Studiul Coloanelor Cromatografice si Alegerea Lor

-PROIECT-

-2010-

CUPRINS:1. Scurt istoric

2. Principiul separrii cromatografice

3. Clasificarea metodelor cromatografice

4. Schema de principiu a cromatografului5. Factorii care influieneaz separarea n cromatografia de lichide

6. Eficiena de separare a coloanei cromatografice

7. Tehnica cromatografiei lichid-solid pe coloan

8. Tehnica cromatografiei HPLC

9. Coloanele cromatografice utilizate in HPLC

10. Tehnica cromatografiei de gaze

11. Coloanele cromatografice utilizate n cromatografia de gaze

12. Diametrul coloanelor de absorie si desorbie13. Coloane cu talere

13.1. Diametrul coloanelor cu talere cu clopoei

13.2. Diametrul coloanelor cu talere perforate

13.3. Diametrul coloanelor cu talere cu supape

13.4. Diametrul coloanelor cu talere cu umplutur

14. Dimensionarea demistoarelor

15. Coloane cu umplutur i materiale de umplere

15.1. Alegerea tipului de coloan cu umplutur sau cu talere

15.1.1. Caracteristicile sistemului

15.1.2. Factorii hidrodinamici

15.1.3. Caracteristici constructive

15.2. Materiale de umplutur

15.2.1. Condiile unei umpluturi

15.2.2. Tipuri de umplutur

15.3.Caracteristicile corpurilor de umplere

15.4. Alegerea tipului de umplutur

16. Aparatur modern

17. Concluzii

18. Bibliografie

Noiuni generale Cromatografia este o metod de separare i analiz a substanelor chimice din amestecuri, care se bazeaz pe interaciunea difereniat a doi sau mai muli compui de separat (numii solui) cu dou faze cromatografice: faza mobil i faza staionar.Izolarea substanelor chimice din amestecuri i identificarea componentelor a reprezentat ntotdeauna una dintre obiectivele prioritare ale chimiei. La ora actual nu numai n chimia analitic ci i n tehnologia chimic se manifest o cerere din ce in ce mai mare de compui cu puritate foarte avansat. Separarea amestecurilor n componente este o operaie esenial care permite obinerea acestora ntr-o stare ct mai pur. Aceast separare se poate face la scar analitic, dac ne intereseaz s cunoatem numai compoziia amestecului sau la scar preparativ, dac vrem s obinem fizic componentele separate.

n prezent exist un mare numr de metode de separare care i-au gsit aplicaii n chimie. Fiecare dintre aceste metode poate cuprinde mai multe tehnici de separare. Cele mai importante dintre metode de separare sunt cele bazate pe echilibrul ntre faze, care valorific diferena dintre proprietile de distribuie ale componentelor unui amestec ntre dou faze nemiscibile aflate n contact. Asemenea metode sunt distilarea, cristalizarea, precipitarea, sublimarea, extracia. Aceste metode, cunoscute i aplicate de mult vreme, s-au dovedit a fi insuficiente atunci cnd s-a pus problema separrii unor amestecuri foarte complexe i a fost nevoie de dezvoltarea unor noi metode, printre care s-au impus mai ales cele cromatografice.

Principalele avanteje pe care le prezint cromatografia ca metod de separare sunt:- permite separarea, identificarea i dozarea cantitativ simultan a componentelor unui amestec.- se poate aplica unui numr foarte mare de produse, practic orice compus organic putnd fi separat printr-o metod cromatografic- sensibilitatea metodelor cromatografice este extrem de ridicat, ceea ce nseamn c necesit doar cantitate foarte mic de prob. n acelai timp ns se pot aplica i la scar preparativ.- durata analizei este redus, comparativ cu alte metode de analiz ale amestecurilor complexe. 1. SCURT ISTORICCromatografia a fost iniiat n 1901 de botanistul rus Tswet, care a separat nite pigmeni vegetali pe o coloan umplut cu carbonat de calciu, folosind ca eluent eterul de petrol. Denumirea de cromatografie pe care a dat-o acestei metode provine de la faptul c iniial a folosit-o pentru separarea unor colorani (chromos = culoare, graphos = scriere n limba greac).

Urmtorul pas important n dezvoltarea cromatografiei a fost fcut n 1941, cnd A. Martin i R. Synge au iniiat cromatografia lichid de repartiie pe coloan, pentru care au primit ulterior Premiul Nobel pentru chimie n 1952. Ei au separat aminoacizi acilai pe o coloan ce coninea silicagel saturat cu ap, iar drept faz mobil au utilizat n-butanol saturat cu ap. n 1944, au fost puse bazele cromatografiei pe hrtie, prima form de cromatografie planar, iar cromatografia de schimb ionic este utilizat ncepnd din 1947. nceputurile cromatografiei de gaze se leag tot de numele lui Archer J.P. Martin, care mpreun cu A.T. James a separat acizi organici volatili pe o coloan de sticl umplut cu Celite acoperit cu ulei siliconic, utiliznd ca faz mobil azotul.

Cromatografia pe coloane cu gel a fost iniiat n 1959 de Porath i Flodin, iar cea de bioafinitate se utilizeaz din 1967. Cromatografia de lichide modern pe coloan, numit de nalt performan sau de nalt presiune (HPLC) poate fi datat la nceputul anilor 1960 i se bazeaz pe lucrrile lui Csaba Horvth, efectuate la Univesitatea Yale.

Cromatografia reprezint o metoda revolutonar, foarte sensibil, de analiz a substanelor chimice. Principiul cromatografiei a fost descoperit de savantii englezi A.J.P. Martin ( n. 1910) i R.L. Synge ( n. 1914), cercetatori, primul, fizician-chimist la Institutul national de Cercetari Medicale din Londra, i al doilea, biochimist la Institutul de Cercetari Rowett din acelasi oras. Principiul acestei metode este simplu: amestecurile de substane complexe, antrenate de lichide convenabil alese, se separ n componentele respective, n cursul deplasarii lichidului ce poart substanele printr-un mediu absorbant, ca de pilda o coloan de pulbere absorbant ( metoda denumit n acest caz cromatografie pe coloan) sau o foaie de hartie de filtru ( metoda ce poart denumirea de cromatografie pe hartie). Pentru " descoperirea si perfecionarea analizei cromatografice de repartiie pe hartie, n analizaorganic".

Se pare ca procedeul cromatografic a fost reinventat de mai multe ori in cursul istoriei stiintei. Astfel, in 1850, chimistul german F.F. Runge ( 1796-1867) a analizat amestecuri de colorani cu ajutorul unei fii de sugativ, a crei extremitate era nmuiat n lichidul ce urma sa fie studiat. Runge a mai propus o metod de separare a corpurilor dizolvate n acelai lichid, cu ajutorul unui praf de lemn introdus in soluie. Civa ani mai trziu, chimistul Schoenbein folosete aceeai metod cromatografic, pentru separarea unor sruri metalice aflate n soluii.

Istoria consemneaz faptul ca biologul rus Mihail S. Tvet (1872-1920) redescoper metoda cromatografic in 1901, cnd efectueaz cu succes prima analiza a clorofilei, folosind un extract din frunze verzi, macerate in eter de petrol, trecute printr-o coloan de carbonat de calciu fin pulverizat. Memoriul lui Tvet a fost publica ntr-o revist botanic obscur din Rusia i, de aceea a rmas necunoscut. De aceea s-a ajuns c principiul metodei cromatografice s fie redescoperit abia n anul 1931. In acel an, chimitii germani Kuhn, Winterstein i Lederer au reusit s separe, prin analiza cromatografic pe coloana de material poros, componentele anumitor varietai de pigmenti cu proprietai foarte asemntoare, numite carotenoide. Reuita analizei celor trei savani a dovedit c prin cromatografie se pot separa i se pot obine n stare pur produi cu proprieti foarte apropiate, care sunt, n acelai timp, greu de separat prin alte mijloace.

Rezultatele obinute prin noua metod sunt att de precise si de surprinzatoare, ncat cromatografia poate fi considerat ca fiind cea mai mare descoperire n domeniul analizei chimice facut n secolul al XX-lea.

Aplicaiile cromatografiei sunt diverse i foarte importante: studierea elementelor de pmanturi rare n stare pur, observarea separarii acizilor aminai in biologie etc. De asemenea, prin cromatografie s-a putut verifica structura insulinei, s-a identificat un nou hormon al tiroidei etc...

Dei nu au fost explicate n mod satisafactor toate fenomele legate de procedeul cromatografic de separare, s-a trecut deja la construirea de aparate sofisticate, care poart denumirea de cromatografe. Aceste aparate, a caror realizare nu poate fi atribuit unui singur inventator, se perfecioneaz n mod continuu. Se poate spune c cromatografia i cromatograful reprezint cu adevarat o oper colectiv a multor savani si ingineri, care i-au adus contribuia, de-al lungul timpului, reusind s transforme o observatie simpl, la ndemana fiecrui elev de liceu, intr-o tehnic de mare precizie i de o deosebit sensibilitate.

Astazi au aparut tehnici i aparate noi, asa cum este cazul radiocromatografiei (procedeu n care sunt folosii izotopii radioactivi) i al electrocormatografiei (procedeu n care se foloseste un cmp electric aplicat soluiei cromatografiate), care au revoluionat chimia cantitativ.2. PRINCIPIUL SEPARRII CROMATOGRAFICE

Principiul de baz al separrii cromatografice const n distribuia inegal a componentelor unui amestec ntre faza mobil i faza staionar. Acest amestec strbate sistemul cromatografic, fiind antrenat de ctre faza mobil. Distribuia inegal este determinat fie de afinitatea diferit a componentelor amestecului fa de cele dou faze, fie de capacitatea diferit de a difuza n acestea. Acest principiu este ilustrat n Figura 1, pe un exemplu din cromatografia de gaze pe coloane capilare. Aceste coloane se caracterizeaz prin faptul c faza staionar se gsete depus n strat foarte subire pe pereii coloanei.

Fig.1.- Principiul separrii cromatografice.Moleculele celor doi compui, 1 i 2 care se gsesc n momentul iniial ametecate, ntr-un volum restrns, vor avea tendina de a se transfera continuu din faza mobil n faza staionar i invers, din cauza agitaiei termice. Deoarece moleculele compusului 2 au o afinitate mai mare fa de faza staionar, ele vor fi mai puternic reinute n aceast faz. Drept urmare, dup un anumit interval de timp se va nregistra o rmnere n urm a acestei componente, comparativ cu componenta mai slab reinut 1. Trebuie remarcat faptul c aceast separare are loc n timpul deplasrii n coloan, deci este in proces dinamic.

3. CLASIFICAREA METODELOR CROMATOGRAFICE

Exist o serie de criterii pe baza crora se poate face o clasificare a metodelor cromatografice: mecanismul separrii, natura fazelor cromatografice, configuraia sistemului cromatografic, etc.

1. Clasificarea n funcie de mecanismul separrii1.1. Cromatografie de adsorbie

1.2. Cromatografie de repartiie

1.3. Cromatografie cu faze chimic legate

1.4. Cromatografie de schimb ionic

1.5. Cromatografie de excluziune

1.6. Cromatografie de afinitate

n funcie de mecanismul separrii, metodele cromatografice se clasific n:

- Cromatografie de adsorbie, n care fenomenul principal care st la baza separrri este adsorbia, iar afinitatea componentelor pentru cele dou faze este n funcie de coeficienii lor de adsorbie.

- Cromatografie de repartiie, n care fenomenul care determin separarea este extracia i separarea componentelor se face n funcie de diferena dintre coeficienii lor de repartiie ntre cele dou faze.

- Cromatografie cu faze chimic legate, care este intermediar ntre cromatografia de adsorbie i cea de repartiie, fiind o combinare a acestora.

- Cromatografia de schimb ionic, care are la baz interaciunile electrostatice i difuzia, iar separarea componentelor se face n funcie de sarcinile lor electrice, constantele de disociere i diametrul efectiv al ionilor.

- Cromatografia de excluziune (numit i cromatografie pe gel), n care fenomenul principal este difuzia, iar separarea se face n funcie de mrimile efective ale moleculelor componentelor.- Cromatografia de bioafinitate, n care separarea are loc datorit unor interaciuni biochimice specifice cu aa-numitele grupri de afinitate.Trebuie menionat c n afar n practica cromatografic se ntlnesc i variante intermediare sau mixte ntre aceste tipuri principale i c exist i alte tipuri de cromatografie, care sunt ns mai puin uzuale.2. Clasificarea n funcie de natura fazelor cromatografice2.1. Cromatografie de gaze2.1.1. Gaz-lichid (GLC)2.1.2. Gaz-solid (GSC)2.2. Cromatografie de lichide2.2.1. Lichid-lichid (LLC)2.2.2. Lichid-solid (LSC)2.3. Cromatografie cu fluide supercritice (SFC)n funcie de starea de agregare a fazei mobile, avem trei tipuri de cromatografie: gazoas, lichid i cu fluide supercritice. Fiecare dintre acestea se submparte n funcie de natura fazei staionare, care poate fi solid sau lichid. n cazul cromatografiei cu fluide supercritice n denumire nu se face referire la natura fazei staionare. Mai trebuie precizat c n cazul n care faza staionar este lichid, ea trebuie fixat pe un suport solid corespunztor, n general un material poros.

3. Clasificarea n funcie de configuraia sistemului cromatografic3.1. Cromatografie pe coloan3.1.1. Cromatografie pe coloane clasice (cu umplutur)3.1.2. Cromatografie pe coloane capilare3.2. Cromatografie planar3.1. Cromatografie n strat subire3.2. Cromatografie pe hrtien funcie de configuraia sistemului cromatografic, avem cromatografie pe coloan i cromatografie planar. Cromatografia pe coloan cuprinde cromatografia pe coloane clasice (cu umplutur) i cromatografia pe coloane capilare (numite i coloane tubulare deschise). Cromatografia planar cuprinde la rndul ei cromatografia pe hrtie i cromatografia n strat subire.4. SCHEMA DE PRINCIPIU A CROMATOGRAFULUI Este prezentat n Figura 2. Faza mobil care se gsete ntr-un rezervor de faz mobil 1 trece printr-un dispozitiv de msurare i reglare a debitului 2, apoi ajunge n dispozitivul pentru introducerea probei 3. Aici are loc preluarea probei de ctre faza mobil, proba fiind n continuare transportat prin coloana cromatografic 4, unde are loc separarea componentelor. Coloana 4 se gsete n mod uzual ntr-o incint termostatat (cuptor n cazul cromatografiei de gaze) pentru ca analiza s se desfoare la o temperatur stabilit. Componentele separate ajung n detectorul 5, unde fiecare component este pus n eviden sub forma unui semnal distinct. Aceste semnale sunt nregistrate de un nregistrator 6 sau reprezint semnalul de intrare al unui sistem de achiziii de date (integrator sau calculator) care permite prelucrarea i stocarea rezultatelor.

1 - rezervor faz mobil2 - dispozitiv de reglare i msurare a debitului3 - dispozitiv de introducere a probei4 - coloan cromatografic5 - detector6 - nregistrator sau integrator

Fig. 2.- Schema de principiu a cromatografuluiDiagrama care reprezint rezultatul analizei cromatografice se numete cromatogram. Ea este nregistrat n general ca o funcie a intensitii semnalului detectorului n raport cu timpul. Semnalul corespunztor fiecrei componente care apare n cromatogram se numete pic cromatografic, iar aria picului este proporional cu concentraia componentei respective. n cazul cromatografiei planare, cromatograma este chiar placa sau hrtia pe care a avut loc analiza, iar componentele sunt evideniate sub forma unor spoturi. Un exemplu de cromatogram este dat n Fig. 3.

Fig. 3. - Analiza cromatografic a unui amestec de hidrocarburi. Fiecare pic cromatografic reprezint cte o component separat.

Termenul de cromatografie de lichide este utilizat pentru a denumi o gam extins de sisteme cromatografice care au n comun faptul c utilizeaz o faz mobil lichid.

Comparativ cu cromatografia de gaze, cea de lichide are avantajul c permite i analizarea probelor greu volatile sau instabile termic, iar faptul c i faza mobil particip la separare ofer posibiliti suplimentare pentru realizarea unor separri eficiente.

Cromatografia de lichide clasic a fost caracterizat de utilizarea unor coloane cu diametre mari, umplute cu particule de faz staionar de o granulaie fin i prin care faza mobil trecea sub influena forei gravitaionale. Aceste sisteme, care se mai folosesc azi n separrile cromatografice lichid-solid, au permis realizarea separrii unor amestecuri complexe de substane n condiii foarte bune, ns viteza de separare este mic iar analiza suplimentar a compuilor separai prin metode spectroscopice este mai dificil. Apariia cromatografiei de lichide de nalt performan (HPLC) a permis eliminarea acestor deficiene i chiar impunerea cromatografiei de lichide ca o metod mai performant de analiz dect cromatografia de gaze.

Principalele avantaje ale cromatografiei de lichide de nalt performan sunt:

- Capacitate de separare ridicat

- Viteza ridicat a separrii

- Posibilitatea monitorizrii continue a efluentului coloanei

- Realizarea unor analize repetate i reproductibile utiliznd aceeai coloan

- Automatizarea procedurii analitice i a prelucrrii datelor.

Primul cromatograf de lichide modern a fost construit de Csaba Horvth la Universitatea din Yale n 1964 i a tehnica fost denumit cromatografie de lichide de nalt presiune (HPLC). n continuare, termenul care s-a impus a fost cel de cromatografie de lichide de nalt performan. Prima separare realizat de grupul lui Horvth a fost cea a unor componente ale acizilor nucleici. Dezvoltarea extraordinar a acestei tehnici n ultimii zeci de ani se datorete n mare msur faptului c a permis analiza unor compui care puteau fi separai foarte greu pe alte ci, de exemplu a biomoleculelor.

Principalele tipuri de cromatografie de lichide sunt:

- cromatografia de adsorbie lichid-solid (LSC)

- cromatografia de repartiie lichid-lichid (LLC)

- cromatografia ionic (IC)

- cromatografia prin excluziune (SEC)

5. FACTORII CARE INFLUIENTEAZ SEPARAREA N CROMATOGRAFIA DE LICHIDE

Pentru a putea utiliza cromatografia de lichide ca metod de analiz n condiii satisfctoare, nu este necesar cunoaterea n amnunt a teorei cromatografiei de lichide, dar este indispensabil stpnirea noiunilor de baz, mai ales pentru a se putea face selecia fazelor cromatografice ntr-o manier corect.

n ciuda complexitii aparente a instrumentului, partea esential a analizei cromatografice este procesul de separare care are loc n coloan, restul aparaturii avnd doar rolul auxiliar de a asigura depozitarea fazei mobile, asigurarea compoziiei sale stabilite i a presiunii de intrare n coloan, introducerea probei, detectarea componentelor separate i procesarea datelor. Ca urmare a modului n care este conceput designul aparatelor moderne, aceast esen se pierde ns de multe ori n spatele complexitii electronice sau inginereti a ntregului sistem. Rezultatul este c rolul important al funciunii coloanei este neles doar superficial i tehnica cromatografic nu este utilizat ntr-o manier adecvat.

n timpul separrii cromatografice n coloan au loc dou procese care se produc simultan, continuu i aparent independent una de altu. Prima este deplasarea fiecrui solut printr-o succesiune de echilibre de distribuie ntre faza mobil i cea staionar, n conformitate cu coeficientul su de distribuie. Al doilea proces este specific coloanei, care trebuie s limiteze dispersia natural a soluilor astfel nct la ieirea din coloan fiecare solut s se regseasc sub forma unei benzi de eluie ct mai nguste i distincte de celelalte. Primul proces, cel al reteniei componentelor, este de natur termodinamic i poate fi controlat prin alegerea corespunztoare a naturii fazelor cromatografice. Cel de-al doilea proces este, n esen, de natur cinetic i depinde de proprietile fizice ale componentelor sistemului de separare cromatografic: faza staionar i faza mobil. Pentru a putea realiza o separare optim, pentru fiecare prob va trebui gsit perechea de faze cea mai potrivit i selectat coloana corespunztoare.

6. EFICIENA DE SEPARAREA A COLOANEI CROMATOGRAFICEn timpul deplasrii prin coloana cromatografic nu este suficient ca benzile de eluie ale celor dou soluii s migreze difereniat, ci este necesar ca ele s fie destul de nguste pentru ca s se separe ct mai complet una de alta. Parametrul de eficien care ne arat posibilitatea separrii a doi compui pe baza selectivitii termodinamice este coeficientul de separare , definit pe baza raportului factorilor de capacitate a celor dou soluii.

Se observ c coeficientul de separare coreleaz interaciunile din faza staionar i cele din faza mobil.

Aadar n cromatografia de lichide, coeficientul de separare poate fi optimizat prin dou modaliti:

- alegerea corespunztoare a fazei staionare;

- alegerea corespunztoare a fazei mobile.

Toi factorii care modific interaciunile moleculare sau intensitatea acestora, att n faza mobil ct i n sau faza staionar vor determina n acelai timp i modificarea selectivitii.

n cromatografia de lichide, faza staionar (indiferent c este polar sau nepolar) va adsorbi ntotdeauna n mod preferenial o anumit component a eluentului, iar grosimea stratului de adsorbie (df1) depinde de natura fazei staionare i a solventului adsorbit (Figura 4). Cu ct ne ndeprtm de suprafa, cu att scade tria legturii acestei adsorbii i este discutabil unde trebuie plasat delimitarea dintre faza mobil adsorbit i cea neadsorbit. Dac se modific compoziia fazei mobile acest lucru determin automat i schimbarea compoziiei stratului de faz mobil adsorbit la suprafaa fazei staionare, iar drept consecin modificarea interciunilor dintre solut i cele dou faze.

Valoarea calculat a coeficientului de separare depinde de timpul mort al coloanei respective n condiiile de lucru. Determinarea acestui timp mort nu este ns aa de simpl ca n cromatografia de gaze, deoarece ntr-o coloan cromatografic de gaze volumul mort poate fi net delimitat, n timp ce ntr-una de lichide aceast delimitare depinde de grosimea filmului de faz mobil adsorbit la suprafaa fazei staionare.

O alt problem n cromatografia de lichide este c majoritatea adsorbenilor (fazelor staionare) utilizai fiind poroi, ntr-o parte a porilor faza mobil va stagna i aici compoziia fazei mobile poate fi diferit de cea din zonele unde ea se gsete n micare.

Fig. 4. - Formarea stratului de faz mobil adsorbit pe suprafaa fazei staionare

Pentru a avea valori reproductibile ale timpului mort (tM=L/v), acesta ar trebui determinat folosind un compus care nu interacioneaz cu faza mobil adsorbit. n realitate un asemenea compus nu exist, de aceea ntotdeauna trebuie precizat cu ce substan s-a fcut determinarea timpului sau volumului mort. Aceast relativitate n determinarea timpului mort are influen i asupra valorilor parametrilor de retenie, mai ales a factorului de capacitate.

Cromatografia de lichide este capabil de rezolvarea unor probleme de separare foarte complexe n bun parte datorit faptului c prin modificarea sistematic a compoziiei eluentului se pot obine valori ale coeficientului de separare ntr-un interval destul de larg.

Realizarea unui coeficient de separare diferit de 1 este o condiie necesar, nu ns i suficient pentru o separare corespunztoare, deoarece la aceeai valoare a acestui coeficient putem avea o separare foarte bun, dar i total nesatisfctoare a componetelor respective (Figura 5).

Fig 5. - Influena abaterii standard asupra separrii cromatografice

Pentru separarea s fie corespunztoare, trebuie ca selectivitatea termodinamic s fie asociat cu o eficien cinetic corespunztoare, adic cu o vitez mare de transfer a moleculelor de solut din faza mobil n faza staionar i invers. Msura acestei eficiene cinetice este limea picului, respectiv abatarea standard . Aceast abatere standard se poate msura pe baza curbei Gauss care caracterizeaz picul respectiv. Dispersia picului, respectiv creterea abaterii standard depinde ns nu numai de eficiena cinetic a coloanei ci i de distana parcurs de solutie n coloan, adic de lungimea coloanei.

Pentru a se putea face o comparaie ntre diferite coloane, trebuie utilizat o valoare relativ a dispersiei solutului (i implicit a lrgirii picului), ceea ce se face cu ajutorul unui parametru de numit numr de talere teoretice N. Valoarea acestuia se calculeaz cu relaia:

unde t i L reprezint abaterea standard exprimat n uniti de timp, respectiv n uniti de lungime. Numrul de talere teoretice depinde ns i el de lungimea coloanei, de aceea pentru eliminarea acestor diferene se utilizeaz lungimea de coloan echivalent unui taler teoretic. Acesta poart numele de nlimea echivalent a talerului teoretic (H) i se calculeaz prin raportarea lungimii coloanei la numrul de talere teoretice. Cu ct aceast nlime este mai mic, eficiena cinetic de separare a coloanei va fi mai mare.

Parametrii N i H (ca i cei efectivi Nef i Hef, care se refer la dispersia picului n faza staionar) se pot utiliza pentru a compara eficiena de separare a diferitelor coloane. Ele sunt deduse pe baza teoriei talerelor n cromatografie, ns nu ne dau nici un fel de informaii despre fenomenele care se produc n coloan i parametrii care infueneaz aceste fenomene. Pentru a explica aceste fenomene, n special rolul proceselor difuzionale n cromatografie, a fost elaborat o alt teorie, teoria cinetic.

Teoria cinetic explic dispersia picurilor cromatografice n timpul deplasrii prin coloan, considerndu-le drept rezultatul a trei procese:

- difuzia turbulent

- difuzia molecular

- rezistena la transferul de mas

Corelarea acestor procese este dat de ecuaia lui Van Deemter, care a fost dedus pentru cromatografia de gaze, nainte ca cromatografia de lichide s fi fost rspndit pe scar larg. Aceast ecuaie ne d corespondena dintre nlimea echivalent a talerului teoretic i viteza fazei mobile i poate fi scris n form restrns astfel:

Cei trei termeni ai ecuaiei reprezint contribuia la nlimea echivalent a talerului i implicit la lrgirea picului cromatografic a celor trei factori menionai: difuzia turbulent, difuzia molecular i rezistena la transferul de mas. Aceast relaie este valabil n principiu pentru toate sistemele cromatografice. n cromatografia de lichide, rolul principal n dispersia zonei i revine rezistenei la transferul de mas i termenul de rezisten la transferul de mas conine dou asemenea rezistene, una in faza mobil i una n faza staionar.

Aadar fa de cromatografia de gaze apare n plus termenul de rezisten la transferul de mas n faza mobil, care are un rol foarte important n dispersia zonei cromatografice. Ecuaia Van Deemter pentru cromatografia de lichide se scrie n form general astfel:

unde CS i CM repezint coeficientul de rezisten la transferul de mas n faza staionar, respectiv n faza mobil.

La deplasarea fazei mobile n coloan avem mai multe cauze care determin diferene n ce privete rezistena la transferul de mas din faza mobil pe faza staionar i invers. Majoritatea fazei mobile este n micare, ns exist zone stagnante care se gsesc fie adsorbite pe suprafaa granulelor de faz staionar fie n interiorul porilor (Figura 6).

Fig. 6. - Rezistena la transferul de mas n umpluturi poroase

Solutul ajunge la suprafaa fazei staionare trecnd prin filmul de faz mobil care stagneaz. Relaia matematic ce red componenta de rezisten la transferul de mas pentru acest proces de difuzie n interiorul particulei este complicat, esenial fiind ns faptul c conine termenul dp2.

sau mai simplu:

unde este o constant care depinde de structura poroas a particulei, k0 este raportul dintre volumul interior al particulei i volumul liber dintre particule, e este viteza de curgere a fazei mobile n spaiul dintre particule, iar Dm este coeficientul de difuziune n faza mobil.

Aadar rezistena la transferul de mas i deci contribuia la lrgirea zonei este proporional cu ptratul diametrului particulei. Pentru a avea eficien cinetic ridicat n procesele cromatografice de lichide, este neaprat necesar folosirea unor umpluturi cu diametre mici de particule. n acelai timp, aceast component difuzional este invers proporional cu coeficientul de difuziune n faza mobil, ceea ce nseamn c va fi avantajoas folosirea unor solveni cu vscozitate ct mai mic.

Influena diametrului particulei asupra nlimii echivalente a talerului teoretic se poate observa i din Figura 7, care red graficul ecuaiei Van Deemter pentru diferite dimensiuni de particule. Cu ct dp este mai mic i n consecin H mai mic, cu att eficiena de separarea a coloanei va fi mai ridicat i ansele de a separa compui avnd proprieti fizico-chimice asemntoare vor fi mai mari.

Fig 7. - Influena diametrului particulelor asupra ecuaiei Van Deemter

Diferena de eficien dintre coloanele cu diametre diferite ale particulelor este important atunci cnd valoarea lui H este determinat n cea mai mare parte de termenii A i C, adic la viteze mari ale fazei mobile. Aadar din punct de vedere analitic ar fi indicat folosirea unei umpluturi cu diametru mic la viteze mari ale fazei mobile, cnd influena teremului Cv este determinant, ns posibilitatea modificrii acestora este limitat din cauza pierderilor de presiune pe coloana cromatografic.

Pierderea de presiune pe coloan este dat de urmtoarea relaie:

unde reprezint rezistena coloanei la curgere, iar este vscozitatea eluentului. Aadar pierderea de presiune este direct proporional cu lungimea coloanei, vscozitatea eluentului i viteza fazei mobile i invers proporional cu ptratul diametrului particulelor de umplutur.

Dac se utilizeaz coloane de lungimi mici, pierderea de presiune poate fi redus, ns i reducerea lungimii coloanei se poate face doar pn la o anumit limit (ea influeneaz nefavorabil eficiena coloanei exprimat prin numrul de talere teoretice). O alt problem este c, lucrndu-se cu umpluturi cu diametre mici de particule la debite mari, apare un gradient termic att pe lungimea ct i pe seciunea coloanei. Creterea de temperatur pe lungimea coloanei poate fi foarte important ajungnd la 20-30C, ceea ce modific vscozitatea eluentului i poate crea o serie de alte probleme, cum ar fi lrgirea picurilor sau asimetria acestora. Pe baza acestor considerente, se poate afirma c n condiiile tehnice actuale diametrul de 2 m al particulelor de umplutur reprezint acea limit la care se atinge eficiena cinetic maxim, fr a afecta funcionalitatea coloanei.

O alt posibilitate de a mri eficiena de separare a coloanei ar fi creterea lungimii coloanei, innd cont de faptul c numrul de talere teoretice este proporional cu ptratul lungimii coloanei. Folosirea unor coloane mai lungi de 30 cm este ns limitat de faptul c umplerea uniform a unei coloane lungi este dificil de realizat din punct de vedere practic, iar o umplutur neuniform va avea o eficien mai sczut datorit creterii termenului difuzional A din ecuaia Van Deemter. Pe de alt parte, s-a vzut c i pierderea de presiune n coloan crete odat cu creterea lungimii acesteia. S-a constatat ns c la legarea mai multor coloane cu umplutur de dimensiuni mici n serie, n anumite cazuri s-a obinut o nsumare a numrului de talere teoretice, dar numai cnd coloanele au fost foarte asemntoare, pentru ca proprietile de curgere prin aceste coloane s nu fie diferite.

n cromatografia de lichide se realizeaz eficiene nalte de separare ale coloanelor, mai ales dac diametrul particulelor de umplutur este mic, ajungndu-se curent la un numr de talere de 100.000 sau chiar mai mult. Aceasta nseamn c se pot atinge i rezoluii ridicate ale separrilor.

7. TEHNICA CROMATOGRAFIEI LICHID-SOLID PE COLOANCromatografia de adsorbie este potrivit mai ales pentru separarea compuilor cu mase moleculare medii, polari i nepolari dar fr sarcini electrice.

Cromatografia de lichid-solid se poate realiza prin trei tehnici posibile:

- cromatografie lichid-solid clasic, pe coloan;

- cromatografie n strat subire;

- cromatografie lichid-solid de nalt performan.

Dintre acestea, cromatografia lichid-solid pe coloan se utilizeaz practic numai n scopuri preparative, n timp ce cea de nalt performan se utilizeaz mai ales n scop analitic, dar i preparativ.

Coloanele utilizate n LSC sunt confecionate n general din sticl, avnd lungimea cuprins ntre 10-90 cm i diametrul interior ntre 1-5 cm. Raportul dintre lungimea i diametrul coloanei trebuie s fie in intervalul 10-20. Aceste coloane pot fi prevzute cu lifuri la ambele capete, pentru a permite ataarea unei plnii de separare pe post de rezervor de solvent n partea superioar, respectiv a unui vas de tip Bchner n partea inferioar pentru colectarea fraciunilor eluate (Figura 8).

Fig. 8. - Coloan utilizat pentru cromatografia lichid-solid

Tehnica cromatografiei LSC pe coloan const din trei etape principale:

- umplerea i pregtirea coloanei;

- ncrcarea probei;

- eluia componentelor probei.

Umplerea coloanei se poate face prin dou tehnici: uscat i umed. Tehnica umplerii uscate se utilizeaz mai puin, deoarece necesit cantiti mai mari de adsorbent. Pentru a realiza separri cu o coloan umplut prin tehnica umed, este necesar o cantitate de adsorbent de 20-50 de ori mai mare fa de cantitatea de prob care va fi supus separrii.

Dac componentele separate au polaritate apropiat, acest raport trebuie mrit la 100-200. Diametrul particulelor de adsorbent utilizate n separrile LSC este cuprins ntre 0,05-0,5 mm. Particule mai mici duc la o vitez de curgere mult prea redus prin coloan, n timp ce particule mai mari determin o separare necorespunztoare. Viteza optim de eluie depinde de muli factori, cum este natura i diametrul particulelor de adsorbent, lungimea coloanei i natura compuilor care trebuie separai. Pentru a realiza umplerea prin tehnica umed, se realizeaz o suspensie de o parte adsorbent la cinci pri faz mobil i aceast suspensie este introdus n coloan.

Coloana trebuie s fie uscat i s aib n partea inferioar un opritor din sticl sinterizat, vat de sticl sau nisip, ct i un robinet pentru se a putea regla debitul de eluie. n timpul umplerii coloana trebuie s se gseasc n poziie vertical, iar introducerea suspensiei este dirijat cu ajutorul unei baghete de sticl pentru ca aezarea ei n coloan s fie uniform. Dup introducerea primei poriuni de suspensie, se deschide robinetul pentru evacuarea solventului cu vitez mic i numai dup aceea se adaug urmtoare poriune. Aceast adugare trebuie efectuat nainte ca poriunea precedent s se fi aezat complet, altfel umplutura se va aeza n straturi.

De asemenea, nu este permis ca nivelul lichidului s scad sub nivelul stratului de adorbent, acesta trebuind s se gseasc permanent n lichid. Dup umplere, coloana nu are voie s prezinte goluri, canale, crpturi sau alte neuniformiti. Dup terminarea umplerii, peste partea superioar a stratului de adsorbent se pune n general un disc de htrie de filtru cu diametrul egal cu diametrul interior al coloanei sau un strat de nisip de 0,5 cm grosime, pentru a preveni dislocarea sa n momentul introducerii probei. Apoi se scurge solventul din coloan pn cnd nivelul lichidului ajunge chiar deasupra nivelului umpluturii. n acest moment coloana este pregtit pentru utilizare.

Introducerea probei (Figura 9) se face prin aplicarea ei n partea superioar a coloanei, cel mai bine cu ajutorul unei pipete Pasteur. Proba trebuie s se gseasc ntr-un volum minim de solvent, de preferin acelai cu cel folosit pentru eluare. Pentru o coloan de 40 cm lungime i 2 cm diametru volumul ideal de soluie de prob este de 1-2 ml. Dup aplicarea probei se deschide robinetul de la partea inferioar a coloanei i proba este lsata s intre complet n adsorbent. Apoi cu un volum ct mai mic de solvent se spal pereii coloanei i aceast poriune de solvent este de asemenea lsat s intre n adsorbent. Intrarea complet a probei n stratul de adsorbent nainte de nceperea eluiei este necesar pentru a preveni diluarea probei. Apoi coloana se umple complet cu eluent i n partea sa superioar se ataeaz rezervorul de eluent. Dup nceperea elurii, fluxul de solvent prin coloan nu mai este permis s fie oprit, deoarece ar duce la dispersia excesiv a componentelor.

Fig. 9. - Introducerea probei n coloana LSC: (a) nivelul solventului se gsete chiar deasupra nivelului umpluturii; (b) aplicarea probei; (c) intrarea probei n adsorbent; (d) splarea pereilor coloanei cu solvent; (e) intrarea acestei soluii n adsorbent; (f) umplerea coloanei cu eluent.

8. TEHNICA CROMATOGRAFIEI HPLCCromatografia de lichide de nalt performan este metoda cromatografic cea mai larg folosit n separarea i identificarea calitativ i cantitativ a substanelor lichide. Faza mobil purttoare denumit "Eluent" mpreun cu substanele lichide de analizat este pompat cu ajutorul unei pompe printr-o coloan de separare ce conine faza staionar. O coloan de separare ntr-un cromatograf HPLC are lungimea cuprins ntre 5 i 30 cm. O substan din faza lichid mobil care interacioneaz puternic cu faza staionar solid rmne un timp mai ndelungat n coloan dect o substan care interacioneaz mai slab cu faza staionar. Corespunztor substanele din amestec prezint timpi de retenie diferii i ajung pe rnd la captul coloanei de separare unde se gsete detectorul.

n cadrul cromatografiei HPLC se folosesc dou metode:

a) cu faz normal

b) cu faz invers

Metoda cu faz normal folosete o faz staionar polar (ex silicagel- gel de silice). Puterea de eluie a fazei mobile este dependent n general de polaritate. Diferiii solveni sunt clasificai n funcie de creterea polaritii n iruri elutrope. Cu ct mai polar este este o faz mobil cu att mai repede este eluat o substan. Molecule polare sunt reinute pe coloan un timp mai ndelungat dect molecule nepolare i ca atare prsesc coloana cu ntrziere.

Metoda cu faz invers este folosit la scara cea mai larg n practic, cca 70% din separrile analitice sunt separri cu faz invers. La aceast metod se folosete o faz staionar nepolar , iar puterea de eluie scade cu creterea polaritii. Faza staionar se obine din reacia dintre din silani substituii cu hidrocarburi cu lanuri lungi i silicagel. n felul acesta suprafaa polar a particulelor de silicagel este este acoperit de un strat nepolar din alcani , deci polaritatea este "inversat" de unde i denumirea de faz invers.

Ca faze mobile se folosesc de obicei amestecuri din ap sau soluii tampon i acetonitril, tetrahydrofuran sau methanol. La separri isocratice compoziia fazei mobile rmn tot timpul egal. La seprarea dup gradient polaritatea amestecului mobil este schimbat n timpul analizei. O aplicaie deosebit pentru metoda cu faz invers o reprezint separarea de substane care prin metoda cu faz normal prezint timpi de retenie prea mari.

Fig 10. - Schema unui cromatograf de lichide de nalt performan (HPLC)

Principalele componente ale cromatografului de lichide sunt:

- sistemul de alimentare cu faz mobil

- dispozitivul pentru introducerea probei

- una sau dou pompe

- coloana

- detectorul

- sistemul de prelucrare a datelor

9. COLOANELE CROMATOGRAFICE UTILIZATE N ANALIZELE HPLC n mod obinuit, coloanele cromatografice utilizate n analizele HPLC sunt confecionate din oel inoxidabil, au lungimea cuprins ntre 10-30 cm i diametrul interior de 4 sau 5 mm. Pentru reinerea fazei staionare n coloan, la capetele acesteia se gsesc dou frite din oel inoxidabil cu ochiuri de 2 m sau mai puin.

Umpluturile folosite in cromatografia de lichide modern au dimensiuni mici, sunt rigide i uniforme. Ele pot fi clasificate n urmtoarele categorii:

Particule polimerice pe baz de copolimer stiren-divinilbenzen. Acestea se folosesc pentru cromatografia de schimb ionic i cromatografia de excluziune steric, ns au fost nlocuite pentru o serie de aplicaii de umpluturi pe baz de silicagel care sunt mai eficiente i mai stabile mecanic.

Particule superficial poroase (peliculare), cu diametrul cuprins ntre 30-55 m, care constau dintr-un nveli subire (1-3 m) de silicagel, dispus pe un nucleu dintr-un material inert, de exemplu granule sferice de sticl. Asemenea umpluturi peliculare se mai folosesc n anumite aplicaii de cromatografie de schimb ionic, ns utilizarea lor a nregistrat un puternic regres odat cu dezvoltarea umputurilor total poroase.

Particule total poroase de silicagel, cu diametre mai mici dect 10 m care sunt cele mai folosite la ora actual pentru coloanele analitice HPLC. Comparativ cu umpluturile peliculare, ele ofer o serie de avantaje n ce privete eficiena coloanei, capacitatea de ncrcare cu prob i viteza analizei.

Dezvoltarea fazelor staionare chimic legate a avut de asemenea o mare importan pentru pentru cromatografia lichid-lichid pe coloane de silicagel.

Procedura aleas pentru umplerea coloanei depinde n mare msur de caracteristicile mecanice ale umpluturii. n cazul umpluturilor cu particule de diametre mai mari de 20 m se poate folosi tehnica de umplere uscat, n timp ce n cazul celor cu diametre mai mici de 20 m se face umplere umed, adic particulele se suspend ntr-un solvent i suspensia rezultat se introduce n coloan, sub presiune. n general se prefer achiziionarea unor coloane gata umplute de la firmele de specialitate, avnd caracteristici definite n cataloagele acestor firme. Lungimea coloanelor este standardizat, fiind de 300, 250, 150, 100 i 75 mm. Coloanele mai lungi vor avea un numr mai mare de talere teoretice, ele fiind considerate standard. Coloanele mai scurte au avantajul unei viteze de separare mai mari i a unui timp de analiz mai redus.

Diametrul standard al umpluturilor folosite n HPLC este de 5 m. Umpluturile mai fine sunt mai eficiente (reducerea la jumtate a diametrului particulelor determin dublarea eficienei de separare), ns mai scumpe.

Se fabric o gam larg de coloane analitice, avnd diametrele interioare cuprinse n intervalul de la 4,6 mm la mai puin de 0,2 mm. Coloanele preparative au diametrul mai mare de 50 mm. n principiu, cu ct diametrul coloanei este mai mare, ncrcarea cu prob va fi mai mare, deci se va putea injecta o cantitate mai mare de prob. Pe de alt parte, exist o serie de elemente care fac coloanele mai nguste mai atractive pentru separrile analitice. Astfel, coloanele mai nguste vor necesita un consum mai mic de solvent, determinnd economii importante. Un alt avantaj important este c picul solutului va elua ntr-un volum mai mic i ntruct rspunsul majoritii detectoarelor depinde de concentraie rezult c nlimea picului va fi mai mare iar limita de detecie va fi redus.

Aceste avantaje au dus la dezvoltarea unor coloane capilare cu diametrul interior redus pn la 0,1 mm, ns folosirea acestora creeaz o serie de alte probleme, cum ar fi cele generate de necesitatea de a lucra cu debite foarte mici de faz mobil sau de a reduce foarte mult volumele moarte, de exemplu cele care apar la conexiunea dintre diferitele componente ale aparatului.

n general, pentru coloanele nguste cu diametre ntre 2 i 0,5 mm se folosete termenul microbore, n timp ce coloanele cu diametre mai mici dect 0,5 mm sunt denumite microcoloane. Microcolanele, la rndul lor, se submpart n coloane capilare umplute (diametre ntre 0,04-0,3 mm) i coloane capilare deschise, cu diametre ntre 3-50 m. Acestea din urm sunt construite din sticl special i din punct de vedere constructiv sunt similare cu coloanele capilare folosite n cromatografia de gaze. Dei folosirea lor necesit o aparatur special n ce privete construcia pompei i a detectorului, care s opereze la debite de faz mobil foarte mici, de pn la 1l/min, ele permit realizarea unor separri cu o eficien mai mare de 100.000 talere teoretice ntr-un timp de analiz mai mic de 30 de minute, cu un consum foarte sczut de faz mobil.

Pentru creterea duratei de utilizare a unei coloane de analiz HPLC se recomand introducerea unei coloane de protecie (precoloan, guard column). Aceasta este o coloan mic ce se amplaseaz ntre injector i coloana analitic i previne pierderea eficienei coloanei analitice datorit prezenei anumitor impuriti prezente n prob sau solvent, de exemplu a celor care se adsorb foarte puternic.

Un alt rol posibil al acestei coloane este de a satura solventul cu faz staionar i a preveni astfel antrenarea fazei staionare din coloana analitic. Coloanele de protecie sunt umplute cu faz staionar microporoas sau pelicular. Cele peliculare sunt mai uoare de manipulat la umplere ns trebuie schimbate mai frecvent deoarece capacitatea lor de reinere este mai sczut.

10. TEHNICA CROMATOGRAFIEI DE GAZEPrin cromatografie de gaze pot fi anlizate toate amestecurile de lichide gaze sau solide care pot fi trecute sau exist n stare gazoas i care nu se descompun la nclzire n alte specii chimice. Modul cel mai uzual de analiz este acela n care amestecurile supuse analizei snt n stare lichid din care snt aduse n stare gazoas prin evaporare. Singura restricie pentru folosirea analizei cromatografice gazoase este la substanele la care temperatura de vaporizare este mai mare dect temperatura de descompunere a substanelor de analizat rezultnd ali compui dect cei supui analizei. n aceste cazuri nainte de introducerea probei n cromatograf se pot realiza nite derivai (compui noi), volatili, utiliznd anumite reacii chimice specifice, procedeu denumit derivatizare. Uurina cu care se pune la punct o analiz noua, sensibilitatea sa, posibilitatea de automatizare precum si largile posibiliti de aplicare sunt avantajele principale ale acestei metode.

Printre domeniile n care GC si-a cucerit un loc de prim rang sunt: petrochimia, industria farmaceutica, protecia mediului, analiza aromelor, igiena si criminalistic.

La cromatografia cu gaze proba este evaporat la intrarea n coloana cromatografic fie direct la captul acestei fie ntr-un dispozitiv special plasat tot la intrarea n coloan. Separarea de-a lungul coloanei (eluia) are loc cu ajutorul unui gaz purttor care spre deosebire de cromatografia de lichide nu interacioneaz cu faza mobil, singurul lui scop fiind acela de agent de transport a speciilor chimice din amestec prin coloan. nceputurile cromatografiei de gaze sunt legate de coloane cu umplutur n care se transfera amestecul de substane gazoase dup ce n prealabil erau evaporate spontan ntr-un injector nclzit. La ora actual este folosit n exclusivitate numai cromatografia de gaze cu coloane fr umplutur la care se deosebesc dou tipuri:

cromatografia de gaze pe faze staionare solide (cromatografie de absorbie)

cromatografia de gaze pe faze staionare lichide (cromatografie de repartiie).

La cromatografia de gaze pe faze staionare solide retenia speciilor de

analizat din amestec este realizat pe baz de absorbie fizic pe peretele interior al coloanelor cromatografice ce au diametre interioare de zecimi de milimetrii i lungimi apreciabile de ordinul zecilor de metrii. Din cauza unor absorbii ireversibile, care duc la rndul lor reproductibiliti slabe, aceast tehnic este folosit rar i numai la substane cu puine molecule n structur.

Cromatografia de gaze pe faze staionare lichide se bazeaz pe repartiia substanei de analizat ntre faza mobil gazoas i o faza lichid imobilizat pe peretele interior al coloanei cromatografice. Acest tip de cromatografie de gaze este folosit la ora actual aproape n exclusivitate. Relaiile matematice care o descriu sunt valabile cu mici modificri i la cromatografia de lichide, aceste modificri sunt dictate de faptul c gazele sunt compresibile i ca atare proprietile i comportarea reologic sunt influenate de presiune i de temperatur. Din acest motiv la cromatografia de gaze este folosit n locul timpului de retenie tr volumul de retenie Vr care ine cont de debitul mediu Q al fazei mobile exprimat n ml/min, debit ce depinde de presiune i de temperatur :

Vr= tr Q

Spre deosebire de cromatografia de lichide viteza fazei mobile are o influen mare asupra lirii de band influena difuziei longitudinale fiind important datorit coeficientului de difuzie mai ridicat cu 3-4 ordine de mrime la gaze fa de cel al lichidelor.

Un gazcromatograf respect schema bloc din figura avnd particulariti specifice pentru analiza unei faze gazoase schema lui de principiu arat ca n figura 11.

Fig.11. - Schema de principiu a unui gazcromatograf. 1 -butelie de gaz purttor, 2-reductor de presiune, 3 - manometru de nalt presiune, 3- manometru de joas presiune, 5- regulator de presiune i debit, 6- sering de injecie pentru substane de analizat n stare iniial lichid, 7-dispozitiv de evaporare rapid , 8-cuptor termostatat de nclzire, 9- coloan cromatografica tubular, 10- detector, 11- amplificator electronic, 12- sistem electronic de achiziie prelucrare i afiare date, 13 - calculator, 14-imprimant11. COLOANELE CROMATOGRAFICE UTILIZATE N CROMATOGRAFIA DE GAZETermenul de coloan cromatografic este oarecum impropriu pentru cromatografia de gaze, el provine nc din timpul n care se foloseau coloane cu umplutur de lungimi rezonabile care ncpeau n gazcromatograf sau care erau montate n poziie vertical lng aparat avnd o termostatare concentric. Diametrul interior al coloanelor cu umplutur pentru gazcromatografie este de 4,6 mm, 3,18 mm sau la aa numitele coloane "micro"