capitol1.doc

1. Drojdiile ca agenţi biotehnologici

Introducere

Microorganismele incluzând bacteriile, drojdiile, fungii filamentoşi şi algele

unicelulare au fost folosite în culturi submerse pentru obţinerea diferitelor produse printre

care şi biomasa proteică. De la începuturile producţiei pe scară largă de penicilină,

streptomicină şi de alte antibiotice şi până la conversia steroizilor de către o varietate de

microorganisme, s-au dezvoltat şi o serie de echipamente pentru culturile submerse dintre

care, mai utilizate sunt două tipuri: bioreactorul cu agitare mecanică, cu diferite variante de

agitatoare şi sisteme de spargere a spumei, fermentatorul airlift care poate fi considerat un

hibrid între fermentatorul clasic cu agitare mecanică şi tipul cu draft al fermentatorului airlift.

Factorii limitativi ai dezvoltării celulare în astfel de echipamente de fermentaţie sunt

transferul de căldură şi transferul de masă, ultimul influenţând folosirea nutrienţilor, în special

a oxigenului de către celule precum şi cantitatea produşilor de metabolism.

În jurul acestui subiect s-a dezvoltat o bogată literatură de specialitate, care descrie

efectul acestor factori asupra dezvoltării culturilor submerse microbiene, cu punerea în

evidenţă a factorului limitativ pentru producţia de masă celulară şi de metaboliţi primari sau

secundari. [1]

În Figura 1 sunt prezentate principalele aplicaţii industriale tradiţionale şi moderne ale

drojdiilor bazate pe exploatarea dezvoltării drojdiilor şi pe procesele metabolice specifice

acestora la nivel industrial [2].

Figura 1. Biotehnologii tradiţionale şi moderne bazate pe drojdii.

11

I. F. Dumitru, A. Vamanu, O. Popa

Accentul este pus pe relaţia dintre fiziologia celulelor de drojdie şi biotehnologie pe de

o parte şi ADN recombinant şi tehnologiile de fermentaţie pe de altă parte. Privitor la drojdiile

non Saccharomyces, creşterea importanţei lor industriale este în particular datorată producţiei

masive de substanţe şi preparate biofarmaceutice. De asemenea a fost evidenţiată importanţa

drojdiilor ca modele experimentale în studiile fundamentale ale ştiinţelor biomedicale [3].

1.1. Aspecte privind biologia drojdiilorDrojdiile sunt benefice pentru omenire, deoarece în cea mai mare măsură sunt utilizate

pentru producerea de alimente, vin, bere, substanţe bioterapeutice şi produse farmaceutice. În

prezent au fost recunoscute aproximativ şapte sute de specii de drojdie. Deoarece drojdiile

sunt adesea utilizate în biotehnologia tradiţională şi modernă, descoperirea de noi specii este

legată şi de noile tehnologii.

Pentru descrierea domeniului drojdiilor au fost utilizate mai multe definiţii. În

conformitate cu Guilliermond (1912) şi Lodder (1970) [11] drojdiile sunt fungi unicelulari cu

reproducere prin înmugurire ori fisiune. În acest sens, s-a recunoscut că drojdiile sunt fungi

unicelulari adevăraţi, dar în realitate, majoritatea speciilor de drojdii sunt dimorfice şi produc

pseudohife şi hife, pe lângă dezvoltarea unicelulară. Similar, majoritatea fungilor hifali sunt

dimorfici şi, în mod uzual, aceştia au fost denumiţi yeast – like.

Identificarea, numirea şi plasarea drojdiilor în propiul lor cadru evolutiv sunt

importante pentru multe domenii ale ştiinţei care includ agricultura, medicina, ştiinţele

biologice, biotehnologia, industria alimentară.

Investigaţii comparative care includ morfologia, fiziologia, genetica, biochimia,

ecologia şi genetica moleculară, au îmbogăţit taxonomia drojdiilor.

Prima perioadă în sistematica drojdiilor care se situează până la nivelul anilor 1960,

este caracterizată prin studii aprofundate de morfologie, fiziologie nutriţională comparată şi

genetică convenţională.

Iniţial pentru utilizări taxonomice se foloseau teste care se refereau la numărul

atomilor de carbon asimilaţi şi la folosirea compuşilor azotului. Wickerman (1951) a extins

aceste cercetări şi astăzi aproximativ un număr de 60 de teste sunt utilizate curent şi ele includ

fermentaţia şi asimilarea compuşilor carbonului, asimilarea compuşilor azotului, cerinţele în

vitamine, rezistenţa la cycloheximide, necesităţi de temperatură.

12

Drojdiile ca agenţi biotehnologici

Studiile genetice relevă prezenţa diferitelor stadii sexuale. Ciclul sexual la ascomicete

poate fi haplontic, diplontic ori diplohaplontic. Speciile de drojdii pot fi homotalice,

heterotalice, sau o combinaţie a acestora. [10]

A doua perioadă în sistematica drojdiilor este considerată de la 1960 până în prezent,

şi este caracterizată printr-o aprofundare a studiului caracterelor morfologice datorită

introducerii microscopiei electronice, a aplicării criteriilor biochimice şi a introducerii

studiilor de genetică moleculară. Microscopia cu transmisie de electroni a relevat diferenţe

între drojdiile ascomicete şi bazidiomicete. Drojdiile ascomicete au pereţii celulari

transparenţi la electroni şi conţin în majoritate - glucani, pătura externă fiind formată din -

manani. Drojdiile bazidiomicete au pereţii celulari cu o structură lamelară netransparentă la

electroni şi formaţi în majoritate din - glucani. Formarea mugurelui este de asemenea

diferită la cele două grupuri de drojdii. Drojdiile ascomicete prezintă o înmugurire

holoblastică, care constă în participarea întregului perete celular, la formarea noului perete, a

mugurelui pe când la drojdiile bazidiomicete care au o înmugurire enteroblastică, participă

numai stratul interior al peretelui celular.

Ultrastructura septului arată diferenţe importante între cele două clase de drojdii.

Septul la majoritatea ascomicetelor are unul sau mai mulţi micropori. Septul simplu are un

singur por central, pe lângă unii pereţi despărţitori de la unele bazidiomicete, care au o

structură de tip dolipor, la care porul central este flancat de o membrană perforată numită

parentezom.

Pentru diferenţieri taxonomice au fost utilizate caracteristici biochimice, compoziţia în

glucide a pereţilor celulari şi capsulelor, spectrul de rezistenţă magnetică a pereţilor celulari,

numărul unităţilor izoprenice din coenzima Q, citocromii, compoziţia în acizi graşi şi paternul

izoenzimelor. [12]

Introducerea studiilor ADN, furnizează în principal, un parametru obiectiv în

estimarea distanţelor evolutive din punct de vedere taxonomic. Diferitele metode utilizate

oferă soluţii la diferite niveluri taxonomice. Valoarea taxonomică a compoziţiei în baze a

ADN (mol% G+C) este în special caracteristică taxonomică de specie. Tulpinile fenotipice

care diferă au un procent mai mare de 2 – 3% în compoziţia bazelor, sunt considerate specii

diferite. Limitele în compoziţia de baze a ADN, diferă pentru drojdiile ascomicete şi

bazidiomicete. Cele mai multe drojdii ascomicete au procentul molar de guanină şi citozină

(mol% G+C) mai mic de 50, pe când majoritatea bazidiomicetelor au acest procent peste 50

(Tabelul 1).

13


Tabelul 1. Distribuţia mol% G+C la diferite ascomicete şi bazidiomicete

Mol% G+C Procentajul la drojdiile

ascomicete

Procentajul la drojdiile

bazidiomicete

25 – 20

30 – 34

35 – 39

40 – 44

45 – 49

50 – 54

55 – 59

60 – 64

65 - 69

0,75

14,5

28

32,5

16

5,5

2

0,75

-

-

-

1

1

10

35

31

18

4

Studiile de hibridare a ADN au fost utilizate pentru determinarea similarităţilor între

specii. Metodele utilizate în aceste studii se referă la analiza spectrofotometrică a formării

heteroduplexului şi la cele fluorometrice şi colorimetrice. [13]

Tehnicile electroforetice utilizate în sistematica drojdiilor au creat posibilitatea

realizării de studii la nivelul cromozomilor individuali. Multe specii de drojdii au o variaţie

considerabilă ca număr şi dimensiune a ADN cromozomal.

1.1.1. Aspecte de genetică moleculară

Ingineria genetică, sau în sens strict tehnologia ADN recombinant a revoluţionat rapid

câteva domenii de bază în genetică şi biologia aplicată. În ultimii ani drojdia Saccharomyces

cerevisiae a fost utilizată ca model experimental pe care s-a studiat expresia genelor din

eucariotele superioare. În Figura 2 sunt prezentate schematic procedeele de bază în

tehnologia ADN recombinant la drojdii.

La tulpinile de drojdii industriale aspectele de genetică moleculară se referă la alegerea

vectorilor, promotorilor, la selecţia markerilor şi la semnalele de secreţie. Aplicaţiile

biotehnologice sunt dependente de clonarea genelor heteroloage pentru drojdii, izolate din

ADN viral, procariote sau eucariote.

14


Figura 2. Procedeele de bază în ingineria genetică la drojdii.

Numeroşi vectori plasmidiali au fost construiţi pentru transformarea genetică a

celulelor de drojdie (Tabelul 2). În general pentru o transformare cât mai eficientă a celulelor

de drojdie, vectorii trebuie să conţină:

- secvenţe de plasmide bacteriene (E. coli), care servesc la producerea clonării şi

amplificării şi care permit ca ADN să se insereze în celula gazdă;

- secvenţă (ARS) care se replică autonom;

- secvenţă centromerică (CEN) pentru stabilitatea segregării mitotice;

- markeri selectaţi corespunzător şi avantajos;

- unul sau câteva situsuri pentru enzimele de restricţie, care permit inserarea ADN

heterolog. [4]

15


Tabelul 2. Vectori plasmidiali pentru transformarea celulelor de drojdie

Tipuri de vector Exemple Caracteristici

Plasmide de integrare

Plasmidă integrativă de drojdie (Ylp)

Frecvenţe scăzute de integrare în loci cromozomali prin recombinare homoloagă. Ylps sunt integrate în copii singulare, iar transformanţii sunt stabili, chiar în absenţa presiunii selective.

Plasmide de replicare

independentă

Plasmidă replicativă de drojdie (YRp)

Frecvenţe înalte de transformare (500 – 2000 de transformanţi per g ADN) datorită elementelor ARS care menţin replicarea extracromozomală. Plasmidele sunt instabile pe timpul dezvoltării drojdiei datorită segregării asimetrice în diviziunea celulară. Yrps sunt utilizate rar.

Plasmidă epizomală de drojdie (YEp)

Acestea sunt derivate din plasmidele de 2 m din Saccharomyces cerevisiae cu origine în secvenţele de replicare. Yeps sunt relativ stabile, susţinute extracromozomal de 50 – 100 copii per celulă.

Plasmidele centromerice

de drojdie (YCp)

Includerea secvenţelor centromerice (CEN) funcţionale de drojdie, conduce la segregarea stabilă în mitoză. Plasmidele sunt susţinute de 1 – 3 copii/celulă şi sunt stabile în diviziunea celulelor.

Plasmide specializate

Plasmidă lineară de

drojdie (YLp)

Acestea sunt plasmide cromozomale artificiale care conţin secvenţe telomerice pentru susţinerea stagiului linear

Cromozomi artificiali de

drojdie (YACs)

Cromozomi artificiali, lineari liberi sunt foarte stabili (conţin secvenţe CEN). Sunt utilizaţi pentru receptarea de inserţii libere de ADN, în analizele genomului uman, bogate în tehnici fizice curente

Plasmidă de expresie (YXp)

Conţine promotor transcripţional şi secvenţe terminale, de care genele heteroloage se pot lega. De asemenea, conţin secvenţe pentru modificarea şi secreţia proteinelor externe

Plasmide Killer

pGKL1 şi 2 din Kluyveromyces lactis sunt plasmide Killer lineare, care pot fi dezvoltate ca vectori de clonare

Plasmide de dezintegrare

(YDp)

Utilizate pentru pierderea totală a secvenţei de vectori bacterieni.

Promotorii sunt utilizaţi ca vectori de clonare în drojdii pentru mărirea transcripţiei

genelor de interes. Secvenţele promotor care derivă din drojdii sunt (homoloage) sau

heteroloage. Cei mai frecvenţi promotori constitutivi de drojdie sunt genele glicolitice care

conduc la o expresie transcripţională înaltă. Enzimele glicolitice din celule de drojdie

fermentate pot fi între 1 – 5% din totalul proteinei solubile, astfel că promotorii ADH, PGK şi

ENO sunt cel mai remarcabili în mărirea activităţii transcripţionale a genelor heteroloage.

Reglarea promotorilor este în primul rând facilitată de dezvoltarea celulei de drojdie în

16


absenţa expresiei genei heteroloage. Pe de altă parte, creşterea biomasei poate fi temporar

separată din expresia genei care controlează disponibilitatea pentru anumiţi nutrienţi

(galactaza în cazul GAL1, fosfatul în cazul PHO5, metionina în cazul MET25 sauu ionii de

cupru în cazul CUP1) (Tabelul 3).

Tabelul 3. Reglarea fiziologică a promotorilor transcripţionali în drojdii

Promotor Reglare fiziologică

GAL1

PHO5

ADH2

MFa1

MF1

CUP1

MEL1

MET25

Hibrid PGK/ARE

Hibrid CYC/GRE

PGK sau TPS/a 2 generator

HSE

AOX1

MOX1

Represat de glucoză, indus de galactoză

Represat de înalte şi indus de scăzute niveluri de fosfat

anorganic

Represat de glucoză, derepresat natural către sfârşitul

dezvoltării pe glucoză

Activ în celule MATa, inactiv în celule MAT sau a/

Indus de şiftul de temperatură scăzut

Indus de ionii de Cu

Indus de galactoză, represat de glucoză

Represat de metionină

Indus de dihidrotestosteron

Indus de deoxicorticosteron

Indus de siftul de temperatură scăzut

Indus de şocul de căldură (390C)

Represat de glicerol, indus de metanol (în Pichia pastoris)

Represat de glicerol, indus de metanol (Hansenula

polymorpha)

Sifturile de temperatură pot fi, de asemenea, utilizate pentru reglarea expresiei genelor

heteroloage în drojdie. [5]

În mod particular activitatea transcripţională puternică a genelor heteroloage poate fi

găsită în drojdiile metilotrofe Hansenula polymorpha şi Pichia pastoris. [6]

Un alt aspect de genetică moleculară relevat cu succes de tehnologia ADN

recombinant este selecţia markerilor corespunzători care sunt utilizaţi la izolarea şi

identificarea celulelor transformante (Tabelul 4).

17


Tabelul 4. Selecţia markerilor genetici utilizaţi în tehnologia ADN recombinant la drojdii.

Tipul de marker Gena Caracteristici

Recesiv

LEU2

TRP1

HIS3

LYS2

Gene cu mutaţii auxotrofice

complementare pentru biosinteza

aminoacizilor

URA3

ADE2

Gene cu auxotrofie complementară

pentru nucleotide

Amiloglucozidază

- LactanazăGene care conferă activitate enzimatică

Dominant

CUP1

G418R

TUNR

KILK1

C230

SMR1

SFA

Rezistenţă la cupru.

Rezistenţă la antibiotic aminoglicozidic.

Rezistenţă la Tunicamicin.

Imunitate la toxina Killer.

Marker cromogenic.

Rezistenţă la metil sulfometuran.

Codifică formiat dehidrogenaza (celule

care se dezvoltă în 6mM formaldehidă).

HygromicinR

MetotrexatR

CloramfenicolR

DiuzonR

ZeocinR

CanavaninăR

Gene care conferă rezistenţă la

medicamente

Markerii recesivi sunt gene care sunt complementare la o mutaţie auxotrofică specifică

în tulpina de drojdie gazdă.Markerii specifici dominanţi sunt necesari pentru selecţia

transformanţilor tulpinilor industriale de Saccharomyces cerevisiae.

Elementele moleculare implicate direct în secreţia de proteine sunt secvenţele semnal

ale capătului N – terminal din proteina destinată excreţiei. Aceste peptide semnal (formate din

aproximativ 15 – 30 aminoacizi) care sunt îndepărtate de proteazele specifice, sunt codificate

18


de către drojdii (native) sau de gene străine heteroloage, care sunt inserate în joncţiunea dintre

partea finală a celui de-al 5’ şi 3’ promotor (Tabelul 5).

Tabelul 5. Secvenţele semnal utilizate pentru secreţia proteinelor heteroloage din drojdii.

Tip Gena secvenţei semnal Caracteristici

Homoloage

SUC2

PHO5

Toxină Killer

- factor

MEL1

Codifică invertaza periplasmică

Codifică fosfataza acidă periplasmică din

Kluyveromyces lactis

Prepro-Mfa1 leader este cel mai frecvent utilizat

Codifică melobioza şi secreţia de glicoproteină

Heteroloage HSACodifică serumalbumina umană (HSA prepro a

fost utilizat în Pichia pastoris)

Renină de Mucor

pusillus

Lizozim de pui

Prolactin de bovine

Gastrin uman

Cele mai utilizate secvenţe semnal în Saccharomyces cerevisiae sunt cele derivate din

invertază (codificată de SUC2), fosfatază acidă (PHO5) şi - factor (MFa1). Specificitatea

exopepdidazelor KEX2 şi STE13 este pentru secvenţele de pe N – terminal ale punctului de

sciziune (Figura 3) - factor leader a fost folosit cu succes direct în secreţia numeroşilor

agenţi terapeutici umani [7].

Figura 3. Compoziţia şi procesarea - factor leader în Saccharomyces cerevisiae.

19


Procesul post – translaţional şi modificarea proteinelor recombinante de drojdie sunt

importante aspecte moleculare, care necesită o atenţie deosebită în special în ceea ce priveşte

producerea de proteine terapeutice umane. Primul pas în procesul post – translaţional este

îndepărtarea iniţiatorului de metionină din proteina astfel sintetizată de către

metionilaminopeptidaza, care este un proces comun eucariotelor superioare. Modificările

chimice pe care drojdiile le elimină odată cu proteinele heteroloage includ: glicozilarea,

fosforilarea, acetilarea, metilarea, meristilarea şi izoprenilarea [4, 8].

Sinteza şi totodată modificarea proteinelor heteroloage produse de către drojdii, suferă

mai întâi o degradare proteolitică intracelulară, înaintea purificării lor. În Saccharomyces

cerevisiae asemenea proteoliză poate fi unispecifică şi asociată cu vacuole sau poate fi

specifică şi cuplată cu sistemul ubiquitin [4, 9].

1.2. Integritatea şi menţinerea genomului mitocondrialInstabilitatea genomului mitocondrial (ADNmt) este o problemă generală de la drojdii

până la organismul uman. Oricum, controlul lui genetic nu este foarte bine cunoscut, cu

excepţia de la drojdia Saccharomyces cerevisiae. De la descoperirea, acum 50 de ani, a unor

mutante petit de către Ephrussi şi colaboratori, s-a arătat că mai mult de 100 de gene nucleare

influenţează direct sau indirect soarta rho+ din ADN mitocondrial [14].

Nu este surprinzător că mutaţiile genelor implicate în metabolismul ADNmt (replicare,

reparare, recombinare) pot cauza o pierdere completă a ADNmt (RHO0 petit) şi/sau conduc la

formele reduse ale acestui genom. Oricum, cele mai multe pierderi ale funcţiei de mutaţie,

care măresc instabilitatea ADNmt la drojdii, se comportă indirect prin implicarea în controlul

diferitelor funcţii genetice, cum ar fi translaţia mitocondrială, sinteza ATP, homeostazia Fe,

metabolismul acizilor graşi, morfologia mitocondriilor. În puţine cazuri s-a arătat că

supraexprimarea genelor măreşte nivelurile mutantelor petit. Mutaţiile la alte gene sunt letale,

în absenţa unui ADNmt funcţional, ceea ce transformă aceste drojdii petit pozitive în forme

petit negative şi celulele petit nu pot fi recuperate în aceste contexte genetice. Multe dintre

aceste date sunt explicate numai dacă una dintre ele presupune că păstrarea genomului rho+

depinde de o structură asemănătoare centromerului, indispensabilă pentru menţinerea ADNmt

rho+ şi/sau a funcţiei subunităţilor de sinteză a ATP codificate mitocondrial, în special ATP6.

20


1.3. Căile MAP – kinazei la drojdia Saccharomyces cerevisiaeUn set de 3 protein – kinaze, cunoscute ca MAPK (protein kinaza mitogen activată),

este întâlnită în mod curent ca parte a căilor de semnalizare în celulele eucariote. Aproape

două decenii de experienţe în domeniul geneticii şi biochimiei, plus completarea recentă a

hărţii genetice a Saccharomyces cerevisiae au adus la iveală doar 5 seturi MAPK funcţionale

şi distincte la această drojdie [15].

Conjugarea sexuală, creşterea celulară şi adaptarea la stres, de exemplu, toate acestea

necesită răspunsurile celulare mediate de MAPK. O principală funcţie a acestor seturi pare a fi

expresia genelor, ca răspuns la semnalele extracelulare sau ca parte a proceselor de dezvoltare

specifice. Seturile MAPK deseori par a regla ciclul celular şi invers.

În ciuda succesului erei ingineriei genetice, în descoperirea acestor căi există încă

multe lipsuri importante despre mecanismele moleculare ale activării acestor cascade, a

modului cum aceste cascade reglează funcţiile celulei. De exemplu, comparaţia căilor de

semnalizare specifice diferitelor drojdii a scos la iveală o varietate foarte mare a diferitelor

tipuri de proteine semnalizatoare, a căror funcţie activează MAPK. Totuşi modul de activare

de către aceste proteine a MAPK, rămâne neclar.

Ştim, de asemenea, că toate căile MAPK ale drojdiei se reglează reciproc şi

interacţionează cu alte căi de semnalizare pentru a produce un model de exprimare coordonat

a genelor, dar mecanismul molecular al acestuia este foarte puţin cunoscut.

1.4. Prionii din Saccharomyces cerevisiae şi Podospora sp.Studiile genetice au arătat că 2 elemente genetice non – mendeliene la Saccharomyces

cerevisiae, numite (URE3) şi (PSI) sunt prionii lui Ure2p şi respectiv Sup35p. (URE3) face

ca celula să se prerepreseze pentru catabolismul azotului, în timp ce (PSI) ridică eficienţa

supresorului ARNts. Aceeaşi abordare a dus la identificarea elementului non – mendelian

(Het-s) al fungului filamentos Podospora anserina, ca prion al proteinei het – s. Forma

prionică a proteinei het-s este cerută pentru incompatibilitatea heterocarionului, o funcţie

normală a fungului, ceea ce sugerează că alte funcţii celulare normale pot fi controlate de

prioni. (URE3) şi (PSI) implică o autopropagare şi agregarea Ure2p şi Sup35p. In vitro Ure2p

şi Sup35p, formează amiloida, o structură filamentoasă, cu o pată birefrigentă verde

caracteristică, pusă în evidenţă cu Roşu de Congo. Depozitele amiloidice sunt de o importanţă

mare pentru viitorul descoperirii unui leac împotriva bolii Alzheimer, a transmiterii

encefalopatiei spongiforme şi a multor altor boli [16].

21


1.5. Ingineria metabolică la drojdiiSaccharomyces cerevisiae este cel mai intens studiat microorganism eucariot, care

ajută la cunoaşterea biologiei celulei eucariote şi, implicit, a biologiei umane.

Vreme de câteva secole Saccharomyces cerevisiae a fost întrebuinţată în producerea

de alimente şi băuturi alcoolice, iar azi acest microorganism este folosit în numeroase procese

din cadrul industriei farmaceutice. Saccharomyces cerevisiae este un organism cu care se

lucrează uşor, deoarece este nepatogen, şi datorită multitudinii de aplicaţii apărute de-a lungul

timpului în obţinerea de produse consumabile, ca etanolul sau drojdia, a fost clasificat ca

organism GRAS (generally regarded as seif = organism considerat sigur, netoxic). De

asemenea, fermentaţia şi procesele tehnologice de producţie la scară largă cu Saccharomyces

cerevisiae fac ca acest organism sa fie atractiv, la îndemână, pentru câteva scopuri

biotehnologice, aşa cum va fi ilustrat în continuare. Un alt motiv important pentru a justifica

utilizarea microorganismului Saccharomyces cerevisiae în cadrul biotehnologiei îl reprezintă

susceptibilităţile sale la modificările genetice prin tehnologia ADN recombinant, care a fost

mai departe înlesnite de accesul la secvenţa genomică completă a Saccharomyces cerevisiae,

publicată în 1996 [16].

Îmbunătăţirea tulpinilor de drojdie de bere s-a bazat în mod tradiţional prin

mutageneză la întâmplare şi pe încrucişările genetice a două tulpini, urmate de screening, în

funcţie de calităţile de interes ale mutantelor. Dezvoltările recente ale unor metode sofisticate

în domeniul tehnologiei ADN recombinant au permis să se manipuleze o anumită cale de

interes şi de aici să se îmbunătăţească celula printr-o abordare mai directă. Totuşi, acum este

posibil să se introducă anumite perturbări genetice în sensul de a modifica puterea de iniţiere a

unei anumite gene, de a induce deleţii asupra genelor sau de a introduce gene întregi în celulă [18].

Îmbunătăţirile propietăţilor celulare obţinute prin combinarea analizelor teoretice

bazate pe informaţiile de biochimie şi pe aplicaţiile ingineriei genetice, au fost oferite de

ingineria metabolică [15]. Această abordare constă în mare în două aspecte importante:

1. partea analitică a ingineriei metabolice, care se ocupă cu studiul celulelor pentru

identificarea tintelor cele mai potrivite şi

2. ingineria genetică a celulelor care se ocupă de obţinerea unor celule cu modificările

genetice dorite.

22


Un mod de a grupa diversele ţinte pentru ingineria metabolică ar cuprinde:

- extensia categoriei substratului;

- îmbunătăţiri ale productivităţii şi producţiei (profitului);

- îmbunătăţirea performanţei procesului biotehnologic;

- îmbunătăţirea propietăţilor celulare.

1.5.1. Noi concepte asupra ingineriei metabolice

După cum s-a menţionat şi în introducere, ingineria metabolică implică o abordare

directă asupra aplicaţiei tehnologiei ADN recombinant pentru îmbunătăţirea tulpinilor, şi a

fost definită ca „îmbunătăţirea directă a formării produsului sau a propietăţilor celulare prin

modificarea unor reacţii biochimice specifice sau introducerea altora noi cu folosirea

tehnologiei ADN recombinant” [18]. În acestă definiţie termenul „reacţii biochimice” trebuie

interpretat în sensul lui mai larg. Ceea ce distinge ingineria metabolică de aplicaţiile clasice de

biologie moleculară este folosirea unei abordări directe. Aceasta presupune cunoştinţe bogate

despre sistemul folosit şi, după cum a fost menţionat în introducere, ingineria metabolică

conţine două părţi: partea analitică şi partea sintetică. Această situaţie este ilustrată în Figura

4. În anumite cazuri partea sintetică o precede pe cea analitică, dacă natura substratului are

nevoie de o extindere prin expresia unei enzime heterogene, dar în toate cazurile este

important ca părţile analitică şi sintetică să meargă mână în mână.

Acest lucru este foarte bine ilustrat prin încercările de a extinde natura substratului.

Aici, în mod clar, primii paşi sunt de a introduce gene heteroloage care activează

metabolismul substratului de interes, iar în acest scop este important să luăm în consideraţie

două strategii diferite:

a. introducerea unei gene ce codifică o proteină de legătură a membranei, care transportă

un anumit substrat în celulă în combinaţie cu o genă ce codifică o proteină

responsabilă pentru scindarea substratului;

b. introducerea unei gene ce codifică o proteină secretată în mediul extracelular, unde

substratul de interes este transformat sau scindat în substraturi care ar putea fi

asimilate direct de organismul gazdă.

23


Figura 4. Aspecte variate ale ingineriei metabolice împărţite în partea analitică şi partea sintetică.

Indiferent de strategia aleasă, este important să se asigure că genele heterogene

sunt exprimate suficient în noul sistem gazdă. Aceasta poate implica luarea în considerare a

unor posibile modificări postranslaţionale, care pot diminua sau elimina activitatea enzimei de

interes, iar aceasta necesită analize atente ale tulpinii recombinante. După obţinerea unui

24


organism recombinant ce poate folosi un anumit substrat, deseori se obţin rate scăzute şi

producţii în general mici ale produsului din substratul respectiv. Pentru a identifica problema

cea mai importantă şi a direcţiona următorul pas sintetic este necesar să se detvolte o analiză

detaliată a fiziologiei celulei. Aceasta poate fi ilustrată în mod clar în încercarea de a

transforma xiloza la etanol prin fermentaţii anaerobe cu Saccharomyces cerevisiae. Astfel,

ingineria metabolică aproape întotdeauna va implica o strânsă interacţiune între părţile

analitică şi sintetică, de obicei fiind necesare mai multe tipuri de construcţii de tulpini, înainte

de obţinerea unei tulpini recombinante optime.

În ingineria metabolică la Saccharomyces cerevisiae, partea sintetică este relativ

devansată de partea analitică. Aceasta se datorează complexităţii metabolismului celular, ce

poate interacţiona cu exprimarea genelor, ce poate determina niveluri metabolice prin

concentraţia de enzime. În multe cazuri sunt necesare multiple modificări, iar pentru fiecare

modificare, pot apărea schimbări neaşteptate ale metabolismului celular. Partea analitică se

referă în mod clasic la fiziologie, în ultimii ani numeroase tehnici avansate fiind utilizate

pentru o analiză mult mai elaborată a fiziologiei celulare. Aceasta include tehnici ale ADN

pentru analiza transcriptoamelor (cuantificarea simultană a tuturor genelor transcrise într-o

celulă), gel bidimensional de electroforeză pentru analiza proteoamelor (cuantificarea

simultană a unui număr mare de proteine într-o celulă), gaz cromatografie cu sprectrometria

de masă (GC – MS) şi lichid cromatografie cu spectrometrie de masă (LC – MS), pentru

analiza nivelurilor metabolice intracelulare, experimente cu C13 pentru analiza reţelei

metabolice, studii avansate de fermentaţie cu monitorizare on – line a variabilelor de cultivare

mai importante şi bioinformatica (modele matematice pentru analiza structurii căilor şi

structurii fluxurilor).

1.5.1.1. Analiza transcriptoamelor şi proteoamelor

Analiza metodologiei ADN în domeniul transcriptoamelor este o tehnică încă nouă în

prezent nefiind exemple despre modul cum a fost folosită tehnica în ramurile ingineriei

metabolice. Deoarece multe provocări în ingineria metabolică implică schimbări genetice

multiple, analiza transcriptoamelor va fi foarte importantă pentru ingineria metabolică în

viitor, deoarece această analiză permite studierea schemei exprimării multor gene.

Ca şi analiza transcriptoamelor, analiza proteoamelor este importantă în ingineria

metabolică. Deseori căile de activitate sunt corelate direct cu concentraţia proteinelor, şi când

exprimarea genelor şi/sau interacţiunile proteină – proteină sunt supuse unei regularizări

25


metabolice, este important să se cuantifice concentraţia proteinelor în diferite tulpini

recombinante. În mod clar, o analiză detaliată a proteomului poate fi valoroasă, deseori fiind

suficientă stabilirea concentraţiei de proteine implicate în căile studiate şi uneori măsurarea

unor proteine reglatorii ce afectează exprimarea genelor relevante.

1.5.1.2.Căile de analiză

Căile de analiză sunt folosite deseori pentru a descrie aplicaţia analizei fluxului

metabolic (MFA) şi analiza controlului metabolic. Căile de analiză s-au dovedit a fi un

succes, ca instrument ajutător pentru partea analitică a ingineriei metabolice. MFA este o

abordare globală a celulei, unde se ia în calcul reţeaua completă a reacţiilor intracelulare, unde

sunt cuantificate fluxurile, prin ramurile individuale ale reţelei. Fluxurile metabolice pot fi

estimate din balanţele şi măsurătorile de metaboliţi ale câtorva căi, prin introducerea

substraturilor marcate cu C13, urmate de măsurătorile distribuţiei acestora în metaboliţii

intracelulari. În acest caz spectroscopia de rezonanţă magnetică nucleară sau GC – MS poate

fi folosită pentru a măsura tiparul metaboliţilor precursori marcaţi. Aplicarea de substraturi

marcate permite determinări de flux ale reacţiilor reversibile şi cuantificarea raţiilor de flux

între căile biosintetice ce duc la acelaşi metabolit. Compararea distribuţiilor fluxului obţinute

în diferite condiţii fiziologice poate da informaţii de preţ despre interacţiile dintre diferite căi

sau poate ajuta la identificarea unor posibile reacţii biochimice, care nu au fost descoperite în

prealabil într-un anumit microorganism [20]. Totuşi, MFA poate fi folosit în alegerea unei

strategii bune pentru ingineria metabolică, dar, poate fi folosit şi ca un instrument pentru

caracterizarea fiziologică a unei tulpini, ce a fost manipulată în vederea introducerii unei

propietăţi noi sau modificate. Un domeniu în care MFA este interesat este îmbunătăţirea

productivităţii. Acest lucru este ilustrat în Figura 2, în care se prezintă o cale foarte simplă, în

care substratul A este convertit în produsul B, cu formarea produsului C. Substratul A poate fi

glucoza, produsul B poate fi etanolul şi produsul C poate fi glicerolul. Depăşirea obţinerii

produsului de substrat este determinată de raţia fluxurilor JB şi JA, unde productivitatea este

dată de fluxul JB. Intermediarul I nu se poate acumula în interiorul celulei, fluxul acestui

metabolit va fi egal cu fluxul ce iese din polul metabolitului. (Figura 5).

Fluxurile sunt descrise de ecuaţia: JA = JB + JC, unul din aceşti termeni poate fi

calculat, dacă celelalte două sunt măsurate. Acesta este conceptul balanţei metaboliţilor. O

strategie clară pentru a îmbunătăţi obţinerea totală de JB este de a reduce sau de a elimina

fluxul JC şi astfel în mod direct va ajunge mai mult carbon la produsul JB.

26


Oricum, formarea lui C joacă de obicei un rol important în metabolismul celular, iar

eliminarea JC de o deleţie a unei gene, va fi letală pentru celulă sau va conduce spre

auxotrofie. În unele cazuri fluxurile pot fi determinate de constrângeri adiţionale, dacă

anumiţi cofactori ca NAD(P)H sunt implicaţi în diferite ramuri. Modularea distribuţiei

fluxului în jurul punctului metabolic I, cere bineînţeles analiza completă a reţelei metabolice

şi de aceea conceptul de MFA este foarte important. MFA este în general cel mai folositor în

cazurile în care o fracţiune relativ mărită a lui C este direcţionată spre produs în vederea

obţinerii de metaboliţi primari. Nu în ultimul rând, conceptul de MFA poate, de asemenea, să

contribuie la înţelegerea modului în care producerea de metaboliţi secundari sau proteine

heteroloage este legată de metabolismul central al lui C, prin canalul metaboliţilor precursori.

[21]

MFA, de asemenea joacă un rol important în clasificarea ramurilor metabolice. Prin

analiza diferitelor mutante este posibilă obţinerea de informaţii despre reglarea diferitelor

fluxuri, dacă o anumită locaţie a căii metabolice este flexibilă sau nu. Pentru o locaţie

metabolică rigidă, enzimele din jurul punctului metabolic I din Figura 6 pot fi reglate prin

regularizarea alosterică. Astfel, implicarea activităţii uneia dintre enzime, în cascada de reacţii

dintre intermediarul I spre produsul B, ar putea să se rezolve printr-o creştere a fluxului JB şi

implicit a randamentului în produs.

Figura 5. Fluxul metabolic JA, JB şi JC prin intermediul I care este un precursor al metaboliţilor B şi C.

27


Aceasta sugerează un alt aspect important al căilor de analiză, şi anume identificarea

enzimei, care exercită controlul fluxului într-o cale metabolică dată. De fapt, problema cu

locul de ţintire al genomului, pentru a obţine o creştere a fluxului printr-o anume cale, este

legată de toate categoriile de inginerie metabolică menţionate în introducere.

Figura 6. Căile metabolice ale glucozei şi xilulozei.

Analiza controlului fluxului este o examinare a bazelor celulare „locale” ce deseori

sunt implicate într-o singură cale metabolică, în contrast cu MFA, unde se considera întreg

metabolismul celular. Studierea controlului fluxului determină efectele perturbărilor în

activităţile enzimatice, pentru a identifica cea mai bună ţintă enzimatică pentru manipularea

genetică. Interesul general este de a supraexprima genele specifice de codificare a enzimelor,

care exercită cel mai mare control asupra fluxului dintr-o cale, deoarece supraexprimarea unei

căi întregi poate fi foarte laborioasă şi deseori imposibilă. Pentru examinarea controlului

fluxului printr-o anume cale metabolică, cadrul analizelor de control metabolic poate servi ca

o unealtă folositoare. Există o varietate de metode pentru determinarea aşa – numiţilor

„coeficienţi de control al fluxului”, care determină un flux relativ mărit datorită unei oarecare 28


creşteri a activităţii enzimelor individuale [16]. La dezvoltarea analizei căilor metabolice este,

de asemenea important să se determine intermediarii ce ar lua parte într-un anumit mecanism

metabolic, care ar putea fi toxici pentru celulă în anumite condiţii. În plus, este important să

ştim dacă o anumită cale intermediară este implicată într-o cale de transducţie – semnal, care

regularizează fluxul prin calea metabolică de interes, prin anumite interacţiuni specifice

proteină – proteină sau prin influenţă la nivel transcripţional [22].

Cea mai bună strategie utilizată în studiile de inginerie metabolică la Saccharomyces

cerevisiae pentru consumul de xiloză a fost introducerea genelor XYL1 şi XYL2 originale din

drojdii capabile să utilizeze xiloza (Candida shehatae, Pichia stipitis). Gena XYL1 codifică

xiloz-reductaza (XR) care reduce xiloza la xilitol cu consum de NAD(P)H. Conversia

xilitolului în xiluloză este obţinută de gena XYL2 care codifică xilitol-dehidrogenaza (XDH)

(Figura 6).

1.5.2. Creşterea productivităţii şi producţiei

Aspectele variate ale ingineriei genetice asupra drojdiei de bere au fost revizuite acum

câţiva ani. Este posibil să fie introduse propietăţi noi în drojdia de bere, printr-o puternică

conexiune între calea analitică a ingineriei metabolice şi manipularea genetică a celulei,

pentru a ajuta ca procesul să fie mai profitabil. Unul dintre principalele motive pentru cererea

unei lungi perioade de folosire a berii este conversia nonenzimatică şi înceată a -

acetolactatului, la componentul nedorit şi fără aromă – diacetilul, care este convertit enzimatic

la acetonă şi subsecvenţial la 2, 3 butan – diol. O cale de a evita pierderea aromei, cauzată de

diacetil, este introducerea unei metode alternative de dereglare a - acetolactatului, pentru a

se trece peste formarea acetilului.

Totuşi, modificările genetice asupra drojdiei de bere prin introducerea - acetolactat

decarboxilazei heterogenă, determină tulpinile transformate să producă acetona direct din -

acetolactat, ceea ce accelerează procesul de creştere prin diminuarea fazei de lag de la

săptămâni la ore (Figura 7). - Acetolactat decarboxilaza a fost evidenţiată cu succes în

drojdii şi provine de la Klebsiella terrigena, Enterobacter aerogenes şi Acetobacter xilinum.

[23] Alte încercări de a minimaliza formarea de diacetil în drojdiile de bere au fost încununate

de succes, prin screening pentru anumite mutante şi supraexprimarea unor gene specifice, care

codifică enzime implicate în procesul de biosinteză a valinei.

29


Figura 7. Căile biochimice ce conduc la glicerol, piruvat şi etanol.

Prin tehnicile de screening pentru mutante rezistente la erbicidul sulfometuron metil şi

expunerea gradată în mediu deficient în valină şi izoleucină (izoleucină - şi valină-), s-au

descoperit tulpini cu activitate de sinteză a acetolactatului scăzută, ce determină un flux de

carbon scăzut, direcţionat spre formarea de - acetolactat. Numai jumătate din cantitatea de

diacetil a fost produsă de unele din acele tulpini în comparaţie cu tulpinile parentale.

O altă strategie de succes a fost cea de creştere a fluxului, prin calea biosintetică a

valinei, în scopul de a trece peste formarea diacetilului.

Manipularea căii metabolice centrale la Saccharomyces cerevisiae a fost folosită

pentru a se creşte productivitatea de etanol. Când 8 enzime diferite ale glicolizei au fost

exprimate separat în multivectori, nici una dintre tulpinile transformate nu a determinat o

producere mai mare de etanol decât tulpina de tip sălbatic. Nici chiar supraexprimarea

enzimelor ce catalizează reacţiile ireversibile, ca hexochinaza, fosfofructochinaza şi

30


piruvatchinaza, nu au avut efect asupra producerii de alcool. Aceste rezultate ilustrează

rigiditatea controlului fluxului prin metabolismul central al Saccharomyces cerevisiae.

Oricum, alte studii au raportat că folosirea fosfofructazei a îmbunătăţit productivitatea de

etanol în cazul resturilor celulare imobilizate care cresc doar aerob.

O problemă majoră în legătură cu producerea de etanol prin fermentaţia anaerobă la

Saccharomyces cerevisiae este formarea substanţială de glicerol, ca produs secundar. În

condiţiile de creştere aerobă, NADH citosolic format din biomasa poate fi reconvertit la

NAD+ prin formarea de glicerol, în concordanţă cu dehidrogenazele NADH mitocondrial

extern, codificate de genele NDE1 şi NDE2 şi alternativ printr-un sistem necunoscut.

Anaerob, oxidarea NADH citosolic se poate produce doar prin formarea de glicerol, deoarece

fosforilarea oxidativă nu funcţionează în astfel de condiţii.

Există două gene, GPD1 şi GPD2, amândouă codificând glicerol - 3 - fosfat

dehidrogenaza, care regenerează NAD+din NADH, în timp ce converteşte dihidroxiaceton –

fosfatul la glicerol - 3 - fosfat, dar izoenzima codificată de gena GPD2 s-a demonstrat ca fiind

cea mai importantă dintre cele două, în condiţii de anaerobioză. Conversia totală a glucozei la

etanol este redox neutră, deoarece NADH este format de gliceraldehida - 3 - fosfat -

dehidrogenaza şi deoarece conversia acetaldehidei la etanol include regenerarea NAD- din

NADH (Figura 7) de către alcool dehidrogenaza I (codificată de ADH1) [24]. Astfel,

formarea glicerolului este importantă pentru menţinerea echilibrului redox din citosol, pentru

a reoxida NADH format. O posibilă strategie pentru a optimiza producţia de etanol poate fi

deducerea formării glicerolului, prin redirecţionarea fluxului de carbon, prin manipularea

metabolismului redox. Când o mutantă gpd2 a fost crescută în condiţii de anaerobioză a fost

obţinută o producţie mai mare de etanol cu 8% în concordanţă cu reducerea de 40% a formării

glicerolului, dar creşterea specifică maximă a fost redusă cu 45% în comparaţie cu tulpina de

tip sălbatic, W303 – 1A [25]. Rezultate similare au fost obţinute cu o mutantă gpd2, provenită

de la altă tulpină de tip sălbatic, unde producţia de etanol a fost mărită doar cu 4,75 fiind

observată o reducere a maximului specific de creştere. Cum o tulpină mutantă cu o dublă

deleţie gpd1 şi gpd2 este incapabilă de a creşte în condiţii de anaerobioză, introducerea unei

noi căi pentru a regenera NAD+- a fost realizată prin exprimarea unei transhidrogenaze

bacteriene (ce catalizează NADH + NADP+ NAD+ + NADPH), provenite de la

Azotobacter vinelandii, într-o mutantă dublă gpd1gpd2. Din nefericire, unirea NAD+ a devenit

limitatoare pentru sinteza biomasei, înainte ca transhidrogenaza să fie capabilă de a susţine

sinteza de NAD+, observându-se de asemenea şi lipsa creşterii în condiţii de anaerobioză.

31


Figura 8. Asimilarea NH4+ în Saccharomyces cerevisiae, unde 2 - oxoglutaratul şi NH4

+ sunt transformate în

glutamat prin două căi diferite.

Într-o altă abordare asupra implicării ingineriei metabolice în mărirea producţiei de

etanol la Saccharomyces cerevisiae s-a intervenit în metabolismul energetic care a fost condus

în sensul schimbării cerinţelor cofactorilor, în asociaţie cu asimilarea de amoniac. Asimilarea

de amoniac la Saccharomyces cerevisiae este descrisă în Figura 8. Amoniacul şi 2 –

oxoglutaratul pot fi convertiţi în glutamat, de diferite izoenzime ale glutamat dehidrogenazei,

folosind NADPH (Gdh1) sau NADH(Gdh2) drept cofactori [22]. Amoniacul poate fi asimilat

şi de glutamin – sintetaza (Glu1), cu formarea de glutamină, care este convertită în glutamat

prin acţiunea glutamat – sintetazei (Glt1); suma celor două reacţii ale Glu1 şi Glt1 este arătată

în Figura 5. Aceste două reacţii cuplate folosesc NADH şi ATP şi au un nivel crescut dacă

formarea de glutamat apare doar pe această cale. Strategia este de a reduce surplusul de

NADH format în asociaţie cu sinteza biomasei în combinaţie cu producerea unei creşteri de

consum de ATP, care ar reduce cerinţele referitoare la producerea de glicerol şi ar creşte

formarea de etanol. Deleţia genei GDIII va da o creştere a producţiei de etanol cu 8% şi o

descreştere a producţiei de glicerol, dar maximul ratei specifice de creştere a fost pe jumătate

– în comparaţie cu cel al unei tulpini de tip sălbatic, datorită unei reduceri a ratei de sinteză a

glutamatului. Prin deleţia genei GDIII şi supraexprimarea genelor GLN1 şi GLT1 de către

promotorii PGK, producţia de etanol a fost mărită cu 3%, în comparaţie cu tulpina gdh1,

supraexprimarea acestor două gene reducând maximul ratei specifice de creştere la 90% faţă

32


de tipul sălbatic. Când GDH2 a fost supraexprimată de un promotor, într-o tulpină mutantă

GDH, maximul ratei specifice de creştere a fost în principal egal cu cel al unei tulpini de tip

sălbatic. Oricum scăderea observată în formaţiunile de glicerol a rezultat nu dintr-o creştere

considerabilă a producţiei de etanol, ci, mai degrabă dintr-o creştere a producerii de biomasă.

Totuşi ingineria metabolică care diminuează formarea de glicerol prin solicitarea unei cantităţi

mărite de NADH reoxidat în celulă, nu conduce neapărat la o mărire a producţiei de etanol.

Pentru a servi acestui scop, o reducere a surplusului de NADH ar trebui combinată cu un

consum mai mare de ATP în formarea biomasei, unde celula compensează pentru cererea

energetică mărită, prin creşterea fluxului spre etanol. Acest exemplu ilustrează cum un flux

îmbunătăţit pe una din căi poate fi obţinut prin ingineria unei căi complet diferite şi arată că

este important ca întreaga reţea metabolică să fie luată în consideraţie. În completarea

exemplului mai sus amintit, mărirea ratei de conversie a ATP la ADP poate fi obţinută prin

introducerea activităţii unei ATP-aze unei anumite celule, unde producţia unui anumit

component poate fi îmbunătăţită. Recent, au fost descrise numeroase aplicaţii ale acestei

abordări [26].

În contrast cu drojdiile folosite în industria băuturilor alcoolice, este de dorit să

direcţionăm fluxul de carbon spre glicerol în timpul formării de etanol la drojdiile

producătoare de vin, deoarece glicerolul poate îmbunătăţii calitatea vinului, oferindu-i

consistenţă.

1.5.3. Imbunătăţirea performanţelor procesului

Pentru a îmbunătăţi producţia la nivelul produşilor biotehnologici, este foarte

important să se utilizeze disciplinele de inginerie genetică, care se ocupă de designul

bioreactorului şi optimizarea tehnologiilor fermentative, care poate duce la o îmbunătăţire a

performanţelor procesului biotehnologic, obţinându-se supraproducţii.

Problematica dezvoltării unor metode optime, pentru îmbunătăţirea anumitor operaţii

ale procesului tehnic este legată de capacitatea tulpinilor de Saccharomyces cerevisiae de

îmbunătăţii performanţele procesului.

Saccharomyces cerevisiae care poate suferi o creştere pseudohifală, poate forma

asociaţii floculare, proprietate ce este de obicei atribuită drojdiilor de fermentaţie [27].

O tulpină de drojdie de bere potrivită ar trebui să fie în stare de a produce floculare,

deoarece această proprietate este cea mai convenabilă de a limpezi berea în comparaţie cu

celelalte metode convenţionale, cum ar fi filtrarea şi centrifugarea [28].

33


Numeroase studii privind flocularea au generat o bază mare de date, dar din nefericire,

compararea acestor date este restricţionată, datorită diferenţelor privitoare la condiţiile de

testare şi de creştere. Două mecanisme de floculare complet diferite au fost observate până

acum: fenotipul NewFlo, găsit în numeroase tulpini de drojdii de bere, şi fenotipul Flo1, găsit

în cele mai multe tulpini floculare de laborator.Cele două fenotipuri diferă remarcabil chiar

prin felul de a flocula. Fenotipul Flo1 dă naştere la floculaţie în timpul creşterii, neţinând

seama de semnalele pe care le primeşte din mediu, cum ar fi limitarea nutrienţilor, în timp ce

flocularea fenotipului NewFlo se pare a fi lansată la sfârşitul creşterii exponenţiale, când îşi

face apariţia lipsa de glucoză. Ultima apariţie a floculării la fenotipul NewFlo este un avantaj

evident pentru industria băuturilor, ajutând la separarea drojdiilor de băutură, dar genetica

fenotipului NewFlo rămâne a fi descoperită. Totuşi o continuare a muncii este necesară pentru

a da o imagine completă asupra genelor implicate în fenotipul Flo1, deoarece sunt necesare

mai multe cunoştiinţe genetice, decât pentru fenotipul NewFlo. Fenotipul Flo1, conţine una

sau mai multe din genele dominante floculare, din care a fost studiată gena FLO1. Aceasta

codifică o proteină a suprafeţei celulare, care joacă rolul principal în procesul de floculare.

Proteina Flo1 este ancorată în peretele celular unde partea N- terminală este expusă mediului,

iar în timpul floculării acest fragment N-terminal se poate ataşa de manoproteinele din

peretele celular vecin. Gena FLO1 a fost integrată cu succes în genomul unei tulpini de

drojdie de bere monofloculară, obţinându-se o tulpină floculară stabilă. Flocularea prin

fermentare cauzează o micşorare a numărului de celule, mărind timpul general de fermentaţie.

Gena FLO1 din tulpinile cu fenotipul Flo1, pare a fi legată la nivel transcripţional de o

creştere în transcrierea FLO1, corelată cu o creştere a floculării. Flocularea constitutivă a fost

observată în toate stadiile de creştere, dar a fost intensificată în fazele de declin şi în faza

staţionară a creşterii. Pentru a introduce flocularea într-o gazdă nefloculantă ar fi necesar să se

stabilească un sistem genetic care să exprime gena pentru floculare doar spre sfârşitul

fermentaţiei. Astfel, ingineria metabolică ar trebui să se concentreze pentru a determina un

anumit sistem genetic, care conţine una sau mai multe gene floculare dominante. Subiectul

mecanismului de control care este responsabil pentru apariţia floculării la limitarea

nutrienţilor la tulpinile fenotipului NewFlo este încă necunoscut [28, 29].

Deşi, introducerea floculării la drojdiile de bere este o metodă convenabilă de separare

a drojdiei din mediu se utilizează încă filtrarea berii care este o etapă tehnică importantă în

industria de băuturi. Prezenţa - glucanilor în orz, împiedică filtrarea datorită vâscozităţii

mărite, (Saccharomyces cerevisiae nu poate hidroliza legăturile 1,4 ale - glucanilor) şi de

34


aceea este necesară adăugarea unor enzime comerciale. Alternativ, poate fi introdusă in

drojdia de bere o genă heteroloagă care codifică - gluconaza de Bacillus subtilis şi

Trichoderma yeesei. Ultima opţiune serveşte ca sarcina pentru ingineria metabolică, deoarece

substratul este mărit pentru a include şi - glucanul şi în consecinţă procesul de obţinere a

berii poate fi îmbunătăţit. [30]

1.5.4. Îmbunătăţirea propietăţilor celulare

Un efort mărit s-a depus pentru a îmbunătăţi propietăţile existente ale Saccharomyces

cerevisiae, legate de exploatarea industrială a acestui organism. Interesante în acest sens sunt

cercetările legate de a obţine o reducere a represiei glucozei, folosită în consumul de sucroză

şi maltoză, care sunt prezente în amestecurile de zahăr din industrie şi care sunt metabolizate

în mod natural de Saccharomyces cerevisiae. Drojdia de bere este produsă aerobic din melase,

care conţin 40% până la 50% sucroză. Producţia de etanol şi produsele de panificaţie sunt

procese anaerobe folosite la scară largă, unde Saccharomyces cerevisiae metabolizează

amestecurile de zahăr. Malţul folosit pentru producerea de etanol conţine 50 – 60% maltoză,

iar amidonul prezent în aluatul pentru pâine este continuu descompus în oligozaharide prin

acţiunea amilazelor [31] Saccharomyces cerevisiae hidrolizează extracelular sucroza şi

intracelular maltoza prin acţiunea invertazei (Suc2) şi respectiv maltazei (MalS) (Figura 9).

Transportorul maltozei (MalT) joacă un rol esenţial în exprimarea genelor MAL, deoarece

maltoza este cerută ca un inductor al acestor gene, în contrast cu exprimarea genei SUC2, care

nu are nevoie de inducere. Gena MAL cuprinde, de asemenea, gena MALR, care codifică o

proteină reglatoare responsabilă pentru inducerea genelor MALT şi MALS.

Figura 9. Metabolismul sucrozei şi maltozei, în concordanţă cu genele respective: Suc2 invertaza, MalT

permeaza, MalS maltaza, MalR responsabilă de reglarea proteinelor pentru inducerea genei MalS şi MalT.

35


Când maltoza sau sucroza sunt prezente în mediu împreună cu glucoza, fazele de lag

intermitente sunt situate între consumul glucozei şi consumul iniţial de sucroză sau maltoză,

fenomen descris ca fiind sub controlul glucozei. Acest mecanism reglator poate avea un efect

costisitor asupra proceselor menţionate mai sus, datorită timpului destinat procesului de

control al glucozei. Sistemul reglator care asigură consumarea glucozei înaintea altor zaharuri

a fost studiat mai ales la nivel transcripţional, la nivelul represiei glucozei. Represia glucozei,

înlesnită de proteina Mig1, controlează exprimarea ambelor gene SUC2 şi MAL. Mecanismul

molecular al represiei glucozei cu ajutorul Mig1, este o cascadă reglatorie care poate implica

un complex de proteine ce conţine Ssn6, Tup1 şi Mig1, unde Mig1 dirijează complexul spre

un consens specific, spre promotorii genelor ţintă. Genele ţintă ale Mig1 sunt limitate nu

numai de genele ce codifică proteinele implicate în funcţiile periferice ale celulei, cum ar fi

gena SUC2, gena MAL şi gena GAL (ce codifică proteinele responsabile de utilizarea

galactozei) şi de genele metabolismului central al carbonului [32, 33].

Pentru a depăşi represia glucozei exercitată de gena SUC2, deleţia MIG1 într-o tulpină

de laborator haploidă (W303 – 1a) s-a dovedit a fi un succes, deoarece s-a observat o creştere

a exprimării genei SUC2, ce a fost obţinută atunci când celulele au crescut pe glucoză. În

plus, micşorarea controlului de glucoză a fost observată la creşterea a 2 mutante mig1 derivate

dintr-o altă tulpină de laborator haploidă şi o tulpină poliploidă industrială, respectiv pe

amestecurile sucroză – glucoză. O altă proteină recent descoperită, Mig2, contribuie de

asemenea la controlarea exprimării genei SUC2. Deleţia adiţională a MIG2 într-o tulpină

mutantă mig1 a arătat o depreciere continuă a exprimării genei SUC2. Studiile fiziologice ale

deleţiilor tulpinilor mig1mig2 au indicat că fărămiţarea lui MIG2 a condus la o continuare a

micşorării controlului glucozei şi o mărire a activităţii respiratorii; mai mult, s-a obţinut o

creştere de 12% a ratei specifice de creştere pe glucoză în comparaţie cu tipul sălbatic. Prin

urmare, deleţia concomitentă a lui MIG1 şi MIG2 s-a dovedit a fi un succes în producţia

drojdiilor de panificaţie, deoarece controlul glucozei este micşorat cu succes în metabolismul

sucrozei [34].

Rata de consumare a glucozei folosită în procesul industrial poate fi mărită fără a

apărea efectul Crabtree, iar rata specifică de creştere, care serveşte ca un important parametru

în producţia drojdiilor de panificaţie, este mărită prin această abordare.

Strategiile de succes pentru metabolismul energetic al genelor MAL pentru diminuarea

extinderii controlului glucozei exercitată asupra acestor gene este diferită de strategiile mai

sus amintite. Transferul genei MIG1 în tulpina haploidă de tip sălbatic B224 a micşorat încet

36


controlul glucozei exercitat asupra genelor MAL. Oricum, acest efect nu s-ar fi putut obţine

cu mutante mig1 derivate din haploida CEN. PK113 – 7D şi tulpina poliploidă industrială

DG1342.[35] Tulpinile mutante mig1 derivate din ultimele două tulpini de tip sălbatic au

început să consume maltoza la niveluri mai scăzute de glucoză, când au fost cultivate în medii

complexe cu glucoză – maltoză, în comparaţie cu tipurile parentale. S-a concluzionat că

aceasta se datorează unei inactivări mai puternice a metaboliţilor permeazei maltozei. Scindări

adiţionale ale genei MIG2 în mutante derivate din tipul sălbatic CEN. PK113 – 7D au arătat

un fenotip uşor mai represat decât mutanta mig1. Desfacerea lui MIG1 (şi MIG2) poate

derepresa anumite proteine implicate în semnalizarea glucozei, iar aceste proteine mediază

inactivarea permeazei maltozei. Mai multe raporturi arată că inactivarea catabolică a

permeazei maltozei, are un impact major asupra metabolismului maltozei, iar analizele de

control metabolic indică de asemenea, că permeazele maltozei limitează metabolismul

maltozei [36].

În loc de a ţinti gene reglatoare ca MIG1 şi MIG2, îmbunătăţirea consumului de

maltoză din amestecurile glucoză – maltoză au fost obţinute prin exprimarea constitutivă a

genelor structurale MAL. Exprimarea constitutivă a MALT şi MALS în mutanta mig1

derivată din tipul sălbatic B224, a arătat o utilizare simultană a glucozei şi maltozei. Când

MALT şi MALS au fost supraexprimate în tulpina de tip sălbatic, maltoza a fost utilizată în

defavoarea glucozei. După cât se poate presupune, supraexprimarea genei MALT

contracarează complet efectul de inactivare a catabolismului carbonului în transportorul

maltozei. În sprijinul micşorării controlului glucozei, supraexprimarea celor două gene

strcturale MAL a crescut rata specifică de creştere cu 0,03h -1 şi la glucoză şi la maltoză,

comparativ cu cea a tipului sălbatic [37].

Deci, această strategie pare să fie atractivă pentru micşorarea controlului glucozei în

metabolismul maltozei în cazul drojdiilor de fermentaţie, ceea ce reduce timpul de producere

a etanolului. Controlul redus al glucozei arată, de asemenea, un timp redus al procesului de

producere a pâinii, care este mai departe micşorat deoarece aluatul poate creşte şi mai repede,

ca rezultat al măririi ratei specifice de creştere.

Deleţia genelor ce codifică proteinele represoare de transcripţie sau supraexprimarea

genelor ce codifică activatorii transcripţionali pozitivi, poate fi o strategie de succes pentru

ingineria metabolică, în anumite sisteme metabolice. Această strategie poate rezulta din

supraexprimarea mai multor gene, care sunt subiectul controlului transcripţional implicând

proteina represoare de deleţie sau proteina represoare.

37


În anumite cazuri această abordare va fi favorabilă în comparaţie cu supraexprimarea

genelor ce codifică unele sau toate enzimele unei anumite căi metabolice [22].

1.6. Producerea de proteine heteroloageDe-a lungul studiilor efectuate asupra comportamentului Saccharomyces cerevisiae, ca

şi a importantei capacităţii acestei drojdii de a exprima gene străine în combinaţie cu aparatul

ei secretor, face din Saccharomyces cerevisiae un organism-gazdă atractiv pentru producerea

de anumite proteine heterogene.

Numeroase proteine heterogene care au fost folosite în scopul de a diagnostica sau ca

agenţi terapeutici umani şi vaccinuri au fost produse cu succes de Saccharomyces cerevisiae.

Interferonul uman a fost prima proteină recombinantă produsă de Saccharomyces

cerevisiae în 1981, iar în anul următor a fost produs primul vaccin obţinut prin intermediul

ingineriei genetice [38]. Producţia industrială de insulină de către Saccharomyces cerevisiae,

acoperă aproape jumătate din nevoia de insulină a 154 de milioane de diabetici din întrega

lume [39]. În ultimii ani secreţia de insulină a Saccharomyces cerevisiae a fost îmbunătăţită

prin ingineria proteinelor secvenţei leader, iar de îmbunătăţirile realizate va beneficia nu

numai farmaciile şi diabeticii, ci şi potenţialul de organism-gazdă al Saccharomyces

cerevisiae pentru producerea, de alte proteine heterogene.

Saccharomyces cerevisiae are o cale secretorie multiplă şi este capabilă de a produce

modificări posttranslaţionale ale proteinelor heterogene, cum ar fi maturarea proteolitică a

prohormonilor şi formarea legăturilor bisulfidice.[40] Aceste trăsături se aseamănă cu cele ale

celulelor mamiferelor, iar unele proteine ale mamiferelor active biologic pot fi exprimate prin

urmare cu succes şi secretate de Saccharomyces cerevisiae. În plus, transformarea

Saccharomyces cerevisiae cu ADN străin şi binescunocuta tehnologie de fermentare a acestui

organism, face din Saccharomyces cerevisiae o gazdă bună pentru producerea de proteine

heteroloage. Cu toate acestea, Saccharomyces cerevisiae prezintă unele dezavantaje, când este

folosită pentru producerea unor anumite proteine recombinante heterogene. Astfel de

probleme au fost observate ca rezultat al instabilităţii plasmidiale ducând la hiperglicozilarea

proteinelor heterogene secretate, ceea ce poate cauza efecte de imunogenitate nedorite. Pentru

a depăşi astfel de modulări nedorite ale proteinelor recombinante de interes, au fost

investigate tulpini alternative, pentru a fi folosite ca organisme gazdă [41, 42].

Celulele haploide de împerechere de tip ale Saccharomyces cerevisiae, secretă

feromonul factor - , printr-o combinare eficientă a celulelor haploide a şi . Factorul - al

38


Saccharomyces cerevisiae prepro – leader este cel mai folosit ca sistem de exprimare

secretorie pentru proteinele heterogene în numeroase şi diferite tulpini, incluzând şi

Saccharomyces cerevisiae. Fuziunea între secvenţa prepro – leader cu o genă heterogenă,

permite ca Saccharomyces cerevisiae să secrete proteine heterogene, deoarece secvenţa leader

mediază translocarea cotranslaţională (Figura 10) a fuziunii proteinei în eucariote [7].

Preregiunea secvenţei leader este separată de o peptidază – semnal, iar în aparatul Golgi

endoproteaza Kex2 separă preregiune în partea C-terminală a maturării dibazice Kex2. Înainte

de secreţie, peptida spaţiatoare a maturării Kex2 de la extremitatea C-terminală este înlăturată

prin acţiunea dipeptidil – aminopeptidazei, codificată de gena STE13 şi proteina heterogenă

este eliberată în mediul extracelular [43].

De-a lungul timpului au fost efectuate studii pentru a îmbunătăţi secreţia de insulină

prin folosirea factorului prepro – leader al Saccharomyces cerevisiae; întregul - factor

prepro – leader al Saccharomyces cerevisiae a fost folosit pentru studiile iniţiale în secreţia de

insulină cu o peptidă spaţiatoare având o secvenţă Glu – Ala – Glu – Ala, care rezultă prin

fuziunea proteinelor arătate în Figura 10 [44].

Figura 10. Ilustrarea unui factor prepro-leader fuzionat cu un precursor al insulinei.

În acest studiu, peptida spaţiatoare a fost îndepărtată cu greu de dipeptidil – aminopeptidaza,

obţinându-se în principal un precursor al insulinei Glu – Ala – Glu – Ala, deci spaţiatorul a fost

îndepărtat prin mutageneza directă asupra locului. Această modificare a factorului al secvenţei

leader a relevat cu succes exprimarea şi secreţia a numeroşi precursori insulinici. Alte studii au

arătat avantajul unui spaţiator, deoarece poate fi atinsă o îmbunătăţire a procesării Kex2p, ceea ce în

cazul insulinei este de preferat deoarece procesarea insuficientă a Kex2, poate cauza o

hiperglicozilare şi o depreciere a producţiei de insulină.

Când spaţiatorii potriviţi şi creaţi în aşa fel încât să poată fi îndepărtaţi de tripsină sau

de Achromobacter lyticusce cu o protează specifică Lys1, au fost introduşi între Kex2 dibazic

şi precursorul insulinic, producţia de precursor al insulinei a fost îmbunătăţită. Prezenţa unui

spaţiator nu numai că s-a dovedit a fi un succes pentru secreţia secvenţei leader a factorului 39


fuzionată cu precursorul insulinei, dar şi glicozilaza N – lincată a celor două părţi a -

factorului propeptidglicozilat, localizate aproape de precursorul insulinei, joacă un rol de

pivot în procesul de secreţie, deoarece lipsa acestor două glicozilaze micşorează semnificativ

secreţia precursorului insulinei [45].

O altă exprimare a fost recent demonstrată la Saccharomyces cerevisiae sub designul

secvenţelor prepro – leader obţinute prin combinarea unei abordări raţionale şi a unei

optimizări treptate [46]. Dacă liderii sintetici au fost folosiţi într-un context spaţiator potrivit,

producţia de precursor de insulină a depăşit producţia obţinută cu - factori prepro – leaderi,

şi mai departe liderii sintetici au facilitat secreţia nu numai a insulinei, dar şi a altor proteine

heterogene [46]. Experimentele pulsatorii au arătat un timp de transmisie prelungit al liderului

sintetic al proteinei de fuzionare a precursorului insulinei la Eucariote cu fuziunea proteinelor

ce conţin - factor prepro – leader, fapt ce oferă o extindere a timpului pentru împachetarea

corectă a precursorului insulinei şi deci producţie mărită. Când prepro – leaderii sintetici

lipsesc din glicozilaza N – lincată, părţile fuzionează cu proteina precursoare a insulinei

obţinându-se o producţie mai mare a precursorului de insulină împachetat corect în

comparaţie cu cea obţinută datorită secvenţelor leader cu - factori. Totuşi, lipsa de legături

N – glicozilate ale prepro – leaderilor, nu a avut un impact asupra capacităţii de secreţie, ceea

ce contrastează cu ceea ce a fost pentru prepro – leaderii - factori, după cum s-a menţionat

mai sus [47].

Înlocuirea părţii de maturare Kex2, cu o altă parte procesată enzimatic, aparţinând

prepro – leaderilor cu legăturile N – glicozilază lipsă, a dus la o secreţie a precursorului

insulinei neprocesat, iar acest precursor neprocesat ar putea fi purificat din mediul de cultură

şi maturat in vitro prin adăugarea de lysyl – protează specifică produsă de Achromobacter

lyticus [47]. Înlocuirea situsului de maturare Kex2 cu un alt situs proteolitic poate fi potrivită

pentru secretarea de proteine heterogene, ce au secvenţa de maturare Kex2 în structura lor,

deoarece o anume proteină poate fi scindată de endoproteaza Kex2, ceea ce cauzează o

descreştere a producţiei de proteine heterogene. Deci, prin alegerea unei enzime proteolitice a

cărei secvenţă de procesare nu este prezentă în proteina heterogenă de interes, această

proteină poate fi secretată ca o proteină de fuziune neprelucrată într-o tulpină mutantă kex2 şi

treptat maturarea se poate induce in vitro. În continuare, secreţia unei proteine heterogene

neprelucrate ce are un pro – leader sintetic poate fi comparată avantajos cu secreţia unei

proteine heterogene prelucrate, deoarece acest pro – leader induce o stabilitate şi o solubilitate

a proteinei de fuziune, ceea ce este de preferat înainte de începerea purificării şi maturării

40


proteinei de fuziune. Noua descoperire a secvenţei sintetice prepro – leader s-a demonstrat a fi

o pârghie extrem de puternică pentru exprimarea şi secreţia de insulină, iar aceste secvenţe

leader pot activa exprimarea şi secreţia proteinelor heterogene, ceea ce nu este posibil cu

factorul - prepro – leader folosit în mod tradiţional.

Conceptele descrise mai sus relatează câteva exemple de obţinere de tulpini de

Saccharomyces cerevisiae cu propietăţi noi sau îmbunătăţite prin inginerie genetică şi

metabolică. Ideea de bază în utilizările tulpinilor de Saccharomyces cerevisiae este aceea de a

satisface din ce în ce mai multe scopuri biotehnologice. Deoarece secvenţa completă

genomică a drojdiei este cunoscută, schimbările genetice ţintă sunt mai uşor de obţinut prin

tehnologia ADN recombinant, ceea ce facilitează şi accelerează studiile de inginerie

metabolică.. Totuşi, rigiditatea Saccharomyces cerevisiae privind alterarea funcţiilor ei

metabolice poate limita anumite abordări ale metabolismului ingineresc, acest microorganism

are cu siguranţă un potenţial mărit pentru căile energetice. Un număr de noi aplicaţii bazate pe

Saccharomyces cerevisiae vor apărea în viitor, iar acestea, împreună cu exemplele

menţionate, vor ilustra clar potenţialul tulpinii Saccharomyces cerevisiae, ca fabrică celulară

în procesele biotehnologice.

Bibliografie1. Spencer, I., Spencer, D., Yeasts Technology, Springer Verlag, Berlin Heidelberg New

York, 3-65, (1994).2. Walker, M. G., Yeast Physiology and Biotechnology, Wiley I. and Sons, 264-319, (1988).3. Berry, D. R., Russell, I. and Steward G. G., Yeast Biotechnology, Allen and Unwin,

London, (1987).4. Hinnen, A., Buxton, F., Chandhuri, B., Hein, I., Hottinger, T., Meyhack, B., Pohlig, G.,

Gene expression in recombinant micro-organism, A. Smith, Marcel Dekker Inc., New York, 121-193, (1995).

5. Piper, P.W., Kirk, N., Genetically Engineered Proteins and Enzymes from yeasts, Production Control, A. Wiseman, Ellis Horword, Leichester, UK, 147-189, (1991).

6. Faber, K. N., Horder, W., Ab. G., Vecnhuis, M., Yeast, 11, 1331-1344, (1995).7. Brake, A. I., Yeast Genetic Engineering, P. J. Barr, A. J. Brake and P. Valenzuela,

Butterwarths, Boston, 269-280, (1989).8. Exhart, M. R., Bussineau, C. M., Current opinion in Biotechnology, 7, 525-530, (1996).9. Hilt, W., Wolf, D. H., Molecular Microbiology, 6, 2437-2442, (1992).10. Wolf, K., Nonconventional Yeasts in Biotechnology, Springer Verlag, Berlin Heidelberg

New York, (1996).11. Lodder, J., The Yeasts, North Holland Publ. Co, amsterdam, (1970).12. Prillinger, H., Oberwinkler, F., Umile, C., Bauer, R., Gen. Appl. Microbiol., 39, 1-34,

(1993).13. Kutzman, C. P., Methods Enzymol, 224, 335-348, (1993). 14. Luttik, M. A. H., Overkamp, P., J. Biol.Chem., 273, 24529-24534, (1998).

41


15. Stephanopoulos, G., Aristodon, A., Nielsen, J., Metabolic engineering, academic Press, Inc. San Diego, Calif., (1998).

16. Lindquist, G., Molecular Psychiatry, 1, 376-379, (1996).17. Goffeau, A., Barell, G. B., Bussy, B., Life with 6000 genes, Science, 274, 546-567,

(1996).18. Bailey, J. E., Science, 252, 1668-1675, (1991).19. Marv, A., De Graaf, A. A., Wiechert, W., Eggeling, L., Gahm, H., Biotechnol. Bioeng.,

49, 111-129, (1996).20. Christensen, B., Nielsen, J., Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 66, 209-231, (1999).21. Pedersen, H., Carlsen, M., Nielsen, J., Appl. Environ. Microbiol., 65, 11-19, (1999).22. Ostergaard, G., Olsson, L., Nielsen, J., Microbiol. Molec. Biol., 64, 34-50, (2000).23. Yamano, S., Tomizuka, K., Gone, M., Imura, T., Tanaka, J, Inone, T., J. Biotechnol., 39,

20-26, (1995).24. Erikson, P., Andre, L., Ansell, R., Blamberg, A., Adler, L., Mol. Microbiol., 17, 95-107,

(1995).25. Valadi, H., Larsson, C., Gustafsson, L., Appl. Microbiol. Biotechnol, 50, 434-438, (1998).26. Jensen, P. R., Snoep, J. L., Westerhoff, H. V., PCT International publication no WO

98/10089, (1998).27. Stratford, M., Adv. Microb. Physiol., 33, 1-71, (1992).28. Teunissen, A., Van der Berg, J. A., Steensma, H. Y., yeast, 11, 1001-1013, (1995).29. Teunissen, A., Van der Berg Steensma, H. Y., Yeast, 11, 435-446, (1995).30. Olsen, O., Thomsen, K.,K., Carlberg Res. Commun 54, 29-39, (1989).31. Ernandes, J. R., Williams, J. W., Russell, I., Steward, G. S., J. Inst. Brew, 99, 57-71,

(1993).32. Hu, Z., Nehlin, J. O., Ronne, H., Michels, C. A., Curr. Genet., 28, 258-266, (1995).33. Trumbly, R. J., Mol. Microbiol., 6, 15-21, (1992).34. Lutfiyya, L. L., Jonston, M., Mol.Cell.Biol., 16, 4790-4797, (1996).35. Klein, C. J. L., Rasmunsen, J. J., Ronnow, B., Olsson, L., Nielsen, J., J. Biotechnol., 68,

197-212, (1999).36. Klein, C. J. L., Olsson, L. L., Nielsen, J., Enzyme Microb. Technol., 23, 91-100, (1998).37. Klein, C. J. L., Olsson, L., Ronnow, B., Mikkelsen, D. J., Nielsen, J., Food Technol.

Biotechnol., 35, 287-292, (1997).38. Hitzeman, R. A., Hagie, F. E., Levine, H. L., Nature, 293, 717-722, (1981).39. Velenzuela, P., Medina A., Rutter, W., J., Ammerrer, G., Hall, D., Nature, 298, 347-350,

(1982).40. Schekman, R., Novick, P., The molecular biology of the yeast Saccharomyces, Cold

Spring Harbor N.Y., 361-393, (1982).41. Buckholz, R. G., Gleeson, M. A. S., Appl. Biochem. Biotechnol.,38, 105-140, (1991).42. Romanos, M. A., Scorer, C. A., Clare, J. J., Yeast, 8, 423-488, (1992).43. Zsebo, K. M., Lu, S., Fieschko, J. C., Goldstein I., J. Biol. Chem., 261, 5858-5865,

(1987).44. Thim, L., Hansen, M. T., Norris, K., Boel, E., Proc. Nat. Acad., Sci USA 83, 6766-6778,

(1986).45. Corplan, S., Green, R., Rocco, J., Kurjan, J., J. Bacteriol, 173, 627-635, (1991).46. Kjeldsen, T., Petterson, A. F., Hach, M., Diers, I., Hansen, P. M., Andersen, A. S., Protein

Expr. Purif, 9, 331-336, (1997).47. Kjeldsen, T., Hach, M., Petterson, A. F., Markussen, J., Protein Expr. Purif., 14, 309-

316, (1998).

42

Date post:	28-Jan-2017
Category:	Documents
Upload:	doannguyet
View:	233 times
Download:	1 times

capitol1.doc

Documents