Post on 07-Jan-2020
transcript
Proiecte de Cercetare Exploratorie tip PCE
PN-II-ID-PCE-2012-4-0018
Contractor: Institutul Clinic Fundeni
Contract nr.: 22/2013
RAPORT STIINȚIFIC
Titlu:
ROLUL MICRORNA IN MODULAREA IMUNA DUPA
SPLENECTOMIA TOTALA SI PARTIALA
Director de proiect: Conf. Dr. Catalin Vasilescu
Perioada raportata: etapa 1, 2 si 3 – 02.09.2013 - 31.12.2015
INSTITUTUL CLINIC FUNDENI
TEMA ”ROLUL MICRORNA IN MODULAREA IMUNA DUPA
SPLENECTOMIA TOTALA SI PARTIALA”
Responsabil stiintific al proiectului : Conf.Dr.Catalin Vasilescu
OBIECTIVE GENERALE
După splenectomie apar perturbari majore ale sistemului imunitar. In ultimii ani se
contureaza tot mai pregnant rolul ARN-urilor noncodante in imunitatea innascuta. Plecand de la
experienta pe care colectivul nostru o are in realizarea splenectomiilor totale si partiale si in
studierea rolului mRNA in acest proiect este urmarita identificarea microRNA-urile exprimate
diferit in plasma/serul pacientilor care au fost splenectomizati total sau partial.
Intelegerea rolului microRNA-urilor in cadrul raspunsului imun are o importanta clinica
reala in preventia si tratamentul timpuriu al posibilelor complicatii infectioase ce pot sa apara
dupa indepartarea chirurgicala a splinei. Aceste noi informatii permit stabilirea semnificatiei
prognostice si diagnostice ale acestor microRNA-uri din plasma/serul pacientilor splenectomizati.
Deoarece in splenectomia subtotala sunt conservate o parte a functiilor splenice, ipoteza care sta
la baza acestui proiect este aceea ca in plasma/serul pacientilor splenectomizati partial/subtotal,
nivelurile de microRNA sunt diferite semnificativ de nivelurile de microRNA-uri la pacientii
splenectomizati total. In continuare, vom corela nivelurile microRNA-urilor cu modificarile
specifice din cadrul raspunsului imun la pacientii splenectomizati total si subtotal.
Studiul de fata detine o componenta prospectiva, deoarece va include investigarea
aspectelor particulare raspunsului imun (descrise mai jos) in cadrul a trei categorii diferite de
pacienti selectati (grupul pacientilor care urmeaza sa efectueaza splenectomie subtotala/partiala,
grupul pacientilor care urmeaza sa efectueze splenectomie totala, grupul de control). De
asemenea, studiul va avea o componenta retrospectiva deoarece aceeasi parametrii (descrisi mai
jos) vor fi cercetati si la pacientii deja splenectomizati si care acum se afla sub urmarire clinica.
Planul proiectului este alcatuit din 2 parti:
1. Evaluarea fenomenului de toleranta la endotoxina ca expresie a raspunsului
imun innascut prin aprecierea capacitatii monocitelor/macrofagelor de secretie a
citokinelor inflamatorii (TNF alfa , IL-1, IL-6, IL-10) dupa stimularea cu LPS, folosind
ca metoda principala de detectie tehnica ELISA.
2. Identificarea nivelurilor de microRNA-uri exprimate diferit in plasma/serul
pacientilor dupa splenectomia totala respectiv partiala si corelarea acestora atat cu
nivelurile de citokine pro-inflamatorii dupa stimularea cu LPS.Mai departe, vom utiliza
microRNA-urile identificate drept markeri pentru aprecierea diferentelor intre raspunsul
imun innascut post-splenectomie totala si respectiv, post-splenectomie partial. In acest
sens, vom sublinia avantajele imune ale splenectomiei partiale/subtotale.
Rolul posibil al microRNA-urilor in reglarea raspunsului imun la pacientii la care s-a
efectuat splenectomie totala sau partiala este un domeniu inca insuficient explorat. Daca vor fi
identificati, acesti bio-markeri au o importanta clinica deosebita deoarece pot orienta clinicianul
in profilaxia si tratamentul timpuriu al complicatiilor infectioase grave post-splenectomie, cum ar
fi OPSI.
OBIECTIVELE PROIECTULUI
ETAPA 1
1.Evaluarea stadiului actual de cunoastere in domeniul proiectului
1.1. Studiul bibliografic, stabilirea protocoalelor de lucru si a criteriilor de
includere, participarea la stagii de formare si perfectionare
1.2 Determinarea surselor optime din punct de vedere al raportului calitate-pret al
echipamentelor si reactantilor
2. Generarea materialului biologic
2.1. Colectarea de materiale biologice
2.2. Inregistrarea datelor clinice
FINANTARE: 140300 RON
ETAPA 2
1. Generarea materialului biologic
1.1. Colectarea de materiale biologice
1.2 Inregistrarea datelor clinice
2. Evaluarea fenomenului de toleranta la endotoxina
2.1. Masurarea nivelelor de citokine in cadrul grupurilor studiate
3. Analiza de etapa a rezultatelor. Diseminarea rezultatelor
3.1. Analiza bioinformatica de etapa
3.2. Participarea la stagii de formare si perfectionare. Prezentarea rezultatelor la
conferinte internationale in domenii specifice proiectului
FINANTARE: 259120 RON
ETAPA 3
1. Generarea materialului biologic
1.1. Colectarea de materiale biologice
1.2 Inregistrarea datelor clinice
2. Evaluarea fenomenului de toleranta la endotoxina
2.1. Masurarea nivelelor de citokine in cadrul grupurilor studiate
2.2. Evaluarea raspunsului imun nespecific si fenomenului de toleranta la
endotoxina
3. Analiza de etapa a rezultatelor. Diseminarea rezultatelor
3.1. Analiza bioinformatica de etapa
3.2. Participarea la stagii de formare si perfectionare. Prezentarea rezultatelor la
conferinte internationale in domenii specifice proiectului
FINANTARE: 321549 RON
EVALUAREA STADIULUI ACTUAL DE CUNOASTERE IN DOMENIUL
PROIECTULUI
Imunitatea innascuta
Sistemul imunitar cuprinde mecanismele de apărare ale organismelor vii față de agenții
patogeni. Este format din două mari componente: imunitatea înnăscută şi imunitatea adaptativă.
Imunitatea înnăscută sau nespecifică grupează mecanismele imune care formează prima
linie de apărare împotriva infecţiilor. Acest tip de răspuns nu este specific unui antigen, cu toate
că include mecanisme celulare şi moleculare care recunosc anumite clase moleculare antigenice,
dar care sunt prezente înainte de contactul organismului cu agentul agresor, iar acţiunea lor oferă
răgazul intrării în funcţiune a răspunsului imun adaptativ (Murphy, 2008).
Imunitatea înnăscută sau nespecifică este antigen independentă şi nu prezintă memorie
imunologică. Aceasta înseamnă că celulele sistemului imunitar înnăscut sunt capabile să
recunoască și să reacționeze la agenții patogeni în mod general, fără a conferi o imunitate
protectoare sau de lungă durată gazdei. Este sistemul imunitar dominant la plante, fungi, insecte și
organisme pluricelulare (Abbas, 2012).
Imunitatea înnăscută este moştenită genetic şi nu mai poate fi influenţată până la sfârşitul
vieţii. Ea utilizează receptori codificați genetic pentru recunoasterea microorganismelor
patogene, iar acest fapt o diferențiază de cealalată componenta a imunitații, cea dobandita care
este prezentă numai la vertebrate.
Imunitatea înnăscută sau nespecifică este asigurată de: structurile anatomice cu rol
protector (tegumente, mucoase – intestinală, respiratorie), enzimele din secreţiile exocrine –
lizozimul, bactericina, mucusul care acoperă mucoasele, pH-ul acid al sucului gastric, care
împiedică colonizarea bacteriană, temperatura corpului prin declanşarea reacţiei febrile, ce creaza
un mediu nefavorabil dezvoltarii microorganismelor, hemostază, bariera celulara – prin celulele
cu rol fagocitar: PMN, macrofage, răspunsul inflamator.
Principalele celulele efectoare ale sistemului innascut sunt polimorfonuclearele (in special
cele neutrofile), macrofagele (MF) si celulele natural killer (NK). Macrofagele şi
polimorfonuclearele sunt celule fagocitare pentru microorganisme. Celulele NK au activitate
impotriva celulelor proprii infectate viral si celulelor tumorale.
Citokinele sunt molecule de natură proteică ce au rolul important de a transmite
informații între celulele sistemului imun, care le şi produc. Deci au rol de mesageri intercelulari.
Nu au rol efector prin ele însele şi majoritatea sunt secretate, dar pot fi şi unele exprimate pe
suprafata membranelor sau stocate in rezervoare in matricea extracelulara. Acestea se leaga de
receptori specifici de pe suprafata celulelor tinta si majoritatea sunt factori de crestere sau de
diferentiere care actioneaza asupra acestor celule din cadrul sistemului hematopoietic.
După mecanismul de acţiune, citokinele se împart în două categorii:
proinflamatoare (TNFα, IL - 1,6 şi 8, G-CSF) şi antiinflamatoare (IL-10, receptorii de TNF şi
receptorul de IL-1).
microRNA- noi actori implicati in imunitate
MicroRNA sunt fragmente de ARN non-codant, recent descoperite, cu o lungime de 20-
22 de nucleotide. Rolul lor constă în reglarea post-transcripţională a expresiei genelor prin
degradarea sau represia translaţiei unor tipuri specifice deARNmesager ("target"). Importanţa
microRNA-urilor în reglarea funcţiilor celulare normale a devenit mai clară odată cu descoperirea
şi studierea mai multor tipuri de microRNA,respectiv a targetului lor, ARN mesager. Rolul exact
al reţelei de microRNA precum şi rolul individual al fiecărui microRNA în cadrul proceselor
celulare se află în continuare în studiu (Du, 2007; Lu, 2009).
Dovezi recente indică faptul că reglarea expresiei genice prin intermediul microRNA
joacă un rol foarte important în procese celulare precum apoptoza, diferenţierea şi ciclul celular.
MicroRNA sunt implicate în reglarea funcţiilor imunologice, a răspunsului imun înnăscut şi a
celui dobândit, în dezvoltarea şi diferenţierea celulelor imune şi în prevenirea autoimunităţii
(Lewis, 2005; Selbach, 2008). In sistemul imun, microRNA intervin în diferenţierea celulelor
limfocitare B şi în inducţia, funcţia şi menţinerea reglării liniei celulare limfocitare T. La nivelul
celulelor dendritice şi macrofagelor intervin prin intermediul receptorilor Toll-like şi au rolul de a
supresa funcţia lor efectoare înainte de activarea lor sau de a urmări funcţia lor după stimulare
(Lu, 2009).
Expresii modificate ale microRNA s-au întâlnit în unele tipuri de proliferare malignă,
unde pot avea atât rol de onco- gene (miR-21, miR-106 şi miR-155), cât şi de supresoare tumorale
(let-7, miR15a/16, miR-34a şi miR-143/145). Unele microRNA sunt deja utilizate ca biomarkeri
în cancere, iar altele sunt candidate pentru terapia genică a cancerului (Croce, 2009).
Recent a fost studiată implicarea microRNA în elaborarea răspunsului imun înnăscut. În
uma stimulării cu LPS a celulelor participante la elaborarea răspunsului imun înnăscut, a
monocitelor şi macrofagelor, s-a înregistrat o creştere a expresiei unor tipuri de microRNA cum
ar fi: miR-146a, miR-155, miR-125a, miR-9, miR-132 (O'Connell, 2007; Taganov, 2006; Tili,
2007).
Rolul splinei în imunitatea înnăscută
Rolul important al splinei în protecţia împotriva agenţilor patogeni din sânge a fost
evidenţiat în studii pe pacienţi splenectomizaţi la care s-a demonstrat un deficit în formarea
răspunsurilor imune împotriva câtorva produse bacteriene, şi necesită, aşadar, profilaxia
antibiotică pe termen lung a infecţiilor (de Porto, 2010; Vasilescu, 2003; Vasilescu, 2006).
Splina este un organ limfatic cu rol fundamental in apararea antiinfectioasa. Pulpa alba
care reprezinta compartimentul imunologic activ al splinei este impartita in doua zone limfocitare
distincte ce contin limfocite T, respectiv B. Splina imbina intr-un mod unic aparare imuna
innascuta si dobandita, fiind capabila de un raspuns imediat, nespecific la stimulul bacterian
(apararea innascuta) cat si un raspuns ulterior, specific ceea ce presupune interactiunea celulelor
efectoare imune specifice unui anumit antigen cu ajutorul moleculelor complexului major de
histocompatibilitate (MHC- Major Histocompatibility Complex) exprimate de celulele
prezentatoare de antigen (APC- antigen-presenting cell) (Mebius, 2005). Aceasta presupune
faptul ca splina joaca un rol fundamental in clearance-ul bacterian fie prin raspuns antigenic, fie
prin capacitatea bactericida a macrofagelor. De asemenea exista dovezi ca splina contribuie si la
decontaminarea endotoxinica bacteriana (Altamura, 2001).
Tecile limfatice periarteriale (PALS -periarterial lymphatic sheaths) contin limfocite T si
reprezinta zona timodependenta, in timp ce foliculii limfatici (primari si secundari) contin
limfocite B si reprezinta zona timoindependenta a pulpei albe. Acestia circumscriu tecile limfatice
(Mebius, 2005). O alta zona importanta din structura splinei este zona marginala care circumscrie
foliculii primari sau zona de manta a foliculilor sendari. Zona marginala pare sa fie locul initial in
care patrund limfocitele B si T si iau contact cu antigenele circulante. In zona marginala se gasesc
limfocitele B cu memorie consecutiv raspunsului imun primar.
In ceea ce priveste macrofagele splenice, ca si efectori ai imunitatii inascute, cele din
pulpa rosie sunt mai putin diferentiate, exprima niveluri ridicate de molecule MHC II si
fagociteaza polizaharidele capsulare ale S. pneumoniae (Timens, 1991). Macrofagele zonei
marginale sunt mai diferentiate, au o exprimare limitata a moleculelor MHC II si se afla in
contact strans cu limfocitele B (Timens, 1991).
Capacitatea de fagocitoza a macrofagelor splenice este fundamentala pentru indepartarea
bacteriilor din torentul sanguin, intrucat macrofagele zonei marginale actioneaza ca APC pentru
polizaharidele bacteriene, inducand secretia de catre limfocitele B a anticorpilor specifici IgM
anti-polizaharid. Acest clearance bacterian este mai putin eficient la pacientii splenectomizati
(Jirillo, 2003).
Postsplenectomie, mecanismele de clearance bacterian sunt alterate crescand riscul la
acesti pacienti de sepsis cu bacterii gram pozitive dar si gram negative, si care este cunoscut sub
numele de OPSI (overwhelming post-splenectomy infection). Sepsisul postsplenectomie are, de
obicei un curs fulminant cu o mortalitate cuprinsa inte 50-70% (Okabayashi, 2008). OPSI este
cauzat in special de bacterii incapsulate gram pozitive precum Streptococcus pneumoniae (care
este agentul etiologic in aproximativ 80% din cazuri), Neisseria meningitidis si Haemophilus
influenzae. In ceea ce priveste mecanismele patogenice ale sepsisului cu bacterii gram pozitive
par sa existe similitudini cu sepsisul gram negativ, cel putin in ceea ce priveste eliberarea de
mediatori nocivi si citokine .
Iata deci ca splina joaca un rol important in protectia gazdei impotriva patogenilor
bacterieni, iar indepartarea ei ar trebui sa reprezinte o decizie medicala atent cantarita si nu o
manevra chirurgicala nediscriminativa (Tiron, 2008; Vasilescu, 2006). De exemplu la pacienti cu
risc crescut de sepsis cum ar fi cei infectati cu virus hepatitic C, boli inflamatorii intestinale sau
neoplazici splenectomia nu este recomandabila, pentru a evita eventuale complicatii fatale
(Altamura, 2001).
REZUMATUL ETAPEI
In prima etapa proiectului au fost inclusi in studiu toti pacientii din Clinica de
Chirurgie Generala si Transplant Hepatic a Institulului Clinic Fundeni la care s-a efectuat
splenectomie totala sau partiala prin abord clasic sau minimal invaziv.
La pacientii aflati in studiu s-au prelevat probe conform protocolului si a fost
evaluata toleranta la endotoxina prin determinarea eliberarii monocitare de citokine: TNF alfa, IL-
1, IL-6, IL-10 utilizind tehnica ELISA. De asemenea probele prelucrate in vederea determinarii
de microRNA au fost depozitate pentru analiza ulterioara
Baza materiala a fost completeta prin achizitionarea de reactivi de laborator folositi
pentru determinarea de citokine umane (IL-10, IL-6, IL-1 , TNF alpha) si de reactivi si materiale
necesarea protoacoalelor de laborator.
In perioada 17-30 noiembrie 2013, directorul de proiect a efectuat o vizita in
vederea schimbului de experienta, in cadrul laboratorului Experimetal Therapeutics din cadrul
MD Anderson Cancer Centre, Houston, USA; laborator condus de catre Prof. Dr. George Calin,
un specialist cu recunoastere internationala, in domeniul microRNA. In cadrul acestei vizite Conf.
Dr. Catalin Vasilescu a sustinut o prezentare orala cu titlul “MicroRNAs and the Dysfunction of
the Innate Immune System in Sepsis” in cadrul manifestarii “MD Anderson Cancer Center
Seminars”.
A fost publicat articolul „Fractal-like kinetics of intracellular enzymatic reactions: a
chemical framework of endotoxin tolerance and a possible non-specific contribution of
macromolecular crowding to cross-tolerance.”, autori: Vasilescu C, Olteanu M, Flondor P, Calin
GA in Theor Biol Med Model. 2013 Sep 14;10:55. doi: 10.1186/1742-4682-10-55. Revista este
clasificata ISI, are un factor de impact de 1,46 si un factor relativ de influenta de 0,753.
In a doua etapa a proiectului au fost inclusi in studiu toti pacientii din Clinica de
Chirurgie Generala si Transplant Hepatic a Institulului Clinic Fundeni la care s-a efectuat
splenectomie totala sau partiala prin abord clasic sau minimal invaziv.
La pacientii aflati in studiu s-au prelevat probe conform protocolului si a fost
evaluata toleranta la endotoxina prin determinarea eliberarii monocitare de citokine: TNF alfa, IL-
1, IL-6, IL-10 utilizind tehnica ELISA. De asemenea probele prelucrate in vederea determinarii
de microRNA au fost depozitate pentru analiza ulterioara
Baza materiala a fost completeta prin achizitionarea de reactivi de laborator folositi
pentru determinarea de citokine umane (IL-10, IL-6, IL-1 , TNF alpha) si de reactivi si materiale
necesarea protoacoalelor de laborator.
In perioada 10-13 septembrie 2014 o echipa formata din directorul de proiect
Conf. Dr. Catalin Vasilescu si un membru al echipei de cercetare Dr. Stefan Tudor a participat la
congresul international MINIMALLY INVASIVE SURGERY WEEK 2014 ANNUAL
MEETING & ENDO EXPO, care a avut loc in Statele Unite ale Americii. La aceasta conferinta a
fost prezentata comunicarea orala cu titlul: „Minimally invasive splenectomy - twenty years,
single team experience”.
In perioada 8-11 octombrie 2014 o echipa formata din directorul de proiect Conf.
Dr. Catalin Vasilescu si 3 membrii ai echipei de cercetare Dr. Stefan Tudor, Dr. Vlad Nacev si
Dr. Monica Lacatus, a participat la congresul international International Congress of Endoscopic
and Laparoscopic Surgeons of Asia (ELSA) 2014 MINIMALLY INVASIVE SURGERY : NOW
AND FUTURE. La aceasta conferinta a fost prezentata comunicarea orala cu titlul: „Robotic
Versus Laparoscopic Splenectomy. Overcoming technical challenges with robotic surgery in
minimally invasive splenectomy”.
A fost publicat articolul „MicroRNAs and ceRNAs: therapeutic implications of RNA
networks” autori: Giza DE, Vasilescu C, Calin GA. in EXPERT OPINION ON BIOLOGICAL
THERAPY ; 2014 Sep;14(9):1285-93. doi: 10.1517/14712598.2014.920812. Revista este
clasificata ISI, are un factor de impact de 3,653 si un factor relativ de influenta de 1,362.
A fost publicat articolul „Robotic Splenectomy: What is the Real Benefit?” autori: Giza
Dana Elena, Tudor Stefan, Purnichescu-Purtan Raluca Roxana, Vasilescu Catalin, in World
Journal of Surgery 2014 Dec;38(12):3067-73. doi: 10.1007/s00268-014-2697-6. Revista este
clasificata ISI, are un factor de impact de 2,348 si un factor relativ de influenta de 1,793.
In a treia etapa a proiectului au fost inclusi in studiu toti pacientii din Clinica de
Chirurgie Generala si Transplant Hepatic a Institulului Clinic Fundeni la care s-a efectuat
splenectomie totala sau partiala prin abord clasic sau minimal invaziv.
La pacientii aflati in studiu s-au prelevat probe conform protocolului si a fost
evaluata toleranta la endotoxina prin determinarea eliberarii monocitare de citokine: TNF alfa, IL-
1, IL-6, IL-10 utilizind tehnica ELISA. De asemenea probele prelucrate in vederea determinarii
de microRNA au fost depozitate pentru analiza ulterioara
Baza materiala a fost completeta prin achizitionarea de reactivi de laborator folositi
pentru determinarea de citokine umane (IL-10, IL-6, IL-1 , TNF alpha) si de reactivi si materiale
necesarea protoacoalelor de laborator.
In perioada 4 – 6 iulie 2015 o echipa formata din directorul de proiect Conf. Dr. Catalin
Vasilescu si un trei membii ai echipei de cercetare, Dr. Monica Lacatus, Dr. Stefan Tudor si Dr
Bogdan Trandafir a participat la congresul international „23rd INTERNATIONAL CONGRESS
OF THE EUROPEAN ASSOCIATION FOR ENDOSCOPIC SURGERY (EAES)” care a avut
loc in Bucuresti, Romania. La aceasta conferinta a fost prezentata comunicarea orala cu titlul:
„Partial laparoscopic splenectomy”.
In perioada 2-5 septembrie 2015 o echipa formata din directorul de proiect Conf. Dr.
Catalin Vasilescu si un doi membii ai echipei de cercetare Dr. Stefan Tudor si Dr Bogdan
Trandafir a participat la congresul international „MINIMALLY INVASIVE SURGERY WEEK
2014 ANNUAL MEETING & ENDO EXPO”, care a avut loc in New York, Statele Unite ale
Americii. La aceasta conferinta a fost prezentata comunicarea orala cu titlul: „Minimally Invasive
Partial Splenectomy – from laparoscopic to robotic surgery”.
In perioada 14-17 octombrie 2015 o echipa formata din directorul de proiect Conf. Dr.
Catalin Vasilescu si trei membrii ai echipei de cercetare, Dr. Stefan Tudor, Dr. Monica Lacatus, si
Dr Bogdan Trandafir a participat la „CONFERINȚA NAȚIONALĂ DE CHIRURGIE 2015”
care a avut loc in Bucuresti, Romania. La aceasta conferinta a fost prezentata comunicarea orala
cu titlul: „Why Do We Love da Vinci? Robotic Surgery: Myths and Realities”.
In perioada 15-18 octombrie 2015 directorul de proiect Conf. Dr. Catalin Vasilescu a
participat la „A XXIII-A CONFERINTA NATIONALA DE HEMATOLOGIE CLINICA SI
MEDICINA TRANSFUZIONALA” care a avut loc in Sinaia, Romania. La aceasta conferinta a
fost prezentata comunicarea orala cu titlul: „Chirurgia in bolile hematologice”.
In perioada 29 – 31 octombrie 2015 o echipa formata din directorul de proiect Conf. Dr.
Catalin Vasilescu si un trei membii ai echipei de cercetare, Dr. Monica Lacatus, Dr. Stefan Tudor
si Dr Bogdan Trandafir a participat la congresul international „THE 4TH INTERNATIONAL
CONGRESS IN ROBOTIC SURGERY” care a avut loc in Bucuresti, Romania. La aceasta
conferinta a fost prezentata comunicarea orala cu titlul: „Robotic Partial and Total Splenectomy -
Experience of a Single Team in a Series of 95 Cases”.
In data de 21 noiembrie 2015 directorul de proiect Conf. Dr. Catalin Vasilescu a participat
la conferinta „ACTUALITĂŢI ÎN MANAGEMENTUL AFECŢIUNILOR HEMATOLOGICE
RARE” care a avut loc la Cheile Gradistei, Romania. La aceasta conferinta a fost prezentata
comunicarea orala cu titlul: „Splenectomia la pacientul cu PTI”.
A fost publicat articolul „Cellular and Kaposi's sarcoma-associated herpes virus
microRNAs in sepsis and surgical trauma” autori: Stefan Tudor, Dana Elena Giza, Catalin
Vasilecu et. al. in revista Cell Death & Disease, (2014)5, e1559; doi:10.1038/cddis.2014.515.
Revista este clasificata ISI, are un factor de impact de 5,014 si un factor relativ de influenta
de 1,639.
MATERIAL SI METODA
Acest studiu prospectiv cuprinde pacienți splenectomizați total sau subtotal pe cale clasica
sau minimal invaziva pentru diferite afecțiuni splenice în Clinica de Chirurgie Generala si
Transplant Hepatic a Institutului Clinic Fundeni.
Splenectomia subtotalã a beneficiat în ultimii ani de o atenţie crescutã, fiind privitã ca o
alternativã la splenectomia totalã în tratarea multor afecţiuni cu determinare splenicã, cum ar fi de
exemplu o serie de afecţiuni hematologice. Chiar dacã splenectomia totalã are efecte net benefice
in astfel de afecţiuni, reducând simptomele şi îmbunãtãţind semnificativ calitatea vieţii acestor
pacienţi, totuşi in urma exerezei totale a splinei se vor manifesta ulterior consecinţele aspleniei,
una dintre cele mai importante fiind infecţiile fulminante cu diferite bacterii încapsulate, cum ar fi
Streptococcus pneumoniae (OPSI). OPSI este precedat de un tablou clinic nespecific ce cuprinde
febrã, migrenã, senzaţie de greaţã, diaree, stare de rãu general.
Cei mai mulţi dintre pacienţi dezvoltã coagulare intravascularã diseminatã si de asemenea,
acidoza şi insuficienţa renalã reprezintã, de multe ori, complicaţii majore, iar mortalitatea este
cuprinsã între 50% şi 60%. S-a demonstrat ca OPSI survine în principal în caz de infecţii
nosocomiale sau în cazul pacienţilor imunodeprimaţi (Crandall et al. 2009;Okabayashi and
Hanazaki 2008;Vasilescu et al. 2003;Vasilescu et al. 2006).
Datele referitoare la pacienti au fost obținute din studiul foilor de observație, al
protocoalelor operatorii și din studiul monocitelor și eliberării de citokine de către acestea, cu
ajutorul tehnicii ELISA, din sângele periferic al pacientilor.
Parametrii studiați au fost:
• Vârsta și sexul pacienților;
• Tipul bolii ce determină afectare splenică;
• Valoarea plasmatică a citokinelor TNF-α, IL-1, IL-6, IL-10, măsurate preoperator (în
pg/ml) , la 7 zile si la o lună postoperator inainte si după stimulare cu LPS bacterian;
• Numărul de leucocite si de monocite secretoare de citokine din sângele fiecărui pacient în
parte
Descrierea tehnicii WBS
Probele de sânge au fost prelevate de la pacienți prin puncționarea venei cubitale. Peste
probele de sânge (20 ml în tuburi de propilen) s-au adaugat 15 UI de heparinat de sodiu pentru
fiecare ml de sânge. Substanța anticoagulantă a fost testată înainte pentru a putea verifica absența
contaminării cu endotoxina.
O parte alicotă din sângele heparinizat, 15 UI/ml de sânge, a fost amestecată cu
endotoxina provenind de la Escherichia coli 055:B5, până la o concentrație finală de 0,1 ng per
ml de sânge.
Aceste probe stimulate cu endotoxina bacteriană, împreună cu cele fără endotoxină, pentru
fiecare pacient în parte au fost incubate pentru două ore la 37°C, într-o atmosferă cu 5% CO2.
După aceste două ore, plasma a fost separată prin centrifugare la 2000 g pentru 10 minute.
Au fost masurate nivelele următoarelor citokine: TNF-α, IL-1, IL-6, IL-10.
Valorile citokinelor plasmatice au fost cuantificate prin utilizarea de teste ELISA obținute
de la R&D Systems.
Pentru toți pacienții incluși în studiu am măsurat valorile acestor citokine (bazale și după
stimularea cu LPS bacterian), atât preoperator, cât si postoperator (la 7 zile si la o lună).
Apoi am calculat numărul monocitelor, secretoare de citokine, per mililitru de sânge,
utilizând numărul de leucocite, obținute din hemoleucogramă si procentul de monocite obținut din
formula leucocitară, efectuate pentru fiecare pacient preoperator și postoperator, la 7 zile,
respectiv o luna.
Am raportat apoi valorile citokinelor, obținute în urma stimulării sangvine cu LPS, la
numărul de monocite per ml, calculate anterior, și am obtinut, o asa numită, valoare corectată a
citokinelor, pentru fiecare pacient si determinare în parte pentru a evidentia capacitatea
monocitului de a elibera citokine sub stimul endotoxinic. Valorile corectate au fost cele utilizate
pentru comparația, în ceea ce privește eliberarea de citokine, între cele două grupuri de pacienți,
adică cei cu splenectomie totală și cei cu splenectomie subtotală.
Schema metodei WBS
A. B. A. B. A. B.
Două eprubete cu sânge În proba A se adaugă Se incubează pentru
integral și anticoagulant 0,1 ng/ml de sânge de LPS 2 ore la 37°C
C1 C2-pot apărea citokine datorită
A. B. agitației create de centrifugare
Supernatant C1+C2=valoarea totală(reală)
Centrifugare a citokinelor
Am calculat media valorilor corectate ale citokinelor,separat pentru fiecare grup de
pacienți în parte și separat pentru fiecare dintre cele trei date de determinare ale citokinelor, adică
preoperator, la 7 zile și la o lună. Cea preoperatorie am considerat-o valoarea de referință pentru a
putea observa daca au existat diferențe în ceea ce privește eliberarea de citokine la determinările
ulterioare în cadrul aceluiași grup de pacienți și între pacienții din cele două grupuri diferite (cu
splenectomie totală si subtotală).
A fost realizata baza de date de splenectomii efectuate in clinica noastra in perioada
raportata. Au fost inclusi in studiu numai pacientii la care splenectomia a fost interventia
principala, fiind exclusi din studiu pacientii la care splenectomia a fost o interventie secundata sau
a fost impusa de o anumita tactica operatorie;de asemenea au fost inclusi in studiu pacientii la
care interventia a fost efectuata prin abord clasic, cit si prin abord laparoscopic principalul
argument pentru alegerea caii de abord fiind dimensiunea splinei, luind in considerare faptul ca in
cazurile cu splenomegalii masive abordul laparoscopic este considerat riscant sau uneori
imposibil.
2 1 3
4
.
5
u
k
b
5
5
Probele de singe au fost duse la laboratorul central de hematologie unde s-au efecuat
dozarile de anticorpi folosind tehnica ELISA si s-au prelucrat si stocat probele de singe in vederea
determinarii ulterioare a microRNA-urilor.
Metoda utilizată în cadrul studiului de față și prin care am reușit să ajungem la aceste
rezultate, respectiv Whole Blood Stimulation ( WBS) este o metoda foarte fiabilă, deoarece
reduce factorii perturbatori, legați de culturile celulare de monocite din sângele periferic, cum ar
fi contaminarea cu endotoxina a acestora, influețând astfel rezulatele finale și modificându-le.
Sangele integral reprezinta un mediu fiziologic, unde eliberarea de citokine poate fi
studiata, deoarece sunt pastrate aici LPS binding protein si modulatorii secretiei acestora, cum ar
fi cortisolul. (Berger et al. 1997;Ertel et al. 1995).
Prin aceasta metodă am creat un model ex-vivo de sepsis, cu toate că nu poate sa confere
informatii despre procesele inflamatorii din tot organismul, însă poate fi analizată secreția de
citokine dintr-un compartiment al acestuia, în acest caz porțiunea numită PALS a splinei (Ertel,
Kremer, Kenney, Steckholzer, Jarrar, Trentz, & Schildberg 1995).
Există anumite studii care au demonstrat că TNF-α este un trigger al eliberării de citokine,
așa ca TNF-α poate induce ea singură eliberarea, de exemplu, de IL-1 sau IL-6, în aceeași
manieră ca și endotoxinele. Aceste studii sugerează de asemenea ca TNF-α acționează ca un
stimul pentru IL-1 sau IL-6, în timpul sepsisului, pentru că s-a observat că atunci cand bacteriile
sau endotoxinele ajung în sânge, are loc o masivă eliberare de TNF-α, urmată abia dupa aceea de
un varf al eliberarii de IL-1 sau IL-6 (Cannon et al. 1990;Rodrick et al. 1992).
Exista numeroase studii in literatura de specialitate privind rolul splenectomiei subtotale
în prezervarea funcției imunologice a splinei. Astfel un studiu publicat în anul 1997 de catre
Moeniralam et al (Moeniralam et al. 1997) a avut scopul de a demonstra faptul ca splina este si ea
implicata, alaturi de ficat, in producerea de IL-6,care este o citokina proinflamatorie, dupa
stimularea cu endotoxina bacteriana, datorita functiei imunologice pe care aceasta o detine.
Valorile citokinei IL-6, după administrarea de endotoxina, au fost masurate atat la grupul de
control cat si la cel splenectomizat si s-a observat ca in cazul celor din urma acestea au fost mai
mari decat la ceilalti, ceea ce demonstreaza splina moduleaza cinetica citokinelor.
Rezultate acestui studiu sunt relevante și pentru studiul nostru arătând faptul că splina are
rol în imunitatea înnăscută, iar splenectomia totală, spre deosebire de cea subtotală, privează
organismul gazda de posibilitatea de apărare în fața bacteriilor, provocând astfel complicații
infecțioase grave.
Ertel si colab. (Ertel, Kremer, Kenney, Steckholzer, Jarrar, Trentz, & Schildberg 1995) a
demonstrat prin stimularea sangelui integral cu LPS, metoda folosita si in studiul de fata sinteza
scazuta de citokine in sepsis. In cadrul studiului s-a utilizat sange integral recoltat de la 15
pacienti aflati in stare septica si de la 20 de pacienti reprezentand grupul de control, ce nu
prezentau nici unul dintre criteriile sepsisului ( in expectative interventiei chirurgicale
reprezentate de cura herniei sau colecistectomie). Sangele de la pacientii septici a fost recoltat in
ziua admisiei in spital si apoi la 1, 2, 3, 5, 7 si 10 zile dupa si de la cei din grupul de control , doar
preoperator pentru a exclude orice influenta asupra rezultatelor, cauzata de stresul chirurgical
sau de anestezie, pentru a putea masura nivelele de citokine proinflamatorii TNF-α, IL-1 β si IL-
6 si cinetica acestora.
O parte din sangele, de la fiecare pacient in parte, din cadrul ambelor grupuri, respectiv cel
cu septici si cel de control , a fost stimulat cu antigene bacteriene , si anume lipopolizaharid
provenind de la E.coli, in cantitate de 1µg/ml, masurandu-se comparativ nivelele de citokine
TNF-α, IL-1 β si IL-6 din momentul incubarii si la 24 de ore ulterior, si de asemenea din partea
de sange nestimulata.
S-a observat o crestere semnificativa a nivelului de citokine proinflamatorii in sangele
stimulat cu LPS bacterian la 24 de ore de la incubatie, in cazul pacientilor din grupul de control ,
in timp ce in cazul pacientilor septici , din contra, s-a inregistrat o scadere marcata a acestora , ce
s-a mentinut de altfel 10 zile. Acest lucru demonstreaza ca in cazul organismelor
imunodeprimate, cum se intampla in cazul pacientilor septici, monocitele din sange nu mai sunt
capabile de a sintetiza si elibera citokine proinflamatorii ca raspuns la un stimul antigenic, de
exemplu bacterian.
In cursul etapei 3 pe masura acumularii rezultatelor preliminarii au aparut urmatoarele
aspecte:
1. necesitatea introducerii unui lot de control fata de planul initial. Observatiile si analiza
rezultatelor obtinute in etapele anterioare au impus introducerea unui nou lot de control alcatuit
din pacienti cu operatii elective, dar fara splenectomie si de pacienti cu imunodepresie de alta
natura (de exemplu pacienti septici). Introducerea acestui nou lot de control a aparut ca absolut
necesara pentru clarificarea rolul microRNA in modularea imuna dupa splenectomia totala si
partiala.
2. Adaptarea design-ului de studiu la rezultatele deja obtinute a impus restructurarea
loturilor de control.
3. Analiza doar acestor pacienti cu operatii elective si cu imunodepresie datorata
sepsisului a condus la descoperirea unui fenomen nou: identificarea unui nivel constant crescut de
mRNA virale (KSHV - Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus) la pacientii cu diverse tipuri de
operatii si la pacientii septici. Aceste rezultate colaterale au fost bine primite in comunitatea
stiintifica si au facut deja in parte obiectul publicarii in revista Cell Death & Disease care face
parte din grupul de publicatii Nature. Aceasta revista are IMPACT FACTOR 5,014 si SCOR
RELATIV DE INFLUENTA 1,639.
REZULTATELE ACTUALE SI GRADUL DE REALIZARE A OBIECTIVELOR:
ETAPA 1
1.Evaluarea stadiului actual de cunoastere in domeniul proiectului
1.1. Studiul bibliografic, stabilirea protocoalelor de lucru si a criteriilor de
includere, participarea la stagii de formare si perfectionare - Obiectiv indeplinit conform
raportului de activitate
1.2 Determinarea surselor optime din punct de vedere al raportului calitate-pret al
echipamentelor si reactantilor - Obiectiv indeplinit conform raportului de activitate
2. Generarea materialului biologic
2.1. Colectarea de materiale biologice - Obiectiv indeplinit conform raportului de
activitate
2.2. Inregistrarea datelor clinice - Obiectiv indeplinit conform raportului de
activitate
ETAPA 2
1. Generarea materialului biologic
1.1. Colectarea de materiale biologice - Obiectiv indeplinit conform raportului de
activitate
1.2 Inregistrarea datelor clinice - Obiectiv indeplinit conform raportului de
activitate
2. Evaluarea fenomenului de toleranta la endotoxina
2.1. Masurarea nivelelor de citokine in cadrul grupurilor studiate - Obiectiv
indeplinit conform raportului de activitate
3. Analiza de etapa a rezultatelor. Diseminarea rezultatelor
3.1. Analiza bioinformatica de etapa - Obiectiv indeplinit conform raportului de
activitate
3.2. Participarea la stagii de formare si perfectionare. Prezentarea rezultatelor la
conferinte internationale in domenii specifice proiectului - Obiectiv indeplinit conform
raportului de activitate
ETAPA 3
1. Generarea materialului biologic
1.1. Colectarea de materiale biologice - Obiectiv indeplinit conform raportului de
activitate
1.2 Inregistrarea datelor clinice - Obiectiv indeplinit conform raportului de
activitate
2. Evaluarea fenomenului de toleranta la endotoxina
2.1. Masurarea nivelelor de citokine in cadrul grupurilor studiate - Obiectiv
indeplinit conform raportului de activitate
2.2. Evaluarea raspunsului imun nespecific si fenomenului de toleranta la
endotoxina - Obiectiv indeplinit conform raportului de activitate
3. Analiza de etapa a rezultatelor. Diseminarea rezultatelor
3.1. Analiza bioinformatica de etapa - Obiectiv indeplinit conform raportului de
activitate
3.2. Participarea la stagii de formare si perfectionare. Prezentarea rezultatelor la
conferinte internationale in domenii specifice proiectului - Obiectiv indeplinit conform
raportului de activitate
CONCLUZII
Până in prezent in cadrul proiectului s-au achizitionat echipamentele si a reactivii de
laborator necesari. Au fost inclusi in studiu pacientii la care interventia chirurgicala a fost
efectuata pe perioada raportata. S-au determinat nivelele de citokine la pacientii inclusi in studiu
pana la data raportarii.
Au fost publicate patru articole in reviste cotate ISI :
1. Fractal-like kinetics of intracellular enzymatic reactions: a chemical framework of
endotoxin tolerance and a possible non-specific contribution of macromolecular crowding to
cross-tolerance., autori: Vasilescu C, Olteanu M, Flondor P, Calin GA in Theor Biol Med Model.
2013 Sep 14;10:55. doi: 10.1186/1742-4682-10-55. IMPACT FACTOR 1,46, SCOR
RELATIV DE INFLUENTA 0,753.
2. Robotic Splenectomy: What is the Real Benefit? Giza DE, Tudor S, Purnichescu-
Purtan RR, Vasilescu C. World J Surg. 2014 Dec;38(12):3067-73. doi: 10.1007/s00268-014-
2697-6. IMPACT FACTOR 2,348, SCOR RELATIV DE INFLUENTA 1,793
3. MicroRNAs and ceRNAs: therapeutic implications of RNA networks. Giza DE,
Vasilescu C, Calin GA. Expert Opin Biol Ther. 2014 Sep;14(9):1285-93. doi:
10.1517/14712598.2014.920812. IMPACT FACTOR 3,653, SCOR RELATIV DE
INFLUENTA 1,362
4. Cellular and Kaposi's sarcoma-associated herpes virus microRNAs in sepsis and
surgical trauma: Stefan Tudor, Dana Elena Giza, Catalin Vasilecu et. al. Cell Death & Disease,
(2014)5, e1559; doi:10.1038/cddis.2014.515. IMPACT FACTOR 5,014, SCOR RELATIV DE
INFLUENTA 1,639.
Directorul de proiect a efectuat o vizita in vederea schimbului de experienta, in cadrul
laboratorului Experimetal Therapeutics din cadrul MD Anderson Cancer Centre, Houston, USA;
laborator condus de catre Prof. Dr. George Calin, un specialist cu recunoastere internationala, in
domeniul microRNA. In cadrul acestei vizite Conf. Dr. Catalin Vasilescu a sustinut o prezentare
orala cu titlul “MicroRNAs and the Dysfunction of the Innate Immune System in Sepsis” in
cadrul manifestarii “MD Anderson Cancer Center Seminars”.
Au fost prezentate cinci comunicari orale la congrese internationale de prestigiu:
- Minimally invasive splenectomy - twenty years, single team experience. C. Vasilescu,
S. Tudor, Monica Lacatus, Dana Elena Giza. MINIMALLY INVASIVE SURGERY WEEK 2014
ANNUAL MEETING & ENDO EXPO, 10-13 Septembrie, 2014. USA.
- Robotic Versus Laparoscopic Splenectomy. Overcoming Technical Challenges with
Robotic Surgery in Minimally Invasive Splenectomy. C. Vasilescu, S. Tudor, Monica Lacatus,
V. Nacev. The International Congress of Endoscopic and Laparoscopic Surgeons of Asia (ELSA
2014). 8-11 Octombrie, 2014. Indonesia
- Partial laparoscopic splenectomy C. Vasilescu. 23rd INTERNATIONAL CONGRESS
OF THE EUROPEAN ASSOCIATION FOR ENDOSCOPIC SURGERY (EAES), 4 – 6 iulie,
2015. Romania
- Minimally Invasive Partial Splenectomy – from laparoscopic to robotic surgery. C.
Vasilescu, S. Tudor, B. Trandafir MINIMALLY INVASIVE SURGERY WEEK 2014 ANNUAL
MEETING & ENDO EXPO, 2-5 Septembrie, 2015. USA.
- Robotic Partial and Total Splenectomy - Experience of a Single Team in a Series of 95
Cases. Monica Lacatus, C. Vasilescu. THE 4TH INTERNATIONAL CONGRESS IN ROBOTIC
SURGERY. 29-31 Octombrie, 2015, Romania
Au fost prezentate trei comunicari orale la congrese nationale de prestigiu:
- Why Do We Love da Vinci? Robotic Surgery: Myths and Realities. C. Vasilescu.
CONFERINȚA NAȚIONALĂ DE CHIRURGIE. 14-17 Octombrie 2015, Romania
- Chirurgia in bolile hematologice. C. Vasilescu. A XXIII-A CONFERINTA
NATIONALA DE HEMATOLOGIE CLINICA SI MEDICINA TRANSFUZIONALA. 15-18
Octombrie, 2015, Romania
- Splenectomia la pacientul cu PTI. C. Vasilescu. ACTUALITĂŢI ÎN
MANAGEMENTUL AFECŢIUNILOR HEMATOLOGICE RARE. 21 Noiembrie, 2015.
Romania
References
Abbas, A.K., Lichtman, A.H., and Pillai, S. Cellular and Molecular Immunology, Elsevier
Saunders Philadelphia 2012.
Altamura, M., Caradonna, L., Amati, L., Pellegrino, N.M., Urgesi, G., and Miniello, S.
Splenectomy and sepsis: the role of the spleen in the immune-mediated bacterial
clearance, Immunopharmacol.Immunotoxicol., 2001 23(2):153-161.
Berger, D., Boelke, E., Seidelmann, M., Vasilescu, C., & Beger, H.G. 1997. Endotoxin-induced
cytokine release from whole blood - similarities between monocyte dysfunction in
septic disease and during post-operative acute phase response. J Endotox Res, 4, (1)
17-24
Cannon, J.G., Tompkins, R.G., Gelfand, J.A., Michie, H.R., Stanford, G.G., van der Meer, J.W.,
Endres, S., Lonnemann, G., Corsetti, J., Chernow, B., & . 1990. Circulating
interleukin-1 and tumor necrosis factor in septic shock and experimental endotoxin
fever. J Infect.Dis., 161, (1) 79-84 available from: PM:2295861
Crandall, M., Shapiro, M.B., & West, M.A. 2009. Does splenectomy protect against immune-
mediated complications in blunt trauma patients? Mol.Med., 15, (7-8) 263-267
available from: PM:19593410
Croce, C.M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer, Nat.Rev.Genet.,
2009 10(10):704-714.
de Porto, A.P., Lammers, A.J., Bennink, R.J., ten Berge, I.J., Speelman, P., and Hoekstra, J.B.
Assessment of splenic function, Eur.J Clin.Microbiol.Infect.Dis., 2010 29(12):1465-
1473.
Du, T. and Zamore, P.D. Beginning to understand microRNA function, Cell Res., 2007
17(8):661-663.
Ertel, W., Kremer, J.P., Kenney, J., Steckholzer, U., Jarrar, D., Trentz, O., and Schildberg, F.W.
Downregulation of proinflammatory cytokine release in whole blood from septic
patients, Blood, 1995 85(5):1341-1347.
Jirillo, E., Mastronardi, M.L., Altamura, M., Munno, I., Miniello, S., Urgesi, G., and Amati, L.
The immunocompromised host: immune alterations in splenectomized patients and
clinical implications, Curr.Pharm.Des, 2003 9(24):1918-1923.
Lewis, B.P., Burge, C.B., and Bartel, D.P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines,
indicates that thousands of human genes are microRNA targets, Cell, 2005
120(1):15-20.
Lu, L.F. and Liston, A. MicroRNA in the immune system, microRNA as an immune system,
Immunology, 2009 127(3):291-298.
Mebius, R.E. and Kraal, G. Structure and function of the spleen, Nat.Rev.Immunol., 2005
5(8):606-616.
Moeniralam, H.S., Bemelman, W.A., Endert, E., Koopmans, R., Sauerwein, H.P., & Romijn, J.A.
1997. The decrease in nonsplenic interleukin-6 (IL-6) production after splenectomy
indicates the existence of a positive feedback loop of IL-6 production during
endotoxemia in dogs. Infect.Immun., 65, (6) 2299-2305 available from: PM:9169767
Murphy, K., Travers, P., and Walport, M. Janeways Immunology, Garland Science 2008.
O'Connell, R.M., Taganov, K.D., Boldin, M.P., Cheng, G., and Baltimore, D. MicroRNA-155 is
induced during the macrophage inflammatory response, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,
2007 104(5):1604-1609.
Okabayashi, T. and Hanazaki, K. Overwhelming postsplenectomy infection syndrome in adults -
a clinically preventable disease, World J.Gastroenterol., 2008 14(2):176-179.
Rodrick, M.L., Moss, N.M., Grbic, J.T., Revhaug, A., O'Dwyer, S.T., Michie, H.R., Gough, D.B.,
Dubravec, D., Manson, J.M., Saporoschetz, I.B., & . 1992. Effects of in vivo
endotoxin infusions on in vitro cellular immune responses in humans. J
Clin.Immunol., 12, (6) 440-450 available from: PM:1287036
Selbach, M., Schwanhausser, B., Thierfelder, N., Fang, Z., Khanin, R., and Rajewsky, N.
Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs, Nature, 2008
455(7209):58-63.
Taganov, K.D., Boldin, M.P., Chang, K.J., and Baltimore, D. NF-kappaB-dependent induction of
microRNA miR-146, an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune
responses, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 2006 103(33):12481-12486.
Tili, E., Michaille, J.J., Cimino, A., Costinean, S., Dumitru, C.D., Adair, B., Fabbri, M., Alder,
H., Liu, C.G., Calin, G.A., and Croce, C.M. Modulation of miR-155 and miR-125b
levels following lipopolysaccharide/TNF-alpha stimulation and their possible roles
in regulating the response to endotoxin shock, J.Immunol., 2007 179(8):5082-5089.
Timens, W. The human spleen and the immune system: not just another lymphoid organ,
Res.Immunol., 1991 142(4):316-320.
Tiron, A. and Vasilescu, C. [Role of the spleen in immunity. Immunologic consequences of
splenectomy], Chirurgia.(Bucur.), 2008 103(3):255-263.
Vasilescu, C., Stanciulea, O., Colita, A., Stoia, R., Moicean, A., and Arion, C. [Laparoscopic
subtotal splenectomy in the treatment of hereditary spherocytosis],
Chirurgia.(Bucur.), 2003 98(6):571-576.
Vasilescu, C., Stanciulea, O., Tudor, S., Stanescu, D., Colita, A., Stoia, R., Coriu, D., Colita, A.,
and Arion, C. Laparoscopic subtotal splenectomy in hereditary spherocytosis : to
preserve the upper or the lower pole of the spleen?, Surg.Endosc., 2006 20(5):748-
752.