Indiferent de domeniul de utilizare, culturile starter concentrate pot fi obţinute prin două procedee:

procedeul de cultivare periodică; procedeul de cultivare continuă.

Tehnologia de obţinere a culturilor starter concentrateTehnologia de obţinere include următoarele operaţii de bază:

inocularea mediului de cultură cu microorganismul din cultura stoc; incubare pentru multiplicare la nivel maxim;

Page 40: Culturi starter de microorganisme

concentrarea mediului împreună cu celulele sau separarea celulelor, de regulă prin centrifugare şi resuspendare într-un lichid adecvat,

conservare prin congelare şi uscare; depozitare în stare congelată şi uscată.

În tehnologia de obţinere a culturilor starter concentrate trebuie ales un mediu de cultură care să asigure toate substanţele pentru dezvoltarea (multiplicarea) culturii, realizându-se un control riguros al temperaturii şi menţinerii pH-ului la valori optime.

Pentru eventuala neutralizare a acidităţii se utilizează hidroxid de amoniu şi/sau hidroxid de calciu.

Conservarea prin congelare a concentratului de microorganisme se face în două moduri:

- sub formă lichidă, în care caz, concentratul de bacterii se suspendă într-un antigel solubil în apă (alcooli polihidrici) care se utilizează în proporţie de 40-50% faţă de concentrat. Congelarea se face la -40C (de fapt se realizează o subrăcire).Acest gen de conservare prezintă următoarele avantaje:

se împiedică acţiunea dăunătoare a gheţii asupra celulelor de bacterii; manipularea concentratului este mai uşoară; concentratul se poate încălzi până la temperatura de utilizare chiar în timpul

manipulării fără ca celulele să-şi piardă viabilitatea şi activitatea;- congelarea în azot lichid (-196C) în care caz concentratul se amestecă cu

un agent crioprotector: 10% glicerol, 7,5% lactoză în cazul bacteriilor lactice.Pentru culturile starter concentrate de pediococi s-a propus ca la concentrat

să se adauge agenţi de stabilizare cum ar fi: glicerolul, lapte praf degresat, extract de malţ, metalglicerofosfaţi alcalini, glutamat monosodic, acid glutamic, cistină şi/sau dextran. Amestecul respectiv se introduce în pungi de plastic care se congelează în azot lichid.

Depozitarea culturilor starter concentrate se poate face:a) la temperaturi de –20…-40C;b) la temperatura de -196C (în azot lichid);

- conservarea prin reducerea conţinutului de apă se face prin liofilizare, în care caz concentratul de bacterii se amestecă cu un suport adecvat (lapte praf degresat, lactoproteine pulbere lactoză, zaharoză) după care se liofilizează. La liofilizare (faza de desicare secundară) temperatura produsului nu trebuie să depăşească 40-45C. După liofilizare se face ambalarea sub vid sau în atmosferă de gaz inert. Depozitarea produselor liofilizate trebuie să se facă la temperaturi scăzute (-18C).

Culturile starter concentrate trebuie să conţină între 2,5·1010 – 5,5·1010 celule viabile-active/ g sau ml.

Utilizarea culturilor starter concentrate de bacterii lactice în industria laptelui

Culturile starter concentrate de bacterii lactice care se folosesc în industria laptelui sunt acelea destinate:

Page 41: Culturi starter de microorganisme

pentru brânza Cheddar, brânzeturi tip italian şi elveţian; pentru brânza de vaci, smântână, lapte bătut, iaurt.

Avantajele şi dezavantajele folosirii culturilor starter de bacterii lactice în industria laptelui sunt arătate în tabelul de mai jos.

Tab. 14. Avantajele şi dezavantajele folosirii culturilor starter de bacterii acterii lactice

Avantaje Dezavantaje

Activitatea culturilor poate fi controlată şi supravegheată înainte de expediere Se elimină operaţiile de întreţinere şi de preparare a maielelor intermediare (primară, secundară, terţiară) Se face economie la forţa de muncă Se pot stabili uşor sistemele de rotaţie în vederea evitării infecţiei cu bacteriofagi Se obţin produse de calitate mai constantă Se scurtează procesele tehnologice ale fabricării produselor prin accelerarea acidifierii, deoarece se suprimă faza de dezvoltare logaritmică în laptele de fabricaţie

Necesită spaţii de depozitare la temperaturi scăzute atât la producător cât şi la cumpărător pentru păstrare până la folosire Concentrarea nu este posibilă la toate culturile starter Depozitarea în stare congelată sau uscată, în funcţie de timp, poate conduce la micşorarea drastică a numărului de celule viabile Culturile pot să fie influenţate negativ în ceea ce priveşte unele plasmide ce codifică anumite funcţiuni

Culturi starter concentrate de bacterii propionice pentru industria laptelui

Mediul de cultură pentru realizarea culturilor starter concentrate de bacterii propionice poate fi laptele degresat cu adaos de 1% tripticază, 1% extract de drojdie ca sursă de vitamine şi factori suplimentari de creştere 1% lactat de sodiu; 0,025% KH2PO4; 0,0005% MnSO4. Mediul de cultură se ajustează la pH = 7,0 şi se sterilizează.

Incubarea mediului de cultură inoculat cu bacterii propionice din cultura stoc se face la 32C/3 zile.

Dacă mediul de cultură conţinând bacterii propionice dezvoltate după incubare se utilizează ca o cultură (maia) de producţie, atunci dezvoltarea bacteriilor propionice se opreşte înainte de coagularea laptelui, deoarece în stare de coagul, cultura starter se repartizează greu în laptele destinat fabricării brânzeturilor.

Celelalte operaţii de obţinere a culturii starter concentrate de bacterii propionice sunt aceleaşi ca cele descrise la celelalte tipuri de culturi starter concentrate.

Depozitarea culturilor starter concentrate de bacterii propionice se face la 5C în care caz celulele îşi păstrează viabilitatea şi activitatea 8 săptămâni. Depozitarea la 25C poate fi făcută pentru cel mult 2 săptămâni.

Page 42: Culturi starter de microorganisme

Culturile starter concentrate se adaugă direct în laptele destinat fabricării brânzeturilor (deci nu se mai folosesc obţinerea de culturi intermediare).

Utilizarea culturilor starter concentrate de bacterii în industria cărniiCulturile starter concentrate de bacterii folosite în industria cărnii pot fi

singulare sau în amestec. Ele pot fi formate din bacterii lactice (L. plantarum, L. sake, L. pentosus, L. alimentarius), pediococi (P. acidilacti, P. pentosaceus), stafilococi (S. carnosus, S. xilosus), micrococi (M. varians), streptomicii (Streptomyces griseus).

În literatura de specialitate sunt menţionate următoarele culturi starter concentrate de bacterii singulare sau în amestec:

S. carnosus S. carnosus + P. pentosaceus; S. xylosus + P. pentosaceus; M. varians; M. varians + P. pentosaceus + P. acidilacti; M. varians + P. pentosaceus; S. carnosus + Streptomyces griseus.

Culturile starter de micrococi sau stafilococi sunt recomandate la maturarea lentă a salamurilor crude unde se realizează o scădere lentă a pH-ului şi deci consistenţa produsului se realizează în timp. Gustul acestor produse este puţin acrişor (pH 5,6-6,1).

Culturile starter mixte (micrococi/stafilococi/lactobacili) se utilizează la maturarea rapidă a salamurilor crude în care caz realizarea consistenţei merge paralel cu acidifierea.

Culturile starter concentrate de utilizare în industria cărnii pot fi livrate în stare lichidă subrăcită sau uscată. Adaosul în compoziţie trebuie să asigure o concentraţie de cel puţin 106-107/g pastă. Modul de folosire al culturilor starter concentrate este în funcţie de modul lor de conservare. Cele congelate în antigel se utilizează ca atare; cele liofilizate se suspend în apă pentru o distribuţie mai uniformă în compoziţie.

Culturile starter concentrate de bacterii lactice pentru industria cărnii nu se amestecă cu sare, condimente, acid ascorbic, acizi alimentari şi nici nu se păstrează în amestec cu substanţele menţionate deoarece se inactivează rapid.

De asemenea trebuie să se aibă în vedere două situaţii particulare: Folosirea culturilor starter concentrate în pasta cu adaos de GDL (glucono delta lactona). În condiţiile folosirii GDL pH-ul pastei scade rapid, proteinele sunt aduse la pH izolelectric şi pierd apa de hidratare, azotitul de reduce bine la NO, se favorizează dezvoltarea bacteriilor lactice care produc şi H2O2. Acidifierea rapidă împiedică însă dezvoltarea micrococilor care sunt necesari dacă se lucrează cu NaNO3. La folosirea GDL este deci recomandat să se folosească culturi starter concentrate de stafilococi care produc catalază, reduc azotatul la azotit şi se pot dezvolta la pH 4,7 fiind şi un bun producător de aromă; Folosirea culturilor starter în pasta cu adaos de uleiuri eterice. Aceste uleiuri eterice au acţiune bacteriostatică, mai ales dacă solventul lor este şi alcoolul etilic şi,

Page 43: Culturi starter de microorganisme

deci, inhibă culturile starter. În acest caz se recomandă să se folosească o cantitate mult mai mare de cultură starter, pe de altă parte uleiurile eterice să fie încapsulate.

Culturile starter concentrate folosite în industria cărnii trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:- să fie tolerante la NaCl (concentraţie 2,5-3%);- să se dezvolte bine în saramura de concentraţie 6%;- să se dezvolte bine în prezenţă de 80-100 mg NaNO2/kg compoziţie dar să acţioneze şi la temperatură mai scăzută (14-24C);- să producă numai acid lactic (culturile starter concentrate de bacterii lactice să cuprindă numai specii homofermentative);- să fie puţin lipolitice şi proteolitice;- să nu producă mirosuri şi gusturi nedorite din cauza produşilor secundari de metabolism;- să fie nepatogene (să nu producă infecţii şi să nu producă toxine);- să se adapteze compoziţiei de carne utilizată şi condiţiilor de fermentare a produselor, respectiv la creşterea concentraţiei de NaCl, la temperatura de afumare rece şi de uscare, de activitate a apei care scade progresiv pe măsura uscării produsului;- să producă catalază şi nitratreductază (cele cu micrococi, streptomicii, stafilococi);- să fie inactivate la 57-60C.

Folosirea culturilor starter concentrate de bacterii (în special lactice şi pediococi) prezintă următoarele avantaje:- se micşorează durata de maturare a produselor carnate;- se îmbunătăţesc proprietăţile senzoriale (gust, miros, consistenţă);- se asigură un grad înalt de inocuitate produsului carnat (salamurile şi cârnaţi cruzi) prin controlul dezvoltării microorganismelor patogene şi de alterare şi prin limitarea folosirii unor substanţe cu caracter toxic (amine şi nitrozamine).

Lactobacilii din culturile starter concentrate produc în compoziţia salamurilor crude următoarele efecte: acidifierea pastei cu următoarele consecinţe:- scăderea pH-ului şi deci aducerea proteinelor la punctul izoelectric deci şi la starea de hidratare minimă, favorizându-se în acest fel uscarea;- reducerea mai rapidă şi mai completă a NaNO2;- inhibarea microorganismelor patogene: Staphilococcus aureus, Salmonella, Cl. botulinum; producerea de substanţe de aromă; controlul producţiei de amine biogene prin inhibarea bacteriilor cu activitate decarboxilazică (inhibare prin competiţie faţă de nutrienţi şi, respectiv, prin acidifiere); controlul producţiei de nitrozamine (aciditate formată, respectiv pH-ul scăzut favorizează transformarea NaNO2 în NO şi deci rămâne în produs o cantitate mai

Page 44: Culturi starter de microorganisme

mică de NaNO2 care ar putea intra în combinaţie cu aminele secundare pentru a forma nitrozaminele; controlul microflorei de alterare şi patogene prin producţia de H2O2, bacteriocine.

Pediococii din culturile starter concentrate produc în compoziţia salamurilor crude următoarele efecte: acidifierea mai redusă a pastei la temperaturi mai ridicate fără formarea de produşi care să afecteze negativ gustul şi mirosul; producerea de H2O2, bacteriocine cu acţiune inhibitoare faţă de microorganismele patogene.

Culturi starter concentrate de spori de mucegaiTehnologia de obţinere include următoarele operaţii:

prepararea mediului de cultură, sterilizarea acestuia şi repartizarea în eprubete (agar înclinat); însămânţarea mediului în eprubete cu spori de mucegai ce se doreşte a se cultiva; termostatare pentru germinare spori cu organe purtătoare de spori şi sporulare; preluare spori cu 2 ml ser fiziologic 0,8% şi însămânţare medii de cultură Czapek cu 2% agar aflate în vase Roux; recoltare spori din vase Roux cu ser fiziologic 0,8% astfel ca să se asigure în suspensie 108-1010 spori/ml; păstrare suspensie la 0-4C.

Cultura cu spori de mucegai concentrată poate fi livrată şi sub formă de emulsie liofilizată, emulgatorul fiind polietilsorbitanul .

Se pot realiza culturi starter concentrate de spori cu mucegaiurile utilizate în industria laptelui şi cărnii, utilizarea lor fiind în funcţie de produsul alimentar în care se foloseşte cultura respectivă de spori de mucegai.

Pentru industria cărnii, la utilizare suspensia de spori de mucegai concentrată se diluează cu apă fiartă şi răcită în raport de 1/3.


Recommended