Laboratorul de Nanotehnologii

TEHNICI DE SPECTROSCOPIE

Mihaela Miu (mihaela.miu@imt.ro)

Definitie generala: Spectroscopia presupune analiza efectului interactiei radiatiei electromagnetice cu proba

Proprietatile radiatiei electromagnetice

energia; viteza;Lungine de unda Amplitudine

amplitudinea; frecventa; unghiul de faza; polarizarea; directia de propagare.

Modificarea a cel putin una din proprietati are loc la interactia radiatiei electromagnetice cu proba

UV Vis: raze X: excitatia electronilor adanci excitatia electronilor de valenta

IR: vibratii moleculare

unde Radio : starile de spin nuclear (in camp magnetic)

Excitarea electronica a electronilor intre orbitalii moleculariOrbitalii legaturilor simple*

4 tipuri de tranzitii posibile:

de antilegatura (neocupati)

Nivele energetice libere*

Orbitalii legaturilor duble*

(posibile stari excitate > Ee)

necesita cea mai mare energie UV indepartat) ;

( Ef)

* in

moleculelor cu leg turi duble (

E = Ee

Ef = hc/

Nivelele vibrationale si rotationale superimpuse peste nivelele electronice

Nivele rotationale Nivele vibrationale Stari electronice excitate Nivele rotationale Nivele vibrationale Stari electronice fundamentale

Metoda spectroscopicaSpectroscopie UV Vis

Fenomenul ce sta la baza

Tipul de radiatie electromagnetica

Domeniul de lungimi de unda

Domeniul de frecventa

Numar de unda

Spectroscopie de fluorescenta Spectroscopia IR

schimbarea starii electronilor exteriori

masoara absorbtia pentru a avea tranzitii din starea fundamentala in starea excitata

Electronii exteriori masoara tranzitiile din stareaexcitata in starea fundamentala Inregistreaza aparitia unor miscari vibrationale ale moleculelor Inregistreaza aparitia unor miscari vibrationale ale moleculelor atunci cind sint insotite de o modificare in momentul dipolului

1000 nm 100 nm determina comportarea chimica 14Hz - 31016Hz 310

Lumina vizibila Radiatie UV

104

106 cm-1

Spectroscopie Raman

schimbarea starii de oscilatie

radiatie IR

100

m

1 m

31012Hz - 31014Hz

100 - 104 cm-1

Spectroscopie de electroni (ESCA) Spectroscopia de rezonanta de spin (ESR)

schimbarea starii electronilor adanci

radiatia R ntgen

10 nm -100 pm

31016Hz - 31018Hz

106

108 cm-1

schimbarea starii de spin a electronului sau a starii hiperfine

microunde

1m

1 cm

300 MHz

30 GHz

0,01

1 cm-1

Spectroscopia de rezonanta magnetica nucleara (RMN)

schimbarea starii de spin a nucleului

unde radio

100 m

1m

3 MHz - 300 MHz

10-4

0.01 cm-1

I

Metoda spectroscopicaSpectroscopie UV Vis

Fenomenul ce sta la baza

Tipul de radiatie electromagnetica

Domeniul de lungimi de unda

Domeniul de frecventa

Numar de unda

Spectroscopie de fluorescenta

schimbarea starii electronilor exteriori

masoara absorbtia pentru a avea tranzitii din starea fundamentala in starea excitata masoara tranzitiile din starea excitata in starea fundamentala

Lumina vizibila Radiatie UV

1000 nm

100 nm

31014Hz - 31016Hz

104

106 cm-1

1

SPECTROSCOPIE UV - VIZFrecvente mari

Spectrul vizibil

Frecvente mici

Lungimi de unda (nm)Violet: 400 - 420 nm Indigo: 420 - 440 nm Blue: 440 - 490 nm Green: 490 - 570 nm

> Cand lumina traverseaza sau este reflectata de o substanta colorata, o parte caracteristica a lungimilor de unda este absorbita. > Lumina ramasa din spectru se presupune a fi complementara in culoare cu lungimile de unda absorbite.

Yellow: 570 - 585 nm Orange: 585 - 620 nm Red: 620 - 780 nm

Absorbtia luminii in domeniul 420-430 nm face ca substanta sa fie galbena, iar Absorbtia luminii in domeniul 500-520 nm face ca substanta sa fie rosie.

Absorbtia luminii din spectru este datorata tranzitiilor electronice

Schema de detectie in spectroscopia UV-Vis

Spectrometru cu monofascicul (pentru fiecare lungime de unda este detectata cantitatea de lumina transmisa / reflectata)

Spectrometru cu retea de diode (tot spectrul este obtinut odata)

Spectrometru dublufascicul

1. Calcularea concentratiei de specii absorbante

Transmitanta: T = I / I0 Absorbanta: A = log10 I0 / I= log101/T = - log Tcoeficient de absorbtie;

= c

c

concentratia speciilor absorbante; absorbtivitatea molara sau

coeficient de extinc ie molara.

A = cl

Legea Lambert

Beer

lumina incidenta

lumina transmisa

lumina incidenta

lumina transmisa

lumina incidenta

lumina transmisa

Absorbanta este direct proportionala cu concentratia solutiei > dublarea concentratiei dubleaza absorbtia

Absorbanta este direct proportionala cu distanta parcursa in solutie > dublarea distantei dubleaza absorbtia

1. Calcularea concentratiei de specii absorbante

A = cl

Legea Lambert

Beer

Exemplu de curbe de absorb ie la diferite concentra ii de analit curba de etalonare a absorbantei la maximul de absorb ie la max

Deviatii de la legea Beer

descrie corect solutiile diluate

La concentratii mari (> 10-2 M) apar interactii intre particulele absorbante. In plus, se modifica indicele de refractie al solutiei

Evolutia spectrului de absorbtie pentru nanocristale cu diametre de la 1,7 nm pana la 12 nm (CdSe/ZnS core/shell QD)450 nm 700 nm

2. Se poate calcula dimensiunea cristalitelor

Lungimi de unda mai mici / energii mai mari

Apare deplasarea spre albastru

blue shift

odata cu scaderea dimensiunilor

Eg (CdSebulk) = 1.75 eV Eg (CdSeOD) = 2.75 eV

bulk

= 710 nm 260 nm

QD

= 450 nm

scaderea dimensiunilor unui cristal

Ex: largirea BI Eg = 1eV corespunde unei deplasari

262 nm

pana la valori nanometrice determina aparitia fenomelor de confinare cuantica Apare fenomenul de largire a benzii interzise (BI)

2

SPECTROSCOPIE DE FLUORESCENTAdetectie complementara spectroscopiei UV-Vis > daca in spectroscopia UV-Viz se masoara energia absorbita de o molecula pentru a trece dintr-o stare fundamentala in stare excitata, > in spectroscopia de fluorescenta se masoara energia emisa de o molecula pentru a trece din starea excitata in starea fundamentala.

Schema procesului de aparitie a fluorescentei

excitare Fluorescenta dezexcitare

Schema de detectie a unui spectrometru de fluorescenta cu o geometrie la 90 utilizand o sursa de Xe

Detaliu drum optic

Schema de detectie a fluorescentei in Microarray technology

Diagrama JablonskiConversie interna > tranzitii neradiative

Vi

stari energetice de vibratie

S0 S1

stare fundamentala; prima stare de tranzitie electronica excitata

Time resolve fluorescenceProba este supusa unei iluminari in pulsuri (durata pulsurilor trebuie sa fie mai scurta ca timpul de viata) > nanoFlash Lamp

Se obtine timpul de viata al unei specii moleculare excitate

ns

s

fluorescenta

fosforescenta

Steady state fluorescence

Se obtine spectrul de emisieProba este supusa unei iluminari continue

(de fapt este o mediere a fenomenelor time resolve )

Investigarea constantei de legatura a bioconjugatelor BSA-Nanoparticule de aur prin spectroscopia de fluorescentaM. Iosin, F. Toderas, and S. Astilean, Institutul de Cercetari Experimentale Interdisciplinare, Laborator de Nanobiofotonica, Universitatea Babes Bolyai, Cluj-Napoca

Fenomen de stingere a fluorescentei

II

Metoda spectroscopica

Fenomenul ce sta la baza

Tipul de radiatie electromagnetica

Domeniul de lungimi de unda

Domeniul de frecventa

Numar de unda

Spectroscopia IR

Spectroscopie Raman

schimbarea starii de oscilatie

Inregistreaza aparitia unor miscari vibrationale ale moleculelor Inregistreaza aparitia unor miscari vibrationale ale moleculelor atunci cind sint insotite de o modificare in momentul dipolului

radiatie IR

100

m

1 m

31012Hz - 31014Hz

100 - 104 cm-1

3

SPECTROSCOPIE IR si Raman

Fiecare atom are 3 grade de libertate > o molecula cu n atomi are 3n grade de libertate3 grade de libertate descriu translatia moleculei 3 grade de libertate descriu rotatia moleculei

+

Pentru o molecula liniara, rotatia in jurul axei nu conteaza (nu afecteaza energia moleculei)

3n-6

grade de libertate descriu vibratiile fundamentale

Cele care produc o modificare neta

3n

5 grade de liberate descriu vibratiile fundamentalein momentul dipolului pot da o activitate IR in polarizare pot da o activitate Raman

Exemple:H2O CO2 molecula neliniara cu 3 atomi molecula liniara cu 3 atomi 3n 3n

Sunt vibratii active atat IR cat si Raman6 = 3 stari vibrationale 5 = 4 stari vibrationale

C6H6 (benzen)

molecula foarte mica, dar cu 30 de benzi de vibratie in IR si Raman polistiren contine 1000 de unitati monomere (16000 atomi) aproximativ 50.000 de vibratii diferite

molecula polimer

Este imposibili identificarea tuturor starilor vibrationale

simplificam luand in considerare numai gruparile chimice repetitive (ex: benzile nucleului aromatic, vibratiile C-H, C-C sau C=C

Teoria spectroscopiei de absorbtie in infrarosuPentru ca o molecula sa absoarba radiatia IR, vibratiile sau rotatiile in interiorul ei trebuie sa determine o schimbare neta in momentul de dipol

Campul electric oscilant al radiatiei electromagnetice interactioneaza cu fluctuatiile momentului de dipol al moleculei

Daca frecventa radiatiei se potriveste cu frecventa vibrationala a moleculei, atunci radiatia va fi absorbita

Va aparea o modificare in amplitudinea vibratiei moleculare.

Factori care afecteaza pozitia vibratiilor moleculelor in spectrul absorbtiilorI // Cazul unor molecule liniare (i) Tipul de vibratii (ii) Taria legaturii

ExempluLegatura C - N absoarbe la 1050 1650 cm-1 Legatura C

ExempluN absoarbe la

2200 cm-1

Energie mai mica

Energie mai mare

ExempluLegatura C - H stretch in alkene absoarbe la 2600 2800 cm-1

Exemplu In cazul unor legaturi similare, diferenta in energiaLegatura C - H bend in alkene absoarbe la 1365 1485 cm-1Atomul cu masa mai mica Atomul cu masa mai mare va vibra mai putin

de absorbtie este data de masa atomilor constituenti

Energie mai mare

Energie mai mica

va vibra mai puternic

Legatura C la 600

Cl absoarbe 800 cm-1

Legatura C la 500

Br absoarbe 600 cm-1

Atomul de Cl e mai usor > energie mai mare de vibratie

Atomul de Br e mai greu > energie mai mica de vibratie

I I // Cazul unor molecule neliniare Exemplu: apa (H2O) molecula neliniara cu 3 atomi 3n 6 = 3 stari vibrationale

3 benzi de absorbtie in IR si Raman

n

1=2

vibratii streching

2n

5=1

vibratii bending

pentru legaturile H - O

pentru structura H

O-H

Felul in care radiatia este utilizata difera in spectroscopia Raman fata de spectroscopia IR : in FTIR energia care acopera un interval de frecvente este directionata catre proba; > absorbtia are loc cand frecventa radiatiei incidente se identifica cu cea la care molecula trece intr-o stare excitata vibrationala in Raman se utilizeaza o singura frecventa a radiatiei pentru iradierea probei > radiatia este imprastiata de molecula, detectandu-se unitatile de energie vibrationale diferite de cele incidente (lumina care interactioneaza cu moleculele distorsioneaza polarizeaza norul electronic)

Imprasierea Raman trebuie exprimata ca o deplasare in energie fata de radiatia de excitatie Pentru legaturi cu un moment puternic de dipol (care sunt active IR) mobilitatea electronilor sau polarizabilitatea este de obicei scazuta. Pentru legaturi cu un moment slab de dipol (care sunt inactive IR) polarizabilitatea este de obicei mare si starile vibrationale ale legaturilor sint active Raman.

Spectru IR

Acid benzoic

Spectru Raman

Spectroscopie Raman

Nu implica nici absorbtia, nici emisia, ci imprastierea radiatiei Radiatia IR incidenta determina miscarea electronilor in legaturi si poate fi: absorbita; difuzata fara a i se modifica lungimea de unda > difuzie Rayleigh;Este sensibila la mobilitatea electronilor in legaturi (polarizabilitatea legaturilor) Masoara cit de usor este sa misti un electron si implicit sa polarizezi o legatura-4

- intensitatea Rayleigh depinde puternic de lungimea de unda I ~

imprastiata Raman-Stokes (daca lungimea de unda a radiatiei difuzate este mai mare dect cea a radiatiei incidente); imprastiata Raman-antiStokes (daca lungimea de unda a radiatiei difuzate este mai mica dect cea a radiatiei incidente);

Spectroscopie IR Energia asociata radiatiilor IR este suficienta sa stimuleze vibratiile moleculare (ale legaturilor chimice) Conditii pentru ca o molecula sa absoarba radiatia n domeniul IR: sa aiba o structura de dipol sau sa poata dobandi o astfel de structura prin excitatie perioada de vibratie trebuie sa fie in faza cu perioada de oscilatie a radiatiei incidente cantitatea de energie a radia iei IR trebuie sa fie permisa de restrictiile cuantice Spectrul IR rezultat reprezinta absorbtia si transmisia moleculara, fiind amprenta moleculara a probei

Spectrele utilizate curent sunt de fapt spectre asupra carora s-a aplicat transformata Fourier

Spectroscopia FTIR - o metoda de masura a tuturor frecventelor IR simultan utilizand interferometria

Schema de detectie

Fasciculul IR incident este divizat in 2 fascicule optice

Un fascicul se reflecta pe o oglinda plata fixa

Al 2-lea fascicul se reflecta pe o oglinda plata care se deplaseaza pe distante scurte (inainte inapoi)

Se recombina cind se reintilnesc in splitter

Pentru ca au parcurcurs drumuri optice diferite, semnalul rezultat este un semnal de interferenta

Fiecare punct contine o informatie despre fiecare frecventa IR care vine de la sursa

Spectrul FTIR pentru o solutie de etanol

O-H

C-H

C-0

Observatii: - o molecula contine legaturi care dau mai multe vibratii posibile > in spectrul IR trebuie sa se regaseasca mai multe absorbtii care sa defineasca o molecula (nu numai o legatura chimica); - se pot identifica legaturile specifice ale unei molecule (gruparile functionale) pentru a determina structura;

III

PHOTON CORRELATION SPECTROSCOPY (DYNAMIC LIGHT SCATTERING)

III

PHOTON CORRELATION SPECTROSCOPY (DYNAMIC LIGHT SCATTERING)

tehnica utilizata pentru determinarea dimensiunilor nanoparticulelorprocesul de clusterizare a particulelor in suspensie

Se obtin in plus informatii despreprocesul de adsorbtie a anticorpilor pe particule

Principiul de detectie:proba cu particule in suspensie este iluminata

particulele vor imprastia lumina in toate directiile

pe un ecran situat in vecinatate vor aparea spoturi luminoase

daca particulele ar fi fixe > imaginea de pe ecran ar fi stationara; fiind in miscare browniana > imaginea nu este stationaraproba Particule in suspensie

Intensitatea luminoasa va fluctua in timp

Din punct de vedere fizic- Atunci cand un fascicul de lumina traverseaza o solutie cu particule sferice aflate in miscare Browniana, interactiile cu particulele determina o deplasare Doppler, modificand lungimea de unda initiala

Depinde de marimea particulelor

Este posibila obtinerea distributia de dimensiuni ale sferelor si sa ai implicit o descriere a miscarii particulelor in mediul respectiv masurand coeficientul de difuzie al particulelor si utilizand functia de autocorelatie.

O functie caracteristica de autocorelatie a luminii imprastiate - determinate experimental

Particulele sau macromoleculele suspendate intr-un mediu lichid, aflate in miscare Browniana determina fluctuatiii ale concentratiei locale a particulelor apar neomogenitati locale ale indicelui de refractie

Rezulta fluctuatii ale intensitatii luminii imprastiate

Semi-largimea emisiei la semi-inaltime (HWHM) este proportionala cu coeficientul de difuzie al particulelor D:

= Dk2unde

unghiul de imprastiere

lungimea de unda a LASER-ului

IV

SPECTROSCOPIE DE IMPEDANTA

IV

SPECTROSCOPIE DE IMPEDANTA

In curent continuu E=IxR

E

Sistem analizat

I

In curent alternativ E=IxZ

E

E0 +

E sin( t)

Sistem analizat

I0 +

I sin( t + )

Z

I, E I, Udeplasare de U: phase shift faza

timp time

Prezentarea rezultatelor masuratorilor de impedanta Z (ii)

= E (i

i)

/ I (i

i)

numar complex

Prezentare in coordonate Carteziene: Z (iindicele i = 1, 2 ,i)

Prezentare in coordonate Polare : Z (ii)

= Rei + iImi.n frecventele din interval

= =Zej

i

Z= (Rei2 + iImi2)1/2 - modul ;Se realizeaza o scanare descrescatoare de la frecvente mari la frecvente mici

f i = arc tan Imi/Rei - faza. Grafice BodeSet de date 3DD3 [i,

Grafic in plan complex (Nyquist)-ImD3 [ Rei, Imi,i]

Zi, f i ]

R1

R2

Re

Avantaje si dezavantaje ale EIS

Pe de o parte functia impedanta contine toate informatiile pentru un sistem investigat (daca ipotezele de lucru sunt alese corespunzator). Pe de alta parte aceasta informatie trebuie extrasa din datele experimentale, (identificarea procedurii de analiza a datelor)

Utilizarea spectroscopiei de impedanta (i)

caracterizarea materialelor si proceselor tehnologice

structura cristalina - evaluare rapida pentru un material cu o structura policristalina a contributiei individuale la conductia electrica sau la polarizare (efectele regiunilor de contact intergranulare sau a volumului)

caracterizarea densitatii de impachetare si distributia de defecte in straturile auto-asamblate transferul electronilor prin stratul auto-asamblat de alkanethiol si implicit prin straturile corespunzatoare de recunoastere moleculara

caracterizarea electrozilor -potentialul de flat-band, densitatea de sarcina (masuratori Mott-Schottky); - proprietatile catalitice ale nanoparticulelor metalice transferul electric in materiale nanocompozite - contributia starilor electronice de suprafatala transportul electronilor

caracterizarea dinamica pentru extragerea parametrilor celulelor solare- concentratia de dopare a junctiunii, - timpul de viata efectiv; - efectul straturilor tampon asupra timpului de viata a purtatorilor minoritari;

Utilizarea spectroscopiei de impedanta electrochimica (ii)caracterizarea sistemelor electrochimice / fenomenelor fizico-chimice care apar la interfetele electrochimice- transportul de masa, transferul de sarcina prin interfata sau efectele adsorbtiei;

1.

- parametrii de reactie (relatia intre geometria electrozilor si cinetica la electrod, monitorizarea incarcarii surprafetei electrozilor datorita speciilor intermediare adsorbite; - efectele straturilor de interfata in cazul structurilor poroase.

dezvoltarea de senzori

- mecanismele ne-faradaice

2.

(pierderile ohmice, conductivitatea ionica in membranele cu schimb protonic); - investigarea integritatii oxidului / straturilor de acoperire; - ratele de corodare (proprietatile straturilor organice de acoperire in contact cu solutiile corozive

caracterizarea sistemelor bio-electrochimice- instrument de detectie in care marcarea nu este necesara (label-free) a modificarii proprietatilor de interfata prin legarea unor biomolecule incarcate pe suprafata - analiza hibridizarii AND-ului pe electrozi

Electrical / Impedance detectionBinding of DNA inside the PSi matrix induces a change in capacitance and conductance. Mott-Schottky plots for different concentration of DNA in electrolyte solution

The capacitance of the Electrolyte/PS/Si has been measured as function of DC potential and the data recorded for different concentration of DNA in electrolyte solution are presented. The figure illustrate that the test structure capacitance plots suffer modifications by adding different concentrations of DNA in electrolyte solution: the flat band potential is shifted to lower values as DNA immobilization starts from 0.31V to 0.24V and 0.21V respectively.

Experimental data Phosphate buffered saline- PBS) is a buffer solution commonly used in biological research. It is a salty solution containing sodium chloride, sodium phosphate, and (in some formulations) potassium chloride and potassium phosphate. The buffer helps to maintain a constant pH. DNA 1 1 M /50 ml PBS solution DNA 2 2 M/50ml PBS solution

Bode (a, b) and Nyquist (c) plots for different concentration of DNA in electrolyte solution

The Bode phase angle plots (a) reveal that phase angle attained a maximum at the value of -30 at higher frequency region, which tends to -20 as the concentration of DNA is increased; opposing, in lower frequencies domain, the maximum is initially around -70 and its value increases to -80 going concomitantly with a gradual shift to lower frequencies, proving that the interface phenomena became dominant. The corresponding impedance module plots fig. (b) show a similar behavior, with a more evident decrease of values in low frequencies domain. The Nyquist graphs presented in fig. (c) indicate that the data are not well separated above 200 Hz and clear distinct below, with a dominant interface capacitance.