UNIVERSITATEA DIN BUCUREŞTI
FACULTATEA DE FIZICĂ
BUCUREŞTI
2013
STUDIUL OPTIC ŞI SPECTRAL AL STABILITĂŢII
SOLUŢIILOR DE MEDICAMENTE ȊN CONDIŢII DE
MEDIU VARIABILE
TEZĂ DE DOCTORAT
Doctorand: Conducător ştiinţific:
Militaru Andra – Cristina (Dinache) CS I Dr. Mihail – Lucian Pascu
Investeşte în oameni!
FONDUL SOCIAL EUROPEAN Programul Operaţional Sectorial pentru Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013 Axa prioritară 1 - „Educaţia şi formarea profesională în sprijinul creşterii economice și dezvoltării societății
bazate pe cunoaștere" Domeniul major de intervenţie 1.5 - „Programe doctorale şi postdoctorale în sprijinul cercetării” Numărul de identificare al contractului: POSDRU 107/1.5/S/80765 Titlul proiectului: „Excelenţă şi interdisciplinaritate în studiile doctorale pentru o societate informaţională”
Studiul optic şi spectral al stabilităţii soluţiilor de medicamente în condiţii de mediu variabile
Doctorand : Militaru Andra – Cristina (Dinache)
Conducător doctorat : CS I Dr. Mihail – Lucian Pascu
- 2013 -
Cercetările științifice care au dus la realizarea acestei teze
de doctorat au fost realizate cu suportul financiar al
Programului Operational Dezvoltarea Resurselor Umane 2007
– 2013, cofinantat prin Fondul Social European, în cadrul
proiectului cu ID: POSDRU/107/1.5/S/80765
CUVANT INAINTE
Gandurile si recunostinta mea se indreapta catre toti cei care m-au sprijinit in
elaborarea si finalizarea tezei de doctorat.
In primul rand, doresc sa-i multumesc domnului Profesor Doctor Mihail – Lucian
Pascu pentru sprijinul si indrumarea acordate pe parcursul intregii mele activitati de
cercetare si sa-mi exprim recunostinta, in special, pentru coordonarea activitatilor
desfasurate pe parcursul elaborarii tezei de doctorat.
Multumesc distinsilor membrii ai Comisiei de doctorat pentru onoarea pe care mi-o
fac prin a evalua aceasta teza, pentru timpul si pentru rabdarea acordate.
De asemenea, doresc sa le multumesc colegilor din grupul de Spectroscopie Laser
al Institutului National de Cercetare – Dezvoltare pentru Fizica Laserilor, Plasmei si
Radiatiei pentru sprijinul acordat si pentru sfaturile competente ce mi le-au oferit.
Apreciez in mod deosebit suportul stiintific si moral si sugestiile oferite de catre
domnisoara Dr. Angela Staicu si domnul Alexandru Pascu. Le datorez sincere multumiri
doamnei Dr. Adriana Smarandache, domnului Dr. Ionut Andrei, domnisoarei Tatiana
Alexandru si domnilor Mihai Boni si Dr. Viorel Nastasa pentru ajutorul acordat in
realizarea unor experimente si pentru discutiile utile pe care le-am purtat. Multumesc
domnisoarei Agota Simon si domnului Alexandru Stoicu pentru ajutorul oferit si doresc
sa-i asigur de recunostinta mea pe doamna Rodica Marin si domnul Mihai Cojocaru
pentru sprijinul moral si incurajarile oferite.
Doresc sa-mi exprim multumirile mele sincere familiei, in special parintilor mei si
surorii mele, dar si celor apropiati, care de-a lungul anilor au contribuit la formarea mea
in viata.
Nu in ultimul rand, doresc sa-i multumesc in mod deosebit sotului meu, Alexandru,
pentru dragostea, intelegerea si rabdarea pe care mi le-a daruit pe parcursul anilor.
Andra – Cristina Militaru (Dinache)
1
CUPRINS
Introducere 3
Capitolul I. Metode de studiu pentru caracterizarea stabilitatii
solutiilor de medicamente
5
1.1. Spectroscopia de absorbtie in UV-Vis 5
1.2. Spectroscopia in infrarosu cu transformata Fourier (FTIR) 8
1.3. Spectroscopia de fluorescenta indusa cu laser (LIF) 10
1.4. Spectrometria de masa 13
1.5. Tehnici de cromatografie 15
1.6. Tehnici de microscopie (optica, electronica de scanare, de forta
atomica)
17
1.7. Microfluidica 21
Capitolul II. Descrierea proprietatilor fizico-chimice ale
medicamentelor studiate
23
2.1. Descrierea fenotiazinelor studiate 23
2.1.1. Clorpromazina (CPZ) 23
2.1.2. Promazina (PZ) 25
2.1.3. Prometazina (PMZ) 25
2.1.4. Tioridazina (TZ) 26
2.2. Descrierea Vancomicinei (VCM) 27
2.3. Descrierea derivatilor chinazolinici 29
2.3.1. BG1188 30
2.3.2. BG1162 31
2.4. Descrierea ecdisteroizilor 31
REZULTATE ORIGINALE 34
Capitolul III. Studiul stabilitatii solutiilor de fenotiazine 35
3.1. Introducere 35
3.2. Stabilitatea in timp a solutiilor de fenotiazine 37
3.3. Stabilitatea solutiilor de fenotiazine in conditii de iradiere cu fascicul
laser
41
3.4. Activitatea antibacteriana a fenotiazinelor 53
3.4.1. Evaluarea susceptibilitatii bacteriilor 54
3.4.2. Evaluarea cineticii de crestere a bacteriilor 61
3.4.3. Evaluarea sinergismului – metoda “tabla de sah” 67
3.5. Concluzii 68
Capitolul IV. Studiul stabilitatii solutiilor de Vancomicina 72
4.1. Introducere 72
4.2. Stabilitatea in timp a solutiilor de Vancomicina 74
4.3. Stabilitatea solutiilor de Vancomicina in conditii de iradiere cu
fascicul laser
76
4.4. Masuratori de microfluidica 88
4.5. Generarea spumelor prin expunere la radiatie laser 91
2
4.6. Concluzii 94
Capitolul V. Studiul stabilitatii solutiilor derivatilor chinazolinici 96
5.1 Introducere 96
5.2. Stabilitatea in timp a solutiilor derivatilor chinazolinici 98
5.2.1 Formarea agregatelor filiforme in solutiile de BG1188 103
5.3. Influenta solventului asupra solutiilor de BG1188 108
5.4. Influenta temperaturii asupra stabilitatii solutiilor de BG1188 109
5.5. Stabilitatea solutiilor de BG1188 in conditii de iradiere cu fascicul
laser
110
5.6. Activitatea antibacteriana a derivatului chinazolinic BG1188 112
5.7. Concluzii 113
Capitolul VI. Studiul stabilitatii solutiilor de ecdisteroizi 116
6.1. Introducere 116
6.2. Stabilitatea solutiilor de ecdisteroizi in conditii de iradiere cu fascicul
laser
117
6.3. Concluzii 121
Capitolul VII. Concluzii generale. Contributii originale 123
Referinte bibliografice 129
Anexa 1. Lista lucrarilor publicate 142
Anexa 2. Lista comunicarilor la conferinte nationale si internationale 144
Anexa 3. Listarea in extenso a lucrarilor publicate la care sunt
prim-autor
147
3
Introducere
In aceasta lucrare, metodele optice si spectrale au fost aplicate pentru a caracteriza
stabilitatea solutiilor de medicamente, fie ele medicamente deja aprobate si utilizate in
tratamentele medicale sau compusi nou creati, cu potential antimicrobian, ce se afla inca in
faza de testare si caracterizare.
Din punctul de vedere al utilizatorilor (farmacisti, personal medical, pacienti), este
necesar sa se cunoasca perioada de timp in care poate fi utilizat un medicament fara sa-si
modifice proprietatile de interes si conditiile in care acesta trebuie pastrat in tot acest timp.
Studierea stabilitatii solutiilor de medicamente a fost facuta in timp, in conditii de
mediu constante (aceeasi temperatura, aceleasi conditii de iluminare etc.), dar si in conditii
de mediu variabile, luand in considerare factori precum temperatura de depozitare,
solventul folosit in prepararea solutiilor de medicamente, conditiile de iluminare in care
sunt pastrate probele in timp.
Studiul stabilitatii in diferite conditii de iluminare (fotostabilitatea) reprezinta o
parte importanta a acestei tezei, in primul rand, pentru a stabili cantitatea/doza de radiatie
(lumina ambientala sau radiatie laser) la care poate fi expus un compus nou sintetizat fara
a-i fi modificate proprietatile, si in al doilea rand, pentru a stabili conditiile de iluminare in
care un medicament cunoscut poate fi modificat, cu scopul de a crea fotoprodusi cu
activitate antimicrobiana imbunatatita fata de cea a medicamentului initial.
Expunerea la radiatie in domeniul ultraviolet-vizibil (UV-Vis) are potentialul de a
modifica structura medicamentelor. A fost demonstrat ca radiatia laser, datorita energiei
mari si a monocromaticitatii, modifica rapid moleculele din solutiile de medicamente,
formand noi fotoprodusi cu activitate antibacteriana, ce pot fi eficienti si impotriva
tulpinilor de bacterii rezistente la tratament.
Astfel, tema tezei de doctorat contribuie la eforturile de cercetare dedicate
infrangerii rezistentei bacteriilor la tratamente multiple (MDR – multi-drug resistance) prin
caracterizarea unor compusi noi, creati cu acest scop, si prin caracterizarea fotostabilitatii
solutiilor de medicamente si a fotoprodusilor rezultati din interactia radiatiei laser cu
solutiile de medicamente. Iradierea cu fascicul laser are avantajul de a produce compusi cu
potential antibacterian mai rapid si mai ieftin decat metodele chimice standard.
Aceasta lucrare este structurata in 7 capitole, primele doua capitole prezentand
succint datele cunoscute in literatura de specialitate referitoare la tematica tezei, capitolele
IV - VI descriind partea experimentala si rezultatele originale, iar ultimul capitol fiind
rezervat concluziilor generale.
Primul capitol face o sinteza a metodelor folosite pentru caracterizarea stabilitatii
solutiilor de medicamente, si anume spectroscopia de absorbtie in UV-Vis, spectroscopia
in infrarosu cu transformata Fourier, spectroscopia de fluorescenta indusa cu laser,
spectrometria de masa cuplata cu cromatografie lichida, cromatografia in strat subtire,
microscopia optica, microscopia electronica de scanare, microscopia de forta atomica si
metode de microfluidica.
In cel de-al doilea capitol sunt descrise proprietatile fizico-chimice cunoscute ale
medicamentelor studiate.
4
Capitolul al III-lea prezinta studiul de stabilitate al fenotiazinelor, urmarind
stabilitatea in timp a solutiilor de fenotiazine si stabilitatea in conditii de iradiere cu
fascicul laser. Diferiti parametri ai conditiilor de iradiere au fost modificati in timpul
experimentelor pentru a obtine conditii optime de producere a noi compusi cu potential
antimicrobian si pentru a afla mai multe informatii despre procesul de modificare al
moleculelor la interactia cu fascicul laser.
Activitatea antibacteriana a solutiilor de fenotiazine neiradiate si iradiate a fost
testata. Testele de microbiologie au fost efectuate la Centre for Food Safety, University
College Dublin, din Irlanda, in cadrul unor stagii de mobilitate.
In capitolul al IV-lea sunt descrise studiile de stabilitate in timp a Vancomicinei, un
antibiotic glicopeptidic, studiile de fotostabilitate si efectele modificarii parametrilor de
iradiere cu fascicul laser, identificarea unor potentiali fotoprodusi de reactie la interactia
solutiilor de Vancomicina cu radiatia laser si generarea spumelor prin expunerea la radiatie
laser a solutiilor de Vancomicina.
Caracterizarea stabilitatii unor compusi nou sintetizati, derivatii chinazolinici
BG1188 si BG1162, este prezentata in capitolul V. A fost studiata stabilitatea in timp a
derivatilor chinazolinici, influenta solventului asupra solutiilor derivatilor chinazolinici,
influenta temperaturii asupra stabilitatii solutiilor si stabilitatea in conditii de iradiere cu
fascicul laser a solutiilor de BG1188. In urma rezultatelor incurajatoare obtinute in cazul
fenotiazinelor, s-a hotarat studierea activitatii antibacteriene a solutiilor neiradiate si
iradiate de BG1188.
Capitolul al VI-lea descrie studiile de stabilitate a solutiilor de ecdisteroizi, acestea
fiind concentrate pe studiul stabilitatii in conditii de iradiere cu laser.
Ultimul capitol al tezei, capitolul VII, prezinta concluziile generale ale studiilor si o
sinteza a contributiilor originale aduse de catre autoare in ceea ce priveste studiul
stabilitatii solutiilor de medicamente in conditii de mediu variabile.
5
Capitolul I. Metode de studiu pentru caracterizarea stabilitatii solutiilor
de medicamente
Stabilitatea solutiilor de medicamente este o caracteristica importanta in studiul
medicamentelor.
Studiul ei este important pentru a putea stabili pentru cat timp si care sunt conditiile
in care un medicament poate fi pastrat astfel incat el sa isi pastreze nemodificate
proprietatile de interes in vederea aplicarii in tratamente.
In studierea stabilitatii in timp a solutiilor de medicamente au fost luati in calcul
factori ca solventul folosit pentru dizolvarea medicamentului, temperatura de depozitare a
solutiilor de medicamente, conditiile de iluminare in care sunt pastrate probele etc.
O atentie speciala este necesar sa fie acordata conditiilor de iluminare in care sunt
pastrate probele si testelor de fotostabilitate a solutiilor de medicamente.
In cadrul testelor de fotostabilitate s-a constatat ca, in conditii de iradiere cu
fascicul laser, pot fi generate noi specii moleculare, ce pot avea activitate imbunatatita fata
de molecula parentala. Acesti noi produsi de reactie iau nastere la interactia radiatiei laser
cu moleculele din solutiile de medicamente si pot fi specii tranziente sau compusi stabili
perioade indelungate de timp.
Pentru a caracteriza stabilitatea solutiilor de medicamente sub influenta factorilor
de mediu naturali sau artificiali si pentru a observa modificarile induse de interactia cu
radiatia laser au fost utilizate mai multe metode optice si spectrale.
Principalele metode folosite in studiul stabilitatii solutiilor de medicamente au fost
spectroscopia de absorbtie in UV-Vis, spectroscopia in infrarosu cu transformata Fourier
(FTIR) si spectroscopia de fluorescenta indusa cu laser (LIF).
De asemenea, pentru mai multe informatii in identificarea unor compusi obtinuti in
timpul studiilor de stabilitate au fost utilizate spectrometria de masa cuplata cu
cromatografie lichida, cromatografia in strat subtire (TLC), microscopia optica,
microscopia electronica de scanare, microscopia de forta atomica si microfluidica.
1.1. Spectroscopia de absorbtie in UV-Vis
Spectroscopia optica este o metoda puternica utilizata in fizica, chimie, biologie,
biofizica si in general, in stiinte interdisciplinare. Datorita sensibilitatii si vitezei foarte
mari, metodele spectroscopice sunt utilizate pentru a studia structura si modificarile ce apar
in structura moleculelor.
Spectroscopia de absorbtie in UV-Vis este folosita pentru a determina structura
unei molecule si modificarile ce pot aparea sub influenta unor factori ca temperatura,
solventul, concentratia, pH-ul etc. (Hammes 2005, Lindon 2000, Robinson 2005).
Spectrele de absorbtie UV-Vis sunt determinate de tranzitiile electronice. Energia
radiatiei din regiunile ultraviolet (UV) si vizibil (Vis) ale spectrului electromagnetic este in
general comparabila cu energia necesara excitarii electronilor din orbitalii moleculari
exteriori (orbitali de valenta). Electronii din stratul de valenta sunt cei care participa la
6
formarea de legaturi intre atomi. Astfel, orice modificare a moleculei va influenta spectrul
de absorbtie in UV-Vis al acelei molecule.
Doua conditii trebuiesc indeplinite pentru ca o tranzitie electronica sa aiba loc.
Prima conditie este ca frecventa oscilatiilor campului electromagnetic sa fie egala cu
raportul dintre ΔE si h, unde ΔE reprezinta diferenta dintre energia starii electronice
excitate si energia starii electronice fundamentale a moleculei, iar h este constanta lui
Planck (h = 6,626x10-34
J s). A doua conditie este ca orbitalii intre care are loc tranzitia
respectiva sa aiba simetrii geometrice diferite si sa fie orientati in functie de polarizarea
campului electric.
Forma spectrului de absorbtie este influentata de dipolul tranzitiei, care determina
si intensitatea benzii de absorbtie.
Absorbanta este definita in functie de intensitatea luminii incidente, I0, si
intensitatea luminii transmise, I:
(1.1)
Atata timp cat este valabila si se poate aplica, legea Beer-Lambert leaga absorbtia
luminii de concentratia compusului absorbant:
(1.2)
unde este coeficientul molar de extinctie, C reprezinta concentratia compusului si l este
lungimea drumului optic (grosimea probei) (Lindon 2000, Mohr 2011, Parson 2007).
Electronii din stratul de valenta ce pot participa la tranzitiile electronice sunt de trei
tipuri. Primul tip este constituit de cei implicati in legaturile simple sau σ. Energia necesara
pentru a excita electronii din legaturile σ este, in general, mai mare decat a fotonilor cu
lungimi de unda in UV. De aceea, compusii saturati, cei care au doar legaturi simple, nu
absorb in UV.
Al doilea tip de electroni sunt cei implicati in legaturi π, in legaturile duble sau
triple. Acest tip de electroni nu necesita o energie foarte mare pentru excitare si de aceea
compusii cu legaturi π absorb in UV sau vizibil.
Ultimul tip de electroni sunt cei care nu sunt implicati in legaturile dintre atomi si
sunt numiti electroni n. Electronii n sunt excitati usor de radiatia UV sau vizibila, astfel ca
multi compusi ce contin electroni n absorb in domeniul UV-Vis.
In Figura 1.1 este prezentata diagrama energiilor relative a orbitalilor moleculari σ,
π, n si a orbitalilor moleculari de antilegatura σ* si π*. Se poate observa ca energia
necesara pentru a excita un electron de pe orbitalul σ pe σ* este mai mare decat energia
necesara excitatii unui electron de pe orbitalul π pe π* sau a unui electron n pe orbitalii
moleculari de antilegatura σ* si π*.
Astfel, energia necesara excitarii unui electron σ pe orbitalul σ* este mai mare decat
energia disponibila in regiunea UV, insa radiatia UV este suficienta pentru a excita
electronii π pe orbitalul π* si electronii n pe orbitalii σ* sau π*.
7
Fig. 1.1. Diagrama nivelelor de energie corespunzatoare orbitalilor σ, π, n si orbitalilor de
antilegatura asociati
Cand moleculele sunt excitate, un electron se deplaseaza de pe orbitalul molecular
ocupat cu ce mai mare energie pe orbitalul neocupat cu cea mai mica energie, acesta fiind
in general un orbital molecular de antilegatura. Astfel, in conformitate cu Figura 1.1,
electronii π vor fi excitati pe orbitalii π* si electronii n pe orbitalii de antilegatura σ* sau π*
(Robinson 2005).
Aceste tranzitii sunt responsabile pentru benzile de absorbtie din spectrele
moleculelor.
Aceste spectre sunt inregistrate cu spectrofotometre de absorbtie in UV-Vis, ce pot
fi cu un singur fascicul sau cu fascicul dublu, unul pentru proba analizata si unul pentru
referinta. Majoritatea spectrofotometrelor moderne si in particular cel folosit pentru
obtinerea rezultatelor raportate in teza sunt cu dublu fascicul.
Partile principale ale unui spectrofotometru de absorbtie in UV-Vis cu dublu
fascicul sunt: o sursa de radiatie luminoasa (S), un monocromator (M) ce separa radiatia in
functie de lungimile de unda, un chopper (C) si un beam splitter (B) pentru alternarea
fasciculului proba/referinta, compartimentele pentru proba de analizat (P) si referinta (R) si
un detector (D). Aceste parti componente pot fi observate in Figura 1.2.
Fig. 1.2. Schema bloc a unui spectrofotometru cu fascicul dublu
Sursele de lumina trebuie sa fie adecvate domeniului spectral dorit, sa aiba
intensitate suficienta si stabilitate de emisie.
8
In general, sunt utilizate impreuna lampile de deuteriu pentru UV (180 – 350 nm) si
cu tungsten pentru vizibil (330 – 900 nm).
Unul sau mai multe monocromatoare sunt utilizate pentru separarea radiatiei
provenite de la sursa in radiatii monocromatice.
Un monocromator este format din: fanta de intrare a radiatiei emise de sursa,
colimator cu una sau mai multe lentile sau cu o oglinda concava, sistem de dispersie,
prisma sau retea de difractie ce separa radiatiile in functie de lungimea de unda si sistem de
focalizare pe fanta de iesire, care lasa sa treaca doar o banda spectrala foarte ingusta,
blocand restul radiatiilor. Largimea de banda a radiatiei emergente din monocromator
depinde, in primul rand de elementul dispersiv, dar si de largimea fantelor de intrare si de
iesire.
Sistemele de dispersie sunt caracterizate de dispersia unghiulara, dispersia liniara si
puterea de rezolutie.
Chopperul (sistemul de divizare a fasciculului) schimba directia fasciculului intre
compartimenul probei si compartimentul de referinta.
Detectorul absoarbe energia fotonilor receptionati si o transforma intr-un semnal
electric masurabil care poate fi corelat cantitativ cu intensitatea radiatiei masurate. Cele
mai importante caracteristici ale unui detector sunt: sensibilitate mare si zgomot de fond
minim, timp de raspuns scurt, stabilitate in timp a raspunsului si dependenta liniara intre
raspunsul detectorului si intensitatea radiatiei masurate.
Detectorii uzuali in spectrofotometrele de absorbtie in UV-Vis sunt detectorii
fotoelectrici, cum ar fi celulele fotovoltaice, celulele fotoemisive, fotodiodele si
fotomultiplicatorii (Parson 2007, Lindon 2000).
Spectrofotometrele actuale sunt conectate la calculator, iar prin intermediul
programelor dedicate spectrele achizitionate, acestea pot fi vizualizate si comparate cu cele
existente in bazele de date.
1.2. Spectroscopia in infrarosu cu transformata Fourier (FTIR)
Energia radiatiei infrarosii (IR) corespunde diferentelor mici de energie intre starile
vibrationale si rotationale ale moleculei. Radiatia absorbita de o molecula este legata de
schimbarile dipolului electric, astfel ca in cazul radiatiei IR aceste schimbari trebuie sa fie
asociate cu miscarile vibrationale si rotationale.
Spectroscopia FTIR este bazata pe absorbtia unei radiatii IR de catre proba
analizata. Ea permite identificarea si analizarea gruparilor chimice prezente in proba
datorita detectiei vibratiilor caracteristice legaturilor chimice (Coates 2000, Lindon 2000,
Pavia 2009).
Vibratiile legaturilor chimice se impart in doua categorii: vibratii de intindere/de
valenta (stretching vibrations) si vibratii de deformare (bending vibrations). O vibratie de
intindere implica o schimbare continua a distantei interatomice de-a lungul axei legaturii
intre doi atomi. Vibratiile de deformare sunt caracterizate de o schimbare a unghiului
dintre doua legaturi si sunt de patru tipuri: de forfecare (scissoring), de balansare
(rocking), de torsiune (wagging), de rotatie (twisting). In plus, pot sa apara interactii sau
9
cuplari intre vibratii. Cuplarea duce la o schimbare a caracteristicilor vibratiilor implicate
(Silverstein 2005, Parson 2007).
Inregistrarea datelor se efectueaza cu un spectrofotometru FTIR, a carui schema
este prezentata in Figura 1.3.
Fasciculul IR care provine de la sursa este dirijat spre inferometru (interferometrul
Michelson fiind cel mai utilizat) care va modula fiecare lungime de unda a fasciculului cu
o frecventa diferita. In interferometru, fasciculul luminos cade pe beam splitter (divizorul
de fascicul). Daca divizorul este ideal, atunci, jumatate din radiatia incidenta va fi
reflectata pe una din oglinzi, iar cealalta jumatate va fi transmisa catre cealalta oglinda.
Cele doua fascicule se intorc la divizor dupa ce sunt reflectate de oglinzi. Cand ajung la
divizor, fasciculele se recombina si interfera. Din fasciculul reflectat de oglinda fixa,
jumatate este transmis prin divizorul de fascicul si jumatate este reflectat inapoi spre sursa.
Fig. 1.3. Schema bloc a unui spectrofotometru FTIR
Detectorul inregistreaza fasciculul transmis, care este fasciculul emergent din
interferometru, perpendicular fata de fasciculul incident.
In functie de pozitia oglinzii mobile, la recombinarea fasciculelor, apar interferente
constructive sau distructive.
Oglinda mobila produce diferenta de drum optic (δ) intre cele doua brate ale
interferometrului. Daca diferenta de drum optic este egala cu un numar intreg de lungimi
de unda (nλ), atunci interferenta este constructiva. In schimb, daca δ este (n+1/2)λ, unde n
este un numar intreg, pozitiv, atunci interferenta celor doua fascicule este distructiva.
Semnalul detectorului apare ca o interferograma (Figura 1.4), reprezentand suma
tuturor frecventelor fasciculului.
10
Aceasta interferograma este apoi convertita intr-un spectru infrarosu, printr-o
operatie matematica denumita transformare Fourier. Transformarea Fourier este un
procedeu matematic care permite conversia informatiei obtinute (printr-o metoda
experimentala adecvata) privind variatia in timp a puterii radiante, in informatie asupra
dependentei acesteia de frecventa, adica intr-un spectru propriu-zis.
Fig. 1.4. Interferograma pentru radiatie policromatica, la iesirea din detector (Coates 2000)
Din spectrele FTIR se pot obtine atat informatii calitative, cat si cantitative. Analiza
calitativa presupune inregistrarea si atribuirea numerelor de unda la care absoarbe proba,
acestea fiind caracteristice gruparilor chimice prezente in proba analizata. Pentru analiza
cantitativa este importanta intensitatea absorbtiei la lungimea de unda caracteristica.
Aceasta depinde de concentratia gruparii chimice responsabile de absorbtie. Cunoscand
aria semnalului caracteristic se poate compara proportia unei grupari chimice date in mai
multe probe, daca se cunoaste grosimea probei masurate (Silverstein 2005, Coates 2000).
1.3. Spectroscopia de fluorescenta indusa cu laser (LIF)
In subcapitolul 1.1 a fost descrisa absorbtia radiatiei electromagnetice de catre
molecule.
Fig. 1.5. Diagrama Perrin - Jablonski
11
Absorbtia unei cuante de energie sub diferite forme (termica, chimica, radianta) de
catre un electron aflat pe nivel fundamental S0 si trecerea sa pe un nivel superior S1 duce la
excitarea moleculei. Aceasta stare de excitatie dureaza aproximativ 10-10
s, dupa care
electronul revine pe starea fundamentala initiala prin eliberarea celei mai mari parti a
energiei absorbite.
Procesele prin care poate avea loc dezexcitarea moleculei sunt: tranzitii neradiative
pe starile electronice inferioare (de exemplu, de pe S2 pe S1) sau pe starile vibrationale
inferioare, incrucisare intersistem (S1 T1), emisie de radiatie de fluorescenta (S1 S0) si
emisie de radiatie de fosforescenta (T1 T0).
Aceste procese sunt reprezentate prin diagrama Perrin - Jablonski (Figura 1.5).
Astfel, fluorescenta reprezinta radiatia emisa de catre molecule sau agregate
moleculare de pe starea singlet excitata cea mai joasa (S1), pe starea fundamentala. Durata
medie a dezexcitarii prin fluorescenta este mai scurta (10-9
– 10-7
s) decat cea a dezecitarii
prin fosforescenta.
Lungimea de unda a maximului benzii de radiatie de fluorescenta emise este
intotdeauna mai mare decat lungimea de unda a radiatiei absorbite. Diferenta intre cele
doua lungimi de unda se numeste deplasare Stokes si este datorata faptului ca dezexcitarea
are loc de pe nivelele de vibratie – rotatie asociate primului nivel excitat de singlet (S1) pe
nivelele de vibratie – rotatie asociate starii electronice de singlet fundamentale S0.
Spectrele de fluorescenta sunt de doua tipuri: 1) spectrul de excitatie a
fluorescentei, ce se obtine la o anumita valoare a lungimii de unda de emisie si reprezinta
intensitatea relativa a fluorescentei in functie de lungimile de unda de excitatie; 2) spectrul
de emisie a fluorescentei, ce se obtine la o lungime de unda de excitatie fixa si reprezinta
intensitatea relativa a fluorescentei in functie de lungimile de unda de emisie (Lakowicz
1983, Tugulea 2003, Valeur 2001, Pascu 2001 a).
Spectrele de fluorescenta indusa cu laser (LIF) sunt spectre de emisie a
fluorescentei, obtinute prin excitarea cu radiatie laser.
Un montaj experimental de LIF este format din doua sub-sisteme, dupa cum poate
fi observat in Figura 1.6.
Fig. 1.6. Schema bloc a unui motaj experimental LIF
Primul sub-sistem al unui montaj experimental LIF este sistemul laser de excitare a
fluorescentei probei, ce contine, in principal o sursa de radiatie laser, radiatie ce este
transmisa direct pe proba sau este dirijata acolo printr-un sistem de oglinzi si lentile sau
printr-o fibra optica.
Al doilea sub-sistem este cel de colectare si prelucrare a fluorescentei. Proba de
analizat se plaseaza intre cele doua sub-sisteme, iar semnalul de fluorescenta este transmis
de la aceasta la sistemul de prelucrare a fluorescentei printr-o fibra optica (Pascu 2001 b).
12
Fibra optica utilizata pentru transmiterea semnalului de fluorescenta (poate fi
monofibra sau manunchi de fibre) trebuie sa fie aleasa in functie de spectrul potential al
fasciculului optic care trebuie transmis si de eficienta acestei transmisii. Fibra optica
contine un miez (mediu optic dielectric transparent pentru radiatia optica) de lungime mare
si sectiune (circulara) relativ mica. Indicele de refractie al miezului este constant sau radial
variabil. Miezul este inconjurat de un material cu indice de refractie mai mic pentru ca
radiatia luminoasa ce se propaga in miez sa sufere o reflexie totala la zona de separare
dintre cele doua medii. Divergenta fasciculului care patrunde in fibra nu trebuie sa
depaseasca unghiul de acceptanta al acesteia (Trager 2007).
Sub-sistemul de culegere si prelucrare a fluorescentei poate sa fie format dintr-un
monocromator, care asigura analiza spectrala prin descompunerea dupa lungimi de unda a
radiatiei de fluorescenta emisa de proba, un fotodetector (fotomultiplicator), ce transforma
fluxul luminos al radiatiei de fluorescenta intr-un semnal electric cu tensiune proportionala
cu acest flux si un osciloscop ce este utilizat pentru a vizualiza si masura semnalele
provenite de la fotodetector. Schema acestui sistem este prezentata in Figura 1.7.
Fig 1.7. Schema unui sistem de colectare si prelucrare
a fluorescentei (Smarandache 2012 a)
Un alt sistem ce poate fi utilizat pentru colectarea si prelucrarea fluorescentei este
format dintr-un sistem integrat policromator – camera CCD. In acest caz ansamblul
monocromator-fotomultiplicator este micsorat la dimensiuni de ordinul a 100 mm.
Fotodetectorul (camera CCD) este constituit dintr-o matrice de 2048 detectori cu
semiconductori avand dimensiuni de ordinul a 10m fiecare. Un sistem electronic controlat
de un soft dedicat culege semnalul emis de acesti detectori (Smarandache 2012 a).
Sistemul de colectare si prelucrare a fluorescentei poate fi reprezentat si de un
spectrometru UV-Vis-NIR, conectat la un calculator pe care opereaza un soft dedicat.
Achizitia spectrului este facuta prin intermediul unei fibre optice monomod, cu diametrul
miezului de 1 mm.
13
Spectroscopia LIF este o metoda utila de punere in evidenta a structurii moleculare
si a modificarilor induse in structura moleculelor datorita sensibilitatii sale ridicate si a
caracterului nedistructiv al masuratorilor (Svanberg 1990, Pascu 1998).
1.4. Spectrometria de masa
Spectrometria de masa este o tehnica analitica ce poate oferi informatii calitative si
cantitative despre masa moleculelor si atomilor din proba analizata sau structura
moleculara a compusilor.
Spectrometria de masa poate fi definita ca o metoda prin care se creeaza ioni in faza
gazoasa din atomii sau moleculele ce se gasesc in proba, se separa ionii in functie de
raportul dintre masa si sarcina (m/z) si se masoara abundenta ionilor formati.
Principiul de baza al spectrometriei de masa pleaca de la miscarea unei particule
incarcate in campurile electrice si magnetice.
Energia cinetica a unei particule incarcate intr-un camp electric este:
(1.3)
unde m este masa particulei, v este viteza, z reprezinta sarcina particulei si V este
potentialul aplicat. Traiectoria unui ion intr-un camp magnetic, H, descrie un arc cu raza r.
Conservarea momentului unghiular al particulei presupune:
(1.4)
Eliminand viteza din ecuatiile (1.3) si (1.4) rezulta:
(1.5)
Relatia (1.5) arata ca in campuri electric si magnetic constante, ionii cu acelasi
raport m/z au aceeasi traiectorie. Astfel, pentru camp magnetic si camp electric pastrate
constante in timpul masuratorilor, spectrul de masa poate fi colectat determinand pozitia
ionilor dupa ce au trecut prin campul magnetic.
Separarea moleculelor si atomilor ionizati in faza gazoasa in functie de rapoartele
m/z se face cu un spectrometru de masa.
O metoda de formare a ionilor din moleculele constituente ale probei este
bombardarea probei cu electroni:
(1.6)
unde M este molecula analizata, reprezinta un electron, iar este molecula ionizata
prin bombardare cu electroni, numita si “ion molecular”.
14
In majoritatea cazurilor, ionii moleculari au energie in exces, acumulata in urma
ionizarii, si sufera o fragmentare in alti ioni cu valori m/z mai mici. Modelul de
fragmentare ionica reprezinta amprenta moleculei analizate.
Acesti ioni sunt separati in functie de valorile m/z, iar spectrometrul de masa
masoara abundenta lor (Hammes 2005, Robinson 2005).
Componentele principale ale unui spectrometru de masa sunt prezentate in Figura
1.8. Aceasta include un sistem de introducere a probei in spectrometru, o sursa de ionizare,
un accelerator de ioni, un analizor de masa si un detector. Cu exceptia sistemului de
introducere a probei, toate celelalte componente se afla in incinte vidate. De asemenea,
aceste componente sunt conectate si la surse de alimentare.
Printre sistemele de introducere a probei in spectrometrul de masa se numara
expansiunea gazului, inserarea directa printr-un capilar sau o sonda si sistemele de
cromatografie.
Prin cromatografie (cromatografia lichida de inalta performanta – HPLC sau
cromatografie in faza gazoasa – GC) un amestec este separat in compusii constituenti, care
sunt apoi introdusi in spectrometrul de masa pentru a fi analizati. Spectrometria de masa
cuplata cu HPLC se numeste pe scurt MS – LC (Robinson 2005, Lindon 2000) .
Fig. 1.8. Schema bloc a unui spectrometru de masa
Metodele cele mai utilizate pentru ionizare sunt desorbtia/ionizarea cu laser asistata
de o matrice (MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) si ionizarea prin
electro-pulverizare (ESI – ElectroSpray Ionization).
MALDI presupune incorporarea probei intr-o matrice solida, cristalina, si folosirea
unui laser pentru desorbtia si ionizarea probei. Radiatia laser trebuie sa aiba o energie mare
si o lungime de unda la care matricea absoarbe puternic.
Metoda ESI creeaza un jet fin de picaturi incarcate, prin pulverizarea probei, la
aproximativ 4000 volti, printr-un varf metalic al unei duze. Acest lucru are loc la presiune
atmosferica. Picaturile pot fi incalzite pentru a facilita evaporarea solventului. Pe masura
ce picaturile se micsoreaza, densitatea campului electric creste, pana cand respingerea
15
dintre ioni face ca acestia sa paraseasca picatura. Ionii sunt apoi dirijati in analizorul de
masa cu lentilele electrostatice. Metoda ESI face posibila observarea unui domeniu extins
de valori m/z (Hammes 2005).
Analizorul de masa are rolul de a diferentia ionii in functie de raportul lor m/z.
Unele analizoare de masa permit trecerea la un anumit moment de timp numai a ionilor ce
au o anumita valoare m/z, insa altele permit trecerea simultana a tuturor ionilor. In a doua
categorie se incadreaza si analizorul de masa cu timp de zbor (TOF – time-of-flight).
Analizorul TOF nu foloseste o forta externa pentru a separa ionii in functie de m/z,
ci functioneaza prin accelerarea unor pulsuri de ioni intr-o regiune fara nici un camp,
numita tub de deriva (drift). Daca toti ionii au aceeasi energie cinetica, atunci viteza unui
ion depinde de raportul m/z, sau doar de masa sa daca toti ionii au aceeasi sarcina. Ionii
mai usori vor trece mai repede prin tubul de drift si vor fi detectati primii. O schema a
acestui proces este prezentata in Figura 1.9.
Fig. 1.9. Separarea a doua specii ionice intr-un tub de drift al unui analizor TOF
Pentru spectrometrele de masa care masoara pe rand cate o valoare m/z se folosesc
detectorii cu un singur canal de ioni, cum ar fi multiplicatorul de electroni sau detectorul
Faraday. Pentru spectrometrele de masa ce pot extrage simultan ioni cu mai multe valori
m/z este necesara detectia simultana a acestor ioni. Pentru aceste spectrometre se folosesc
detectori multipli (Robinson 2005).
1.5. Tehnici de cromatografie
Daca in spectrometria de masa se considera cromatografele a fi sisteme de
introducere a probei in spectrometrul de masa, in cromatografie se considera ca
spectrometrele de masa sunt “detectori” pentru cromatografe.
Tehnicile de cromatografie permit separarea compusilor asemanatori din
amestecurile de substante, prin transportarea probei (analit) printr-un mediu de material
(faza stationara) de catre un fluid (faza mobila).
Tehnica a fost denumita “cromatografie” de catre botanistul Mikhail Tswett, care a
pus un amestec de pigmenti din plante deasupra unei coloane de sticla plina cu particule de
carbonat de calciu. Elutia continua a amestecului de pigmenti prin coloana, cu un solvent
16
aditional, numit eluent, a dus la separarea pigmentilor, ce aveau aspectul unor benzi
colorate care se miscau prin coloana cu viteze diferite (Robinson 2005).
Tehnicile de cromatografie se pot clasifica in functie de:
1. Natura fazei mobile (de exemplu: cu gaz, cu lichid) si subdivizate in functie de
natura fazei stationare (de exemplu: cromatografie lichid-solid, cand faza mobila
este un lichid si faza stationara un solid);
2. Procesele fizico-chimice care stau la baza separarii (cromatografie de adsorbtie, de
partitie, cu schimbatori de ioni, de excluziune, cu strat molecular);
3. Modalitatea de imobilizare a fazei stationare (cromatografie pe coloana si planara);
4. Tehnica de developare (developare prin elutie, analiza frontala, developare prin
transferare).
Proprietatile critice ce definesc un proces cromatografic sunt:
- fazele stationara si mobila sa fie imiscibile;
- curgerea fazei mobile sa aiba loc de la un capat la celalalt al fazei stationare;
- diferite rate de partitie pentru fiecare solvat din amestec si multe cicluri ale acestui
proces in timpul elutiei;
- un mijloc de vizualizare al benzilor solvatilor separati pe faza stationara sau un
mijloc de detectare a peakurilor din faza mobila.
Separarea solvatilor in faza stationara se face in functie de coeficientii lor de
distributie sau de partitie (KD). KD este o masura a interactiei dintre solvat si cele doua faze
si este definit prin relatia:
(1.7)
unde este concentratia fazei organice si este concentratia fazei apoase.
Aceasta relatie e valabila in cazul in care un solvat, la echilibru, este solubil in doua
faze lichide. Cand sistemul este format dintr-o faza mobila si una stationara, atunci:
(1.8)
unde este concentratia unui component in faza stationara si este concentratia
aceluiasi component in faza mobila.
Un alt factor de luat in calcul este rata de migrare a unui component, Rm. Aceasta
este invers proportionala cu coeficientul de distributie (Tugulea 2003, Robinson 2005).
In continuare, vor fi descrise succint doua dintre tehnicile de cromatografie care au
fost folosite in cadrul tezei: cromatografia in strat subtire (TLC) si cromatografia lichida de
inalta performanta (HPLC).
In functie de materialele folosite, TLC poate fi: de adsorbtie, de partitie sau cu
schimb de ioni.
Pentru analiza unor probe prin TLC este nevoie de :
- placi de cromatografie cu faza stationara (silicagel, celuloza, oxid de zinc, oxid de
aluminiu, silicat de magneziu, carbonat de calciu etc.);
17
- solvent de developare sau sistem de soventi.
Proba ce urmeaza a fi analizata se depune in spoturi mici, ~5-10 µL, la marginea
placii. Placa se introduce in developant, cu spoturile chiar deasupra solventului, dar fara ca
acestea sa atinga solventul. Separarea solvatilor se va face in miscarea spoturilor pe placa,
miscare antrenata de vaporii fazei mobile (developantul).
In acest caz, cromatografierea se realizeaza ca urmare a adsorbtiei fazei mobile de
catre cea stationara.
Pentru alegerea corecta a materialelor necesare in TLC este important Rf, care este
definit ca raportul dintre distanta parcursa de substanta care migreaza si distanta parcursa
de frontul solventului (Tugulea 2003).
TLC este sensibila pentru cantitati mici de proba, simpla si ieftina, dar ca precizie
este inferioara HPLC.
HPLC este o tehnica de inalta performata, ce opereaza ca tehnica de partitie si este
considerata o evolutie a cromatografiei pe coloana clasica.
Datorita introducerii pompelor s-a marit presiunea de lucru (200 atm), iar
dezvoltarea unor faze stationare performante, de dimensiuni tot mai mici (granule sferice
de faza stationara, cu diametre 2-5 µm), in coloane tot mai scurte (3-10 cm) a permis
dezvolarea unui cromatograf HPLC, a carui schema bloc este prezentata in Figura 1.10.
Fig. 1.10. Schema bloc a unui cromatograf HPLC
O parte importanta a unui cromatograf HPLC o constituie detectorul. Acesta trebuie
sa fie foarte sensibil deoarece coloanele de separare performante au capacitati de incarcare
mici. De asemenea, volumul detectorilor trebuie sa aiba o valoare apropiata de volumul
probei (de ordinul μL) pentru a se putea sesiza in mod continuu peakul cromatografic. Cei
mai utilizati detectori sunt cei spectrofotometrici in UV-Vis. Alti detectori ce mai pot fi
utilizati sunt: detectorii refractometrici, cei bazati pe spectrometria de masa, cei bazati pe
FTIR, detectorii fluorimetrici, cei electrochimici etc. (Robinson 2005, Jäntschi 2009).
1.6. Tehnici de microscopie (optica, electronica de scanare, de forta atomica)
Tehnicile de microscopie sunt foarte importante in domenii precum biologia,
medicina, fizica, biofizica etc.
Microscopia optica implica trecerea luminii transmise prin proba sau reflectate de
catre aceasta printr-un set de lentile ce ofera o imagine marita a probei.
In prezent, utilizatorii microscopului nu se mai confrunta cu probleme legate de
aberatii cromatice, sferice sau cu imagini neclare, insa microscopia optica standard sau cu
camp luminos (bright field microscopy) are unele limitari. Rezolutia este limitata de
difractia luminii la aproximativ 0,2 μm, se pot vizualiza numai obiecte de culoare inchisa
sau care refracta puternic lumina, iar claritatea imaginii poate fi redusa de lumina provenita
18
din puncte aflate in afara planului focal. Aceste limitari au fost depasite prin noi tehnici de
microscopie specifice. (Davidson 2002)
Pana spre sfarsitul anilor 1980 majoritatea tuburilor microscoapelor aveau lungimi
fixe, dar apoi s-a trecut la optica corectata la infinit.
Marirea obiectivului este egala cu raportul h’/h, care este determinat de lentilele din
tubul microscopului (Ltb).
In Figura 1.11 se poate observa spatiul infinit definit de razele de lumina paralele in
fiecare unghi azimut dintre obiectiv si lentilele tubului. Acesta este spatiul in care
producatorii microscopului adauga diferite accesorii, cum ar fi iluminatoare verticale,
prisme, polarizoare etc.
Marirea obiectivului in sistemul corectat la infinit este egala cu distanta focala a
lentilelor tubului impartita la distanta focala a obiectivului.
Fig. 1.11. Mersul razelor de lumina intr-un microscop cu corectie la infinit
O alta tehnica de microscopie optica des utilizata in biofizica sau fizica este
microscopia de fluorescenta. Aceasta este o ramura a microscopiei care studiaza
fluorescenta compusilor organici si anorganici concomitent cu absorbtia si reflexia.
Microscopia de fluorescenta este o metoda foarte buna pentru a studia probele ce sunt
fluorescente in mod natural (autofluorescenta) sau ce pot deveni fluorescente prin tratarea
cu substante chimice (fluorescenta secundara).
In Figura 1.12 este prezentata configuratia unui microscop de fluorescenta, care
functioneaza in reflexie.
Se poate observa ca lumina emisa de o lampa cu mercur este focalizata de lentilele
colectoare inainte sa treaca prin diafragmele aperturii si campului. Filtrul de excitare lasa
sa treaca numai lungimile de unda dorite pentru excitarea probei. Acestea sunt reflectate
prin obiectiv pentru a ilumina proba. Lungimile de unda ale fluorescentei emise de proba
trec inapoi prin obiectiv, apoi prin oglinda dicroica si in final sunt filtrate de filtrul de
emisie.
19
Sarcina de baza a microscopului de fluorescenta este sa permita radiatiei de excitare
sa iradieze proba si apoi sa separe lumina fluorescenta radiativa mult mai slaba, de lumina
de excitare, care este mult mai intensa. Astfel, numai lumina de emisie ajunge la detector.
Zonele fluorescente rezultante stralucesc in comparatie cu fundalul intunecat, avand un
contrast suficient de bun ce permite detectia.
Fig. 1.12. Schema unui microscop de fluorescenta, ce functioneaza in reflexie
Un avantaj al microscopiei de fluorescenta este ca, desi aceasta nu asigura o
rezolutie spatiala sub limita de difractie a obiectivului respectiv, prezenta moleculelor
fluorescente sub aceste limite este vizibila (Davidson 2002).
O alta metoda des intalnita in studiul biomoleculelor complexe si a agregatelor
moleculare este microscopia electronica.
Microscopia electronica de scanare (scanning electron microscopy - SEM) este una
dintre cele mai populare tehnici de microscopie, iar microscopul electronic de scanare este
cel mai folosit instrument dintre cele cu fascicul de electroni.
SEM produce imagini ce pot fi usor comparate cu cele ale microscoapelor optice, in
timp ce rezolutia sa se apropie de 0,5 nm.
Proba este examinata cu un fascicul de electroni si scanata pe toata suprafata.
Radiatiile de la proba, stimulate de raza incidenta, sunt detectate, amplificate si folosite
pentru a modula luminozitatea unui al doilea fascicul de electroni sincronizat cu primul.
Daca aria scanata pe tubul de afisaj este A x A si aria scanata de pe proba corespunzatoare
este B x B, atunci marirea liniara este M = A/B. Marirea este astfel geometrica in origine si
poate fi schimbata variind aria scanata de pe proba.
Componentele pot fi impartite in doua categorii principale. In prima categorie intra
sistemul electro-optic si sistemul detector, iar in a doua sistemele de scanare, procesare si
afisare.
20
Componentele electro-optice sunt descrise ca fiind “coloana” instrumentului, in
timp ce celelalte componente sunt “consola” instrumentului. Sursa de electroni este
reprezentata de tunul ce produce electroni din catozi de lanthanum hexaburid sau tungsten
sau dintr-o sursa cu emisie in camp. Acesti electroni sunt apoi accelerati la o energie ce
variaza intre 500 eV pana la 30 keV. Fasciculul de electroni este focalizat pe proba de una
sau mai multe lentile condensoare. In general, lentila obiectiv-finala este de tip pinhole, cu
proba aflandu-se in afara campului magnetic al lentilei. Acest aranjament asigura accesul la
proba. In instrumentele mai moderne se folosesc lentile cu imersie, in care proba se afla in
interiorul lentilelor, in centrul campului lentilelor.
Marirea in SEM poate fi controlata pe un domeniu pana la 6 ordine de marime, de
la 10 pana la 500000 de ori. Spre deosebire de microscoapele optice, marirea imaginii in
SEM nu depinde de puterea lentilelor obiectivului. In SEM, marirea rezulta din raportul
dintre dimensiunile cadrului de pe proba si cadrului afisat de dispozitiv. Presupunand ca
ecranul de afisare are o dimensiune fixa, o marire mai mare rezulta din reducerea
dimensiunii cadrului de pe specimen (Amelinckx 1997).
O alta tehnica de microscopie utila in analiza la scara nano este microscopia de
forta atomica (AFM - atomic force microscopy). Aceasta este un tip de microscopie de
scanare cu o rezolutie de ordinul fractiunilor de nanometru.
In Figura 1.13 sunt prezentate componentele principale ale unui AFM: o dioda laser
(1), un brat flexibil cu un varf ascutit care scaneaza proba (2), oglinda (3), fotodetector (4)
electronica pentru inregistrarea semnalului (5) si masa de scanare ce contine proba (6).
Cand varful aflat pe bratul flexibil este apropiat de proba, intre suprafata probei si
varful AFM apar forte ce duc la deflexiunea bratului. Aceste forte pot fi forte de contact
mecanic, forte van der Waals, forte capilare, legaturi chimice, forte electrostatice, forte
magnetice, forte Casimir etc.
Fig. 1.13. Componentele unui AFM: (1) dioda laser, (2) brat flexibil cu ac pentru scanare,
(3) oglinda, (4) fotodetector, (5) electronica pentru inregistrarea semnalului, (6) masa de
scanare pentru proba
21
Masurand deflexiunile cu un fascicul laser reflectat de pe suprafata bratului pe un
fotodetector, pe toata suprafata probei se obtine profilul 3D al probei analizate.
AFM poate functiona in mod static sau in mod dinamic. In modul static (in contact)
de operare, deflexiunea varfului este folosita ca semnal de feedback, iar in modul dinamic
varful bratului nu intra in contact cu suprafata probei.
Spre deosebire de SEM, care ofera o imagine bidimensionala a probei, AFM ofera
un profil 3D al suprafetei, si in plus AFM are o rezolutie mai buna decat SEM (Braga
2004, Ikai 2008).
1.7. Microfluidica
Microfluidica studiaza comportamentul fluidelor cu volume foarte mici, iar acest
comportament poate oferi informatii utile in identificarea produsilor de reactie formati in
micropicaturi ce contin solutii de medicamente, la interactia cu radiatia laser.
Aceste informatii pot fi oferite de masurarea tensiunii superficiale si interfaciale.
Una dintre metodele de masurare a tensiunii superficiale este metoda picaturii
atarnate. Prin aceasta metoda se poate determina tensiunea superficiala a unui lichid dupa
forma unei picaturi sau bule. Forma picaturii sau bulei este data de ecuatia Gauss-Laplace:
(
) (1.9)
care reprezinta relatia dintre curbura meniscului de lichid si tensiunea superficiala
(interfaciala), . ΔP reprezinta diferenta de presiune intre interfete, iar R1 si R2 sunt razele
principale ale curburii.
Din ecuatia Gauss-Laplace se poate afla tesiunea superficiala, folosind ca
parametru de fitare pentru coordonatele unei picaturi. Modificand se obtin mai multe
curbe teoretice. Valoarea pentru care curba toeretica se potriveste cel mai bine datelor
experimentale, reprezinta tensiunea superficiala (Figura 1.14).
Fig. 1.14. Fitarea conturului unei picaturi (Nastasa 2012)
22
Tensiometria de analiza a profilului picaturii (profile analysis tensiometry - PAT)
se bazeaza pe solutia ecuatiei Gauss-Laplace ce descrie forma profilului axisimetric al
picaturilor si bulelor. Aceasta este o metoda cu o precizie mai mare decat metodele de
contact.
PAT poate analiza formarea suprafetelor in timp, de la cateva secunde pana la
cateva ore, permitand astfel sa se atinga starile de echilibru ale straturilor de adsorbtie
(Miller 2011, Nastasa 2012).
Aceasta tehnica poate se ofere informatii despre hidrofobicitatea fotoprodusilor
obtinuti in timpul iradierii unei picaturi ce contine solutii de medicamente, sau analizand
profilul unei bule de gaz in solutie, poate oferi informatii despre fotoprodusii formati
intr-un volum mare de solutie de medicamente la interactia cu fascicul laser.
23
Capitolul II. Descrierea proprietatilor fizico-chimice ale medicamentelor
studiate
In acest capitol sunt prezentate pe larg caracteristicile medicamentelor ce sunt
studiate in aceasta teza.
Compusii analizati in acest capitol sunt: derivati ai fenotiazinei (Clorpromazina,
Promazina, Prometazina, Tioridazina), Vancomicina – antibiotic glicopeptidic, derivati
chinazolinici (BG1188 si BG1162) si ecdisteroizi (20E si 20ED).
2.1. Descrierea fenotiazinelor studiate
Prima clasa de medicamente studiate in aceasta teza sunt derivatii de fenotiazina, si
anume, Clorpromazina (CPZ), Promazina (PZ), Prometazina (PMZ) si Tioridazina (TZ).
Toate cele patru medicamente au la baza nucleul fenotiazina.
Fenotiazina are formula chimica S(C6H4)2NH si masa molara 199,27 g/mol.
Aceasta are o structura triciclica, atomii de azot si de sulf fiind atasati inelului central, si
este inrudita cu clasa tiazinelor, dupa cum se poate observa in Figura 2.1.
Fig. 2.1. Structura moleculara a fenotiazinei
Acest compus organic a fost obtinut initial din reactia difenilaminei cu sulful, insa
acum se sintetizeaza prin ciclizarea difenilsulfidelor 2-substituite. Fenotiazina sta la baza
multor medicamente antipsihotice si antihistaminice.
Denumirea de “fenotiazine” descrie intreaga clasa de medicamente neuroleptice ce
au ca nucleu fenotiazina. Fenotiazinele au aspect de pudra de culoare alba pana la galben-
pal (Taurand 2005, Kahl 2005).
In afara de activitatea antipsihotica, fenotiazinele sunt folosite si in cazurile de
insuficienta cardiaca congestiva, in tratamentul tuberculozei, iar unele studii arata ca
acestea au proprietati antibacteriene (Amaral 1992, Amaral 2007, Martins 2008, Michalak
2006).
Activitatea biologica a fenotiazinelor depinde de proprietatile lor fizico-chimice si
de prezenta unor grupari functionale in structura acestora (Eghbal 2004).
2.1.1. Clorpromazina (CPZ)
Prima dintre fenotiazinele studiate in aceasta teza este CPZ. Aceasta a fost folosita
in experimente in forma clorhidrat, forma folosita si in aplicatiile medicale.
24
Denumirea IUPAC a CPZ este 3-(2-cloro-10H-fenotiazin-10-il)-N,N-dimetil-
propan-1-amina si are formula chimica C17H19ClN2S. CPZ are masa molara 318,86 g/mol,
iar in forma clorhidrat masa molara este 355,33 g/mol.
Structura moleculara a CPZ este prezentata in Figura 2.2.a, iar reprezentarea
tridimensionala a moleculei de CPZ este data in Figura 2.2.b. Atomii de C sunt reprezentati
cu culoare gri, cei de H cu alb, atomii de azot cu albastru, atomul de clor cu verde si cel de
sulf cu galben.
Fig. 2.2.a) Structura moleculara a CPZ; b) Reprezentarea 3D a CPZ
CPZ a fost sintetizat de chimistul Paul Charpentier in decembrie 1950, pornind de
la reactia 1,4-dicloro-2-nitrobenzen cu 2-bromobenzenetiol, si a fost eliberat pe piata in
1953 ca anestezic (Charpentier 1953, López-Muñoz 2005). Din 1954 a inceput sa fie folosit
in tratamentul bolilor psihice, cum ar fi schizofrenia sau excitarea psiho-motorie (Gilman
2001).
In afara de rolul antipsihotic, s-a observat ca CPZ este eficient in tratarea malariei
la maimute (Kyle 1993) sau in tratamenul tuberculozei la oameni (Amaral 1996,
Kristiansen 1997).
In (Kristiansen 2003) a fost demonstrat ca CPZ mareste susceptibilitatea la
oxacilina a unor tulpini Staphylococcus aureus rezistente la meticilina (MRSA), iar in
(Pascu 2011, Pascu 2013, Alexandru 2013) s-a aratat ca CPZ devine activ impotriva unei
tulpini de Staphylococcus aureus MRSA in urma expunerii la radiatie laser.
Studiile au aratat ca expunerea CPZ la radiatie UV poate genera radicali cu timp de
viata foarte scurt (Felmeister 1964, Goucher 1975), dar si fotoprodusi de reactie stabili
(Pascu 2013, Trautwein 2012, Nałecz-Jawecki 2008, Schröder 2006).
Produsi similari cu radicalii obtinuti de Felmeister, cu timp de viata scurt sau stabili
pentru un timp indelungat, au putut fi obtinuti prin oxidarea CPZ cu saruri ferice (Fels
1959), prin procese metabolice (Forrest 1958), prin oxidare electrochimica (Merkle 1964)
si prin oxidare enzimatica (Piette 1964).
Radicalii obtinuti prin expunerea CPZ la radiatie UV cresc foto-toxicitatea
solutiilor de CPZ (Elisei 2002).
In (Pascu 2013) s-a demonstrat ca expunerea la radiatie laser, la lungimea de unda
266 nm, a solutiilor de CPZ duce la formarea in solutia iradiata a PZ, hidroxipromazina sau
PZ sulfoxid, hidroxipromazina sulfoxid si CPZ sulfoxid si alti aproximativ 200 de
fotoprodusi.
25
2.1.2. Promazina (PZ)
Al doilea medicament studiat din clasa fenotiazinelor este PZ. La fel ca si CPZ, PZ
a fost folosita in forma clorhidrat in experimente (PZ HCl).
Formula chimica a PZ este C17H20N2S, iar denumirea sa conform IUPAC este N,N-
dimetil-3-(10H-fenotiazin-10-il)-propan-1-amina. PZ are masa molara 284,42 g/mol, iar
masa molara a PZ HCl, forma utilizata in experimentele prezentate in Capitolul III al tezei,
este 320,88 g/mol.
Diferenta dintre structura moleculara a PZ si cea a CPZ consta intr-un atom de clor
pe care CPZ il are in plus fata de PZ.
In Figura 2.3.a este prezentata structura moleculara a PZ, iar in Figura 2.3.b se
poate observa reprezentarea 3D a moleculei de PZ.
Fig. 2.3.a) Structura moleculara a PZ; b) Reprezentarea 3D a PZ
In Figura 2.3.b atomii de carbon sunt reprezentati cu culoare gri, cei de H cu alb,
atomii de azot cu albastru, iar atomii de S cu galben.
PZ este sintetizata prin alchilarea fenotiazinei cu 3-clor-dimetil-aminopropil, in
prezenta amidei de sodiu (Charpentier 1950 a).
La fel ca si CPZ, PZ face parte din clasa medicamentelor antipsihotice si este
prescrisa in tratamentul schizofreniei, insa nu este aprobata in Statele Unite pentru
tratamentul oamenilor (Promazina 2013).
Unele studii arata ca Promazina are potentialul de a imbunatati activitatea
citotoxica a Doxorubicinei impotriva unor celule de adenocarcinom uman (Kuzma-Richeret
2011).
PZ este fotosensibila si poate fi modificata sub influenta radiatiei UV, la fel ca si
CPZ (Dinache 2013).
2.1.3. Prometazina (PMZ)
PMZ face parte din clasa fenotiazinelor, insa are un efect antipsihotic slab, dar un
efect sedativ puternic. De asemenea, este folosit impotriva greturilor si ca antialergic.
Impreuna cu codeina este folosit si impotriva tusei.
Acesta are aspectul unei pudre cristaline alb-galbuie care, in contact prelungit cu
26
aerul, se oxideaza si isi modifica culoarea in bleu (Prometazina 2008, Gocke 1996).
PMZ este un compus racemic, iar enantiomerii sai pot avea efecte farmaceutice
diferite (Bosakova 2002).
Denumirea conform regulilor IUPAC a PMZ este (RS)-N,N-dimetil-1-(10H-
fenotiazin-10-il)propan-2-amina. PMZ are formula chimica C17H20N2S.
Acesta este utilizata in toate experimenetele in forma clorhidrat (HCl).
Masa molara a PMZ este 284,42 g/mol, iar masa molara a PMZ HCl, este
320,88 g/mol. Formula chimica si, implicit, masa molara sunt egale cu cele ale PZ, insa,
din Figura 2.4.a se poate vedea ca PMZ are structura moleculara diferita de PZ.
Reprezentarea 3D a moleculei de PMZ este data in Figura 2.4.b. Atomii de C sunt
reprezentati cu culoare gri, cei de H cu alb, atomii de azot cu albastru, iar atomul de sulf cu
galben.
Fig. 2.4. a) Structura moleculara a PMZ; b) Reprezentarea 3D a PMZ
PMZ se obtine prin alchilarea fenotiazinei cu 1-cloro-2-(dimetilamino)propan in
prezenta amidei de sodiu (Charpentier 1950 b, Beringer 2006).
La fel ca si celelalte fenotiazine, PMZ este fotosensibil. Radiatia UV si lumina
ambientala influenteaza stabilitatea solutiilor de PMZ (Bosakova 2002).
2.1.4. Tioridazina (TZ)
TZ, ultima din clasa fenotiazinelor studiata in teza, apartine grupei piperidinelor si
a inlocuit CPZ in tratamentul psihozelor deoarece produce mai putine efecte adverse decat
CPZ. TZ este utilizata in tratarea tuberculozei, fiind eficace impotriva tulpinilor de
Mycobacterium tuberculosis rezistente la tratament (Amaral 2010, Viveiros 2005, Ordway
2003).
Denumirea IUPAC a TZ este 10-2-[(RS)-1-Metilpiperidin-2-yl]etil-2-
metilsulfanilfenotiazina.
Formula chimica a TZ este C21H26N2S2. La fel ca si celelalte fenotiazine, TZ este
folosit in experimente in forma clorhidrat.
Masa moleculara a TZ este 370,57 g/mol, iar in forma clorhidrat 407,03 g/mol.
Structura moleculara a TZ este prezentata in Figura 2.5.a, iar a reprezentarea 3D a
TZ in Figura 2.5.b. Atomii de C sunt reprezentati cu culoare gri, cei de H cu alb, atomii de
27
azot cu albastru si atomii de sulf cu galben.
Fig. 2.5.a) Structura moleculara a TZ; b) Reprezentarea 3D a TZ
La fel ca PMZ, TZ este un compus racemic, cei doi enantiomeri avand aceleasi
proprietati fizice, cu exceptia comportarii la interactia cu lumina polarizata, un enantiomer
rotind planul de polarizare spre dreapta – notat (+), si celalalt rotind planul de polarizare
spre stanga – notat cu (-).
Studiile au demonstrat ca cei trei compusi chirali au proprietati antibacteriene, iar
TZ(-) prezinta cea mai scazuta activitate asupra creierului (Hendricks 2005).
Ca si celelalte fenotiazine studiate, TZ este fotosensibila, iar prin foto-ionizare
poate genera un radical cationic si un electron solvatat. Stabilizarea radicalul cationic este
favorizata de formarea unor agregate moleculare mici.
Studiile au aratat ca radicalul cationic format prin expunerea TZ la radiatie UV
creste foto-toxicitatea solutiilor de TZ, la fel ca in cazul CPZ (Rodrigues 2006, Elisei
2002).
2.2. Descrierea Vancomicinei (VCM)
Vancomicina (VCM) este un antibiotic folosit in unele cazuri ca ultima solutie in
lupta impotriva rezistentei la tratamente multiple (MDR) a bacteriilor Gram-pozitive.
McCormick si McGuire, de la compania Eli Lilly & Co. au izolat, pentru prima
data, dintr-o proba de sol din Indonezia un microorganism numit Streptomyces orientalis,
microorganism ce produce o substanta cu activitate antibiotica (Vancomicina) atunci cand
este crescut in mediu de cultura artificial (McCormick 1962).
VCM este activa impotriva majoritatii bacteriilor Gram-pozitive si impotriva
catorva organisme anaerobe (de exemplu Clostridium difficile). Insa, din cauza efectelor
secundare grave, administrarea VCM este ultima optiune de tratament, VCM fiind, in
general utilizata doar in tratarea infectiilor cu stafilococi rezistenti la meticilina si/sau
penicilina (Sheldrick 1978, Van Bambeke 2006).
Formula chimica a VCM este C66H75Cl2N9O24. Aceasta are masa moleculara
1449,25 g/mol. In experimentele prezentate in Capitolul IV al tezei, VCM a fost folosit
numai in forma clorhidrat, forma utilizata si in aplicatiile medicale.
28
In Figura 2.6.a este prezentata structura moleculara a VCM, iar in Figura 2.6.b se
poate observa reprezentarea 3D a moleculei de VCM.
In Figura 2.6.b, atomii de C sunt reprezentati cu gri, cei de oxigen cu rosu, atomii
de H cu alb, cei de N cu albastru si cei de clor cu verde.
Fig. 2.6. a) Structura moleculara a VCM; b) Reprezentarea 3D a VCM
29
VCM este formata dintr-o dizaharida atasata la al patrulea reziduu de aminoacid din
nucleul aglican. Nucleul este o heptapeptida, ce este relativ comuna antibioticelor
glicopeptidice (Nieto 1971 a).
Activitatea antibacteriana consta in inhibarea transglicozilarii complexului lipidic
fosfodizaharida-pentapeptida in timpul celui de-al doilea stagiu al sintezei peretelui celular,
inhiband astfel biosinteza peretelui celular al bacteriei prin legarea acil-D-alanil-D-alanina
(acil-D-Ala-D-Ala) la capatul carboxil liber prin 5 legaturi de hidrogen (Allen 2003, Nieto
1971 a, Nieto 1971 b, Reynolds 1989, Watanakunakorn 1984).
Studiile au aratat ca VCM formeaza homodimeri si ca dimerizarea imbunatateste
activitatea antibacteriana (Allen 2003, Nieto 1971 a). In (Gerhard 1993) a fost sugerat ca
homodimerii se formeaza in solutii apoase fara sa fie necesara prezenta unui ligand
peptidic si ca zaharidele contribuie la dimerizare. In acelasi timp, au fost investigate
mecanismele de clorinare si a fost demonstrat ca atomii de clor sunt implicati in
stabilizarea dimerilor.
Structura de cristalizare a VCM confirma existenta moleculelor sub forma de
dimeri asimetrici, dar rolul zaharidelor nu este confirmat. Se pare ca acestea se orienteaza
catre peretele celular al bacteriei, insa nu participa la legaturile de hidrogen dintre unitatile
de monomeri. Un rol important in activitatea moleculelor de VCM se pare ca il are
asparagina din catena laterala, ce se indoaie pentru a tine situsul de legare intr-o
conformatie convenabila pentru dockingul peptidei (Schafer 1996).
Studiile au demonstrat ca moleculele de VCM pot forma dimeri in configuratiile
“spate-in-spate” (“back-to-back”) sau “fata-in-fata” (“face-to-face”), si mai mult, la
concentratii suficient de mari, dimerii de VCM se pot aranja “unul-langa-altul” (“side-by-
side”) (Schafer 1996, Loll 1998, Nitanai 2009). Cateva mecanisme prin care dimerizarea
imbunatateste activitatea antibacteriana au fost descrise (Loll 1998, Mackay 1994).
Daca nu ar avea loc dimerizarea, activitatea antibacteriana a VCM ar scadea. Spre
exemplu, cand este indepartat substituentul clorului din inelul aromatic activitatea
antibacteriana este redusa cu 30% (Gerhard 1993).
Pierderea amoniacului transforma moleculele de VCM in produsul de degradare
CDP-1, care cristalizeaza sub forma de monomer si nu prezinta activitate antibacteriana.
De asemenea, atomul de clor al CDP-1 are o orientare diferita comparativ cu VCM
(Sheldrick 1978, Schafer 1996, Nitanai 2009, Harris 1983).
Datorita gruparilor ce absorb radiatia UV, VCM are potentialul de a fi modificata
prin expunere la radiatie laser. Fotoprodusii VCM ar putea avea toxicitate redusa fata de
moleculele neexpuse.
2.3. Descrierea derivatilor chinazolinici
Chinazolinele constituie o clasa importanta de compusi datorita proprietatilor lor
farmaceutice variate, acestea avand efecte diuretice, antihipertensive, antitumorale,
antialergice, antiinfectioase, analgezice, anti-inflamatoare si antifungice (Alagarsamy
2007, Fry 1987, Mani Chandrika 2008, Grover 2006, Rohini 2009).
Chinazolina este formata din doua inele aromatice simple, unul benzenic si unul
pirimidinic. Formula chimica a chinazolinei este C8H6N2, iar masa sa moleculara este
30
130, 14 g/mol. Structura moleculara a chinazolinei este prezentata in Figura 2.7.
Fig. 2.7. Structura moleculara a chinazolinei
Chinazolina are aspectul unei pudre cristaline de culoare galbena, iar derivatii de
chinazolina au culori de la alb-galbui pana la galben inchis.
Sinteza derivatilor chinazolinici porneste, in principal, de la acidul antranilic si
benzonitril, insa are loc pe mai multe cai, in functie de activitatea ce se doreste a fi obtinuta
(Brown 1996, Wang 2013).
Sinteza derivatilor chinazolinici studiati in aceasta teza, BG1188 si BG1162, este
prezentata in (Baïtiche 2004). Cei doi derivati chinazolinici fac parte dintr-o clasa
sintetizata de grupul de cercetare UMR-MD1, de la Facultatea de Farmacie si Medicina din
Marsilia, Franta. BG1188 si BG1162 au fost sintetizati pentru a creste susceptibilitatea
unor tulpini de bacterii Gram-negative la antibiotice. Acestia au rol de inhibitori ai
pompelor de eflux (Chevalier 2010).
2.3.1. BG1188
Derivatul chinazolinic BG1188 are formula chimica C12H14N4O3, avand compozitia
C(54,96%) H(5,38%) N(21,36%) O(18,30%). Masa molara a BG1188 este 262,26 g/mol.
Fiind un derivat nou sintetizat, ale carui proprietati nu sunt cunoscute inca, cu
ajutorul unui program de modelare (ChemSketch, ACD Labs) au fost calculate teoretic
cateva caracteristici ale moleculei de BG1188.
Densitatea calculata este 1,33 ± 0,1 g/cm3, tensiunea superficiala este
54,3 ± 7 dyne/cm, iar indicele de refractie este 1,631 ± 0,05.
Structura sa moleculara este prezentata in Figura 2.8.a. O reprezentare 3D a
moleculei de BG1188 este data in Figura 2.8.b, unde atomii de C sunt reprezentati cu
culoarea gri, cei de N cu albastru, H cu alb si atomii de O cu rosu.
Fig. 2.8. a) Structura moleculara a BG1188; b) Reprezentarea 3D a BG1188
Denumirea conform normelor IUPAC a BG1188 este 3-[2-(dimetilamino)etil]-6-
nitrochinazolin-4(3H)-ona.
31
Derivatul chinazolinic BG1188 este solubil in apa si in dimetil sulfoxid (DMSO).
2.3.2. BG1162
Al doilea derivat chinazolinic studiat este BG1162. Acesta are formula chimica
C14H20N4, iar denumirea sa conform regulilor IUPAC este N,N-dietil-N'-(chinazolin-4-
il)etan-1,2-diamina.
Masa moleculara a BG1162 este 244,33 g/mol, fiind format din C(68,82%)
H(8,25%) N(22,93%).
Structura moleculara a BG1162 este prezentata in Figura 2.9.a, iar reprezentarea sa
3D poate fi observata in Figura 2.9.b. Atomii de C sunt reprezentati cu culoarea gri, atomii
de N cu albastru si cei de H cu alb.
Fig. 2.9. a) Structura moleculara a BG1162; b) Reprezentarea 3D a BG1162
Din aceleasi considerente ca in cazul derivatului chinazolinic BG1188, cateva
proprietati ale BG1162 au fost determinate cu ajutorul programului ChemSketch (ACD
Labs).
Astfel, volumul molar al BG1162 este 219,2 ± 3,0 cm3, indicele de refractie este
1,617 ± 0,02, tensiunea superficiala este 49,9 ± 3,0 dyne/cm, iar densitatea este
1,114 ± 0,06 g/ cm3.
La fel ca si BG1188, derivatul chinazolinic BG1162 este solubil atat in apa, cat si in
DMSO.
Noutatea derivatilor chinazolinici BG1188 si BG1162 impune efectuarea unor teste
de stabilitate, in conditii de mediu cat mai variate, inclusiv studierea stabilitatii in conditii
de iradiere cu fascicul laser.
2.4. Descrierea ecdisteroizilor
Ecdisteroizii sunt similari hormonului de naparlire de la insecte si se gasesc des in
plante.
Desi sunt foarte toxici pentru insecte, in cazul mamiferelor ecdisteroizii au
toxicitate foarte scazuta, probabil pentru ca mamiferele nu au un receptor bine definit
32
pentru acestia. Doza letala medie (LD50) de 20-hidroxiecdisona (20E) pentru soareci este
6,4 g/kg, in cazul unei injectii intraperitoneale (Matsuda 1970, Hunyadi 2012).
In (Kumpun 2011) este sugerat ca o dieta ce include plante ce contin ecdisteroizi
este benefica pentru sanatatea oamenilor.
La mamifere, ecdisteroizii au avut diferite efecte, incluzand activitate usor
anabolica, adaptogena, antihiperglicemica si antihiperlipidemica, activitati specifice
impotriva celulelor canceroase (Báthori 2008, Dinan 2006, Dinan 2009, Lafont 2009).
Cel mai abundent ecdisteroid in natura este 20E.
Fig. 2.10. a) Structura moleculara a 20E; b) Reprezentarea 3D a 20E
Structura moleculara a 20E este prezentata in Figura 2.10.a, iar reprezentarea 3D a
ecdisteroidului este data in Figura 2.10.b, unde atomii de C sunt reprezentati cu gri, cei de
H cu alb si atomii de O cu rosu.
Formula chimica a 20E este C27H44O7, iar masa sa moleculara este 480,63 g/mol.
Gruparile hidroxil prezente in molecula de 20E fac ca aceasta sa aiba o polaritate
mare, o proprietate caracteristica majoritatii ecdisteroizilor (Hunyadi 2012).
Cel de-al doilea ecdisteroid studiat este 20-hidroxiecdisone 2,3;20,22-diacetonida
(20ED). 20ED este derivatul lui 20E si poate fi sintetizat foarte usor din acesta.
In Figura 2.11.a este prezentata structura moleculara a 20ED, iar reprezentarea 3D
a acestuia este data in Figura 2.11.b. Codul culorilor atomilor este acelasi ca in Figura 2.10.
Fig. 2.11. a) Structura moleculara a 20ED; b) Reprezentarea 3D a 20ED
20ED are formula chimica C33H52O7, iar masa lui moleculara este 560,76 g/mol.
33
Spre deosebire de 20E, polaritatea compusului 20ED este mai mica in comparatie
cu majoritatea ecdisteroizilor, probabil si pentru ca are mai putine gupari hidroxil prezente
in molecula.
In (Martins 2010) s-a demonstrat ca 20ED actioneaza sinergistic cu doxorubicina
impotriva celulelor canceroase.
Ambii ecdisteroizi contin o jumatate enona in inelul aromatic B, ceea ce
favorizeaza absorbtia radiatiei UV. Astfel, prezenta gruparii 7-en-6-ona in inelul B face ca
ecdisteroizii 20E si 20ED sa fie fotosensibili, stabilitatea acestora urmand sa fie studiata in
conditii de iradiere cu fascicul laser.
34
REZULTATE ORIGINALE
35
Capitolul III. Studiul stabilitatii solutiilor de fenotiazine
3.1. Introducere
Acest capitol descrie studiile de stabilitate a solutiilor de fenotiazine sub influenta
factorilor de mediu. Desi studiile de stabilitate nu au avut ca scop final aprobarea pe piata a
noi medicamente, acestea fiind preliminare, cu caracter de cercetare, stabilitatea
medicamentelor a fost testata luand in considerare si normele stabilite la Conferinta
Internationala pentru Armonizarea Conditiilor Tehnice pentru Inregistrarea
Farmaceuticelor pentru Uz Uman.
Evaluarea stabilitatii medicamentelor este necesara pentru a stabili in ce fel
calitatile de interes ale unui medicament variaza in timp sub inflenta factorilor de mediu
naturali sau artificiali si in ce intervale de timp ele pot fi folosite pentru aplicatii (ICH Q1A
2003).
Normele generale stabilite in (ICH Q1A 2003) descriu pasii ce trebuie urmati
pentru a stabili termenul de valabilitate al unui medicament (cat timp acesta isi pastreaza
proprietatile de interes nemodificate) si conditiile de pastrare ce trebuie indeplinite.
Normele testelor de fotostabilitate, stabilitatea medicamentelor in conditii diferite
de iluminare, sunt descrise in (ICH Q1B 1996).
Fenotiazinele studiate in acest capitol sunt Clorpromazina (CPZ), Promazina (PZ),
Prometazina (PMZ) si Tioridazina (TZ). Acestea au fost descrise pe larg in Capitolul II al
tezei. Fenotiazinele au fost folosite in forma clorhidrat in toate experimentele desfasurate.
Solutiile de fenotiazine au fost preparate in apa ultra pura, deionizata, obtinuta de la
un sistem TKA Genpure, cu un filtru steril TKA Pacific UP/UPW6, avand continut
bacterian <1CFU/ml si continut de particule <1 particula/mL, la o rezistivitate de
18,2 MΩxcm si conductivitate de 0,055 μS/cm, la 25°C.
Concentratiile probelor utilizate in experimentele de stabilitate au variat intre 10-4
M
si ~5x10-2
M (20 mg/ml). In functie de rezultatele si de aplicatiile urmarite, au fost folosite
concentratia masica si concentratia molara, valorile echivalente pentru concentratiile
utilizate in experimente fiind date in Tabelul 3.1.
Tabel 3.1. Concentratiile masice si molare ale fenotiazinelor folosite in experimente.
Numele Masa
(g/mol)
Concentratia masica
(mg/ml)
Concentratia molara
(M)
CPZ HCl 355,33 20 5,6285x10-2
0,0355 10-4
PZ HCl 320,88 20 6,2328 x10-2
0,0320 10-4
PMZ HCl 320,88 20 6,2328 x10-2
0,0320 10-4
TZ HCl 407,03 20 4,9136 x10-2
0,0407 10-4
36
Pentru studierea stabilitatii in timp a solutiilor de fenotiazine, au fost preparate
concentratii de 10-4
M in apa ultra pura, deionizata. Probele au fost pastrate la 4oC, la
intuneric. Spectrele de absorbtie in UV-Vis au fost inregistrate la intervale diferite de timp
de la prepararea probelor pentru a urmari daca apar modificari ale solutiilor de fenotiazine.
Evaluarea fotostabilitatii solutiilor de fenotiazine a fost facuta pentru probe
neiradiate pastrate intervale lungi de timp in intuneric si pentru probe expuse/iradiate cu
fascicul laser.
Dupa inregistrarea spectrelor de absorbtie ale fenotiazinelor neiradiate se alege
lungimea de unda la care se efectueaza iradierea/expunerea. Aceasta va fi cat mai apropiata
de lungimea de unda la care exista un maxim de absorbtie al moleculei studiate.
Evaluarea modificarilor moleculelor de medicament s-a facut inregistrand spectrele
de absorbtie UV-Vis-NIR ale solutiilor neiradiate si la diferite intervale de timp dupa
iradiere.
Montajul experimental utilizat pentru a iradia solutiile de fenotiazine si pentru a
inregistra modificarile induse de fasciculul laser este prezentat in Figura 3.1.
Fig. 3.1. Montajul experimental de iradiere a fenotiazinelor si repreprezentarea generica a
tehnicilor de masurare a stabilitatii lor
Spectrele de absorbtie se inregistreaza cu un spectrofotometru de absorbtie in UV-
Vis-NIR Lambda 950 de la Perkin-Elmer, SUA. Domeniul spectral al spectrofotometrului
este 175 – 3300 nm. Acesta are o rezolutie ≥ 0,05 nm in domeniul UV-Vis si ≥ 0,20 nm in
NIR. Eroarea intrinseca a spectrofotometrului este de 0,004%. Acesta este de tip dublu
fascicul, dublu monocromator, si este controlat de un microcomputer. Spectrofotometrul
are o retea de difractie cu 1440 linii/mm pentru domeniul spectral UV-Vis si 360 linii/mm
pentru NIR, in montura Littrow. Sistemul de divizare a fasciculului contine un chopper de
46 Hz, cu ciclu intuneric/proba/intuneric/referinta, cu corectie a semnalului. Detectia
semnalului se realizeaza cu ajutorul fotomultiplicatorului R6872 pe intreg domeniul UV-
Vis. Pentru domeniul spectral NIR, detectia semnalului de realizeaza cu un detector PbS cu
37
racire Peltier. Sursele sunt reprezentate de o lampa de tungsten-halogen si o lampa de
deuteriu, ambele prealiniate.
Pentru iradierea probelor se foloseste un laser pulsat cu Nd:YAG “Surelite II”,
Excel Technology (Continuum, SUA), cu frecventa 10 Hz, pompat cu lampi flash. Laserul
poate genera patru lungimi de unda fixe, fiind dotat cu cristale neliniare: 1064 nm, 532 nm,
355 nm si 266 nm. Pentru Q-switch se foloseste o celula Pockels si optica Gaussiana.
Fasciculul laser este trecut printr-un filtru neutru, colimat cu ajutorul unui telescop si
focalizat pe proba prin lentile cu distanta focala lunga, pentru a putea controla si reproduce
conditiile de iradiere.
Solutiile de fenotiazine au fost iradiate in cuve de cuart, cu drum optic de 10 mm, la
lungimile de unda 266 nm si 355 nm, reprezentand a patra (fourth harmonic generation –
FHG), respectiv a treia (third harmonic generation – THG) armonica a radiatiei
fundamentale emise de laseru Nd:YAG la 1064 nm. Energia fasciculului laser a variat de la
6,5 mJ la 30 mJ, in functie de experiment, la fel ca si timpul de expunere a probelor.
Volumul probei iradiate a fost de 2 mL si a fost amestecat pe toata durata expunerii
la radiatie laser cu ajutorul unui agitator magnetic (AREC.X, VELP Scientifica) cu o viteza
de 600 rotatii/minut. Fasciculul laser a fost focalizat deasupra magnetului, pentru a se
asigura ca toata radiatia interactioneaza cu solutiile de fenotiazine.
Un alt indicator al modificarilor ce pot aparea in timpul iradierii este pH-ul solutiei.
Masuratori ale pH-ului solutiilor de fenotiazine au fost inregistrate inainte si dupa
expunerea la radiatie laser.
La finalul experimentelor de stabilitate a fost evaluata activitatea antibacteriana a
solutiilor de fenotiazine neiradiate si iradiate.
3.2. Stabilitatea in timp a solutiilor de fenotiazine
Stabilitatea in timp a solutiilor de CPZ 10-4
M in apa ultra pura a fost urmarita pe
parcursul a 144 de ore (6 zile). Probele au fost pastrate la intuneric, la 4oC, si au fost scoase
din frigider cu 30 minute inainte de inregistrarea spectrelor de absorbtie pentru a se asigura
ca solutiile ajung la temperatura camerei, fiind pastrate tot la intuneric.
Pentru a studia stabilitatea solutiilor de CPZ 10-4
M in apa ultra pura au fost
inregistrate spectrele de absorbtie ale probelor imediat dupa preparare si la diferite
intervale de timp, pana la 144 ore de la preparare. Comparand spectrele prezentate in
Figura 3.2 se poate observa ca variatia maximelor de absorbtie ramane in limitele de eroare
ale sistemului de masura pe toata durata experimentelor, ceea ce indica faptul ca solutiile
de CPZ 10-4
M in apa ultra pura raman stabile pe durata masuratorilor.
Eroarea totala este reprezentata de eroarea intrinseca a spectrofotometrului
(0,004%) si de o eroare indusa de pozitionarea manuala a cuvei de absorbtie (0,00407).
Pentru a calcula eroarea indusa de pozitionarea cuvei s-au facut 20 de masuratori
succesive, imediat dupa prepararea solutiilor de fenotiazine, si s-a calculat deviatia
standard pentru valorile absorbantei (extinctiei) de la 306 nm.
In Figura 3.2 se poate observa ca solutiile de CPZ 10-4
M in apa ultra pura prezinta
trei maxime de absorbtie in domeniul UV, la 202 nm, 254 nm si 306 nm.
38
Fig. 3.2. Evolutia in timp a CPZ 10
-4M in apa ultra pura.
Primul maxim de absorbtie, la 202 nmn, apare sub forma de umar, iar forma lui
poate fi influentata de oxigenul atmosferic, a carui cantitate poate varia de la o masuratoare
la cealalta. Coeficientul molar de extinctie al maximului de la 254 nm are o valoare relativ
mare (ε = 31496 L mol-1
cm-1
), indicand o tranzitie π – π*. Banda de absorbtie cu maximul
la 306 nm este mai larga, indicand probabilitatea ca aceasta sa fie formata dintr-o
superpozitie a mai multor tranzitii n – π*.
Spectrele solutiilor de PZ 10-4
M in apa ultra pura au fost inregistrate in conditii
similare cu cele descrise in cazul solutiilor de CPZ.
Figura 3.3 prezinta spectrele de absorbtie in UV-Vis ale solutiilor de PZ 10-4
M in
apa ultra pura inregistrate la diferite perioade de timp de la preparare, pentru a analiza
stabilitatea in timp a solutiilor acestui derivat de fenotiazina. Se poate observa ca solutiile
de PZ 10-4
M in apa ultra pura raman stabile pana la 144 de ore, variatia spectrelor de
absorbtie producandu-se in limitele de eroare. Eroarea experimentala a fost calculata la fel
ca in cazul spectrelor solutiilor de CPZ.
Spectrul de absorbtie al PZ 10-4
M in apa ultra pura este similar cu spectrul solutiei
de CPZ, cele doua molecule fiind asemanatoare, singura diferenta dintre ele fiind un atom
de clor, dupa cum a fost prezentat in Capitolul II al tezei.
In Figura 3.3 se pot identifica benzi de absorbtie, avand maximele la 202 nm, 252
nm si 302 nm. Maximul de la 202 nm se datoreaza, foarte probabil, in cea mai mare parte
absorbtiei oxigenului atmosferic, iar benzile de absorbtie de la 252 nm si 302 nm pot
aparea datorita unor tranzitii π – π*, respectiv n – π*.
39
Fig. 3.3. Evolutia in timp a PZ 10
-4M in apa ultra pura.
Forma spectrelor de absorbtie a solutiilor de PMZ 10-4
M in apa ultra pura este
similara cu spectrele solutiilor de CPZ si PZ. O banda de absorbtie datorata oxigenului
atmosferic apare in spectre in jurul lungimii de unda de 200 nm, dupa cum se poate
observa in Figura 3.4.
Fig. 3.4. Evolutia in timp a PMZ 10
-4M in apa ultra pura.
40
Alte doua benzi de absorbtie, caracteristice derivatului fenotiazinic, apar cu
maxime la 249 nm si 298 nm. Banda de absorbtie de la 249 nm se datoreaza, cel mai
probabil, unei tranzitii π – π*, in timp ce banda cu maximul la 298 nm se poate datora unei
tranzitii n – π*, fapt sustinut si de coeficientul molar de extinctie relativ scazut (ε = 3155 L
mol-1
cm-1
).
Spectrele de absorbtie din Figura 3.4 evidentiaza stabilitatea solutiilor de PMZ
10-4
M in apa ultra pura. Pe toata perioada experimentelor (144 ore), apar mici diferente in
extinctie, insa acestea se incadereaza in limitele de eroare.
Conditiile experimentale au fost aceleasi ca cele descrise pentru experimentele de
stabilitate a CPZ, iar eroarea experimentala a fost calculata similar.
Experimentele s-au desfasurat in aceleasi conditii si in cazul solutiilor de TZ 10-4
M
in apa ultra pura.
Stabilitatea solutiilor a fost studiata comparand spectrul de absorbtie al TZ 10-4
M in
apa ultra pura inregistrat imediat dupa preparare cu cele masurate la diferite intervale de
timp dupa preparare, pana la 144 ore (Figura 3.5).
Studiul facut pune in evidenta faptul ca solutiile de TZ 10-4
M in apa ultra pura isi
pastreaza caractesticile initiale, ramanand stabile pe toata durata experimentelor.
Fig. 3.5. Evolutia in timp a TZ 10
-4M in apa ultra pura.
Spectrul solutiei de TZ 10-4
M in apa ultra pura este caracterizat de o superpozitie de
benzi cu maxime de absorbtie la 228 nm si 262 nm, datorate unor tranzitii π – π*, si o
banda de absorbtie larga cu maximul la 312 nm. Aceasta se poate datora unei tranzitii n –
π*.
41
Spectrele celor patru medicamente studiate (CPZ, PZ, PMZ si TZ) sunt intrucatva
similare si raman stabile pe toata perioada de studiu. Aceste spectre pastreaza benzile
caracteristice radicalului fenotiazina (Houben-Weyl 1984).
3.3. Stabilitatea solutiilor de fenotiazine in conditii de iradiere cu fascicul laser
Testele de fotostabilitate ale solutiilor de fenotiazine au fost efectuate in conditii de
iradiere cu fascicul laser.
Structura fenotiazinelor poate fi modificata daca acestea sunt expuse la lumina
naturala sau la radiatie UV (Pascu 2013, Huang 1964).
Au fost testate diferite conditii de iradiere cu fascicul laser pentru optimiza si
pentru a standardiza procesul de modificare a fenotiazinelor si de obtinere a noi compusi
cu potential antimicrobial.
Un prim experiment a constat in expunerea solutiilor de fenotiazine la radiatie
laser, la o lungime de unda de 266 nm, cu o energie medie a fasciculului de 6,5 mJ.
Un volum de 2 mL de CPZ 20 mg/mL in apa ultra pura a fost expus timp de doua
ore la radiatie laser, in conditiile mentionate anterior.
Solutiile de CPZ 20 mg/mL au fost apoi diluate la 0,2 mg/mL in apa ultra pura
pentru masurarea spectrelor de absorbtie, deoarece la concentratia initiala absorbtia
probelor era prea puternica, iar detectorul era saturat sub 300 nm.
Fig. 3.6. Spectrele de absorbtie ale CPZ masurate pe o proba de solutie in apa la 0,2
mg/mL obtinuta prin diluarea probei de 20 mg/mL irradiate cu facsicul laser la 266 nm.
In Figura 3.6 sunt prezentate spectrele de absorbtie ale solutiilor de CPZ diluate la
0,2 mg/mL in apa ultrapura inainte si dupa expunere la radiatie laser, la 266 nm, cu energia
6,5 mJ.
42
Spectrul solutiei neiradiate prezinta doua benzi de absorbtie, cu maxime la 254 nm
si 306 nm, valori ce coincid cu cele obtinute in cadrul studiilor de stabilitate in timp.
Expunerea la radiatie laser timp de doua ore induce modificari ale moleculelor ce
pot fi observate in spectrele de absorbtie. Maximul de absorbtie de la 254 nm apare in
spectrul solutiei iradiate la 255 nm, iar coeficientul molar de extinctie corespunzator
descreste de la 29548 L mol-1
cm-1
la 27462 L mol-1
cm-1
. In cazul benzii de absorbtie de la
306 nm, in urma iradierii apare un efect hipsocromic, maximul deplasandu-se la 303 nm.
Deplasarea hipsocromica poate fi o consecinta schimbarii pH-ului solutiei sau a polaritatii.
In (Pascu 2013) s-a aratat ca in urma iradierii, pH-ul solutiei scade de la 5,6 (pentru
solutiile de CPZ neiradiate) la 2,3. In timpul iradierii, moleculele de CPZ se modifica si
apar noi produsi. Studiile de cromatografie in strat subtire (TLC) au identificat aparitia mai
multor compusi cu polaritati diferite. Cu ajutorul cromatografiei lichide de inalta presiune
(HPLC) cuplata cu spectrometrie de masa (MS) a fost identificata prezenta in solutiile
iradiate a peste 200 de compusi. Dintre acestia au fost identificati ca produsi de reactie
obtinuti in timpul iradierii solutiei de CPZ: promazina (PZ), hidroxipromazina sau
promazina sulfoxid, hidroxipromazina sulfoxid si clorpromazina sulfoxid (Pascu 2013).
Fig. 3.7. Spectrele de absorbtie ale PZ masurate pe o proba de solutie in apa la 0,2 mg/mL
obtinuta prin diluarea probei de 20 mg/mL irradiate cu facsicul laser la 266 nm.
Spectrele de absorbtie ale solutiilor de PZ in apa ultra pura neiradiate si iradiate cu
fascicul laser, la 266 nm, cu energia 6,5 mJ, sunt prezentate in Figura 3.7. Solutiile de PZ
au fost iradiate la concentratia de 20 mg/ml si diluate la 0,2 mg/mL inainte de inregistrarea
spectrelor de absorbtie.
Spectrul solutiei de PZ 0,2 mg/mL in apa ultra pura neiradiata prezinta un maxim
de absorbtie la 252 nm si o banda larga de absorbtie cu maximul la 302 nm. Dupa 2 ore de
43
iradiere, maximul de la 252 nm descreste, coeficientul molar de extinctie scazand de la ε =
45055 L mol-1
cm-1
la ε = 29072 L mol-1
cm-1
. Aceasta descrestere a extinctiei este o
dovada a modificarii moleculelor de PZ si de formare a noi specii in timpul iradierii, la fel
ca in cazul expunerii solutiilor de CPZ la radiatie laser.
Maximul de la 302 nm se deplaseaza dupa cele 2 ore de iradiere la 300 nm. Acest
efect hipsocromic se poate datora scaderii pH-ului solutiei sau aparitiei unor produsi de
reactie cu polaritate mai mare. Diferenta coeficientilor molari de extinctie este mai mica
decat in cazul maximului de la 252 nm. Coeficientul molar de extinctie al maximului de la
302 nm este 5687 L mol-1
cm-1
, iar in urma celor doua ore de expunere a probelor la
radiatie laser ε = 4295 L mol-1
cm-1
.
Modificarile induse in spectrele de absorbtie de expunerea la radiatie laser a
solutiilor de PMZ sunt prezentate si pot fi analizate in Figura 3.8.
Fig. 3.8. Spectrele de absorbtie ale PMZ masurate pe o proba de solutie in apa la 0,2
mg/mL obtinuta prin diluarea probei de 20 mg/mL irradiate cu facsicul laser la 266 nm.
Concentratia probelor de PMZ in apa ultra pura preparate pentru experimentele de
spectroscopie de absorbtie in UV-Vis este de 0,2mg/mL. Iradierea probelor a fost facuta in
conditiile mentionate anterior.
Spectrul de absorbtie in UV-Vis al solutiei de PMZ neiradiate prezinta doua benzi
de absorbtie cu maxime la 249 nm si la 298. Forma spectrului se modifica in timpul
iradierii, ca dovada a modificarii moleculelor de PMZ. Coeficientul molar de extinctie al
maximului de la 249 nm scade de la ε = 29125 L mol-1
cm-1
la ε = 23742 L mol-1
cm-1
.
Absorbanta maximului de la 298 nm nu se modifica vizibil, insa apare un efect
hipsocromic, maximul deplasandu-se la 295 nm. Acest efect poate fi corelat, ca si in
44
cazurile anterioare, cu scaderea pH-ului solutiei de PMZ dupa 2 ore de expunere la radiatie
laser.
Analizand spectrele de absorbtie in UV-Vis din Figura 3.9 se pot identifica
modificarile produse in solutiile TZ de expunerea la radiatie laser, la lungimea de unda de
266nm, cu o energie medie a fasciculului de 6,5 mJ. Solutiile de TZ 20 mg/mL in apa ultra
pura au fost iradiate timp de 2 ore, iar apoi diluate la 0,2 mg/ml inainte de masurarea
spectrelor de absorbtie.
Fig. 3.9. Spectrele de absorbtie ale TZ masurate pe o proba de solutie in apa la 0,2 mg/mL
obtinuta prin diluarea probei de 20mg/mL irradiate cu facsicul laser la 266nm.
In cazul spectrelor de absorbtie ale solutiilor de TZ iradiate si neiradiate se
observa mici modificari in valorile extinctiei si in forma spectrelor. Maximul benzii de
absorbtie de la 262 nm scade in urma iradierii, ajungand de la ε = 37081 L mol-1
cm-1
la ε =
36775 L mol-1
cm-1
. In cazul celui de-al doilea maxim, datorat cel mai probabil unei
tranzitii n – π*, apare o deplasare hipsocromica de la 313 nm la 309 nm.
Aceste modificari aparute in spectrele de absorbtie in UV-Vis demonstreaza ca
fenotiazinele studiate nu raman stabile in conditii de expunere la fascicul laser si ca
iradierea poate modifica structura moleculelor si poate produce noi compusi (fotoprodusi)
cu caracteristici diferite fata de medicamentul initial.
Teste de activitate antimicrobiana sunt necesare si vor fi prezentate ulterior in
cadrul tezei, la fel ca si testarea mai multor conditii experimentale de iradiere, pentru a
intelege mai bine procesul de interactie medicament – fascicul laser si pentru a optimiza
producerea de noi compusi.
45
Un alt studiu de fotostabilitate a solutiilor de fenotiazine presupune expunerea unor
solutii de CPZ 20 mg/mL la radiatie laser cu energia medie mai mare, de 30 mJ, la
lungimea de unda 355 nm, timp de 30 minute.
Primele modificari aparute in timpul iradierii pot fi observate cu ochiul liber in
probe: inca din primele minute incepe sa de formeze un precipitat de culoare verde inchis,
care apoi, daca proba se agita, se dizolva in solutie. Solutia neiradiata de CPZ este initial
incolora, insa in timpul iradierii se coloreaza treptat de la galben deschis pana la maro
inchis (Figura 3.10).
Fig. 3.10. Modificarea solutiei de CPZ 20 mg/mL in apa ultra pura in timpul iradierii
(λ = 355 nm; E = 30 mJ)
Spectrele de absorbtie ale solutiilor au fost inregistrate fara ca acestea sa fie diluate,
ca in experimentele anterioare. In acest studiu au fost urmarite modificarile aparute in
spectre in domeniul spectral 400 nm – 1300 nm.
Fig. 3.11. a) Influenta radiatiei laser (λ = 355 nm; E = 30 mJ) asupra solutiilor de CPZ la
concentratia 20 mg/mL in apa ultrapura; b) Cinetica maximelor de absorbtie ale solutiei de
CPZ in timpul iradierii.
In Figura 3.11.a se poate observa ca in timpul iradierii la 355nm, cu o energie
medie de 30 mJ, apar doua benzi de absorbtie noi, una sub forma de umar, cu maximul la
46
aproximativ 518nm, iar a doua in jurul a 946 nm. Intensitatea ambelor maxime are o
evolutie liniara in raport cu durata iradierii (Figura 3.11.b).
Aparitia acestor doua noi maxime si cresterea lor liniara confirma faptul ca
moleculele de CPZ se modifica treptat in timpul iradierii. Aceste modificari pot duce la
formarea unor produsi stabili in timp, precum cei identificati in (Pascu 2013, Trautwein
2012, Nałecz-Jawecki 2008, Schröder 2006), dar si a unor specii tranziente, a unor radicali
liberi, cu timp de viata scurt (Gocke 1996, Felmeister 1964).
Fig. 3.12. Evolutia in timp a solutiei de CPZ 20 mg/mL in apa ultra pura, dupa incetarea
iradierii.
Stabilitatea solutiei de CPZ la concentratia 20 mg/mL in apa ultra pura expusa 30
minute la radiatie laser, la 355 nm, cu energia de 30 mJ, a fost urmarita dupa incetarea
iradierii.
In Figura 3.12 se poate observa ca maximul de la 518 nm descreste putin, insa este
prezent si dupa 3 ore de la iradiere, spre deosebire de banda cu maximul in jur de 946 nm,
care descreste inca din primele minute dupa incetarea expunerii la fascicul laser, disparand
complet la 3 ore de la stoparea iradierii.
Acesta banda de absorbtie cu maximul la 946 nm poate fi atribuita radicalilor liberi
cu timp de viata scurt, spre exemplu radicalul promazil, a caror aparitie a fost semnalata in
timpul expunerii solutiilor de CPZ la radiatie UV (Gocke 1996).
Pe de alta parte, din Figura 3.11.b rezulta ca data fiind variatia liniara a extinctiei la
946 nm cu timpul de iradiere si concentratia fotoprodusului responsabil de aparitia acestui
maxim creste liniar. Aceasta arata ca formarea fotoprodusului depinde mai degraba de
mecanismele de absorbtie ale radiatiei laser de catre CPZ, decat de mecanisme de
recombinare in solutie care nu influenteaza evolutia produsului.
S-a demonstrat faptul ca prin expunerea la radiatie UV fenotiazinele au potentialul
de a forma noi compusi cu activitate antibacteriana (Pascu 2013, Pascu 2011, Alexandru
47
2013, Armada 2013), insa mecanismul de reactie prin care se formeaza acesti produsi nu
este cunoscut.
Un prim pas in a intelege procesul de interactie a radiatiei laser cu moleculele de
fenotiazine si implicit mecanismul de formare al noilor compusi a fost facut in (Dinache
2013). Pentru aceasta, au fost expuse solutii de CPZ si PZ 10-4
M in apa ultrapura la radiatie
laser timp de 2 ore. Energia medie a fasciculului a fost 6,5 mJ, la lungimea de unda 266
nm.
In Figura 3.13.a sunt prezentate spectrele solutiilor de CPZ 10-4
M inainte si dupa
iradiere, iar cele ale solutiilor de PZ 10-4
M in Figura 3.13.b.
Fig. 3.13. Spectrele solutiilor neiradiate si iradiate de a) CPZ 10
-4M si b) PZ 10
-4M in apa
ultra pura
Spectrele solutiilor de CPZ si PZ neiradiate sunt similare datorita asemanarii dintre
cele doua molecule, singura diferenta dintre ele fiind un atom de clor pe care CPZ il are in
plus fata de PZ.
Spre deosebire de primele experimente prezentate, in care solutiile de fenotiazine
au fost iradiate in aceleasi conditii (λ = 266 nm; E = 6,5 mJ; t = 2 ore; volumul probei = 2
mL), concentratiile fenotiazinelor au fost mult mai mici.
La concentratia de 10-4
M, numarul moleculelor de CPZ din volumul solutiei este
mult mai mic decat la concentratia 20 mg/mL (5,6285x10-2
M). Astfel, dupa 2 ore de
iradiere, raportul dintre numarul de molecule modificate si nemodificate este mult mai
mare la concentratia de 10-4
M, iar numarul total de molecule nemodificate eset mult mai
mic decat la 20 mg/mL. Din aceasta cauza, spectrele solutiilor iradiate din Figura 3.13
prezinta modificari mai accentuate fata de spectrele fenotiazinelor iradiate la concentratia
de 20 mg/mL (Figura 3.6).
In cazul solutiei de CPZ 10-4
M, forma spectrului de absorbtie inregistrat dupa 2 ore
de expunere la radiatie laser este total modificata, benzile de absorbtie nemaifiind vizibile.
Valoarea extinctiei benzii de absobtie la 254 nm descreste in urma iradierii de la 0,329 la
0,097, in timp ce valoarea extinctiei la 307 nm creste de la 0,041 la 0,061. Benzile de
absorbtie nu pot fi diferentiate, probabil pentru ca moleculele de CPZ sunt separate in
fragmente mici, ce au benzi de absorbtie largi, cu valori ale extinctiei mici, in acelasi
domeniu spectral.
48
Aceeasi explicatie poate fi valabila si in cazul moleculelor de PZ. Pentru spectrul
de absorbtie al solutiei iradiate de PZ la 10-4
M, valoarea extinctiei la 252 nm scade de la
0,324 la 0,105, insa valoarea extinctiei la 301 nm creste de la 0,039 la 0,066.
Concentratia de 10-4
M a fost aleasa in aceste experimente pentru ca energia
radiatiei laser (6,5 mJ) sa nu fie absorbita in totalitate de proba si sa se poata calcula
energia absorbita de moleculele dintr-un volum de 2mL de solutie. Iradierea a avut loc intr-
o cuva cu lungimea drumului optic de 1 cm.
Pentru solutiile de CPZ 10-4
M, energia absorbita in timpul iradierii scade
exponential, dupa cum poate fi observat in Figura 3.14.
Fig. 3.14. Energia absorbita de solutia de CPZ 10
-4M in apa ultra pura in timpul iradierii
Energia medie a fasciculului laser este 6,5 mJ, din care 1 mJ este absorbit de cuva
in care se afla solutia. Astfel, energia absorbita de solutia de CPZ 10-4
M, masurata la 5
minute dupa inceperea iradierii a fost 4,846 mJ si a scazut la 4,447 mJ la sfarsitul celor 2
ore de iradiere.
Fasciculul laser ce traverseaza cuva in care se afla proba este astfel focalizat incat
descrie un cilindru cu diametrul de 5 mm si inaltimea de 10 mm (egala cu latimea cuvei).
Volumul de solutie de CPZ cuprins in acest cilindru este 196,25 μL. Pentru concentratia de
10-4
M, in acest volum avem 196,25x10-10
moli de CPZ si 11,81845x1015
molecule de CPZ.
Solutia de CPZ din cuva a fost agitata in timpul iradierii cu ajutorul unui agitator
magnetic, cu viteza de 10 rotatii/secunda, iar rata de repetitie a pulsurilor laser a fost de 10
pulsuri/secunda (intervalul de timp dintre doua pulsuri succesive a fost 100 ms). Dupa
observatiile noastre, agitarea lichidului, produsa de rotatiile magnetului, nu a fost transmisa
pana la suprafata libera a lichidului din celula, unde a avut interactia cu radiatia laser.
Totusi, solutia a fost agitata astfel incat toate moleculele din volumul solutiei sa traverseze
cilindrul descris de fascicului laser in cuva si sa interactioneze cu fotonii din fascicul. In
plus, miscarea browniana si tendinta moleculelor de a migra in regiunile cu concentratia
49
mai mica, la temperatura camerei, este un proces cunoscut ce poate duce la amestecarea
moleculelor in lichid. Acesta este si cazul moleculelor de CPZ, dupa ce moleculele de CPZ
disociaza sub influenta radiatiei laser si concentratia lor scade cu cresterea timpului de
expunere la fascicul. Astfel, e de asteptat ca moleculele de CPZ sa migreze in volumul
lichidului expus la radiatie laser (in cilindrul descris de fasciculul laser in cuva). La viteza
datorata miscarii browniene, unei molecule de CPZ i-ar lua mai mult de 109 secunde sa
traverseze diagonala cilindrului descris de fasciculul laser in cuva. Acest timp este foarte
mare in comparatie cu durata pulsului laser (FWHM 6 ns) sau cu intervalul de timp dintre
doua pulsuri succesive (100 ms). Din acest motiv, presupunem ca viteza moleculelor in
volumul cilindrului descris de fasciculul laser este egala cu viteza de rotatie a magnetului si
ca pe durata unui puls laser nu exista o difuzie semnificativa a moleculelor noi de CPZ in
volumul fasciculului laser. Astfel, consideram ca pe intreaga durata a unei rotatii a
magnetului, avem un singur puls laser ce interactioneaza cu 196,25x10-10
moli de CPZ.
Energia medie masurata dupa 5 minute de iradiere a fost 4,846x10-6
kJ. Astfel,
energia medie absorbita dupa 5 minute de numarul total de moli de CPZ din cilindrul
descris de fasciculul laser in cuva a fost 241,07 kJ mol-1
. La sfarsitul celor doua ore de
iradiere, energia medie absorbita de numarul de moli de CPZ din volumul expus
fasciculului laser a fost 226,59 kJ mol-1
.
Pentru ca modificarile structurale ale moleculelor, induse de radiatia laserului la
266 nm, sa aiba loc cum au fost descrise in (Pascu 2013), energia absorbita trebuie sa fie
cel putin egala cu energia de disociere a legaturii chimice (BDE – bond dissociation
energy), pentru fiecare legatura implicata. De exemplu, primul produs identificat intr-o
cantitate insemnata in solutiile iradiate de CPZ este PZ. Pentru ca o molecula de CPZ sa se
transforme intr-o molecula de PZ este necesar sa se rupa legatura C–Cl. Pentru ca aceasta
legatura chimica sa se rupa, energia absorbita de molecula de CPZ trebuie sa fie cel putin
egala cu energia de disociere a legaturii C–Cl.
Energia de disociere a unei legaturi chimice este egala cu diferenta de entalpie ce
apare la scindarea unei legaturi si depinde de structura moleculei. Energia de disociere este
calculata in conditii standard de presiune si la temperatura de 298 K (Blanksby 2003, Luo
2003).
In general, valorile energiei de disociere a legaturii C–Cl difera in functie de tipul
moleculei, iar in cazul compusilor aromatici substituiti valorile variaza si in functie de
pozitionarea atomului de clor fata de radical. De exemplu, valorile energiei de disociere
pentru Cl–CH3 (clormetan) este 350 kJ mol-1
; pentru clorbenzen substituit, energia de
disociere a legaturii C–Cl variaza in functie de pozitionarea radicalului de la 376 kJ mol-1
la 399 kJ mol-1
. In functie de similaritatea cu moleculele de CPZ am ales pentru acest caz o
energie medie de disociere de 385 kJ mol-1
.
Pentru ca alte disocieri ale moleculelor de CPZ sa aiba loc, trebuiesc luate in calcul
si energiile de disociere ale celorlalte legaturi chimice prezente in molecula de CPZ: C–H,
C–C, C–N si C–S. Este necesar ca observatiile anterioare ce privesc energia de disociere a
legaturii sa fie considerate si pentru aceste tipuri de legaturi chimice.
Energia de disociere a C–H in metan este 439 kJ mol-1
, in inelul piridinic este 468
kJ mol-1
, iar intr-un inel piridinic substituit este 362, 365 sau 378 kJ mol-1
, in functie de
pozitia radicalului. In functie de aceste valori si de similaritatea moleculelor considerate cu
50
molecula de CPZ, am ales pentru calcule o valoare medie a energiei de disociere a C–H de
400 kJ mol-1
.
Pentru legatura C–C energia de disociere in etan este 377 kJ mol-1
, in metilbenzen
valoarea ei este 426 kJ mol-1
. In bifenil, energia de disociere a C–C este 478 kJ mol-1
, iar
energia necesara pentru a rupe un radical de un inel piridinic variaza intre 362 kJ mol-1
si
433 kJ mol-1
, relativ la pozitionarea radicalului. Tinand cont de structura moleculei de
CPZ, am selectat o valoare medie pentru energia de disociere a C–C de 430 kJ mol-1
.
Pentru nitrobenzen substituit, energia de disociere a legaturii C–N variaza intre 276
si 302 kJ mol-1
. Pentru fenil metilamina, energia de disociere a C–N este de 420 kJ mol-1
,
iar pentru fenil dimetilamina este de 390 kJ mol-1
. Tinand cont de pozitionarea legaturilor
C–N in moleculele de CPZ, am ales valoarea 300 kJ mol-1
pentru energia de disociere a
acestor legaturi.
Legatura S–C are valori diferite ale entalpiei in functie de structura moleculelor din
aceleasi motive mentionate anterior. In difenil sulfid, energia de disociere a legaturii S–C
este 327 kJ mol-1
, iar in benzentiol aceasta este 362 kJ mol-1
. In metantiol entalpia este 312
kJ mol-1
(Luo 2003). Valoarea medie a energiei de disociere a S–C a fost aleasa 330 kJ
mol-1
pentru calculele noastre.
Valoarea energiei medii absorbite de moleculele de CPZ impartita la numarul de
moli din cilindrul descris de fasciculul laser cand traverseaza cuva este pe tot parcursul
iradierii mai mica decat energia de disociere a oricarei legaturi din molecula de CPZ.
Luand in considerare aceasta si faptul ca apar modificari ale moleculelor (legaturile se rup
si se formeaza noi compusi) rezulta ca energia nu este absorbita de toate moleculele
prezente in volumul de interactie in timpul unui puls laser.
Numarul maxim de moli ce absorb in timpul unui puls laser pentru a putea rupe o
legatura chimica este dat de relatia:
(3.1)
unde N este numarul de moli din volumul considerat, E este energia medie absorbita in
timpul iradierii si BDE reprezinta energia de disociere a unei legaturi chimice.
Numarul maxim de molecule ce pot absorbi energia fasciculului laser pentru ca o
legatura sa se rupa poate fi calculat conform relatiei:
(3.2)
unde n este numarul de molecule, iar NA este numarul lui Avogadro (6.02214129(27)×1023
mol-1
).
In Tabelul 3.2 sunt date valorile obtinute pentru numarul maxim de molecule de
CPZ din volumul cuvei traversat de fasciculul laser ce absorb energia necesara pentru a
rupe fiecare tip de legatura in parte. In a doua coloana a tabelului se gasesc valorile
energiei absorbite de solutia de CPZ 10-4
M in apa ultra pura la diferite perioade in timpul
iradierii. Numarul total de molecule prezente in volumul cilidrului descris de fasciculul
laser ce traverseaza cuva este 11,8185x1015
. In coloanele 3 – 7 sunt date valorile numarului
51
maxim posibil de molecule de CPZ ce pot absorbi energia pentru a putea rupe fiecare tip de
legatura chimica prezenta in CPZ: C–Cl, C–H, C–C, C–N si C–S. Aceste valori au fost
calculate in functie de energiile de disociere selectate anterior: 385 kJ mol-1
pentru C–Cl,
400 kJ mol-1
pentru legatura C–H, 430 kJ mol-1
pentru C–C kJ mol-1
, pentru C–N 300 kJ
mol-1
si pentru C–S 330 kJ mol-1
. Numarul maxim de molecule cu absorb a fost calculat
considerand ca pe durata unui puls laser are loc disocierea unui singur tip de legatura
chimica.
Tabel 3.2. Numarul maxim de molecule de CPZ ce pot absorbi energia necesara pentru a
rupe diferite tipuri de legaturi chimice prezente in molecule
Timp
(min)
E x 10-6
(kJ)
n pt C-Cl
sa se rupa
x1015
(molecule)
n pt C-H
sa se rupa
x1015
(molecule)
n pt C-C
sa se rupa
x1015
(molecule)
n pt C-N
sa se rupa
x1015
(molecule)
n pt C-S
sa se rupa
x1015
(molecule)
5 4,846 7,58008 7,29582 6,78681 9,72777 8,84342
15 4,731 7,40019 7,12269 6,62576 9,49692 8,63356
30 4,658 7,28601 7,01278 6,52352 9,35038 8,50034
45 4,62 7,22657 6,95557 6,4703 9,2741 8,431
60 4,584 7,17026 6,90137 6,41988 9,20183 8,3653
75 4,55 7,11708 6,85019 6,37227 9,13358 8,30326
90 4,52 7,07015 6,80502 6,33025 9,07336 8,24851
105 4,494 7,02948 6,76588 6,29384 9,02117 8,20106
120 4,447 6,95596 6,69512 6,22801 8,92682 8,11529
Comportarea in timpul iradierii a numarului maxim de molecule ce pot absorbi
energia unui puls laser pentru a disocia legatura C–Cl din molecula de CPZ este data in
Figura 3.15.
Se observa o descrestere exponentiala a numarului moleculelor de la 7,58008x1015
,
in primele 5 minute de iradiere, la 6,95596x1015
, la sfarsitul celor 2 ore de iradiere. Aceste
valori depind de cantitatea de energie absorbita in timpul iradierii.
Aceeasi descrestere exponentiala a numarului maxim de molecule ce pot absorbi
energia pulsului laser este observata in cazul tuturor tipurilor de legaturi din moleculele de
CPZ.
Ea indica faptul ca numarul de molecule de CPZ prezente la inceputul iradierii in
volumul iradiat descreste in timpul expunerii la radiatie laser. Acest lucru a fost evidentiat
si in (Pascu 2013) prin metode de cromatografie in strat subtire, unde s-a observat ca
moleculele de CPZ au disparut dupa 30 de minute si au aparut noi compusi.
52
Fig. 3.15. Numarul maxim de molecule de CPZ ce pot absorbi energia unui puls laser
pentru a disocia legatura C–Cl in timpul pe parcursul a 2 ore de iradiere.
Energia fotonilor a fost calculata conform relatiei:
(3.3)
unde Ef reprezinta energia unui foton, h este constanta lui Planck (6.62606957x10-34
J s), c
este viteza luminii in aer (2.99792458x108 m/s) si λ reprezinta lungimea de unda a radiatiei
laser (266 nm).
De aici, rezulta ca energia fotonului la 266nm este Ef = 0,7472 x10-15
mJ sau, in
unitati molare Ef = 449,72 kJ mol-1
.
Tabel 3.3. Numarul de fotoni absorbiti de solutia de CPZ 10-4
M in timpul iradierii.
Timp (min) Ef (mJ) nf (fotoni)
5 4,846 6,48555 x 1015
15 4,731 6,33164 x 1015
30 4,658 6,23394 x 1015
45 4,62 6,18308 x 1015
60 4,584 6,1349 x 1015
75 4,55 6,0894 x 1015
90 4,52 6,04925 x 1015
105 4,494 6,01445 x 1015
120 4,447 5,95155 x 1015
In Tabelul 3.3 este dat numarul de fotoni absorbiti (nf ) in solutia de CPZ 10-4
M la
diferite momente pe parcursul iradierii.
53
Ordinul de marime al numarului fotonilor absorbiti de solutia de CPZ 10-4
M in apa
ultra pura este egal cu cel al numarului maxim de molecule ce absorb energia pulsului laser
pentru a disocia o legatura chimica. Aceasta poate fi o buna explicatie pentru descresterea
exponentiala a numarului de molecule de CPZ si producerea graduala de noi specii in
solutiile iradiate, in special daca luam in considerare probabilitatea ca o molecula de CPZ
sa absoarba fotonii emisi.
Acelasi comportament a fost observat si in cazul moleculelor PZ in timpul
expunerii la radiatie laser a solutiilor de PZ la 10-4
M in apa ultra pura. Energia absorbita de
moleculele de PZ descreste exponential in timpul iradierii, la fel ca in cazul solutiilor de
CPZ. Tinand cont ca singura diferenta dintre molecula de PZ si cea de CPZ este un atom
de clor, implicit o legatura C–Cl, aceleasi calcule se pot aplica si in cazul iradierii
moleculelor de PZ, tinand seama de energiile de disociere a legaturilor chimice si de
valorile inregistrate pentru energia absorbita de moleculele de PZ.
Aceste rezultate demonstreaza ca exista o transformare a moleculelor de fenotiazine
si ca numarul lor scade exponential pe durata iradierii solutiilor, fapt ce a fost observat si
cu ajutorul tehnicilor de cromatografie. Aceste date pot fi o reprezentare cantitativa a
efectelor interactiei fasciculului laser cu moleculele de fenotiazine.
3.4. Activitatea antibacteriana a fenotiazinelor
Activitatea antibacteriana a fenotiazinelor prezentate si a fenotiazinelor expuse la
radiatie laser a fost si ea studiata.
Testele de activitate antibacteriana raportate in teza au fost facute la Centre for
Food Safety, University College Dublin, din Irlanda, in cadrul unor stagii de mobilitate.
Conditiile de iradiere pentru fenotiazinele utilizate in testele de activitate
antibacteriana au fost: lungimea de unda a fasciculului laser a fost 266 nm, energia medie a
radiatiei a fost 6,5 mJ, iar timpul de expunere 2 ore.
Studiile privind activitatea antibacteriana a fenotiazinelor neiradiate si iradiate au
fost efectuate atat pe bacterii Gram-pozitive, cat si pe bacterii Gram-negative.
Bacteriile Gram-negative pe care au fost testate fenotiazinele au fost: Klebsiella
pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes si Salmonella enterica
serovar Typhimurium DT104, iar cele Gram-pozitive au fost: Staphylococcus aureus,
Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii si Listeria welshimeri. Testarea fenotiazinelor s-a
facut atat pe tulpini de referinta, cat si pe tulpini izolate clinic. Aceste tulpini au fost
selectate deoarece infectiile cauzate de ele fac parte din una dintre cele mai importante
probleme ale medicinei, si anume rezistenta la tratamente multiple (MDR – multi-drug
resistance).
Conditiile de crestere a bacteriilor. Stocurile de bacterii sunt pastrate la -80oC. Cu
o ansa sterila se traseaza linii din stocul de bacterii pe o placa Petri cu agar Mueller-Hinton
si se incubeaza la 37oC pentru 18 ore. De pe aceste placi Petri se selecteaza colonii izolate,
care se inoculeaza in eprubete cu 5 mL de mediu de crestere Mueller-Hinton. Eprubetele
se incubeaza la 37oC, cu agitare continua, pentru 16-18 ore.
Testarea activitatii antibacteriene a constat in evaluarea susceptibilitatii bacteriilor
la fenotiazine prin determinarea concentratiei minime inhibitorii (MIC – Minimum
54
Inhibitory Concentration) si determinarea concentratiei minime bactericide (MBC –
Minimum Bactericidal Concentration), evaluarea cineticii de crestere a bacteriilor (curbele
de crestere) si evaluarea sinergismului prin metoda “tabla de sah”.
3.4.1. Evaluarea susceptibilitatii bacteriilor
Concentratia minima inhibitorie (MIC) a fenotiazinelor a fost determinata folosind
metoda microdilutiei mediului de cultura. Pe scurt, 100 µL de mediu de crestere Mueller-
Hinton au fost adaugati in fiecare godeu al micoplacilor cu 96 de godeuri, cu exceptia
coloanei 12. Un volum de 200 µL din medicamentul studiat a fost adaugat in godeurile
coloanei 12, incepand cu randul A pana la randul H. S-au efectuat dilutii succesive ale
compusului de la coloana 12 pana la coloana 3. Din coloana 3 se vor arunca 100 µL din
amestec dupa terminarea dilutiei, pentru a asigura un volum egal in toate godeurile
microplacii. Randurile 1 si 2 sunt randuri de control. In primul rand se adauga doar mediu
de cultura, ce va servi ca si control in cazul contaminarii, iar randul al doilea va contine
doar mediu de crestere inoculat cu bacteria in solutie tampon fosfat salin (PBS – phosphate
buffered saline). Randul al doilea va servi ca si control de crestere al bacteriei in lipsa unui
compus antimicrobian. Microplacile au fost incubate peste noapte la 37oC, timp de 16-18
ore. Dupa aceasta perioada, microplacile au fost analizate cu ochiul liber, notandu-se
cresterea sau lipsa cresterii bacteriilor in godeuri. Concentratia minima inhibitorie este
definita ca fiind concentratia minima a compusului antimicrobian pentru care nu se obtine
o crestere vizibila a bacteriei. Toate aceste experimente au fost repetate de trei ori pentru a
se asigura corectitudinea rezultatelor.
Dupa examinarea microplacilor si determinarea concetratiei minime inhibitorii, 5
µL din fiecare godeu in care nu s-a observat crestere a bacteriilor au fost transferati pe
placi Petri cu agar Mueller-Hinton. Acestea au fost incubate 16-18 ore la 37oC. Dupa
aceasta perioada, placile au fost analizate cu ochiul liber pentru a determina concentratia
minima bactericida (MBC). Concentratia cea mai mica de compus pentru care nu se
observa nicio unitate care formeaza colonii (CFU – colony forming units) este considerata
concentratia minima bactericida. Toate aceste experimente au fost repetate de trei ori
pentru a se asigura corectitudinea rezultatelor.
Valorile concentratiei minime inhibitorii si concentratiei minime bactericide ale
fenotiazinelor neiradiate si iradiate au fost determinate pentru fiecare tulpina in parte si
sunt prezentate in tabelele de mai jos.
In Tabelul 3.4 se regasesc valorile concentratiei minime inhibitorii ale
fenotiazinelor pentru tulpinile de referinta si izolate clinic de Klebsiella pneumoniae.
Valorile concentratiei minime inhibitorii arata ca CPZ iradiat are un efect de
inhibitie la o concentratie de patru ori mai mica decat CPZ neiradiat (12,5 µg/mL fata de
50 µg/mL) in cazul tupinii de referinta Klebsiella pneumoniae ATCC 35218. Un efect
similar a fost obervat pentru tulpina izolata clinic KP006, unde concetratia minima
inhibitorie a CPZ iradiat a fost 100 µg/mL, de doua ori mai mica decat a compusului
neiradiat, insa aceasta diferenta nu este considerata semnificativa.
In cazul tulpinilor izolate clinic KP001 si KP004, concentratia minima inhibitorie a
TZ iradiat a fost de doua ori mai mare decat pentru TZ neiradiat, indicand o activitate
55
antibacteriana mai buna a compusului neiradiat. Totusi, pentru ca o diferenta in
concentratie sa fie semnificativa, aceasta trebuie sa fie de cel putin 4 ori mai mare sau mai
mica (cel putin doua dilutii succesive).
Tabel 3.4. Valorile concentratiei minime inhibitorii (MIC) pentru Klebsiella pneumoniae
Tulpini MIC (µg/mL)
CPZ CPZ ir. TZ TZ ir. PMZ PMZ ir.
ATCC 35218 50 12.5 100 100 100 100
KP001 100 100 100 200 200 200
KP004 100 100 100 200 200 200
KP006 200 100 200 200 200 200
KP008 100 100 200 200 200 200
KP010 100 100 200 200 200 200
In Tabelul 3.5 se regasesc valorile concentratiei minime bactericide ale
fenotiazinelor pentru tulpinile de referinta si izolate clinic de Klebsiella pneumoniae.
La fel ca in cazul concentratiei minime inhibitorii, se oberva diferente intre
activitatea CPZ neiradiat si iradiat pentru tulpina de referinta ATCC 35218 si pentru
tulpina izolata clinic KP006. Pentru ambele tulpini, concentratia minima inhibitorie a CPZ
iradiat a fost mai mica decat a CPZ neiradiat, indicand o activitate antibacteriana mai buna
a compusilor obtinuti prin expunere la radiatie laser.
Tabel 3.5. Valorile concentratiei minime bactericide (MBC) pentru Klebsiella pneumoniae
Tulpini MBC (µg/mL)
CPZ CPZ ir. TZ TZ ir. PMZ PMZ ir.
ATCC 35218 100 50 100 100 200 100
KP001 100 100 100 200 200 100
KP004 100 100 200 200 200 200
KP006 200 100 200 200 200 200
KP008 100 100 200 200 200 200
KP010 100 100 200 200 200 200
Spre deosebire de MIC, concentratia minima bactericida a PMZ iradiat este de doua
ori mai mica decat a PMZ neiradiat in cazul tulpinii de referinta ATCC 35218 si a tupinii
izolate clinic KP001.
Concentratiile minime inhibitorii ale fenotiazinelor neiradiate si ale celor expuse la
radiatie laser obtinute pentru fiecare tulpina de Pseudomonas aeruginosa sunt date in
Tabelul 3.6.
Valorile concentratiei minime inhibitorii arata ca CPZ iradiat a avut o activitate mai
buna decat cel neiradiat in cazul tulpinilor izolate clinic NCF46, NCF47, NCF100 si
NCF102. Diferente semnificative au fost obtinute in cazul tulpinilor izolate clinic NCF100
si NCF102. Concentratia minima inhibitorie a CPZ iradiat pentru tulpina NCF100 a fost 25
µg/mL, de patru ori mai mica decat a CPZ neiradiat, iar concentratia minima inhibitorie a
56
CPZ iradiat pentru tulpina NCF102 a fost 12,5 µg/mL, tot de patru ori mai mica decat a
CPZ neiradiat.
Tabel 3.6. Valorile concentratiei minime inhibitorii pentru Pseudomonas aeruginosa
Tulpini MIC (µg/mL)
CPZ CPZ ir. TZ TZ ir. PMZ PMZ ir.
PAO1 100 100 100 100 200 200
NCF46 200 100 100 100 200 200
NCF47 200 100 100 50 200 200
NCF100 200 25 50 25 200 200
NCF102 100 12.5 100 100 200 50
NCF110 100 100 200 100 200 100
Pentru tulpina izolata clinic NCF102 s-a obtinut tot o valoare de patru ori mai mica
pentru PMZ iradiat fata de cel neiradiat.
Diferente mai mici s-au obtinut in cazul tulpinilor izolate clinic NCF47 si NCF100,
pentru care concentratiile minime inhibitorii a TZ iradiat au fost de doua ori mai mici decat
a TZ neiradiat.
Tabel 3.7. Valorile concentratiei minime bactericide pentru Pseudomonas aeruginosa
Tulpini MBC (µg/mL)
CPZ CPZ ir. TZ TZ ir. PMZ PMZ ir.
PAO1 200 100 100 100 200 200
NCF46 200 200 200 200 200 200
NCF47 200 100 200 100 200 200
NCF100 200 200 100 200 200 200
NCF102 100 50 100 100 200 100
NCF110 100 100 100 100 200 100
In Tabelul 3.7 se gasesc valorile concentratiilor minime bactericide ale derivatilor
fenotiazinici pentru tulpinile de Pseudomonas aeruginosa.
Pentru tulpina de referinta PAO1 concentratia minima bactericida a CPZ (200
µg/mL) a fost de doua ori mai mare decat a CPZ neiradiat (100 µg/mL). Aceleasi valori
s-au obtinut si in cazul tulpinii NCF47. Pentru tulpina NCF102, valorile concentratiei
minime bactericide au fost 100 µg/mL pentru CPZ si 50 µg/mL pentru CPZ iradiat.
PMZ iradiat a avut o activitate antibacteriana mai buna decat PMZ neiradiat in
cazul tulpinilor izolate clinic NCF102 si NCF110, la fel ca si TZ iradiat in cazul tulpinii
NCF47. Impotriva tulpinii izolate clinic, NCF100 TZ neiradiat a avut o activitate mai buna
decat solutia de TZ expusa la radiatie laser.
Valorile concentratiei minime inhibitorii pentru tulpinile de referinta si izolate
clinic de Enterobacter aerogenes sunt date in Tabelul 3.8, unde se poate observa ca in
cazul acestor tulpini nu exista diferente semnificative intre concentratiile minime
57
inhibitorii ale derivatilor fenotiazinici si compusii obtinuti prin expunerea lor la radiatie
laser.
Tabel 3.8. Valorile concentratiei minime inhibitorii pentru Enterobacter aerogenes
Tulpini MIC (µg/mL)
CPZ CPZ ir. TZ TZ ir. PMZ PMZ ir.
ATCC 13048 100 100 200 200 200 200
EA 22SP84 100 100 200 200 200 200
EA 178LAV 100 100 200 200 200 200
EA 108418 100 100 200 200 200 200
EA 122554 100 100 200 200 200 200
EA 137454 50 50 100 200 100 100
Singura tulpina pentru care se obtine o diferenta in concentratii este EA 137454,
pentru care concentratia minima inhibitorie a TZ este 100 µg/mL, iar concentratia minima
inhibitorie a TZ iradiat este 200 µg/mL, indicand ca TZ iradiat are o activitate
antibacteriana mai slaba in comparatie cu TZ neiradiat.
In Tabelul 3.9 se gasesc valorile concentratiei minime bactericide a fenotiazinelor
neiradiate si iradiate pentru tulpinile de Enterobacter aerogenes.
Se poate observa ca nu exista diferente semnificative in cazul tulpinilor de referinta
sau a celor izolate clinic.
Tabel 3.9. Valorile concentratiei minime bactericide pentru Enterobacter aerogenes
Tulpini MBC (µg/mL)
CPZ CPZ ir. TZ TZ ir. PMZ PMZ ir.
ATCC 13048 100 100 200 200 200 200
EA 22SP84 200 100 200 200 200 200
EA 178LAV 200 100 200 200 200 200
EA 108418 100 100 200 200 200 200
EA 122554 100 100 200 200 200 200
EA 137454 50 50 100 100 100 100
In cazul tulpinilor izolate clinic EA 22SP84 si EA 178LAV, concentratiile minime
bactericide ale CPZ au fost 200 µg/mL, iar ale CPZ iradiat au fost 100 µg/mL, indicand o
activitate mai buna a CPZ iradiat in comparatie cu medicamentul neiradiat in cazul acestor
tulpini.
Ultimele tulpini de bacterii Gram-negative pe care au fost testate fenotiazinele au
fost tulpinile de referinta si izolate clinic de Salmonella enterica serovar Typhimurium
DT104.
Valorile concentratiei minime inhibitorii a fenotiazinelor sunt date in Tabelul 3.10.
Nici in cazul tulpinilor de Salmonella enterica serovar Typhimurium DT104 nu au
existat diferente importante intre concentratia minima inhibitorie a fenotiazinelor neiradiate
si cea a fenotiazinelor iradiate.
58
Tabel 3.10. Valorile concentratiei minime inhibitorii pentru Salmonella enterica serovar
Typhimurium DT104
Tulpini MIC (µg/mL)
TZ TZ ir. PMZ PMZ ir. PZ PZ ir.
13348 100 100 100 100 100 50
3798 100 100 200 200 200 100
A43 100 200 200 200 200 100
1481 100 200 200 200 200 100
100326 100 200 200 200 200 100
100533 100 200 200 200 200 100
100688 100 200 200 200 200 100
Pentru tulpinile izolate clinic A43, 1481, 100326, 100533 si 100688, concentratia
minima inhibitorie a TZ neiradiat a fost de doua ori mai mica decat in cazul TZ neiradiat.
PZ iradiat a avut o activitate mai buna decat PZ neiradiat impotriva tuturor
tulpinilor testate, atat impotriva tulpinii de referinta 13348, cat si impotriva celorlalte
tulpini izolate clinic.
In Tabelul 3.11 sunt date valorile concentratiei minime bactericide a fenotiazinelor
pentru tulpinile de referinta (13348) si pentru tulpinile izolate clinic de Salmonella enterica
serovar Typhimurium DT104.
Tabel 3.11. Valorile concentratiei minime bactericide pentru Salmonella enterica serovar
Typhimurium DT104
Tulpini MBC (µg/mL)
TZ TZ ir. PMZ PMZ ir. PZ PZ ir.
13348 100 100 100 100 100 50
3798 100 100 200 200 200 100
A43 200 200 200 200 200 100
1481 200 200 200 200 200 100
100326 200 200 200 200 200 100
100533 200 200 200 200 200 100
100688 200 200 200 200 200 100
In cazul tulpinilor de Salmonella enterica serovar Typhimurium DT104 testate nu
au existat diferente de concentratie minima bactericida intre TZ neiradiat si TZ iradiat, la
fel cum nu au existat diferente nici intre concentratia minima bactericida a PMZ neiradiat
si cea a PMZ iradiat.
In schimb, concentratia minima bactericida a PZ iradiat a fost de doua ori mai mica
decat concentratia minima bactericida a PZ neiradiat, indicand faptul ca PZ iradiat a avut o
activitate mai buna impotriva tulpinilor testate decat PZ neiradiat.
Activitatea fenotiazinelor a fost testata si pe bacterii Gram-pozitive: Staphylococcus
aureus si tulpini de Listeria.
59
Susceptibilitatea tulpinilor de Staphylococcus aureus la fenotiazinele neiradiate si
iradiate poate fi evaluata pe baza valorilor obtinute pentru concentratiile minime inhibitorii
(Tabelul 3.12) si pentru concentratiile minime bactericide (Tabelul 3.13).
Valorile concentratiei minime inhibitorii prezentate in Tabelul 3.12 indica o
activitate foarte buna a fenotiazinelor iradiate impotriva tulpinilor de Staphylococcus
aureus, indiferent ca sunt tulpini de referinta (MSSA 8325/A si MRSA ATCC 43300) sau
tulpini izolate clinic.
MSSA 8325/A este o tulpina de referinta susceptibila la meticilina (MSSA –
Methicillin-Susceptible Staphylococcus aureus), iar MRSA ATCC 43300 este o tulpina de
referinta rezistenta la meticilina (MRSA – Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus).
Concentratia minima inhibitorie a CPZ iradiat este 3,125 µg/mL pentru toate
tulpinile de Staphylococcus aureus testate. In cazul tulpinilor MSSA 8325/A, MRSA
002/03, MRSA 006/04 si MRSA 010/05, concentratia minima inhibitorie a CPZ iradiat este
de 16 ori mai mica decat in concentratia minima inhibitorie a CPZ neiradiat (50 µg/mL).
Pentru tulpinile MRSA ATCC 43300, MRSA 003/05 si MRSA 016/05, concentratia
minima inhibitorie a CPZ iradiat este de 32 ori mai mica decat in concentratia minima
inhibitorie a CPZ neiradiat (100 µg/mL).
Tabel 3.12. Valorile concentratiei minime inhibitorii pentru Staphylococcus aureus
Tulpini MIC (µg/mL)
CPZ CPZ ir. TZ TZ ir. PMZ PMZ ir. PZ PZ ir.
MSSA 8325/A 50 3,125 25 6,25 200 12,5 200 25
MRSA ATCC 43300 100 3,125 25 6,25 200 12,5 200 25
MRSA 002/03 50 3,125 25 6,25 200 12,5 200 12,5
MRSA 006/04 50 3,125 25 6,25 200 12,5 200 25
MRSA 003/05 100 3,125 25 6,25 200 12,5 200 25
MRSA 010/05 50 3,125 25 6,25 200 12,5 200 25
MRSA 016/05 100 3,125 25 6,25 200 12,5 200 25
Si in cazul solutiilor de TZ se obtin diferente considerabile: concentratia minima
inhibitorie a TZ iradiat este 6,25 µg/mL, de 4 ori mai mica decat cea a TZ neiradiat (25
µg/mL). Aceeasi diferenta se obtine si in cazul solutiilor de PZ, insa concentratia minima
inhibitorie a PZ iradiat este 25 µg/mL, iar cea a PZ neiradiat este 200 µg/mL, pentru toate
tulpinile de Staphylococcus aureus testate, cu exceptia tulpinii izolate clinic MRSA 002/03.
Pentru aceasta concentratia minima inhibitorie a PZ iradiat este 12,5 µg/mL.
Concentratia minima inhibitorie a PMZ iradiat este 12,5 µg/mL, de 16 ori mai mica
decat a solutiilor neiradiate, atat pentru tulpinile de referinta de Staphylococcus aureus, cat
si pentru cele izolate clinic.
Datele prezentate in Tabelul 3.13 pentru concentratia minima bactericida indica o
activitate antibacteriana foarte buna a fenotiazinelor iradiate.
Concentratia minima bactericida a CPZ iradiat pentru tulpina de referinta
susceptibila la antibiotice MSSA 8325/A a fost 6,25 µg/mL, iar a CPZ neiradiat a fost 100
µg/mL. Pentru tulpina izolata clinic MRSA 006/04, concentratia minima bactericida a CPZ
60
iradiat a fost 3,125 µg/mL, iar a CPZ neiradiat a fost 50 µg/mL. Pentru ambele tulpini,
concentratia minima bactericida a CPZ iradiat a fost de 16 ori mai mica decat a CPZ
neiradiat.
Tabel 3.13. Valorile concentratiei minime bactericide pentru Staphylococcus aureus
Tulpini MBC (µg/mL)
CPZ CPZ ir. TZ TZ ir. PMZ PMZ ir. PZ PZ ir.
MSSA 8325/A 100 6,25 25 6,25 200 12,5 200 25
MRSA ATCC 43300 100 3,125 25 6,25 200 12,5 200 25
MRSA 002/03 100 3,125 50 6,25 200 12,5 200 25
MRSA 006/04 50 3,125 25 6,25 200 12,5 200 25
MRSA 003/05 100 3,125 25 6,25 200 12,5 200 25
MRSA 010/05 100 3,125 50 6,25 200 12,5 200 25
MRSA 016/05 100 3,125 50 6,25 200 12,5 200 25
Pentru toate tulpinile de Staphylococcus aureus, valorile concentratiei minime
bactericide a TZ iradiat au fost 6,25 µg/mL. Valorile concentratiilor minime bactericide ale
TZ neiradiat au fost 25 µg/mL sau 50 µg/mL, in functie de tulpina testata.
Concentratiile minime bactericide ale PMZ si PZ neiradiate au aceeasi valoare (200
µg/mL) pentru toate tulpinile iradiate, in schimb difera concentratia minima bactericida a
PMZ iradiat (12,5 µg/mL) de cea a PZ iradiat (25 µg/mL).
Din datele prezentate, se poate afirma ca fenotiazinele iradiate au avut activitate
mai buna decat cele neiradiate impotriva tuturor tulpinilor de Staphylococcus aureus
testate.
In Tabelul 3.14 sunt prezentate concentratiile minime inhibitorii a tupinilor de
Listeria.
Tabel 3.14. Valorile concentratiei minime inhibitorii pentru tulpinile de Listeria
Tulpini MIC (µg/mL)
CPZ CPZ ir. TZ TZ ir. PMZ PMZ ir. PZ PZ ir.
Listeria
monocytogens NCTC 11994
50 3,125 25 12,5 100 50 100 25
Listeria
ivanovii NCTC 11846
25 3,125 25 12,5 200 50 100 25
Listeria
welshimeri
NCTC 11857
50 3,125 25 12,5 200 50 100 25
Concentratia minima inhibitorie a CPZ iradiat a fost 3,125 µg/mL pentru toate
tulpinile de Listeria, insa cea a CPZ neiradiat a fost 50 µg/mL pentru Listeria
monocytogens NCTC 11994 si Listeria welshimeri NCTC 11857, iar pentru Listeria
ivanovii NCTC 11846 a fost 25 µg/mL.
61
Pentru toate tulpinile de Listeria testate, concentratia minina inhibitorie a TZ iradiat
a fost 25 µg/mL, de doua ori mai mica decat cea a TZ neiradiat.
Aceeasi diferenta a fost si intre concentratia minima inhibitorie a PMZ iradiat (50
µg/mL) si cea a PMZ neiradiat (100 µg/mL) pentru tulpina Listeria monocytogens NCTC
11994. Pentru celelalte doua tulpini testate, concentratia minima inhibitorie a PMZ iradiat
(50 µg/mL) a fost de 4 ori mai mica decat cea a PMZ neiradiat.
Concentratia minima inhibitorie a PZ iradiat a fost 25 µg/mL, de 4 ori mai mica
decat concentratia minima inhibitorie a PZ neiradiat. Rezultatele au fost aceleasi pentru
toate tulpinile testate.
Valorile concentratiei minime bactericide obtinute pentru tulpinile de Listeria sunt
date in Tabelul 3.15.
Concentratia minima bactericida a CPZ iradiat este egala cu 3,125 µg/mL si este de
16 ori mai mica decat cea a CPZ neiradiat.
Rezultatele obtinute pentru TZ si TZ iradiat sunt egale cu valorile concentratiei
minime inhibitorii, la fel ca si in cazul solutiilor de PMZ si PMZ iradiat.
Concentratia minima bactericida a PZ iradiat a fost 25 µg/mL, de 8 ori mai mica
decat concentratia minima bactericida a PZ neiradiat, pentru toate tulpinile de Listeria
testate.
Tabel 3.15. Valorile concentratiei minime bactericide pentru tulpinile de Listeria
Tulpini MBC (µg/mL)
CPZ CPZ ir. TZ TZ ir. PMZ PMZ ir. PZ PZ ir.
Listeria
monocytogens NCTC 11994
50 3,125 25 12,5 100 50 200 25
Listeria
ivanovii NCTC 11846
50 3,125 25 12,5 200 50 200 25
Listeria
Welshimeri
NCTC 11857
50 3,125 25 12,5 200 50 200 25
La fel ca in cazul tulpinilor de Staphylococcus aureus, si in cazul tuturor tulpinilor
de Listeria testate, fenotiazinele expuse la radiatie laser au avut o activitate antibacteriana
mult mai buna decat fenotiazinele neiradiate.
3.4.2. Evaluarea cineticii de crestere a bacteriilor
Pentru toate tulpinile de Staphylococcus aureus testate, au fost inregistrate curbele
de crestere in prezenta fenotiazinelor neiradiate si iradiate.
Pentru efectuarea experimentelor de cinetica, mai intai densitatea optica a
suspensiei de bacterii in PBS a fost ajustata la 0,005 si masurata la 610nm. Fenotiazinele
au fost diluate la o concentratie egala cu jumatate din concentratia minima inhibitorie in
aceasta suspensie. Acestea au fost incubate la 37oC timp de 24 de ore, iar densitatea optica
62
a fost citita la fiecare 15 minute. Microplacile au fost agitate inainte de fiecare
masuratoare. Curbele de crestere a unei tulpini in prezenta fiecarei fenotiazine au fost
comparate cu cea a tulpinii crescute doar in mediu de cultura.
Fig. 3.16. Fazele cresterii bacteriilor
In curbele de crestere a bacteriilor se pot identifica patru faze: faza de lag, in care
celulele se adapteaza la mediul de crestere, faza exponentiala, in care are loc divizarea
celulelor, faza stationara, in care rata de deces este egala cu cea de crestere, si faza de
declin, in care intervine moartea celulara (Zwietering 1990).
Fig. 3.17. Curbele de crestere a tulpinii de referinta Staphylococcus aureus MSSA 8325/A
in prezenta a: a) CPZ neiradiat si CPZ iradiat; b) TZ neiradiat si TZ iradiat; c) PMZ
neiradiat si PMZ iradiat; d) PZ neiradiat si PZ iradiat.
63
In studiile de cinetica a cresterii tulpinilor de Staphylococcus aureus in prezenta
fenotiazinelor neiradiate si iradiate s-a analizat faza de lag.
In Figura 3.17 sunt date curbele de crestere a tulpinii de referinta a Staphylococcus
aureus, susceptibila la meticilina, MSSA 8325/A.
Curba de crestere a tulpinii incubate doar in mediu de cultura este reprezentata cu
negru. Se poate observa ca faza de lag pentru aceasta este de 2 ore.
Curbele de crestere ale tulpinilor incubate in prezenta fenotiazinelor nu prezinta
modificari semnificative, cu exceptia tulpinii MSSA 8325/A incubata impreuna cu CPZ
iradiat. Concentratia solutiei de CPZ iradiat adaugata in mediul de crestere a fost 1,562
µg/mL, ceea ce reprezinta jumatate din concentratia minima inhibitorie. In acest caz, faza
de lag este prelungita la 3 ore (Figura 3.17.a).
In cazul tulpinii MSSA 8325/A incubate in prezenta PMZ iradiat, cu concentratia
12,5 µg/mL, nu apar schimbari in faza de lag, insa se observa modificari ale fazei
exponentiale. Panta fazei exponentiale reprezinta rata de crestere a bacteriilor.
Fig. 3.18. Curbele de crestere a tulpinii de referinta Staphylococcus aureus MRSA ATCC
43300 in prezenta a: a) CPZ neiradiat si CPZ iradiat; b) TZ neiradiat si TZ iradiat; c) PZ
neiradiat si PZ iradiat; d) PMZ neiradiat si PMZ iradiat.
64
In Figura 3.17.c se poate observa ca rata de crestere a bacteriilor in prezenta PMZ
iradiat este mult mai mica decat in mediul de cultura simplu sau in prezenta celorlalte
medicamente.
Totusi, tulpina Staphylococcus aureus MSSA 8325/A incubata in prezenta PMZ
iradiat, continua sa se divizeze si nu atinge faza stationara pana la sfarsitul celor 24 de ore
de studio (Figura 3.17.c).
In Figura 3.18 se poate observa ca tulpina de referinta Staphylococcus aureus
MRSA ATCC 43300 raspunde mai bine la unele fenotiazine decat MSSA 8325/A.
Prezenta CPZ 50 µg/mL prelungeste faza de lag de la 2 ore la 3 ore, iar CPZ iradiat
1,562 µg/mL prelungeste faza de lag la 4 ore, indicand ca tulpina se adapteaza mai greu la
mediul de crestere ce contine si fenotiazine (Figura 3.18.a).
TZ iradiat 6,25 µg/mL creste faza de lag a tulpinii MSSA 8325/A la 5 ore, insa cel
mai bun rezultat se obtine in cazul PZ iradiat 12,5 µg/mL, a carui prezenta in mediul de
cultura in timpul incubarii prelungeste faza de lag la 8 ore (Figura 3.18 b, c).
In figurile urmatoare sunt prezentate curbele de crestere a trei dintre tulpinile de
Staphylococcus aureus izolate clinic care au fost studiate. Aceste tulpini au fost izolate din
spitalele din Irlanda insa pana in momentul de fata nu au fost caracterizate genetic.
Fig. 3.19. Curbele de crestere a tulpinii izolate clinic Staphylococcus aureus MRSA 003/05
in prezenta a: a) CPZ neiradiat si CPZ iradiat; b) TZ neiradiat si TZ iradiat; c) PMZ
neiradiat si PMZ iradiat; d) PZ neiradiat si PZ iradiat.
65
Modalitatea de raspuns la fenotiazine a tulpinilor izolate clinic difera de la una la
cealalta, deoarece acestea prezinta diferite modificari genetice ce au dus la dezvoltatea
rezistentei acestora la antibiotice.
Curbele de crestere a tulpinilor izolate clinic Staphylococcus aureus MRSA 003/05
in prezenta fenotiazinelor neiradiate si iradiate sunt date in Figura 3.19.
Faza de lag a tulpinii MRSA 003/05 este prelungita in prezenta CPZ neiradiat, dar
si a CPZ iradiat, la 5 ore (Figura 3.19.a).
TZ iradiat 6,25 µg/mL prelungeste faza de lag a bacteriilor de la 2 ore la 7 ore, iar
PMZ neiradiat 100 µg/mL prelungeste faza de lag doar la 3 ore (Figura 3.19.b, c).
Atat PMZ iradiat 25 µg/mL, cat si PZ iradiat 12,5 µg/mL, prelungesc faza de lag a
tulpinii MRSA 003/05 la 9 ore (Figura 3.19 c, d).
Aceste diferente in faza de lag indica faptul ca bacteriile se adapteaza mult mai
greu la mediul de cultura ce contine si fenotiazine. De asemenea, se poate observa ca
fenotiazinele iradiate au o activitate mult mai buna decat cele neiradiate.
Fig. 3.20. Curbele de crestere a tulpinii izolate clinic Staphylococcus aureus MRSA 006/04
in prezenta a: a) CPZ neiradiat si CPZ iradiat; b) TZ neiradiat si TZ iradiat; c) PMZ
neiradiat si PMZ iradiat; d) PZ neiradiat si PZ iradiat.
66
In Figura 3.20 se regasesc curbele de crestere a tulpinilor izolate clinic
Staphylococcus aureus MRSA 006/04 incubate in mediu de cultura fara medicament
(culoare neagra) si incubate in prezenta fenotiazinelor neiradiate si iradiate.
In cazul acestei tulpini izolate clinic, prezenta fenotiazinelor neiradiate (CPZ, TZ,
PMZ si PZ), la concentratia egala cu jumatate din concentratia minima inhibitorie, nu
aduce modificari semnificative fazei de lag (Figura 3.20.a-d).
Rezultate bune se obtin, in schimb, in cazul TZ iradiat si PZ iradiat. Prezenta TZ
iradiat de 6,25 µg/mL prelungeste faza de lag la 9 ore, iar PZ iradiat 12,5 µg/mL
prelungeste faza de lag de la 2 ore la 7 ore (Figura 3.20.b,d).
In ambele cazuri, faza exponentiala este prelungita, iar tulpinile MRSA 006/05 nu
ajung in faza stationara nici in prezenta TZ iradiat, nici in prezenta PZ iradiat, pana la
sfarsitul celor 24 de ore de studiu.
Ultimele curbe de crestere prezentate sunt cele ale tulpinii izolate clinic
Staphylococcus aureus MRSA 010/05 (Figura 3.21).
Atat CPZ neiradiat 50 µg/mL, cat si CPZ iradiat 1,562 µg/mL, prelungesc faza de
lag a tulpinii MRSA 010/05 la 5 ore, insa panta fazei exponentiale in prezenta CPZ
neiradiat este mai mica, indicand o rata de crestere mai mica a tulpinii (Figura 3.21.a).
Fig. 3.21. Curbele de crestere a tulpinii izolate clinic Staphylococcus aureus MRSA 010/05
in prezenta a: a) CPZ neiradiat si CPZ iradiat; b) TZ neiradiat si TZ iradiat; c) PMZ
neiradiat si PMZ iradiat; d) PZ neiradiat si PZ iradiat.
67
Celelalte fenotiazine neiradiate nu modifica semnificativ faza de lag a tulpinii
izolate clinic Staphylococcus aureus MRSA 010/05.
Incubarea tulpinii MRSA 010/05 in prezenta TZ iradiat 6,25 µg/mL are ca efect
prelungirea fazei de lag de la 2 ore la 6 ore (Figura 3.21.b). PMZ iradiat 25 µg/mL
prelungeste faza de lag la 4 ore, iar prezenta PZ iradiat 12,5 µg/mL prelungeste faza de lag
la 9 ore (Figura 3.21.c,d).
Curbele de crestere au demonstrat ca fenotiazinele iradiate au, in general, o
activitate mai buna fata de cele neiradiate impotriva tulpinilor de Staphylococcus aureus.
3.4.3. Evaluarea sinergismului – metoda “tabla de sah”
Metoda “tabla de sah” a fost folosita pentru a evalua raspunsul bacteriilor la doi
compusi antimicrobieni administrati impreuna.
Aceasta metoda poate determina daca activitatea combinata a celor doua
medicamente este: a) sinergetica – atunci cand activitatea unui medicament administrat in
combinatie cu celalalt este semnificativ mai mare decat activitatea medicamentului singur;
b) antagonista – cand activitatea unui medicament utilizat in aceasta combinatie este mult
mai mica decat a medicamentului folosit singur; c) aditiva – atunci cand activitatea celor
doi compusi administrati impreuna este egala cu activitatile adunate ale fiecarui compus in
parte; d) indiferenta – cand activitatea medicamentelor combinate nu difera cu mult de
rezultatul obtinut in cazul utilizarii celui mai activ compus antimicrobian singur (Motyl
2006).
Metoda “tabla de sah” a fost folosita pentru a testa sinergiile fenotiazinelor (CPZ,
CPZ iradiat, PZ, PZ iradiat, TZ si TZ iradiat) impreuna cu antibioticele Ampicilina si
Ciprofloxacin pentru tulpina de referinta MRSA ATCC 43300 si tulpinile izolate clinic
MRSA 002/03, MRSA 006/04 si MRSA 016/05 ale Staphylococcus aureus. Testele au fost
facute pentru toate combinatiile posibile ale compusilor antimicrobieni.
Pentru a putea evalua raspunsul unui organism la cele doua medicamente
administrate impreuna a fost necesar sa se determine anterior valorile concentratiilor
minime inhibitorii ale fenotiazinelor si a antibioticelor.
Experimental, pentru metoda “tabla de sah” un volum de 100 µL de mediu Mueller
– Hinton a fost adaugat in fiecare godeu al microplacii cu 96 de godeuri, cu exceptia primei
coloane. Un volum de 200 µL de antibiotic a fost adaugat in prima coloana a microplacii.
Concentratia antibioticului a fost de 4 ori mai mare decat concentratia minima inhibitorie a
acestuia determinata pentru fiecare tulpina in parte. Concentratia antibioticului a fost
injumatatita succesiv prin dilutii, de la coloana a doua pana la coloana 11. In coloana 12 nu
s-a adaugat antibiotic, deoarece aceasta a fost folosita ca si control de crestere a bacteriilor.
De asemenea, niciun compus antibacterian nu se adauga in randul H, deoarece acesta e
folosit ca si control in cazul contaminarii. In randul A se adauga cate 100 µL de
fenotiazine, cu o concentratie de 4 ori mai mare decat concentratia minima inhibitorie.
Concentratia fenotiazinelor a fost injumatatita prin dilutii succesive de la randul B pana la
randul G. In fiecare godeu, cu exceptia randului H, se adauga cate 100 µL de suspensie de
bacterii in PBS. Rezultatele se citesc cu ochiul liber dupa 16-18 ore de incubare la 37oC si
68
se fac poze ale microplacilor. Densitatea optica se poate folosi pentru a compara cresterea
bacteriilor.
In Figura 3.22 este prezentata o imagine a unei microplaci in care s-a aplicat
metoda “tabla de sah”. Au fost aplicate impreuna ampicilina si PZ iradiat impotriva unei
tulpini izolate clinic de Staphylococcus aureus MRSA 002/03. Godeurile in care nu au
crescut bacterii dupa incubare apar ca fiind transparente, iar cele in care exista bacterii apar
ca fiind albicioase/ tulburi.
Ultimul rand (randul H) este randul de control pentru contaminarea mediului de
cultura. In randurile A si B (primele doua randuri) se poate observa ca PZ iradiat inhiba
cresterea bacteriilor.
Ampicilina nu prezinta activitate impotriva tulpinii MRSA 002/03, la concentratiile
testate.
Activitatea celor doi compusi administrati impreuna poate fi clasificata ca fiind
indiferenta. Aceleasi rezultate au fost obtinute in cazul tuturor combinatiilor de fenotiazine
si antibiotice testate, pentru toate cele patru tulpini.
Fig. 3.22. Activitatea antibacteriana a ampicilinei utilizata impreuna cu PZ iradiat
impotriva tulpinii MRSA 002/03, determinata prin metoda “tabla de sah”
Metoda “tabla de sah” face parte din testele ce pot demonstra ca un medicament are
rol de inhibitor al pompelor de eflux si astfel poate imbunatati activitatea unui antibiotic.
Aceste experimente au demonstrat ca, in cazul tulpinilor de Staphylococcus aureus testate,
fenotiazinele neiradiate si iradiate nu actioneaza ca inhibitori ai pompelor de eflux si nu
faciliteaza activitatea antibioticelor testate.
3.5. Concluzii
Este necesar sa se cunoasca conditiile in care un medicament isi pastreaza
proprietatile de interes, de aceea sunt importante studiile de stabilitate a medicamentelor
sub influenta factorilor de mediu naturali sau artificiali.
69
Studiile de stabilitate in timp a fenotiazinelor au demonstrat ca solutiile de CPZ,
PZ, PMZ si TZ in apa ultra pura, la concentratia 10-4
M, raman stabile pe toata perioada
studiilor (144 ore).
Diferentele dintre spectrele de absorbtie in UV-Vis ale fenotiazinelor neiradiate
studiate, inregistrate la diferite perioade de timp de la prepararea solutiilor, au ramas in
limitele de eroare experimentala pe toata durata studiilor.
Spectrele de absorbtie in UV-Vis ale celor patru fenotiazine studiate prezinta
caracteristici similare: o banda de absorbtie in jurul a 255 nm, al carui coeficient de extictie
molara are o valoare relativ mare, indicand o tranzitie π – π*, si o a doua banda de
absorbtie in jurul a 305 nm, cu un coeficient de extinctie molara mai mic, ce indica o
tranzitie n – π*.
O parte importanta a studiilor de stabilitate o reprezinta fotostabilitatea, in special
pentru ca fenotiazinele in general sunt sensibile la radiatie UV.
Testele de fotostabilitate au fost efectuate in diferite conditii de iradiere cu fascicul
laser pentru a optimiza si pentru a standardiza procesul de modificare al fenotiazinelor si
de obtinere a noi compusi cu potential antimicrobian.
Primele modificari aparute in timpul iradierii pot fi obervate cu ochiul liber. In
cazul CPZ, in primele minute incepe sa se formeze un precipitat de culoare verde inchis,
care se dizolva in solutie prin agitare. Solutia neiradiata de CPZ este incolora, insa in
timpul iradierii se coloreaza treptat de la galben deschis pana la maro inchis.
Modificarile fenotiazinelor sunt inregistrate si in spectrele de absorbtie in UV-Vis
si demonstreaza ca fenotiazinele studiate nu raman stabile in conditii de expunere la
fascicul laser si ca iradierea poate modifica structura moleculelor si poate produce noi
compusi cu caracteristici diferite fata de medicamentul initial.
Spectrele de absorbtie in UV-Vis ale fenotiazinelor iradiate la 266 nm, cu o energie
medie de 6,5 mJ, prezinta o deplasare hipsocromica a maximului de la 305 nm, fata de
fenotiazinele neiradiate. Aceasta deplasare hipsocromica se datoreaza scaderii pH-ului
solutiilor in timpul iradierii si/sau schimbarii polaritatii solutiilor.
Aceasta ipoteza confirma rezultatele raportate in (Pascu 2013), unde prin
cromatografie in strat subtire s-a demonstrat ca in timpul iradierii solutiilor de CPZ apar
produsi de reactie mai polari decat CPZ. Prin HPLC-DAD si HPLC-MS au fost identificati
PZ, hidroxipromazina sau PZ sulfoxid, hidroxipromazina sulfoxid si CPZ sulfoxid, printre
cei aproximativ 200 de compusi obtinuti in timpul expunerii solutiei de CPZ la radiatie
laser.
Studiile de spectroscopie in UV-Vis si de cromatografie au demonstrat ca produsii
identificati sunt stabili pana la 3 luni de la iradiere.
Pe langa produsii stabili, in timpul iradierii apar si specii tranziente, radicali cu timp
de viata foarte scurt, cum este si radicalul promazil (Gocke 1996, Felmeister 1964).
Aparitia acestor specii tranziente in timpul iradierii cu fascicul laser este pusa in
evidenta in spectrele de absorbtie ale solutiei de CPZ 20 mg/ml in apa ultra pura, iradiata la
355 nm, cu o energie medie de 30 mJ. In timpul iradierii apar doua benzi de absorbtie noi,
una sub forma de umar, cu maximul de absorbtie in jur de 518 nm, iar a doua banda in
jurul a 946 nm. Ambele maxime cresc liniar pe durata iradierii, indicand faptul ca
70
moleculele de CPZ se modifica treptat in timpul iradierii, iar rata de producere a produsilor
responsabili de aparitia maximelor este aceeasi pentru ambele maxime.
Dupa incetarea iradierii, maximul de la 518 descreste putin, insa este prezent si
dupa 3 ore de la iradiere, spre deosebire de banda cu maximul in jur de 946 nm, care
descreste din primele minute dupa incetarea expunerii la fascicul laser, disparand complet
la 3 ore dupa iradiere. Banda de absorbtie de la 946 nm poate fi atribuita speciilor
tranziente produse in timpul iradierii.
Pentru a intelege procesul de interactie a radiatiei laser cu moleculele de fenotiazine
si implicit mecanismul de formare al noilor compusi, solutii de CPZ si PZ 10-4
M in apa
ultrapura au fost expuse la radiatie laser timp de 2 ore. Energia medie a fasciculului a fost
6,5 mJ, la lungimea de unda 266 nm.
S-a constat ca energia absorbita de probe descreste exponential in timpul celor doua
ore de iradiere. Pe baza acestor valori si a energiilor de disociere a legaturilor chimice, s-a
calculat numarul maxim de molecule ce pot absorbi energia pulsului laser pentru ca fiecare
timp de legatura sa se rupa.
Tinand cont de energia absorbita si ca energia fotonului la 266nm este Ef = 0,7472
x10-15
mJ (Ef = 449,72 kJ mol-1
), s-a calculat numarul de fotoni absorbiti pe durata unui
puls laser si s-a constatat ca ordinul de marime al numarului fotonilor absorbiti de solutia
de CPZ 10-4
M in apa ultra pura este egal cu cel al numarului maxim de molecule ce absorb
energia pulsului laser pentru a disocia o legatura chimica.
Rezultatele demonstreaza ca exista o transformare a moleculelor de fenotiazine si
ca numarul acestora scade exponential pe durata iradierii solutiilor, fapt ce a fost observat
si cu ajutorul tehnicilor de cromatografie. Aceste date pot fi o reprezentare cantitativa a
interactiei fasciculului laser cu moleculele de fenotiazine.
Activitatea antibacteriana a fenotiazinelor neiradiate si a celor iradiate a fost testata
pe tulpini de referinta si izolate clinic de bacterii Gram-negative (Klebsiella pneumoniae,
Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes si Salmonella enterica serovar
Typhimurium DT104) si Gram-pozitive (Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes,
Listeria ivanovii si Listeria welshimeri). Aceste tulpini fac parte din una dintre cele mai
importante probleme ale medicinei, si anume rezistenta la tratamente multiple (MDR –
multi-drug resistance).
Din testele de susceptibilitate a bacteriilor, adica din valorile obtinute pentru
concentratiile minime inhibitorii si pentru concentratiile minime bactericide, s-a constatat
ca fenotiazinele iradiate au o activitate antibacteriana mult mai buna decat fenotiazinele
neiradiate.
De asemenea, s-a obtinut o activitate mai buna a fenotiazinelor iradiate in cazul
tulpinilor de Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii si Listeria
welshimeri decat in cazul tulpinilor de bacterii Gram-negative testate. Cele mai bune
rezultate au fost obtinute in cazul CPZ iradiat ale carui valori ale concentratiei minime
inhibitorii si concentratiei minime bactericide au fost de 3,125 µg/mL, fata de 100 µg/mL
pentru CPZ neiradiat, pentru unele tulpini de Staphylococcus aureus.
Testele de evaluare a cineticii de crestere a tulpinilor de Staphylococcus aureus au
demonstrat ca fenotiazinele iradiate sunt mai active decat cele neiradiate. Tulpinile de
Staphylococcus aureus izolate clinic au raspuns diferit la fenotiazine deoarece acestea
71
prezinta diferite modificari genetice necaracterizate ce au dus la dezvoltarea rezistentei
acestora la antibiotice, insa, statistic, cele mai bune rezultate s-au obtinut in cazul TZ
iradiat, PMZ iradiat si PZ iradiat. Spre exemplu, PMZ iradiat 25 µg/mL si PZ iradiat 12,5
µg/mL prelungesc faza de lag a tulpinii MRSA 003/05 la 9 ore, iar TZ iradiat 6,25 µg/mL
prelungeste faza de lag de la 2 ore la 9 ore in cazul tulpinii izolate clinic MRSA 006/04.
Metoda “tabla de sah” demonstreaza ca activitatea fenotiazinelor administrate
impreuna cu un antibiotic poate fi clasificata ca fiind indiferenta. Rezultate au fost obtinute
in cazul tuturor combinatiilor de fenotiazine (CPZ, CPZ iradiat, PZ, PZ iradiat, TZ si TZ
iradiat) impreuna cu antibioticele Ampicilina si Ciprofloxacin pentru tulpina de referinta
MRSA ATCC 43300 si tulpinile izolate clinic MRSA 002/03, MRSA 006/04 si MRSA
016/05 ale Staphylococcus aures.
Prin metoda “tabla de sah” s-a demonstrat ca, in cazul tulpinilor de Staphylococcus
aureus testate, fenotiazinele neiradiate si iradiate nu actioneaza ca inhibitori ai pompelor de
eflux si nu faciliteaza activitatea antibioticelor testate. Acest rezultat impreuna cu faptul ca
fenotiazinele iradiate au o activitate mai buna impotriva bacteriilor Gram-pozitive decat
impotriva celor Gram-negative, pot sugera ca mecanismul de actiune al fenotiazinelor este
de permeabilizare a membranei bacteriei si nu de inhibitie a pompelor de eflux, tinand cont
ca peretele celular al bacteriilor Gram-negative este mai complex, avand si o membrana
externa in plus fata de cel al bacteriilor Gram-pozitive.
Mecanismul de activitate antibacteriana al fenotiazinelor iradiate ramane sa fie
identificat, la fel ca si mecanismul de producere al compusilor noi in timpul expunerii
solutiilor de fenotiazine la fascicul laser. Acesta poate reprezenta un progres in invingerea
rezistentei la tratamente multiple a bacteriilor.
72
Capitolul IV. Studiul stabilitatii solutiilor de Vancomicina
4.1. Introducere
In acest capitol sunt prezentate studiile de stabilitate ale solutiilor de Vancomicina
(VCM) sub influenta factorilor de mediu naturali sau artificiali.
Studiile au fost axate in principal pe fotostabilitatea Vancomicinei si pe efectele
expunerii solutiilor de VCM la radiatie laser.
In experimentele desfasurate s-a folosit VCM in forma clorhidrat achizitionata de la
Sigma Aldrich (puritate pentru aplicatii biologice). Forma clorhidrat este cea aprobata in
tratamentele medicale.
Solutiile de VCM au fost preparate in apa ultra pura, deionizata, cu caracteristicile
prezentate in Capitolul III, sau in dimetil sulfoxid (DMSO), cu grad de puritate mai mare
de 99%. Concentratiile solutiile de VCM utilizate in experimente au fost intre 10-4
M si
2x10-3
M.
Studiul stabilitatii in timp a solutiilor de VCM in apa ultra pura au fost efectuate pe
doua concentratii: 10-4
M si 10-3
M. Probele au fost pastrate la 4oC, la intuneric. Stabilitatea
solutiilor de VCM a fost evaluata cu ajutorul spectrelor de absorbtie in UV-Vis. Acestea au
fost inregistrate la intervale diferite de timp de la prepararea probelor pentru a urmari daca
apar modificari ale VCM in timp.
Fotostabilitatea solutiilor de VCM fost studiata in conditii de iradiere cu fascicul
laser. Lungimea de unda a radiatiei laser utilizate in experimentele de fotostabilitate a fost
aleasa in urma inregistrarii spectrelor de absorbtie in UV-Vis, astfel incat sa fie cat mai
apropiata de lungimea de unda la care VCM prezinta benzi de absorbtie.
Modificarile solutiilor de VCM au fost urmarite inregistrand spectrele de absorbtie
UV-Vis-NIR ale solutiilor neiradiate si apoi, aceleasi spectre, la diferite intervale de timp
dupa iradiere. De asemenea, pentru identificarea modificarilor produse de fasciculul laser
au fost inregistrate spectre FTIR si spectre de masa ale solutiilor de VCM inainte si dupa
iradiere. Spectrele de fluorescenta indusa laser (LIF) au fost inregistrate in timp real, la fel
ca si tensiunea interfaciala dintre o bula de aer si solutia de VCM in timpul iradierii.
Experimentele de microfluidica au rolul de a evidentia producerea unor compusi
hidrofobi in timpul expunerii solutiilor de VCM la radiatie laser.
Experimentele de fotostabilitate a solutiilor de VCM pot fi impartite in doua
categorii: iradiere in volum sau iradiere in picatura. In cazul iradierii in picatura, procesele
au loc intr-un timp mai scurt datorita volumului probelor de ordinul microlitrilor.
Conditiile in care s-a efectuat iradierea (energia fasciculului laser, volumul solutiei
iradiate, lungimea drumului optic) au fost variate in functie de necesitatile experimentului.
Iradierea solutiilor de VCM s-a facut la 266 nm, cu ajutorul unui laser pulsat
Nd:YAG “Surelite II”, descris in Capitolul III al tezei.
Montajul experimental utilizat in cadrul experimentelor de stabilitate in conditii de
iradiere cu fascicul laser este prezentat in Figura 4.1.
73
Fig. 4.1. Montajul experimental utilizat pentru iradierea solutiilor de VCM
Spectrele de absorbtie se inregistreaza cu un spectrofotometru de absorbtie in UV-
Vis-NIR Lambda 950 de la Perkin-Elmer, ale carui caracteristici au fost descrise in
Capitolul III, in cuve cu drum optic de 1 mm.
Pentru inregistrarea spectrelor de fluorescenta indusa laser (LIF), probele de VCM
au fost excitate cu ajutorul laserului pulsat Nd:YAG, iar spectrele au fost colectate cu
spectrometrul HR4000CG–UV–NIR, Ocean Optics. Domeniul spectral al spectrometrului
este 200 nm – 1100 nm, iar rezolutia spectrala este de 0,75 nm. Achizitia spectrului a fost
facuta prin intermediul unei fibre optice monomod, cu diametrul miezului de 1 mm.
Spectrele FTIR au fost inregistrate cu un spectrometru Nicolet iS50, Thermo
Scientific, pe domeniul 4000 cm-1
– 400 cm-1
. Rezolutia spectrofotometrului este 4 cm-1
.
Absorbtia probelor a fost inregistrata pe celule KRS5 (bromo-iodura de taliu (TlBr-TlI)).
Studierea fragmentelor obtinute in timpul iradierii solutiilor de VCM s-a facut si
prin cromatografia in faza lichida cuplata cu spectrometrie de masa cu timp de zbor si
ionizare prin electro-pulverizare (LC/ESI-TOF-MS).
Pentru aceste masuratori s-a folosit un sistem de cromatografie lichida (LC) Agilent
1260 Infinity series, echipat cu o pompa cuaternara si analizor automat. Elutia a fost facuta
100% cu apa, cu o viteza de curgere de 0,2 mL/min, iar fragmentele au fost detectate cu un
spectrometru de masa ortogonal cu timp de zbor 6224 TOF LC/MS Agilent Technologies
System, cuplat cu o sursa de ionizare prin electro-pulverizare (ESI) cu ace de pulverizare
duble pentru o infuzie continua de solutie cu masa de referinta. Pentru desolvatarea
picaturilor s-a folosit gaz incalzit care usuca, cu o viteza de curgere de 9 L/min, cu o
presiune de nebulizare de 40 Psi. Pulverizarea a fost indusa cu un voltaj al capilarului de
3000 V si un voltaj de fragmentare de 100 V.
74
In cadrul experimentelor de microfluidica a fost inregistrata tensiunea interfaciala
dinamica (DIT) intre o bula de aer si solutia de VCM in timpul iradierii.
Tensiogramele au fost inregistrate cu ajutorul tensiometrului de analiza a profilului
picaturii PAT-1 (Sinterface, Berlin-Germania). O bula de aer este generata prin intermediul
unui capilar curbat in forma de “U”, care este introdus in cuva sistemului PAT-1 ce contine
solutia de VCM. Volumul bulei de aer este 10 µL. Fasciculul laser este focalizat sub
capilar pentru a permite fotoprodusilor generati sa migreze liber catre bula de aer. Acest
montaj permite masurarea in timp real, pe toata durata iradierii cu fascicul laser, a
modificarilor tensiunii interfaciale dinamice la suprafata bulei de aer si masurarea
fenomenului de adsorbtie ce apare in solutie incepand cu cateva secunde, pana la cateva
ore.
Metodele alese permit caracterizarea stabilitatii solutiilor sau a modificarilor
aparute sub influenta factorilor externi.
4.2. Stabilitatea in timp a solutiilor de Vancomicina
Studiul stabilitatii in timp a solutiilor de VCM a constat in inregistrarea spectrelor
de absorbtie in UV-Vis si urmarirea modificarilor ce pot apare in spectre.
Spectrele de absorbtie ale solutiilor de VCM au fost inregistrate la diferite intervale
de timp dupa prepararea solutiilor, pana la 408 ore. In Figura 4.2 este prezentat spectrul de
absorbtie al solutiilor de VCM 10-4
M in apa ultra pura.
Fig. 4.2. Evolutia in timp a solutiilor de VCM 10
-4M in apa ultra pura
Solutiile de VCM 10-4
M in apa ultrapura au fost pastrate la intuneric, la 4oC.
Inainte de inregistrarea spectrelor probele au fost scoase de la frigider si lasate la
temperatura camerei, la intuneric, timp de 30 minute.
75
In Figura 4.2 se poate observa ca solutiile de VCM 10-4
M in apa ultra pura isi
pastreaza forma initiala a spectrului pe toata durata studiilor, pana la 408 ore (17 zile).
Spectrul de absorbtie al solutiei de VCM la 10-4
M in apa ultra pura prezinta trei
benzi de absorbtie, prima la 199 nm, a doua sub forma unui umar, in jurul valorii de 236
nm, iar a treia la 280 nm.
Aparitia primei benzi de absorbtie de la 199 nm poate fi determinata de o tranzitie
π – π*, iar umarul de la 236 nm poate fi atribuit unei tranzitii n – π*.
Este cunoscut ca peptidele prezinta o tranzitie intensa π – π* la 190 nm si o tranzitie
n – π* in jurul a 210 – 220 nm. A doua tranzitie este mai slaba si apare in spectru sub
forma unui umar deoarece este interzisa conform regulilor de simetrie (Pattabhi 2002).
Dupa cum a fost prezentat in Capitolul II, VCM este o glicopeptida ce este formata
dintr-o dizaharida legata de al patrulea aminoacid al unei heptapeptide (Nieto 1971 a).
Forma spectrului de absorbtie al VCM se datoreaza in mare parte absorbtiilor
aminoacizilor din heptapeptida, influentate de prezenta componentei glican. Prezenta
glicanului modifica lungimile de unda caracteristice benzilor de absorbtie ale peptidelor
sau ale proteinelor (Rondeau 2010).
Primele doua benzi de absorbtie din spectrul VCM apar putin deplasate fata de
valorile prezentate pentru peptide simple datorita influentelor dizaharidei si a complexitatii
moleculei.
De asemenea, asparagina, ce formeaza o catena laterala cu rol in activitatea
antimicrobiala a VCM, prezinta o banda de absorbtie in domeniul 190 – 230 nm care
influenteaza aspectul spectrului de absorbtie al solutiilor de VCM. Totusi, banda de
absorbtie a asparaginei este mult mai slaba decat cea datorata legaturii peptidice.
Maximul de absorbtie de la 280 nm este analizat pentru stabilitate in solutiile de
VCM 10-3
M in apa ultra pura.
In Figura 4.3 sunt prezentate spectrele de absorbtie in UV-Vis ale solutiilor de
VCM la 10-3
M in apa ultra pura inregistrate la diferite perioade de timp dupa prepararea
solutiilor.
Experimentele au fost desfasurate in aceleasi conditii ca si pentru solutiile de VCM
10-4
M in apa ultra pura.
Este urmarita stabilitatea maximului de la 280 nm, deoarece la aceasta concentratie,
extinctia solutiei sub 250 nm este mult prea mare si detectorul spectrofotometrului se
satureaza. Spectrele de absorbtie nu au prezentat modificari pe durata experimentelor,
indicand ca solutiile de VCM 10-3
M in apa ultra pura raman stabile pana la 408 ore.
Banda de absorbtie cu maximul la 280 nm poate fi atribuita unei tranzitii π – π*, ce
se poate datora, in principal, radicalului tirozinei ce face parte din molecula de VCM (Jin
1995).
Stabilitatea solutiilor de VCM la 10-3
M in apa ultra pura, neexpuse la lumina
ambientala sau la fascicul laser este demonstrata de alura spectrelor si de faptul ca
diferentele de intensitate care apar de la un spectru la altul raman in limitele erorilor de
masura descrise in Capitolul III.
76
Fig. 4.3. Evolutia in timp a solutiilor de VCM 10
-3M in apa ultra pura
Pentru ambele concentratii testate, 10-4
M si 10-3
M, solutiile de VCM in apa ultra
pura si-au pastrat caracteristicile initiale si au ramas stabile timp de 408 ore, cat s-au
desfasurat experimentele.
4.3. Stabilitatea solutiilor de Vancomicina in conditii de iradiere cu fascicul
laser
Fotostabilitatea solutiilor de VCM a fost studiata si in conditii de iradiere cu
fascicul laser.
Conditiile de iradiere au fost modificate pentru a se incerca o optimizare a
procesului de obtinere a noi produsi din solutiile de VCM prin expunere la fascicul laser.
In functie de conditiile experimentale au fost obtinute diferite modificari ale
moleculelor de VCM, avand ca rezultat producerea unor compusi cu caracter hidrofob sau
generarea de spume.
In primul set de experimente o solutie de VCM 2x10-3
M in apa ultra pura a fost
expusa la radiatie laser cu o energie medie de 30 mJ, obtinuta de la armonica a patra a
fasciculului fundamental, emis de laserul Nd:YAG (266 nm) si armonica a doua a aceluiasi
fascicul laser (532 nm).
Conform specificatiilor producatorului, la aceasta energie, 22 mJ se datoreaza
fasciculului la 532 nm si 8 mJ radiatiei UV.
Experimentele au demonstrat ca fasciculul la 532 nm nu este responsabil de
modificarile produse in VCM, extinctia VCM in jurul acestei valori fiind zero.
In Figura 4.4.a sunt prezentate spectrele de absorbtie ale solutiilor de VCM
2x10-3
M in apa ultra pura neiradiate si expuse la radiatie laser la perioade pana la 60 de
minute. Volumul probelor a fost de 1 mL si au fost expuse in cuve de 10 mm.
77
Solutiile de VCM 2x10-3
M in apa ultra pura absorb puternic sub 250 nm,
provocand saturarea spectrului de absorbtie. Aceste date sunt in concordanta cu (Nastasa
2011).
Spectrul solutiei neiradiate de VCM 2x10-3
M in apa ultra pura prezinta un maxim
de absorbtie la 281 nm caruia ii corespunde un coeficient de extinctie molara (ε) egal cu
6239,5 L mol-1
cm-1
. Aceasta banda de absorbtie poate fi atribuita, in principal, unei
tranzitii π – π* a radicalului tirozinei din heptapeptida, parte a moleculei de VCM (Jin
1995).
Fig. 4.4. Influenta radiatiei laser asupra solutiei de VCM 2x10
-3M in apa ultra pura: a)
Spectrele de absorbtie ale solutiilor la diferiti timpi de iradiere; b) cinetica maximelor de
absorbtie la 281 nm si 306 nm.
In timpul celor 60 minute de expunere a solutiilor de VCM 2x10-3
M in apa ultra
pura la radiatie laser cu energia medie de 30 mJ are loc modificarea moleculelor de VCM.
Modificarile pot fi observate si in spectrele de absorbtie inca din primul minut de iradiere:
extinctia maximului de la 281 nm creste, iar la 263 nm si 306 nm apar doua benzi de
absorbtie sub forma de umar.
In timpul iradierii are loc o deplasare batocromica si maximul de la 281 nm este
deplasat la 289 nm.
In acelasi timp, un efect hipercromic are loc, iar coeficientul molar de extinctie
creste la ε = 15259.3 L mol-1
cm-1
. In (Pattabhi 2002) efectul hipercromic este descris ca
fiind datorat interactiilor dipolilor electrici ai cromoforilor, interactii ce apar in timpul
aranjarii moleculelor una in continuarea celeilalte (“end-to-end”). Aceasta teorie este in
concordanta cu posibila aranjare a dimerilor de Vancomcina unul langa celalalt (“side-by-
side”) ce apare la o concentratie suficient de mare, dupa cum este descris in (Nitanai
2009).
Forma spectrelor de absorbtie este influentata si de modificarile pH-ului. Un efect
hipercromic se observa in cazul tirozinei cu cresterea pH-ului, insa in cazul solutiilor de
VCM in apa pH-ul scade in timpul iradierii.
Inlaturarea unei grupari OH de la tirozina poate induce un efect batocromic al
maximului de absorbtie de la 281 nm, asa cum se observa si in timpul iradierii solutiilor de
VCM.
78
Cinetica maximelor de absorbtie de la 281 nm si 306 nm este prezentata in Figura
4.4.b. Se poate observa ca la ambele lungimi de unda, coeficientul molar de extinctie creste
exponential pe durata celor 60 de minute de iradiere, cu o tendinta de saturare la timpi de
expunere mai mari de 30 minute. Aceasta comportare arata ca produsii de fotoreactie
responsabili de aparitia celor doua maxime cresc in concentratie pana la timpi de expunere
de aproximativ 30 minute, dupa care producerea lor se satureaza fie ca urmare a
recombinarilor in solutie fie ca urmare a scaderii numarului de molecule de VCM
disponibile pentru producerea lor.
Banda de absorbtie de la 263 nm se poate datora fenilalaninei. Aceasta se poate
obtine in timpul iradierii prin inlaturarea gruparii hidroxil. Fenilalanina prezinta o absorbtie
slaba in jurul lungimii de unda de 263 nm (Kerwin 2007).
Prin expunerea Vancomicinei la radiatie laser, printre modificarile ce au loc, poate
fi afectata direct tirozina, care, in afara de fenilalanina, se poate transforma in unul din cei
doi derivati ai fenilalaninei: 3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA) sau 2,4-
dihidroxifenilalanina (2,4-DHPhe) (Jin 1995).
Prezenta gruparilor (OH)- libere in solutie poate contribui la scaderea pH-ului ce se
observa in timpul iradierii.
Aparitia benzii de absorbtie sub forma de umar la 306 nm se poate datora
modificarilor inelelor aromatice ale moleculelor de VCM ce pot aparea in timpul expunerii
la radiatie laser.
Stabilitatea solutiilor iradiate a fost urmarita pentru probe de VCM 10-3
M in apa
ultra pura, expuse la radiatie laser la 266 nm si 532 nm, cu o energie medie de 12 mJ, timp
de 60 minute. Probele au avut volumul de 1 mL si au fost iradiate in cuve cu lungimea
drumului optic de 10 mm.
Fig. 4.5. Stabilitatea solutiei de VCM 10
-3M in apa ultra pura dupa iradiere de 60 minute,
cu o energie medie a fasciculului de 12 mJ: a) Spectrele de absorbtie ale solutiilor la
diferiti timpi dupa incetarea iradierii; b) cinetica maximelor de absorbtie la 262 nm, 281
nm si 306 nm.
In Figura 4.5.a sunt prezentate spectrele de absorbtie ale solutiei de VCM 10-3
M
imediat dupa iradiere si la diferite intervale de timp dupa ce solutia a fost iradiata 60 de
minute.
79
Se poate observa ca, pana la 384 de ore dupa iradiere, extinctia maximelor de
absorbtie scade usor, insa cele trei benzi de absorbtie raman vizibile.
In Figura 4.5.b este prezentata evolutia in timp a coeficientului molar de extinctie la
lungimile de unda la care se oberva maxime de absorbtie imediat dupa iradiere. Pentru o
mai buna descriere a cineticii coeficientului molar de absorbtie, datele inregistrate se
fiteaza cu o functie polinomiala de gradul al III-lea.
Se poate observa ca pentru toate celei trei lungimi de unda, coeficientrul molar de
extinctie are acelasi comportament in timp. Pe durata experimentelor, extinctia maximelor
de la 262 nm, 290 nm si 306 nm scade, insa in primele 72 de ore de la incetarea iradierii
are loc o scadere mult mai rapida decat in restul perioadei.
Acest comportament poate sa indice faptul ca o parte din modificarile ce au loc in
timpul iradierii cu o energie medie a fasciculului laser de 12 mJ, nu sunt definitve si
recombinari ale produsilor formati pot sa apara, mai multe in perioada apropiata iradierii.
La perioade mai lungi dupa iradiere, dupa ce produsii disponibili se recombina, in spectrul
de absorbtie raman vizibile benzile datorate compusilor stabili in timp. O explicatie ar fi ca
energia acumulata in solutie (in moleculele de VCM excitate, de exemplu) continua dupa
iradiere sa duca la dezactivarea moleculelor de VCM. Cand produsii de reactie obtinuti
sunt suficienti, ca si concentratie, si energia s-a consumat, procesul de descompunere
rapida a VCM se opreste moleculele de fotoprodusi se recombine si are loc o stabilizare
extinctiei, dupa care moleculele de VCM continua sa se descompuna.
Fig. 4.6. Stabilitatea in timp si stabilitatea in conditii de iradiere cu fascicul laser a solutiei
de VCM 2x10-3
M in DMSO
In Figura 4.6 sunt prezentate spectrele de absorbtie in UV-Vis ale solutiilor de
VCM 2x10-3
M in DMSO inainte si dupa expunerea la radiatie laser.
Solutiile de VCM 2x10-3
M in DMSO, atat neiradiate, cat si iradiate, prezinta o
absorbtie puternica sub 250 nm, iar spectrul de aborbtie este saturat sub aceasta lungime de
80
unda. Absorbtia puternica este datorata atat Vancomicinei la concentratia utilizata, cat si
solventului, spectrul de absorbtie al DMSO fiind saturat sub 250 nm.
Spectrul solutiei neiradiate de VCM la 2x10-3
M in DMSO prezinta doua benzi de
absorbtie, prima cu maximul la 283 nm, si a doua sub forma de umar, cu maximul la 291
nm.
Diferentele dintre spectrele de absorbtie ale Vancomicinei in apa si cele in DMSO
se datoreaza diferentelor in aranjarea spatiala a moleculelor in solventi cu polaritate diferita
sau diferentei de pH (Berthod 2010).
Cele doua benzi de absorbtie suprapuse din spectrul solutiei de VCM 2x10-3
M in
DMSO, cu maxime la 283 nm si 291 nm, pot fi atribuite unor tranzitii π – π* ale radicalului
tirozinei si ale celorlalte inele aromatice din moleculele de VCM.
Se poate observa ca in primele 24 de ore de la preparare nu apar diferente in
spectrele de absorbtie, indicand ca solutiile de VCM in DMSO raman stabile cel putin 24
de la preparare.
Pentru studiul stabilitatii solutiilor de VCM in DMSO in conditii de iradiere cu
fascicul laser, 1 mL de solutie a fost iradiat in cuva de 10 mm, timp de 1 ora, la 266 nm si
532 nm, cu o energie medie a fasciculului laser de 45 mJ.
In Figura 4.6 se pot observa modificarile induse in spectrele de absorbtie de
expunerea la radiatie laser. In urma iradierii, maximele de la 283 nm si 291 nm nu se mai
disting, insa extinctia la aceste lungimi de unda aproape ca se tripleaza, avand loc un efect
hipercromic.
Forma spectrului solutiei de VCM la 2x10-3
M in DMSO iradiata timp de o ora
indica posibilitatea ca o deplasare hipsocromica sa aiba loc si cele doua maxime de la 283
nm si 291 nm sa fie suprapuse peste benzile de absorbtie de la lungimi de unda mai mici de
250 nm.
Comparand spectrele de absorbtie ale solutiilor iradiate de VCM 2x10-3
M in
DMSO inregistrate imediat dupa expunere la radiatie laser si la 24 de ore dupa ce a incetat
iradierea, se poate observa ca modificarile induse de radiatia laser in conditiile
experimentale descrise mai sus sunt ireversibile si solutiile iradiate sunt stabile pentru cel
putin 24 de ore dupa iradiere.
Unul dintre parametrii ce pot fi fi schimbati cu usurinta in cadrul experimentelor de
stabilitate in conditii de iradiere este energia fasciculului laser.
Pentru a vedea in ce masura energia radiatiei laser influenteaza modificarea
moleculelor au fost inregistrate spectre de absorbtie ale solutiilor de VCM 10-3
M in apa
ultra pura expuse la fascicule laser cu energii medii variind intre 12 mJ si 50 mJ (Figura
4.7). Conditiile de iradiere care au ramas neschimbate au fost: volumul probei egal cu 1
mL, lungimea drumului optic egala cu 10 mm, lungimile de unda ale radiatiei laser folosite
simultan (266 nm si 532 nm) si timpul de iradiere de 1 ora.
In Figura 4.7 se poate observa ca, desi la energiile mai mici folosite (12 – 20 mJ)
apare o deplasare batocromica a maximului de la 281 nm catre 290 nm, la energii mai mari
ale fasciculului laser (de exemplu, 40 – 50 mJ), maximul de absorbtie sufera o deplasare
hipsocromica fata de cazul energiilor mai mici ale fasciculului laser.
La energiile de 40 mJ si 50 mJ, banda de absorbtie cu maximul la 285, apare sub
forma unui umar, incepand sa se suprapuna peste benzile de absorbtie de la lungimi de
81
unda mai mici de 250 nm. Un comportament similar a fost semnalat anterior in cazul
expunerii solutiilor de VCM 2x10-3
M in DMSO la fascicul laser cu energia medie de 45
mJ.
Fig. 4.7. Influenta energiei fasciculului laser asupra modificarilor spectrelor de absorbtie
ale solutiilor de VCM 10-3
M in apa ultra pura
Spectrele de absorbtie indica faptul ca la energii mai mari (40 – 50 mJ) radicalul
tirozinei si o parte din inelele aromatice pot suferi modificari mai mari decat la energii mai
mici, in cazul expunerii solutiilor la radiatie laser timp de 1 ora.
Fig. 4.8. Influenta volumului probei si a lungimii drumului optic asupra modificarilor
VCM 2x10-3
M in apa ultra pura induse de expunerea la fascicul laser
82
In afara de solventul utilizat si de energia fasciculului laser, alti parametri ce pot fi
modificati in experimentele de stabilitate in conditii de iradiere cu fascicul laser sunt
volumul probei si lungimea drumului optic.
In Figura 4.8 sunt prezentate spectrele de absorbtie ale probelor de VCM 2x10-3
M
in apa ultra pura iradiate, prima cu un volum de 1 mL si cu lungimea drumului optic de 10
mm, reprezentat cu rosu, iar a doua cu un volum de 0,5 mL si cu lungimea drumului optic
de 5 mm, reprezentat cu culoare verde.
Conditiile de iradiere ce au ramas neschimbate au fost lungimile de unda ale
radiatiilor laser (266 nm si 532 nm), energia medie a fasciculului egala cu 40 mJ si timpul
de iradiere de 2 ore.
Se poate observa ca in cazul primei probe, cu volumul egal cu 1 mL, apare un efect
batocromic si maximul de absorbtie este deplasat de la 281 nm la 287 nm. In acelasi timp,
are loc un efect hipercromic al maximului, extinctia maximului ajungand la o valoare tripla
in urma iradierii.
Aceste schimbari ale spectrului de absorbtie demonstreaza ca in timpul iradierii
radicalul tirozina si inelele aromatice din moleculele de VCM sufera modificari.
Pentru a doua proba, de volum 0,5 mL, modificarile induse de radiatia laser in
spectrul solutiei de VCM sunt mai mari. Acest lucru se poate datora faptului ca intr-un
volum mai mic, in aceleasi conditii experimentale, la sfarsitul celor 2 ore de iradiere
practic toate moleculele de VCM sunt modificate, astfel incat efectul lor este dominant in
spectrul de absorbtie. Maximul de absorbtie de al 281 nm in proba neiradiata este acoperit
in acest caz, foarte probabil, de suprapunerea mai multor benzi de absorbtie ale unor foto-
produsi de tranzitie generati prin interactia probei de VCM cu fasciculul laser.
In spectrul de absorbtie al celei de-a doua probe, benzile de absorbtie nu mai pot fi
distinse, insa la 281 nm valoarea extinctiei solutiei iradiate este usor mai mare decat a celei
neiradiate. Aceasta forma a spectrului poate sa indice ca benzile de absorbtie ale
compusilor formati in urma iradierii sunt mult mai largi si se suprapun, neputand fii
distinse maxime de absorbtie.
Fig. 4.9. Stabilitatea micropicaturilor de VCM 2x10
-3M in apa ultra pura in conditii de
iradiere cu fascicul laser: a) Spectrele LIF ale Vancomicinei in apa ultra pura; b) cinetica
intensitatii fluorescentei la 351 nm si 499 nm.
83
Un alt tip de experimente au fost desfasurate in cadrul studiilor de stabilitate in
conditii de iradiere cu fascicul laser, si anume expunerea solutiilor de VCM la radiatie
laser sub forma de micropicaturi atarnate.
Modificarile induse de fasciculul laser in micropicaturile de VCM au fost studiate
cu ajutorul fluorescentei induse laser (LIF – Laser Induced Fluorescence).
Spectrele LIF ale micropicaturilor de VCM 2x10-3
M in apa ultra pura au fost
inregistrate in timp real. Conditiile de iradiere pentru acest experiment au fost: volumul
picaturii 10 μL, lungimile de unda ale radiatiei laser 266 nm si 532 nm, iar energia medie a
fasciculului 6 mJ.
In Figura 4.9.a sunt prezentate spectrele LIF ale micropicaturilor de VCM 2x10-3
M
in apa ultra pura. Se poate observa ca in primele secunde de expunere la radiatie laser,
VCM prezinta doua peak-uri de fluorescenta, primul cu maximul la 351 nm, iar al doilea la
499 nm.
Cele doua maxime de fluorescenta se datoreaza aminoacizilor din heptapeptida, in
special tirozinei (Kerwin 2007). Legarea glicanului la o proteina sau o peptida poate da
nastere unei fluorescente caracteristice cu maximul in jur de 460 nm (Rondeau 2010), ceea
ce poate explica prezenta maximului de la 499 nm din spectrele LIF ale Vancomicinei.
Intensitatea celor doua maxime scade pana la anulare la sfarsitul celor 6 minute si
40 secunde de expunere la radiatie laser.
Stingerea fluorescentei se poate datora mai multor procese, cum ar fi reactii in stare
excitata, rearanjare a moleculei, stingerea prin coliziune sau stingerea statica (Lakowicz
2008, Ni 2010). Disocierea moleculei poate fi un alt proces care duce la stingerea completa
a fluorescentei pompate cu fascicul laser.
Stingerea statica se datoreaza formarii unui complex in starea fundamentala intre
fluorofor si un stingator (quencher) de fluorescenta, iar formarea acestui complex produce
schimbari si in spectrul de absorbtie al fluoroforului, spre deosebire de stingerea prin
coliziune (Silva 2004, Ni 2010).
In cazul solutiilor de VCM, in timpul expunerii la radiatie laser, se produc
modificari atat in spectrele de emisie a fluorescentei, cat si in spectrele de absorbtie in UV-
Vis. Maximul de fluorescenta de la 351 nm se poate datora, in principal, radicalilor de
tirozina din compozitia moleculelor de VCM. Stingerea fluorescentei la 351 nm
demonstreaza ca radicalii de tirozina sunt tranformati, cel mai probabil, in fenilalanina prin
inlaturarea gruparii hidroxil, sub influenta radiatiei laser. Aceste rezultate sunt in
concordanta cu cele obtinute din spectrele de absorbtie ale solutiilor de VCM iradiate
(Figura 4.4).
Fenilalanina are o fluorescenta foarte slaba, care nu poate fi observata in prezenta
altor molecule precum tirozina sau triptofanul (Kerwin 2007).
Tirozina ajunge in starea excitata de singlet prin iradiere cu fascicul laser in UV
(Jin 1995). In (Jin 1995) s-a demonstrat ca din tirozina in starea singlet, prin fotoionizare si
prin ruperea legaturii O–H din fenol, iau nastere radicalii fenoxili. Acestia sunt precursori
ai 2,2’-bitirozil. Tot in tirozina singlet poate sa aiba loc deplasarea O–H fenolic in acelasi
timp cu ruperea inelului aromatic. Stingerea tirozinei in starea triplet poate duce, in final, la
formarea 3a-hidroxi-6-oxo-2,3,3a,6,7,7a-hexahidro-1H-indol-2-acid carboxilic (HOHICA),
3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA) si a 2,4-dihidroxifenilalanina (2,4-DHPhe) (Jin 1995).
84
In Figura 4.9.b se poate observa ca intensitatea fluorescentei la 351 nm scade
exponential pe durata experimentelor. Aceasta evolutie a intensitatii fluorescentei indica
rata de modificare a moleculelor de VCM si de transfomare a tirozinei in fenilalanina, sau
in una din formele DOPA sau 2,4-DHPhe. Se poate observa ca procesul de modificare al
moleculelor are loc mai rapid in primele 2 minute (120 secunde), ca apoi rata de
transformare sa scada pana la sfarsitul celor 6 minute si 40 secunde. O tendinta de scadere
a intensitatii fluorescenetei apare si la 499nm, dar evolutia sa este liniara ceeace arata ca
emisia estefacuta de alta molecula/produs de reactie decat in cazul maximului de la 351
nm.
Fig. 4.10. Stabilitatea micropicaturilor de VCM 2x10
-3M in DMSO in conditii de iradiere
cu fascicul laser: a) Spectrele LIF ale Vancomicinei in DMSO; b) cinetica intensitatii
fluorescentei la 351 nm si 499 nm.
In Figura 4.10.a sunt prezentate spectrele LIF ale micropicaturilor de VCM 2x10-
3M in DMSO. Conditiile de iradiere pentru inregistrarea spectrelor LIF au fost: volumul
picaturii egal cu 7 μL, lungimile de unda ale radiatiei laser au fost 266 nm si 532 nm, iar
energia medie a fasciculului a fost egala cu 4 mJ.
Peak-urile de fluorescenta de la 351 nm si 499 nm se regasesc si in spectrul LIF al
Vancomicinei 2x10-3
M in DMSO, insa intensitatea fluorescentei celui de-al doilea maxim
este foarte slaba in primele secunde de expunere la radiatie laser.
La fel ca si in cazul solutiilor de VCM in apa, maximul de fluorescenta de la 351
nm scade in timpul iradierii si poate fi atribuit tirozinei, care se tranforma treptat in
fenilalanina prin pierderea gruparii hidroxil, sub influenta radiatiei laser.
Opus comportarii solutiilor de VCM in apa, intensitatea celui de-al doilea maxim
de fluorescenta (499 nm) creste pana la sfarsitul celor 7 minute de iradiere.
Acest comportament indica formarea a noi specii in timpul iradierii. Stingerea
fluorescentei se poate datora formarii unui nou compus ce este responsabil de cresterea
maximului de la 499 nm. Pe masura ce aceasta specie noua este generata, are loc scaderea
primului maxim de fluorescenta.
Unul dintre compusii ce se poate forma in urma modificarii tirozinei, si poate fi
responsabil pentru maximul de fluorescenta de la 499 nm este ditirozina, dimerul tirozinei
(Gaspard 2008).
85
Rata transformarii moleculelor de VCM in timpul expunerii la fascicul laser poate
fi observata in Figura 4.10.b. Atat scaderea intensitatii maximului de la 351 nm, cat si
cresterea intensitatii maximului de la 499 nm, au loc intr-un ritm exponential. Modificarile
moleculelor au loc mai rapid in primele 120 secunde, ca apoi rata de modificare sa fie
foarte mica, aproape atingand un platou.
Aceste experimente ce implica probe sub forma de micropicaturi au demonstrat ca
timpul de obtinere al modificarilor sub influenta radiatiei laser este foarte rapid (de ordinul
minutelor), pe cand, pentru a obtine aceleasi modificari ale probelor de 1 mL, este nevoie
de iradieri de ordinul orelor. De asemenea, energia radiatiei laser necesara modificarii
moleculelor este mult mai mica.
Pentru a identifica mai bine modificarile induse de radiatia laser in moleculele de
VCM au fost inregistrate spectrele de absorbtie FTIR (Fourier Transform Infrared
Spectroscopy) ale solutiilor de VCM in apa inainte si dupa iradiere.
Fig. 4.11. Spectrele FTIR ale solutiilor de VCM 2x10
-3M in apa ultra pura inainte si dupa
iradiere
In Figura 4.11 sunt prezentate spectrul FTIR al solutiei neiradiate de VCM 2x10-3
M
in apa ultra pura si cel al al solutiei iradiate la 266 nm si 532 nm, cu o energie medie egala
cu 40 mJ, timp de iradiere egal cu 2 ore, volumul probei a fost egal cu 0,5 mL, iar cuva de
iradiere a avut drumul optic egal cu 5 mm. Spectrele au fost inregistrate pe domeniul 400 –
4000 cm-1
, cu o rezolutie de 4 cm-1
.
Spectrul FTIR al solutiei de VCM 2x10-3
M in apa ultra pura neiradiata prezinta
benzi de absorbtie amide caracteristice peptidelor, suprapuse cu benzile ce apar datorita
aminoacizilor din catena laterala (Krimm 1983, Salter 1995, Venyaminov 1990, Kong
2007).
86
In regiunea 3380 – 2870 cm-1
spectrul prezinta o banda de absorbtie larga, ce
rezulta din suprapunerea benzilor de intindere a legaturilor O–H cu banda amida A,
datorata vibratiilor de intindere a legaturilor N–H.
O banda de absorbtie datorata gruparii carbonil (banda amida I) este prezenta la
1651 cm-1
si se suprapune partial peste banda amida II, cu maximul la 1587 cm-1
, ce se
datoreaza unor vibratii de inconvoiere asimetrica N–H, intindere C–N si inconvoiere –
NH2. Legatura C=O este prezenta atat in partea polipeptidica a Vancomicinei, cat si in
asparagina prezenta in catena laterala, ce joaca un rol important in activitatea
antimicrobiala a Vancomicinei (Schafer 1996). Gruparea NH2 este prezenta si in
asparagina.
Banda de absorbtie cu maximul de la 1504 cm-1
este rezultatul superpozitiei
benzilor datorate vibratiilor de intindere a legaturilor C–C din inelele aromatice si
vibratiilor de inconvoiere a legaturilor N–H.
Vibratiile legaturilor C–C din inelele aromatice si intinderile simetrice a (C=O)2
sunt responsabile pentru benzile de absorbtie suprapuse cu maxime la 1422 si 1398 cm-1
.
Intinderile C–N dau nastere benzilor de absorbtie de la 1330 si 1312 cm-1
. O banda
de absorbtie puternica este prezenta la 1231 cm-1
si se datoreaza vibratiilor de intindere a
legaturilor C–O. Aceste vibratii pot fi responsabile si pentru benzile suprapuse din regiunea
1100 – 1010 cm-1
.
Benzile de absorbtie din regiunea 995 – 930 cm-1
se datoreaza vibratiilor de
inconvoiere in afara planului (out-of-plane – “oop”) ale legaturilor O–H.
Benzile de absorbtie suprapuse din regiunea 900 – 500 cm-1
se datoreaza mai
multor tipuri de vibratii: inconvoiere in afara planului “oop” a legaturilor C–H, inconvoiere
in afara planului “oop” a legaturilor C–C din inelul aromatic, vibratii de intindere a
legaturilor C–Cl, vibratii wagging ale legaturilor N–H, vibratii de inconvoiere (banda
amida IV) a legaturilor OCN, vibratii de inconvoiere in afara planului a legaturilor N–H
(banda amida V) si vibratii de inconvoiere in afara planului a legaturilor C=O (banda
amida VI).
In spectrul FTIR al solutiei de VCM 2x10-3
M in apa ultra pura expusa la radiatie
laser 2 ore se observa o scadere importanta in intensitatea benzilor datorate vibratiilor de
intindere ale legaturilor C–O si C–Cl.
Aceste date sugereaza ca moleculele de VCM sunt modificate prin interactia cu
radiatia laser si cel mai probabil un numar destul de mare de produsi de reactie sunt
generati in solutie.
Descresterea puternica a benzii de absorbtie de la 1231 cm-1
indica ruperea unor
legaturi C–O, ceea ce se poate intampla in cazul reziduurilor de tirozina, permitand
transformarea lor in reziduri de fenilalanina. Acest lucru este in concordanta cu rezultatele
obtinute din spectrele de absorbtie in UV-Vis si in spectrele LIF, conform carora tirozina
din moleculele de VCM este transfomata in fenilalanina.
O alta metoda de investigatie a modificarilor moleculelor de VCM obtinute in
timpul iradierii este cromatografia lichida cuplata cu spectrometria de masa.
In Figura 4.12 sunt prezentate spectrele de masa ale solutiilor de VCM 2x10-3
M in
apa ultra pura neiradiate si expuse la radiatie laser timp de 1 ora.
87
Fig. 4.12. Spectrele de masa ale solutiilor de VCM 2x10
-3M in apa ultra pura inainte si
dupa expunere la radiatie laser
In Figura 4.12 este reprezentata abundenta, exprimata in inregistrari per secunda, pe
axa OY, in functie de raportul dintre masa si sarcina (m/z), pe axa OX.
In timpul iradierii solutiilor de VCM la 266 nm, cel mai probabil, fotonii sunt
absorbiti de inelele aromatice din aminoacizi, deoarece gruparile fenil absorb radiatia UV,
iar geometria moleculei permite absorbtia fotonilor.
Se poate observa in Figura 4.12 ca pentru solutia neiradiata, VCM este detectata ca
ion simplu incarcat la m/z = 1450,4797, tinand cont ca masa moleculara a Vancomicinei
este 1449,259 Da.
Se poate observa ca abundenta ionului simplu incarcat de la m/z = 1450,4797 este
mica in comparatie cu abundenta fragmentului cu m/z = 724,7457, ce corespunde ionului
dublu incarcat al Vancomicinei (Bogusz 2004).
Comparand cele doua spectre de masa se poate observa ca rata dintre abundenta
ionului dublu incarcat si cea a ionului simplu incarcat este 4,7372 pentru solutia de VCM
neiradiata, mai mica decat 7,437 pentru solutia de VCM iradiata 2 ore.
Aceasta indica faptul ca fotoprodusii de reactie provin mai mult de la ionul dublu
incarcat decat de la cel simplu incarcat in timpul iradierii solutiei.
In acelasi timp, compusi generati prin expunere la radiatie laser se observa in
spectru la valori m/z mai mici decat ale Vancomicinei simplu ionizata (1378,5342;
1394,5334; 1414,5107 si 1432,5051) ce coexista cu produsul de la 1450,4809 (m/z
corespunzator ionului simplu incarcat al Vancomicinei). Acesti fotoprodusi sunt obtinuti,
cel mai probabil, din VCM simplu ionizata initiala, un argument fiind ca suma
abundentelor fiecarui fotoprodus (61044 inregistrari pe secunda) este aproape de abundenta
88
inregistrata la raportul m/z corespunzator moleculei de VCM simplu ionizata (70569
inregistrari pe secunda) inainte de iradiere. Diferenta dintre cele doua valori se datoreaza
celorlalti fotoprodusi ce se regasesc cu abundenta mult mai mica in spectru.
Acelasi lucru se observa si pentru VCM dublu ionizata (Figura 4.12). Valoarea m/z
a fotoprodusilor obtinuti din VCM dublu ionizata este exact jumatate din raportul m/z al
fotoprodusilor obtinuti din VCM simplu ionizata.
Dupa expunerea solutiei de VCM la radiatie laser, in spectrul de masa se observa
un fragment glican la m/z egal cu 324,1769. Prezenta sa in solutie indica faptul ca
legaturile de oxigen dintre heptapeptida si fragmentul glican se rup in timpul iradierii,
eliberand glicanul in solutia apoasa.
In afara de glican, in spectrul de masa al Vancomicinei iradiate (Figura 4.12) se
poate identifica un alt fotoprodus, N-metil-leucina, la m/z egal cu 144,1074, ce are o
abundenta relativ mica.
Acesti fotoprodusi influenteaza proprietatile de udare ale solutiei iradiate deoarece
sunt considerati puternic hidrofobi (Sereda 1994, Monera 1995). Acesti compusi pot fi
responsabili si pentru comportamentul tensiunii superficiale a solutiei iradiate de VCM.
4.4. Masuratori de microfluidica
O metoda ce poate oferi informatii despre generarea compusilor hidrofobi si rata lor
de producere in solutiile de VCM in timpul expunerii la radiatie laser este masurarea in
timp real a tensiunii interfaciale dinamice (dynamic interfacial tension - DIT) a unei bule
de gaz generata in solutiile de VCM.
Dupa cum se poate vedea si in Figura 4.1, o bula de aer este generata in solutie la
inceputul unei sesiuni de iradiere si tensiunea interfaciala dinamica este masurata cu
sistemul PAT1.
Evolutia tensiunii interfaciale dinamice in timpul iradierii solutiilor de VCM 2x10-
3M in apa ultrapura este prezentata in Figura 4.13. Conditiile de iradiere au fost: lungimea
de unda a raditiei laser a fost egala cu 266 nm, energia medie a fasciculului a fost 7 mJ, iar
volumul probei a fost 2 mL. Volumul bulei de aer generata in solutia de VCM a fost de 10
μL.
Iradierea Vancomicinei s-a produs in doua sesiuni, iar rezultatele privind tensiunea
interfaciala dinamica au fost reproductibile.
Valorile initiale ale tensiunii interfaciale dinamice in ambele cazuri au fost
apropiate de cea a interfetei apa – aer, dar apoi au scazut usor si dupa 15 minute de iradiere
o scadere brusca - de tip prag - a fost inregistrata. Aceasta scadere brusca se continua cu o
scadere exponentiala pana la sfarsitul iradierii.
Dupa doua ore de expunere, iradierea a fost oprita si o noua bula de aer a fost
generata. Tensiunea interfaciala dinamica a noii bule de aer a fost masurata, prezentand o
descrestere exponentiala, dar efectul de prag nemaifiind prezent.
In cazul ambelor sesiuni de iradiere, comportamentul tensiunii interfaciale
dinamice a fost specific procesului prin care o substanta hidrofoba (sau mai multe
substante hidrofobe) se acumuleaza gradual la suprafata bulei.
89
In cadrul acestor experimente de optfluidica s-a observat in timp real formarea
produsilor de reactie activi de suprafata.
Presupunerea unui timp de migrare apare necesara pentru a explica de ce produsii
obtinuti prin procesul de fotoreactie conduc la formarea unui strat activ pe suprafata bulei
de aer, care poate fi evidentiat in timp real pe durata iradierii cu ajutorul masuratorilor de
tensiune interfaciala dinamica. Acest efect poate fi influentat de timpul de difuzie al
speciilor cu masa moleculara mai mare.
Fig. 4.13. Masurarea tensiunii interfaciale la suprafata bulelor de aer in solutii de VCM
2x10-3
M in apa ultrapura, in timpul expunerii la radiatie laser.
Unele dintre caracteristicile comportamentului interfacial pot fi corelate cu studii
anterioare despre tensiunea inerfaciala in cazul adsorbtiei surfactantilor putin solubili sau
insolubili. Variatia pantei ce apare in masuratorile in timp real se poate datora unei tranzitii
de faza interfaciale. Aceasta poate aparea, spre exemplu, in straturile adsorbite de n-
dodecanol (Ferrari 2004, Palazzolo 2002). Formarea stratului poate fi insotita de o
adsorbtie competitiva si de formarea de domenii sau faze in stratul adsorbit.
Pe de alta parte, comportamentul monoton al tensiogramei Vancomicinei dupa
iradiere indica un comportament similar cu cel al unui surfactant solubil, care, in plus, este
reproductibil in a doua parte a iradierii in timp real. In acest fel se poate observa timpul de
reactie in volum si procesul de difuzie a moleculelor active de suprafata (Liggieri 1999).
De asemenea, timpul de iradiere (2 ore) permite o estimare a timpului necesar
ajungerii la conditii de echilibru al adsorbtiei.
90
Din moment ce produsii formati in timpul iradierii au fost identificati partial, macar
la nivel de grupari functionale, dintre acestia de interes sunt posibilele surse de filme active
adsorbite de suprafata, provenite din foto-modificarea Vancomicinei.
Din datele obtinute in spectrele de masa se pot selecta posibile molecule ce pot fi
responsabile pentru comportamentul interfacial: fragmentul glican si N-metil-leucina,
datorita caracteristicilor lor hidrofobe.
Pentru a determina caracterul hidrofob sau hidrofil al compusilor obtinuti prin
iradierea Vancomicinei s-a ales modulul KOA (coeficientul de partitie octanol-apa) al
programului Estimation Programs Interface Suite (EPIS 2013).
Modulul a fost folosit pentru a exprima comportamentul speciilor chimice separate
ce alcatuiesc molecula de VCM, pentru a identifica o posibila componenta chimica
responsabila pentru comportamentul cu prag (Figura 4.13) ce apare in timpul masuratorilor
de tensiune interfaciala dinamica.
Tabel 4.1. Valorile estimative ale KOA obtinute cu EPI Suite v.1.68
Radical al Vancomicinei KOA
Asparagina -3,81
Dihidroxifenilglicina -2,73
Hidroxifenilglicina -0,87
β-hidroxi-clorotirozina -0,48
N-metil-leucina 0,05
Heptapeptida (aglicon) 1,31
Coeficientii prezentati in Tabelul 4.1 reprezinta raportul dintre solubilitatea
compusului in octanol (un solvent nepolar) si solubilitatea sa in apa (un solvent polar). Cu
cat valoarea coeficientului KOA este mai mare, cu atat compusul este mai nepolar.
N-metil-leucina prezenta in VCM este de fapt o forma derivata a leucinei, avand o
grupare metil atasata unui atom de azot. Pe langa faptul ca leucina este un aminoacid
hidrofob (Sereda 1994, Monera 1995) datorita catenei laterale alifatice isobutil, prezenta
unei grupari metil mareste caracterul hidrofob al structurii.
In Figura 4.12 s-a observat ca N-metil-leucina apare doar in spectrul de masa al
solutiei iradiate de VCM.
Aceste masuratori reprezinta o noua metoda de caracterizare a compusilor activi de
suprafata produsi in solutiile de VCM in timpul expunerii la radiatie laser.
Prin masurarea tensiunii interfaciale dinamice in timpul iradierii solutiilor de VCM,
se observa formarea unor compusi cu caracter hidrofob. Asociate cu rezultatele obtinute
prin spectrometria de masa, putem afirma ca N-metil-leucina se formeaza in timpul
iradierii si face parte din compusii adsorbiti la suprafata bulei de aer din solutiile de VCM.
91
4.5. Generarea spumelor prin expunere la radiatie laser
In timpul studiilor de stabilitate in conditii de iradiere cu fascicul laser s-au obtinut
modificari ale solutiilor de VCM, printre care si producerea de spume sub influenta
fasciculului laser.
Unele studii au demonstrat ca spuma unor medicamente este mai activa decat
solutia medicamentului respectiv, spre exemplu Polidocanolul, folosit in scleroterapie
(Eckman 2009, Smarandache 2012 b, Trelles 2010).
Cele mai cunoscute metode de spumare a medicamentelor sunt: metoda Monfreux,
metoda Tessari si metoda sistemului cu seringa dubla. Toate aceste metode se bazeaza pe
presiunea cu care este apasat lichidul. Dintre acestea, cea mai utilizata este metoda Tessari.
Prin aceasta metoda, spuma este formata intre doua seringi etanse legate printr-o valva cu 3
cai, datorita presiunii cu care lichidul este apasat dintr-o seringa in cealalta.
Spumele realizate in acest fel folosesc aerul atmosferic, bogat in azot, gaz ce are o
solubilitate scazuta in lichidele din corp (Smarandache 2010, Redondo 2005).
O alta metoda de producere a spumelor a fost raportata pentru prima data in
(Lazare 2005), unde colagenul si alti biopolimeri similari au fost expusi sub forma de filme
subtiri la radiatie laser. Pulsurile laser au generat micro-spume la suprafata filmelor subtiri
de biopolimeri.
In cazul solutiilor de VCM in apa ultra pura, spumele au fost obtinute in timpul
iradierii cu laser pulsat cu Nd:YAG, la 266 nm si 532 nm, atat in cazul iradierii in volum,
cat si in picatura. Durata pulsului laser este de 6 ns.
Modificarile obtinute in spectrele de absorbtie in UV-Vis si LIF pentru solutiile in
care s-a obtinut spuma sunt similare cu cele prezentate in subcapitolul 4.3.
Dintre conditiile experimentale variate in cadrul studiilor de stabilitate in conditii
de iradiere cu fascicul laser, parametrul care a influentat producerea spumelor a fost
energia fasciculului laser. Pragul minim al energiei radiatiei laser pentru care s-au obtinut
spume a fost, in functie de volum, 40 de mJ pentru un volum de 0,5 mL si 7 mJ pentru 5
μL.
Conditiile experimentale pentru producerea spumelor intr-un volum de 0,5 mL de
solutie de VCM 2x10-3
M in apa ultra pura au fost: lungimile de unda ale fasciculului laser
266 nm si 532 nm, energia medie a fasciculului 40 mJ, lungimea drumului optic egala cu 5
mm.
In Figura 4.14 sunt prezentate cuvele cu solutie de VCM 2x10-3
M in apa ultra pura
dupa 1 ora de iradiere (a) si 2 ore de iradiere (b).
Solutia de VCM 2x10-3
M in apa ultra pura neiradiata este incolora si transparenta,
insa dupa expunerea la radiatie laser timp de 1 ora aceasta isi schimba culoarea in galben
deschis si spuma incepe sa se acumuleze la suprafata lichidului. Dupa 2 ore de iradiere,
solutia de VCM are culoarea portocaliu inchis si este tulbure. In acelasi timp, se poate
observa prezenta unei cantitati mai mari de spuma. Spuma ramane stabila cateva zeci de
minute. In acelasi timp cu disparitia spumei, in solutia portocalie se decanteaza un
precipitat portocaliu-maro, iar solutia ramane transparenta.
92
Fig. 4.14. VCM 2x10
-3M in apa ultra pura iradiata: a) 1 ora si b) 2 ore
In cazul expunerii la radiatie laser a micro-picaturilor de VCM 2x10-3
M in apa ultra
pura, conditiile de iradiere au fost: lungimile de unda ale fasciculului laser 266 nm si 532
nm, energia medie a fasciculului a fost egala cu 7 mJ, iar volumul picaturii a fost 5 μL.
Fasciculul laser a fost focalizat in asa fel incat sa acopere toata suprafata picaturii, fara a o
depasi.
In Figura 4.15 sunt prezentate imaginile unui picaturi de VCM 2x10-3
M in apa ultra
pura, inregistrate la diferite momente in timpul iradierii.
Fig. 4.15. Generarea spumelor in micro-picaturile de VCM 2x10
-3M in apa ultra pura in
timpul iradierii.
Se poate observa in Figura 4.15 ca pe masura ce creste timpul de expunere la
radiatie laser, solutia de VCM 2x10-3
M in apa ultra pura se transforma treptat in spuma. In
93
aproximativ 40 minute o picatura cu volumul de 5 μL este transformata in totalitate in
spuma.
S-a obervat ca formarea spumelor este influentata de energia fasciculului, dar si de
durata pulsului.
Mecanismul prin care spumele se formeaza in solutia de VCM este un mecanism de
ablatie laser in lichid. Studiile au aratat ca pulsurile scurte duc la ablatie fotomecanica,
impreuna cu cavitatie sub suprafata, ce se datoreaza unei presiuni termoelastice tranziente,
in timp ce, in cazul pulsurilor mult mai lungi decat timpul de relaxare acustica, acumularea
energiei duce la cresterea temperaturii solutiei peste punctul de fierbere, si are ca efect
expulzarea unor mici volume din volumul total al solutiei (Paltauf 2003).
Lazare et al. au studiat formarea spumelor in filme subtiri de gelatina, colagen,
chitosan si alti biopolimeri prin iradierea cu pulsuri laser de ordinul nanosecundelor si
femtosecundelor (Lazare 2005, Lazare 2009 a, Gaspard 2008).
Pentru formarea spumelor este necesara nucleatia si cresterea brusca si densa a
bulelor. Acest proces este generat de unda acustica tranzienta indusa de pulsul laser.
Nucleatia bulelor se datoreaza componentei de rezistenta a undei fotoacustice induse de
pulsul laser.
In cazul filmelor de biopolimeri, continutul mare de apa reduce rezistenta la rupere
(elasticitatea) a probei, facilitand nucleatia bulelor si cresterea lor si ajutand astfel la
formarea spumelor (Gaspard 2008).
Totusi, temperatura probelor a fost monitorizata si s-a ajuns la concluzia ca, desi
are loc o incalzire, nu este suficient de mare ca sa fie responsabila de producerea spumelor,
mai puternic fiind efectul fotoacustic, corelat cu variatii mari de presiune (Lazare 2005).
Acest proces ce are ca rezultat producerea spumelor este denumit “ablatie rece”
deoarece nu se datoreaza expansiunii termice la temperaturi inalte, ci mai degraba
campului de rezistenta (tensile field) foarte intens generat de confinarea presiunii
(Oraevsky 1995).
Datorita expansiunii termice rapide se formeaza un puls de presiune bipolar datorita
secventei accelerare – decelerare pe directia fascilulului laser. Unda de presiune este
formata dintr-o unda de compresie ce se formeaza in timpul accelerarii, urmata de o
presiune negativa sau unda de rezistenta, formata in timpul decelerarii. Aceasta
componenta de rezistenta (presiune negativa) are un rol important in ablatie si in formarea
spumelor, deoarece corespunde intinderii legaturilor chimice din molecule. Daca presiunea
negativa este mai mare decat rezistenta la rupere a probei, atunci apar goluri sau bule
(Lazare 2005).
Nu este suficient ca presiunea sa fie mare si compresiva pentru a aparea nucleatia.
Nucleatia apare dupa un timp de intarziere caracteristic, ce permite undei de compresie sa
traverseze lungimea probei in care are loc absorbtia radiatiei laser. Dupa acest timp, numit
“avalansa de nucleatie”, incepe formarea spumei.
Pentru a pune in evidenta acest timp, transmitanta probelor a fost masurata si s-a
observat ca in intervalul 0 – 60 ns are loc o scadere brusca a transmitantei. Intervalul de
timp pana la scaderea transmitantei reprezinta timpul de inductie sau timpul de avalansa.
Acest comportament poate fi modelat pentru nucleatia bulelor folosind formalismul
clasic al nucleatiei omogene si poate demonstra ca viteza mare de nucleatie este data numai
94
de unda de rezistenta. Acesta unda de presiune negativa apare numai dupa un timp de
relaxare a undei de compresie ce are loc prin traversarea probei, perioada ce corespunde
timpului de relaxare (Lazare 2009 a, Lazare 2009 b, Lazare 2010).
Studiile spectroscopice au aratat in cazul filmelor de gelatina, in timpul producerii
spumelor, o componenta principala care sufera modificari este tirozina (Gaspard 2008).
Ca si in cazul solutiilor de VCM, spectrele de absorbtie si cele de fluorescenta
indusa laser ale gelatinei se modifica in timpul expunerii la radiatie laser si in timpul
formarii spumelor.
In subcapitolul 4.4 s-a aratat ca, in timpul studiilor de stabilitate in conditii de
iradiere cu fascicul laser, VCM sufera modificari ce pot fi observate in spectrele de
absorbtie in UV-Vis si in spectrele LIF. Aceste modificari au fost identificate ca
provenind, in mare parte, din modificarea tirozinei.
Deoarece nu s-a observat o incalzire semnificativa a solutiilor de VCM (incalzire
de 1-2oC la suprafata cuvei), formarea spumelor in solutiile de VCM 2x10
-3M in apa ultra
pura in timpul iradierii are la baza nucleatia bulelor, datorata undei de rezistenta a pulsului
laser.
4.6. Concluzii
Studiile de stabilitate a solutiilor de VCM au fost axate pe stabilitatea in conditii de
iradiere cu fascicul laser.
In cadrul studiilor de stabilitate in timp, spectrele de absorbtie in UV-Vis ale
solutiilor de VCM in apa ultra pura, la concentratiile 10-4
M si 10-3
M, au fost inregistrate.
Solutiile de VCM au ramas stabile pentru cel putin 408 ore, cat au durat experimentele,
pentru ambele concentratii studiate.
VCM prezinta trei benzi de absorbtie in UV: prima la 199 nm, a doua sub forma
unui umar, in jurul valorii de 236 nm, iar a treia la 280 nm.
Forma spectrului de absorbtie al Vancomicinei se datoreaza in mare parte
absorbtiilor aminoacizilor din heptapeptida, in special a tirozinei, influentate de prezenta
componentei glican, ce poate sa modifice lungimile de unda caracteristice benzilor de
absorbtie ale peptidelor.
Aparitia primei benzi de absorbtie de la 199 nm poate fi determinata de o tranzitie
π – π*, iar umarul de la 236 nm poate fi atribuit unei tranzitii n – π*. Banda de absorbtie cu
maximul la 280 nm poate fi atribuita unei tranzitii π – π*, ce se poate datora, in principal,
reziduului de tirozina din molecula de VCM.
De asemenea, asparagina, ce formeaza o catena laterala cu rol in activitatea
antimicrobiala a Vancomicinei, prezinta o banda de absorbtie in domeniul 190 – 230 nm ce
influenteaza aspectul spectrului de absorbtie al solutiilor de VCM.
In cadrul studiilor de stabilitate in conditii de iradiere cu fascicul laser s-a urmarit
identificarea modificarilor aparute in timpul expunerii solutiilor de VCM la radiatie laser
prin diferite metode.
Parametrii de iradiere au fost modificati pentru a obtine conditiile optime
experimentale in functie de rezultatele urmarite. Parametrii modificati au fost: solventul,
95
energia fasciculului laser, volumul probei, lungimea drumului optic a cuvei de iradiere si
timpul de iradiere.
Din spectrele de absorbtie in UV-Vis si spectrele LIF ale solutiilor de VCM,
inregistrate inainte e expunerea la radiatie laser si la diferiti timpi de iradiere, s-a putut
observa ca moleculele de Vancomcina se modifica in timpul iradierii, aparand compusi
noi. Dintre modificarile identificate, cel mai probabil in timpul iradierii este afectata
tirozina, ce se poate transforma in fenilalanina, ditirozina, 3a-hidroxi-6-oxo-2,3,3a,6,7,7a-
hexahidro-1H-indol-2-acid carboxilic (HOHICA), 3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA) sau
2,4-dihidroxifenilalanina (2,4-DHPhe).
Din spectrele FTIR ale solutiilor de VCM in apa ultra pura se observa ca dupa
iradiere are loc o scadere importanta a intensitatii benzilor datorate vibratiilor de intindere
ale legaturilor C–O si C–Cl. Ruperea unor legaturi C–O se poate intampla si in cazul
reziduurilor de tirozina, permitand transformarea lor in reziduri de fenilalanina. Acest lucru
este in concordanta cu rezultatele obtinute din spectrele de absorbtie in UV-Vis si in
spectrele LIF.
In spectrele de masa ale solutiilor de VCM iradiate s-a observat apartitia mai
multor fotoprodusi de reactie. Dintre acestia au fost identificati N-metil-leucina si glicanul.
Prezenta glicanului in solutie indica faptul ca legaturile de oxigen dintre
heptapeptida si fragmentul glican se rup in timpul iradierii, eliberand glicanul in solutia
apoasa.
N-metil-leucina este un compus puternic hidrofob, avand coeficientul de partitie
octanol-apa egal cu 0,05.
Formarea compusilor cu caracter hidrofob in timpul iradierii a putut fi studiata in
timp real, prin inregistrarea tensiunii interfaciale dinamice, pe suprafata unei bule de aer
generata intr-o solutie de VCM in apa.
In timpul a doua sesiuni de iradiere consecutive, comportamentul tensiunii
interfaciale dinamice a fost specific procesului prin care o substanta hidrofoba (sau mai
multe substante hidrofobe) se acumuleaza gradual la suprafata bulei.
Expunerea solutiilor de VCM la radiatie laser cu energii medii mai mari (40 de mJ
pentru un volum de 0,5 mL si 7 mJ pentru micro-picaturi cu volum de 5 μL) a avut ca
rezultat modificarea moleculelor de VCM si generarea de spume.
Formarea spumelor in solutiile de VCM 2x10-3
M in apa ultra pura in timpul
iradierii are la baza nucleatia bulelor, datorata undei de rezistenta generate de pulsul laser.
Este putin probabil ca formarea spumelor sa se datoreze cresterii temperaturii, deoarece nu
s-a observat o incalzire semnificativa a solutiilor de VCM (incalzire de 1-2oC la suprafata
cuvei).
Generarea spumelor produce modificari in molecula de VCM, afectand in special
radicalul tirozina.
In urma modificarilor induse de radiatia laser in molecula de VCM este posibil ca
activitatea antibacteriana a acesteia sa fie afectata, insa studii urmeaza sa fie efectuate.
Generarea spumelor sub influenta fasciculului laser, are in schimb potentialul de a
imbunatatii activitatea biologica prin crearea de situsuri de adeziune.
96
Capitolul V. Studiul stabilitatii solutiilor derivatilor chinazolinici
5.1. Introducere
Derivatii chinazolinici studiati in acest capitol au fost sintetizati de Facultatea de
Medicina si Farmacie din Marsilia, Franta.
Colaborarea cu grupul de cercetare UMR-MD1 din Marsilia, privind stabilitatea
derivatilor chinazolinici, a inceput in cadrul retelei COST BM0701 ATENS – Transportul
si efluxul antibioticelor: noi strategii de combatere a rezistentei bacteriene.
O serie de derivati chinazolinici a fost dezvoltata cu scopul infrangerii rezistentei la
tratamente multiple a bacteriilor. Acesti derivati au fost creati cu rol de inhibitori ai
pompelor de eflux si, impreuna cu antibioticele, sunt eficienti impotriva bacteriilor Gram-
negative (Chevalier 2010).
Grupul de cercetare UMR-MD1 a sugerat efectuarea unui studiu de stabilitate a
compusilor chinazolinici, acestia fiind nou sintetizati. Este important sa se cunoasca
stabilitatea solutiilor lor si este necesar sa se cunoasca cat timp de la preparare isi pastreaza
proprietatile initiale si in ce conditii trebuiesc pastrate acestea pentru a nu-si schimba
caracteristicile.
Din seria de chinazoline, au fost alesi doi compusi reprezentativi, denumiti BG1188
si BG1162. Denumirea IUPAC a BG1188 este 3-[2-(dimetilamino)etil]-6-nitroquinazolin-
4-ona, iar a BG1162 este N,N-dietil-N’-(quinazolin-4-il)etan-1,2-diamina. Formulele
chimice si informatii mai amanuntite despre proprietatile celor doi derivati quinazolinici
sunt prezentate in Capitolul II al tezei.
Studiile de stabilitate au implicat urmarirea stabilitatii in timp a solutiilor
derivatilor chinazolinici in conditii de mediu nevariabile, influenta solventului asupra
solutiilor, influenta temperaturii asupra stabilitatii solutiilor si urmarirea stabilitatii acestora
in conditii de iradiere cu fascicul laser (fotostabilitate).
Solventii utilizati in studiile de stabilitate au fost apa ultra pura, obtinuta printr-un
filtru steril, cu proprietatile descrise in Capitolul III, si dimetil sulfoxidul (DMSO), cu
puritate de peste 99%.
Pentru studiile de stabilitate, domeniul de concentratii folosit pentru solutiile de
BG1188 in apa ultrapura a fost 10-6
M – 2x10-3
M.
Pentru a studia influenta temperaturii asupra stabilitatii solutiilor de BG1188, o
parte dintre probe au fost pastrate la 22°C (temperatura camerei), iar restul la frigider, la
4°C. Solutiile pastrate la 4°C au fost scoase din frigider si lasate 30 de minute pentru a
ajunge la temperatura camerei, inainte de masuratori. Indiferent de temperatura de
depozitare, toate probele au fost pastrate la intuneric.
Concentratia probelor in DMSO a fost 10-3
M, iar probele au fost pastrate la
temperatura camerei (22°C), deoarece DMSO are punctul de inghet egal cu 18,5°C si
probele ar fi inghetat daca ar fi fost pastrate la frigider. Solutiile au fost depozitate la numai
intuneric.
Studiile de stabilitate a solutiilor de BG1162 in apa ultra pura au fost efectuate
pentru concentratii cuprinse intre 10-6
M si 2x10-3
M. Probele au fost pastrate la intuneric, la
97
4°C si la 22°C. Probele pastrate la frigider au fost scoase cu 30 de minute inainte pentru a
ajunge la temperatura camerei.
Concentratia solutiilor studiate de BG1162 in DMSO a fost 10-3
M. Acestea au fost
pastrate la temperatura camerei si au fost protejate de lumina.
Montajul experimental utilizat in studierea derivatilor chinazolinici este prezentat
in Figura 5.1.
Fig. 5.1. Montajul experimental utilizat pentru studierea stabilitatii solutiilor derivatilor
chinazolinici
Pentru studierea stabilitatii in timp a solutiilor derivatilor chinazolinici au fost
inregistrate spectrele de absorbtie in UV-Vis imediat dupa prepararea solutiilor si la
intervale diferite de timp de la preparare. Spectrele de absorbtie in UV-Vis au fost
inregistrate cu spectrofotometrul de absorbtie in UV-Vis-NIR Lambda 950 de la Perkin-
Elmer, descris in Capitolul III.
Cu ajutorul spectroscopiei de absorbtie in UV-Vis au fost studiate si influenta
solventului si a temperaturii asupra solutiilor derivatilor chinazolinici.
Evaluarea stabilitatii solutiilor derivatilor chinazolinici in conditii de iradiere cu
fascicul laser (fotostabilitatea) a fost efectuata dupa inregistrarea spectrelor de absorbtie ale
acestora si pe aceasta baza a fost aleasa lungimea de unda la care se efectueaza iradierea.
Aceasta va fi cat mai apropiata de lungimea de unda la care exista un maxim de absorbtie
al derivatului chinazolinic.
Pentru studiile de fotostabilitate, solutiile au fost iradiate cu un laser pulsat cu
Nd:YAG “Surelite II”, ale carui caracteristici au fost prezentate anterior in Capitolul III.
Deoarece in cazul fenotiazinelor s-a observat o imbunatatire a activitatii
antibacteriene in urma expunerii la radiatie laser, activitatea antibacteriana a derivatului
chinazolinic BG1188 a fost evaluata inainte si dupa iradiere cu fascicul laser.
98
In cadrul studiilor de stabilitate in timp a derivatului chinazolinic BG1188 a fost
observata formarea unor agregate filiforme. Pentru vizualizarea acestora a fost folosit un
microscop optic Imager Z1m, de la Zeiss, cu o camera pentru inregistratea imaginilor axio
Cam MRc 5 (HR); rezolutia camerei poate varia de la 1388x1040 la 4164x3120 pixeli.
Microscopul poate lucra in transmisie, reflexie sau fluorescenta.
Pentru obtinerea unor informatii mai detaliate, imagini au mai fost inregistrate cu
un microscop electronic cu scanare (SEM) Evo 50 XVP Zeiss si un microscop de forta
atomica (AFM) Park Systems XE-100.
Pentru a intelege provenienta agregatelor si mecanismul lor de formare au fost
inregistrate spectre FTIR ale agregatelor cu un spectrometru FTIR cu sistem de imagistica
Spotlight 400 FTIR imaging system, de la Perkin Elmer. Spectrele au fost inregistrate in
domeniul 4000 – 400 cm-1
cu o rezolutie de 4 cm-1
. Rezolutia camerei este de 10 μm.
5.2. Stabilitatea in timp a solutiilor derivatilor chinazolinici
Studiul stabilitatii in timp a solutiilor derivatilor chinazolinici a constat in
inregistrarea spectrelor de absorbtie in UV-Vis imediat dupa preparare si la diferite
intervale de timp pentru a urmari eventualele modificari din spectre.
In Figura 5.2 sunt prezentate spectrele de absorbtie in UV-Vis ale solutiilor de
BG1188 10-3
M in apa ultra pura, inregistrate in primele 24 de ore de la preparare.
Fig. 5.2. Evolutia in timp a solutiilor de BG1188 10
-3M in apa ultra pura, in primele 24 de
ore dupa preparare.
Solutiile au fost pastrate la intuneric, la temperatura camerei, in primele 24 de ore
dupa preparare, iar spectrele lor de absorbtie au fost inregistrate la fiecare ora.
99
In Figura 5.2 se poate observa ca solutiile de BG1188 10-3
M in apa ultra pura
prezinta trei benzi de absorbtie, cu maxime la 207 nm, 224 nm si 314 nm.
Benzile de absorbtie cu maximele la 224 nm si 314 nm sunt caracteristice
derivatilor chinazolinici (Aaron 1991), iar banda cu maximul la 207 nm, ce apare ca un
umar se poate datora influentei absorbtiei oxigenului atmosferic. Aceasta banda sub forma
de umar prezinta si cele mai multe variatii pe durata experimentelor.
Banda de absorbtie cu maximul la 224 nm se caracterizeaza printr-un coeficient
molar de extinctie mare si poate fi atribuit unei tranzitii π – π* (1B), originand in benzen.
Banda cu maximul la 314 nm se datoreaza unor tranzitii π – π* (1La si
1Lb) si este
caracterizata de o extinctie mai mica a maximului. Largimea benzii este posibil sa se
datoreze suprapunerii benzii datorate tranzitiei π – π* cu o banda ce poate fi atribuita unei
tranzitii n – π* (Aaron 1991).
Spectrele sunt stabile in primele 24 ore, ramanand in limita erorilor experimentale,
care sunt in total ±1,045, provenind de la eroarea intrinseca a spectrofotometrului
(±0,004%) si de la eroarea introdusa de pozitionarea celulelor de 1 mm in compartimentul
probei si respectiv al celulei de referinta (±1,041%). Aceasta ultima eroare a fost calculata
in functie de variatia extinctiei maximului de la 314 nm pentru pozitionari diferite ale
celulelor de 1 mm in 20 de masuratori consecutive. Valoarea de 1,041% reprezinta
diferenta dintre cea mai mare si cea mai mica valoare a extinctiei maximului de la 314 nm,
fiind data in procente din cea mai mare valoarea a extinctiei maximului (Militaru 2011 a).
Fig. 5.3. Evolutia in timp a solutiilor de BG1188 10
-3M in apa ultra pura
Evolutia in timp a spectrelor de absorbtie a probei de BG1188 10-3
M in apa
ultrapura pastrata, in acest caz, la intuneric, la 4oC, pentru un interval de timp mai lung
100
(2856 ore – 119 zile), este prezentata in Figura 5.3.
Inainte de fiecare masuratoare, probele au fost scoase de la frigider si pastrate la
temperatura camerei, la intuneric, timp de 30 de minute.
In acest caz, stabilitatea probei a fost foarte mare. Luand in considerare eroarea
totala de ±1.045%, spectrele pot fi impartite in doua grupuri: primul incluzand spectrele de
absorbtie pana la 1032 ore, iar al doilea grup cuprinde spectrele intre 1056 de ore (44 zile)
si 2856 de ore (119 zile – aproximativ 4 luni). Aceasta grupare a spectrelor poate fi
observata in Figura 5.3, unde zona maximului de la 314 nm este marita si barele de eroare
sunt prezentate pentru unele spectre, astfel incat figura sa ramana descifrabila.
In concluzie, proba ramane stabila in primele 43 de zile de la preparare si sufera o
usoara modificare a spectrelor de absorbtie ce depaseste limitele erorilor de masura dupa
44 de zile, insa forma spectrelor ramane aceeasi.
In Figura 5.4.a sunt prezentate spectrele de absorbtie ale solutiilor de BG1188 in
DMSO, inregistrate la diferite perioade de timp dupa preparare.
Fig. 5.4. Evolutia in timp a solutiilor de BG1188 10
-3M in DMSO. a) Spectrele de
absorbtie la diferiti timpi dupa prepararea solutiei; b) cinetica maximului de absorbtie la
324 nm
Masuratorile de stabilitate ale solutiilor de BG1188 in DMSO prezinta rezultate
diferite fata de solutiile in apa ultrapura. In Figura 5.4 este prezentata evolutia spectrelor de
absorbtie a solutiei de BG1188 10-3
M in DMSO, pastrata in intuneric, la temperatura
camerei (22°C).
Forma spectrului acestei solutii nu poate fi observata sub 250 nm, din cauza
absorbtiei puternice a solventului, ceea ce provoaca o saturare a semnalului
spectrofotometrului la lungimi de unda mai mici de 250 nm.
Maximul de absorbtie care aparea la 314 nm in cazul solutiilor de BG1188 10-3
M in
apa ultra pura, in DMSO apare la 324 nm, datorita diferentei de polaritate a celor doi
solventi.
Banda de absorbtie cu maximul la 324 nm se datoreaza suprapunerii unei benzi
datorate tranzitiilor π – π* (1La si
1Lb) cu o banda ce poate fi atribuita unei tranzitii n – π*
(Aaron 1991).
101
In Figura 5.4.a se poate observa ca solutiile de BG1188 10-3
M in DMSO nu sunt
stabile, forma spectrelor de absorbtie ale acestora modificandu-se inca din primele minute
dupa prepararea solutiilor.
Evolutia in timp a coeficientului molar de extinctie este data in Figura 5.4.b. La
lungimea de unda de 324 nm, cinetica coeficientului molar de extinctie este foarte bine
descrisa de o functie polinomiala de gradul al III-lea, avand la inceput o crestere mai
brusca, ceea ce indica o modificare rapida a moleculelor de BG1188 la interactia cu
solventul in primele 30 de minute. Desi s-a urmarit ca inregistrarea spectrelor de absorbtie
sa fie facuta dupa dizolvarea totala a BG1188 in solvent, este posibil ca acest sa dureze mai
mult decat poate fi observat cu ochiul liber si in primele 30 de minute sa aiba loc reactii
chimice prin care moleculele de BG1188 sa se lege de moleculele de DMSO.
Maximul de la 324 nm sufera o deplasare hipsocromica la 318 nm dupa 1 ora si 45
de minute de la prepararea solutiei de BG1188 10-3
M in DMSO si in acelasi timp un umar
al benzii de absorbtie apare in jur de 330 nm. Acest lucru indica modificarea moleculelor
de BG1188 in DMSO, avand ca rezultat separarea mai buna a benzilor de absorbtie ce isi
au originea in tranzitiile π – π* (1La si
1Lb) de banda de absorbtie ce poate fi atribuita
tranzitiei n – π*.
O suprapunere de benzi de absorbtie se poate observa si sub 280 nm, cu maxime la
263 nm si 275 nm. La fel ca in cazul maximelor in jur de 324 nm, extinctia creste in timp si
in cazul benzilor de absorbtie cu maxime la 263 nm si 275 nm. Aceste benzi de absorbtie
pot fi atribuite unor tranzitii π – π*.
Un alt derivat chinazolinic a carui stabilitate a fost studiata este BG1162.
In Figura 5.5 sunt prezentate spectrele de absorbtie in UV ale solutiei derivatului
chinazolinic BG1162 10-3
M in apa ultra pura, inregistrate la diferiti timpi dupa prepararea
solutiei. Solutiile au fost pastrate la intuneric, la 4oC.
Se poate observa ca solutiile de BG1162 10-3
M in apa ultra pura sunt instabile dupa
primele 24 de ore de la preparare, spectrele depasind limitele de eroare, ce au fost calculate
la fel ca in cazul solutiilor de BG1188.
Spectrele solutiilor de BG1162 10-3
M in apa ultra pura prezinta mai multe benzi de
absorbtie suprapuse in regiunea 200 – 250 nm, cu maxime la 205 nm, 216 nm si 234 nm.
Aceste benzi suprapuse se pot datora unor tranzitii π – π* ale moleculor.
In regiunea 260 – 340 nm a spectrelor de absorbtie, solutiile de BG1162 10-3
M in
apa ultra pura prezinta mai multe benzi de absorbtie suprapuse, cu maxime la 287 nm, 301
nm, 313 nm si 325 nm. Acestea se datoreaza, cel mai probabil, tranzitiilor π – π* si unor
tranzitii n – π*.
Comportamentul solutiilor de BG1162 in apa ultra pura este opus celui solutiilor de
BG1188 in apa ultrapura, acestea din urma fiind stabile o perioada indelungata.
102
Fig. 5.5. Evolutia in timp a solutiilor de BG1162 10
-3M in apa ultra pura
Pe de alta parte, in timp de solutiile de BG1188 in DMSO sunt instabile, solutiile
de BG1162 in DMSO se comporta total diferit fata de acestea.
In Figura 5.6 sunt prezentate spectrele de absorbtie ale solutiilor de BG1162 la
concentratia 2x10-3
M in DMSO.
Fig. 5.6. Evolutia in timp a solutiilor de BG1162 2x10
-3M in DMSO
103
Solutiile de BG1162 2x10-3
M in DMSO au fost pastrate la intuneric, la 22oC, iar
spectrele lor de absorbtie au fost inregistrate periodic, pana la 144 de ore (6 zile) de la
preparare.
Ca si in cazul anterior, din cauza absorbtiei puternice a DMSO, forma spectrelor nu
poate fi analizata decat la lungimi de unde mai mari de 250 nm. Se poate observa ca
spectrele prezinta mai multe benzi de absorbtie suprapuse in regiunea 260 – 350 nm, cu
maxime la 296 nm, 305 nm, 319 nm si 330 nm. Aceste benzi de absorbtie suprapuse se
datoreaza, cel mai probabil, tranzitiilor π – π* si unor tranzitii n – π*.
Din Figura 5.6 se poate observa ca solutiile de BG1162 la 2x10-3
M in DMSO
raman stabile cel putin 144 ore, cat timp stabilitatea lor a fost urmarita, spre deosebire de
solutiile de BG1162 in apa ultra pura, care sunt instabile.
5.2.1. Formarea agregatelor filiforme in solutiile de BG1188
In timpul studiilor de stabilitate in timp a solutiilor de BG1188 s-a observat
formarea unor agregate filiforme. Aceste agregate au fost observate initial cu ochiul liber
in toate solutiile de BG1188, indiferent de solventul sau de concentratia solutiei si
indiferent de conditiile de depozitare.
Pentru o vizualizare mai buna a acestor agregate, au fost inregistrate imagini ale
acestora cu ajutorul unui microscop optic Imager Z1m Zeiss, in transmisie, reflexie sau
fluorescenta.
Fig. 5.7. Imagini de microscopie optica ale agregatelor obtinute in solutiile de BG1188
104
In Figura 5.7.a este prezentata imaginea unui cluster format din agregatele filiforme
intr-o solutie de BG1188 5x10-4
M in apa ultra pura. Imaginea a fost obtinuta prin
microscopie optica in transmisie la marirea 10X.
In Figura 5.7.b se pot observa agregatele filiforme din solutia de BG1188 5x10-4
M
in apa ultra pura, imaginea fiind inregistrata prin microscopie de epifluorescenta, cu o
marire 100X.
Inregistrata in aceleasi conditii ca in prima imagine, dar de data aceasta cu o marire
de 50X, in Figura 5.7.c se pot observa mai in detaliu firele formate in solutie.
Agregatele in forma de fire, formate in solutia de BG1188 10-3
M in apa ultra pura
pot fi observate in Figura 5.7.d. Imaginea lor a fost inregistrata prin microscopie optica in
reflexie, la o marire de 50X.
Din aceste imagini se poate observa ca agregatele sunt de doua feluri. Primele par a
fi fire lungi, deschise la culoare, cu o latime aproximativ constanta pe toata lungimea
firului. Printre cele mai mari fire masurate au fost cele cu lungimile de 2,5 – 3 mm, si cu
latimea de 20 – 30 μm.
Al doilea tip de fire par sa fie formate dintr-o insiruire de sfere inchise la culoare,
cu diametre de 2 – 3 μm. Acestea din urma sunt cele care prezinta si fluorescenta in
albastru.
Pentru obtinerea mai multor informatii legate de aspectul agregatelor, au fost
inregistrate imagini cu un microscop electronic cu scanare (SEM) Evo 50 XVP Zeiss.
Fig. 5.8. Imagini SEM ale aceleiasi probe de agregate obtinute in solutiile de BG1188, la
diferite mariri
105
In Figura 5.8 sunt prezentate imagini, la diferite mariri, ale agregatelor filiforme
obtinute in solutii de BG1188 5x10-4
M in apa ultra pura, inregistrate cu un microscop
electronic cu scanare. Aceste imagini confirma faptul ca firele formate in solutiile de
BG1188 se inscriu in cele doua tipuri.
In Figura 5.8.a se observa prezenta unui fir lung, ce face parte din primul tip de
fire, iar restul firelor, mai mici si mai subtiri au portiuni ce par formate din sfere. Mai mult,
sferele par a fi compuse din formatiuni mai mici, de ordinul sutelor de nm, dupa cum se
poate vedea in Figura 5.8.d.
In Figura 5.9 sunt prezentate imagini ale unor portiuni din agregatele filiforme
ingregistrare cu un microscop de forta atomica (AFM). Firele s-au format in solutii de
BG1188 5x10-4
M in apa ultra pura.
Imaginile AFM pun in evidenta profilul tridimensional al agregatelor.
Fig. 5.9. Imagini de microscopie de forta atomica (AFM) ale agregatelor obtinute in
solutiile de BG1188
Profilul tridimensional al celor doua fire din Figura 5.9 confirma ca acestea sunt
structurate din sfere cu un diametru de aproximativ 4 μm.
Intrebarile principale legate de agregatele filiforme sunt ce sunt ele de fapt si care
este mecanismul de formare a lor.
Examinarea prin difractie de raze X a agregatelor filiforme a confirmat ca acestea
nu au o structura cristalina.
106
O urmatoare ipoteza a fost ca aceste agregate ar putea fi polimeri ai moleculelor de
BG1188 si pentru aceasta a fost calculat gradul de polimerizare al BG1188 pentru
intervalul de concentratii 10-6
M – 2x10-3
M, luand in considerare maximul de absorbtie de
la 314 nm.
Pentru determinarea spectrofotometrica a gradului de polimerizare este necesar sa
se cunoasca extinctia maximului considerat pentru fiecare concentratie in parte. La
concentratii foarte mari este posibil ca legea Lambert – Beer sa nu se mai aplice si extinctia
sa nu mai depinda liniar de concentratie, in special in cazul in care se formeaza polimeri.
Folosind metoda descrisa in (Tugulea 2003), gradul de polimerizare al BG1188 se
calculeaza din panta graficului lg(C-Cm) in functie de lg Cm, unde C reprezinta
concentratia probei si Cm este concentratia la care sunt prezenti in solutie numai
monomeri.
In Figura 5.10 sunt prezentate graficele determinate pentru solutiile de BG1188 pe
domeniul de concentratii 10-6
M – 2x10-3
M. Doua curbe de polimerizare sunt prezentate,
prima pentru un set de probe masurate imediat dupa preparare, iar in acest caz gradul de
polimerizare calculat este 1,018. A doua curba este trasata pentru un set de probe pastrate
la intuneric, la temperatura camerei (22oC) si masurate la o luna dupa preparare; gradul de
polimerizare obtinut in acest caz este de 1,023.
Al doilea set de date a fost inregistrat dupa 30 de zile, pentru a vedea daca procesul
de polimerizare in acest caz nu este dependent de timp, nu doar de concentratie, data fiind
aparitia agregatelor filiforme.
Fig. 5.10. Curbele de polimerizare pentru un set de date masurate imediat dupa preparare
() si pentru un alt set de probe pastrate la intuneric si masurate la o luna
dupa preparare ()
107
Tinand cont de valorile obtinute pentru gradul de polimerizare, atat imediat dupa
prepararea solutiilor, cat si la 30 de zile dupa aceasta, putem sa concluzionam ca pentru tot
domeniul de concentratii, pe toata durata experimentelor, in solutiile de BG1188 in apa
ultra pura nu au fost prezenti decat monomeri.
Aceste rezultate infirma ipoteza initiala, conform careia agregatele filiforme ar
putea fi polimeri.
Pentru a afla structura agregatelor filiforme au fost inregistrate spectrele FTIR ale
firelor si comparate cu spectrul FTIR al pulberii de BG1188.
In Figura 5.11 sunt prezentate spectrele FTIR ale agregatelor filiforme si ale
pulberii de BG1188, iar in imaginea alaturata spectrelor este evidentiat locul (marcat cu
chenar rosu) din clusterul de fire unde a fost inregistrat spectrul agregatelor. Imaginea
clusterului de agregate si spectrele FTIR au fost inregistrate cu sistemul de imagistica
Spotlight 400 FTIR.
Fig. 5.11. Spectrele FTIR ale agregatelor filiforme si a pulberii de BG1188
Spectrul FTIR al pulberii de BG1188 prezinta benzi caracteristice quinazolinelor
(NIST webbook).
Banda cu maximul la 3070 cm-1
se poate datora unei vibratii de intindere C-H din
inelul aromatic.
In regiunea 3000 cm-1
– 2800 cm-1
exista o suprapunere de benzi ce se pot datora
unor intinderi CH in gruparea N-CH3 si unor vibratii de intindere CH in inelul
chinazolinic.
Benzile ce apar intre 1700 cm-1
si 1800 cm-1
pot fi rezultatul vibratiilor de intindere
a legaturilor C=O.
Vibratiile de intindere a legaturii neconjugate C=C pot da nastere benzii cu
108
maximul la 1654 cm-1
, iar vibratiile de intindere asimetrica a legaturilor N–O sunt
responsabile de aparitia benzii de la 1556 cm-1
.
Benzile de la 1506 cm-1
si 1418 cm-1
apar ca rezultat al vibratiilor de intindere a
legaturii C–C din inelul aromatic.
Intinderea simetrica a legaturii N–O poate fi responsabila de aparitia benzii de la
1306 cm-1
, iar vibratiile de intindere a legaturii C–N din radicalul alifatic atasat
chinazolinei dau nastere benzilor din regiunea 1250 cm-1
– 1020 cm-1
.
Benzile suprapuse ce apar in intervalul 900 cm-1
– 675 cm-1
se datoreaza unor
vibratii de inconvoiere in afara planului “oop” a legaturilor C–H, inconvoierii in afara
planului “oop” a legaturilor C–C din inelul aromatic si vibratiilor wagging ale legaturilor
N–H.
In comparatie cu spectrul FTIR ale BG1188, spectrul agregatelor prezinta
modificari importante in zona benzii datorate intinderii legaturii carbonil. De asemenea,
sunt afectate benzile din regiunea 2200 cm-1
– 2500 cm-1
(Militaru 2011 b).
Asemanarile dintre cele doua spectre indica posibilitatea ca agregatele filiforme sa
isi aiba originea moleculele de BG1188, insa mecanismul de formare inca nu este
cunoscut.
Continuand cu ipoteza ca agregatele filiforme sunt formate din fragmente de
BG1188, atunci lipsa acestor molecule de BG1188 trebuie sa se regaseasca in spectrele de
absorbtie in UV-Vis.
Considerand spectrele din Figura 5.3, descresterea totala in timp a extinctiei indica
posibila descrestere a numarului de molecule de BG1188 din solutie. Daca se ia in
considerare maximul de la 314nm, pentru concentratia de 10-3
M a unei solutii cu volumul
de 400 μL, numarul de molecule din solutie imediat dupa preparare (0 ore) este
2.408854x1017
molecule, iar la 2856 ore numarul de molecule din solutie este de
2.330617x017
molecule. Aceasta arata ca dupa 4 luni 3% (7.823683x1015
) din moleculele
de BG1188 din solutie dispar si este posibil ca fragmente din acestea sa participe la
formarea agregatelor filiforme.
Mecanismul de formare al agregatelor filiforme ramane inca necunoscut, ipotezele
testate pana acum dovedindu-se incomplete sau neaplicabile. Cercetarile de acest tip
deschid insa perspective noi pentru producerea de formatiuni nanometrice din solutii.
5.3. Influenta solventului asupra solutiilor de BG1188
Solventul este un factor important in studiul stabilitatii solutiilor de medicamente.
Moleculele de medicamente interactioneaza in mod unic cu solventi diferiti. Dupa cum s-a
arat in subcapitolul 5.2, derivatii chinazolinici au un comportament diferit in timp in
functie de solventul utilizat.
Solutiile de BG1188 in apa ultra pura sunt foarte stabile, insa in DMSO se modifica
incepand cu primele minute de la preparare. Comportamentul solutiilor de BG1162 este
total opus: solutiile in apa ultra pura sunt instabile, iar cele in DMSO raman stabile pe toata
durata experimentelor.
Forma spectrelor de absorbtie este influentata de solventul in care este dizolvat
medicamentul.
109
In Figura 5.12 sunt prezentate spectrele solutiilor de BG1188 in apa ultra pura si in
DMSO.
Spectrul de absorbtie al solutiei de BG1188 10-3
M in apa ultra pura prezinta trei
benzi de absorbtie, cu maxime la 207 nm, 224 nm si 314 nm. Spectrul de absorbtie al
solutiei de BG1188 10-3
M in DMSO nu poate fi analizat sub 250 nm din cauza absorbtiei
puternice a DMSO, insa are o banda de absorbtie la cu maximul la 324 nm.
Fig. 5.12. Influenta solventului asupra spectrelor de absorbtie a solutiilor de BG1188
In cazul maximului de la 314 nm apare o deplasare batocromica si in spectrul
solutiei de BG1188 10-3
M in DMSO, aceasta banda de absorbtie are maximul la 324 nm,
deoarece intre cei doi solventi exista o diferenta de polaritate. Desi ambii sunt solventi
polari, constanta dielectrica a apei este 80, mai mare decat a DMSO (47,2) (Sigma-Aldrich
2013).
Aceasta banda de absorbtie cu maximul la 314 / 324 nm se datoreaza suprapunerii
unei benzi datorate tranzitiei π – π* cu o banda ce poate fi atribuita unei tranzitii n – π*.
5.4. Influenta temperaturii asupra stabilitatii solutiilor de BG1188
Unul dintre factorii importanti in studiul stabilitatii unui medicament este
temperatura de depozitare.
Pentru majoritatea medicamentelor aprobate, printre instructiunile de utilizare, sunt
indicate si conditiile de pastrare, la frigider (4oC) sau la temperatura camerei.
Pentru testele de stabilitate am ales doua temperaturi de depozitare uzuale: 4oC si
22oC (temperatura camerei). Aceste temperaturi au fost alese luand in considerare
viitoarele posibile aplicatii medicale ale derivatilor chinazolinici.
110
In Figura 5.13 sunt prezentate spectrele de absorbtie a solutiilor de BG1188 10-3
M
in apa ultra pura, pastrate la intuneric, la doua temperaturi uzuale in aplicatiile medicale,
4oC si 22
oC (temperatura camerei).
Solutiile depozitate la 4oC au fost extrase de la frigider si lasate 30 de minute
pentru a ajunge la temperatura camerei inainte de inregistrarea spectrelor de absorbtie in
UV-Vis.
Influenta temperaturii asupra stabilitatii solutiilor de BG1188 10-3
M in apa ultra
pura a fost studiata intr-un interval de 672 de ore (28 de zile) de la prepararea probelor.
Fig. 5.13. Influenta temperaturii de depozitare asupra stabilitatii solutiilor de BG1188
In Figura 5.13 se poate observa ca diferentele dintre spectrele de absorbtie raman in
limitele de eroare, indicand ca cele doua temperaturi de depozitare nu afecteaza stabilitatea
solutiilor de BG1188 (Militaru 2011 a).
5.5. Stabilitatea solutiilor de BG1188 in conditii de iradiere cu fascicul laser
Studiile de fotostabilitate sunt o parte necesara in cazul aprobarii unui medicament
pentru aplicatii medicale. Normele studiilor de fotostabilitate a medicamentelor, in diferite
conditii de iluminare, sunt descrise in (ICH Q1B, 1996).
Fotostabilitatea solutiilor derivatului chinazolinic BG1188 a fost testata in conditii
de iradiere cu fascicul laser.
In Figura 5.14.a sunt prezentate spectrele de absorbtie ale solutiilor de BG1188
10-3
M in apa ultra pura inregistrate inainte de expunerea la radiatie laser si la diferiti timpi
de iradiere.
111
Conditiile de iradiere a solutiilor de BG1188 10-3
M in apa ultra pura au fost:
lungimea de unda a fost 355 nm, energia medie a fasciculului laser a fost egala cu 30 mJ,
volumul probei a fost 2 mL, iar lungimea drumului optic 10 mm. Timpul maxim de
iradiere a fost 5 minute.
Se poate observa ca expunerea la radiatie laser modifica structura moleculei de
BG1188, ducand la formarea de noi specii.
Forma spectrelor de absorbtie se modifica in timpul iradierii, extinctia celor 3
maxime de absorbtie scazand exponential pana la sfarsitul celor 5 minute de iradiere.
Fig. 5.14. Stabilitatea solutiilor de BG1188 10
-3M in apa ultra pura in conditii de iradiere
cu fascicul laser: a) Spectrele de absorbtie in UV-Vis; b) cinetica coeficientului molar de
extinctie la 351 nm si 499 nm, in timpul iradierii.
Scaderea exponentiala a maximului de la 224 nm (Figura 5.14.b), datorat unei
tranzitii π – π* (1B), cu originea in inelul benzenic (Aaron 1991), arata ce expunerea la
radiatie laser afecteaza si radicalul chinazolinic din moleculele de BG1188.
De asemenea, se modifica si banda de absorbtie cu maximul la 314 nm, ce se
datoreaza unor tranzitii π – π* si unei tranzitii n – π* (Aaron 1991). Coeficientul molar de
extinctie la 314 nm descreste exponential pe durata iradierii (Figura 5.14.b).
In Figura 5.14.a se poate observa existenta a trei puncte isosbestice in spectrele
solutiilor de BG1188 10-3
M in apa ultra pura neiradiate si la diferiti timpi de iradiere.
Cele trei puncte isosbestice se gasesc in spectre la 248 nm, 286 nm si 354 nm si au
coeficientii molari de extinctie 6991,64 L mol-1
cm-1
, 4606,41 L mol-1
cm-1
, respectiv
2182,68 L mol-1
cm-1
.
Prezenta unui punct isosbestic indica faptul ca, in timpul iradierii, are loc o reactie
fotochimica intre doua specii moleculare, care au aceiasi coeficienti molari de extinctie la
lungimea de unda la care apare punctul isosbestic.
Tinand cont ca probabilitatea ca doua specii moleculare sa aiba aceleasi valori ale
coeficientului molar de absorbtie in trei puncte diferite este mica, prezenta a trei puncte
isosbestice indica faptul ca, in timpul iradierii, exista cel putin 6 compusi diferiti in solutie
(cate doi pentru fiecare punct isosbestic).
112
De asemenea, prezenta unui punct isosbestic indica faptul ca stoichiometria reactiei
ramane neschimbata pe durata iradierii (Goldbook 2012, Parson 2007, Smarandache 2012
c).
5.6. Activitatea antibacteriana a derivatului chinazolinic BG1188
Activitatea antibacteriana a solutiilor de BG1188 in apa ultra pura neiradiate si
iradiate a fost si ea studiata in cadrul unor stagii de mobilitate la Centre for Food Safety,
University College Dublin, din Irlanda.
Aceste studii au fost incurajate de rezultatele obtinute in cazul fenotiazinelor. In
Capitolul III al tezei sunt prezentate teste ce demonstreaza ca expunerea la radiatie laser a
fenotiazinelor imbunatateste activitatea antibacteriana a acestora. De aceea, s-a hotarat
efectuarea unor teste de susceptibilitate a bacteriilor la BG1188, desi acest derivat
chinazolinic a fost creat ca inhibitor al pompelor de eflux ale bacteriilor.
Activitatea BG1188 si a BG1188 iradiat a fost testata impotriva unor tulpini de
bacterii Gram-pozitive (Staphylococcus aureus) si ale unora Gram-negative (Salmonella
enterica serovar Typhimurium DT104).
Testele de susceptibilitate au constat in determinarea concentratiei minime
inhibitorii (MIC) si a concentratiei minime bactericide (MBC), protocolul acestor teste
fiind descris in Capitolul III.
Concetratia minima bactericida (MIC) este definita ca valoarea minima a
concentratiei de compus antimicrobian pentru care nu se mai observa cresterea bacteriei,
iar concentratia minima bactericida este concentratia cea mai mica de compus pentru care
nu se observa nicio unitate care formeaza colonii (CFU – colony forming units).
Tabel 5.1. Valorile MIC si MBC pentru tulpinile de Salmonella enterica serovar
Typhimurium DT104
MIC (μg/ml) MBC (μg/ml)
Tulpini BG1188 BG1188 iradiat BG1188 BG1188 iradiat
13348 >200 >200 >200 >200
3798 >200 >200 >200 >200
A43 >200 >200 >200 >200
1481 >200 >200 >200 >200
100326 >200 >200 >200 >200
100533 >200 >200 >200 >200
100688 >200 >200 >200 >200
In Tabelul 5.1 se gasesc valorile concentratiilor minime inhibitorii si concentratiilor
minime bactericide ale derivatului chinazolinic BG1188 pentru tulpinile de Salmonella
enterica serovar Typhimurium DT104.
113
Atat pentru tulpina de referinta Salmonella enterica serovar Typhimurium DT104
13348, cat si pentru celelalte tulpini izolate clinic, valorile MIC si MBC au fost mai mari
de 200 μg/ml. Concentratia maxima testata a fost 200 μg/ml.
Aceste valori ale MIC si MBC sunt prea mari pentru a putea considera ca BG1188
sau BG1188 iradiat au activitate antibacteriana individuala impotriva tulpinilor de
Salmonella enterica serovar Typhimurium DT104.
In Tabelul 5.2 sunt prezentate valorile concentratiilor minime inhibitorii si
concentratiilor minime bactericide ale BG1188 pentru tulpinile de referinta si izolate clinic
de Staphylococcus aureus.
Tabel 5.2. Valorile MIC si MBC pentru tulpinile de Staphylococcus aureus
MIC (μg/ml) MBC (μg/ml)
Tulpini BG1188 BG1188 iradiat BG1188 BG1188 iradiat
MSSA 8325/A >200 >200 >200 >200
MRSA ATCC 43300 >200 >200 >200 >200
MRSA 002/03 >200 >200 >200 >200
MRSA 006/04 >200 >200 >200 >200
MRSA 003/05 >200 >200 >200 >200
MRSA 010/05 >200 >200 >200 >200
MRSA 016/05 >200 >200 >200 >200
Rezultatele obtinute au fost mai mari decat concentratia maxima de BG1188
aplicata (200 μg/ml), atat pentru tulpinile de referinta MSSA 8325/A si MRSA ATCC
43300, cat si pentru restul tulpinilor izolate clinic.
La fel ca in cazul tulpinilor de Salmonella enterica serovar Typhimurium DT104,
ceste valori ale MIC si MBC sunt prea mari pentru a putea considera ca BG1188 sau
BG1188 iradiat au activitate antibacteriana individuala impotriva tulpinilor de
Staphylococcus aureus.
Totusi, derivatul chinazolinic BG1188 are rol de inhibitor al pompelor de eflux si a
imbunatatit activitatea cloramfenicolului impotriva mai multor tulpini de bacterii Gram-
negative (Chevalier 2010).
5.7. Concluzii
Studiile de stabilitate ale derivatilor chinazolinici BG1188 si BG1162 au fost cerute
in cadrul unei colaborari cu grupul de cercetare UMR-MD1, in cadrul retelei COST
BM0701 ATENS – Transportul si efluxul antibioticelor: noi strategii de combatere a
rezistentei bacteriene, deoarece acestia fiind noi sintetizati, este important sa se cunoasca
stabilitatea solutiilor lor, cat timp de la preparare isi pastreaza proprietatile de interes si in
ce conditii trebuiesc pastrate acestea pentru a nu-si schimba caracteristicile.
Studiile de stabilitate in timp a solutiilor derivatilor chinazolinici au aratat ca
solutiile de BG1188 in apa ultra pura sunt stabile perioade indelungate de timp (2856 ore),
114
insa solutiile de BG1188 in DMSO sunt foarte instabile, forma spectrelor de absorbtie
modificandu-se din primele minute dupa prepararea solutiilor.
Derivatul chinazolinic BG1162 are un comportament total opus fata de BG188.
Solutiile de BG1162 in apa ultra pura sunt instabile, in timp ce spectrele solutiilor de
BG1162 in DMSO raman in limitele de eroare, demonstrand ca aceste solutii sunt stabile
pentru cel putin 144 de ore de la preparare lor.
Spectrele solutiilor de BG1188 in apa ultra pura prezinta trei benzi de absorbtie, cu
maxime la 207 nm, 224 nm si 314 nm.
Banda de absorbtie cu maximul la 224 nm se poate datora unei tranzitii π – π* (1B),
originand in benzen, iar banda cu maximul la 314 nm se datoreaza unor tranzitii π – π*
(1La si
1Lb). Largimea benzii indica faptul ca exista o suprapunere de benzii datorate
tranzitiei π – π* cu o banda ce poate fi atribuita unei tranzitii n – π*.
In cazul solutiilor de BG1188 in DMSO, maximul de la 314 nm sufera o deplasare
la 324 nm datorita polaritatii solventului.
Din cauza instabilitatii in timp a solutiilor de BG1188 in DMSO, maximul de la
324 nm sufera o deplasare hipsocromica la 318 nm dupa 1 ora si 45 de minute de la
prepararea solutiei si in acelasi timp un umar al benzii de absorbtie apare in jur de 330 nm.
Acest lucru indica modificarea moleculelor de BG1188 in DMSO, avand ca rezultat
separarea mai buna a benzilor de absorbtie ce isi au originea in tranzitiile π – π* de banda
de absorbtie ce poate fi atribuita tranzitiei n – π*.
Spectrele solutiilor de BG1162 in apa ultra pura prezinta mai multe benzi de
absorbtie suprapuse in regiunea 200 – 250 nm, ce se pot datora unor tranzitii π – π* ale
moleculelor, iar in regiunea 260 – 340 nm prezinta mai multe benzi de absorbtie suprapuse,
cu maxime la 287 nm, 301 nm, 313 nm si 325 nm. Aceste benzi suprapuse se datoreaza,
cel mai probabil, tranzitiilor π – π* si unor tranzitii n – π*.
In timpul studiilor de stabilitate a solutiilor de BG1188 se observa aparitia unor
agregate filiforme. Imaginile obtinute cu un microscop optic, un microscop electronic de
scanare si un microscop de forta atomica, au aratat ca exista doua tipuri de agregate: primul
tip, fire lungi, deschise la culoare, cu o latime aproximativ constanta pe toata lungimea
firului, iar al doilea tip de fire par sa fie formate dintr-o insiruire de sfere inchise la culoare,
cu diametre de 2 – 3 μm. Acestea din urma sunt cele care prezinta si fluorescenta in
albastru.
Calcularea gradului de polimerizare a aratat ca aceste agregate nu sunt polimeri, iar
studiile de difractie de raze X au aratat ca nu sunt cristale.
Mecanismul de formare al agregatelor nu este cunoscut inca, insa tinand cont de
similaritatile din spectrele FTIR apare ca acestea sunt formate din fragmente de molecule
de BG1188.
Influenta temperaturii asupra stabilitatii solutiilor de BG1188 in apa ultra pura a
fost studiata timp de 672 de ore de la prepararea probelor. Pentru studii au fost alese doua
temperaturi de depozitare, uzuale in aplicatiile medicale, 4oC si 22
oC (temperatura
camerei). Diferentele dintre spectrele de absorbtie au ramas in limitele de eroare, indicand
ca cele doua temperaturi de depozitare nu afecteaza stabilitatea solutiilor de BG1188.
115
Fotostabilitatea solutiilor de BG1188 in apa ultra pura a fost studiata in conditii de
iradiere cu fascicul laser. Forma spectrelor de absorbtie a solutiilor de BG1188 se modifica
in timpul iradierii, indicand modificarea moleculelor si aparitia a noi specii moleculare.
Scaderea exponentiala a maximului de la 224 nm, datorat unei tranzitii π – π* (1B),
cu originea in inelul benzenic, arata ca iradierea modifica si radicalul chinazolinic din
moleculele de BG1188. De asemenea, se modifica si banda de absorbtie cu maximul la 314
nm, ce se datoreaza unor tranzitii π – π* si unei tranzitii n – π*.
In spectrele inregistrate in timpul iradierii apar trei puncte isosbestice la 248 nm,
286 nm si 354 nm.
Prezenta unui punct isosbestic indica faptul ca, in timpul iradierii, are loc o reactie
fotochimica intre doua specii moleculare, care au aceiasi coeficienti molari de extinctie la
lungimea de unda la care apare punctul isosbestic.
Tinand cont ca probabilitatea ca doua specii moleculare sa aiba aceleasi valori ale
coeficientului molar de absorbtie in trei puncte diferite este mica, prezenta a trei puncte
isosbestice indica faptul ca, in timpul iradierii, exista cel putin 6 compusi diferiti in solutie
(cate doi pentru fiecare punct isosbestic).
In cadrul acestor studii, a fost testata si activitatea solutiilor de BG1188 in apa ultra
pura neiradiate si iradiate impotriva tulpinilor de Staphylococcus aureus si de Salmonella
enterica serovar Typhimurium DT104.
Pentru toate tulpinile de bacterii testate, valorile MIC si MBC ale BG1188 si
BG1188 iradiat demonstreaza ca acesti compusi nu prezinta activitate antibacteriana de
sine statatoare. Testele anterioare demonstreaza ca BG1188 are rol de inhibitor al
pompelor de eflux ale bacteriilor, actionand impreuna cu cloramfenicolul.
116
Capitolul VI. Studiul stabilitatii solutiilor de ecdisteroizi
6.1. Introducere
In acest capitol sunt prezentate studiile de stabilitate ale solutiilor de ecdisteroizi,
fiind accentuat studiul de fotostabilitate a acestora.
Fotostabilitatea solutiilor de ecdisteroizi a fost analizata in conditii de iradiere cu
fascicul laser.
Cei doi ecdisteroizi studiati au fost 20-hidroxiecdisone (20E) si derivatul lui 20-
hidroxiecdisone 2,3;20,22-diacetoinda (20ED). Puritatea compusilor este de peste 98%.
Proprietatile fizico-chimice ale celor doi ecdisteroizi, 20E si 20ED, au fost descrise in
Capitolul II al tezei.
Pentru studiile de stabilitate in conditii de iradiere cu fascicul laser, au fost
preparate solutii ale ecdisteroizilor la concentratii intre 2 mg/ml si 20 mg/ml. Volumul
probelor pentru expunerea la radiatie laser a fost de 1,5 mL. Solventii utilizati pentru
prepararea solutiilor au fost metanol pentru 20E si cloroform pentru 20ED.
Montajul experimental ultilizat pentru expunerea solutiilor de ecdisteroizi la
radiatie laser si pentru analiza modificarilor aparute in timpul expunerii este prezentat in
Figura 6.1.
Fig. 6.1. Montajul experimental utilizat pentru iradierea ecdisteroizilor.
Iradierea solutiilor de ecdisteroizi a fost facuta la 266 nm, cu ajutorul unui laser
pulsat Nd:YAG “Surelite II”, ale carui caracteristici au fost descrise in Capitolul III al
tezei.
Probele au fost agitate in permanenta cu un agitator magnetic (AREC.X,VELP
Scientifica) cu o viteza de 600 rpm, pentru a se asigura dispersarea moleculelor iradiate in
tot volumul probei.
117
Fasciculul laser a fost focalizat deasupra magnetului, pentru a se asigura ca toata
radiatia interactioneaza cu solutiile de ecdisteroizi.
Modificarile induse de expunerea la radiatie laser sunt analizate prin spectroscopie
de absorbtie in UV-Vis, spectroscopie de fluorescenta indusa laser (LIF) si cromatografie
in strat subtire (TLC).
Spectrele de absorbtie in UV-Vis ale ecdisteroizilor au fost inregistrate cu un
spectrofotometru de absorbtie in UV-Vis-NIR Lambda 950 de la Perkin-Elmer, descris
anterior in Capitolul III, in cuve cu drum optic de 1 mm.
Pentru inregistrarea spectrelor de fluorescenta indusa laser (LIF), solutiile de
ecdisteroizi au fost excitate cu ajutorul laserului pulsat Nd:YAG, iar spectrele au fost
colectate cu spectrometrul HR4000CG–UV–NIR, Ocean Optics. Domeniul spectral al
spectrometrului este 200 nm – 1100 nm, iar rezolutia spectrala este de 0,75 nm. Achizitia
spectrului a fost facuta prin intermediul unei fibre optice monomod, cu diametrul miezului
de 1 mm.
Pentru experimentele de TLC, volume de 10 μL din fiecare solutie neiradiata si la
diferite perioade de iradiere au fost aplicate pe placi de TLC in faza normala (DC-
Alufolien Kieselgel 60F254; Merck, Germania). Sistemele de solventi folosite pentru TLC
au fost: acetat etil-etanol-apa (16:2:1, v/v/v) (TLC1), diclormetan-metanol (25:2) (TLC2),
toluen-acetona-etanol-amoniac 25% (100:140:32:9, v/v/v/v) pentru TLC3 si volumele
300:140:32:9 pentru TLC4. Placile de TLC au fost analizate la lungimile de unda 254 nm si
366 nm ale lampii UV.
Expunerea ecdisteroizilor a avut loc pana la 60 de minute pentru a determina
perioadele minime necesare obtinerii modificarii optime a compusilor.
Pentru o rezolutie mai buna, au fost analizate placile de TLC bidimensionale (2D).
Pentru 20E, TLC 2D au fost utilizate sistemele de solventi TLC1 si TLC2, iar pentru 20ED
au fost folosite sistemele TLC3 si TLC4.
Spectrele de absorbtie in UV-Vis si cromatogramele in strat subtire au fost
inregistrate pentru cei doi ecdisteroizi la intervalele de timp de iradiere: 1 minut, 2 minute
si 30 secunde, 4 minute si 30 secunde, 8 minute, 11 si 14 minute.
6.2. Stabilitatea solutiilor de ecdisteroizi in conditii de iradiere cu fascicul laser
O prima metoda ultilizata pentru studierea stabilitatii solutiilor de ecdisteroizi este
spectroscopia de absorbtie in UV-Vis.
In Figura 6.2.a sunt prezentate spectrele de absorbtie ale solutiei de 20E in metanol,
la concentratia de 1 mg/mL, inregistrate la diferiti timpi de iradiere.
Conditiile de iradiere ale solutiilor de 20E in metanol au fost: lungimea de unda a
fasciculului laser 266 nm, energia medie a fasciculului 6,5 mJ, volumul probei 1 mL, iar
lungimea drumului optic a cuvei de iradiere 10 mm.
Solutia neiradiata de 20E in metanol prezinta o banda de absorbtie cu maximul la
243 nm. Aceasta banda se datoreaza unei tranzitii π – π*.
Aceasta banda de absorbtie este caracteristica ecdisteroizilor, care au o grupare 7-
en-6-ona in inelul B. Acest cromofor absoarbe in UV, cu un maxim am benzii de absorbtie
in jur de 250 nm (Hunyadi 2012, Bryce-Smith 1992).
118
Gruparea 7-en-6-ona in inelul B poate fi observata in formulele chimice ale
compusilor 20E si 20ED prezentate in Capitolul II al tezei.
Fig. 6.2. Influenta radiatiei laser asupra solutiei de 20E in metanol la concentratia 1
mg/mL: a) Spectrele de absorbtie ale solutiilor la diferiti timpi de iradiere; b) cinetica
maximului de absorbtie la 243 nm.
In timpul celor 14 minute de iradiere, banda de absorbtie cu maximul la 243 nm
scade aproape liniar, dupa cum se poate observa in Figura 6.2.b. Extinctia la 243 nm a
solutiei iradiate 14 minute este de 10 ori mai mica decat a maximului de absorbtie al
solutiei neiradiate.
In Figura 6.2.a se poate observa ca maximul de absorbtie de la 243 nm nu este
afectat de expunerea la radiatie laser timp de 1 minut, modificarea moleculelor si formarea
de noi fotoprodusi incepand cu al doilea minut de iradiere.
Descresterea maximului indica modificarea sub influenta fasciculului laser a
moleculelor de 20E, cel mai probabil, prima afectata fiind gruparea 7-en-6-ona in inelul B.
Modificarea moleculelor si aparitia a noi compusi este evidentiata si de usoara
creste a extinctiei in jurul a 300 nm. Datorita extinctiei foarte mici, este probabil ca banda
de absorbtie ce apare in jur de 300 nm sa se datoreze unei tranzitii n – π*.
Spectrele de absorbtie ale solutiei de 20ED in cloroform, la concentratia de 1
mg/ml, inregistrate la diferiti timpi de iradiere sunt prezentate in Figura 6.3.a.
Expunerea solutiilor de 20ED la fascicul laser s-a facut in aceleasi conditii ca in
cazul solutiilor de 20E.
La fel ca 20E, solutia neiradiata de 20ED in cloroform prezinta o banda de
absorbtie, caracteristica ecdisteroizilor, cu maximul la 241 nm, ce se datoreaza unei
tranzitii π – π*.
Expunerea la radiatie laser induce modificari ale moleculelor de 20ED ce au ca
rezultat formarea de noi compusi. Acest lucru este indicat de modificarea spectrelor de
absorbtie in timpul celor 14 minute de iradiere (Figura 6.3.a).
Tinand cont de banda de absorbtie cu maximul la 241 nm se datoreaza in principal
gruparii 7-en-6-ona in inelul B al ecdisteroizilor, scaderea acestui maxim in timpul iradierii
indica o transformare a acestei grupari si formarea unui nou produs sau a mai multor
produsi de reactie.
119
In Figura 6.3.b se poate observa ca scadera maximului de absorbtie la 241 nm are
loc mai rapid in primele minute de iradiere, dar apoi, incepand cu minutul al 8-lea,
extinctia maximului scade foarte putin. Acest lucru arata ca majoritatea moleculelor de
20ED sunt transformate sub influenta radiatiei laser in primele 8 minute, ramanand un
procent destul de mic de molecule ce se modifica in intervalul 8 – 14 minute.
Fig. 6.3. Influenta radiatiei laser asupra solutiei de 20ED in cloroform la concentratia 1
mg/mL: a) Spectrele de absorbtie ale solutiilor la diferiti timpi de iradiere; b) cinetica
maximelor de absorbtie la 241 nm si 299 nm.
Produsii formati in timpul iradierii prezinta o banda de absorbtie cu maximul la 299
nm. Aceasta banda se poate datora unei tranzitii n – π*.
Totusi, exista posibilitatea ca aceasta absorbtie larga, cu maximul la 299 nm, sa se
datoreze suprapunerii mai multor benzi de absorbtie, datorate mai multor specii, unele
tranziente si altele stabile in timp/ cu timp de viata mai lung.
Evolutia maximului de la 299 nm (Figura 6.3.b) indica prezenta unei specii
tranziente, ce este prezenta pana la 4 minute si 30 secunde in timpul iradierii. Dupa acest
timp, maximul la 299 nm, scade usor, ceea ce poate arata ca absorbtia se datoreaza doar
produsilor stabili/ cu timp de viata mai lung.
Modificarea ambelor maxime de absorbtie tinde sa se satureze pana la finalul celor
14 minute de iradiere, indicand ca moleculele de 20ED au fost transformate in produsi de
reactie si ca in solutie nu mai sunt molecule disponibile pentru modificare sub influenta
radiatiei laser.
Modificarea ecdisteroizilor prin expunere la radiatie laser este demonstrata si prin
spectroscopia de fluorescenta indusa laser.
In Figura 6.4 sunt prezentate spectrele de fluorescenta indusa laser ale solutiilor de
ecdisteroizi.
Se poate observa ca intensitatea fluorescentei in cazul solutiilor de 20E 1 mg/mL in
metanol creste treptat in primele 10 minute de iradiere, insa apoi stagneaza (Figura 6.4.a).
Spectrele LIF ale 20E prezinta 3 maxime in jur de 290 nm, 420 nm si 480 nm. Cresterea
intensitatii maximelor emisiei indica modificarea moleculelor de 20E in primele 10 minute,
cel mai probabil, in primul rand modificandu-se cromoforul 7-en-6-ona in inelul B al
ecdisteroidului.
120
In Figura 6.4.b se poate observa ca spectrele LIF ale solutiilor de 20ED 1 mg/mL in
cloroform prezinta un maxim de intensitate al emisiei in jur de 500 nm si un umar mai mic
in jur de 430 nm. Ambele maxime cresc treptat in timpul celor 14 minute de iradiere.
Aceasta modificare a fluorescentei indica o modificare a moleculelor de 20ED in timpul
expunerii la radiatie laser.
Fig. 6.4. Spectrele LIF ale solutiilor de: a) 20E 1 mg/mL in metanol; b) 20ED 1 mg/mL in
cloroform.
In cazul expunerii la radiatie laser pentru perioade mai lungi, s-a observat ca emisia
solutiilor de 20ED a ramas stabila mai mult de doua ore, ceea ce sugreaza ca fluorescenta
se datoreaza, in mare parte, produsilor fotostabili.
Spre deosebire de 20ED, intensitatea fluorescentei solutiilor de 20E in metanol a
inceput sa scada dupa 15-20 de minute si a disparut complet dupa 40 de minute. Acest
lucru indica faptul ca fluorescenta se datoreaza unor specii tranziente formate in solutiile
de 20E in timpul iradierii.
Modificarile obtinute in solutiile de ecdisteroizi in timpul expunerii la radiatie laser
au fost observate si cu ajutorul cromatografiei in strat subtire (TLC) 1D si 2D.
Cromatogramele solutiilor de ecdisteroizi, la concentratia de 1 mg/mL, iradiate la
266 nm, cu o energie medie de 6,5 mJ, timp de 5 minute, 10, 20, pana la 60 de minute au
aratat ca modificarile cele mai importante au loc in primele 5 minute de iradiere, iar dupa
10 minute de iradiere se pare ca moleculele initiale sunt transformate in totalitate in specii
noi.
In continuare, au fost inregistrate cromatogramele solutiilor de ecdisteroizi, la
concentratia de 2 mg/mL, iradiate pana la 14 minute (Figura 6.5).
Cromatogramele din Figura 6.5 confirma rezultatele obtinute prin spectroscopia de
absorbtie in UV-Vis si prin spectroscopia LIF: moleculele de 20E si 20ED se modifica in
timpul iradierii formand noi compusi, iar pana la sfarsitul celor 14 minute de iradiere
aproape toate moleculele din solutie, la concentratia testata, au fost transformate in noi
specii moleculare.
121
Figura 6.5.B sugereaza formarea, dupa 14 minute de iradiere a 20ED, unui compus
cu conjugare extinsa, ce se poate intampla, spre exemplu, datorita eliminarii gruparii
14-OH (Hunyadi 2012). Acest lucru nu se observa insa in cazul solutiilor de 20E (Figura
6.5.C).
Fig. 6.5. A) TLC 1D a solutiilor de 20E si 20ED, la concentratia 2 mg/mL, la diferiti timpi
de iradiere; B) TLC 2D a solutiei de 20ED iradiata 14 minute; C) TLC 2D a solutiei de
20E iradiata 14 minute.
Tinand cont ca cei doi ecdisteroizi sunt aproape identici in zona cromoforului, ce
absoarbe majoritatea radiatiei UV, trebuie luata in calcul si contributia solventului, astfel,
pierderea gruparilor hidroxil pare sa fie mai favorabila in cloroform decat in metanol.
Atat in cromatogramele compusului 20E, cat si in cele ale 20ED, se observa
aparitia unui compus cu absorbtie puternica la UV254 (expunerea la 254 nm, la o lampa
utilizata pentru analiza TLC). In sistemul TLC1, petele celor doi compusi originand de la
20E si 20ED apar la factori de retentie (Rf) aproape identici, insa la utilizarea altor sisteme
de solventi se observa ca cei doi compusi nu sunt identici.
Totusi, 20ED trebuie sa piarda in timpul iradierii cel putin o grupare acetonida
pentru a da nastere unui compus cu polaritate relativ mare, in timp ce, celelalte specii
pastreaza o polaritate destul de mica, la fel ca si compusul parental, in comparatie cu
polaritatea 20E si a fotoprodusilor lui (Hunyadi 2012).
6.3. Concluzii
Studiile de fotostabilitate a celor doi ecdisteroizi, 20E si 20ED, au demonstrat ca
expunerea compusilor la radiatie laser induce modificari ale moleculelor, ducand la
formarea de noi specii moleculare.
Din spectrele de absorbtie in UV-Vis s-a observat ca solutia neiradiata de 20E in
metanol prezinta o banda de absorbtie cu maximul la 243 nm, banda se datoreaza unei
tranzitii π – π*. Aceasta banda de absorbtie este caracteristica ecdisteroizilor, care au o
grupare 7-en-6-ona in inelul B.
In timpul iradierii, banda de absorbtie cu maximul la 243 nm scade treptat, indicand
modificarea sub influenta fasciculului laser a moleculelor de 20E, cel mai probabil, prima
afectata fiind gruparea 7-en-6-ona in inelul B.
122
Modificarea moleculelor si aparitia a noi compusi este evidentiata si de usoara
creste a extinctiei in jurul a 300 nm, banda de absorbtie se poate datora unei tranzitii
n – π*.
Solutia neiradiata de 20ED in cloroform prezinta o banda de absorbtie, cu maximul
la 241 nm, ce se datoreaza unei tranzitii π – π*. Scaderea acestui maxim in timpul iradierii
indica o transformare a gruparii 7-en-6-ona in inelul B al ecdisteroizilor. Evolutia extinctiei
maximului in timpul iradierii arata ca majoritatea moleculelor de 20ED sunt transformate
sub influenta radiatiei laser in primele 8 minute, ramanad un procent destul de mic de
molecule ce se modifica in intervalul 8 – 14 minute.
In timpul iradierii solutiilor de 20ED, apar fotoprodusi ce prezinta o banda larga de
absorbtie cu maximul la 299 nm. Aceasta banda poate sa fie formata prin suprapunerea
mai multor benzi de absorbtie, datorate mai multor specii, unele tranziente si altele stabile
in timp/ cu timp de viata mai lung. Evolutia maximului de la 299 nm indica prezenta unei
specii tranziente, ce este prezenta pana la 4 minute si 30 secunde in timpul iradierii. Dupa
acest timp, maximul la 299 nm, scade usor, ceea ce poate arata ca absorbtia se datoreaza
doar produsilor stabili/ cu timp de viata mai lung.
Modificarea cromoforului prezent in cei doi ecdisteroizi este demonstrata si de
modificarea intensitatii fluorescentei in spectrele LIF.
Spectrele LIF ale 20E prezinta 3 maxime in jur de 290 nm, 420 nm si 480 nm.
Cresterea intensitatii maximelor emisiei indica modificarea moleculelor de 20E in primele
10 minute.
Spectrele LIF ale 20ED prezinta un maxim de intensitate al emisiei in jur de 500
nm si un umar mai mic in jur de 430 nm. Ambele maxime cresc treptat pana la finalul
iradierii.
TLC confirma ca moleculele de 20E si 20ED se modifica in timpul iradierii
formand noi compusi cu polaritati diferite, iar pana la sfarsitul celor 14 minute de iradiere
aproape toate moleculele din solutie au fost transformate in noi specii moleculare.
Scopul acestui studiu a fost de a pune la punct un sistem de transformare rapida a
unor compusi bioactivi (20E si 20ED), urmand ca fotoprodusii obtinuti prin expunere la
radiatie laser sa fie separati si caracterizati, iar activitatea lor sa fie testata impotriva unor
celule tumorale.
123
Capitolul VII. Concluzii generale. Contributii originale
Studiul stabilitatii medicamentelor este important inainte de includerea acestora in
aplicatiile medicale deoarece, din punctul de vedere al utilizatorilor (farmacisti, personal
medical, pacienti), este necesar sa se stabileasca in ce fel proprietatile de interes ale unui
medicament variaza in timp sub inflenta factorilor de mediu naturali sau artificiali si in ce
intervale de timp pot fi folosite medicamentele respective pentru aplicatii.
Evaluarea stabilitatii in timp a solutiilor de medicamente a fost facuta, prin metode
optice si spectrale, in primul rand, in conditii de mediu constante (aceeasi temperatura,
aceleasi conditii de iluminare/intuneric etc.). Al doilea timp de experimente au implicat
evaluarea influentei factorilor de mediu asupra stabilitatii solutiilor de medicamente, luand
in considerare factori precum temperatura de depozitare, solventul folosit in prepararea
solutiilor de medicamente, conditiile de iluminare in care sunt pastrate probele in timp.
Tema tezei de doctorat se incadreaza in directia de cercetare dedicata infrangerii
rezistentei la tratamente multiple (MDR – multi-drug resistance) a bacteriilor. Contributiile
aduse de aceste studii includ caracterizarea spectrala a unor compusi noi, dezvoltati pentru
a inhiba pompele de eflux ale bacteriilor rezistente la antibiotice, studierea stabilitatii
solutiilor acestor compusi sub influenta factorilor de mediu naturali sau artificiali,
evaluarea fotostabilitatii solutiilor de medicamente si caracterizarea fotoprodusilor rezultati
in urma interactiei solutiilor de medicamente cu radiatia laser.
Studiul activitatii antibacteriene a fotoprodusilor de reactie a demonstrat ca
expunerea la radiatie laser are potentialul de a forma specii noi cu activitate antibacteriana
imbunatatita fata de medicamentul neiradiat, propunand, astfel, iradierea cu fascicul laser a
solutiilor de medicamente ca o noua metoda de invingere a rezistentei la tratamente
multiple a bacteriilor.
Experimentele au fost desfasurate, in mare parte, in cadrul unor colaborari
internationale, si anume:
- Studiul stabilitatii solutiilor derivatilor chinazolinici a fost solicitat de grupul de
cercetare de la Facultatea de Medicina si Farmacie din Marsilia, Franta, care a sintetizat
acesti compusi cu rol de inhibitori ai pompelor de eflux ale bacteriilor.
- Studiul activitatii antibacteriene a solutiilor de fenotiazine neiradiate si iradiate a
fost defasurat in laboratoarele de microbiologie ale Centre for Food Safety, University
College Dublin, Irlanda, in cadrul unor stagii de mobilitate ale autoarei.
- Studiul fotostabilitatii solutiilor de ecdisteroizi si caracterizarea fotoprodusilor
obtinuti prin interactia cu fascicul laser au fost sugerate de grupul de cercetare de la
Facultatea de Farmacie, Universitatea din Szeged, Ungaria, care a sintetizat cei doi derivati
studiati.
In continuare, va fi prezentata o sinteza a rezultatelor originale obtinute de autoarea
tezei in urma studiilor experimentale descrise pe larg in cursul lucrarii.
A) Studiile de stabilitate in timp a fenotiazinelor au demonstrat ca solutiile de
CPZ, PZ, PMZ si TZ in apa ultra pura raman stabile, diferentele dintre spectrele de
124
absorbtie in UV-Vis ale fenotiazinelor ramanand in limitele de eroare experimentala pe
toata durata studiilor (144 de ore).
Spectrele de absorbtie in UV-Vis ale celor patru fenotiazine studiate prezinta
caracteristici similare: o banda de absorbtie in jurul a 255 nm, al carui coeficient de extictie
molara are o valoare relativ mare, indicand o tranzitie π – π*, si o a doua banda de
absorbtie in jurul a 305 nm, cu un coeficient de extinctie molara mai mic, ce indica o
tranzitie n – π*.
Testele de fotostabilitate arata ca spectrele de absorbtie in UV-Vis ale solutiilor de
fenotiazine se modifica in timpul iradierii, indicand ca fenotiazinele studiate nu raman
stabile in conditii de expunere la fascicul laser si ca iradierea poate modifica structura
moleculelor si poate produce noi compusi cu caracteristici diferite fata de medicamentul
initial.
Spectrele de absorbtie in UV-Vis ale fenotiazinelor iradiate la 266 nm, cu o energie
medie de 6,5 mJ, prezinta o deplasare hipsocromica a maximului de la 305 nm, fata de
fenotiazinele neiradiate. Aceasta deplasare hipsocromica se datoreaza scaderii pH-ului
solutiilor in timpul iradierii si/sau schimbarii polaritatii solutiilor.
Studiile de spectroscopie in UV-Vis si de cromatografie au demonstrat ca iradierea
produce compusi stabili pe o perioada de pana la 3 luni de la iradiere, insa apar si specii
tranziente, radicali cu timp de viata foarte scurt, a caror aparitie a fost evidentiata in
spectrele de absorbtie ale solutiei de CPZ 20 mg/mL in apa ultra pura, iradiata la 355 nm,
cu o energie medie de 30 mJ.
In timpul iradierii apar doua benzi de absorbtie noi, prima cu maximul in jur de 518
nm, iar a doua banda in jurul a 946 nm. Ambele maxime cresc liniar pe durata iradierii,
indicand faptul ca moleculele de CPZ se modifica treptat, iar rata de producere a produsilor
responsabili de aparitia maximelor este aceeasi pentru ambele maxime. Dupa incetarea
iradierii, maximul de la 518 descreste putin, insa este prezent si dupa 3 ore de la iradiere,
spre deosebire de banda cu maximul in jur de 946 nm, care descreste din primele minute
dupa incetarea expunerii la fascicul laser, disparand complet la 3 ore dupa iradiere. Banda
de absorbtie de la 946 nm poate fi atribuita speciilor tranziente produse in timpul iradierii.
Pentru a intelege procesul de interactie a radiatiei laser cu moleculele de fenotiazine
si implicit mecanismul de formare al noilor compusi, solutii de CPZ si PZ 10-4
M in apa
ultrapura au fost expuse la radiatie laser timp de 2 ore. S-a constat ca energia absorbita de
probe descreste exponential in timpul celor doua ore de iradiere.
S-a calculat numarul maxim de molecule ce pot absorbi energia pulsului laser
pentru ca fiecare tip de legatura sa se rupa si numarul de fotoni absorbiti pe durata unui
puls laser. S-a constatat ca ordinul de marime al numarului fotonilor absorbiti de solutia de
CPZ 10-4
M este egal cu cel al numarului maxim de molecule ce absorb energia pulsului
laser pentru a disocia o legatura chimica. Rezultatele demonstreaza ca exista o
transformare a moleculelor de fenotiazine si ca numarul acestora scade exponential pe
durata iradierii solutiilor. Aceste date pot fi o reprezentare cantitativa a interactiei
fasciculului laser cu moleculele de fenotiazine.
Activitatea antibacteriana a fenotiazinelor neiradiate si a celor iradiate a fost testata
pe tulpini de referinta si izolate clinic de bacterii Gram-negative (Klebsiella pneumoniae,
Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes si Salmonella enterica serovar
125
Typhimurium DT104) si Gram-pozitive (Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes,
Listeria ivanovii si Listeria welshimeri).
Din testele de susceptibilitate a bacteriilor a rezultat ca fenotiazinele iradiate au o
activitate antibacteriana mult mai buna decat fenotiazinele neiradiate si ca fenotiazinele
iradiate au o activitate mult mai buna impotriva bacteriilor Gram-pozitive decat impotriva
celor Gram-negative, cele mai bune valori ale MIC si MBC obtinandu-se pentru CPZ si PZ
iradiate, pentru tulpinile de Staph. aureus si cele de Listeria.
Testele de evaluare a cineticii de crestere a tulpinilor de Staphylococcus aureus au
demonstrat ca fenotiazinele iradiate sunt mai active decat cele neiradiate. Statistic, cele mai
bune rezultate s-au obtinut pentru PZ iradiat, PMZ iradiat si TZ iradiat, care au prelungit
considerabil faza de lag (perioada in care bacteria se adapteaza la mediul de crestere) a
tulpinilor izolate clinic.
Metoda “tabla de sah” demonstreaza ca activitatea fenotiazinelor administrate
impreuna cu un antibiotic poate fi clasificata ca fiind indiferenta in cazul tulpinilor de
Staphylococcus aureus testate, aratand ca fenotiazinele neiradiate si iradiate nu actioneaza
ca inhibitori ai pompelor de eflux si nu faciliteaza activitatea antibioticelor testate.
Rezultatele testelor de activitate antibacteriana sugereaza ca mecanismul de actiune al
fenotiazinelor este, mai degraba, de permeabilizare a membranei bacteriei, decat de
inhibitie a pompelor de eflux, tinand cont ca peretele celular al bacteriilor Gram-negative
este mai complex, avand o membrana externa in plus fata de cel al bacteriilor Gram-
pozitive.
B) Studiile de stabilitate in timp a solutiilor de VCM in apa ultra pura, la
concentratiile 10-4
M si 10-3
M, au aratat ca acestea sunt stabile pentru cel putin 408 ore.
VCM prezinta trei benzi de absorbtie in UV: prima la 199 nm, a doua sub forma
unui umar, in jurul valorii de 236 nm, iar a treia la 280 nm, ce se datoreaza in mare parte
absorbtiilor aminoacizilor din heptapeptida, in special a tirozinei, influentate de prezenta
componentei glican. Aparitia benzii de absorbtie de la 199 nm poate fi determinata de o
tranzitie π – π*, iar umarul de la 236 nm poate fi atribuit unei tranzitii n – π*. Banda cu
maximul la 280 nm poate fi atribuita unei tranzitii π – π*, ce se poate datora, in principal,
reziduului de tirozina din molecula de VCM. In plus, asparagina, ce formeaza o catena
laterala cu rol in activitatea antimicrobiala a VCM, prezinta o banda de absorbtie in
domeniul 190 – 230 nm ce influenteaza aspectul spectrului de absorbtie al solutiilor de
VCM.
In cadrul studiilor de fotostabilitate s-a constatat ca VCM se modifica in timpul
expunerii la radiatie laser, iar parametrii de iradiere au fost modificati pentru a obtine
conditiile optime experimentale in functie de rezultatele urmarite.
Din spectrele de absorbtie in UV-Vis si spectrele LIF ale solutiilor de VCM,
inregistrate inainte de expunerea la radiatie laser si apoi la diferiti timpi de iradiere, s-a
putut observa ca moleculele de VCM se modifica in timpul iradierii, aparand compusi noi.
Dintre modificarile identificate, cel mai probabil in timpul iradierii este afectata tirozina, ce
se poate transforma in fenilalanina, ditirozina, 3a-hidroxi-6-oxo-2,3,3a,6,7,7a-hexahidro-
1H-indol-2-acid carboxilic (HOHICA), 3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA) sau 2,4-
dihidroxifenilalanina (2,4-DHPhe).
126
Din spectrele FTIR ale solutiilor de VCM in apa ultra pura se observa ca dupa
iradiere are loc o scadere importanta a intensitatii benzilor datorate vibratiilor de intindere
ale legaturilor C–O si C–Cl. Ruperea unor legaturi C–O se poate intampla si in cazul
reziduurilor de tirozina, permitand transformarea lor in reziduri de fenilalanina. Acest lucru
este in concordanta cu rezultatele obtinute din spectrele de absorbtie in UV-Vis si in
spectrele LIF.
In spectrele de masa ale solutiilor de VCM iradiate s-a observat apartitia mai
multor fotoprodusi de reactie. Dintre acestia au fost identificati N-metil-leucina si glicanul,
N-metil-leucina fiind un compus puternic hidrofob.
Prezenta glicanului in solutie indica faptul ca legaturile de oxigen dintre
heptapeptida si fragmentul glican se rup in timpul iradierii, eliberand glicanul in solutia
apoasa.
Formarea compusilor cu caracter hidrofob in timpul iradierii a fost studiata in timp
real, prin inregistrarea tensiunii interfaciale dinamice, pe suprafata unei bule de aer
generata intr-o solutie de VCM in apa. In timpul a doua sesiuni de iradiere consecutive,
comportamentul tensiunii interfaciale dinamice a fost specific procesului prin care o
substanta hidrofoba (sau mai multe substante hidrofobe) se acumuleaza gradual la
suprafata bulei.
Expunerea solutiilor de VCM la radiatie laser cu energii mari a avut ca rezultat
modificarea moleculelor de VCM si generarea de spume.
Formarea spumelor in solutiile de VCM in timpul iradierii are la baza nucleatia
bulelor, datorata undei de rezistenta generate de pulsul laser. Este putin probabil ca
formarea spumelor sa se datoreze cresterii temperaturii, deoarece nu s-a observat o
incalzire semnificativa a solutiilor de VCM (incalzire de 1-2oC la suprafata cuvei).
Generarea spumelor produce modificari in molecula de VCM, afectand in special
radicalul tirozina.
In urma modificarilor induse de radiatia laser in molecula de VCM este posibil ca
activitatea antibacteriana a acesteia sa fie afectata, desi, in general, generarea spumelor sub
influenta fasciculului laser, are potentialul de a imbunatati activitatea biologica prin crearea
de situsuri de adeziune.
C) Studiile de stabilitate in timp a solutiilor derivatilor chinazolinici au aratat
ca solutiile de BG1188 in apa ultra pura sunt stabile perioade indelungate de timp (2856
ore), insa solutiile de BG1188 in DMSO sunt foarte instabile, forma spectrelor de absorbtie
modificandu-se din primele minute dupa prepararea solutiilor.
Opus fata de BG188, solutiile de BG1162 in apa ultra pura sunt instabile, in timp ce
spectrele solutiilor de BG1162 in DMSO raman in limitele de eroare, demonstrand ca
aceste solutii sunt stabile pe toata perioada experimentelor (144 de ore).
Spectrele solutiilor de BG1188 in apa ultra pura prezinta trei benzi de absorbtie, cu
maxime la 207 nm, 224 nm si 314 nm. Banda de absorbtie cu maximul la 224 nm se poate
datora unei tranzitii π – π* (1B), originand in benzen, iar banda cu maximul la 314 nm se
datoreaza unor tranzitii π – π* (1La si
1Lb). Largimea benzii indica faptul ca exista o
suprapunere de benzi datorate tranzitiei π – π* cu o banda ce poate fi atribuita unei tranzitii
n – π*.
127
In cazul solutiilor de BG1188 in DMSO, maximul de la 314 nm sufera o deplasare
la 324 nm datorita polaritatii solventului.
Din cauza instabilitatii in timp a solutiilor de BG1188 in DMSO, maximul de la
324 nm sufera o deplasare hipsocromica la 318 nm dupa 1 ora si 45 de minute de la
prepararea solutiei si in acelasi timp un umar al benzii de absorbtie apare in jur de 330 nm.
Acest lucru indica modificarea moleculelor de BG1188 in DMSO, avand ca rezultat
separarea mai buna a benzilor de absorbtie ce isi au originea in tranzitiile π – π* de banda
de absorbtie ce poate fi atribuita tranzitiei n – π*.
Spectrele solutiilor de BG1162 in apa ultra pura prezinta mai multe benzi de
absorbtie suprapuse in regiunea 200 – 250 nm, ce se pot datora unor tranzitii π – π* ale
moleculelor, iar in regiunea 260 – 340 nm prezinta mai multe benzi de absorbtie suprapuse,
cu maxime la 287 nm, 301 nm, 313 nm si 325 nm. Aceste benzi suprapuse se datoreaza,
cel mai probabil, tranzitiilor π – π* si unor tranzitii n – π*.
In timpul studiilor de stabilitate a solutiilor de BG1188 se observa aparitia unor
agregate filiforme. Imaginile obtinute cu un microscop optic, un microscop electronic de
scanare si un microscop de forta atomica, au aratat ca exista doua tipuri de agregate: primul
tip, fire lungi, deschise la culoare, cu o latime aproximativ constanta pe toata lungimea
firului, iar al doilea tip de fire par sa fie formate dintr-o insiruire de sfere inchise la culoare,
cu diametre de 2 – 3 μm.
Mecanismul de formare al agregatelor nu este cunoscut inca, insa tinand cont de
similaritatile din spectrele FTIR apare ca acestea sunt formate din fragmente de molecule
de BG1188. Calcularea gradului de polimerizare a aratat ca aceste agregate nu sunt
polimeri, iar studiile de difractie de raze X au aratat ca nu sunt cristale.
Influenta temperaturii asupra stabilitatii solutiilor de BG1188 in apa ultra pura a
fost studiata. S-a aratat ca la doua temperaturi de depozitare uzuale, 4oC si 22
oC
(temperatura camerei), nu apar diferente semnificative spectrele de absorbtie ale solutiilor,
indicand ca cele doua temperaturi de depozitare nu afecteaza stabilitatea acestora.
In timpul studiilor de fotostabilitate a solutiilor de BG1188 in apa ultra s-a constat
scaderea exponentiala a maximului de la 224 nm, datorat unei tranzitii π – π* (1B), cu
originea in inelul benzenic, ceea ce arata ca iradierea modifica si radicalul chinazolinic din
moleculele de BG1188. De asemenea, se modifica si banda de absorbtie cu maximul la 314
nm, ce se datoreaza unor tranzitii π – π* si unei tranzitii n – π*.
In spectrele inregistrate in timpul iradierii apar trei puncte isosbestice la 248 nm,
286 nm si 354 nm, ce indica faptul ca exista cel putin 6 compusi diferiti in solutie (cate doi
pentru fiecare punct isosbestic).
Testele de activitate a solutiilor de BG1188 in apa ultra pura neiradiate si iradiate
impotriva tulpinilor de Staphylococcus aureus si de Salmonella enterica serovar
Typhimurium DT104 au demonstrat ca acesti compusi nu prezinta activitate antibacteriana.
D) Studiile de fotostabilitate a ecdisteroizilor, 20E si 20ED, au demonstrat ca
expunerea compusilor la radiatie laser induce modificari ale moleculelor, ducand la
formarea unor noi specii moleculare.
Din spectrele de absorbtie in UV-Vis s-a observat ca solutia neiradiata de 20E in
metanol prezinta o banda de absorbtie cu maximul la 243 nm, ce se datoreaza unei tranzitii
π – π* si este caracteristica ecdisteroizilor, care au o grupare 7-en-6-ona in inelul B. In
128
timpul iradierii, aceasta banda scade treptat, indicand modificarea sub influenta
fasciculului laser a moleculelor de 20E, cel mai probabil, prima afectata fiind gruparea 7-
en-6-ona in inelul B. Modificarea moleculelor si aparitia a noi compusi este evidentiata si
de usoara creste a extinctiei in jurul a 300 nm, banda de absorbtie se poate datora unei
tranzitii n – π*.
Solutia neiradiata de 20ED in cloroform prezinta o banda de absorbtie, cu maximul la 241
nm, ce se datoreaza unei tranzitii π – π*. Scaderea acestui maxim in timpul iradierii indica
o transformare a gruparii 7-en-6-ona in inelul B al ecdisteroizilor. Evolutia extinctiei
maximului in timpul iradierii arata ca majoritatea moleculelor de 20ED sunt transformate
sub influenta radiatiei laser in primele 8 minute, ramanad un procent destul de mic de
molecule ce se modifica in intervalul 8 – 14 minute.
In timpul iradierii solutiilor de 20ED, apar fotoprodusi ce prezinta o banda larga de
absorbtie cu maximul la 299 nm. Aceasta banda poate sa fie formata prin suprapunerea
mai multor benzi de absorbtie, datorate mai multor specii, unele tranziente si altele stabile
in timp/ cu timp de viata mai lung. Evolutia maximului de la 299 nm indica prezenta unei
specii tranziente, ce este prezenta pana la 4 minute si 30 secunde in timpul iradierii. Dupa
acest timp, maximul la 299 nm, scade usor, ceea ce poate arata ca absorbtia se datoreaza
doar produsilor stabili/ cu timp de viata mai lung.
Modificarea cromoforului prezent in cei doi ecdisteroizi este demonstrata si de
modificarea intensitatii fluorescentei in spectrele LIF. Spectrele LIF ale 20E prezinta 3
maxime in jur de 290 nm, 420 nm si 480 nm. Cresterea intensitatii maximelor emisiei
indica modificarea moleculelor de 20E in primele 10 minute. Spectrele LIF ale 20ED
prezinta un maxim de intensitate al emisiei in jur de 500 nm si un umar mai mic in jur de
430 nm. Ambele maxime cresc treptat pana la finalul iradierii.
TLC confirma ca moleculele de 20E si 20ED se modifica in timpul iradierii
formand noi compusi cu polaritati diferite, iar pana la sfarsitul celor 14 minute de iradiere
aproape toate moleculele din solutie au fost transformate in noi specii moleculare.
Aceste rezultate dau nastere la noi perspective in studiul celor patru clase de
medicamente.
In cazul fenotiazinelor, ramane sa fie identificati toti produsii ce se formeaza in
timpul expunerii solutiilor de fenotiazine la fascicul laser, precum si mecanismul de
producere al acestor compusi, ca apoi sa poata fi identificat mecanismul de activitate al
acestora impotriva bacteriilor. Acesta poate reprezenta un progres in invingerea rezistentei
la tratamente multiple a bacteriilor.
La fel si in cazul VCM, urmeaza sa fie identificati toti fotoprodusi generati in
timpul iradierii cu fascicul laser si mecanismul de formare al lor, precum si mecanismul de
generare al spumelor cu fascicul laser in solutiile de VCM
In cazul derivatilor chinazolinici, ipotezele testate pana acum in cazul
mecanismului de formare al agregatelor filiforme in solutiile de BG1188 s-au dovedit
incomplete sau neaplicabile, ramanand ca acest mecanism sa fie testat ulterior.
In cazul ecdisteroizilor, urmeaza ca fotoprodusii obtinuti prin expunere la radiatie
laser sa fie separati si caracterizati, iar activitatea lor sa fie testata impotriva unor celule
tumorale.
129
Referinte bibliografice
(Aaron 1991) J.J. Aaron, A. Tine, M. D. Gaye, C. Parkanyi, C. Boniface, T. W. N. Bieze,
Effects of solvent on the electronic absorption and fluorescence spectra of quinazolines,
and determination of their ground and excited singlet-state dipole moments,
Spectrochimica Acta, Vol.47A, Nr. 3/4, 419 – 430 (1991)
(Alagarsamy 2007) Alagarsamy V, Solomon VR, Dhanabal K: Synthesis and
pharmacological evaluation of some 3-phenyl-2-substituted-3H -quinazolin-4-one as
analgesic, anti-inflammatory agents. Bioorg Med Chem, 15:235-241 (2007)
(Alexandru 2013) T. Alexandru, A. Armada, B. Danko, A. Hunyadi, A. Militaru, M. Boni,
V. Nastasa, A. Martins, M. Viveiros, M.L. Pascu, J. Molnar, L. Amaral, Biological
Evaluation of Products Formed from the Irradiation of Chlorpromazine with a 266 nm
Laser Beam, Biochemistry & Pharmacology, 2, 109 (2013)
(Allen 2003) N.E.Allen, T.I.Nicas. Mechanism of action of oritavancin and related
glycopeptide antibiotics, FEMS Microbiology Reviews 26, 511 -532 (2003)
(Amaral 1992) Amaral L., Kristiansen J., Lorian V., Synergic effect of chlorpromazine on
the activity of some antibiotics, J. Antimicrob. Chemother., 30(4), 556-558. (1992)
(Amaral 1996) Amaral L, Kristiansen JE, Abebe LS, Millett W, Inhibition of the
respiration of multi-drug resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis by
thioridazine: potential use for initial therapy of freshly diagnosed tuberculosis. J
Antimicrob Chemother 38: 1049–1053, (1996)
(Amaral 2007) Amaral L., Martins M., Viveiros M., Enhanced killing of intracellular
multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis by compounds that affect the activity of
efflux pumps, J. Antimicrob. Chemother., 59(6), 1237-1246. (2007)
(Amaral 2010) Amaral L, Martins A, Molnar J, Kristiansen JE, Martins M, et al.,
Phenothiazines, bacterial efflux pumps and targeting the macrophage for enhanced killing
of intracellular XDRTB. In Vivo 24: 409–424 (2010)
(Amelinckx 1997) S. Amelinckx, D. Van Dyck, J. Van Landuyt, G. Van Tendeloo,
Electron Microscopy. Principles and Fundamentals, Ed. VCH, Germania, (1997)
(Armada 2013) Armada AM, Alexandru T, Machado D, Danko B, Hunyadi A, Dinache A,
Nastasa V, Boni M, Ramos J, Viveiros M, Molnar J, Pascu ML, Amaral L. The In Vitro
Activityof Products Formed from Exposure of Chlorpromazine to a 266nm LASER Beam
130
Against Species of Mycobacteria of Human Interest. In Vivo; 27(5):605-10. (2013)
(Baïtiche 2004) Baïtiche M, Mahamoud A, Benachour D, Merbah M, Barbe J. Synthesis of
new quinazoline derivatives. Heterocycl Commun; 10:269–72 (2004)
(Báthori 2008) Báthori M, Tóth N, Hunyadi A, Márki Á and Zádor E: Phytoecdysteroids
and anabolic-androgenic Steroids – structure and effects on humans. Curr Med Chem
15(1): 75-91, (2008)
(Beringer 2006) Beringer, P.; Troy, D. A.; Remington, J. P. ; Remington: The Science and
Practice of Pharmacy. Hagerstown, MD: Lippincott Williams & Wilkins. p. 1545, (2006)
(Berthod 2010) Berthod A, Chiral Recognition in Separation Methods: Mechanisms and
Applications, pag. 203 – 222, Ed. Springer Berlin Heidelberg, Berlin, Germania (2010)
(Blanksby 2003) S.J. Blanksby, G.B. Ellison, Bond Dissociation Energies of Organic
Molecules, Acc. Chem. Res, 36, 255 – 263 (2003)
(Bogusz 2004) M. J. Bogusz, H. Hassan and M. Al Tufail, Toxichem Krimtech, 71(1), 2-9,
(2004)
(Bosakova 2002) Z. Bosakova, I. Klouckova, E. Tesarova, Study of the stability of
promethazine enantiomers by liquid chromatography using a vancomycin-bonded chiral
stationary phase, Journal of Chromatography B, 770: 63–69, (2002)
(Braga 2004) P.C. Braga, D. Ricci, Atomic Force Microscopy, Biomedical Methods and
Applications, Methods in Molecular Biology, Vol. 242, Ed. Humana Press (2004)
(Brown 1996) Brown, D.J. The Chemistry of Heterocyclic Compounds: Quinazolines,
Taylor E. (Ed.), John Wiley & Sons Ed., (1996)
(Bryce-Smith 1992) Bryce-Smith D, Gilbert A (eds.): Photochemistry – A Review of
Chemical Literature, RSC Publishing, Cambridge, UK (1992)
(Charpentier 1950 a) P. Charpentier, U.S. Patent 2,519,886 (1950)
(Charpentier 1950 b) P. Charpentier, U.S. Patent 2,530,451 (1950)
(Charpentier 1953) P. Charpentier, U.S. Patent 2,645,640 (1953)
(Chevalier 2010) Chevalier, J.; Mahamoud, A.; Baitiche, M.; Adam, E.; Viveiros, M.;
Smarandache, A.; Militaru, A.; Pascu, M.L.; Amaral, L.; Pagès, J.M., Quinazoline
derivatives are efficient chemosensitizers of antibioticactivity in Enterobacter aerogenes,
Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa resistant strains, Int. J. Antimicrob
131
Agents, 36, 164-168 (2010)
(Coates 2000) Coates J., Interpretation of Infrared Spectra, A Practical Approach, in
Encyclopedia of Analytical Chemistry, R.A. Meyers (Ed.), Editura John Wiley & Sons
Ltd, Chichester (2000)
(Davidson 2002) M. W. Davidson, M. Abramowitz, Optical Microscopy, Encyclopedia of
Imaging Science and Technology (2002)
(Dinache 2013) A. Dinache, M. Boni, M.L. Pascu, Phenothiazine Derivatives Interaction
with Laser Radiation, Romanian Reports in Physics, accepted for publication (2013)
(Dinan 2006) Dinan L and Lafont R: Effects and applications of arthropod steroid
hormones (ecdysteroids) in mammals. J Endocrinol 191(1): 1-8, (2006)
(Dinan 2009) Dinan L: The Karlson lecture. Phytoecdysteroids: What use are they? Arch
Insect Biochem Physiol 72(3): 126-141, (2009)
(Eckmann 2009) D. M. Eckmann, Polidocanol for Endovenous Microfoam Sclerosant
Therapy, Expert Opin Investig Drugs., 18(12):1919-27 (2009)
(Eghbal 2004) A. Eghbal, S. Tafazoli, P. Pennefather, P.J. O’Brien, Peroxidase catalysed
formation of cytotoxic prooxidant phenothiazine free radicals at physiological pH, Chem.
Biol. Interact. 151: 43–51, (2004)
(Elisei 2002) Elisei, F.; Latterini, L.; Aloisi, G.G.; Mazzucato, U.; Viola, G.; Mioio, G.;
Vedaldi, D.; Dall’Acqua, F. Excited-state properties and in vitro phototoxicity studies of
three phenothiazine derivatives. Photochem. Photobiol., Vol.75, pag.11-21 (2002)
(EPIS 2013) Estimation Programs Interface Suite™ for Microsoft® Windows, v 4.11, a
package of ab initio programs, http://www.epa.gov. (2013)
(Felmeister 1964) Felmeister A., Discher C. A., Photodegradation of Chlorpromazine
Hydrochloride, J. Pharm. Sci., Vol. 53. No. 7, pp. 756 – 762 (1964)
(Fels 1959) I. G. Fels, M. Kaufman, Free Radicals from Chlorpromazine , Nature, Vol.
183, pp 1392-1393 (1959)
(Ferrari 2004) M. Ferrari, F. Ravera and L. Liggieri, J. of Colloid and Interface Science,
272(2), 277-280 (2004)
(Forrest 1958) Forrest, S., Forrest, F.M., Berger, M., Free radicals as metabolites of drugs
derived from phenothiazine -, Biochim. Biophys. Acta, 29, 441 (1958)
132
(Fry 1987) Fry D.W., Jackson R.C., Biological and biochemical properties of new
anticancer folate antagonists., Cancer Metastasis Rev.; 5(3): 251-70, (1987)
(Gaspard 2008) S. Gaspard, M. Oujja, C. Abrusci, F. Catalina, S. Lazare, J.P. Desvergne,
M. Castillejo, Laser induced foaming and chemical modifications of gelatine films, Journal
of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry 193: 187 – 192 (2008)
(Gerhard 1993) Gerhard U, Mackay J.P., Maplestone R.A., Williams D.H., The Role of the
Sugar and Chlorine Substituents in the Dimerization of Vancomycin Antibiotics, J. Am.
Chem. Soc., 115, 232 – 237 (1993)
(Gilman 2001) Gilman, Alfred; Goodman, Louis Sanford; Hardman, Joel G.; Limbird, Lee
E., ed. , Goodman & Gilman's the pharmacological basis of therapeutics (10th ed.). New
York: McGraw-Hill. pp. 447–449 (2001)
(Gocke 1996) E. Gocke, Review of the genotoxic properties of chlorpromazine and related
phenothiazines, Mutation Research 366, 9-21. (1996)
(Goldbook 2012) “Compendium of Chemical Terminology” Version 2.3.2, International
Union of Pure and Applied Chemistry 2012-08-19
http://goldbook.iupac.org/PDF/goldbook.pdf (2012)
(Goucher 1975) Goucher C., Windle J. J., Levy L., Stable Enzyme Inhibitors and Stable
Free Radical Species in Ultraviolet-Irradiated Solutions of Chlorpromazine, Mol.
Pharmacol., 11, 603-612, (1975)
(Grover 2006) Grover, G.; Kini, S.G. Synthesis and evaluation of new quinazolone
derivatives of nalidixic acid as potential antibacterial and antifungal agents. European
Journal of Medicinal Chemistry, Vol.41, pag. 256–262 (2006)
(Harris 1983) Harris C. M., Kopecka H., Harris T. M., Vancomycin: Structure and
Transformation to CDP-I, J. Am. Chem. Soc., 105, 6915-6922 (1983)
(Hammes 2005) Hammes G.G, Spectroscopy for the biological Sciences, Ed. John Wiley
& Sons, Inc. (2005)
(Hendricks 2005) Hendricks, O.; Molnar, A.; Sorensen Butterworth, T.; Butaye, P.;
Kolmos, H.J.;Bolstad Christensen, J.; Kristiansen, J.E. In vitro Activity of Phenothiazines
Derivatives in Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium. Clinical Pharmacology
and Toxicology, Vol.96, pag. 33-36, (2005)
(Houben-Weyl 1984) Houben-Weyl, Beilstein E III/IV 27, 1214 ff, J. Heterocycl. Chem.
21, 613 (1984)
133
(Huang 1964) C.L. Huang, F.L. Sands, “The effect of ultraviolet irradiation on
Chlorpromazine. I. Aerobic condition”, J. Chromatog., 13: 246-249 (1964)
(Hunyadi 2012) Hunyadi, A.; Danko, B.; Boni, M.; Militaru, A.; Alexandru, T.; Nastasa,
V.; Andrei, I. R.; Pascu, M.L.; Amaral, L.;"Rapid, Laser-Induced Conversion of 20-
Hydroxyecdysone and its Diacetonide - Experimental Set-up of a System for
Photochemical Transformation of Bioactive Substances"; Anticancer Research, 32 (4),
1291 – 1297 (2012)
(ICH Q1A 2003) Stability Testing of New Drug Substances and Products Q1A(R2),
International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of
Pharmaceuticals for Human Use (2003)
http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q1A_R
2/Step4/Q1A_R2__Guideline.pdf
(ICH Q1B 1996) Stability Testing: Photostability Testing of New Substances and Products
Q1B, International Conference on Harmonization of Technical Requirements for
Registration of Pharmaceuticals for Human Use (1996)
http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q1B/Ste
p4/Q1B_Guideline.pdf
(Ikai 2008) A. Ikai, The World of Nano-Biomechanics: Mechanical Imaging and
Measurement by Atomic Force Microscopy, Ed. Elsevier, Amsterdam (2008)
(Jäntschi 2009) Jäntschi L, Nascu H.I, Chimie Analitica si Instrumentala, Ed. Academic
Pres & AcademicDirect (2009)
(Jin 1995) Jin F., Leitich J., von Sonntag C., The photolysis (λ = 254nm) of tyrosine in
aqueous solutions in the absence and presence of oxygen. The reaction of tyrosine with
singlet oxygen, Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, 92, 147-153
(1995)
(Kahl 2005) T. Kahl, K.-W. Schröder, F. R. Lawrence, W. J. Marshall, Hartmut Höke,
Rudolf Jäckh, "Aniline" in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Wiley-VCH:
Weinheim (2005)
(Kerwin 2007) B. A. Kerwin, R. L. Remmele, Jr., Protect from Light: Photodegradation
and Protein Biologics, Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 96, Nr. 6, 1468 – 1479
(2007)
(Kong 2007) Kong J., Yu S., Fourier Transform Infrared Spectroscopic Analysis of Protein
Secondary Structures, Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 39(8): 549–559 (2007)
(Krimm 1983) Krimm S., Vibrational analysis of conformation in peptides, polypeptides,
134
and protein, Biopolymers, Vol. 22,217-225 (1983)
(Kristiansen 1997) Kristiansen JE, Amaral L., The potential management of resistant
infections with non-antibiotics. J Antimicrob Chemother 40: 319–327, (1997)
(Kristiansen 2003) Kristiansen M.M., Leandro C., Ordway D., Martins M., Viveiros M.,
Pacheco T., Kristiansen J. E., Amaral L., Phenothiazines alter resistance of methicillin-
resistant strains of Staphylococcus aureus (MRSA) to oxacillin in vitro, Int. J. Antimicrob.
Agents, 22, 250–253, (2003)
(Kumpun 2011) Kumpun S, Maria A, Crouzet S, Evrard-Todeschi N, Girault JP and
Lafont R: Ecdysteroids from Chenopodium quinoa Willd., an ancient Andean crop of high
nutritional value. Food Chemistry 125: 1226-1234, (2011)
(Kuzma-Richeret 2011) A. Kuzma-Richeret, J. Saczko, A. Choromanska, M. Dumanska,
M. Drag-Zalesinska, T. Wysocka, A. Chwilkowska, A. Pola,D. Mosiadz, A.
Marcinkowska, J. Kulbacka, The Influence of Phenothiazine Derivatives on Doxorubicin
Treatment in Sensitive and Resistant Human Breast Adenocarcinoma Cells, Folia
Biologica (Praha) 57, 261-267 (2011)
(Kyle 1993) Kyle DE, Milhous WK, Rossan RN, Reversal of Plasmodium falciparum
resistance to chloroquine in Panamanian Aortus monkeys. Am J Trop Med Hyg 48: 126–
133, (1993)
(Lafont 2009) Lafont R and Dinan L: Innovative and future applications for ecdysteroids.
In: Ecdysone: Structures and Functions. Smagghe G (ed.). Springer: the Netherlands, pp.
551-560, (2009)
(Lakowicz 1983) Lakowicz, J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press,
New York (1983)
(Lakowicz 2008) J.R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Specroscopy, second ed.,
Plenum Press, (2008)
(Lazare 2005) S. Lazare, V. Tokarev, A. Sionkowska, M. Wisniewski, Surface foaming of
collagen, chitosan and other biopolymer films by KrF excimer laser ablation in the
photomechanical regime, Applied Physics A, 81, 465 – 470 (2005)
(Lazare 2009 a) S. Lazare, R. Bonneau, S. Gaspard, M. Oujja, R. De Nalda, M. Castillejo,
A. Sionkowska, Modeling the dynamics of one laser pulse surface nanofoaming of
biopolymers, Applied Physics A, 94: 719 – 729 (2009)
135
(Lazare 2009 b) S. Lazare, R. Bonneau, S. Gaspard, M. Oujja, R. De Nalda, M. Castillejo,
A. Sionkowska, Dynamics of One Laser Pulse Surface Nanofoaming of Biopolymers,
Journal of Laser Micro/Nanoengineering, Vol. 4, Nr. 3, 152 – 158 (2009)
(Lazare 2010) S. Lazare, I. Elaboudi, M. Castillejo, A. Sionkowska, Applied Physics A,
101: 215 – 224, (2010)
(Liggieri 1999) L. Liggieri, M. Ferrari, A. Massa and F. Ravera, Colloids and Surfaces A,
156, 455-463 (1999)
(Lindon 2000) Lindon J.C., Tranter G.E., Holmes J.L., Encyclopedia of Spectroscopy and
Spectrometry, Vol. 1, Ed. Elsevier (2000)
(Loll 1998) Loll P.J., Miller R., Weeks C.M., Axelsen P.H., A ligand-mediated
dimerization mode for vancomycin, Chemistry & Biology, Vol. 5, No. 5, 293 – 298 (1998)
(López-Muñoz 2005) López-Muñoz, Francisco; Alamo, Cecilio; Cuenca, Eduardo; Shen,
Winston W.; Clervoy, Patrick; Rubio, Gabriel, "History of the discovery and clinical
introduction of chlorpromazine".Annals of Clinical Psychiatry 17 (3) (2005)
(Luo 2003) Y.R. Luo, “Handbook of bond dissociation energies in organic compounds”,
CRC Press, Florida (2003)
(Mackay 1994) J. P. Mackay, U. Gerhard, D. A. Beauregard, M. S. Westwell, M. S. Searle,
D. H. Williams, Glycopeptide Antibiotic Activity and the Possible Role of Dimerization: A
Model for Biological Signaling, J. Am. Chem. Soc., 116, 4581 – 4590, (1994)
(Mani Chandrika 2008) Mani Chandrika, P.; Yakaiah, T.; Raghu Ram Rao, A.; Narsaiah,
B.; Chakra Reddy, N.; Sridhar, V.; Venkateshwara Rao, J. Synthesis of novel 4,6-
disubstituted quinazoline derivatives, their anti-inflammatory and anti-cancer activity
(cytotoxic) against U937 leukemia cell lines. European Journal of Medicinal Chemistry,
Vol.43, pag. 846-852, (2008)
(Martins 2010) Martins A, Toth N, Molnar J, Hohmann J, Báthori M and Hunyadi A:
Ecdysteroids reverse resistance of human MDR1 gene transfected mouse lymphoma cells.
Planta Med 76: P239, (2010)
(Martins 2008) Martins, M.; Dastidar, S.G.; Fanning, S.; Kristiansen, J.E.; Molnar, J.;
Pages, J.M.; Schelz, Z.; Spengler, G.; Viveiros, M.; Amaral, L. Potential role of non-
antibiotics (helper compounds) in the treatment of multidrug-resistant Gram-negative
infections: mechanisms for their direct and indirect activities. International Journal of
Antimicrobial Agents, Vol.31, pag. 198–208, (2008)
(Matsuda 1970) Matsuda H, Kawaba T and Yamamoto Y: Pharmacological studies of
136
insect metamorphosing steroids from Achyranthis radix. Folia Pharmacologica Japonica
66: 551-563, (1970)
(McCormick 1962) McCormick MH, McGuire JM. Vancomycin and Method for its
Preparation, US 3067099 (1962)
(Merkle 1964) Merkle F. H., Discher C. A., Electrochemical Oxidation of Chlorpromazine
Hydrochloride, J. Pharm. Sci., Vol. 53. No. 6, pp. 620 – 623, (1964)
(Michalak 2006) K. Michalak, O. Wesolowska, N. Motohashi, J. Molnar, A. B. Hendrich,
Interactions of Phenothiazines with Lipid Bilayer and their Role in Multidrug Resistance
Reversal, Current Drug Targets, 7, 1095-1105 (2006)
(Militaru 2011 a) Militaru, A.; Smarandache, A.; Mahamoud, A.; Alibert, S.; Pagès, J.M.;
Pascu, M.L. Time Stability Studies of Quinazoline Derivative Designed to Fight Drug
Resistance Acquired by Bacteria. Letters in Drug Design &Discovery, Vol.8, Nr. 2, pag.
124-129. (2011)
(Militaru 2011 b) A. Militaru, A. Smarandache, M.L. Pascu &al., “Stability
characterization of quinazoline derivative BG1188 by optical methods”, AIP Conf. Proc.
1364, 13 – 23, (2011)
(Miller 2011) R. Miller, L. Liggieri, Bubble and Drop Interfaces, in "Progress in Colloid
and Interface Science", Vol. 2, Ed. Brill, Leiden (2011)
(Mohr 2011) P.J. Mohr, B.N. Taylor, D.B. Newell, "The 2010 CODATA Recommended
Values of the Fundamental Physical Constants", http://physics.nist.gov (2011)
(Monera 1995) Oscar D. Monera, Terrance J. Sereda, Nian E. Zhou1 and Cyril M. Kay, J.
of Peptide Science, 1(5), 319–329 (1995)
(Motyl 2006) Motyl M., Dorso K., Barrett J., Giacobbe R., Basic Microbiological
Techniques Used in Antibacterial Drug Discovery. Current Protocols in Pharmacology,
Supplement 31: 13A.3.15 – 13.A.3.22 (2006)
(Nałecz-Jawecki 2008) G. Nałecz-Jawecki, A. Hajnas, J. Sawicki, Photodegradation and
phototoxicity of thioridazine and chlorpromazine evaluated with chemical analysis and
aquatic organisms, Ecotoxicology, 17:13–20 (2008)
(Nastasa 2011) V. Nastasa, K. Samaras, I.R. Andrei, M.L. Pascu and T. Karapantsios,
Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 382, 246 – 250
(2011)
137
(Nastasa 2012) V. Nastasa, Studiul proprietatilor micro- si nano-picaturilor, utilizand
interactiunea cu radiatia laser – Teza de doctorat (2012)
(Ni 2010) Y. Ni, S. Su, S. Kokot, Spectrometric studies on the interaction of
fluoroquinolones and bovine serum albumin, Spectrochimica Acta Part A, 75, 547 – 552
(2010)
(Nieto 1971 a) Nieto, M., Perkins, H.R., Physiochemical properties of vancomycin and
iodovancomycin and their complexes with diacetyl-L-lysyl-D-alanyl-D-alanine. Biochem.
J. 123, 773 – 787 (1971)
(Nieto 1971 b) Nieto M., Perkins HR. The Specificity of Combination between Ristocetins
and Peptides Related to Bacterial Cell Wall Mucopeptide Precursors, Biochem. J., 124,
845 – 852 (1971)
(NIST webbook) http://webbook.nist.gov/cgi/cbook.cgi?ID=C253827&Mask=80#IR-Spec
(Nitanai 2009) Y. Nitanai, T. Kikuchi, K. Kakoi, S. Hanamaki, I. Fujisawa, K. Aoki,
Crystal Structures of the Complexes between Vancomycin and Cell-Wall Precursor
Analogs, J. Mol. Biol., 385, 1422 – 1432 (2009)
(Oraevsky 1995) A.A. Oraevsky, S.L. Jacques, F. Tittel: J. Appl. Phys. 78, 1281 (1995)
(Ordway 2003) Ordway D, Viveiros M, Leandro C, Bettencourt R, Almeida J, et al.,
Clinical concentrations of thioridazine kill intracellular multidrug-resistant Mycobacterium
tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother 47: 917–922 (2003)
(Palazzolo 2002) R. Palazzolo, F. Ravera, M. Ferrari and L. Liggieri, Langmuir, 18, 3592
(2002)
(Paltauf 2003) G. Paltauf, P. E. Dyer, Photomechanical Processes and Effects in Ablation,
Chem. Rev., 103, 487−518 (2003)
(Pascu 1998) Pascu M.L, Moise N, Smarandache A, Laser monitoring of pesticides in
water, SPIE 3405, pag. 1202-1214, (1998)
(Pascu 2001 a) M.L. Pascu, L. Danaila, Lasers in Neurosurgery, Editura Academiei
Romane, Bucuresti (2001)
(Pascu 2001 b) M.L. Pascu, Moise N; Staicu A, Tunable dye laser applications in
environment pollution monitoring, Journal of Molecular Structure, Vol. 598(1), pag. 57-64,
(2001);
(Pascu 2011) M. L. Pascu, V. Nastasa, A. Smarandache, A. Militaru, A. Martins, M.
138
Viveiros, M. Boni, I.R. Andrei, A. Pascu, A. Staicu, J. Molnar, S. Fanning, and L. Amaral,
“Direct Modification of Bioactive Phenothiazines by Exposure to Laser Radiation”, Recent
Patents on Anti-Infective Drug Discovery 6 (2), 147-157 (2011)
(Pascu 2013) M.L. Pascu, B. Danko, A. Martins, N. Jedlinszki, T. Alexandru, V. Nastasa,
M. Boni, A. Militaru, I. R. Andrei, A. Staicu, A. Hunyadi, S. Fanning, L.
Amaral, Exposure of Chlorpromazine to 266 nm Laser Beam Generates New Species with
Antibacterial Properties: Contributions to Development of a New Process for Drug
Discovery, PLoS ONE, 8, e55767 (2013)
(Parson 2007) Parson W.W., Modern Optical Spectroscopy – With Examples from
Biophysics and Biochemistry, Ed. Springer, New York (2007)
(Pattabhi 2002) V. Pattabhi,N. Gautham, Biophysics, Kluwer Academic Plublishers, The
Netherlands (2002)
(Pavia 2009) Pavia D.L., Lampman G.M., Kriz G.S., Vyvyan J.R., Introduction to
Spectroscopy, Fourth Edition, Ed. Brooks/Cole, Cengage Learning, USA (2009)
(Piette 1964) Piette L. H., Bulow G., Yamazaki I., Electron-Paramagnetic-Resonance
Studies of the Chlorpromazine Free Radical Formed During Enzymic Oxidation by
Peroxidase-Hydrogen Peroxide, Biochim Biophys Acta.; 88:120-9, (1964)
(Promazina 2013) http://en.wikipedia.org/wiki/Promazine
(Prometazina 2008) http://www.rxlist.com/promethazine-hcl-drug.htm
(Redondo 2005) P. Redondo, J. Cabrera, Microfoam Sclerotherapy, Seminars in Cutaneous
Medicine and Surgery (2005)
(Reynolds 1989) Reynolds P.E., Structure, Biochemistry and Mechanism of Action of
Glycopeptide Antibiotics, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., Vol. 8, No. 11, 943 – 950
(1989)
(Robinson 2005) Robinson J.W., Skelly Frame E.M., Frame II G. M., Undergraduate
instrumental Analysis, Ed. Marcel Dekker (2005)
(Rodrigues 2006) Rodrigues, T.; dos Santos, C.G.; Riposati, A.; Barbosa, L.R.S.; Di
Mascio, P.; Itri, R.; Baptista, M.S.; Nascimento, O.R.; Nantes, I.L. Photochemically
Generated Stable Cation Radical of Phenothiazine Aggregates in Mildly Acid Buffer
Solutions. J.Phys.Chem, B, Vol.110, pag. 12257-12265 (2006)
(Rohini 2009) Rohini, R.; Shanker, K.; Reddy, P.M.; Ho, Y.P.; Ravinder, V. Mono and
bis-6-arylbenzimidazo[1,2-c]quinazolines: A new class of antimicrobial agents. European
139
Journal of Medicinal Chemistry, Vol.44, pag. 3330–3339 (2009)
(Rondeau 2010) P. Rondeau, G. Navarra, F. Cacciabaudo, M. Leone, E. Bourdon, V.
Militello, Thermal aggregation of gylcated bovine serum albumin, Biochimica et
Biophysica Acta, 1804, 789–798. (2010)
(Salter 1995) Salter C.J., Mitchell R.C., Drake A.F., Infrared spectroscopic studies of
vancomycin and its interactions with N-acetyl-D-Ala-D-Ala and N,N'-diacetyl-L-Lys-D-
Ala-D-Ala, J. CHEM. SOC. PERKIN TRANS. 2, 2203 – 2211 (1995)
(Schafer 1996) Schafer M., Scheider T.R., Sheldrick G. M., Crystal structure of
vancomycin; Structure, Vol. 6, no. 12, 1509 – 1515 (1996)
(Schröder 2006) S. Schröder, J. P. Surmann, Phototoxicity testing by online irradiation and
HPLC, Anal Bioanal Chem, 386:1695–1700 (2006)
(Sereda 1994) Terrance J. Sereda, Colin T. Mant, Frank D. Sönnichsen and Robert S.
Hodges, J. of Chromatography A, 676(1), 139-153, (1994)
(Sheldrick 1978) Sheldrick GM, Jones PG, Kennard O, Williams DH, Smith GA. Structure
of Vancomycin and its complex with acetyl-D-alanyl-Dalanine, Nature, 271:223-225
(1978)
(Sigma-Aldrich 2013) http://www.sigmaaldrich.com/chemistry/solvents/dimethyl-
sulfoxide-center.html
(Silva 2004) D. Silva, C.M. Cortez, S.R.W. Louro, Spectrochim. Acta A, Vol. 60, 1215 –
1223 (2004)
(Silverstein 2005) Silverstein R.M., Webster F.X., Kiemle D.J., Spectrometric
Identification of Organic Compounds, Seventh Edition, Ed. John Wiley & Sons, Inc., USA
(2005)
(Smarandache 2010) Smarandache, A.; Trelles, M.; Pascu, M.L. Measurement of the
modifications of Polidocanol absorption spectra after exposure to NIR laser radiation. J
Optoelectronics Advanced Materials, Vol.12, Nr.9, pag. 1942 – 1945 (2010)
(Smarandache 2012 a) Smarandache A., Studiul proprietatilor optice ale poluantilor
mediului - Teza de doctorat (2012)
(Smaranache 2012 b) Smarandache, A. Laser Beams Interaction with Polidocanol Foam:
Molecular Background, Photomedicine and Laser Surgery, 30(5): 262-267 (2012)
140
(Smarandache 2012 c) Adriana Smarandache, Andra Militaru, Hakan Goker, Alexandru
Pascu, Mihail-Lucian Pascu, Laser methods for pharmaceutical pollutants removal,
Advanced Topics in Optoelectronics, Microelectronics, and Nanotechnologies VI, edited
by Paul Schiopu, Razvan Tamas, Proc. of SPIE Vol. 8411, 84111E (2012)
(Svanberg 1990) Svanberg S, Applied Laser Spectrocopy. Demtröder, W.; Inguscio, M.,
Ed. Plenum Press, New York, (1990)
(Taurand 2005) G. Taurand, "Phenothiazine and Derivatives" in Ullmann's Encyclopedia
of Industrial Chemistry, Wiley-VCH, Weinheim (2005)
(Trager 2007) Trager F., Handbook of Lasers and Optics,. Ed. Springer, New York, (2007)
(Trautwein 2012) C. Trautwein, K. Kümmerer, Degradation of the tricyclic antipsychotic
drug chlorpromazine under environmental conditions, identification of its main aquatic
biotic and abiotic transformation products by LC–MS and their effects on environmental
bacteria, Journal of Chromatography B, 889–890, 24–38 (2012)
(Trelles 2010) Trelles, M.A., Weiss, R., Moreno–Moraga, J., Romero, C., Velez, M., and
Perez, X., Treatment of legs veins with combined pulsed dye and Nd:YAD lasers: 60
patients as- sessed at 6 months. Lasers Surg. Med. 42, 609–614. (2010)
(Tugulea 2003) L. Tugulea, D. Gazdaru, Tehnici si metode experimentale in Biofizica, Ed.
Universitatii din Bucuresti, Bucuresti (2003)
(Valeur 2001) B. Valeur, Molecular Fluorescence. Principles and Applications, Ed. Wiley
– VCH Verlag, Weinheim (2001)
(Van Bambeke 2006) Van Bambeke F. Glycopeptides and glycodepsipeptides in clinical
development: A comparative review of their antibacterial spectrum, pharmacokinetics and
clinical efficacy, Curr Opin Investig Drugs., Aug; 7(8):740-9. (2006)
(Venyaminov 1990) Venyaminov S.Y., Kalnin N.N., Quantitative IR Spectrophotometry
of Peptide Compounds in Water (H2O) Solutions. 1. Spectral Parameters of Amino Acid
Residue Absorption Bands, Biopolymers, Vol. 30, 1243-1257 (1990)
(Viveiros 2005) Viveiros M, Martins M, Couto I, Kristiansen JE, Molnar J, et al., The in
vitro activity of phenothiazines against Mycobacterium avium: potential of thioridazine for
therapy of the co-infected AIDS patient. In Vivo 19: 733–736, (2005)
(Wang 2013) D. Wang, F. Gao, Quinazoline derivatives: synthesis and bioactivities,
Chemistry Central Journal, 7:95 doi:10.1186/1752-153X-7-95 (2013)
(Watanakunakorn 1984) C. Watanakunakorn. Mode of action and in-vitro activity of
141
vancomycin, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 14, Suppl. D, 7-1 (1984)
(Zwietering 1990) Zwietering M H, Jongenburger I, Rombouts F M, van 'T Riet
K. "Modeling of the Bacterial Growth Curve". Applied and Environmental
Microbiology 56 (6): 1875–1881 (1990)
142
Anexa 1
Lista lucrarilor publicate
- cu A.I. conform www.eigenfactor.org
1. M.L. Pascu, B. Danko, A. Martins, N. Jedlinszki, T. Alexandru, V. Nastasa, M.
Boni, A. Militaru, I. R. Andrei, A. Staicu, A. Hunyadi, S. Fanning, L.
Amaral, Exposure of Chlorpromazine to 266 nm Laser Beam Generates New
Species with Antibacterial Properties: Contributions to Development of a New
Process for Drug Discovery, PLoS ONE, 8, e55767 (2013) (AI: 1,7984)
2. Armada AM, Alexandru T, Machado D, Danko B, Hunyadi A, Dinache A, Nastasa
V, Boni M, Ramos J, Viveiros M, Molnar J, Pascu ML, Amaral L. The In Vitro
Activityof Products Formed from Exposure of Chlorpromazine to a 266nm LASER
Beam Against Species of Mycobacteria of Human Interest. In Vivo; 27(5):605-10.
(2013) (AI: 0,2471)
3. T. Alexandru, A. Armada, B. Danko, A. Hunyadi, A. Militaru, M. Boni, V.
Nastasa, A. Martins, M. Viveiros, M.L. Pascu, J. Molnar, L. Amaral, Biological
Evaluation of Products Formed from the Irradiation of Chlorpromazine with a 266
nm Laser Beam, Biochemistry & Pharmacology, 2, 109 (2013)
4. A. Dinache, M. Boni, M.L. Pascu, Phenothiazine Derivatives Interaction with
Laser Radiation, Romanian Reports in Physics, Vol. 65, No. 3, 1078 – 1091 (2013)
(AI: 0,1493)
5. Hunyadi, A.; Danko, B.; Boni, M.; Militaru, A.; Alexandru, T.; Nastasa, V.;
Andrei, I. R.; Pascu, M.L.; Amaral, L.;"Rapid, Laser-Induced Conversion of 20-
Hydroxyecdysone and its Diacetonide - Experimental Set-up of a System for
Photochemical Transformation of Bioactive Substances"; Anticancer Research, 32
(4), 1291 – 1297 (2012) (AI: 0,406)
6. Boni, M.; Nastasa, V.; Militaru, A.; Smarandache, A.;Andrei, I.R.; Staicu, A.;
Pascu, M.L.; "Laser beams interaction with liquids in optofluidic experiments";
Romanian Reports in Physics, 64(S), 1179-1194 (2012) (AI: 0,1493)
7. A. Smarandache, A. Militaru, H. Goker, A. Pascu, M. L. Pascu; "Laser methods
for pharmaceutical pollutants removal"; Proc. SPIE 8411, (2012)
8. A. Militaru, A. Smarandache, A. Mahamoud, S. Alibert, J.M. Pagès, M.L. Pascu,
"Time stability studies of quinazoline derivative designed to fight drug resistance
143
acquired by bacteria", Letters in Drug Design & Discovery 8 (2), 124-129 (2011)
(AI: 0,1403)
9. A. Militaru, A. Smarandache, M.L. Pascu &al., “Stability characterization of
quinazoline derivative BG1188 by optical methods”, AIP Conf. Proc. 1364, 117,
(2011);
10. M. L. Pascu, V. Nastasa, A. Smarandache, A. Militaru, A. Martins, M. Viveiros,
M. Boni, I.R. Andrei, A. Pascu, A. Staicu, J. Molnar, S. Fanning, and L. Amaral,
“Direct Modification of Bioactive Phenothiazines by Exposure to Laser Radiation”,
Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery 6 (2), 147-157 (2011)
11. Chevalier, J.; Mahamoud, A.; Baitiche, M.; Adam, E.; Viveiros, M.; Smarandache,
A.; Militaru, A.; Pascu, M.L.; Amaral, L.; Pagès, J.M., Quinazoline derivatives are
efficient chemosensitizers of antibioticactivity in Enterobacter aerogenes,
Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa resistant strains, Int. J.
Antimicrob Agents, 36, 164-168 (2010) (AI: 1,0459)
Total A.I.: 3.9363
144
Anexa 2
Lista comunicarilor la conferinte internationale
Lucrari invitate
1. Smarandache A., Militaru A., Goker H., Pascu A., Pascu M.L.; "Laser Methods
for Pharmaceutical Pollutants Removal"; ATOM-N 2012, Constanta, Romania,
august 2012
2. G. Popescu, A.Smarandache, A.Militaru, M.L.Pascu, In silico modeling and
analysis of EPI activity of laser irradiated drugs, 6th Management Committee
Meeting and WGs meeting COST Action BM0701– 6-7 December, Bruxelles,
Belgium
3. M.L. Pascu, A.Smarandache, J.Kristiansen, A.Militaru, V. Nastasa, L. Amaral,
Phenothiazines molecular modifications at interaction with modifications at
interaction with laser beams, LASER FLORENCE 2011, Florence, 3-6 november
2011
4. M.L. Pascu, L. Amaral, V.Nastasa, A. Militaru, A. Smarandache, “Improvement
of phenothiazines efficiency on MDR bacteria, after exposure to laser radiation”,
Laser Florence 2010, Florence, Italy, 5-6 Noiembrie 2010
5. M.L. Pascu. A. Staicu, V. Nastasa, A. Militaru, Pascu A., Andrei I.R., Boni M.,
Costache M., Pages J.M., Barbe J., Alibert S., Mahamoud A., Ferrari M., Rao S.,
Liggieri L., Amaral L., “Laser and Optical Techniques Used to Modify Molecular
Structures of Medicines”, Progress in studies on ABC transport inhibition
Symposium at Chemical Research Center, Academia de Stiinte din Ungaria,
Budapesta, Aprilie 2010
Prezentari orale
1. Dinache A., M. Boni, M. Martins, M. P. McCusker, V. Nastasa, S. Fanning, M.L.
Pascu, Spectroscopic studies and applications of laser exposed drugs; Conferinta
Internationala “Modern Laser Applications - INDLAS 2013 “ - International
Student Conference on Photonics (ISCP), Bran, Romania, mai 2013
2. A.Stoicu, E. Radu, V. Nastasa, A. Dinache, T. Alexandru, M. Boni, G. Popescu, A.
Staicu, M.L. Pascu, Spectrochemical Study about the Photoreaction Products
Obtained by Chlorpromazine Exposure to UV Laser Beam; Conferinta
Internationala “Modern Laser Applications - INDLAS 2013 “ - International
Student Conference on Photonics (ISCP), Bran, Romania, mai 2013
3. A. Militaru, S. Fanning, M. Martins, M. McCusker, V. Nastasa, C. Hansen, P.
Guiry, M L Pascu; "Interaction of medicines modified by exposure to laser
radiation with bacteria"; Exploratory Workshop 2012 „Emerging Analytical to
Investigate Nitro-oxidative Stress, Romania, iulie 2012
4. T. Alexandru, M. L. Pascu, B. Danko, V. Nastasa, M. Boni, A. Militaru, I. R.
Andrei, A. Staicu, A. Hunyadi, S. Fanning, L. Amaral, "Exposure of
145
Chlorpromazine to 266 nm laser beam generates new species with antibacterial
properties", International Student Conference on Photonics, Sinaia, Romania, mai
2012
5. M. L. Pascu, V. Nastasa, M. Boni, T. Alexandru, A. Smarandache, A. Militaru;
"Laser methods used to fight the multiple drug resistance (MDR) developed by
bacteria"; Exploratory Workshop 2012 „Emerging Analytical to Investigate Nitro-
oxidative Stress, Bucuresti, Romania, iulie 2012
6. T. Alexadru, M. L. Pascu, A. Armada, B. Danko, V. Nastasa, M. Boni, A.
Militaru, I. R. Andrei, A. Staicu, A. Hunyadi, M. Viveiros, L.Amaral; "Activity of
irradiated Chlorpromazine with a 266 nm laser beam against efflux pumps system";
Exploratory Workshop 2012 „Emerging Analytical to Investigate Nitro-oxidative
Stress, Bucuresti, Romania, iulie 2012
7. T. Alexandru, A. Hunyadi, B. Danko, M. Boni, A. Militaru, V. Nastasa,
"Molecular Modifications of 20-Hydroxyecdysone by Exposure to Laser Beams";
International Conference "Advanced Topics in Optoelectronics, Microelectronics
and Nanotechnologies", Constanta, Romania, august 2012
8. A. Militaru (Dinache), M. Martins, M. P. McCusker, T. Alexandru, V. Nastasa,
M. Boni, S. Fanning, M. L. Pascu; "Laser modified medicines: new alternatives in
fighting MDR bacteria"; International Conference on Antimicrobial Research -
ICAR2012, Lisabona, Portugalia, noiembrie 2012
9. M.L. Pascu, A. Militaru, M. Boni, T. Alexandru, V. Nastasa, I. R. Andrei; "Laser
Methods Used to Fight Multiple Drug Resistance to Treatment"; Laser Florence
2012, Florenta, Italia, nov. 2012
10. A. Militaru, “Efficiency Studies of Phenothiazines and Other Medicines Modified
by Exposure to Laser Radiation”, 6th Management Committee Meeting and WGs
meeting COST Action BM0701– 6-7 December 2011, Bruxelles, Belgium
11. V. Nastasa, A. Militaru, L. Amaral, M.L. Pascu, “Molecular modifications of
chlorpromazine prepared as solution in micro-droplets form by exposure to laser
radiation”, International Student Workshop on Laser Applications 2011, Bran,
Romania, 31 Mai- 4 Iunie, 2011
12. A. Smarandache, A. Militaru, V. Nastasa, J. Kristiansen, M.L. Pascu, “Studies of
the spectral properties of Phenothiazines”, International Student Workshop on
Laser Applications 2011, Bran, Iunie2011
13. A.Militaru, A. Smarandache, L. Frunza, J.M. Pagès and M.L. Pascu, “Stability
properties of medicines solutions: spectral evidence and wire-like formations”,
International Student Workshop on Laser Applications 2011, Bran, 31 Mai- 4 Iunie,
2011
Postere
1. A. Dinache, V. Nastasa, M.L. Pascu, Generation of foams in Vancomycin HCl by
exposure to laser radiation; Conferinta COST MP1106 si la „Workshop Smart and
Green Interfaces”, Praga, Republica Ceha, martie 2013
146
2. T. Alexandru, M. L. Pascu, B. Danko, V. Nastasa, M. Boni, A. Militaru, I. R.
Andrei, A. Staicu, A. Hunyadi, A. Armada, M. Viveiros, L. Amaral; "Generation
and biological evaluation of the products formed from the exposure of
Chlorpromazine to a 266 nm laser beam"; International Conference "Micro- to
Nano-Photonics III- ROMOPTO 2012, Bucuresti, Romania, septembrie 2012
3. A. Militaru (Dinache), A. Smarandache, S. Alibert, A. Mahamoud , V. Damian,
M. Filipescu, L. Frunza, J. M. Pagès, M. L. Pascu; "Quinazoline derivatives
designed as antimicrobials: spectroscopic studies and microscopy evidence of
micro-aggregates formation", International Conference on Antimicrobial Research -
ICAR2012, Lisabona, Portugalia, noiembrie 2012
4. A. Militaru, S. Alibert, A. Mahamoud, V. Damian, M. Filipescu, M. Enculescu, J.
M. Pagès, M. L. Pascu, “Studies on molecular aggregates in quinazoline derivatives
solutions by exploring methods”, International Student Workshop on Laser
Applications 2011, Bran, 31 Mai- 4 Iunie, 2011
5. M.L. Pascu, V. Nastasa, A. Militaru, A. Staicu, A. Smarandache, S. Fanning, L.
Amaral, “Fighting Multiple Drug Resistance of bacteria by treatment with
Chlorpromazine modified by exposure to laser radiation”, EOSOF 2011, May,
Muenchen,2011
6. A. Militaru, A. Smarandache, V. Nastasa, A. Mahamoud, V. Damian, N. Popescu-
Pogrion, S. Alibert, F. Vasiliu, J.M. Pages, M.L. Pascu, “Stability characterization
of quinazoline derivative BG1188 by optical methods”, Laser Florence 2010, 5-6
Noiembrie 2010, Florence, Italy
Lista prezentarilor orale la conferinte nationale
1. A. Dinache, M. Boni, M. Martins, M. P. McCusker, V. Nastasa, S. Fanning si M.L.
Pascu, “Antibacterial activity and spectroscopic analysis of laser modified drugs”,
Sesiunea Anuala de comunicari stiintifice a Facultatii de Fizica, Bucuresti, iunie
2013
2. Militaru, A.; Smarandache, A.; Mahamoud, A.; Damian, V.; Alibert, S.; Pagès,
J.M.; Pascu, M.L. Optical characterization of quinazoline derivatives stability.
Sesiunea Anuala de Cominicari Stiintifice a Facultatii de Fizica, Bucuresti,
Romania, iunie 2010
147
Anexa 3
Listarea in extenso a lucrarilor publicate la care
sunt prim-autor
Romanian Reports in Physics, Vol. 65, No. 3, P. 1078–1091, 2013
Dedicated to Professor Valentin I. Vlad’s 70th Anniversary
PHENOTHIAZINE DERIVATIVES INTERACTION WITH LASER RADIATION
ANDRA DINACHE1,2, M. BONI1,2, M.L. PASCU1,2,* 1 National Institute for Laser, Plasma and Radiation Physics, Romania
2 University of Bucharest, Faculty of Physics, Romania *E-mail: [email protected]
Received June 24, 2013
Abstract. Phenothiazine derivatives are sensitive to light, especially to UV radiation. Chlorpromazine (CPZ) and Promazine (PZ) solutions in ultrapure water were exposed to 266 nm laser radiation in order to modify their structure and to obtain new species active against multidrug resistant bacteria. Modifications of the UV-Vis absorption spectra of the solutions indicate changes of the molecules. During irradiation, CPZ molecules are modified gradually. The energy absorbed during irradiation was measured. The maximum amount of CPZ molecules that could absorb the energy in order to break each type of bond in the CPZ molecule (C–Cl, C–H, C–C, C–N and C–S) was calculated. A general qualitative picture of the effects of laser radiation on CPZ and PZ is made. Key words: phenothiazine, chlorpromazine, CPZ, promazine, PZ, laser irradiation,
UV-Vis absorption spectroscopy, bond dissociation energy.
1. INTRODUCTION
Exposure of medicines at ultraviolet (UV) and/or visible (Vis) radiation may modify the structure of the molecules and yield new compounds. Most molecules that are of biological interest absorb in the UV region of the spectra [1]. Compared to incoherent sources, when it comes to expose medicine molecules to light beams, the lasers offer the advantage of specific wavelength, very low beam bandwidth and much higher beam energy.
Studies have shown that several medicines from different classes were modified when exposed to light sources, especially to UV radiation.
The cytostatic activity on an in vivo experimental model of 5-Fluorouracil (5-FU) was enhanced under the influence of UV-Vis radiation. 5-FU solutions were exposed to a Hg lamp (emission spectral range: 300–600 nm) and N2 laser (wavelength: 337.1 nm) and then applied on rabbit pseudotumour eye tissues, with measurable results. Similar results were obtained in the case of Methotrexate (MTX). Both medicines acted as photosensitizers [2, 3].
2 Phenothiazine derivatives interaction with laser radiation 1079
Another study reports an improvement of the effect of Polidocanol, (that is a pharmaceutical active ingredient of commercially available Aethoxysklerol 2%, used in sclerotherapy), if the medicine is injected as foam in a varicose tissue and if the so impregnated tissue is exposed to 1.06 µm laser beam [4,5].
An enhancement of the bioactivity of medicines may be possible in the case of some molecules if they are exposed to laser radiation outside the biological targets, i.e. not necessarily in cells, bacteria or tissues impregnated from the beginning with the photosensitive medicine. In other words, we may expose to laser radiation the solutions of medicines, modify the medicines molecules and apply them on the biological targets studying the results of their action. This may be more effective on eye pseudotumour tissues than the exposure to laser radiation of the tissue impregnated with the unirradiated medicine [4,5].
In another case, two ecdysteroids, equivalent with the insect molting hormone, were considered promising candidates for photo-transformation by exposure to a 266nm laser radiation [6].
As for the phenothiazine derivatives, laser irradiation of medicines solutions was proposed as a method of generating new species active against multidrug resistant bacteria [7,8]. In this case, the antibacterial activity of the Chlorpromazine (CPZ) solutions exposed at 266nm laser beam was evaluated against several Gram-positive and Gram-negative bacterial strains. The activity of the products of irradiation against Staphylococcus aureus and Escherichia coli strains was enhanced, but the activity against Salmonella enterica serovar Enteritidis was slight [9].
Studies were performed in order to identify the modifications that arise in phenothiazines molecules during exposure to laser radiation.
In [7], the structural changes of CPZ induced by 266nm laser radiation were investigated and several irradiation products were identified as Promazine (PZ), hydroxypromazine or PZ sulfoxide, hydroxypromazine sulfoxide, CPZ and CPZ sulfoxide. Correlated with the results reported in [7], this paper constitutes a first step in elucidating the interaction mechanisms of the phenothiazine derivatives molecules with the laser radiation.
2. MATERIALS AND METHODS
The phenothiazine derivatives utilized in this study are CPZ and PZ, both medicines being normally used as neuroleptics. According to previous literature reports, they are photosensitive and may produce phototoxic and/or photoallergic reactions to patients [10, 11, 12].
CPZ and PZ are both in hydrochloride form and, for our studies, were purchased from Sigma-Aldrich as biological grade powders (purity over 98%). The chemical formulas of CPZ and PZ are C17H19ClN2S and C17H20N2S, respectively.
Andra Dinache, M. Boni, M.L. Pascu 3 1080
The chemical structures of CPZ (Fig. 1a) and PZ (Fig. 1b) are similar, the only difference being in CPZ a chlorine atom (represented with green color) attached to the tricyclic phenothiazine part of the molecule. In Fig. 1, the carbon atoms are represented with grey color, nitrogen atoms with blue, sulfur atoms with yellow and hydrogen atoms with white color.
Fig. 1 – Chemical structures of: a) CPZ; b) PZ.
The solutions of CPZ and PZ were prepared at a concentration of 10-4M in ultrapure deionized water immediately before the irradiation. This concentration was chosen after recording the absorption spectra at different concentrations of CPZ and PZ. At 10-4M the absorption signal is not saturated and the shape of the absorption spectra could be clearly analyzed. On the other hand, the concentration of 10-4M is below the critical micelle concentration (cmc) or the concentration at which the polymerization takes place; in this way, in each solution only phenothiazine monomers were present [7, 13, 14]. To avoid measuring errors due to photosensitive properties of the CPZ or PZ, the vials containing the solutions were protected from light.
The ultrapure deionized water was obtained via a sterile filter (TKA Pacific UP/UPW6) and TKA Genpure ultra-pure water system accessory. Its bacterial content is <1CFU/ml, the particle content <1 particle/ml at a resistivity of 18.2MΩ×cm and 0.055µS/cm conductivity, at 25°C.
The experimental set-up used for exposing the samples to laser radiation is described in Fig. 2.
Volumes of 2ml of CPZ or PZ solutions were exposed to laser radiation for 2 hours, in a cuvette having 10mm width. The wavelength of the radiation is 266nm, which is the fourth harmonic of a Nd:YAG laser radiation emitted at 1.064µm. Laser pulses repetition rate is 10pps and the full time width of the pulse
4 Phenothiazine derivatives interaction with laser radiation 1081
is 10ns. The average energy of the laser radiation was 6.5mJ, so that at the concentration of 10-4M the beam was not entirely absorbed by the sample, as observed experimentally. A second powermeter was placed after the cuvette in order to measure the value of the energy that is transmitted through the sample.
Fig. 2 – Experimental set-up used for irradiation of the phenothiazines.
A magnetic bar was inserted in the cuvette and the laser beam was focused above it; the cuvette was placed on a magnetic stirrer to ensure a continuous stirring during the irradiation time interval (two hours) of 600 revolutions per minute.
Before and after the irradiation the absorption spectra of the phenothiazines solutions were measured using a Perkin Elmer Lambda 950 UV/Vis/NIR spectrophotometer, with an error bar of ± 0.004%. The thickness of the optical cells used for absorption spectra measurements was 1 mm.
3. RESULTS AND DISCUSSIONS
Since the phenothiazine derivatives CPZ and PZ are photosensitive drugs their absorption spectra were recorded to identify the appropriate wavelength to be used for exposure to laser beams.
In Fig. 3 are displayed the absorption spectra of two CPZ 10-4M solutions in ultrapure deionized water: first unirradiated, recorded immediately after preparation, and the second, the spectrum of the solution exposed for 2 hours at 266nm laser radiation, with an average energy of 6.5mJ.
The absorption spectrum of unirradiated CPZ 10-4M in ultrapure deionized water solution recorded immediately after preparation presents three absorption bands: a partially resolved band below 205nm, that may originate from the atmospheric oxygen, and bands at 254nm and 307nm, respectively.
Andra Dinache, M. Boni, M.L. Pascu 5 1082
Fig. 3 – Absorption spectra of CPZ 10-4M solutions in ultrapure water before
and after exposure to laser radiation.
The absorption peak at 254nm is probably due to a π – π* transition, because its high molar absorptivity. Also, the relative broad absorption band at 307nm is most likely a result of a n – π* transition, having a low molar absorptivity.
The modifications induced by exposure to laser radiation are obvious from the absorption spectrum recorded after 2 hours of irradiation.
The shape of the spectra is totally modified and the absorption bands are no longer visible. The value of the absorbance at 254nm decreased after irradiation from 0.329 to 0.097. In the case of the broader peak at 307nm, the absorbance value increased from 0.041 to 0.061, but the band cannot be differentiated, probably because the CPZ molecules are separated in smaller fragments that have large absorption bands with low absorbance in the same spectral range.
The absorption spectra of PZ 10-4M solutions in ultrapure deionized water recorded before and after exposure to laser beam are shown in Fig. 4.
The irradiation conditions were identical with those in the previous experiment; the sample was irradiated for 2 hours at 266nm. The energy of the laser beam was 6.5mJ.
Because the structures of CPZ and PZ are very similar, the UV-Vis absorption spectra of the two molecules are almost identical.
The absorption spectrum of the unirradiated PZ 10-4M solution in ultrapure water has the general shape similar to the CPZ absorption spectrum; the partially resolved band originating from the oxygen is present below 205nm, but the absorbance maxima of the two bands are at 252nm and 301nm.
6 Phenothiazine derivatives interaction with laser radiation 1083
Fig. 4 – Absorption spectra of PZ 10-4M solutions in ultrapure water before
and after exposure to laser radiation.
As in the case of CPZ, the narrow peak with high molar absorptivity at 252nm is due to a π – π* transition and the broad peak, but with a low molar absorptivity, at 301nm, is due to a n – π* transition.
During irradiation, the structure of the PZ molecules is modified so that, after 2 hours of laser exposure, the absorption bands are no longer visible, most likely because the fragments formed have large absorption bands with low absorbance. The absorbance at 252nm decreased after exposure to laser radiation from 0.324 to 0.105 and for the peak at 301nm, the absorbance value increased from 0.039 to 0.066.
The changes that appear in the absorption spectra of the irradiated CPZ and PZ are in agreement with the data reported in [7] and the production of promazyl radical and of sulfoxides is likely. The exposure to laser radiation may produce changes in the phenothiazines molecular structure and may affect the S0 → S1 and S0 → Sn transitions, as suggested for Thioridazine (TZ) in [15].
In [7], attempts were made to identify the products yielded during irradiation. PZ, hydroxypromazine or PZ sulfoxide, hydroxypromazine sulfoxide, CPZ and CPZ sulfoxide were identified, but the presence of other 200 unidentified compounds was noticed. Some mechanisms of modification were proposed, but the processes of interaction of laser radiation with the molecules in solution have not been fully clarified, yet.
The conditions of irradiation were chosen so that, at the concentration of 10-4 M, the average energy of the laser beam (6.5mJ) is not totally absorbed by the sample. A volume of 2ml of solution is placed in a cuvette of 1cm width.
Andra Dinache, M. Boni, M.L. Pascu 7 1084
For the CPZ 10-4M solution, the energy absorbed during irradiation decays exponentially, as shown in Fig. 5.
Fig. 5 – Energy absorption by a CPZ 10-4M solution during 2 hours exposure.
The average energy absorbed by the CPZ sample measured at 5 minutes after starting the irradiation was 5.846 mJ and it decreased to 5.447 mJ at the end of 2 hours of irradiation.
The volume of solution in the cuvette that is crossed by the laser beam is, considering the diameter of the laser beam 5mm and the optical length 10mm, 196.25µl. At the given concentration, in this volume, we have 196.25×10-10 moles of CPZ and consequently, the number of CPZ molecules in this volume is 11.81845×1015.
The solution in the cuvette was stirred during irradiation at 10 rotations per second and the laser pulse repetition rate was 10 pulses per second (100ms time interval between two successive pulses). According to our observations, due to the solution viscosity, the liquid agitation produced by stirring was not transmitted to its free surface in the spectrophotometer cell where the interaction with the laser beam was produced. Though, the solution was rotated so that within its volume practically all the molecules crossed the laser beam path and were placed in the conditions to interact with the laser beam photons. On the other hand, the Brownian motion and the tendency of molecules to migrate to regions with lower concentration at room temperature is a known process which leads to molecules
8 Phenothiazine derivatives interaction with laser radiation 1085
mixture in the liquid. It is the CPZ molecules case as well, since the molecules dissociate after interaction with the laser beam and their concentration decreases with the increasing of the exposure time to the laser beam. So, it is to be expected that CPZ molecules have the tendency of migrating in the liquid volume (i.e. the cylinder) directly exposed to the laser radiation. At the speed of the CPZ molecules produced by the Brownian movement, it would take more than 109 seconds for a molecule to cross the diagonal of the cylinder described by the intersection of the laser beam with the cuvette. This is very long time with respect to the laser pulse lifetime (10ns) as well as with respect to the time interval of 100ms between two successive laser pulses. For this reason we assume that the speed of the molecules in the laser beam volume is equal to the speed of the stirring magnet and that during 10ns there is not a significant diffusion of new CPZ molecules in the volume of the laser beam. Even more, we consider that for the entire duration of one rotation (one full rotation of the magnet takes 100ms at 600 rotations per minute) we have only one laser pulse that interacts with 196.25×10-10 moles of CPZ (the pulse repetition rate is 10 pps).
The average measured energy absorbed after 5 minutes was 5.846 mJ. Consequently, the corresponding average energy absorbed by the total moles of CPZ in the volume of the laser beam was 297.885 kJ mol-1. At the end of 2 hours of irradiation, the average energy absorbed by the total moles of CPZ was 277.554 kJ mol-1.
For the structural changes of molecules to be induced by 266nm laser radiation as described in [7] the energy absorbed must be at least equal to the bond-dissociation energy for each bond involved. For example, a first product identified in a large quantity in the irradiated CPZ solutions is PZ. For the CPZ molecule to be transformed in a PZ molecule it is necessary for the C–Cl bond to break. For this to happen, the energy absorbed by the CPZ molecule must be at least equal to the bond-dissociation energy (BDE) for the C-Cl bond.
The bond-dissociation energy is equal to the enthalpy change that appears at a bond cleavage and it depends on the structure of the molecule. BDE is usually calculated at standard pressure and at the temperature of 298 K [16, 17].
In general, the BDE values for C–Cl vary function of the type of molecule and in the case of substituted aromatic compounds the value also varies with positioning of the chlorine atom with respect to the radical. The BDE value for Cl–CH3 (chloromethane) is 350 kJ mol-1; for the substituted chlorobenzene, C–Cl BDE varies with the position of the radical from 376 kJ mol-1 to 399 kJ mol-1. Due to the similarity with the CPZ molecules we have chosen in our case an average BDE for C–Cl of 385 kJ mol-1.
For other dissociations to happen we need to consider the BDE for the other type of bonds in the CPZ molecules, like C–H, C–C, C–N and C–S. The considerations regarding BDE variations apply for these bonds as for the C–Cl bond.
Andra Dinache, M. Boni, M.L. Pascu 9 1086
The BDE for C–H in methane is 439 kJ mol-1, in pyridine ring 468 kJ mol-1 and in a substituted pyridine ring it is 362, 365 or 378 kJ mol-1, function of the position of the radical. Considering these values we have chosen for the calculations in this paper the BDE average value of 400 kJ mol-1.
For the C–C bond, the BDE in ethane is 377 kJ mol-1, and in methylbenzene BDE equals 426 kJ mol-1. In biphenyl the C–C bond enthalpy is 478 kJ mol-1 and the energy required to break a radical from a pyridine ring is between 362 kJ mol-1 and 433 kJ mol-1, given the positioning of the radical on the phenyl ring. Taking into account the similarities with the CPZ molecule, we selected a value of 430 kJ mol-1.
For a substituted nitrobenzene, the BDE for C–N bond ranges between 276–302 kJ mol-1. For a phenyl methylamine C–N BDE is 420 kJ mol-1 and for a phenyl dimethylamine is 390 kJ mol-1. Taking into account the positioning of the C–N bonds in the CPZ molecules we considered for further calculations a lower value for BDE, namely 300 kJ mol-1.
The S–C bond has different enthalpy values for different molecules for the same reasons as mentioned above. In diphenyl sulfide, BDE is 327 kJ mol-1 and in benzenethiol it is 362 kJ mol-1, but for methanethiol the enthalpy is 312 kJ mol-1. A mean value of BDE was chosen for the S–C bond, in our case 330 kJ mol-1 [17].
The average energy absorbed by the CPZ molecules divided to the number of moles present in the area of the cuvette crossed by the laser radiation is at any time lower than any bond dissociation energy in the molecule. Considering this and the fact that modifications occur (bond break and new compounds are formed during irradiation, as shown by the absorption spectra) it results that the energy is not absorbed by all the molecules present in the interaction volume during one laser pulse, which is in agreement with the quantum mechanics approach of these processes.
The maximum number of moles that absorb during one pulse in order to break a bond is:
BDEEN = ,
where N is the number of moles in the considered volume, E is the average absorbed energy and BDE is the bond dissociation energy.
Further, one may find out the maximum number of molecules in the considered volume that absorb the energy so that a bond is dissociated, according to the equation:
An N N= × , where n is the number of molecules and NA is Avogadro’s number.
The values obtained for the maximum number of CPZ molecules in the area of the cuvette crossed by the laser beam that absorb the amount of energy needed to break each type of bond during different time intervals are given in Table 1.
10 Phenothiazine derivatives interaction with laser radiation 1087
Table 1
Maximum number of CPZ molecules that could absorb the energy needed to break different types of bonds
Time (min)
E ×10-6 (kJ)
n for C-Cl to break ×1015 (molecules)
n for C-H to break ×1015 (molecules)
n for C-C to break ×1015 (molecules)
n for C- N to break ×1015 (molecules)
n for C-S to break ×1015 (molecules)
5 5.846 9.14427 8.80136 8.18731 11.7351 10.6683 15 5.731 8.96439 8.62822 8.02625 11.5043 10.4585 30 5.658 8.8502 8.51832 7.92402 11.3578 10.3252 45 5.62 8.79076 8.46111 7.8708 11.2815 10.2559 60 5.584 8.73445 8.40691 7.82038 11.2092 10.1902 75 5.55 8.68127 8.35572 7.77276 11.141 10.1281 90 5.52 8.63434 8.31056 7.73075 11.0807 10.0734 105 5.494 8.59367 8.27141 7.69434 11.0285 10.026 120 5.447 8.52016 8.20065 7.62851 10.9342 9.94018
The second column in Table 1 represents the amount of energy absorbed by
the CPZ molecules recorded at different times of irradiation. The total number of molecules present in the volume of solution crossed by the laser radiation is 11.8185×1015. In columns 3 – 7 are listed the values for the maximum possible number of molecules that could absorb in order to break each type of bond present in a CPZ molecule: C–Cl, C–H, C–C, C–N and, C–S, respectively. These values were calculated considering the bond dissociation energies: 385 kJ mol-1 for C–Cl bond, 400 kJ mol-1 for C–H bond, 430 kJ mol-1 for C–C bond, 300 kJ mol-1 for C–N bond, and 330 kJ mol-1 for C–S bond. The maximum number of absorbing molecules was calculated considering that for the duration of one pulse occurs the dissociation of only one type of bond.
The behavior of the maximum number of molecules that could absorb the energy of the laser pulse in order to dissociate the C–Cl bond is given in Fig. 6 for the entire duration of irradiation, computed from the measurements of the energy absorbed by the solution at different irradiation times. An exponential decrease of the number of molecules is observed from 9.14427×1015 to 8.52016×1015 molecules. These values depend on the amount of energy absorbed during irradiation.
The same exponential decrease is observed also for all other types of bonds in the CPZ molecule based on the measured absorbed energy, only.
This continuous decrease of absorbing molecules number is an indicator of the fact that the number of the initial CPZ molecules present in the irradiated volume is decreasing with the increasing of the exposure time. This was evidenced in [7] through chromatography methods, when the amount of CPZ disappeared after 30 minutes of irradiation and new species were formed, some of them being identified.
Andra Dinache, M. Boni, M.L. Pascu 11 1088
Fig. 6 – Maximum number of molecules that could absorb the energy of the laser pulse in order to
dissociate the C–Cl bond during 2 hours of irradiation.
The energy of the photons was calculated according to:
photonh cE ×
=λ
,
where Ephoton represents the energy of one photon, h is Planck’s constant (6.62606957 ×10-34 J s), c is the speed of light in air (2.99792458 ×108 m/s) and λ is the wavelength of the laser radiation (266 nm).
The number of photons (nph) absorbed by the CPZ 10-4M solution at different times during irradiation is given in Table 2.
The order of magnitude of the number of photons absorbed by CPZ 10-4M samples is in the same range as the maximum number of molecules that absorb the energy of the laser radiation in order to dissociate a bond.
Table 2
Number of photons absorbed in a CPZ 10-4M solution at different times of irradiation
Time (min)
E (mJ)
Ephoton (mJ)
nph (photons)
5 5.846 0.7472 ×10-15 7.8238 ×1015 15 5.731 0.7472 ×10-15 7.6699 ×1015 30 5.658 0.7472 ×10-15 7.5722 ×1015
12 Phenothiazine derivatives interaction with laser radiation 1089
Table 2 (continued)
45 5.62 0.7472 ×10-15 7.5214 ×1015 60 5.584 0.7472 ×10-15 7.4732 ×1015 75 5.55 0.7472 ×10-15 7.4277 ×1015 90 5.52 0.7472 ×10-15 7.3875 ×1015
105 5.494 0.7472 ×10-15 7.3527 ×1015 120 5.447 0.7472 ×10-15 7.2898 ×1015
This would be a good explanation for the gradual decrease of the CPZ
molecule number and the gradual production of the new species in irradiated solutions, if one considers that the probability that a CPZ molecule to absorb laser photons and further to dissociate is very far from unit.
Modifications during exposure to laser radiation occur in the PZ 10-4M solutions and the same behavior was observed for the CPZ molecules, as well. The energy absorbed by the molecules present in the solution during 2 hours of irradiation decreased in exponential manner, as well. Regarding the fact that the only difference between the CPZ and PZ molecule is a chlorine atom, implicit the lack of a C–Cl bond, the same calculations could be applied for PZ molecules considering the same values for the bond dissociation energies and the values recorded for the energy absorbed in the PZ solution during irradiation.
4. CONCLUSIONS
Phenothiazine derivatives CPZ and PZ solutions in ultrapure water are modified during exposure to 266nm laser radiation and the UV-Vis absorption spectra of the solutions are an indicator of these changes.
In this paper some semi-quantitative theoretical considerations were developed in order to calculate the maximum amount of molecules that absorb the laser pulse energy for these modifications to occur. The maximum amount of CPZ molecules that could absorb the energy for each type of bond in the CPZ molecule (C–Cl, C–H, C–C, C–N and, C–S) to break was calculated. The number of photons absorbed in CPZ 10-4M solutions in ultrapure water was calculated at different times of irradiation.
The results show that at the utilized energies of the laser beam and at the CPZ and PZ working concentrations, one may describe quite exactly the evolution (decreasing) of the number of phenothiazine molecules which are modified by exposure to laser radiation. This is in agreement with literature reports showing these numbers evolution by TLC, HPLC, etc methods.
Andra Dinache, M. Boni, M.L. Pascu 13 1090
Acknowledgements. Dinache A. acknowledges financial support of the Sectorial Operational Programme for Human Resources Development 2007-2013, co-financed by the European Social Fund, under the project number POSDRU/107/1.5/S/80765. Financing is acknowledged by the Program LAPLAS 3, PN 09 39/2009 and CNCS – UEFISCDI by projects PN – II – ID – PCE – 2011 -3 - 0922 and PN – II – PT – PCCA -2011 - 3.1 - 1350.
REFERENCES
1. G.G. Hammes, Spectroscopy for the Biological Sciences, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, 2005. 2. M.L. Pascu, A. Staicu, L. Voicu, M. Brezeanu, B. Carstocea, R. Pascu, D. Gazdaru, Methotrexate
as a Photosensitiser, Anticancer Research, 24, 2925–2930 (2004). 3. M.L. Pascu, M. Brezeanu, L. Voicu, A. Staicu, B. Carstocea, R.A. Pascu, 5-Fluorouracil as a
Phosensitiser, In vivo, 19, 215–220 (2005). 4. A. Smarandache, Laser Beams Interaction with Polidocanol Foam: Molecular Background,
Photomedicine and Laser Surgery, 30, 262–267 (2012). 5. A. Smarandache, M. Trelles, M.L. Pascu, Measurement of the modifications of Polidocanol
absorption spectra after exposure to NIR laser radiation, Journal of Optoelectronics and Advanced Materials, 12, 1942–1945 (2010).
6. A. Hunyadi, B. Danko, M. Boni, A. Militaru, T. Alexandru, V. Nastasa, I.R. Andrei, M.L. Pascu, L. Amaral, Rapid, Laser-Induced Conversion of 20-Hydroxyecdysone and its Diacetonide – Experimental Set-up of a System for Photochemical Transformation of Bioactive Substances, Anticancer Research, 32, 1291–1298 (2012).
7. M.L. Pascu, B. Danko, A. Martins, N. Jedlinszki, T. Alexandru, et al., Exposure of Chlorpromazine to 266 nm Laser Beam Generates New Species with Antibacterial Properties: Contributions to Development of a New Process for Drug Discovery, PLoS ONE, 8, e55767 (2013).
8. M. L. Pascu, V. Nastasa, A. Smarandache, A. Militaru, A. Martins, M. Viveiros, M. Boni, I. R. Andrei, A. Pascu, A. Staicu, J. Molnar, S. Fanning, L. Amaral, Direct Modification of Bioactive Phenothiazines by Exposure to Laser Radiation, Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery, 6, 147–157 (2011).
9. T. Alexandru, A. Armada, B. Danko, A. Hunyadi, A. Militaru, M. Boni, V. Nastasa, A. Martins, M. Viveiros, M.L. Pascu, J. Molnar, L. Amaral, Biological Evaluation of Products Formed from the Irradiation of Chlorpromazine with a 266 nm Laser Beam, Biochemistry & Pharmacology, 2, 109 (2013).
10. G. Nałecz-Jawecki, A. Hajnas, J. Sawicki, Photodegradation and phototoxicity of thioridazine and chlorpromazine evaluated with chemical analysis and aquatic organisms, Ecotoxicology, 17, 13–20 (2008).
11. Ch. Bastianon, R. Zanoni, G. Miolo, S. Caffieri, E. Reddi, Mitochondria and plasma membrane as targets of UVA-induced toxicity of neuroleptic drugs fluphenazine, perphenazine and thioridazine, Intl J Biochem Cell Biol, 37,901–908 (2005).
12. E. Gocke, Review of the genotoxic properties of chlorpromazine and related phenothiazines, Mutat Res, 366, 9–21 (1996).
13. M.P. McIntosh, N. Leong, K. Katneni, J. Morizzi, D. M. Shackleford, et al., Impact of chlorpromazine self-association on its apparent binding constants with cyclodextrins: effect of SBE7-b-CD on the disposition of chlorpromazine in the rat, J Pharm Sci, 99, 2999–3008 (2010).
14. S. Schreier, S.V.P. Malheiros, E. de Paula, Surface active drugs: self-association and interaction with membranes and surfactants. Physicochemical and biological aspects, Biochimica et Biophysica Acta, 150, 210–234 (2000).
14 Phenothiazine derivatives interaction with laser radiation 1091
15. M.L. Pascu, A. Smarandache, M. Boni, J. Kristiansen, V. Nastasa, I. R. Andrei, Spectral Properties of Some Molecular Solutions, Romanian Reports in Physics, 63 (Supplement), 1267–1284 (2011).
16. S.J. Blanksby, G.B. Ellison, Bond Dissociation Energies of Organic Molecules, Acc. Chem. Res, 36, 255–263 (2003).
17. Y.R. Luo, Handbook of bond dissociation energies in organic compounds, CRC Press, Florida, 2003.
124 Letters in Drug Design & Discovery, 2011, 8, 124-129
1570-1808/11 $58.00+.00 © 2011 Bentham Science Publishers Ltd.
Time Stability Studies of Quinazoline Derivative Designed to Fight Drug
Resistance Acquired by Bacteria
Andra Militaru*,1, Adriana Smarandache
1, Abdallah Mahamoud
2, Sandrine Alibert
2,
Jean-Marie Pagès2 and Mihail-Lucian Pascu
1
1National Institute for Laser, Plasma and Radiation Physics, Magurele, Romania
2UMR-MD1, Facultés de Médecine et de Pharmacie, Université de la Méditerranée, IFR88, Marseille, France
Received May 31, 2010: Revised September 15, 2010: Accepted September 15, 2010
Abstract: The 3-[2-(dimethylamino)ethyl]-6-nitroquinazolin-4(3H)-one (BG1188) may modify the antibiotic susceptibil-
ity of human Gram-negative bacteria which present multidrug resistant phenotype. This application requires to know the
time stability of BG1188 solutions. This paper reports for the first time about the time stability of the BG1188 solutions
measured by optical absorption; the solvents were ultrapure de-ionized water and dimethyl sulfoxide (DMSO). In ul-
trapure water, BG1188 concentration varied between 2x10-3
M (stock solution) and 10-6
M, at pH = 6.7. In DMSO, the
concentration was 10-3
M (recommended by higher activity on bacteria). Solutions in ultrapure water were kept in dark at
4°C and measured at room temperature (22°C). The ultraviolet-visible (UV-Vis) absorption spectra have shown that only
monomer forms were present in solutions. One of the obtained results is that the time evolution of the absorption spectra
at 10-3
M in ultrapure water shows a reproducibility within the measuring errors (±1.045%) for time intervals up to 1032
hours (more than 40 days) after preparation, showing a high stability of BG1188 solutions; generally, samples are stable
within the experimental errors at concentrations higher than 10-5
M, but the stability time interval may be variable: from
119 days at 10-4
M to 34 days at 10-5
M.
As for solutions in the DMSO, the absorption spectra show that the samples exhibit modifications immediately after
preparation, in terms of peak intensities and shapes, so that the BG1188 solutions in DMSO may be considered as unsta-
ble.
Keywords: Absorption spectra, BG1188, DMSO, Quinazoline derivatives, Time stability, Ultrapure water.
INTRODUCTION
The multidrug resistance to antibiotics among pathogenic bacteria is a continuous emerging problem for the clinic management of infectious diseases and requires development of novel antibacterial agents [1-3]. Quinazoline derivatives constitute, along this line, an important group of compounds since they have a specific variety of pharmaceutical proper-ties: diuretic, antihypertensive, anticancer, anti-allergic, anti-fungal and anti-infective effects.
Quinazoline structure was fully described; a series of quinazoline derivatives were developed at UMR-MD1 (Mar-seille, France) [4]. Among them, 3-[2-(dimethylamino) ethyl]-6-nitroquinazolin-4(3H)-one is considered for stability studies in the present paper.
The study of the time stability of the quinazoline deriva-tives is required by the applications in which the substances are used, where they are mainly prepared as solutions in dif-ferent solvents; from the user’s point of view it is important to know the time constraints which must be considered dur-ing the use of the solutions on bacteria, cell cultures and other targets.
The time stability of the BG1188 solutions in ultrapure de-ionized water or DMSO was systematically studied and
*Address correspondence to this author at the National Institute for Laser, Plasma and Radiation Physics, Str. Atomistilor Nr. 409, 077125, Magurele, Judetul Ilfov, Romania; Tel: 0040 21 457 57 39; Fax: 0040 21 457 57 39; E-mail: [email protected]
the obtained results are reported for the first time in this pa-per.
The method selected for the stability evaluation was ab-sorption spectroscopy. This method allowed to find out that BG1188 solutions in ultrapure de-ionized water are re-markably stable up to 1032 hours after preparation and may be used for applications within this time interval. On the contrary, the solutions in DMSO are highly unstable and it is not recommended to use this solvent during BG1188 appli-cations.
MATERIALS AND METHODS
The BG1188 has the molecular formula C12 H14 N4 O3; the chemical formula is shown in Fig. (1) and the 3D qualita-tive representation in Fig. (2).
N
NNO2
O
N(CH3)2
Fig. (1). Chemical formula of BG1188.
The stability studies on BG1188 were carried out in solu-tions in ultrapure de-ionized water or in DMSO. The ul-trapure de-ionized water was delivered via a sterile filter; its bacterial content is <1CFU/ml and the particle content <1 (TKA Smart2Pure UV) at a resistivity of 18.2 M xcm and
Time Stability Studies of Quinazoline Derivative Letters in Drug Design & Discovery, 2011, Vol. 8, No. 2 125
0.055μS/cm conductivity, at 25°C. The DMSO is commer-cial grade and it was used without further purification.
Stock solutions of BG1188 2x10-3
M were prepared in ul-trapure water and DMSO. The BG1188 concentration range in ultrapure water solutions was 10
-3M - 10
-6M. The reason
of choosing this concentration range derived from [3] where quinazoline MIC (minimal inhibitory concentration) of 1.25mM is used to study the BG1188 effects on Enterobacter aerogenes strains.
In DMSO, the concentration of BG1188 was 10-3
M from the same reasons as mentioned above in ultrapure water so-lutions case.
The solutions were kept in the dark, regardless of the sol-vent used. The solutions prepared in ultrapure water were kept in the fridge, at 4°C. For measurements at room tem-perature (22°C), solutions were previously extracted from the fridge and kept half an hour to reach 22°C. Some sam-ples were kept in the dark at 22°C, but their stability was not influenced by the temperature.
The BG1188 solutions in DMSO were kept all the time at room temperature (22°C), in the dark.
In some cases, to avoid precipitation during experiments, the solutions were exposed to ultrasounds and at the same time heated up to 50°C; the exposure time at ultrasounds was up to 15min at 35kHz with a peak output power of 240W and a HF power of 30Weff. The measurements before and after the exposure and the heating have shown that the re-spective solution remained stable and the absorption spectra remained unchanged.
The absorption spectra were recorded between 200 nm and 450 nm, using a Perkin-Elmer Lambda 950 UV-Vis-NIR spectrophotometer, with an error limit of ± 0.004%. Optical cells of 1mm thickness were used and the errors related to the positioning of the cells in the absorption, or reference compartments of the spectrophotometer varied between ±1.041% for a concentration of 10
-3M and ±19.493% for a
concentration of 10-6
M (the errors were computed consider-ing that the radiation losses on the absorption cells walls were constant whereas the absorption peaks intensities strongly varied with concentration).
RESULTS
The stability measurements consisted in recording the ab-sorption spectra of the BG1188 solutions at several concen-trations. The absorption spectra of the solutions in ultrapure water between 2x10
-3M and 10
-6M are shown in Fig. (3) for
samples prepared by dilution starting from stock solution (2x10
-3M) and kept in the dark at room temperature (22ºC);
the absorption spectra have a broad peak at about 314nm and exhibit below 250nm more bands which are partially re-solved. The peak at 314nm was used to compute the degree of polymerization in the samples. In fact, the broad absorp-tion peaks around 314nm exhibit a wavelength walk-off to-wards smaller values with the concentration decrease: from 314nm at 10
-3M to around 310nm at 10
-5M. At the same
time, peaks below 250nm keep their position in the spectrum at 224nm, respectively 207nm (Fig. 3).
Fig. (3). Absorption spectra of BG1188 solutions in ultrapure water
along the concentration range used in the experiments.
In Fig. (4), data are represented as the logarithm of the difference between the sample concentration c and the
Fig. (2). 3D representation of the BG1188 molecule.
Fig. (4). Polymerization curves for a set of samples immediately
after preparation (Data 1) and for another set of samples kept in the
dark at room temperature and measured one month after prepara-
tion (Data 2).
126 Letters in Drug Design & Discovery, 2011, Vol. 8, No. 2 Militaru et al.
monomer concentration cm, function of the cm logarithm. The degree of polymerization was computed as recommended in literature [5-7]. Two polymerization curves are shown, out of which one is drawn for a sample set measured immediately after preparation; the degree of polymerization is 1.018 in this case. The second curve is drawn for another set of sam-ples which were kept in the dark at room temperature and measured one month after preparation; the degree of polym-erization obtained was 1.023. In conclusion, samples used in the measurements contained only monomers during the time interval considered for measurements.
One of the parameters used to appreciate the stability of the BG1188 solutions in ultrapure water or DMSO was the time evolution of the absorption spectra [8]. The absorption spectra of a sample at 10
-3M in ultrapure water, measured in
1mm thickness cells and determined in the first 8 hours after preparation are shown in Fig. (5). During the experiment, between the successive measurements the sample was kept in the dark at 22ºC and it was exposed only to the light origi-nating from the spectrophotometer light source during the absorption measurements. The spectra are highly stable for the first 8 hours, remaining within the experimental errors of the measurements, which were in total ±1.045%, originating from the spectrophotometer intrinsic catalogue error (± 0.004%) and the deviation of the positioning of the cell in the absorption compartment of the spectrophotometer (±1.041%). This last error was computed based on the varia-tions of the absorption peak at 314nm obtained for different positions of the 1mm thickness absorption cell in 20 repeated measurements. The value ±1.041% represents the difference between the highest and the smallest values of the absorption peak at 314nm (this value is given in percents from the high-est value of the peak intensity). The absolute values of the differences between the highest and the smallest peak inten-sities do not depend on the sample concentration and were due to the absorption cells only (reflection on cell surfaces, irreproducibility - even unobservable with the naked eye - of the location of the cell between two measurements etc.).
Fig. (5). Time evolution of absorption spectra of BG1188 solution
in ultrapure water at 10-3
M in the first 8 hours after preparation.
The evolution of the absorption spectra in time for a BG1188 sample in ultrapure water at 10
-3M kept in this case
in the dark at 4ºC, for a longer time interval: immediately after preparation – 2856 hours (119 days) is given in Fig. (6). Before each measurement the sample extracted from 4ºC was kept in the dark at room temperature (22ºC) half an hour. In this case the stability of the sample is very high. Considering the total error of ±1.045% one may divide the partially superposed spectra into two main groups: one in-cluding the curves up to 1032 hours which remain within the experimental error bars and another which groups the rest of the curves between 1056 hours (44 days) and 2856 hours (119 days – about 4 months) within the same error. The grouping may be better observed in the icon of Fig. (6) where the area of the 314nm peak is expanded and the error bars are shown for some of the peaks, so that the picture re-mains readable. In conclusion, the sample remains stable within the first 43 days and has a slight modification of the absorption spectrum which comes out of the measuring er-rors after 44 days.
Fig. (6). Time evolution of the absorption of BG1188 solution in
ultrapure water at 10-3
M.
At 10-4
M concentration in ultrapure water, the sample kept in the dark at 22ºC shows a significant stability (Fig. 7). For time intervals (24 hours after solution preparation to 2856 hours – 119 days) the evolution of the spectrum is shown in Fig. (8). The samples were manipulated as de-scribed in Fig. (6); one may observe that the absorption spec-tra are grouped for the entire time interval used for monitor-ing of the solutions evolution, within the experimental errors of the measurements, showing a very good stability of the solutions (Fig. 8). In this case, the solution is stable for, at least, 2856 hours (119 days). The slight shift of the wave-length of the peak which appears at 10
-3M case at 314nm, is
relative since it is broad and the indication of its wavelength at 315nm may be due to a variation in approximating the maximum absorption value due to local (spectrophotometer) noises.
The time evolution of the BG1188 solution at 10-5
M in ultrapure de-ionized water (Fig. 9) has characteristics which are quite similar to the 10
-4M sample on one hand, but differs
from it on the other. The general shape of the absorption spectrum is reproduced, but the peak at 314nm -315nm is shifted at 310nm, whereas the UV peaks at 207nm and 224nm are broadened and remain in the same wavelengths
Time Stability Studies of Quinazoline Derivative Letters in Drug Design & Discovery, 2011, Vol. 8, No. 2 127
domains at 206nm and 223nm, respectively. As for the in-tensity distribution of the maxima, the variations of the peaks values, particularly of the peak at 310nm, they may be grouped, after considering the experimental error bars, in three sets starting from the preparation of the sample. The first set includes curves kept in the dark at 22 ºC and a time interval between 0 and 816 hours (34 days), the second set includes the time interval 816 (34 days) – 1320 (55 days) in which one may consider the solution stable within the ex-perimental errors; the third group contains the sample kept between 1320 (55days) and 2856 hours (119 days) within which the solution is stable considering the experimental error bar. According to these data the BG1188 solution in ultrapure water at 10
-5M may be considered stable in the first
34 days after preparation: although slightly modified, the solution may be considered stable in view of further applica-tion for the time intervals between 34 – 55 days and 55 – 119 days.
The stability measurements performed on BG1188 solu-tion in DMSO show different results. In Fig. (10), the time
evolution of the absorption spectrum of a solution at 10-3
M, kept in the dark at room temperature (22 ºC) is presented.
Fig. (9). Time evolution of the absorption of BG1188 solution in
ultrapure water at 10-5
M.
Fig. (10). Time evolution of the absorption of BG1188 solution in
DMSO at 10-3
M.
The shape of the spectrum is different with respect to the case of solutions in ultrapure de-ionized water although two groups of absorption bands are measured. A superposition of two bands is observed with the peak at 324 nm immediately after solution preparation, which walks-off at 318nm after 105 minutes. Another superposition of bands appearing closer to the 324nm, below 280nm is registered which changes its relative intensities in time. The most important difference between the BG1188 ultrapure water and DMSO solutions is that in the latter case the absorption spectrum peaks are increasing with time and the intensity variations are higher than the experimental errors even at short time intervals. Fig. (10) indicated that the modifications of the solution in the first 15 minutes after the preparation are much larger than the errors of measurements.
DISCUSSION
The measurements of the absorption spectra show, in general, a significant stability of the BG1188 solutions in
Fig. (7). Time evolution of absorption spectra of BG1188 solution
in ultrapure water at 10-4
M in the first 8 hours after preparation.
Fig. (8). Time evolution of the BG1188 absorption in ultrapure
water at 10-4
M.
128 Letters in Drug Design & Discovery, 2011, Vol. 8, No. 2 Militaru et al.
ultrapure de-ionized water in the concentration range 10-3
M – 10
-5M.
On the other hand, the intensity of the absorption spectra recorded for solutions in ultrapure water shows, in average, a slight decrease in time. This may be due to different phe-nomena which may take place at the interface of the recipi-ent walls with the solution.
One possibility would be the deposition (even adsorp-tion) of a small amount of BG1188 substance on the walls of the vessels in which the solutions are kept. Other explanation could be the process by which the BG1188 molecules orga-nize themselves to form micro-crystallites or precipitates. The overall decreasing in time of the absorption signal inten-sity shows the possible decrease of the number of BG1188 molecules in the solution. If one considers, for instance, the absorption peak at 314nm obtained for a 10
-3M solution
which has 400 L volume (Fig. 6) the number of molecules in the solution at 0 hours is 2.408854x10
17 and at 2856 hours
is 2.330617x1017
; this shows that after 4 months, 3% of BG1188 molecules are lost in the solution which in real numbers means 7.823683x10
15 molecules.
For the BG1188 solutions in DMSO, their behaviour shows a totally different evolution in time which may be due to the differences between the characteristics of the interac-tion of the BG1188 molecules with DMSO. Since the solu-tions were not stable in time, the measurements were made only at 10
-3M considering that these characteristics will be
kept for all the other concentrations, which as a matter of fact was observed during the experiments.
The tested solutions were kept always in the dark at room temperature (22ºC) or at 4ºC.
Usually, when measurements at short time intervals were made (normally up to 8 hours), the solutions were kept in the dark at room temperature; when long term (more days and months) measurements were performed, the solutions were kept in the dark, in the fridge, at 4ºC.
The two temperatures were chosen because during the current work with these solutions they are either stored in the
fridge at 4ºC, or stored and manipulated at room temperature (22ºC). We considered that the time stability studied at the two temperatures follows–up better the experimental reality during the use of the substance; the alternative could be to perform forced stability investigations using higher tempera-tures and shorter periods of storage which is far from the conditions in which the substance is kept and used.
The differences in stability of the BG1188 solutions due to the different storage temperatures were not significant. This behaviour was followed-up during the experiments.
In Fig. (11), the absorption spectra for pairs of solutions at 10
-3M in ultrapure de-ionized water, kept in dark at the
two respective temperatures for time intervals up to 672 hours (28 days) are presented.
From the error bars in the icon, one may conclude that the differences between the samples remain within the ex-perimental errors occurring during experiments time.
CONCLUSIONS
According to the reported measurements, the stability of the BG1188 solutions in ultrapure de-ionized water in the concentration range 10
-3M – 10
-5M is very high. Conse-
quently, for applications of the 10-3
M concentration samples one may use stock solutions kept in the dark at 4ºC during the first month after preparation. For concentrations down to 10
-5M (but not lower) this time interval may be even longer,
up to 4 months. In general, the temperature storage of the solutions may be chosen between the room temperature (22ºC) and 4ºC. No significant influence of the storage tem-perature was observed on the samples stability for time up to one month.
On the contrary, the solutions in DMSO exhibit a poor stability for any time intervals after preparation which makes it necessary to use them in applications immediately after preparation, i.e. within the first 2 – 3 minutes. At the mo-ment we cannot mention well documented hypotheses about the processes responsible for the low stability of BG1188 in DMSO; neither can we suggest possible chemical reactions which may be in background of the observed changes in the BG1188 solutions in DMSO.
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors belonging to the NILPRP acknowledge the financing of the project by Rom. ANCS project 41-018/2007 and Program LAPLAS PN 09 33/2009. All authors acknowl-edge the COST network BM0701 – ATENS support in car-rying out this work.
REFERENCES
[1] Falagas, M.E.; Bliziotis, I.A. Pandrug-resistant Gram-negative bacteria: the dawn of the post-antibiotic era? Int. J. Antimicrob. Agents, 2007, 29(6), 630-636.
[2] Blot, S.; Depuydt, P.; Vandewoude, K.; De Bacquer, D. Measuring the impact of multidrug resistance in nosocomial infection. Curr. Opin. Infect. Dis., 2007, 20(4), 391-396.
[3] Chevalier, J.; Mahamoud, A.; Baitiche, M.; Adam, E.; Viveiros, M.; Smarandache, A.; Militaru, A.; Pascu, M.L.; Amaral, L.; Pagès, J.M., Quinazoline derivatives are efficient chemosensitizers of an-
Fig. (11). Comparison between the spectra obtained for BG1188
solutions in ultrapure water kept at room temperature (22ºC), and
4ºC.
Time Stability Studies of Quinazoline Derivative Letters in Drug Design & Discovery, 2011, Vol. 8, No. 2 129
tibioticactivity in Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa resistant strains. Int. J. Antimicrob. Agents, 2010, 36, 164-168.
[4] Baïtiche, M.; Mahamoud, A.; Benachour, D.; Merbah, M.; Barbe, J. Synthesis of new quinazoline derivatives. Heterocycl. Commun., 2004, 10, 269-272.
[5] Perkampus, H.H. UV-VIS Spectroscopy and its Applications; Springer –Verlag; Berlin, 1992.
[6] Kucera, M. Mechanism and kinetics of addition polymerization; Comprehensive Chemical Kinetics, Vol. 31, 2nd ed.; Compton, E.G. Ed.; Elsevier Science: Amsterdam, 1992.
[7] Koenig, J.L. Spectroscopy of Polymers, 2nd ed.; Elsevier Science: New York, 1999.
[8] Pascu, R.A.; Trifu, M.; Dumitrescu, M.; Mahamoud, A.; Staicu, A.; Dicu, M.; Smarandache, A.; Carstocea, B.; Pascu, M.L. In LASER FLORENCE 2008: Selected Presentations at the International La-ser Medicine Congress, Conference Proceedings of LASER FLORENCE 2008: International Congress Laser Medicine, Flor-ence, Italy, October 31-November 1, 2008; Longo, L., Ed.; Ameri-can Institute of Physics: New York, USA, 2009; pp. 8-14.
Stability Characterization of Quinazoline Derivative BG1188 by Optical Methods
Andra Militarua, Adriana Smarandachea, Abdallah Mahamoudb, Victor Damiana, Paul Ganeac, Sandrine Alibertb, Jean-Marie Pagèsb, Mihail-Lucian Pascua
aNational Institute for Lasers, Plasma, and Radiation Physics, P.O. Box MG-36, str. Atomistilor 409, 077125, Magurele, Romania
bUMR-MD1, Facultés de Médecine et de Pharmacie, Université de la Méditerranée, IFR88, Marseille, FrancecNational Institute of Material Physics, Atomistilor str. 105 bis, P.O. Box MG 7, 077125, Magurele, Romania
Abstract. 3-[2-(dimethylamino)ethyl]-6-nitroquinazolin-4(3H)-one, labeled BG1188, is a new synthesized compound, out of a series of quinazoline derivatives developed to fight the multidrug resistance of antibiotics acquired by bacteria. A characterization of the BG1188 powder was made using FTIR spectra in order to evidence the functional groups in the medicine’s molecule. The ultraviolet-visible (UV-Vis) absorption spectra were used to study the stability of the BG1188 solutions in two solvents and at different temperatures. BG1188 concentration in ultrapure water was varied between 2x10-3M (stock solution) and 10-6M. The concentration recommended by higher activity on bacteria was 10-3M. For the same reason, this was the utilized concentration of BG1188 in dimethyl sulfoxide (DMSO). Time stability was characterized by comparing the time evolution of the UV-Vis absorption spectra of the BG1188 solutions in ultrapure de-ionized water or in DMSO. The spectra were recorded daily for about 4 months after the preparation for the BG1188 solutions in ultrapure water. Generally, samples are stable within the experimental errors at concentrations higher than 10-5M, but the stability time interval may vary from 119 days at 10-4M to 34 days at 10-5M. Time evolution of the absorption spectra at 10-3M in ultrapure water shows reproducibility within the measuring errors (±1.045%) for time intervals up to 1032 hours (more than 40 days) after preparation. On the other hand, BG1188 solutions in DMSO may be considered unstable because the absorption spectra modify in terms of peak shapes and intensities, indicating that the samples exhibit modifications immediately after preparation. Regardless the solvent used, some aggregation phenomena took place and wire-like aggregates were observed in all the solutions with the naked eye. These aggregates were analyzed, tentatively, using optical microscopy and FTIR.
Keywords: BG1188, quinazoline derivative, FTIR spectroscopy, UV-Vis absorption spectroscopy, optical microscopyPACS: 87.15.M-, 87.64.K-
INTRODUCTION
3-[2-(dimethylamino)ethyl]-6-nitroquinazolin-4(3H)-one (labeled BG1188) is part of a series of new quinazoline derivatives that were synthesized to increase the antibiotic susceptibility of Gram-negative bacteria presenting multidrug-resistant phenotypes. Designing new antibacterial agents is one of the methods used to fight the multidrug resistance to antibiotics developed by the pathogenic bacteria, a continuous emerging problem for the clinic management of infectious diseases [1, 2, 3]. For this purpose, along with quinolone derivatives, quinazoline derivatives were considered due to their variety of pharmaceutical properties: antihypertensive, anti-allergic, antifungal, anticancer and anti-infective effects. The structure of quinazoline was already described [4].
The stability characterization of BG1188 is particularly needed in view of its further use as solutions in different solvents; from the user’s point of view it is important to know the temperature and time constraints which must be considered during the storage of the medicine solutions and their use on bacteria, cell cultures and other targets.
For the stability characterization of BG1188 the absorption spectra were recorded. The comparison between UV-Vis absorption spectra revealed that the BG1188 solutions in ultrapure de-ionized water are stable up to 1032 hours
Advances in Laserology - Selected papers of Laser Florence 2010AIP Conf. Proc. 1364, 13-23 (2011); doi: 10.1063/1.3626907
© 2011 American Institute of Physics 978-0-7354-0922-4/$30.00
13
Downloaded 21 Jun 2012 to 81.181.130.136. Redistribution subject to AIP license or copyright; see http://proceedings.aip.org/about/rights_permissions
after preparation. The BG1188 solutions in dimethyl sulfoxide (DMSO) are highly unstable: modifications of the absorption spectra are evidenced beginning the first minutes after preparation. Therefore, it is recommended to use the BG1188 solutions in ultrapure de-ionized water within the first 43 days after preparation, but it is not recommended to use DMSO as a solvent for BG1188 applications [5].
Another method, FTIR spectroscopy, was used to identify, for the first time, different functional groups in the BG1188 molecules.
During the stability characterization experiments wire-like aggregates were observed in all the BG1188 solutions, regardless the solvent used or the storage temperature. These aggregates were visible with the naked-eye and were observed and characterized in detail with an optical microscope.
MATERIALS AND METHODS
BG1188 is a quinazoline derivative designed and prepared at UMR-MD1 (Marseille, France). The compound is presented under the form of light yellow crystals, keeping the appearance of quinazolines [6]. The chemical formula of BG1188 is shown in Figure 1.
FIGURE 1. Chemical formula of quinazoline derivative BG1188
3[2(dimethylamino)ethyl]-6-nitroquinazolin-4(3H)-one has the molecular formula C12H14N4O3. Based on this chemical formula, a 3D qualitative representation was developed and it is shown in Figure 2, having in mind to be used in further studies of interaction with biological targets and/or light beams.
FIGURE 2. 3D qualitative representation of quinazoline derivative BG1188
For the FTIR spectroscopy studies, BG1188 was used in powder form as delivered by UMR-MD1. The spectra were recorded between 4000 and 650cm-1 with a Spotlight 400 FTIR imaging system (Perkin Elmer) in reflection scanning mode, each spectrum having a resolution of 4cm-1.
The maximum nominal resolution was 6.25×6.25μm per pixel. Because the typical sampling areas of interest were in a much higher range (namely of 8×25mm), all settings were selected to improve acquisition speed and to reduce the size of the data sets. Therefore, only images of 500×500μm of the plates were recorded with two scans per exposure.
For the stability studies, BG1188 stock solutions were prepared only in ultrapure de-ionized water or only in DMSO. The ultrapure de-ionized water was obtained as shown in [5]. The utilized DMSO is a commercial grade substance and it was used without further purification.
The concentration of the stock solution in ultrapure water or DMSO was 2x10-3M; starting from it, the BG1188 solutions were prepared within the concentration range 10-3M – 10-6M which was chosen according to the conclusions drawn in [3] where quinazoline minimal inhibitory concentration (MIC) of 1.25x10-3M is used to study the BG1188 effects on Enterobacter aerogenes strains. The 10-3M concentration of BG1188 in DMSO was used for stability characterization considering the same reasons as in the case of ultrapure water solutions.
14
Downloaded 21 Jun 2012 to 81.181.130.136. Redistribution subject to AIP license or copyright; see http://proceedings.aip.org/about/rights_permissions
All solutions were kept in dark, regardless the solvent used. The BG1188 solutions in DMSO were kept at 22°C, the room temperature, all the time during the experiments.
Two cases were studied for the BG1188 solutions in ultrapure water. In the first case, the samples were kept at 4°C, in the fridge, and were extracted from it with half an hour before measurements, so that they could reach the room temperature (22°C) before the measurements. In the second case, the solutions were kept at 22°C all the time. The samples’ spectra were compared and it was concluded that there were no differences between them which could have been induced by the storage temperature.
For the stability characterization, the absorption spectra were recorded between 200nm and 450nm, using a Perkin-Elmer Lambda 950 UV-Vis-NIR spectrophotometer. Optical cells of 1mm thickness were used.
The experimental errors associated with the absorption spectra originate in the intrinsic error of the spectrophotometer, ± 0.004%, and the errors related to the positioning of the cells in the absorption or reference compartments of the spectrophotometer. This last type of errors varied between ±1.041% for a concentration of 10-3M and ±19.493% for 10-6M (the errors were computed considering that the radiation losses on the absorption cells walls were constant whereas the absorption peaks intensities strongly varied with concentration).
An interesting process which takes place after BG1188 solution preparation in both solvents is the appearance of wire-like precipitates containing BG1188 molecules in solutions kept longer time intervals. On the other hand, it seems that the processes leading to the aggregates formation start immediately after the preparation of the solutions. These wire-like aggregates were better observed with a Zeiss Optical Microscope (Imager. Z1m) provided with an axio Cam MRc 5 (HR); the camera resolution may vary from: 1388x1040 to 4164x3120 pixels of 14 bits. The microscope may work in transmission, reflection or fluorescence mode.
RESULTS
Quinazoline derivative BG1188 is a relatively complex molecule. In Figure 3 FTIR spectra of powder (Figure 3–1) and bundle of aggregates (Figure 3–2) were recorded. This is the first FTIR spectrum of BG1188 powder and the most important bands were assigned to different functional groups in these molecules.
FIGURE 3. FTIR spectra of BG1188 as 1) powder; 2) one of the formed bundle of aggregates
The FTIR spectrum of the BG1188 reveals the relative complexity of the molecule. The peak at 3070cm-1 may be assigned to C-H stretch in the aromatic ring. These bands are also present in approximately the same spectral range as for the quinazoline’s FTIR spectrum [7]. CH stretching vibrations in the N-CH3 group, and the C-H stretch of the quinazoline ring, occur as bands between 3000cm-1 and 2800cm-1. The bands between 1700cm-1 and 1800cm-1 may be the result of C=O stretching vibrations. The band observed at 1654cm-1 is the result of C=C stretching vibrations
15
Downloaded 21 Jun 2012 to 81.181.130.136. Redistribution subject to AIP license or copyright; see http://proceedings.aip.org/about/rights_permissions
of a non-conjugated bond, the one at 1556cm-1 of the N-O asymmetric stretch and the bands at 1506cm-1 and 1418cm-1 are a result of CC stretch in the aromatic ring. The N-O symmetric stretch leads to a band at 1306cm-1. The C-N stretching vibrations from the aliphatic radical attached to the quinazoline are responsible for the bands between 1250cm-1 and 1020cm-1. The C-H in the aromatic rings, positioned out of the plane, leads to bands between 900cm-1
and 675cm-1. Other bands may be due to noise or combinations of bands. As for the bundle of aggregates formed in the solution a full FTIR recording is given in Figure 3–2 for
comparison with the powder case and details of it are described elsewhere [8]. Anyway, from Figure 3–2 it results that the main carbonyl stretching band and the bands in the spectral range 2200-2500cm-1 are mostly affected by aggregation.
In Figure 4 is presented the image of the aggregates out of which the FTIR sample measured in Figure 3–2 is extracted from the marked area; the image is obtained using the Spotlight 400 FTIR imaging system.
FIGURE 4. The bundle of aggregates; the square shows the zone from where the FTIR spectra were recorded.
The stability characterization is based on the time evolution of the electronic structure of the molecules and consists in the systematic recording of the absorption spectra of the BG1188 solutions for up to four months time intervals measured after preparation.
The absorption spectra of the BG1188 solutions in ultrapure water, at concentrations between 2x10-3M and 10-6M are shown in Figure 5 for samples prepared by dilution starting from stock solution (2x10-3M) and kept in dark at room temperature (22ºC); the absorption spectra have a broad peak at about 314nm and exhibit below 250nm more bands which are partially resolved. The broad absorption peaks around 314nm exhibit a shift towards smaller wavelength values with the concentration decrease: from 314nm at 10-3M to around 310nm at 10-5M. At the same time, peaks below 250nm keep their position in the spectrum at 224nm, respectively 207nm (Figure 5).
The peak at 314nm was used to compute the degree of polymerization for the BG1188 samples as recommended in [9,10, 11].
16
Downloaded 21 Jun 2012 to 81.181.130.136. Redistribution subject to AIP license or copyright; see http://proceedings.aip.org/about/rights_permissions
FIGURE 5. Absorption spectra of BG1188 solutions in ultrapure water along the concentration range 10-6M – 2x10-3M
In Figure 6, data are represented as the logarithm of the difference between the sample concentration c and the monomer concentration cm, function of the cm logarithm.
FIGURE 6. Polymerization curves for a set of samples immediately after preparation () and for another set of samples kept in the dark at room temperature and measured one month after preparation ().
Two sets of measurements were made; the first one () was measured immediately after the solutions were prepared and the degree of polymerization is 1.018 in this case. For the second set of measurements (), the solutions were kept in the dark at room temperature for one month and then measured; the value of the degree of polymerization is 1.023. Both values indicate that for the concentration range considered, BG1188 was present in solutions only in monomer form during the whole time interval of the experiments.
17
Downloaded 21 Jun 2012 to 81.181.130.136. Redistribution subject to AIP license or copyright; see http://proceedings.aip.org/about/rights_permissions
One of the parameters used to characterize the stability of the BG1188 solutions in ultrapure water or DMSO was the time evolution of the absorption spectra [12]. The absorption spectra of a sample at 10-3M in ultrapure water, measured in 1mm thickness cells and determined in the first 8 hours after preparation are shown in Figure 7. The spectra are highly stable for the first 8 hours, remaining within the experimental errors of the measurements. During the experiment the sample was kept in the dark at 22ºC between the successive measurements and it was exposed only to the light originating from the spectrophotometer light source during the absorption measurements.
The errors considered for the experiment were in total ±1.045%, originating from the spectrophotometer intrinsic catalogue error (± 0.004%) and the deviation of the positioning of the cell in the absorption compartment of the spectrophotometer (±1.041%). This last error was computed based on the variations of the absorption peak at 314nm obtained for different positions of the 1mm thickness absorption cell in 20 repeated measurements. The value ±1.041% represents the difference between the highest and the smallest values of the absorption peak at 314nm (this value is given in percents from the highest value of the peak intensity). The absolute values of the differences between the highest and the smallest peak intensities do not depend on the sample concentration and were due to the absorption cells only (reflection on cell surfaces, irreproducibility - even unobservable with the naked eye - of the location of the cell between two measurements etc.).
FIGURE 7. Time evolution of absorption spectra of BG1188 10-3 M solution in ultrapure water in the first 8 hours after preparation.
The evolution of the absorption spectra in time for a BG1188 sample in ultrapure water at 10-3M kept in this case in dark at 4ºC, for a longer time interval, from immediately after preparation up to 2856 hours (119 days) is given in Figure 8.
Considering the total errors one may divide the partially superposed spectra into two main groups: one including the curves up to 1032 hours which remain within the experimental error bars and another which groups the rest of the curves between 1056 hours (44 days) and 2856 hours (119 days – about 4 months) within the same error range. The grouping may be better observed in the icon of Figure 8 where the area of the 314nm peak is expanded and the error bars are shown for some of the peaks, so that the picture remains readable. In conclusion, the sample remains stable within the first 43 days and has a slight modification of the absorption spectrum which comes out of the measuring errors after 44 days.
18
Downloaded 21 Jun 2012 to 81.181.130.136. Redistribution subject to AIP license or copyright; see http://proceedings.aip.org/about/rights_permissions
FIGURE 8. Time evolution of absorption spectra of BG1188 10-3 M solution in ultrapure water.
At 10-4M concentration in ultrapure water the sample shows a significant stability (Figure 9). For time intervals (24 hours after solution preparation, to 2856 hours – 119 days) the evolution of the spectrum is
shown in Figure 9. The samples were handled as described in Figure 8; one may observe that the absorption spectra are grouped for the entire time interval used for monitoring the samples evolution, within the experimental errors of the measurements, showing a very good stability of the solutions.
FIGURE 9. Time evolution of the absorption of BG1188 10-4M solution in ultrapure water.
In this case, the solution is stable for, at least, 2856 hours (119 days). The slight shift of the peak wavelength which appears at 314nm for the concentration of 10-3M, is relative since the peak is broad and the indication of its
19
Downloaded 21 Jun 2012 to 81.181.130.136. Redistribution subject to AIP license or copyright; see http://proceedings.aip.org/about/rights_permissions
wavelength at 315nm may be due to a variation in approximating the maximum absorption value due to local (spectrophotometer) noises.
The time evolution of the BG1188 solution at 10-5M in ultrapure de-ionized water (Figure 10) has characteristics which are quite similar to the 10-4M sample on one hand, but differs from it on the other.
FIGURE 10. Time evolution of the absorption of BG1188 10-5 M solution in ultrapure water.
The general shape of the absorption spectrum is reproduced, but the peak at 314nm - 315nm is shifted at 310nm, whereas the UV peaks at 207nm and 224nm are broadened and remain in the same wavelengths domains at 206nm and 223nm, respectively. As for the intensity distribution of the maxima, particularly at 310nm, they may be grouped, after considering the experimental error bars, in three sets starting from the preparation of the sample. The first set includes curves kept in the dark at 22 ºC and a time interval between 0 and 816 hours (34 days), the second set includes the time interval 816 (34 days) – 1320 (55 days) in which one may consider the solution stable within the experimental errors; the third group contains the sample kept between 1320 (55days) and 2856 hours (119 days) within which the solution is stable considering the experimental error bar. According to these data the BG1188 solution in ultrapure water at 10-5M may be considered stable in the first 34 days after preparation. Although slightly modified, the solution may be considered stable in view of further application for the time intervals between 34 – 55 days and 55 – 119 days.
In Figure 11 the evolution in time of the absorption spectra of BG1188 solution in DMSO at 10-3M is shown. The shape of the spectrum is different with respect to the case of solutions in ultrapure de-ionized water although two groups of absorption bands are measured. A superposition of two bands is observed with the peak at 324 nm immediately after solution preparation, which shifts at 318nm after 105 minutes. Another superposition of bands appearing closer to the 324nm, below 280nm is registered which changes its relative intensities in time. The most important difference between the BG1188 ultrapure water and DMSO solutions is that in the latter case the absorption spectrum peaks are increasing with time and the intensity variations are higher than the experimental errors even at short time intervals.
Figure 11 indicates that the modifications of the solution in the first 15 minutes after the preparation are much larger than the errors of measurements.
20
Downloaded 21 Jun 2012 to 81.181.130.136. Redistribution subject to AIP license or copyright; see http://proceedings.aip.org/about/rights_permissions
FIGURE 11. Time evolution of the absorption of BG1188 10-3M solution in DMSO.
DISCUSSION
The measurements of the absorption spectra show, in general, a significant stability of the BG1188 solutions in ultrapure de-ionized water in the concentration range 10-3M – 10-5M.
On the other hand, the intensity of the absorption spectra recorded for solutions in ultrapure water shows, in average, a slight decrease in time. This may be due to different phenomena which may take place at the interface of the recipient walls with the solution.
One possibility would be the deposition (even adsorption) of a small amount of BG1188 substance on the walls of the vessels in which the solutions are kept. Other explanation could be the process by which the BG1188 molecules organize themselves to form micro-crystallites or precipitates. The overall decreasing in time of the absorption signal intensity shows the possible decrease of the number of BG1188 molecules in the solution. If one considers, for instance, the absorption peak at 314nm obtained for a 10-3M solution which has a volume of 400µL (Figure 8) the number of molecules in solution at 0 hours (immediately after preparation) is 2.408854x1017 and at 2856 hours is 2.330617x1017; this shows that after 4 months, 3% of BG1188 molecules are lost from the solution which in real numbers means 7.823683x1015 molecules.
In all the analyzed samples, regardless the solvent or the storage temperature, wire-like aggregates (bundles of aggregates) appeared. For a better observation, optical microscopy images were recorded. From the images obtained it seems that there are two types of aggregates.
In Figure 12, it is shown a 500 times magnified image of a bundle of wire-like aggregates, obtained in a BG1188 5x10-4M solution in ultrapure de-ionized water. The “cluster” was extracted from the solution and placed on a glass slide for microscopic measurements. The first type of aggregates looks like a transparent, white, long wire which seems to have the same width for all its length (structure labeled a in Figure 12). The second type of observed wire-like formations, looks like a chain of dark colored spheres/balls, which apparently contain dry material (structure labeled b in Figure 12). The total number of molecules contributing to these wire formations may be in the range 1015 - 1016 molecules as calculated above. It remains to better understand the mechanisms of wire formation.
For the BG1188 solutions in DMSO, their behavior shows a totally different evolution in time which may be due to the differences between the characteristics of the interaction of the BG1188 molecules with DMSO. Since the solutions were highly unstable in time, the measurements were made only at 10-3M considering that these characteristics will be kept for all the other concentrations which was observed, actually, during the experiments.
21
Downloaded 21 Jun 2012 to 81.181.130.136. Redistribution subject to AIP license or copyright; see http://proceedings.aip.org/about/rights_permissions
FIGURE 12. 50X optical microscopy image of cluster of aggregates formed in a BG1188 5x10-4 M solution in ultrapure water.
The measured solutions were kept always in the dark at room temperature (22ºC) or at 4ºC. Usually, when measurements at up to 8 hours were made, the solutions were kept in dark at room temperature; when long term (more days and months) measurements were performed, the solutions were kept in dark, in the fridge, at 4ºC.
FIGURE 13. Comparison between the spectra obtained for BG1188 solutions in ultrapure water kept at room temperature (22ºC) and 4ºC.
The two temperatures were chosen because during the laboratory current work, the solutions are either stored in the fridge at 4ºC, or stored and handled at room temperature (22ºC). We considered that the time stability studied at the two temperatures follows–up better the experimental reality during the use of the substance; the alternative could
22
Downloaded 21 Jun 2012 to 81.181.130.136. Redistribution subject to AIP license or copyright; see http://proceedings.aip.org/about/rights_permissions
be to perform forced stability investigations using higher temperatures and shorter periods of storage which is far from the conditions in which the substance is kept and used.
The differences in stability of the BG1188 solutions due to the different storage temperatures were not significant. This behavior was followed-up during the experiments.
In Figure 13, the absorption spectra for pairs of solutions at 10-3M in ultrapure de-ionized water, kept in dark at the two respective temperatures for time intervals up to 672 hours (28 days) are presented.
From the error bars in the icon, one may conclude that the differences between the samples remain within the experimental errors occurring during experiments time.
CONCLUSIONS
The stability of the BG1188 solutions in ultrapure de-ionized water in the concentration range 10-3M – 10-5M is very high. Consequently, for applications of the samples at 10-3M one may use stock solutions kept in dark at 4ºC during the first month after preparation. For concentrations down to 10-5M (but not lower) this time interval may be even longer, up to 4 months. In general, the temperature storage of the solutions may be chosen between the room temperature (22ºC) and 4ºC. No significant influence of the storage temperature was observed on the samples stability for time intervals up to one month.
On the other hand, the BG1188 solutions in DMSO exhibit a poor stability for any time intervals after preparation which makes it necessary to use them in applications immediately after preparation, i.e. within the first 2 – 3 minutes. At the moment we cannot mention well documented hypotheses about the processes responsible for the low stability of BG1188 in DMSO; neither can we suggest possible chemical reactions which may be in background of the observed changes in the BG1188 solutions in DMSO.
For solutions in both solvents, wire like formations are observed in the samples which are produced regardless the temperature and the used concentration. This may be responsible for the slight diminishing of the absorption peaks in time in the case of the solutions in ultrapure de-ionized water. The mechanism of the wires formation remains to be clarified.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors belonging to the NILPRP acknowledge the financing of the project by Rom. ANCS project 41-018/2007 and Program LAPLAS 3, PN 09 39/2009. All authors acknowledge the COST network BM0701 – ATENS support in carrying out this work.
REFERENCES
1. J. Chevalier, A. Mahamoud, M. Baitiche, E. Adam, M. Viveiros, A. Smarandache, A. Militaru, M.L. Pascu, L. Amaral and J.M. Pagès, Int. J. Antimicrob Agents, 36, 164-168 (2010).
2. M.E. Falagas and I.A. Bliziotis, Int. J. Antimicrob. Agents, 29 (6), 630-636, (2007). 3. S. Blot, P. Depuydt, K. Vandewoude and D. De Bacquer, Curr. Opin. Infect. Dis., 20 (4), 391-396, (2007). 4. M. Baïtiche, A. Mahamoud, D. Benachour, M. Merbah and J. Barbe, Heterocycl. Commun., 10, 269–72, (2004). 5. A. Militaru, A. Smarandache, A. Mahamoud, S. Alibert, J.M. Pagès and M.L. Pascu, Letters in Drug Design & Discovery,
8(2),124 – 129, (2011). 6. http://chemicalland21.com/specialtychem/finechem/QUINAZOLINE.htm 7. http://webbook.nist.gov/cgi/cbook.cgi?ID=C253827&Mask=80#IR-Spec 8. A. Militaru, A. Smarandache, A. Mahamoud, V. Damian, L. Frunza, P. Ganea, S. Alibert, J.-M. Pagès, M.-L. Pascu, paper
under preparation. 9. H.H. Perkampus, UV-Vis spectroscopy and its applications, Springer – Verlag, Berlin, (1992). 10. M. Kucera, Mechanism and kinetics of addition polymerization; Comprehensive Chemical Kinetics, Vol.31, 2nd ed., E.G.
Compton, Ed., Elsevier Science, Amsterdam, (1992). 11. J.L. Koenig, Spectroscopy of polymers, 2nd ed., Elsevier Science: New York, (1999). 12. R.A. Pascu, M. Trifu, M. Dumitrescu, A. Mahamoud, A. Staicu, M. Dicu, A. Smarandache, B. Carstocea and M.L. Pascu, “In
vivo studies of the effects of alkyl substituted Benzo[b]pyridinium compounds exposed to optical radiation” in LASER FLORENCE 2008: Selected Presentations at the International Laser Medicine Congress, edited by L. Longo, AIPConference Proceedings of LASER FLORENCE 2008: International Congress Laser Medicine, Florence, Italy, October 31-November 1, 2008; American Institute of Physics, NY, 2009, pp. 8-14.
23
Downloaded 21 Jun 2012 to 81.181.130.136. Redistribution subject to AIP license or copyright; see http://proceedings.aip.org/about/rights_permissions
