+ All Categories
Home > Documents > CROMATOGRAFIE - 2009

CROMATOGRAFIE - 2009

Date post: 02-Dec-2015
Category:
Upload: marina
View: 296 times
Download: 4 times
Share this document with a friend
72
II. CROMATOGRAFIA Analiza cromatografica include mai multe metode de separare si totodată de analiza a componentilor amestecului din proba. Separarea precede analiza si se realizeaza prin repetarea, de un numar mare de ori, a echilibrului de distributie între doua faze. Una dintre faze este imobila și poarta denumirea de faza stationara (aflata de regula într-un tub numit coloana) iar cealalta faza mobila, denumită și eluent, se deplaseaza prin golurile primei faze. Separarea pe cale cromatografică a speciilor chimice dintr- un amestec se petrece într-o coloana cromatografica, piesa cheie a întregii metode. Faza mobila, - ce se scurge continuu, cu viteza constanta, prin interstitiile fazei stationare, adeseori poroase, provoacă migrarea, cu viteze diferite, a celor n componente ale amestecului de-a lungul coloanei. Amestecul supus separarii se introduce sub forma de solutie la începutul coloanei, folosindu-se un dispozitiv de introducere a probei (de exemplu o microseringa la gazcromatografie și pompă de înaltă presiune la comatografia de lichide de tip HPLC), si se afla initial fixat într-o zona îngusta de la începutul coloanei. Antrenați de eluent, o parte din componentii probei migreaza apoi prin coloana cu viteze diferite. Acest lucru se datoreaza interactiunilor fizice specifice, dintre moleculele probei si faza stationara (nu orice molecula poate migra pe orice faza stationara). Efectul, este numit retenție si aceasta provoaca o asa-numita migrare diferentiata. Adica moleculele migreaza în grupuri, în fiecare grup existând doar molecule de acelasi fel. Aceasta face posibila sesizarea pe rând a componentilor, la părăsirea coloanei cromatografice de catre un detector care este un analizor fizico-chimic, sensibil la mai multi (în mod ideal la oricare) dintre speciile moleculare ce traversează coloana ceomatografică. Detectorul dă un semnal proportional cu masa sau cu concentratia solutiei de component în faza mobila. Intr-o exprimare plastică se poate spune că detectorul "marcheaza" trecerea fiecareia din substantele ce compun initial amestecul analizat în mod similar cu un sistem Video care 1
Transcript
Page 1: CROMATOGRAFIE - 2009

II. CROMATOGRAFIA

Analiza cromatografica include mai multe metode de separare si totodată de analiza a componentilor amestecului din proba. Separarea precede analiza si se realizeaza prin repetarea, de un numar mare de ori, a echilibrului de distributie între doua faze. Una dintre faze este imobila și poarta denumirea de faza stationara (aflata de regula într-un tub numit coloana) iar cealalta faza mobila, denumită și eluent, se deplaseaza prin golurile primei faze.

Separarea pe cale cromatografică a speciilor chimice dintr-un amestec se petrece într-o coloana cromatografica, piesa cheie a întregii metode. Faza mobila, - ce se scurge continuu, cu viteza constanta, prin interstitiile fazei stationare, adeseori poroase, provoacă migrarea, cu viteze diferite, a celor n componente ale amestecului de-a lungul coloanei. Amestecul supus separarii se introduce sub forma de solutie la începutul coloanei, folosindu-se un dispozitiv de introducere a probei (de exemplu o microseringa la gazcromatografie și pompă de înaltă presiune la comatografia de lichide de tip HPLC), si se afla initial fixat într-o zona îngusta de la începutul coloanei. Antrenați de eluent, o parte din componentii probei migreaza apoi prin coloana cu viteze diferite. Acest lucru se datoreaza interactiunilor fizice specifice, dintre moleculele probei si faza stationara (nu orice molecula poate migra pe orice faza stationara). Efectul, este numit retenție si aceasta provoaca o asa-numita migrare diferentiata. Adica moleculele migreaza în grupuri, în fiecare grup existând doar molecule de acelasi fel. Aceasta face posibila sesizarea pe rând a componentilor, la părăsirea coloanei cromatografice de catre un detector care este un analizor fizico-chimic, sensibil la mai multi (în mod ideal la oricare) dintre speciile moleculare ce traversează coloana ceomatografică. Detectorul dă un semnal proportional cu masa sau cu concentratia solutiei de component în faza mobila. Intr-o exprimare plastică se poate spune că detectorul "marcheaza" trecerea fiecareia din substantele ce compun initial amestecul analizat în mod similar cu un sistem Video care înregistreaza trecerea liniei de sosire de către concurenti în atletism.

Fig. II.1. Elementele unei cromatograme

Dacă se inregistrează semnalele date de detector in funcție de timp se obține o cromatogramă. Pe cromatograma se disting o serie de maxime, numite peak-uri (peak engl. = vârf), care se produc deasupra liniei de baza sau a portiunii orizontale a curbei, paralela cu axa timpului. In cazul ideal, oricare peak are forma distributiei normale

1

Page 2: CROMATOGRAFIE - 2009

Gauss. In cazul introducerii unui singur component intr-un eluent inert se obține cea mai simplă cromatogramă posibilă de tipul celei din figura II.1. Pe axa absciselor fiind reprezentat timpul (sau volumul) de eluent scurs, cu debit cunoscut, de la introducerea (injectarea) probei, iar pe cea a ordonatelor, semnalul detectorului – exprimat în unitati arbitrare.

In cazul unei cromatograme distingem urmatoarele elemente de bază:

1. Peak- urile cromatografice . În cazul prezentat în fig. 1, cele doua semnale sau vârfuri sunt denumite peak-uri care sint valorificate în toate metodele cromatografice în scopul analizei calitative si cantitative a speciilor prezente in amestecul analizat. In acest sens inălțimea peak-ului sau suprafața lui reprezintă o măsură a concentrației speciei chimice și timpul de sosire la detector ( denumit timp de retenție) reprezintă o caracteristică a naturii speciei. In sens pur grafic o cromatogramă este asemănătoare cu o spectrogramă. Diferențele intervin la faptul că la o spectrogramă identificarea speciilor dintr-un amestec se face prin lungimea de undă care este o constantă fizică, iar la o cromatogramă identificarea speciilor se face prin timpul de retenție care este o mărime caracteristică numai in conditii date de temperatură, presiune, uzura coloanei etc. La analiza amestecurilor complexe cromatografia este superioară spectrometriei. La analiza spectrometrică a unor amestecuri complexe, cu lungimi de undă specifice apropiate pentru unele specii chimice, se poate ajunge la identificări greșite. Asemenea erori sînt excluse la cromatografie deoarece componentele amestecurilor analizate trec la timpi diferiți prin dreptul detectoarelor specifice fiind astfel exclusă atît confuzia acestora cît și posibilitatea ca acestia să părăsească coloana neidentificați .

Primul peak din cromatogramă, de înălțime mai redusă, corespunde unui component inert ( gazul purtător în cromatografia de gaze sau diluantul lichid in cromatografia de lichide ) - care este retinut în foarte mică măsură de coloana cromatografică. Cel de-al doilea peak , notat cu C, corespunde speciei (unice în cazul de fata) analizate. Sosirea intirziată a grupului de molecule a acestei specii față de eluent se datorează staționarii mai îndelungate în coloana cromatografică ca urmare afinității mai mari a acestei specii față de materialul coloanei. Gradul de afinitate este exprimat prin numărul absorbțiilor și desorbțiilor repetate de pe umplutura sau pereții coloanei și este o caracteritrică a naturii speciilor analizate. Cu cît numărul absorbțiilor și desorbțiilor este mai mare pe traseul parcurgrerii coloanei de către o specie chimică cu atît mai tîrziu va sosi aceasta la detector la. In cazul unor amestecuri complexe timpii de sosire se vor distribui pe un anumit interval

Timpul mort, tM - este timpul în care un component, complet neretinut de catre faza stationara, parcurge coloana si tuburile de legatura pâna la detector. Acesta nu poate fi zero. În cazul gazcromatografiei (GC) timpul mort, de exmplu, este egal cu timpul de retentie al aerului: tM = tR (R = Retentie). Deci, cu alte cuvinte, reprezinta timpul scurs de la injectarea (introducerea) probei în coloana si aparitia maximului de concentratie în detector, pentru componentul neretinut.

Timpul de retentie, tR - o marime caracteristica pentru fiecare component al amestecului separat de coloana - reprezinta timpul scurs de la injectarea probei si aparitia maximului de concentratie în detector. De exemplu, în cazul prezentat anterior în fig. 1, acesta este distanta de la axa ordonatelor (începutul cromatogramei) pâna la verticala prin vârful picului C. Acest timp, pentru un component si o coloana (plus conditii experimentale) date este constant, indiferent daca componentul respectiv este singur sau în amestec.

2

Page 3: CROMATOGRAFIE - 2009

Timpul de retentie ajustat, tR'- introdus în cromatografie pentru a se putea compara timpii masurati pe coloane diferite, în cazul aceluiași component - este dat de diferenta:

tR' = tR - tM Volumul de retentie, VR este volumul de eluent corespunzator timpului de

retentie (legat de timpul tR prin intermediul debitului eluentului, Qe):

VR = tR·Qe

Volum de retentie ajustat VR' are expresia :

VR' = VR - VM

unde VM este volumul mort; acest volum mort este legat de debitul eluentului coloanei, Fe, prin produsul:

VM = tM·Fe

si reprezinta volumul golurilor din coloana plus volumul tuburilor de legatura de la coloana la detector.

Factorul de reţinere k ( factorul de capacitate ). Din cromatogramă din fig. 1 se observă că natura speciilor chimice poate fi interpretată prin prisma timpului de retenţie tr acest timp depinde însă pe lîngă natura specieiei şi de alţi factori precum : lungimea coloanei, natura şi granulaţia umpluturii, etc, ca atare timpul de reţinere poate fi considerat specific naturii speciilor chimice numai în condiţii precis definite neavînd un caracter universal. Acesta este motivul pentru care pentru identificare calitativă este folosit factorul de reţinere (k) denumit in literatură şi factor de capacitate:

un factor de kapacitate de valoare mică indică o rezoluţie de identificare scăzută iar un factor de capacitate de valoare mare indică un timp de separare şi de analiză mare cu efect negativ asupra producţivităţii. Din punct de vedere al ordinului de mărime factorul de capacitate trebuie să se situeze intre 1 şi 10.

Gradul de separare a doi componenţi (α) - exprimă gradul de separare cromatografică a două substanţe şi este definit ca raport intre factorul k de reținere a celor doi componenți :

Eficienţa unei coloane cromatografice . Ca măsură a eficenţei unei coloane cromatografice de lungime L este folosit fie numărul N de talere teoretice necesare separării fie este folosită înălţimea teoretică H a talerului. Teoria talerelor se bazează pe conceptul că o coloană cromatografică poate fi asimilată cu o mulţime de minicoloane (talere) lipite unul de altul , pe fiecare din aceste talere realizîndu-se echilibrul între faza

3

Page 4: CROMATOGRAFIE - 2009

mobilă şi cea staţionară . în acest concept se ia in considerare situaţia în care un taler realizează singur separarea cromatografică a componentelor, este evident că pentru aceasta viteza fazei mobile ar trebui să fie infinit de mică iar timpul de efectuare a unei cromatograme extrem de mare. Într-o coloană cromatografică cu umplutură pentru lichide un taler este asimilat cu o particulele de umplere a coloanei, astfel colanele comerciale conţin cca 50.000 talere pe metru dacă este vorba de particule cu diametrul de 5 μm sau cca 25.000 talere pe metru liniar dacă este vorba de particule de umplere cu diametrul de 10 μm. In general eficienţa unei coloane cromatografice de separare creşte atunci cînd dimensiunea particulelor de umplere scade. Numărul teoretic de talere necesar într-o coloană cromatografică de lungime L este dat de relaţia:

unde: L - lungimea coloanei măsurată de la sistemul de injecţie pînă la detector H- înălţimea teoretică a talerului

de unde rezultă înălţimea talerului ca fiind :

Una din problemele de bază ale cromatografiei în general este aceea a lăţirii benzii Peak-urilor ca urmare a călătoriei speciilor chimice prin coloana cromatografică. In condiţii ideale o specie chimică ar trebui să se deplaseze prin coloană fără ca banda ei să se lăţească la bază. În realitate însă are loc o lăţire destul de pronunţată la traversarea coloanei cauzată de difuzie moleculară longitudinală, de curgeri neuniforme prin coloană, de variaţii necontrolate ale sorbţiei şi resorbţiei. Eficienţa unei coloane cromatografice este cu atît mai ridicată cu cît lăţirile W1 şi W2 în condiţii date ale timpilor de retenţie tr1 şi tr2 sînt mai mici, numărul de talere teoretice N fiind dat de relaţia:

Din relaţia de mai sus rezultă că numărul de talere respectiv eficienţa unei coloane poate fi calculată din două măsurători de timpi: tr şi W.

O altă metodă pentru determinarea eficienţei, considerată de mulţi cercetători ca fiind de încredere mai mare [Skoog] o reprezintă determinare lălţimii peak-ului la jumătatea înălţimii lui, figura , numărul de talere teoretice rezultate fiind :

4

Page 5: CROMATOGRAFIE - 2009

Fig. Definirea lăţimii unui Peak la jumătatea înălţimii lui ( VARIAN p1-18)

Dintre cele două mărimi : înălţimea H a talerului şi numărul N de talere ce indică ambele eficienţa coloanei este preferată exprimarea prin numărul de talere deoarece este adimensional şi poate fi folosită în comparaţii directe ale diferitelor tipuri de coloane cu condiţia ca eficienţa să fi fost stabilită cu aceeaşi fază mobilă. Numărul de talere poate fi mărit foarte simplu prin creşterea lungimii coloanei.

Rezoluţia de separare Rs - reprezintă măsura separării unui mai avansate sau mai puţin avansate aunui component de altul , cu cît distanţa între două peak-uri este mai mare cu atit rezoluţia este mai bună, totodată creşte şi timpul de analiză cromatografică:

unde : w1, w2 reprezintă lăţimea bazei picurilor celor două componente. Exprimarea pentru t şi w poate fi în unităţi de timp, de volum, sau de lungime. Atîta timp cît pentru cele două mărimi se folosesc aceleaşi unităţi se consideră că două peak-uri sînt complet separate la bază dacă Rs = 1,5. In figura 2 sînt prezentate două Peak-uri neseparate complet.

5

Page 6: CROMATOGRAFIE - 2009

Fig.2. Situaţia unei separări incomplete a Peak-urilor

Dacă cele două peak- uri sînt apropiate şi au ariile egale , figura 3, ecuaţia () devine

ecuaţie ce arată influenţa termodinamică a sistemului cromatografic asupra rezoluţieiei prin termenul de la numărător şi a eficienţei de separare prin abaterea standard . In situaţia in care: tr2 – tr1 = 4

rezoluţia Rs are valoarea egală cu unu ceea ce corespunde unei separări avansatea a celor doi componenţi de cca 98 %. Folosirea termenilor de statistică matematică este justificată de asemănarea dintre peak-urilor cromatografice şi curbe de tip Gauss valoarea lăţirii W fiind egală cu 4

Mărimi specifice cromatografiei

Lungimea coloanei cromatografice (L)- reprezintă lungimea coloanei măsurată de la sistemul de injecţie pînă la detector

Viteza liniară de curgere (u) estedefin ită prin viteza de curgere a fazei mobile şi este exprimată prin:

Timpul de traversare (timpul mort) (t0 ) – este timpul parcurs de o specie chimică nereţinut e (neretardate) de umplutura coloanei de la injecţie pînă la traversarea coloanei, această specie traversează coloana cu viteza fazei mobile. Acest timp espe măsurat automat prin semnalul electric dat de sistemul de injecţie şi semnalul dat de detector atunci cînd valoarea derivatei a I – a a peak-ului cromatografic

6

Page 7: CROMATOGRAFIE - 2009

atinge valoarea zero. Timpul t0 formează baza de plecare pentru determinarea factorului de reţinere

Timpul de reţinere (tr)- reprezintă timpul necesar ca o specie chimică să traverseze coloana cromatografică din momentul injectiei pînă la sosirea la detector . Ca şi la timpul mort şi acest timp espe măsurat automat prin semnalul electric dat de sistemul de injecţie şi semnalul dat de detector atunci cînd valoarea derivatei a I – a a peak-ului cromatografic atinge valoarea zero.

Factorul de reţinere ( factorul de capacitate ) (k). Din cromatogramă din fig. 1 se observă că natura speciilor chimice poate fi interpretată prin prisma timpului de retenţie tr acest timp depinde însă pe lîngă natura specieiei şi de alţi factori precum : lungimea coloanei, natura şi granulaţia umpluturii, etc, ca atare timpul de reţinere poate fi considerat specific naturii speciilor chimice numai în condiţii precis definite neavînd un caracter universal. Acesta este motivul pentru care pentru identificare calitativă este folosit factorul de reţinere (k) denumit in literatură şi factor de capacitate:

un factor de kapacitate de valoare mică indică o rezoluţie de identificare scăzută iar un factor de capacitate de valoare mare indică un timp de separare şi de analiză mare cu efect negativ asupra producţivităţii. Din punct de vedere al ordinului de mărime factorul de capacitate trebuie să se situeze intre 1 şi 10.

Gradul de separare a doi componenţi (α) - exprimă gradul de separare cromatografică a două substanţe şi este definit ca raport intre factorul k de reținere a celor doi componenți :

Eficienţa unei coloane cromatografice . Ca măsură a eficenţei unei coloane cromatografice de lungime L este folosit fie numărul N de talere teoretice necesare separării fie înălţimea teoretică H a talerului. Teoria talerelor se bazează pe conceptul că o coloană cromatografică poate fi asimilată cu o mulţime de minicoloane (talere) lipite unul de altul , pe fiecare din aceste talere realizîndu-se echilibrul între faza mobilă şi cea staţionară . în acest concept se ia in considerare situaţia în care un taler realizează singur separarea cromatografică a componentelor, este evident că pentru aceasta viteza fazei mobile ar trebui să fie infinit de mică iar timpul de efectuare a unei cromatograme extrem de mare. Într-o coloană cromatografică cu umplutură pentru lichide un taler este asimilat cu o particulele de umplere a coloanei, astfel colanele comerciale conţin cca 50.000 talere pe metru dacă este vorba de particule cu diametrul de 5 μm sau cca 25.000 talere pe metru liniar dacă este vorba de particule de umplere cu diametrul de 10 μm. In general eficienţa unei coloane cromatografice de separare creşte atunci cînd dimensiunea particulelor de umplere scade. Numărul teoretic de talere necesar într-o coloană cromatografică de lungime L este dat de relaţia:

7

Page 8: CROMATOGRAFIE - 2009

de unde rezultă înălţimea talerului ca fiind :

Una din problemele de bază ale cromatografiei în general este aceea a lăţirii benzii Peak-urilor ca urmare a călătoriei speciilor chimice prin coloana cromatografică. In condiţii ideale o specie chimică ar trebui să se deplaseze prin coloană fără ca banda ei să se lăţească la bază. În realitate însă are loc o lăţire destul de pronunţată la traversarea coloanei cauzată de difuzie moleculară longitudinală, de curgeri neuniforme prin coloană, de variaţii necontrolate ale sorbţiei şi resorbţiei. Eficienţa unei coloane cromatografice este cu atît mai ridicată cu cît lăţirile W1 şi W2 în condiţii date ale timpilor de retenţie tr1 şi tr2 sînt mai mici, numărul de talere teoretice N fiind dat de relaţia:

Din relaţia de mai sus rezultă că numărul de talere respectiv eficienţa unei coloane poate fi calculată din două măsurători de timpi: tr şi W.

Factori ce influențează lăţirea de bandă

în călătoria ei prin coloană lăţirea de bandă a unei probe este influenţată de patru factori:

1. difuzia radială 2. difuzia longitudinală3. efectele transportului de masă4. efectele exterioare

Difuzia radială se bazează pe faptul că o probă datorită drumului de curgere distribuit radial parcurge într-o coloană lungimi diferite făcînd ca ea să sosească pe un interval mai mare de timp (bandă lăţită). Diferenţele de lungime iau naştere ca urmare a diferitelor forme şi dimensiuni ale umpluturii coloanei precum şi datorită golurilor neuniforme din umplutură, reprezentarea schematică este dată în figura

8

Page 9: CROMATOGRAFIE - 2009

Fig. Efectul difuziei radiale asupra lăţirii benzii [VARIAN P1-25]

Pentru ca o coloană să prezinte o lăţire de bandă mică este nevoie ca ea să aibe o umplutură de dimensiune cît mai mică şi de diametru cît mai uniform. Difuzia radială este cu atit mai ridicată cu cît proba traversează mai încet coloana. La coloane capilare fără umplutură , folosite în gazcromatografie, difuzia radială poate fi neglijată.

Difuzia longitudinală se datorează pe diferenţierea axială a vitezei de curgere ca urmare a difuziei axiale. Acest efect este mai pronunţat pe măsura creşterii timpului de staţionare a probei în coloană. Spre deosebire de difuzia radială la cea axială se poate reduce efectul asupra lăţirii de bandă prin mărirea vitezei fazei mobile. Din cauza

Fig. Efectul difuziei longitudinale asupra lăţirii benzii VARIAN p1-26

9

Page 10: CROMATOGRAFIE - 2009

Fig. Efectul curgerii cu viteză diferită şi a difuziei asupra lăţirii de bandă . i- la curgere a

unui lichid printr-o conductă viteza liniară se schimbă de-a lungul secţiunii în sensul că moleculele din centru se deplaseză mai rapid decît cele din imediata vecinătater a peretelui, ii- şi difuzia multidirecţională a probelor lichide duce la lăţirea de bandă

coeficientului de difuzie mai mic cu ordine de mărime de cca 103-104 la lichide decît la gaze difuzia longitudinală este minoră în cazul cromatografiei de lichide în schimb la cromatografia de gaze ea joacă un rol hotărîtor. Influenţa efectului difuziei longitudinale asupra lăţirii de bandă este reprezentată în figura

Efectele transportului de masă se manifestă asupra lăţirii de bandă datorită faptului că cinetica de absorbţie- desorbţie a moleculelor probei între faza staţionară şi cea mobilă este mai lentă decît viteza moleculelor în faza mobilă. Atunci cînd o moleculă a fazei mobile intră în interacţiune cu faza staţionară petrece pe şi în aceasta un un anumit timp pînă cînd intră din nou în fluxul de curgere şi este transportată mai departe de faza mobilă. In tot acest timp molecula pierde timp faţă de moleculele care nu au interacţionat cu faza staţionară. Un rol important la retenţia moleculelor o joacă şi structura poroasă (atunci cînd este cazul) a fazei staţionare. Fenomenele de transport de masă devin cu atît mai pronunţate cu cît viteza de curgere liniară este mai mare, ca atare lăţirea de bandă datorită efectului de transport de masă poate fi redusă prin scăderea vitezei de curgere a fazei mobile . De asemenea ea poate fi redusă prin folosirea , (la coloanele cu umplutură) a unor particule cu diametru cît mai mic şi neporoase pentru umplutură, precum şi folosirea de solvenţi de vîscozitate mică (la cromatografia de lichide) .

Fig.

Efectul curgerii cu viteză diferită şi a difuziei asupra lăţirii de bandă

Efectele exterioare ale lăţirii de bandă se manifestă în exteriorul coloanei şi sînt cauzate de volume moarte în injector , în detector, precum şi în conductele de transport. Suma efectelor enunţate mai sus se numesc “Efecte extracolumnare „ un experiment [1] simplu poate demonstra efectul diferitelor volume moarte intercalate în circuitul de lichid iar în figura este exemplificat acest lucru pentru trei situa\ii concrete :

10

Page 11: CROMATOGRAFIE - 2009

Fig. Laţirea de bandă: i - la o cromatogramă normală, ii- la o cromatogramă care se obţine

prin intercalarea intre detector şi ieşirea coloanei a unui tub cu lungimea de 15 cm şi diametrul interior de 0,8 mm, iii- la o cromatogramă care se obţine prin intercalarea intre detector şi ieşirea coloanei a unui tub cu lungimea de 12,5 cm şi un diametru interior de 4,6 mm

O altă metodă pentru determinarea eficienţei, considerată de mulţi cercetători ca fiind de încredere mai mare [Skoog] o reprezintă determinare lălţimii peak-ului la jumătatea înălţimii lui, figura , numărul de talere teoretice rezultate fiind :

11

Page 12: CROMATOGRAFIE - 2009

Fig. Definirea lăţimii unui Peak la jumătatea înălţimii lui ( VARIAN p1-18)

Dintre cele două mărimi : înălţimea H a talerului şi numărul N de talere ce indică ambele eficienţa coloanei este preferată exprimarea prin numărul de talere deoarece este adimensional şi poate fi folosită în comparaţii directe ale diferitelor tipuri de coloane cu condiţia ca eficienţa să fi fost stabilită cu aceeaşi fază mobilă. Numărul de talere poate fi mărit foarte simplu prin creşterea lungimii coloanei.

Rezoluţia de separare Rs - reprezintă măsura separării unui mai avansate sau mai puţin avansate aunui component de altul , cu cît distanţa între două peak-uri este mai mare cu atit rezoluţia este mai bună, totodată creşte şi timpul de analiză cromatografică:

unde : w1, w2 reprezintă lăţimea bazei picurilor celor două componente. Exprimarea pentru t şi w poate fi în unităţi de timp, de volum, sau de lungime. Atîta timp cît pentru cele două mărimi se folosesc aceleaşi unităţi se consideră că două peak-uri sînt complet separate la bază dacă Rs = 1,5. In figura 2 sînt prezentate două Peak-uri neseparate complet.

12

Page 13: CROMATOGRAFIE - 2009

Fig.2. Situaţia unei separări incomplete a Peak-urilor

Dacă cele două peak- uri sînt apropiate şi au ariile egale , figura 3, ecuaţia () devine

ecuaţie ce arată influenţa termodinamică a sistemului cromatografic asupra rezoluţieiei prin termenul de la numărător şi a eficienţei de separare prin abaterea standard . In situaţia in care: tr2 – tr1 = 4

rezoluţia Rs are valoarea egală cu unu ceea ce corespunde unei separări avansatea a celor doi componenţi de cca 98 %. Folosirea termenilor de statistică matematică este justificată de asemănarea dintre peak-urilor cromatografice şi curbe de tip Gauss valoarea lăţirii W fiind egală cu 4

Lăţirea de bandă

Lăţirea de bandă a unei probe în călătoria ei prin coloană este influenţată de patru factori:

5. difuzia radială 6. difuzia longitudinală7. efectele transportului de masă8. efectele exterioare

Difuzia radială se bazează pe faptul că o probă datorită drumului de curgere distribuit radial parcurge într-o coloană lungimi diferite făcînd ca ea să sosească pe un interval mai mare de timp (bandă lăţită). Diferenţele de lungime iau naştere ca urmare a diferitelor forme şi dimensiuni ale umpluturii coloanei precum şi datorită golurilor neuniforme din umplutură, reprezentarea schematică este dată în figura

13

Page 14: CROMATOGRAFIE - 2009

Fig. Efectul difuziei radiale asupra lăţirii benzii [VARIAN P1-25]

Pentru ca o coloană să prezinte o lăţire de bandă mică este nevoie ca ea să aibe o umplutură de dimensiune cît mai mică şi de diametru cît mai uniform. Difuzia radială este cu atit mai ridicată cu cît proba traversează mai încet coloana. La coloane capilare fără umplutură , folosite în gazcromatografie, difuzia radială poate fi neglijată.

Difuzia longitudinală se datorează pe diferenţierea axială a vitezei de curgere ca urmare a difuziei axiale. Acest efect este mai pronunţat pe măsura creşterii timpului de staţionare a probei în coloană. Spre deosebire de difuzia radială la cea axială se poate reduce efectul asupra lăţirii de bandă prin mărirea vitezei fazei mobile. Din cauza coeficientului de difuzie mai mic cu cca 103-104

Fig. Efectul difuziei longitudinale asupra lăţirii benzii VARIAN p1-26

la lichide decît la gaze difuzia longitudinală este minoră în cazul cromatografiei de lichide în schimb la cromatografia de gaze ea joacă un rol hotărîtor. Influenţa efectului difuziei longitudinale asupra lăţirii de bandă este reprezentată în figura

14

Page 15: CROMATOGRAFIE - 2009

Efectele transportului de masă se manifestă asupra lăţirii de bandă datorită faptului că cinetica de absorbţie- desorbţie a moleculelor probei între faza staţionară şi cea mobilă este mai lentă decît viteza moleculelor în faza mobilă. Atunci cînd o moleculă a fazei mobile intră în interacţiune cu faza staţionară petrece pe şi în aceasta un un anumit timp pînă cînd intră din nou în fluxul de curgere şi este transportată mai departe de faza mobilă. In tot acest timp molecula pierde timp faţă de moleculele care nu au interacţionat cu faza staţionară. Un rol important la retenţia moleculelor o joacă şi structura poroasă (atunci cînd este cazul) a fazei staţionare. Fenomenele de transport de masă devin cu atît mai pronunţate cu cît viteza de curgere liniară este mai mare, ca atare lăţirea de bandă datorită efectului de transport de masă poate fi redusă prin scăderea vitezei de curgere a fazei mobile . De asemenea ea poate fi redusă prin folosirea , (la coloanele cu umplutură) a unor particule cu diametru cît mai mic şi neporoase pentru umplutură, precum şi folosirea de solvenţi de vîscozitate mică (la cromatografia de lichide) .

Fig.

Efectele exterioare ale lăţirii de bandă se manifestă în exteriorul coloanei şi sînt cauzate de volume moarte în injector , în detector, precum şi în conductele de transport. Suma efectelor enunţate mai sus se numesc “Efecte extracolumnare „ un experiment [1] simplu poate demonstra efectul diferitelor volume moarte intercalate în circuitul de lichid iar în figura este exemplificat acest lucru pentru trei situa\ii concrete :

15

Page 16: CROMATOGRAFIE - 2009

Fig. Laţirea de bandă: i - la o cromatogramă normală, ii- la o cromatogramă care se obţine

prin intercalarea intre detector şi ieşirea coloanei a unui tub cu lungimea de 15 cm şi diametrul interior de 0,8 mm, iii- la o cromatogramă care se obţine prin intercalarea intre detector şi ieşirea coloanei a unui tub cu lungimea de 12,5 cm şi un diametru interior de 4,6 mm

Simetria Peak-urtilor. Forma peak-urilor poate fi foarte diferită , în vederea caracterizării acestora IUPAC a elaborat o clasificare , astfel:

- la crestere mai accentuată a frontului Peak-ului decit a scăderii acestuia denumirea este de „Tailing „

- la cresterea mai lină a frontului peak-ului faţă de scăderea acestuia denumirea este de „Fronting „

Factorul de Tailing sau de fronting reprezintă o măsură a simetriei peak-ului şi se determină la valoarea de 10% din înăţlimea peak-ului după relaţiile din figura

16

Page 17: CROMATOGRAFIE - 2009

Analiza calitativă

17

Page 18: CROMATOGRAFIE - 2009

Analiza cantitativă

Metoda normării suprafeţei (înălţimii)La analiza cantitativă se are în vedere faptul că suprafaţa respectiv inălţimea

unui peak este proportională cu concentraţia componentului reprezentat de acel peak. Pentru a exprima concentraţia procentuală a unui component trebuie avută în vedere înălţimea totală sau suprafaţa totală a tuturor componentelor din amestec care este considerată ca avînd o compoziţie de 100% . Concentraţia fiecărui component din amestec se determină pe urmă prin regula de trei simple. La acest mod de abordare a analizei cantitative se acceptă următoarele: 1. se presupune că pe cromatogramă sînt evidenţiate toate componentele şi că

fiecare componentă apare sub forma unui peak individual bine definit. Această presupunere nu ţine cont de faptul că două sau mai multe componente pot parăsi în acelaşi timp coloana fiind identificate ca o singură specie, sau unele specii pot fi reţinute total pe coloană şi iar altele eventual nici nu sînt detectate

2. se presupune că sensibilitatea detectorului este aceeaşi pentru toate componentele amestecului ceea ce în cele mai multe cazuri nu se adevereşte

bazat pe aceste presupuneri şi efectele generate de ele se procedează la calibrarea sensibilităţii detectorului prin diferite metode care vor fi descrise în continuare.

Metoda standardului extern

La folosirea acestei metode se prepară un standard extern care conţine specia (speciile) urmărită , dacă se bănuieşte ordinul de mărime al concentraţiei componentei

18

Page 19: CROMATOGRAFIE - 2009

(componentelor) urmărite este bine ca la standardul extern concentraţia să fie în acelaşi domeniu. Faza mobilă astfel preparată se trimite prin cromatograf şi se trasează o cromatogramă , operaţia se repetă pentru proba de analizat. Din cromatograma standard se determină pentru peak- ul urmărit, figura, un factor de răspuns r ca fiind raportul dintre concentraţia componentei [Ai] urmărite şi înălţimea h sau suprafaţa S a peak-ului, :

b

Fig. Mărimi caracteristice ale peak-ului luate în calcul la determinarea concentraţiei prin metoda standardului extern

în continuare concentraţia oricărei componente din probă se determină prin înmulţirea factorului de răspuns r cu înălţimea h sau cu suprafaţa S peak-ului. De fapt prin calcularea acestui factor de răspuns r se simplifică determinarea concentraţiei prin regula de trei simple, factorul de răspuns regăsindu-se de fiecare dată în această regulă sub forma unei constante, la calcularea concentraţiei diferitelor componente din amestec. Acest mod de determinare a concentraţiei unei componente presupune o dependenţă liniară între înălţimea respectiv suprafaţa peak-ului şi concentraţie. Atunci cînd această dependenţă este cunoscută sau bănuită ca fiind neliniară se efectuează mai multe cromatograme etalon cu concentraţii cunoscute care includ în domeniu valoarea concentraţ iei necunoscute , figura şi cu valorile obţinute se trasează o curbă de

Fig. Înălţimea şi forma peak-urilor la calibrarea multiplă cu concentraţii crescătoare a componentului urmărit

Fig. Curba de etalonare a componentului urmărit oarecare

etalonare în coordonate h(S) şi concentraţie. Pe această curbă de etalonare se extrapolează valorile înălţimii sau suprafeţei peak-ului urmărit pentru detrminarea concentraţiei speciei pe care o reprezintă acesta. Imprecizia acestei metode este legată de erorile de dozare ale probei de analizat avînd în vedere şi volumele mici ce se dozează.

19

Page 20: CROMATOGRAFIE - 2009

Metoda standardului intern

La folosirea acestei metode se obţin cele mai mari precizii deoarece sînt evitate erorile datorate impreciziei de dozare a probei la injecţie. Tehnica se bazează pe adăugarea atit la proba standard cît şi la proba urmărită o cantitate bine stabilită dintr-un standard intern. Raportul dintre suprafeţele peak-urilor sau a înălţimii probei şi suprafaţa peak-ului standardului intern reprezintă parametrul analitic urmărit respectiv factorul de răspuns r :

factor care se poate exprima , atunci cînd se ţine cont de corespondenţa dintre suprafaţa S a peak-ului şi concentraţia c , şi ca fiind [LINDSAY]:

unde: c - concentraţia componentei care intereseazăS - suprafaţa (respectiv inălţimea) peak-ului cs - concentraţia standardului internSs - suprafaţa (respectiv inălţimea) peak-ului standardukui intern

In aceste condiţii concentraţia componentei urmărite cu are expresia:

unde: cu - concentraţia componentei analizateSu - suprafaţa (respectiv înălţimea) peak-ului componentei analizatecs - concentraţia standardului internSs - suprafaţa (respectiv inălţimea) peak-ului standardului intern

20

Page 21: CROMATOGRAFIE - 2009

II.1. CLASIFICAREA TEHNICILOR CROMATOGRAFICE S-au realizat numeroase variante ale metodei cromatografice, diferind unele de

altele în primul rând prin natura fazei mobile, dar si a celei stationare. Astfel se distinge:

21

Page 22: CROMATOGRAFIE - 2009

a. cromatografia de gaze (GC) când faza mobila este un gaz; b. cromatografia de lichide (LC) când faza mobila este un lichid

c. cromatografia cu fluide supracritice la care faza mobila este un lichid aflat peste temperatura critica.

In cadrul cromatografiei de gaze (GC) se disting urmatoarele tehnici:

1. Cromatografia gaz-lichid (cromatografie de repartiţie), faza stationara este un lichid nevolatil imobilizat pe un suport solid. Aici suportul poate fi unul granular, poros, de tip silicagelul sau alumina, situat într-o coloană, la asa-numita cromatografie conventională sau suportul poate fi chiar peretele coloanei, confectionată la dimensiuni capilare, la așa numita cromatografie pe coloana capilara.

2. Cromatografia gaz-solid (cromatografie de absorbţie), faza stationara o constituie tot silicagelul sau alumina, respectiv “sitele moleculare” (niste silicati naturali sau sintetici) respectiv granulele de carbon poros. Metoda este extrem de importanta pentru separarea gazelor permanente (CO, CO2, O2, N2, gaze nobile etc.)

II.2. CROMATOGRAFIA DE GAZE

Prin cromatografie de gaze pot fi anlizate toate amestecurile de lichide gaze sau solide care pot fi trecute sau există în stare gazoasă şi care nu se descompun la încălzire în alte specii chimice. Modul cel mai uzual de analiză este acela în care amestecurile supuse analizei sînt în stare lichidă din care sînt aduse în stare gazoasă prin evaporare .Singura restrictie pentru folosirea analizei cromatografice gazoase este la substanţele la care temperatura de vaporizare este mai mare decît temperatura de descompunere a substantelor de analizat rezultind alţi compuşi decît cei supuşi analizei. In aceste cazuri Înainte de introducerea probei în cromatograf se pot realiza niste derivati (compusi noi), volatili, utilizând anumite reactii chimice specifice, procedeu denumit derivatizare. Uşurinta cu care se pune la punct o analiza noua, sensibilitatea sa, posibilitatea de automatizare precum si largile posibilitati de aplicare sunt avantajele principale ale acestei metode.

Printre domeniile în care GC si-a cucerit un loc de prim rang sunt: petrochimia, industria farmaceutica, protectia mediului, analiza aromelor, igiena si criminalistica.

La cromatografia cu gaze proba este evaporată la intrarea în coloana cromatografică fie direct la capătul acestei fie într-un dispozitiv special plasat tot la intrarea în coloană. Separarea de-a lungul coloanei (eluţia) are loc cu ajutorul unui gaz purtător care spre deosebire de cromatografia de lichide nu interacţionează cu faza mobilă , singurul lui scop fiind acela de agent de transport a speciilor chimice din amestec prin coloană. Începuturile Cromatografiei de gaze sînt legate de coloane cu umplutură în care se transfera amestecul de substanţe gazoase după ce în prealabil erau evaporate spontan într-un injector încălzit. La ora actuală este folosită în exclusivitate numai cromatografia de gaze cu coloane fără umplutură cu cele dou[ tipuri :

- cromatografia de gaze pe faze staţionare solide (cromatografie de absorbţie)- cromatografia de gaze pe faze staţionare lichide (cromatografie de repartiţie)La cromatografia de gaze pe faze staţionare solide retenţia speciilor de

analizat din amestec este realizată pe bază de absorbţie fizică pe peretele interior al

22

Page 23: CROMATOGRAFIE - 2009

coloanelor cromatografice ce au diametre interioare de zecimi de milimetrii şi lungimi apreciabile de ordinul zecilor de metrii. Din cauza unor absorbţii ireversibile, care duc la rîndul lor reproductibilităţi slabe, această tehnică este folosită rar şi numai la substanţe cu puţine molecule în structură.

Cromatografia de gaze pe faze staţionare lichide se bazează pe repartiţia substanţei de analizat între faza mobilă gazoasă şi o faza lichidă imobilizată pe peretele interior al coloanei cromatografice. Acest tip de cromatografie de gaze este folosită la ora actuală la scara cea mai larga. Relaţiile matematice care o descriu sînt valabile cu mici modificări şi la cromatografia de lichide, aceste modificări sînt dictate de faptul că gazele sînt compresibile şi ca atare proprietăţile şi comportarea reologică sînt influenţate de presiune şi de temperatură. Din acest motiv la cromatografia de gaze este folosit în locul timpului de retenţie tr volumul de retenţie Vr care ţine cont de debitul mediu Q al fazei mobile exprimată în ml/min, debit ce depinde de presiune şi de temperatură :

Vr= tr . Q

Spre deosebire de cromatografia de lichide viteza fazei mobile are o influenţă mare asupra lăţirii de bandă ( vezi şi cap. – Cromatografia de lichide) influenţa difuziei longitudinale fiind importantă dtorită coeficientului de difuzie mai ridicat cu 3-4 ordine de mărime la gaze faţă de cel al lichidelor.

II.2.1. Aparate folosite în gazcromatografia de gaze

Un gazcromatograf respectă schema bloc din figura avînd particularităţi specifice pentru analiza unei faze gazoase schema lui de principiu arată ca în figura II.2.

Fig.II.2. Schema de principiu a unui gazcromatograf. 1-butelie de gaz purtător, 2-reductor de presiune, 3 - manometru de înaltă presiune, 3- manometru de joasă presiune, 5- regulator de presiune şi debit, 6- seringă de injecţie pentru substanţe de analizat în stare iniţială lichidă, 7-dispozitiv de evaporare rapidă , 8-cuptor termostatat de încălzire, 9- coloană cromatografică tubulară, 10- detector, 11- amplificator electronic, 12- sistem electronic de achiziţie prelucrare şi afişare date, 13 – calculator, 14- imprimantă

23

Page 24: CROMATOGRAFIE - 2009

II.2.1.1. Alimentarea cu gaz purtător

Gazul purtător trebuie să fie inert din punct de vedere chimic. Din acest punct de vedere intră în discuţie gazele inerte, hidrogenul, azotul şi bioxidul de carbon. Natura gazului utilizat depinde de tipul de detector folosit , iar acesta depinde la rîndul lui de mai mulţi factori dar în principal de clasa de substanţe analizate. Gazele purtătoare de înaltă puritate sînt preluate de regulă din butelii speciale de înaltă presiune prevăzute cu reductoare de presiune ce asigură presiuni de intrare cuprinse între 1,5 şi 3 ata, dar pot fi produse şi pe loc cu generatoare speciale ( hidrogen, azot). Pe traseul gazului purtător se găseşte un debitmetru electronic precum şi o sită moleculară pentru reţinerea vaporilor de apă şi a eventualelor impurităţi solide de dimensiuni mici.

II.2.1.2. Sistemul de injecţie

Caracteristicile sistemului de injecţie asigură în mare parte calitatea analizelor cromatografice, fiind responsabile de lăţirea de bandă a peak-urilor. Un sistem

Fig.II.3. Fazele de injecţie ale amestecului lichid de analizat

performant de injecţie trebuie să asigure injecţia în timp scurt a unor cantităţi extrem de mici de subsatanţă de analizat numai aşa sînt asigurate peak-uri înguste la bază. Extragerea probei se face dintr-un minirecpient cilindric de sticlă aşezat pe suportul mobil a autosamplerului prin intermediul unei microseringi speciale acţionată automat. Acul seringii perforează un dop de cauciuc siliconic sau şi absoarbe o cantitate bine definită de probă, figura II.3. , după care se ridică automat , se deplasează şi injectează proba printr-un “semptum” prevăzut cu un dop de cauciuc siliconic într-un dispozitiv de evaporare rapidă situat la intrarea în coloană. Este foarte important ca evaporarea să se producă practic instantaneu astfel încît amestecul fazei purtătoare cu substanţa de analizat să se producă chiar la baza coloanei cromatografice. Volumul unei probe analizate pentru coloane analitice normale variază de la cîţiva μl la cca 30 μl, la coloane capilare volumul probei este mult mai mic de cîtiva nl fiind necesară folosirea unui sistem de splitare ( divizare), figura II.4., a volumului probei , sistem care asigură preluarea pentru analiză numai a unui volum extrem de mic restul fiind purjat în mediu.

24

Page 25: CROMATOGRAFIE - 2009

Aceste sisteme de splitare sînt în principiu divizări de debit cu tuburi de tip “T”, existente atît pe traseul gazului purtător cît şi pe cel al amestecului gazos, pe ale cărori ramuri se crează rezistenţe hidraulice bine controlate astfel încît să poată fi purjată cea mai mare parte din substanţa de analizat, pe coloană ajungînd numai o parte infimă de amestec şi gaz purtător aşa cum de altfel este necesar. Manipularea a unor cantităţi

Fig. II.4. Două procedee de splitatare a volumului probei la cromatograful de gazea-cu splitare, b- fara splitare, 1-debitmetru, 2-port de injectie (sepptum), 3- tub de evaporare cu dop de vata de sticlă sau de cuarţ , 4 corpul dispozitivului de injecţie , 5- ventil cu trei căi, 6- ventil cu ace cu debit reglabil , 7- regulator de presiune

mici de probă, aşa cum este cazul la gazcromatografie, pe cale manuală duce la erori importante motiv pentru care pentru dozare şi injecţie sînt recomandate dispozitive de tip autosampler.

II.2.1.3. Coloane cromatografice

Termenul de coloană cromatografică este oarecum impropriu pentru cromatografia de gaze, el provine incă din timpul în care se foloseau coloane cu umplutură de lungimi rezonabile care încăpeau în gazcromatograf sau care erau montate în poziţie verticală lîngă aparat avînd o termostatare concentrică. Diametrul interior al coloanelor cu umplutură pentru gazcromatografie este de 4,6 mm, 3,18 mm sau la aşa numitele coloane “micro” <1mm. Acest tip de coloane este astăzi extrem de rar folosit din cauza faptului că au o capacitate de separare redusă şi o rezoluţie slabă. Astăzi sînt folosite cu precădere coloane capilare care se prezintă sub forma unor tuburi metalice de cupru , oţel inoxidabil sau din sticlă cele din urmă fiind trase într-un film de poliamidă sau de aluminiu pentru a le mări rezistenţa mecanică la incovoiere.

25

Page 26: CROMATOGRAFIE - 2009

“Coloanele capilare ” sînt goale, au diametre interioare submilimetrice şi lungimi de zeci de metrii putînd depăşi chiar şi o sută de metri. Coloanele capilare au capacitate de separare şi rezoluţie mare în schimb din cauza cantităţilor extrem de mici de substanţă analizată au au o limită de detecţie scăzută şi un timp de analiză mai ridicat. Asa cum s/a ar[tat deja din cauza volumului extrem de mic necesar într-o coloană capilară , de ordinul μl sau chiar nl, ale amestecului gazos de analizat înainte de intrarea în coloana cromatografică se foloseşte “splitarea” (divizarea) probei ,prin această operaţie numai o mică parte a acesteia, la limita dozării volumice, este admisă în colană cealaltă parte fiind purjată în atmosferă. Cantitate mică de substanţă analizată este motivul limitei de detecţie mai scăzute la cromatografia de gaze. Atît coloanele cu umplutură cît şi cele capilare pot funcţiona în regim de cromatografie de absorbţie (gaz- solid) sau în regim de cromatografie de repartiţie (gaz - lichid). La folosirea coloanelor cu umplutură pentru cromatografia de absorbţie umplutura este formată dintr-un absorbant foarte fin, figura, iar la cromatografia de repartiţie umplutura este formată dintr-un material poros figura II.5, a cărui suprafaţă este impregnată cu o fază lichidă staţionară.

Fig.II.5. Tipuri de coloane utilizate în gazcromatografie. a- coloane cu umplutură pentru cromatografia de absorbţie, 1-perete coloană, 2-umplutură poroasă . b-coloane cu umplutură pentru cromatografia de repartiţie, 1-perete coloană, 2- umplutura, 3-fază staţionară lichidă depusă pe umplutură, 3-umplutură. c-coloană capilară cu film lichid subţire, 1-perete coloană, 2-film lichid , d-coloană capilară cu strat subţire impregnat cu lichid, 1-perete coloană, 2- film lichid, 3-strat granular subţire.

La folosirea coloanelor capilare se deosebesc coloane cu film şi capilare cu strat. La coloanele capilare cu film, figura, faza staţionară aderă sub forma unui film subţire de peretele interior neted al coloanei capilare iar la coloanele capilare cu strat, figura, faza stationară este aplicată sub forma unui strat subţire de diatomee impregnat cu faza lichidă staţionară. În cadrul cromatografiei de gaze sînt valabile tot relaţiile stabilite la ceromatografia de lichide cu condiţia ca influenţa temperaturii şi a presiunii să fie redusă la maxim. În acest scop procesul de sparare în coloană trebuie să fie izoterm iar trecerea amestecului în fază gazoasă cît mai rapid posibil. Pentru alegerea corectă a unei coloane pentru gazcromatografie este nevoie să se ţină cont de următoarele:

26

Page 27: CROMATOGRAFIE - 2009

- proprietăţile negative ale unei coloane ( cost, timp de analiză, absorbţie reziduală) sînt proporţionale cu lungimea crescînd deci cu creşterea acesteia

- singura proprietate pozitivă a coloanei şi anume capacitatea ei de separare creşte abia cu pătratul lungimii coloanei, acesta fiind şi motivul folosirii unor coloane de lungime medie de 20 -30 m în locul unor lungimi ce pot depăşi 100 m. Afară de aceasta la coloane scurte scade timpul de analiză şi absorbţia reziduală deoarece ea este proporţională cu lungimea drumului parcurs de faza mobilă în mediul absorbant

- Atunci cînd se solicită o separare avansată se vor folosi coloane de lungime mare cu recomandarea ca drept gaz purtător să se folosească hidrogenul deoarece se reduc sensibil timpii de analiză.

- Reducerea timpului analiză prin mărirea presiunii iniţiale a gazului purtător duce la reducerea capacităţii de separare a coloanei capilare

II.2.1.4. Cuptoare de termostatare

Temperatura coloanei este un parametru esenţial pentru gazcromatografie deoarece ea provoacă practic gradientul de presiune ce transportă gazul prin coloană. Creşterea Temperaturii duce la creşterea exponenţială a presiunii amestecului gazos care la rîndul ei duce la creşterea vitezei de migrare reducînd sensibil timpul de retenţie. În general se consideră că o creştere atemperaturii cu cca 300C duce la reducerea la jumătate a timpului de retenţie. În realitate nu interesează viteza absolută de migrare ci viteza relativă de migrare vr ca fiind raportul dintre viteza medie vma liniară a substanţei analizate raportată la viteza medie vmp a gazului purtător:

valoarea vitezei relative de migrare se situează între 0 şi 1, ceea ce înseamnă că la valoarea zero nu are loc nici o migrare, temperatura fiind prea mică, iar la valoarea 1 nu are loc nici o separare deoarece amestecul de de analizat traversează coloana cu aceeşi viteză cu gazul purtător nefiind reţinuţi diferenţiat în timp diferiţii componenţi. Care valoare intermediară între zero şi 1 este optimă depinde în mare parte de dificultatea separării. Temperatura optimă a coloanei depinde de temperatura de fierbere şi de gradul de separare. Pentru amestecuri a căror temperatură de evaporare se situează într-un domeniu destul de apropiat se poate spune cu o apreciere relativ bună că o temperatură egală sau ceva mai mare decît temperatura medie de evaporare a probei duce la un timp de eluţie apreciat de cca 4-30 minute ceea ce reprezintă valori acceptabile. Dacă se foloseşte acest raţionament se apelează la regimul de lucru izoterm (temperatura coloanei constantă). In cadrul lucrului în regim izoterm valoarea temperaturii trebuie menţinută constant în limitele ±0,1 0C motiv pentru care coloana se găseşte într-un cuptor termostatat . În cazul unor probe cu un interval mare de fierbere este de dorit să fie folosit un program de temperatură în cadrul căruia temperatura este crescută fie în mod continuu fie în trepte . La injecţie proba se găseşte la temperatura cea mai scăzută optimă pentru componentele volatile dar necorespunzătoare pentru componentele cu temperatură de vaporizare mare. În timpul analizei temperatura este crescută progresiv pînă cînd se obţine în final temperatura corespunzătoare componentelor volatile. În cadrul programelor de temperatură nu

27

Page 28: CROMATOGRAFIE - 2009

trebuie depăşită însă temperatura care duce la valorii mai mari de 1 a vitezei relative de migrare vr

II.2.1.5. Detectoare pentru gazcromatografie

II.2.1.5.1. Caracteristicile detectoarelor

La ieşirea din coloana gascromatografice există condiţii optime de măsurare pentru multe tipuri de detectoare deoarece aici ies pe rînd substanţe gazoase pure cu o diluţie ideală realizată cu un gaz inert. Pentru identificări calitative este indicată folosirea de spectrometre la ieşirea gazcromatografelor. Cele mai utilizate combinaţii sînt: gazcromatograf- spectrometru de masă ( GC-MS) sau gazcromatograf- spectrometru în infraroşu cu transformată Fourier (GC-FTIR). Pentru analiza cantitativă a probelor ( probe a căror compoziţie calitativă este deja cunoscută) s-au impus cîteva detectoare utilizate la ora actuală la scară mare acestea se clasifică după principiul lor fizic în:

- Detectoare sensibile la variaţie de concentraţie - Detectoare sensibile la variaţie de debit masic

La detectoarele sensibile la variaţie de concentraţie semnalul electric al detectorului este proporţional cu concentraţia momentană a substanţei ( i) din volumul din imediata vecinătate a detectorului. La un detector sensibil la variaţie de debit masic semnalul electric al detectorului este proporţional cu debitul masic (Mi), adică cu masa de substanţă ce trece în unitatea de timp prin dreptul detectorului. Detectoare sensibile la variaţia de concentraţie sînt influenţate de debitul de gaz purtător motiv pentru care debitul de gaz purtător trebuie reglat automat în vederea menţinerii constante a valorii lui. Influenţa debitului de gaz purtător nu se manifestă la detectoarele sensibile la variaţie de debit masic.

Sensibilitatea S a detectorului reprezintă nivelul de conversie a mărimii fizice neelectrice într-o mărime electrică proporţională. La detectoarele sensibile la

Fig.II.6. Componente dăunătoare ale semnalului electric al detectoarelor

28

Page 29: CROMATOGRAFIE - 2009

variaţie de concentraţie sensibilitatea detectorului este dată de raportul dintre semnalul electric Ei şi concentraţia substanţei i din gazul purtător, iar la detectoare sensibile la variaţie de debit masic sensibilitatea este dată de raportul dintre semnalul electric Ei şi debitul masic Mi - masă în unitate de timp). Prin înregistrarea semnalului electric al detectorului (potentialul electric E-mV sau curentul electric I-mA) în funcţie de timp se obţine cromatograma. Semnalul electric al unui detector conține pe lîngă semnal electric util şi componente dăunătoare sau parazite precum: abateri, zgomot de fond , drift (plajă de variaţie) , figura II.6., care pot duce la erori importante de măsurare. Abaterile periodice îşi au originea în reglările periodice automate ale temperaturii şi debitului gazului pe cînd oscilaţii neperiodice trebuie puse mai ales pe seama coloanelor de separare incălzite incomplet sau murdare. Zgomotul de fond are frecvenţă ridicată este specific fiecărui detector şi electronicii sale aferente şi se manifestă mai ales atunci cînd amplificarea electronică a semnalului este mare. Componentele parazite din semnalul electric se determină în felul următor: din semnalul înregistrat al detectorului în funcţie de timp se alege întimplîtor un interval de 15 minute si se trasează pe ambele părţi ale liniei de bază a semnalului două linii paralele în aşa fel încît aceste linii să atingă tangenţial intr-un interval de cca 10 minute peak-urile (virfurile) a cele mai mari. Drift-ul , figura , este definit ca fiind înclinaţia celor două linii paralele faţă de abscisă. Abaterile sînt definite ca distanţa între cele două linii. Pentru stabilirea mărimii zgomotului de fond se alege intervalul de un minut care prezină cel mai mare zgomot. Nivelul zgomotului de fond se determină prin mărimea distanţei între cele două linii paralele ce unesc vîrfurile semnalului de zgomot.

Limita de detectare Ld reprezintă concentraţia [mg/l] sau debitul masic [g/s] a substanţelor analizate de valoarea cea mai mică care sînt detectabile cu un senzor cromatografic adecvat: Pentru descrierea capacităţii unui senzor folosit în cromatografie se foloseşte exclusiv limita de detectabilitate şi nu sensibilitatea lui. Limita de detectabilitate se determină din raportul dintre nivelul p a tuturor semnalelor parazite praportat la sensibilitate S:

Ld =p/S

Numai atunci cînd diferenţa E între valoarea mărimii măsurate şi valoarea medie a unei analize oarbe este de trei ori mai mare decît abaterea standard (s) a tuturor semnalelor parazite p se poate susţine cu o siguranţă de 99% că că un punct de măsurare oarecare P de pe cromatogramă reprezintă un punct a semnalului util şi nu a componentelor parazite ale semnalului. La acest raţionament se iau în calcul numai abaterile pozitive ale Peak-urilor de la valoarea medie ( jumătatea semnalului de eroare). Acest concept teoretic , dealtfel perfect valabil, este modificat în practica cromatografică în sensul că se iau în considerare atît abaterile pozitive cît şi cele negative , măsurătorea făcîndu-se ” vîrf – vîrf”. Din aceste măsurători ar rezulta prin împărţire un factor f , (f = 1,5 (în loc de 3) pentru distanţa punctului de măsurare P de la valoarea mediană a semnalului de abatere . de regulă pentru calculul limitei de detectabilitate Ld se fololoseşte un factor f =1,2 – 2:

Ld = (1,5...2) semnal de abatere /Si

Ld = (5...10) semnal de abatere /Si

29

Page 30: CROMATOGRAFIE - 2009

În conformitate cu alte standarde sînt folosite şi alte valori pentru factorul f, de ex IUPAC recomandă f = 3.

Limita de determinare reală Ldet reclamă valori mai mari pentru (f) decît în cadrul limitei de detectare, astfel valoarea acestuia trebuie să fie cuprinsă între 5-10 corespunzător cu siguranţa statistică cerută pentru rezultatul măsurătorilor.

Constanta de timp (τ) , figura II.7. a unui detector cromatografic, inclusiv a electronicii aferente, reprezintă timpul care trece din momentul iniţierii măsurătorii pînă în momentul în care este indicat 63,2% a întregului semnal. După (5τ) se obţin 99,3 % a întregului semnal

Fig.II.7. Influenţa consatantei de timp asupra timpul de răspuns t

Selectivitatea unui detector Si,j descrie sensibilităţile diferite pentru două materiale diferite i şi j. Selectivitatea Si,j este indicată ca fiind raportul sensibilităţii detectorului pentru cele două substanţe:

Sij= Si/Sj

Dacă sensibilitatea pentru substanţa j se apropie de valoarea unu detectorul este specific pentru substanţa i, (Si = ∞)

Domeniul liniar al unui detector, figuraII.8, reprezintă domeniul unde sensibilitatea Si este constantă . În partea de jos domeniul liniar este limitat prin limita

30

Page 31: CROMATOGRAFIE - 2009

Fig.II.8. Domeniul liniar (a) şi domeniul dinamic (b) al unui detector folosit în cromatografie

de detectabilitate Ld. În partea de sus prin o abatere tolerată de 5% de la dreapta ideală de liniaritate. Pentru exemplificare grafică a domeniului liniar se reprezintă în coordonate dublu logaritmice suprafaţa peak-ului Ai sau a semnalului detectorului Ei în funcţie de cantitatea mi a probei, concentraţia Ci , respectiv faţă de debitul masic Qmii, figura II.8.a, Intr-un alt tip de reprezentare folosită se reprezintă sensibilitatea Si în funcţie de cantitatea de probă folosită mi, în funcţie de concentraţia Ci sau în funcţie de debitul masic Qmii, figura II.8.b. Valoric domeniul liniar se exprimă prin raportul dintre limita superioară a domeniului liniar şi limita de detectabilitate, este obligatorie şi indicarea naturii substanţei analizate i. Domeniul dinamic al detectorului este plasat în continuarea domeniului liniar şi reprezintă domeniul în care o modificare a concentraţiei sau a debitului masic mai provoacă o modificare sensibilă şi posibil de calibrat a semnalului detectorului, figura II.8.a,b.

II.2.1.5.2. Detectorul de ionizare cu flacără ( FID)

Detectorul de ionizare cu flacără, figura II.9, este un detector folosit pentru substanţe organice ( hidraţi de carbon) ce are aplicaţia de bază la cromatografele de gaze deoarece îmbină o sensibilitate ridicată cu robusteţea. Un detector de ionizare cu flacără este de cca 1000 ori mai sensibil decît un detector de conductivitate termică. Alte domenii de aplicare ale acestui detector sînt la supravegherea apelor privind prezenţa de hidrocarburi volatile precum şi la supravegherea poluării atmosferei şi a aerului din spaţii interioare cu hidrocarburi gazoase. Principiul detectorului se bazează pe măsurarea conductivităţii electrice unei flăcări de hidrogen plasată între doi electrozi. Substanţele de analizat sînt transportate în flacără cu un gaz purtător unde sînt ionizate termic datorită aportului de căldură din flacără. În felul acesta în cîmpul electric dintre cei doi electrozi apare un curent ionic măsurabil care este înregistrat în funcţie de timp de către înregistrator sub formă unor vîrfuri (Peak-uri) cu aplicaţii în analiza chimică calitativă. Intensitatea semnalului electric al detectorului (înălţimea maximă al Peak-ului) este liniară şi proporţională cu conţinutul de hidrocarbură într-un domeniu foarte larg de concentraţie , cu aplicaţii în analiză cantitativă. Din acest motiv concentraţia unei hidrocarburi poate fi determinată direct din semnal fără a se folosi curbe de etalonare. Unele substanţe organice ( de ex. acidul formic, acetaldehida) au detectabilitate slabă . Alte substanţe precum: gazele nobile, H2 , N2, NO2 , CO, CO2 , H2O , CS2 , NH3 , 02 , CCl4 sau alte legături de halogen , halogenuri de siliciu

31

Page 32: CROMATOGRAFIE - 2009

Fig.II.9. Schema de principiu a detectorului gazcromatografic de tip FID. 1-arezător, 2-flacără de hidrogen, 3,4- electrozi colectori de electroni, 5 – amplificator electronic, 6- sistem electronic de prelucrare şi afişare

Sistemul cromatospectrometric prezentat in figura II.10 permite determinarea concomitentă a compoziţiei calitative şi cantitative moleculare precum şi a celei calitative şi cantitative atomice din amestecuri complexe de gaze. În acest scop este folosit un gazcromatograf echipat cu detector FID dispozitivat cu o structură spectrometrică modulară formată dintr-o sondă, compusă la rîndul ei dintr-o lentilă colimatoare, o fibră optică, un spectrometru miniatural compact echipat cu reţea de difracţie fixă , detector Diode- Aray, soft pentru prelucrare informaţii spectrale de emisie atomică precum şi un sistem de procesare, afişare şi tipărire spectre. Sonda se montează perpendicular pe direcţia de ardere a flăcării de hidrogen şi valorifică emisia spectrală a atomilor elementelor chimice excitate în flacăra de hidrogen la cca 3.000 0C. Informaţia spectrală ajunge prin lentila colimatoare şi fibra optică pe reţeaua de difracţie a unui spectrometru miniatural, iar după difracţie, pe un detector Diode-Array care împreună cu microprocesorul spectrometrului furnizează spectrograma de emisie atomică a speciilor chimice elementare (elemente chimice) prezente in amestecul de gaze analizat.

32

Page 33: CROMATOGRAFIE - 2009

Fig.II.10. Sistem combinat cromatospectrometric. 1-gazcromatograf, 2- detector de ionizare, 3- sistem de adaptare pentru sonda optică, 4-flacără de hidrogen, 5-lentilă colimatoare din sticlă de cuarţ, 6- fibră optică de transmisie, 7-spectrometru cu reţea de difracţie şi detector Diode- Array, 8- sistem de procesare afişare şi tipărire spectre

II.2.1.5.3. Detectorul pentru compuşi de azot şi fosfor (NPD)

Detectorul pentru azot şi fosfor este un detector modificat de tip FID care conţine o sursă alcalină de silicat sub forma unei perle din sticlă sau ceramică dopată cu elemente alcaline, precum K,Rb,Cs, ce eliberează uşor electroni. Perla alcalină este fixată pe o sîrmă de platină între flacăra de hidrogen şi electrozii colectori de electroni ai detectorului, figura fiind încălzită atît pe cale electrică prin sîrma de platină pusă sub tensiune cît şi prin flacăra de hidrogen, în jurul ei formîndu-se un nor termic plasmatic care prin norul de electroni emişi are totdeauna sarcina negativă faţă de sarcina pozitivă a electrozilor colectori . Detectorul NPD poate fi folosit în două moduri:

- ca detector de fosfor (P)- ca detector de azot (NP)

în cazul utilizării lui ca detector de fosfor, figura II.11 a , flacăra de hidrogen arde ca la detectorul FID deasupra arzătorului cu deosebirea că arzătorul este legat la pămînt, figura, deoarece electronii rezultaţi din arderea unor componente ce conţin atomi de carbon , electroni ce constituie semnalul electric la un detector FID , sînt respinşi în acest caz de potenţialul negativ al perlei scurgîndu-se la masă, în schimb electronii ce iau naştere pe suprafaţa perlei alcaline , al căror număr este proporţional cu concentraţia de fosfor, ajung nestingheriţi la electrozii colectori formînd semnalul electric al detectorului. În ce priveşte mecanismul propriuzis de reacţie trebuie arătat că la început se formează în flacără oxizi de fosfor cu un număr impar de electroni , prin fixarea a electronului impar se formează în prima fază anionii diferiţilor acizi fosforici care în flacără sînt oxidaţi în flacără cu radicali OH la acizi neutrii de fosfor ,

33

Page 34: CROMATOGRAFIE - 2009

a) b)

Fig. II.11. Schema de principiu a detectorului pentru: a- fosfor (P), b- azot şi fosfor (N-P). 1-arzător, 2- flacără de hidrogen, 3,4 electrozi colectori de electroni, 5-perlă alcalină, 6-plasmă, 7- amplificator electronic, 8-sistem electronic de prelucrare şi afişare

ocazie cu care electronul fixat este eliberat şi se constituie în semnalul electric al detectorului. La folosirea detectorului pentru compuşi de azot mecanismul este asemănător ca la fosfor deoarece şi şi azotul are un număr impar de electroni care duce la formarea de oxizi numai că aceştia se descompun prea repede şi nu reacţionează cu perla alcalină . Dacă în schimb se scade regimul termic de încălzire al perlei se formează radicali cian care dau reacţie alcalină specifică . Pentru a reduce regimul termic se micşorează debitul de hidrogen la un nivel de cca 1-3 μl/min şi cel de aer la cca 100 μl/min, condiţii în care flacăra de hidrogen se stinge iar aportul slab de hidrogen existent , ca urmare a reducerii debitului acestuia, duce la aprinderea lui în jurul perlei sub forma unui nor plasmatic slab . Radicalii cian formaţi prin piroliză termică fixează un electron iar anionii CN- formaţi reacţionează cu hidrogenul respectiv cu radicali OHo cu formare de compuşi neutrii de tip CO2, H2O, N2 cu eliberarea unui electron ce se constituie , aşa cum s-a mai arătat, în semnalul detectorului .

Detectorul azot - fosfor este un detector selectiv putînd fi folosit în principiu pentru toate elementele care au un număr impar de electroni , inclusiv pentru compuşi volatili de bor şi arsen , utilizarea lui de bază este totuşi cea pentru compuşi fosfor şi azot în regimul de lucru N-P, figura II.11 b. În regimul de lucru numai pentru fosfor (regimul P) detectorul este selectiv pentru compuşi de fosfor dar are sensibilitatea mai redusă ca în regimul de lucru N-P. Un mod de lucru numai pentru azot (regim de lucru de tip N) nu este posibil fiind indicate alături de compuşi de azot totdeauna şi compuşi de fosfor , bineînţeles dacă aceştia sînt prezenţi în amestecul de subsatanţe analizate

II.2.1.5.4. Detectorul de conductivitate termică

Detectorul de conductivitate termică este unul din cele mai vechi detectoare folosite în cromatografie. El se bazează pe măsurarea continuă a conductivităţii termice a amestecului de gaze compus dintr-un gaz purtător şi amestecul gazos de analizat, figura. Conductivitatea termică este o mărime fizică specifică naturii şi concentraţiei substanţelor. Amestecuri de gaze de compoziţii şi concentraţii diferite ce scaldă cei patru rezistori încălziţi ai punţii Wheatstone modifică proporţional cu natura şi cu

34

Page 35: CROMATOGRAFIE - 2009

concentraţiilor substanţelor rezistenţa acestor rezistori ducînd la apariţia unei tensiuni de dezechilibru a punţii.

Fig.II.12. Schema de principiu a unui analizor de gaze bazat pe principiul punţii Wheatstone. 1- amplificator electronic, 2- sistem electronic de achiziţie , prelucrare şi afişare, R1,R2, R3, R4 - rezistori din platină încălziţi electric

Detectorul de conductivitate termică , figura II.12, este format dintr-un bloc metalic compact bine termostatat în care se găsesc patru celule de gaz identice prevăzute cu filamente de platină sau de wolfram , sub formă de sîrmă, legate electric într-o punte de tip Wheatstone. În detector se realizează o măsurare comparativă de compensaţie. În acest scop prin două celule, situate pe două laturi opuse ale braţelor punţii, trece gazul purtător pur, iar prin celelalte două braţe ale punţii trece gazul purtător în amestec cu gazele pentru analizat. Toate filamentele sînt parcurse de un curent electric care provoacă încălzirea acestora prin efect Joule-Lenz. Temperatura sîrmelor şi prin aceasta şi rezistenţa lor electrică depinde de conductivitatea termică a gazelor ce trec prin celule. Modificări ale compoziţiei gazelor provoacă prin conductivităţile lor termice specifice modificări corespunzătoare de temperatură şi prin această modificări ale rezistenţei electrice a filamentelor de sîrmă. Diferenţele de temperatură a filamentelor în celulele de măsurare şi în celulele de referinţă duc la un dezechilibru electric măsurabil al punţii Wheatstone. Timpul la care se produce acest dezechilibru este proporţional cu natura substanţei care traversează la acel moment două braţe opuse ale punţii , iar valoarea dezechilibrului este proporţională cu concentraţia acelei substanţe din amestecul de gaze analizat. Detectorul de conductivitate termică este un detector universal, utilizabil la aproape toate substanţele, singurele îngrădiri sînt la substanţe puternic corozive care distrug filamentele, dar are o sensibilitate destul de scăzută.

II.2.1.5.5. Detectorul cu capcană de electroni (ECD)

Detectorul cu capcană de electroni (ECD engl. Electron Capture Detector), este un detector specific pentru gazcromatografie folosit în analiza substanţelor sulfuroase, substanţelor cu azot şi a substanţelor halogenate ( ex. PCB, Lindan, etc). Aplicaţiile de

35

Page 36: CROMATOGRAFIE - 2009

bază sînt în analiza urmelor şi în chimia mediului. Detectorul este format dintr-o cameră de ionizare ce conţine un catod şi un anod şi un flux continuu de gaz. Pentru ionizare sînt folosite radiaţii (ß) emise de o sursă radioactivă sub forma unei folii foarte subţiri al izotopului Ni63, sursa de radiaţii constituie totodată şi catodul, figura II.13. Descompunerea radiaţiei (ß) duce la emisia de electroni primari care se ciocnesc cu moleculele (N2) ale gazului purtător şi ca urmare iau naştere ioni N2 încărcaţi pozitiv şi electroni secundari liberi. Prin aplicarea unei tensiuni între cei doi electrozi apare un cîmp electric prin care electronii secundari liberi se deplasează spre anod unde produc un curent electric de cîţiva nanoamperi numit curent de ionizare de bază. Dacă în amestecul de gaze este un gaz cu afinitate mare faţă de electroni atunci această substanţă colectează o mare parte din electronii liberi ceea ce duce la micşorarea curentului de ionizare de bază. Această micşorare afectează proporţional curentul de bază şi reprezintă semnalul util al detectorului. Detectorul cu capcană de electroni reacţionează la substanţe cu afinitate de electroni cum sînt de exemplu substanţe halogenate precum şi anumite pesticide. Sistemul clasic cu măsurarea curentului de ionizare de bază, descris mai sus, are dezavantajul unui domeniu liniar redus, motiv pentru care în aparate moderne se foloseşte alt sistem de lucru. Astfel se aplică un impuls de tensiune cu frecvenţă variabilă . În momentul în care există semnalul de tensiune (0,5 pînă la 1μs), electronii care nu au reacţionat cu substanţele amestecului de gaze din gazul purtător sînt colectaţi de anod. Timpii de pulsare a semnalului electric se aleg aşa de scurţi pentru ca ionii grei, rezultaţi ca urmare a absorbţiei de electroni, să nu poată ajunge la anod. Frecvenţa semnalelor electrice aplicate nu este constantă ci modificată continuu în sensul asigurării unei intensităţi de curent constante. Dacă în detector intră prin amestecul de gaze un număr mare de molecule electrofile pentru compensarea scăderii sub limită a curentului (ca urmare a scăderii numărului de electroni) se măreşte frecvenţa curentului. La acest mod de lucru semnalul util al detectorului nu-l mai reprezintă micşorarea curentului de ionizare de bază ci modificarea frecvenţei tensiunii aplicate în scopul menţinerii constante a intensităţii curentului , frecvenţa semnalului fiind proporţională cu concentraţia moleculelor captoare de electroni. Prin timpul de pauză între semnale se asigură în limite largi un număr de electroni liberi constant , ceea ce însemnă că şi la concentraţii mari ale substanţei de analizat sînt suficienţi electroni la dispoziţie pentru ionizare. Numărul de electoni se adaptează concentraţiei substanţei de analizat prin acesta extinzîndu-se sensibil şi domeniul liniar.

36

Page 37: CROMATOGRAFIE - 2009

Fig.II.13. Schema de principiu a detectorului gazcromatografic de tip ECD. 1 Camera de ionizare, 2- folie de izotop Ni63, 3- amplificator electronic, 4- sistem electronic de prelucrare şi afişare

Tab.II.1. Sensibilitatea aproximativă pentru diferite clase de compuşi organici

Gruparea chimică Sensibilitatea relativă

Hidrocarburi 1

eteri, esteri 10

Alcoli alifatici, cetone, amine 100

Legături mono-Cl- şi mono-F-, mono-Br-, legături di-Cl şi di-F 1000

Aldehide şi legături tri-Cl 104

Legături mono-J-, di-Br- şi legături nitro 105

Legături di-J-, tri-Br-, legături poly-Cl şi poly-F 106

Valorile din tabel 1 sînt valori aproximative dar corecte din punct de vedere al ierarhizării. Sensibilitatea variază destul de mult chiar în cadrul aceleiaşi grupări chimice deoarece ea depinde de structura legăturilor .

II.2.1.5.6. Detectorul de emisie atomica

Detectorul de emisie atomică (AED - Atomic Emission Detector), figura II.14, reprezintă o realizare relativ recentă fiind legat în principal de evoluţia detectorului de tip Diode- Array. Eluatul ce părăseşte colana cromatografică este introdus într-o plasmă termică de heliu generată într-un cuptor cu microunde . Energia înaltă a plasmei atomizează toate elementele din probă provocînd emisie atomică specifică a acestora . Prin decompunerea radiaţiei rezultate cu o reţea de difracţie rezultă spectrul atomic al probei care este preluat de un detector Diode – Array. Marele avantaj al acestui tip de detector este analiza multiplă fiind posibilă detectarea mai multor elemente în acelaşi timp. Profitînd de prezenţa unei plasme de înaltă energie deja existentă la spectrometrele clasice cu plasmă cuplată inductiv (ICP-MS), la ora actuală se realizează combinaţii deosebit de performante între cromatografe HPLC şi spectrometrele cu plasmă cuplate inductiv (HPLC-ICP-MS) şi gazcromatografe şi spectrometre cu plasmă cuplate inductiv (GC -ICP-MS). Aceste combinaţii sînt avantajoase ca preţ de cost deoarece un cromatograf clasic beneficiază de o plasmă termică deosebit de performantă generată de un alt aparat , respectic un spectroscop cu plasmă cuplată inductiv (ICP) prezent poate chiar în acelaşi laborator.

37

Page 38: CROMATOGRAFIE - 2009

Fig.II.14. Schema de principiu a detectorului de emisie atomică. 1-cameră cu plasmă termică dată de microunde, 2- plasmă termică, 3-oglindă plană de reflexie, 4- retea de difracţie, 5-detector Diode-Array, 6-amplificator electronic, 7- sistem electronic de achiziţie , prelucrare şi afişare

II.2.1.5.7. Detectorul cu fotoionizare

Folosirea detectorului cu fotoionizare, figura II.15, în cromatografia de gaze se datorează atît selectivităţii cît şi sensibilităţii sale ridicate la detectarea hidrocarburilor

Fig.II.15. Schema de principiu a detectorului cu fotoionizare. 1-cameră de ionizare cu radiaţii ultraviolete, 2,3- electrozi, 4- lampă de ultraviolete, 5- amplificator electronic, 6- sistem electronic de prelucrare şi afişare

aromatice sau a speciilor organice cu heteroatomi . Acest tip de detector utilizeză ionizarea cu radiaţii ultraviolete a compuşilor ce părăsesc coloana cromatografică după următorul model:

Doi electrozi colectează electronii rezultaţi ca urmare a ionizării, electroni ce formează de fapt semnalul electric al detectorului. Nivelul acestui semnal este proporţional cu gradul de ionizare , iar acesta la rîndul lui este proporţional cu concentraţia specieiei anlizate ce se găseşte în acel moment în camera de ionizare.

38

Page 39: CROMATOGRAFIE - 2009

II.3. CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTA PERFORMANTA (HPLC)

CROMATOGRAFIA DE LICHIDE

În cadrul cromatografiei in lichide (LC) se disting mai multe variante, în functie de mecanismele de separare, astfel există :

- cromatografia de lichide pe coloana inchisa;- cromatografia de lichide pe coloana deschisa;

In cadrul cromatografiei de lichide pe coloana inchisă sînt cunoscute metodele: 1. Cromatografia de adsorbtie utilizata pentru separarea substantelor organice cu

molecule de dimensiuni mici si medii pe adsorbanti, ca silicagel si alumina, folosindu-se, ca faze mobile, diferite amestecuri de solventi organici.

2. Cromatografia ionica (de schimb ionic), care se petrece pe o faza stationara solida, poroasa, formata din materiale specifice - schimbatorii de ioni - substante cu o retea solida afânata, de natura organica sau anorganica. Cele mai raspândite sunt rasinile schimbatoare de ioni.

3. Cromatografia de excluziune sterica se desfasoara pe faze stationare poroase dar cu porozitatea selectionata astfel încât sa corespunda dimensiunilor moleculelor supuse separarii. O parte dintre molecule intra prin pori, iar altele sunt excluse deplasându-se practic neretinute odata cu faza mobila. Tehnica se mai întâlneste si sub denumirea de filtrare prin geluri sau permeatie prin geluri în functie de natura apoasa sau organica a fazei mobile.

4. Cromatografia lichid-lichid (LLC), în care faza stationara este o faza lichida, nemiscibila cu cea mobila si imobilizata pe un suport solid, într-o coloana. Aici suportul solid este inert fata de componentele din proba. Acesta tehnica este cea mai raspândita devenind aproape sinonima cu cromatografia de lichide. In cadrul cromatografiei de lichide pe coloana deschisa faza mobila circula printr-un

material poros dispus într-un plan si formând un strat relativ subtire, dar de compozitie asemanatoare cu cele mentionate la cromatografia pe coloana închisă. Se disting metodele : 1. Cromatogafia pe hârtie, tehnica în care faza stationara este o hârtie poroasa din

celuloza (initial o hârtie de filtru) care este irigata de solvent prin forte capilare.2. Cromatografia pe strat subtire (TLC), în care faza stationara pulverulenta este fixată de suportul plan (sticla, aluminiu, material plastic) cu un liant, formând un strat subtire (0.1- 0.5mm) de asemenea irigata prin capilaritate. 3. Cromatografia pe strat subtire de înalta performanta (HPTLC), în care faza stationara are granulatie extrem de fina ridicându-se astfel eficienta separarilor dar si viteza acestora.

Cromatografia HPLC

39

Page 40: CROMATOGRAFIE - 2009

Cromatografia de lichide de înaltă performanţă ( engl. HPLC - High Performance Liquid Chromatography ) cunoscută în literatură şi sub denumirea de cromatografie de înaltă presiune (High Pressure Liquid Chromatography) este metoda cromatografică cea performantă şi este folosită în separarea şi identificarea calitativă şi cantitativă a substanţelor din amestecuri lichide. Separări şi analize de substanţe imposibul de realizat prin alte metode pot fi realizate uşor prin HPLC. Pe de altă parte la această tehnică pot fi făcute şi multe greşeli. Acesta este motivul pentru care este nevoie de o experienţă practică bogată dar şi de cunostiinţe stiinţifice fundamentale. Avînd în vedere că atît în cromatografia de gaze (GC) cît şi in cromatografia de lichide HPLC starea de agregare iniţială a probelor este cea lichidă trebuie luată decizia asupra metodei cromatografice folosite pentru acel amestec. In acest scop trebuie avute în vedere următoarele:

- la cromatografia de gaze proba trebuie adusă în stare gazoasă prin încălzire fără ca această operaţie să ducă la distrugere integrităţii moleculare a speciei anlizate , in practică numai cca 20 % din speciile moleculare îndeplinesc această condiţie [LINDSAY

- la cromatografia de gaze detectorii au universalitate mai mare şi au limite de detecţie mai bune decît la cromatografia de lichide

- comportarea speciilor moleculare polare sau ionizabile au o comportare cromatografică necorespunzătoare în gazcromatografie ca urmare analiza lor trebuie făcută in cromatografie lichidă

- în cromatografia de gaze există numai o singură fază staţionară care poate interacţiona cu moleculele probei , faza solidă sau faza lichidă, cu aceasta fază poate absorbi proba gazoasă în orice raport

- în HPLC atît faza staţionară cît şi cea mobilă pot interacţiona mai selectiv cu proba . Multitudinea acestor interacţiuni selective face cromatografia HPLC multilaterală faţă de cromatografia de gaze cu ea putînt fi rezolvate probleme de separare avansată deosebit de complexe.

- În situaţiile în care ambele metode pot fi aplicate decizia este pentru gazcromatografie aceste analize au sensibilitate mai mare şi sînt mai rapide, iar dacă este vorba de determinări curente la anumite clase de compuşi trebuie avut in vdere că un gazcromatograf este sensibil mai ieftin decît un cromatograf pentru HPLC.

La cromatografia HPLC faza mobilă purtătoare denumită "Eluent" împreună cu substanţele lichide de analizat este pompată cu ajutorul unei pompe printr-o coloană cromatografică de separare ce conţine faza staţionară. În mod obişnuit înaintea coloanei de separare propriu zise se cuplează o pre - coloană de separare pentru reţinerea impurităţilor, coloană care este sensibil mai ieftină decît coloana de bază. O coloană de separare într-un cromatograf HPLC are lungimea cuprinsă între 5 şi 30 cm iar debitul de fază mobilă este cuprins între 1-5 ml/min.

La ora actuală există următoarele metode de cromatografie de lichide :- cromatografie prin absorbţie- cromatografie prin repartiţie- cromatografie prin schimb ionic- cromatografie de excludere cromatografie prin gel

La cromatografia schimbătoare de ioni faza stationară este este o răşină schimbătoare de ioni iar gradul de separare este dat de intensitatea interacţiunilor intre

40

Page 41: CROMATOGRAFIE - 2009

ionii probei şi grupele schimbătoare de ioni din răşină . In cromatografia de excludere ca fază staţionară este folosit un gel cu pori mari care poate separa moleculele după mărime şi formă , la acest tip de cromatografie moleculele mari traversează cel mai rapid sistemul cromatografic. Cromatografia cu lichide supracritice

Dacă în timpul separarii cromatografice compoziţia substanţei de analizat rămîne constantă tehnica de cromatografică este denumită eluţie izocratică. Dacă compoziţia fazei analizate este schimbată în timpul procesului de separare după o modalitate prestabilită, tehnica poartă denumirea de eluţie de gradient .Cea din urmă tehnică este folosită atunci cînd domeniul timpilor de retenţie a moleculelor din probă este atît de mare încît acetes nu pot fi eluate într-un timp rezonabil cu un solvent pur sau cu un amestec de solvenţi.

Detectorii folosiţi în HPLC lînt detectori selectivi, ceea ce înseamnă că ei nu răspund la toate moleculele existente înt-un amestec ci numai la anumite molecule sau clase de compuşi. In cromatografia de lichide încă nu există un detector universal şi de inaltă sensibilitate aşa cum este de exemplu detectorul de ionizare cu flacără FID din cadrul cromatografiei de lichide, în schimb detectoarele din cromatografia de lichide acoperă un număr mult mai mare de substanţe decît cele din cromatografia de gaze. Unele molecule de probe sînt greu de detectat în HPLC şi trebuiesc aduse după părăsirea coloanei cromatografice într-o formă detectabilă tehnică denumită derivatizare după coloană. Ca şi la alte cromatografii în condiţii tehnice date pentru analiza calitativă este definitoriu timpul necesar unei molecule din probă pentru a traversa sistemul cromatografic şi a ajunge la detector, timp denumit timp de retenţie. Dat fiind numărul extrem de mare de substanţe organice unele substanţe au timpi de retenţie identici situaţie în care peak-urile se suprapun putînd da naştere la erori importante de interpretare. Pentru înlăturarea acestui neajuns cele mai importante detectoare pentru HPLC sînt spectrometrele. Tot mai des ieşirile din coloanele cromatografice se cuplează la spectrometre clasice cel mai des folosit fiind spectrometrul de masă (MS) situaţia clasică fiind cea LC-MS sau LC-MS-MS. Aceste combinaţii de aparate au sisteme de performante de prelucrarea datelor ce permit identificarea automată prin compararea electronică a spectrului oricărei specii moleculare, în momentul sosirii ei din coloana cromatografică la spectrometru, cu spectrele etalon din bibliotecă electronică de spectre.

Aparatura folosită în cromatografia HPLC

Cromatografele de lichide de înaltă performanţă sînt formate dint-un sistem de vase cu solvenţi (1) , o pompă de înaltă presiune (3), o coloană cromatografică (6), unul sau mai mulţi detectori (8), şi un sistem de prelucrare a datelor (9), ele mai sînt completate cu elemente de reglare automată a debitului , a presiunii şi a temperaturii. In figura 1 este reprezentată schema de principiu a unui cromatograf de lichide.

41

Page 42: CROMATOGRAFIE - 2009

Fig. 1 Schema de principiu a unui cromatograf de lichide. 1- butelie, 2-ventil înaltă presiune, 3-manometru înaltă presiune, 4-reductor de presiune, 5- manometru de joasă presiune, 6- sistem distribuitor şi dozare heliu, 7,8- recipiente cu solvent, 9- filtru, 10-pompă cu sistem de gradient, 11-sistem de măsurare a presiunii şi a debitului, 12-sistem de introducere probă, 13- xxxx, 14-coloană cromatografică,

7- incintă de termostatare a coloanei, 8-detector, 9-sistem de achiziţie şi prelucrare date, 10-cromatogramă.

Trebuie avut în vedere că în HPLC se folosesc solvenţi organici puternici sau soluâii tampon care pot ataca chimic orice componentă ce se găseşte în traseul lor de la recipientele de stocare pină la detector , ca atare toate materialele folosite pe acest traseu trebuie să prezinte o rezistenţă chimică corespunzătoare. O altă recomandare este aceea ca volumul mort , denumit şi volum extracolumnar, între introducerea probei şi traversarea detectorului să fie menţinut cît mai mic posibil prin aceasta evitîndu-se o lăţire de bandă (vezi şi cap). Reducerea volumului mort se realizează în primul rînd prin măsuri constructive ale furnizorului de cromatograf şi prin de alegerea corespunzătoare a coloanei cromatografice. In continuare vor fi descrise pe rînd elementele componente ale unui cromatograf de tip HPLC

Cromatografia de lichide de înalta performanta (HPLC) acopera azi, în proportie aproximativ 80%, analiza substantelor moleculare: organice, organo-metalice si anorganice inclusiv compusii foarte polari sau labili termic precum si compusii cu masa moleculara ridicata (naturali sau sintetici). De aceea, împreuna cu cromatografia de

42

Page 43: CROMATOGRAFIE - 2009

Fig. II.16. Prezentarea schematica a unui cromatograf de lichide (HPLC) modern gaze constituie un punct de sprijin important în analizele chimice moderne. Desi eficacitatea coloanelor nu o egaleaza înca pe cea din GC, prin faptul ca se poate modifica, pe lânga faza stationara, si faza mobila, cromatografia de lichide (LC) face posibile separari si analize uneori imposibil de realizat prin alte tehnici. Cuplajul cu spectrometria de masa a transformat, în ultimul timp, aceasta metoda în principalul mijloc de analiza a compusilor moleculari naturali sau sintetici, constituind unul din pilonii pe care se sprijina chimia sintetica actuala si pe care s-a dezvoltat biochimia si biotehnologia moderna.

Metoda constituie o evolutie a unei metode mai vechi, cromatografia pe coloana clasica, care servea în primul rând la izolarea preparativa a compusilor naturali. Prin introducerea pompelor si în consecinta, lucrându-se la presiuni tot mai ridicate (200atm), dezvoltarea unor faze stationare performante, de dimensiuni tot mai mici (recent constituite din granule de faze stationare sferice, cu diametre 2-5µm), în coloane tot mai scurte (3-10cm) s-a ajuns, începând cu anul 1969, la configuratia actuala figura II.16. Se poate observa ca din recipientele continând unul sau mai multi solventi pompa (sau pompele), alimenteaza coloana cu eluent (de regula un amestec de doi sau mai multi solventi). În imediata vecinatate a coloanei se introduce proba, automat, prin intermediul unui ventil cu by pass. În coloana aflata într-o etuva termostat, are loc separarea propriu-zisa. Efluentul coloanei intra într-un detector de unde componentul, daca este separat complet, poate fi colectat si izolat, cu ajutorul unui colector de fractiuni. Semnalul este înregistrat fie cu un înregistrator, fie direct în memoria unui calculator. În esenta, un cromatograf analitic HPLC are schema bloc din figura II.17. unde nu s-a mai prezentat colectorul de fractiuni, interesant doar din punct de vedere preparativ. Se poate observa asemanarea cu GC singura deosebire majora constituind-o sursa de eluent – pompa.

43

Page 44: CROMATOGRAFIE - 2009

Solvent → Pompa → Injector → Coloana → Detector → Înregistrator

Fig. II.17. Schema bloc a unui cromatograf HPLC

II. 2.1. Detectori utilizati in cromatografia de lichide de înalta performanta (HPLC)

Tehnica HPLC s-a dezvoltat o data cu perfectionarea detectorilor. Detectorii în cromatografie sunt instrumente analitice specializate, situate la iesirea eluentului dintr-o coloana si care pot înregistra continuu substantele separate de catre aceasta. Deci detectorii constituie acea parte a instrumentatiei care permite sa se observe modul cum decurge separarea prin coloana fara a se vedea componentii propriu zisi ci doar semnalul lor.

Întrucât coloanele de separare performante au capacitati de încarcare mici, sistemul de detectie trebuie sa fie unul foarte sensibil. Totodata, pentru ca în LC volumul de proba este de ordinul microlitrilor (8-10µl), volumul detectorilor trebuie sa fie de volum apropiat pentru a se putea sesiza în mod continuu picul cromatografic.

În calitate de instrumente se poate utiliza, în principiu, oricare dispozitiv de analiza chimica cunoscut, pentru probe lichide, precum si orice combinatii de instrumente fizice. De exemplu, în ultimul timp, combinatia dintre un detector refractometric si unul bazat pe difuzia luminii este extrem de eficace în analiza polimerilor în amestec cu monomeri sau oligomeri dintr-un material. Exista chiar posibilitatea cresterii sensibilitatii detectiei printr-o reactie chimica în urma adaugarii, cu un debit controlat, a unui reactiv potrivit. Tehnica se numeste derivatizare si se poate practica chiar înainte de introducerea probei în coloana, dar si dupa iesirea din coloana a componentelor separate. Metoda a fost utilizata pâna în prezent în special legata de metodele spectrofotometrice (colorimetrice) sau fluorimetrice si mai ales pentru analiza unor amestecuri de compusi numerosi având aceleasi functiuni reactive (de exemplu aminoacizi).

Caracteristicile detectorilor sunt asemanatoare cu ale celorlalte instrumente analitice si oarecum similare cu cele descrise la metoda GC.

II. 2.1.1. Detectori spectrofotometrici în UV-VIS

Acest grup de detectori sunt cei mai folositi detectori pâna în prezent, atât în LC, cât si în HPLC. Pentru a putea fi utilizati, compusii separati cromatografic trebuie sa fie colorati - adica sa absoarba lumina pe domeniul de lungimi de unda al detectorului. Pe de alta parte, eluentul trebuie sa fie practic transparent pentru acelasi domeniu spectral.

Legea fizica pe baza careia functioneaza acesti detectori este legea Lambert-Beer (A=elC). Deci unitatile vor fi unitati de absorbanta, adimensionale. De aceea limita de detectie sau zgomotul de fond se prezinta în cazul acestor detectori în AUFS (prescurtare de la Absorbance Units Full Scale = unitati de absorbanta raportate la întreaga scala, l. engl.). Astfel în cadrul instrumentelor actuale sensibilitatea este de 0,001 AUFS cu zgomotul de fond de 1%.

Motivul principal al popularitatii acestor detectori este acela ca numeroasele substante organice, anume cele care contin legaturi duble (electroni p), respectiv au

44

Page 45: CROMATOGRAFIE - 2009

grefate functiuni organice cu electroni neparticipanti, absorb lumina în UV-VIS. Este vorba de toate hidrocarburile olefinice si aromatice precum si derivatii tuturor hidrocarburilor cu diferite functiuni organice (=C=O, =C=S, -N-O, -N=N-, -NH2). Între acestea se includ si numeroasele combinatii de interes biologic ca enzime, acizi nucleici etc.Un mare avantaj al acestor detectori este faptul ca sunt insensibili la micile variatii de debit si temperatura. Sensibilitatea detectorului este direct proporţionala cu coeficientul de extincţie si cu lungimea celulei. Pentru a mari sensibilitatea detectorului ar trebui mărita lungimea celulei dar aceasta este restricţionata. Sensibilitatea este de ordinul 5x10-8g/ml. Cele mai moderne celule au diametre de 0,5-2mm si lungimi de 1-10mm.

Se pot distinge si în cazul acestei clase de detectori mai multe tipuri de detectori. 1. Detectorii monocromatici au fost primii utilizati, fiind mai ieftini deoarece lucreaza doar la o lungime de unda. Modelul cel mai raspândit se compune dintr-o sursa luminoasa cu deuteriu sau cu vapori de mercur, un monocromator care separa un domeniu îngust (de ex. linia 254nm a mercurului) si un detector. Schema bloc a unui astfel de detector este prezentata în figura II.18.

Sursa → Monocromator → Celula → Înregistrator

Fig. II.18. Schema bloc a unui detector HPLC spectrofotometric

2. Detectorii policromatici mai frecvent utilizaţi în cromatografele HPLC moderne permit si selectarea lungimii de unda la care se lucrează, dar chiar pot înregistra electronic absorbanta celulei la mai multe lungimi de unda simultan. Acest mod de lucru da o mai mare siguranţa analizei, în sensul ca permite stabilirea purităţii, adică daca picul constituie un semnal dat de o singura substanţa sau de un amestec (ceea ce se cunoaşte sub numele de stabilirea purităţii picului).

Principiul de functionare al detectotrului Uv este porezentată în figura II.19. Detectorul este format dintr-o celula cilindrica (5) cu capacitate de 1µl-10µl care este intersectata de coloana cu eluent. Razele UV (1) sunt aranjate astfel incit sa treacă prin celula cu proba de analizat (5) si apoi sa cada pe fotoelement (6). Semnalul de la fotoelement ajunge la amplificator (7) (acesta măreşte intensitatea semnalului) si apoi la sistemul de achiziţie, prelucrare si afişare a datelor obţinute (8); rezultatul este o cromatograma (9) ale cărui picuri va oferi informaţii calitativa si cantitative despre substanţele din soluţia analizata.

1

2 3

4

5

6

7

8

9

10

I

t

45

Page 46: CROMATOGRAFIE - 2009

Fig. II.19. Principiul de funcţionare al detectorului de UV. 1- raze UV, 2- substanţa ce vine de la coloana cromatografica,3- substanţa ce pleacă, 4- geam de cuarţ, 5- tub capilar prin care circula substanţa de analizat, 6- detector (fotomultiplicator), 7- amplificator,8- sistem de achiziţie, prelucrare si afişare a datelor, 9- cromatograma,10- cuva detectorului

II. 2.1.2. Detectori refractometrici

Detectorii refractometrici, au la baza legile refractiei luminii.Principiul de functionare al acestor detectori are la baza legea lui Fresnel - de

transmitere a luminii prin medii transparente având un indicele de refractie dat. Astfel, un fascicul luminos (mono sau policomponent) trece printr-o celula cu doua compartimente unul continând doar eluentul pur iar celalalt faza mobila care paraseste coloana , figura II.20

Fig.II.20. Principiul de functionare al unui detector refractometric. 1- radiatia luminoasa, 2- amestec de substante, 3- solvent pur,4- perete sticla, 5- detector refractometric, 6,6*- fotoelement, 7- amplificator, 8- surub reglator, 9- sistem înregistrator, 10- cromatograma, C- cuva refractometrica, M- sistem ce regleaza detectorul in funcţie de unghiul sub care cad razele

Radiatia luminoasa (1) trece prin solventul pur, apoi prin peretele de sticla ce separa cele 2 incinte, prin amestecul de substante. Ajunge sub un anumit unghi pe detector, o parte se reflecta pe fotoelementul 6’ iar o parte se refracta pe fotoelementul 6. Semnalul este amplificat. Daca cele doua tensiuni primite de la cei 2 detectori sunt diferite, motorul primeşte un semnal de corecţie, in scopul egalizării tensiunilor, astfel are loc compensarea modificării indicilor de refracţie. In urma deplasarii şurubului 8 , sistemul înregistrator 9 va înregistra datele sub forma unei cromatograme.Diferenta dintre indicii de refractie pentru solutiile aflate în cele doua compartimente vor fi practic nule, atâta timp cât din coloana iese doar eluentul pur, dar diferita în momentul în care în eluent mai apare un component separat - antrenat de catre eluent din coloana. În momentul iesirii unui component are loc o deplasare a pozitiei fascicolului emergent din detector - deplasare care este proportionala cu concentratia si sesizata de catre detector.

M1

2

3

4

5 6

6’9 7

10

8

CI

t

46

Page 47: CROMATOGRAFIE - 2009

În cazul acestui tip de detector sunt posibile si picuri negative, ceea ce face necesara aducerea liniei de baza la jumatatea scalei lucru care, pe lânga sensibilitatea relativ coborâta (10-5mol·L-1), constituie un dezavantaj. Acest detector este universal, dar nu poate fi utilizat în cromatografia cu gradienti deoarece, în acest caz, compozitia eluentului la intrarea în coloana difera de cea de la iesire si se modifica continuu, neexistând o linie de baza. De asemenea fenomenul este foarte sensibil la temperatura (±0.0001°C) fiind necesara termostatarea, atât a detectorului cât si a coloanei.

II. 2.1.3. Detectorii electrochimici

Detectori electrochimici sunt folositi cu precadere pentru identificare calitativa si cantitativa la amestecuri de electroliti precum si la substante care se pot oxida respectiv reduce. Intru-cat marea majoritate a substantelor se pot oxida sau reduce si intru-cat detctorii si logistica electronica de interpretare a datelor au devenit foarte performante momentan HPLC cu detectori electrochimici a devenit cea mai importanta metoda analiza si identificare a substantelor.

Exista doua tipuri de detectori electrochimici: - Conductometrici- sunt folositi pentru detectia calitativa si cantitaiva la electoliti

- Coulometrici, amperometrici- sunt folositi pentru detectii in regim de oxido-reducere la substantele organice;

II. 2.1.3.1. Detectorii conductometrici

Detectorii conductometrici sunt folositi in special pentru solutiile ionice unde substantele disociaza complet. Acest tip de detectori se utilizeaza cu precadere în cromatografia pe schimbatori de ioni si sunt sensibili la ioni anorganici sau organici inclusiv acizi organici. Sunt asadar detectori specifici. Sunt suficient de sensibili (500pg-1ng). Detectorii conductometrici măsoară conductivitatea fazei mobile. Este constituit din doi electrozi situaţi in coloana cu eluent si o rezistenta situata intre cei doi. Rezistenta este măsurata cu ajutorul circuitului electric la care este legata.

Principiul de functionare al unui detector conductometric este prezentat în figura II.21. Celula conductometrica este etansa, iar cei doi electrozi sunt fixati si dimensionati din fabrica. Substanta de analizat(4) vine de la coloana cromatografica si intra in celula conductometrica(2). Cand se modifica concentratia primei substante (H=kC) se modifica conductivitatea celor doi electrozi (3). Aceasta schimbare este amplificata si prinsa sub forma unui pic in cromatograma (8). Astfel se realizeaza analiza cantitativa probei. A doua substanta va modifica conductivitatea electrolilor dupa un anumit timp cea ce duce la masurarea timpului de retentie (analiza calitativa) si la aparitia unui nou pic in cromaograma.

Este necesar un generator de inalta frecventa pentru a nu se instala un transfer de ioni intre cei doi electrozi ceea ce ar duce la denaturarea analizei. Se alimenteaza cu 5kH.

47

Page 48: CROMATOGRAFIE - 2009

Fig.II.21. Principiul de functionare al detectorului conductometric. 1- generator de inalta frecventa, 2- celula conductometrica, 3- electrozi de platina, 4- sustanta de analizat ce vine de la coloana cromatografica, 5- substanta iese din celula conductometrica, 6- amplificator, 7- sistem de achiziţie, prelucrare si afişare a datelor, 8- cromatograma in coordonate conductivitate si timp

II. 2.1.3.2. Detectorii amperometrici sau coulometrici

Principiul de functionare: celula electrochimica, figura II.22. , este formata din trei electrozi, unul de referinta, unul de lucru si unul auxiliar, aflati int-un tub capilar alimentat cu solutie de la coloana cromatografica. Intre electrodul de lucru si cel de referinta se aplica o tensiune functie de potential ceea ce duce la aparitia pe curba cinetica a curbelor de reducere, care sunt pozitive, si a curbelor de oxidare, care sunt negative , figura II.23. ale elementelor care se gasesc in solutia electrolitica complexa. Din E1 substantele incep sa se reduca, intensitatea de reducere creste cu potentialul. Daca se aplica potential negativ in partea stanga a lui E0, se observa ca E3 reprezinta inceputul oxidarii unui element iar E4 sfarsitul oxidarii acelui element.

Fig.II.22. Principiul de functionare al detectorului electrochimic amperometric. 1- substantele ce vin de la coloana cromatografica, 2- electrodul de lucru, 3- electrodul auxiliar 4- celula electrochimica,5- tub capilar prin care circula substanţa de analizat, 6-

8

1 2

3

4

67

H5

10

1

2

3 4

5

6

7

8

9

t

i

48

Page 49: CROMATOGRAFIE - 2009

electrodul de referinta, 7- substanta iese din tubul capilar, 8- amplificator, 9- sistem de achiziţie, prelucrare si afişare a datelor,10- cromatograma in coordonate intensitatea cinetica si timp

Fig.II.23. Diagrama curbei cinetice si cromatograma obtinutaPentru a se putea efectua masurarile trebuie sa se cunoasca diagrama

potentialelor. Picurile pe cromatograma apar sub forma unui potential de semiunda (se duc tangente la curbele de reducere si oxidare iar la mijlocul distantei dintre liniile ce se duc din capatul tangentei pe ordonata cromatogramei se afla varful picului).

II. 2.1.4. Detectorii de fluorescenta

Detectorii de fluorescenta se bazează pe măsurarea intensităţii fluorescentei pentru substanţele ce prezintă acest fenomen. Fluorescenta este un fenomen care apare la unele substanţe când sunt iradiate cu ultraviolete. Acele substanţe emit radiaţii pe o lungime de unda mai mare decât a radiatei incidente. Daca emisia de radiaţii are loc in acelaşi timp cu emisia de radiaţie ultravioleta incidenta fenomenul se numeşte fluorescenta. Putini compuşi prezintă fluorescenta iar cei ce nu prezintă pot fi transformaţi in derivaţi ai lor ce au aceasta proprietate.

Fluorescenta s-a arătat a fi foarte folositoare ca proces de detecţie iar cu detectorii bazaţi pe fluorescenta s-au obţinut unele dintre cele mai înalte sensibilitati din cromatografie de lichide. Tehnicile de detecţie bazate pe fluorescenta conferă o buna sensibilitate probelor concentrate si o sensibilitate mult mai mica atunci când se folosesc instrumente de genul senzorilor de temperata, presiune etc..Din aceasta cauza lumina de fluorescenta este măsurata pe un fundal întunecat( sau la zgomot de fond redus).

Pentru ca intensitatea fluorescentei sa poată fi măsurata instrumental, raportul dintre cantitatea de radiaţie remisa si cantitatea de radiaţie UV incidenta trebuie sa aibă valori cuprinse intre 0.1-1. Sistemul optic al celor mai multi detectori de fluorescenta este aranjat astfel incat lumina fluorescenta sa cada sub un anumit unghi( de 90º), figura II.24., pe raza incidenta.Acest lucru micsoreaza cantitatea de lumina incidenta care ar interactiona cu semnalul. In aceste circumstante semnalul este masurat pe un fundal aproape negru (pentru a mai reduce din luminozitatea fundalului se foloseste un filtru).

E3E4E5E60

E0 E1 E2 E(mv)

-i

+it

I

49

Page 50: CROMATOGRAFIE - 2009

Cel mai simplu detector este format dintr-o sursa de excitare si un senzor ce monitorizeaza semnalul pentru toate lungimile de unda (pentru anumite probe poate fi foarte sensibil si relativ ieftin).

Fig.II.24. Principiul de funcţionare al detectorului de fluorescenta.1- sursa de radiaţie, 2- fanta, 3- filtru, 4- lentila, 5- substanţa ce vine de la coloana. 6- substanţa de analizat, 7-cuva cu pereţi de cuarţ, 8- unghi de 90 grade,9- substanţa ce iese din cuva, 10- lentila, 11- filtru, 12- fanta, 13- detector de fluorescenta, 14- amplificator, 15- sistem de preluare, prelucrare si afişare a datelor, 16- cromatograma.

Principiul de funcţionare: Radiaţia emisa de sursa (1) după trecerea prin filtru este focalizata de lentila (4) apoi cade sub un unghi de 90º pe radiaţia incidenta. Lumina fluorescenta emisa este focalizata de lentila (10), trece prin filtrul (11) si ajunge la detectorul de fluorescenta care ii măsoară intensitatea. Semnalul este apoi amplificat si preluat de sistemul de prelucrare si afişare a datelor(15). Datele obţinute sunt afişate sub forma unei cromatograme (16).

II. 2.1.5.Detectoare Diode Array

Detectorul sir de fotodiode poate fi folosit in numeroase situatii, de exemplu determinarea puritatii unei solutii, separarea hidrocarburilor aromatice.

Principiul de utilizare. Detectorul este utilizat cu lampa de deuteriu si xenon care emit ultraviolete (1). Lumina de la lampa trece prin proba aflata in tubul capilar (5) iar lumina dispersata trece printr-o retea de difractie (6) apoi cade pe dioda Array (7). Rezolutia detectorului depinde de numarul diodelor si de numarul lungimilor de unda acoperite. Doda Array poate contin sute de diode iar semnalul de la fiecare dioda este preluat si amplificat de catre amplicator (8) ca la sfarsit sa ajunga la sistem de preluare, prelucrare si afişare a datelor (9) care de obicei este un calculator care stocheaza datele pe hard disc. La sfarsitul analizei informatile oferite de fotodiode sunt afisate pe o cromatograma. Sunt oferite intensitatile substantelor din amestec (analiza cantitativa) si timpii lor de retentie (analiza calitativa).

Sensitivitatea detectorului sir de fotodiode este de 1x10-7 g/ml iar domeniu dinamic liniar de 5x103.

Schema principiului de functionare este prezentat in figura II.25

1

2

3

4

5

67

8

9 10 11 12

13

14

15

t

I 16

50

Page 51: CROMATOGRAFIE - 2009

Fig.II.25. Principiul de funcţionare al detectorului sir de fotodiode. 1- radiaţii ultraviolete, 2- substanţa ce vine de la coloana cromatografica,3- substanţa ce pleacă la tratament chimic, 4- fereastră cuart, 5- tub capilar prin care circula substanţa de analizat, 6- reţea de difracţie, 7- dioda Array, 8- amplificator, 9- sistem de preluare,achiziţie si afişare a datelor, 10- cromatograma (in care se preiau concomitent toate lungimile de unda)

II. 2.1.6. Alti detectori

In practica analitica se mai întâlnesc si alti detectori prezentati schematic în tabelul 2. Dintre acestia o mentiune speciala trebuie facuta pentru cei bazati pe spectrometria de masa si FT-IR, care au permis determinari calitative uneori imposibil de realizat prin alte variante de detectie în lipsa etaloanelor cunoscute.

Acesti detectori permit ca, pe baza unei baze de date formata din spectre cunoscute, sa se obtina compusii cei mai apropiati (3 dintre acestia), din toate substantele chimice cunoscute, care ar putea fi prezenti în proba.

Tab. II.2. Alti detectori utilizati în LC

Detectori LC Limita de detectie

Caracteristici Disponibilitatecomerciala

Fluorimetrici 1-10pg Este necesara uneori derivatizareaSensibilitate 10-10M

Da

Electrochimici (Amperometrici)

10pg = 1ng Sensibilitate 10-10M Compusi oxidabili sau reductibili

Da

Bazati pe Spectrometria de Masa (MS)

100pg - 1ng

Necesare coloane capilare Necesara pulverizarea Pret de cost ridicat

Da

FT-IR 1µg Pret de cost ridicat Da

Difuzia luminii 10µg Adecvati pentru macromolecule DaActivitate optica 1ng Pentru substante optic active Nu

1

2 3

4 5

6

7

8

9

10

I

t

51

Page 52: CROMATOGRAFIE - 2009

Electrozi ion selectivi

10ng Doar pentru ioni sau compusi ionizabili

Nu

Fotoionizare 1pg- 1ng - Nu

II. 2.2. Electroforeza capilara

Electroforeza este o metoda cromatografica de analiza la care separarea componentilor se face pe baza unui gradient de potential in curent continuu.

Electroforeza poate fi: fara medii stabilizante; cu medii stabilizante.

Mediile stabilizante pot fi: hartia electroforetica; geluri speciale pe placi de sticla; structuri de pulberi depuse in tuburi.

Bazele electroforezei au fost puse de catre Tisellius ce a dezvoltat electroforeza fara medii stabilizante figura II.26. a si b. In fig. II.26. a este reprezentata forma initiala a montajului, inainte de alimentarea cu tensiune, cand substantele sunt amestecate. Cand sistemul este alimentat cu tensiune electrica componentele se separa in functie de gradientul lor de potential, fig. II.26.b.

Fig.II.26. Scema de principiu a electroforezei fara medii stabilizante Electroforeza capilara (EC) este folosita pentru separarea speciilor ionice datorita

incarcaturii lor electrice si a fortelor de atractie si respingere. Se deosebeste de HPLC doar prin faptul ca separarea pe componenti se face sub inalta tensiune electrica pe cand la HPLC se face cu o pompa de inalta presiune. Exista si combinatii intre electroforeza capilara si HPLC (ce nu se poate detecta cu HPLC intra in sistemul de detectare al eletroforezei capilare).

+ +

-_

Solutie tampon

C

B+C

A+B+C

A

A+B

A

C

B+CB

ab

electrozi

52

Page 53: CROMATOGRAFIE - 2009

Fig.II.27. Principiul electroforezei capilare.1- anod, 2- solutie tampon, 3- celula electroforetica, 4- catod, 5- fotodetector (in UV, Dioda Array etc), 6- tub capilar, 7-sursa de radiatie, 8-fanta, 9- Amplificator, 10- sistem de preluare,achiziţie si afişare a datelor, 11- cromatograma electoforetica

Principiul de functionare , figura II.27, este relativ simplu. La aplicarea tensiunii electrice U, ionii substantelor din amestec vor incepe sa migreze prin tubul capilar in functie de potentialele lor specifice. Astfel se realizeaza separarea ompusilor din amestecul de analizat. Deplasarea lor e bidirectionala (de la stanga la dreapta si de la dreapta la stanga). In deplasarea lor prin tubul capilar, la un moment dat ionii substantei vor fi detectati cu ajutorul unui sistem de detectie ce vor transmite semnalul la un amplificator. Dupa amplificarea semnalul ajunge la sistemul de preluare, achiziţie si afişare a datelor care ne va oferi informatiile in ceea ce priveste substantele din amestecul analizat sub forma unei cromatograme electroforetice. Fiecare substanta este caracterizata de timpul propriu de retentie (analiza canlitativa) iar inaltimea picului corespunzator ofera informatii despre cantitatea de substanta existenta.

Avantaje ale electroforezei capilare sint:- separarea componentilor dintr-un amestec este mai avansata ca la HPLC şi creste cu

cit tensiune electrica aplicata este mai mare - pretul este mult mai mic decat cel de achizitie a unui HPLC;- fiabilitate mai buna decit la HPLC

I

t

+

12

34

5

6

7

89

10

11

_

53


Recommended