Proiecte de Cercetare Exploratorie tip PCE PN-II-ID-PCE...

Proiecte de Cercetare Exploratorie tip PCE

PN-II-ID-PCE-2012-4-0018

Contractor: Institutul Clinic Fundeni

Contract nr.: 22/2013

RAPORT STIINȚIFIC

Titlu:

ROLUL MICRORNA IN MODULAREA IMUNA DUPA

SPLENECTOMIA TOTALA SI PARTIALA

Director de proiect: Conf. Dr. Catalin Vasilescu

Perioada raportata: etapa 1, 2 si 3 – 02.09.2013 - 31.12.2015

INSTITUTUL CLINIC FUNDENI

TEMA ”ROLUL MICRORNA IN MODULAREA IMUNA DUPA

SPLENECTOMIA TOTALA SI PARTIALA”

Responsabil stiintific al proiectului : Conf.Dr.Catalin Vasilescu

OBIECTIVE GENERALE

După splenectomie apar perturbari majore ale sistemului imunitar. In ultimii ani se

contureaza tot mai pregnant rolul ARN-urilor noncodante in imunitatea innascuta. Plecand de la

experienta pe care colectivul nostru o are in realizarea splenectomiilor totale si partiale si in

studierea rolului mRNA in acest proiect este urmarita identificarea microRNA-urile exprimate

diferit in plasma/serul pacientilor care au fost splenectomizati total sau partial.

Intelegerea rolului microRNA-urilor in cadrul raspunsului imun are o importanta clinica

reala in preventia si tratamentul timpuriu al posibilelor complicatii infectioase ce pot sa apara

dupa indepartarea chirurgicala a splinei. Aceste noi informatii permit stabilirea semnificatiei

prognostice si diagnostice ale acestor microRNA-uri din plasma/serul pacientilor splenectomizati.

Deoarece in splenectomia subtotala sunt conservate o parte a functiilor splenice, ipoteza care sta

la baza acestui proiect este aceea ca in plasma/serul pacientilor splenectomizati partial/subtotal,

nivelurile de microRNA sunt diferite semnificativ de nivelurile de microRNA-uri la pacientii

splenectomizati total. In continuare, vom corela nivelurile microRNA-urilor cu modificarile

specifice din cadrul raspunsului imun la pacientii splenectomizati total si subtotal.

Studiul de fata detine o componenta prospectiva, deoarece va include investigarea

aspectelor particulare raspunsului imun (descrise mai jos) in cadrul a trei categorii diferite de

pacienti selectati (grupul pacientilor care urmeaza sa efectueaza splenectomie subtotala/partiala,

grupul pacientilor care urmeaza sa efectueze splenectomie totala, grupul de control). De

asemenea, studiul va avea o componenta retrospectiva deoarece aceeasi parametrii (descrisi mai

jos) vor fi cercetati si la pacientii deja splenectomizati si care acum se afla sub urmarire clinica.

Planul proiectului este alcatuit din 2 parti:

1. Evaluarea fenomenului de toleranta la endotoxina ca expresie a raspunsului

imun innascut prin aprecierea capacitatii monocitelor/macrofagelor de secretie a

citokinelor inflamatorii (TNF alfa , IL-1, IL-6, IL-10) dupa stimularea cu LPS, folosind

ca metoda principala de detectie tehnica ELISA.

2. Identificarea nivelurilor de microRNA-uri exprimate diferit in plasma/serul

pacientilor dupa splenectomia totala respectiv partiala si corelarea acestora atat cu

nivelurile de citokine pro-inflamatorii dupa stimularea cu LPS.Mai departe, vom utiliza

microRNA-urile identificate drept markeri pentru aprecierea diferentelor intre raspunsul

imun innascut post-splenectomie totala si respectiv, post-splenectomie partial. In acest

sens, vom sublinia avantajele imune ale splenectomiei partiale/subtotale.

Rolul posibil al microRNA-urilor in reglarea raspunsului imun la pacientii la care s-a

efectuat splenectomie totala sau partiala este un domeniu inca insuficient explorat. Daca vor fi

identificati, acesti bio-markeri au o importanta clinica deosebita deoarece pot orienta clinicianul

in profilaxia si tratamentul timpuriu al complicatiilor infectioase grave post-splenectomie, cum ar

fi OPSI.

OBIECTIVELE PROIECTULUI

ETAPA 1

1.Evaluarea stadiului actual de cunoastere in domeniul proiectului

1.1. Studiul bibliografic, stabilirea protocoalelor de lucru si a criteriilor de

includere, participarea la stagii de formare si perfectionare

1.2 Determinarea surselor optime din punct de vedere al raportului calitate-pret al

echipamentelor si reactantilor

2. Generarea materialului biologic

2.1. Colectarea de materiale biologice

2.2. Inregistrarea datelor clinice

FINANTARE: 140300 RON

ETAPA 2



1.2 Inregistrarea datelor clinice

2. Evaluarea fenomenului de toleranta la endotoxina

2.1. Masurarea nivelelor de citokine in cadrul grupurilor studiate

3. Analiza de etapa a rezultatelor. Diseminarea rezultatelor

3.1. Analiza bioinformatica de etapa

3.2. Participarea la stagii de formare si perfectionare. Prezentarea rezultatelor la

conferinte internationale in domenii specifice proiectului


ETAPA 3



1.2 Inregistrarea datelor clinice


2.1. Masurarea nivelelor de citokine in cadrul grupurilor studiate

2.2. Evaluarea raspunsului imun nespecific si fenomenului de toleranta la

endotoxina


3.1. Analiza bioinformatica de etapa


conferinte internationale in domenii specifice proiectului


EVALUAREA STADIULUI ACTUAL DE CUNOASTERE IN DOMENIUL

PROIECTULUI

Imunitatea innascuta

Sistemul imunitar cuprinde mecanismele de apărare ale organismelor vii față de agenții

patogeni. Este format din două mari componente: imunitatea înnăscută şi imunitatea adaptativă.

Imunitatea înnăscută sau nespecifică grupează mecanismele imune care formează prima

linie de apărare împotriva infecţiilor. Acest tip de răspuns nu este specific unui antigen, cu toate

că include mecanisme celulare şi moleculare care recunosc anumite clase moleculare antigenice,

dar care sunt prezente înainte de contactul organismului cu agentul agresor, iar acţiunea lor oferă

răgazul intrării în funcţiune a răspunsului imun adaptativ (Murphy, 2008).

Imunitatea înnăscută sau nespecifică este antigen independentă şi nu prezintă memorie

imunologică. Aceasta înseamnă că celulele sistemului imunitar înnăscut sunt capabile să

recunoască și să reacționeze la agenții patogeni în mod general, fără a conferi o imunitate

protectoare sau de lungă durată gazdei. Este sistemul imunitar dominant la plante, fungi, insecte și

organisme pluricelulare (Abbas, 2012).

Imunitatea înnăscută este moştenită genetic şi nu mai poate fi influenţată până la sfârşitul

vieţii. Ea utilizează receptori codificați genetic pentru recunoasterea microorganismelor

patogene, iar acest fapt o diferențiază de cealalată componenta a imunitații, cea dobandita care

este prezentă numai la vertebrate.

Imunitatea înnăscută sau nespecifică este asigurată de: structurile anatomice cu rol

protector (tegumente, mucoase – intestinală, respiratorie), enzimele din secreţiile exocrine –

lizozimul, bactericina, mucusul care acoperă mucoasele, pH-ul acid al sucului gastric, care

împiedică colonizarea bacteriană, temperatura corpului prin declanşarea reacţiei febrile, ce creaza

un mediu nefavorabil dezvoltarii microorganismelor, hemostază, bariera celulara – prin celulele

cu rol fagocitar: PMN, macrofage, răspunsul inflamator.

Principalele celulele efectoare ale sistemului innascut sunt polimorfonuclearele (in special

cele neutrofile), macrofagele (MF) si celulele natural killer (NK). Macrofagele şi

polimorfonuclearele sunt celule fagocitare pentru microorganisme. Celulele NK au activitate

impotriva celulelor proprii infectate viral si celulelor tumorale.

Citokinele sunt molecule de natură proteică ce au rolul important de a transmite

informații între celulele sistemului imun, care le şi produc. Deci au rol de mesageri intercelulari.

Nu au rol efector prin ele însele şi majoritatea sunt secretate, dar pot fi şi unele exprimate pe

suprafata membranelor sau stocate in rezervoare in matricea extracelulara. Acestea se leaga de

receptori specifici de pe suprafata celulelor tinta si majoritatea sunt factori de crestere sau de

diferentiere care actioneaza asupra acestor celule din cadrul sistemului hematopoietic.

După mecanismul de acţiune, citokinele se împart în două categorii:

proinflamatoare (TNFα, IL - 1,6 şi 8, G-CSF) şi antiinflamatoare (IL-10, receptorii de TNF şi

receptorul de IL-1).

microRNA- noi actori implicati in imunitate

MicroRNA sunt fragmente de ARN non-codant, recent descoperite, cu o lungime de 20-

22 de nucleotide. Rolul lor constă în reglarea post-transcripţională a expresiei genelor prin

degradarea sau represia translaţiei unor tipuri specifice deARNmesager ("target"). Importanţa

microRNA-urilor în reglarea funcţiilor celulare normale a devenit mai clară odată cu descoperirea

şi studierea mai multor tipuri de microRNA,respectiv a targetului lor, ARN mesager. Rolul exact

al reţelei de microRNA precum şi rolul individual al fiecărui microRNA în cadrul proceselor

celulare se află în continuare în studiu (Du, 2007; Lu, 2009).

Dovezi recente indică faptul că reglarea expresiei genice prin intermediul microRNA

joacă un rol foarte important în procese celulare precum apoptoza, diferenţierea şi ciclul celular.

MicroRNA sunt implicate în reglarea funcţiilor imunologice, a răspunsului imun înnăscut şi a

celui dobândit, în dezvoltarea şi diferenţierea celulelor imune şi în prevenirea autoimunităţii

(Lewis, 2005; Selbach, 2008). In sistemul imun, microRNA intervin în diferenţierea celulelor

limfocitare B şi în inducţia, funcţia şi menţinerea reglării liniei celulare limfocitare T. La nivelul

celulelor dendritice şi macrofagelor intervin prin intermediul receptorilor Toll-like şi au rolul de a

supresa funcţia lor efectoare înainte de activarea lor sau de a urmări funcţia lor după stimulare

(Lu, 2009).

Expresii modificate ale microRNA s-au întâlnit în unele tipuri de proliferare malignă,

unde pot avea atât rol de onco- gene (miR-21, miR-106 şi miR-155), cât şi de supresoare tumorale

(let-7, miR15a/16, miR-34a şi miR-143/145). Unele microRNA sunt deja utilizate ca biomarkeri

în cancere, iar altele sunt candidate pentru terapia genică a cancerului (Croce, 2009).

Recent a fost studiată implicarea microRNA în elaborarea răspunsului imun înnăscut. În

uma stimulării cu LPS a celulelor participante la elaborarea răspunsului imun înnăscut, a

monocitelor şi macrofagelor, s-a înregistrat o creştere a expresiei unor tipuri de microRNA cum

ar fi: miR-146a, miR-155, miR-125a, miR-9, miR-132 (O'Connell, 2007; Taganov, 2006; Tili,

2007).

Rolul splinei în imunitatea înnăscută

Rolul important al splinei în protecţia împotriva agenţilor patogeni din sânge a fost

evidenţiat în studii pe pacienţi splenectomizaţi la care s-a demonstrat un deficit în formarea

răspunsurilor imune împotriva câtorva produse bacteriene, şi necesită, aşadar, profilaxia

antibiotică pe termen lung a infecţiilor (de Porto, 2010; Vasilescu, 2003; Vasilescu, 2006).

Splina este un organ limfatic cu rol fundamental in apararea antiinfectioasa. Pulpa alba

care reprezinta compartimentul imunologic activ al splinei este impartita in doua zone limfocitare

distincte ce contin limfocite T, respectiv B. Splina imbina intr-un mod unic aparare imuna

innascuta si dobandita, fiind capabila de un raspuns imediat, nespecific la stimulul bacterian

(apararea innascuta) cat si un raspuns ulterior, specific ceea ce presupune interactiunea celulelor

efectoare imune specifice unui anumit antigen cu ajutorul moleculelor complexului major de

histocompatibilitate (MHC- Major Histocompatibility Complex) exprimate de celulele

prezentatoare de antigen (APC- antigen-presenting cell) (Mebius, 2005). Aceasta presupune

faptul ca splina joaca un rol fundamental in clearance-ul bacterian fie prin raspuns antigenic, fie

prin capacitatea bactericida a macrofagelor. De asemenea exista dovezi ca splina contribuie si la

decontaminarea endotoxinica bacteriana (Altamura, 2001).

Tecile limfatice periarteriale (PALS -periarterial lymphatic sheaths) contin limfocite T si

reprezinta zona timodependenta, in timp ce foliculii limfatici (primari si secundari) contin

limfocite B si reprezinta zona timoindependenta a pulpei albe. Acestia circumscriu tecile limfatice

(Mebius, 2005). O alta zona importanta din structura splinei este zona marginala care circumscrie

foliculii primari sau zona de manta a foliculilor sendari. Zona marginala pare sa fie locul initial in

care patrund limfocitele B si T si iau contact cu antigenele circulante. In zona marginala se gasesc

limfocitele B cu memorie consecutiv raspunsului imun primar.

In ceea ce priveste macrofagele splenice, ca si efectori ai imunitatii inascute, cele din

pulpa rosie sunt mai putin diferentiate, exprima niveluri ridicate de molecule MHC II si

fagociteaza polizaharidele capsulare ale S. pneumoniae (Timens, 1991). Macrofagele zonei

marginale sunt mai diferentiate, au o exprimare limitata a moleculelor MHC II si se afla in

contact strans cu limfocitele B (Timens, 1991).

Capacitatea de fagocitoza a macrofagelor splenice este fundamentala pentru indepartarea

bacteriilor din torentul sanguin, intrucat macrofagele zonei marginale actioneaza ca APC pentru

polizaharidele bacteriene, inducand secretia de catre limfocitele B a anticorpilor specifici IgM

anti-polizaharid. Acest clearance bacterian este mai putin eficient la pacientii splenectomizati

(Jirillo, 2003).

Postsplenectomie, mecanismele de clearance bacterian sunt alterate crescand riscul la

acesti pacienti de sepsis cu bacterii gram pozitive dar si gram negative, si care este cunoscut sub

numele de OPSI (overwhelming post-splenectomy infection). Sepsisul postsplenectomie are, de

obicei un curs fulminant cu o mortalitate cuprinsa inte 50-70% (Okabayashi, 2008). OPSI este

cauzat in special de bacterii incapsulate gram pozitive precum Streptococcus pneumoniae (care

este agentul etiologic in aproximativ 80% din cazuri), Neisseria meningitidis si Haemophilus

influenzae. In ceea ce priveste mecanismele patogenice ale sepsisului cu bacterii gram pozitive

par sa existe similitudini cu sepsisul gram negativ, cel putin in ceea ce priveste eliberarea de

mediatori nocivi si citokine .

Iata deci ca splina joaca un rol important in protectia gazdei impotriva patogenilor

bacterieni, iar indepartarea ei ar trebui sa reprezinte o decizie medicala atent cantarita si nu o

manevra chirurgicala nediscriminativa (Tiron, 2008; Vasilescu, 2006). De exemplu la pacienti cu

risc crescut de sepsis cum ar fi cei infectati cu virus hepatitic C, boli inflamatorii intestinale sau

neoplazici splenectomia nu este recomandabila, pentru a evita eventuale complicatii fatale

(Altamura, 2001).

REZUMATUL ETAPEI

In prima etapa proiectului au fost inclusi in studiu toti pacientii din Clinica de

Chirurgie Generala si Transplant Hepatic a Institulului Clinic Fundeni la care s-a efectuat

splenectomie totala sau partiala prin abord clasic sau minimal invaziv.

La pacientii aflati in studiu s-au prelevat probe conform protocolului si a fost

evaluata toleranta la endotoxina prin determinarea eliberarii monocitare de citokine: TNF alfa, IL-

1, IL-6, IL-10 utilizind tehnica ELISA. De asemenea probele prelucrate in vederea determinarii

de microRNA au fost depozitate pentru analiza ulterioara

Baza materiala a fost completeta prin achizitionarea de reactivi de laborator folositi

pentru determinarea de citokine umane (IL-10, IL-6, IL-1 , TNF alpha) si de reactivi si materiale

necesarea protoacoalelor de laborator.

In perioada 17-30 noiembrie 2013, directorul de proiect a efectuat o vizita in

vederea schimbului de experienta, in cadrul laboratorului Experimetal Therapeutics din cadrul

MD Anderson Cancer Centre, Houston, USA; laborator condus de catre Prof. Dr. George Calin,

un specialist cu recunoastere internationala, in domeniul microRNA. In cadrul acestei vizite Conf.

Dr. Catalin Vasilescu a sustinut o prezentare orala cu titlul “MicroRNAs and the Dysfunction of

the Innate Immune System in Sepsis” in cadrul manifestarii “MD Anderson Cancer Center

Seminars”.

A fost publicat articolul „Fractal-like kinetics of intracellular enzymatic reactions: a

chemical framework of endotoxin tolerance and a possible non-specific contribution of

macromolecular crowding to cross-tolerance.”, autori: Vasilescu C, Olteanu M, Flondor P, Calin

GA in Theor Biol Med Model. 2013 Sep 14;10:55. doi: 10.1186/1742-4682-10-55. Revista este

clasificata ISI, are un factor de impact de 1,46 si un factor relativ de influenta de 0,753.

In a doua etapa a proiectului au fost inclusi in studiu toti pacientii din Clinica de










In perioada 10-13 septembrie 2014 o echipa formata din directorul de proiect

Conf. Dr. Catalin Vasilescu si un membru al echipei de cercetare Dr. Stefan Tudor a participat la

congresul international MINIMALLY INVASIVE SURGERY WEEK 2014 ANNUAL

MEETING & ENDO EXPO, care a avut loc in Statele Unite ale Americii. La aceasta conferinta a

fost prezentata comunicarea orala cu titlul: „Minimally invasive splenectomy - twenty years,

single team experience”.

In perioada 8-11 octombrie 2014 o echipa formata din directorul de proiect Conf.

Dr. Catalin Vasilescu si 3 membrii ai echipei de cercetare Dr. Stefan Tudor, Dr. Vlad Nacev si

Dr. Monica Lacatus, a participat la congresul international International Congress of Endoscopic

and Laparoscopic Surgeons of Asia (ELSA) 2014 MINIMALLY INVASIVE SURGERY : NOW

AND FUTURE. La aceasta conferinta a fost prezentata comunicarea orala cu titlul: „Robotic

Versus Laparoscopic Splenectomy. Overcoming technical challenges with robotic surgery in

minimally invasive splenectomy”.

A fost publicat articolul „MicroRNAs and ceRNAs: therapeutic implications of RNA

networks” autori: Giza DE, Vasilescu C, Calin GA. in EXPERT OPINION ON BIOLOGICAL

THERAPY ; 2014 Sep;14(9):1285-93. doi: 10.1517/14712598.2014.920812. Revista este


A fost publicat articolul „Robotic Splenectomy: What is the Real Benefit?” autori: Giza

Dana Elena, Tudor Stefan, Purnichescu-Purtan Raluca Roxana, Vasilescu Catalin, in World

Journal of Surgery 2014 Dec;38(12):3067-73. doi: 10.1007/s00268-014-2697-6. Revista este


In a treia etapa a proiectului au fost inclusi in studiu toti pacientii din Clinica de










In perioada 4 – 6 iulie 2015 o echipa formata din directorul de proiect Conf. Dr. Catalin

Vasilescu si un trei membii ai echipei de cercetare, Dr. Monica Lacatus, Dr. Stefan Tudor si Dr

Bogdan Trandafir a participat la congresul international „23rd INTERNATIONAL CONGRESS

OF THE EUROPEAN ASSOCIATION FOR ENDOSCOPIC SURGERY (EAES)” care a avut

loc in Bucuresti, Romania. La aceasta conferinta a fost prezentata comunicarea orala cu titlul:

„Partial laparoscopic splenectomy”.

In perioada 2-5 septembrie 2015 o echipa formata din directorul de proiect Conf. Dr.

Catalin Vasilescu si un doi membii ai echipei de cercetare Dr. Stefan Tudor si Dr Bogdan

Trandafir a participat la congresul international „MINIMALLY INVASIVE SURGERY WEEK

2014 ANNUAL MEETING & ENDO EXPO”, care a avut loc in New York, Statele Unite ale

Americii. La aceasta conferinta a fost prezentata comunicarea orala cu titlul: „Minimally Invasive

Partial Splenectomy – from laparoscopic to robotic surgery”.

In perioada 14-17 octombrie 2015 o echipa formata din directorul de proiect Conf. Dr.

Catalin Vasilescu si trei membrii ai echipei de cercetare, Dr. Stefan Tudor, Dr. Monica Lacatus, si

Dr Bogdan Trandafir a participat la „CONFERINȚA NAȚIONALĂ DE CHIRURGIE 2015”

care a avut loc in Bucuresti, Romania. La aceasta conferinta a fost prezentata comunicarea orala

cu titlul: „Why Do We Love da Vinci? Robotic Surgery: Myths and Realities”.

In perioada 15-18 octombrie 2015 directorul de proiect Conf. Dr. Catalin Vasilescu a

participat la „A XXIII-A CONFERINTA NATIONALA DE HEMATOLOGIE CLINICA SI

MEDICINA TRANSFUZIONALA” care a avut loc in Sinaia, Romania. La aceasta conferinta a

fost prezentata comunicarea orala cu titlul: „Chirurgia in bolile hematologice”.

In perioada 29 – 31 octombrie 2015 o echipa formata din directorul de proiect Conf. Dr.

Catalin Vasilescu si un trei membii ai echipei de cercetare, Dr. Monica Lacatus, Dr. Stefan Tudor

si Dr Bogdan Trandafir a participat la congresul international „THE 4TH INTERNATIONAL

CONGRESS IN ROBOTIC SURGERY” care a avut loc in Bucuresti, Romania. La aceasta

conferinta a fost prezentata comunicarea orala cu titlul: „Robotic Partial and Total Splenectomy -

Experience of a Single Team in a Series of 95 Cases”.

In data de 21 noiembrie 2015 directorul de proiect Conf. Dr. Catalin Vasilescu a participat

la conferinta „ACTUALITĂŢI ÎN MANAGEMENTUL AFECŢIUNILOR HEMATOLOGICE

RARE” care a avut loc la Cheile Gradistei, Romania. La aceasta conferinta a fost prezentata

comunicarea orala cu titlul: „Splenectomia la pacientul cu PTI”.

A fost publicat articolul „Cellular and Kaposi's sarcoma-associated herpes virus

microRNAs in sepsis and surgical trauma” autori: Stefan Tudor, Dana Elena Giza, Catalin

Vasilecu et. al. in revista Cell Death & Disease, (2014)5, e1559; doi:10.1038/cddis.2014.515.

Revista este clasificata ISI, are un factor de impact de 5,014 si un factor relativ de influenta

de 1,639.

MATERIAL SI METODA

Acest studiu prospectiv cuprinde pacienți splenectomizați total sau subtotal pe cale clasica

sau minimal invaziva pentru diferite afecțiuni splenice în Clinica de Chirurgie Generala si

Transplant Hepatic a Institutului Clinic Fundeni.

Splenectomia subtotalã a beneficiat în ultimii ani de o atenţie crescutã, fiind privitã ca o

alternativã la splenectomia totalã în tratarea multor afecţiuni cu determinare splenicã, cum ar fi de

exemplu o serie de afecţiuni hematologice. Chiar dacã splenectomia totalã are efecte net benefice

in astfel de afecţiuni, reducând simptomele şi îmbunãtãţind semnificativ calitatea vieţii acestor

pacienţi, totuşi in urma exerezei totale a splinei se vor manifesta ulterior consecinţele aspleniei,

una dintre cele mai importante fiind infecţiile fulminante cu diferite bacterii încapsulate, cum ar fi

Streptococcus pneumoniae (OPSI). OPSI este precedat de un tablou clinic nespecific ce cuprinde

febrã, migrenã, senzaţie de greaţã, diaree, stare de rãu general.

Cei mai mulţi dintre pacienţi dezvoltã coagulare intravascularã diseminatã si de asemenea,

acidoza şi insuficienţa renalã reprezintã, de multe ori, complicaţii majore, iar mortalitatea este

cuprinsã între 50% şi 60%. S-a demonstrat ca OPSI survine în principal în caz de infecţii

nosocomiale sau în cazul pacienţilor imunodeprimaţi (Crandall et al. 2009;Okabayashi and

Hanazaki 2008;Vasilescu et al. 2003;Vasilescu et al. 2006).

Datele referitoare la pacienti au fost obținute din studiul foilor de observație, al

protocoalelor operatorii și din studiul monocitelor și eliberării de citokine de către acestea, cu

ajutorul tehnicii ELISA, din sângele periferic al pacientilor.

Parametrii studiați au fost:

• Vârsta și sexul pacienților;

• Tipul bolii ce determină afectare splenică;

• Valoarea plasmatică a citokinelor TNF-α, IL-1, IL-6, IL-10, măsurate preoperator (în

pg/ml) , la 7 zile si la o lună postoperator inainte si după stimulare cu LPS bacterian;

• Numărul de leucocite si de monocite secretoare de citokine din sângele fiecărui pacient în

parte

Descrierea tehnicii WBS

Probele de sânge au fost prelevate de la pacienți prin puncționarea venei cubitale. Peste

probele de sânge (20 ml în tuburi de propilen) s-au adaugat 15 UI de heparinat de sodiu pentru

fiecare ml de sânge. Substanța anticoagulantă a fost testată înainte pentru a putea verifica absența

contaminării cu endotoxina.

O parte alicotă din sângele heparinizat, 15 UI/ml de sânge, a fost amestecată cu

endotoxina provenind de la Escherichia coli 055:B5, până la o concentrație finală de 0,1 ng per

ml de sânge.

Aceste probe stimulate cu endotoxina bacteriană, împreună cu cele fără endotoxină, pentru

fiecare pacient în parte au fost incubate pentru două ore la 37°C, într-o atmosferă cu 5% CO2.

După aceste două ore, plasma a fost separată prin centrifugare la 2000 g pentru 10 minute.

Au fost masurate nivelele următoarelor citokine: TNF-α, IL-1, IL-6, IL-10.

Valorile citokinelor plasmatice au fost cuantificate prin utilizarea de teste ELISA obținute

de la R&D Systems.

Pentru toți pacienții incluși în studiu am măsurat valorile acestor citokine (bazale și după

stimularea cu LPS bacterian), atât preoperator, cât si postoperator (la 7 zile si la o lună).

Apoi am calculat numărul monocitelor, secretoare de citokine, per mililitru de sânge,

utilizând numărul de leucocite, obținute din hemoleucogramă si procentul de monocite obținut din

formula leucocitară, efectuate pentru fiecare pacient preoperator și postoperator, la 7 zile,

respectiv o luna.

Am raportat apoi valorile citokinelor, obținute în urma stimulării sangvine cu LPS, la

numărul de monocite per ml, calculate anterior, și am obtinut, o asa numită, valoare corectată a

citokinelor, pentru fiecare pacient si determinare în parte pentru a evidentia capacitatea

monocitului de a elibera citokine sub stimul endotoxinic. Valorile corectate au fost cele utilizate

pentru comparația, în ceea ce privește eliberarea de citokine, între cele două grupuri de pacienți,

adică cei cu splenectomie totală și cei cu splenectomie subtotală.

Schema metodei WBS

A. B. A. B. A. B.

Două eprubete cu sânge În proba A se adaugă Se incubează pentru

integral și anticoagulant 0,1 ng/ml de sânge de LPS 2 ore la 37°C

C1 C2-pot apărea citokine datorită

A. B. agitației create de centrifugare

Supernatant C1+C2=valoarea totală(reală)

Centrifugare a citokinelor

Am calculat media valorilor corectate ale citokinelor,separat pentru fiecare grup de

pacienți în parte și separat pentru fiecare dintre cele trei date de determinare ale citokinelor, adică

preoperator, la 7 zile și la o lună. Cea preoperatorie am considerat-o valoarea de referință pentru a

putea observa daca au existat diferențe în ceea ce privește eliberarea de citokine la determinările

ulterioare în cadrul aceluiași grup de pacienți și între pacienții din cele două grupuri diferite (cu

splenectomie totală si subtotală).

A fost realizata baza de date de splenectomii efectuate in clinica noastra in perioada

raportata. Au fost inclusi in studiu numai pacientii la care splenectomia a fost interventia

principala, fiind exclusi din studiu pacientii la care splenectomia a fost o interventie secundata sau

a fost impusa de o anumita tactica operatorie;de asemenea au fost inclusi in studiu pacientii la

care interventia a fost efectuata prin abord clasic, cit si prin abord laparoscopic principalul

argument pentru alegerea caii de abord fiind dimensiunea splinei, luind in considerare faptul ca in

cazurile cu splenomegalii masive abordul laparoscopic este considerat riscant sau uneori

imposibil.

2 1 3

4

.

5

u

k

b

5

5

Probele de singe au fost duse la laboratorul central de hematologie unde s-au efecuat

dozarile de anticorpi folosind tehnica ELISA si s-au prelucrat si stocat probele de singe in vederea

determinarii ulterioare a microRNA-urilor.

Metoda utilizată în cadrul studiului de față și prin care am reușit să ajungem la aceste

rezultate, respectiv Whole Blood Stimulation ( WBS) este o metoda foarte fiabilă, deoarece

reduce factorii perturbatori, legați de culturile celulare de monocite din sângele periferic, cum ar

fi contaminarea cu endotoxina a acestora, influețând astfel rezulatele finale și modificându-le.

Sangele integral reprezinta un mediu fiziologic, unde eliberarea de citokine poate fi

studiata, deoarece sunt pastrate aici LPS binding protein si modulatorii secretiei acestora, cum ar

fi cortisolul. (Berger et al. 1997;Ertel et al. 1995).

Prin aceasta metodă am creat un model ex-vivo de sepsis, cu toate că nu poate sa confere

informatii despre procesele inflamatorii din tot organismul, însă poate fi analizată secreția de

citokine dintr-un compartiment al acestuia, în acest caz porțiunea numită PALS a splinei (Ertel,

Kremer, Kenney, Steckholzer, Jarrar, Trentz, & Schildberg 1995).

Există anumite studii care au demonstrat că TNF-α este un trigger al eliberării de citokine,

așa ca TNF-α poate induce ea singură eliberarea, de exemplu, de IL-1 sau IL-6, în aceeași

manieră ca și endotoxinele. Aceste studii sugerează de asemenea ca TNF-α acționează ca un

stimul pentru IL-1 sau IL-6, în timpul sepsisului, pentru că s-a observat că atunci cand bacteriile

sau endotoxinele ajung în sânge, are loc o masivă eliberare de TNF-α, urmată abia dupa aceea de

un varf al eliberarii de IL-1 sau IL-6 (Cannon et al. 1990;Rodrick et al. 1992).

Exista numeroase studii in literatura de specialitate privind rolul splenectomiei subtotale

în prezervarea funcției imunologice a splinei. Astfel un studiu publicat în anul 1997 de catre

Moeniralam et al (Moeniralam et al. 1997) a avut scopul de a demonstra faptul ca splina este si ea

implicata, alaturi de ficat, in producerea de IL-6,care este o citokina proinflamatorie, dupa

stimularea cu endotoxina bacteriana, datorita functiei imunologice pe care aceasta o detine.

Valorile citokinei IL-6, după administrarea de endotoxina, au fost masurate atat la grupul de

control cat si la cel splenectomizat si s-a observat ca in cazul celor din urma acestea au fost mai

mari decat la ceilalti, ceea ce demonstreaza splina moduleaza cinetica citokinelor.

Rezultate acestui studiu sunt relevante și pentru studiul nostru arătând faptul că splina are

rol în imunitatea înnăscută, iar splenectomia totală, spre deosebire de cea subtotală, privează

organismul gazda de posibilitatea de apărare în fața bacteriilor, provocând astfel complicații

infecțioase grave.

Ertel si colab. (Ertel, Kremer, Kenney, Steckholzer, Jarrar, Trentz, & Schildberg 1995) a

demonstrat prin stimularea sangelui integral cu LPS, metoda folosita si in studiul de fata sinteza

scazuta de citokine in sepsis. In cadrul studiului s-a utilizat sange integral recoltat de la 15

pacienti aflati in stare septica si de la 20 de pacienti reprezentand grupul de control, ce nu

prezentau nici unul dintre criteriile sepsisului ( in expectative interventiei chirurgicale

reprezentate de cura herniei sau colecistectomie). Sangele de la pacientii septici a fost recoltat in

ziua admisiei in spital si apoi la 1, 2, 3, 5, 7 si 10 zile dupa si de la cei din grupul de control , doar

preoperator pentru a exclude orice influenta asupra rezultatelor, cauzata de stresul chirurgical

sau de anestezie, pentru a putea masura nivelele de citokine proinflamatorii TNF-α, IL-1 β si IL-

6 si cinetica acestora.

O parte din sangele, de la fiecare pacient in parte, din cadrul ambelor grupuri, respectiv cel

cu septici si cel de control , a fost stimulat cu antigene bacteriene , si anume lipopolizaharid

provenind de la E.coli, in cantitate de 1µg/ml, masurandu-se comparativ nivelele de citokine

TNF-α, IL-1 β si IL-6 din momentul incubarii si la 24 de ore ulterior, si de asemenea din partea

de sange nestimulata.

S-a observat o crestere semnificativa a nivelului de citokine proinflamatorii in sangele

stimulat cu LPS bacterian la 24 de ore de la incubatie, in cazul pacientilor din grupul de control ,

in timp ce in cazul pacientilor septici , din contra, s-a inregistrat o scadere marcata a acestora , ce

s-a mentinut de altfel 10 zile. Acest lucru demonstreaza ca in cazul organismelor

imunodeprimate, cum se intampla in cazul pacientilor septici, monocitele din sange nu mai sunt

capabile de a sintetiza si elibera citokine proinflamatorii ca raspuns la un stimul antigenic, de

exemplu bacterian.

In cursul etapei 3 pe masura acumularii rezultatelor preliminarii au aparut urmatoarele

aspecte:

1. necesitatea introducerii unui lot de control fata de planul initial. Observatiile si analiza

rezultatelor obtinute in etapele anterioare au impus introducerea unui nou lot de control alcatuit

din pacienti cu operatii elective, dar fara splenectomie si de pacienti cu imunodepresie de alta

natura (de exemplu pacienti septici). Introducerea acestui nou lot de control a aparut ca absolut

necesara pentru clarificarea rolul microRNA in modularea imuna dupa splenectomia totala si

partiala.

2. Adaptarea design-ului de studiu la rezultatele deja obtinute a impus restructurarea

loturilor de control.

3. Analiza doar acestor pacienti cu operatii elective si cu imunodepresie datorata

sepsisului a condus la descoperirea unui fenomen nou: identificarea unui nivel constant crescut de

mRNA virale (KSHV - Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus) la pacientii cu diverse tipuri de

operatii si la pacientii septici. Aceste rezultate colaterale au fost bine primite in comunitatea

stiintifica si au facut deja in parte obiectul publicarii in revista Cell Death & Disease care face

parte din grupul de publicatii Nature. Aceasta revista are IMPACT FACTOR 5,014 si SCOR

RELATIV DE INFLUENTA 1,639.

REZULTATELE ACTUALE SI GRADUL DE REALIZARE A OBIECTIVELOR:

ETAPA 1

1.Evaluarea stadiului actual de cunoastere in domeniul proiectului

1.1. Studiul bibliografic, stabilirea protocoalelor de lucru si a criteriilor de

includere, participarea la stagii de formare si perfectionare - Obiectiv indeplinit conform

raportului de activitate

1.2 Determinarea surselor optime din punct de vedere al raportului calitate-pret al

echipamentelor si reactantilor - Obiectiv indeplinit conform raportului de activitate


2.1. Colectarea de materiale biologice - Obiectiv indeplinit conform raportului de

activitate

2.2. Inregistrarea datelor clinice - Obiectiv indeplinit conform raportului de

activitate

ETAPA 2



activitate

1.2 Inregistrarea datelor clinice - Obiectiv indeplinit conform raportului de

activitate


2.1. Masurarea nivelelor de citokine in cadrul grupurilor studiate - Obiectiv

indeplinit conform raportului de activitate


3.1. Analiza bioinformatica de etapa - Obiectiv indeplinit conform raportului de

activitate


conferinte internationale in domenii specifice proiectului - Obiectiv indeplinit conform


ETAPA 3



activitate

1.2 Inregistrarea datelor clinice - Obiectiv indeplinit conform raportului de

activitate


2.1. Masurarea nivelelor de citokine in cadrul grupurilor studiate - Obiectiv

indeplinit conform raportului de activitate

2.2. Evaluarea raspunsului imun nespecific si fenomenului de toleranta la

endotoxina - Obiectiv indeplinit conform raportului de activitate


3.1. Analiza bioinformatica de etapa - Obiectiv indeplinit conform raportului de

activitate


conferinte internationale in domenii specifice proiectului - Obiectiv indeplinit conform


CONCLUZII

Până in prezent in cadrul proiectului s-au achizitionat echipamentele si a reactivii de

laborator necesari. Au fost inclusi in studiu pacientii la care interventia chirurgicala a fost

efectuata pe perioada raportata. S-au determinat nivelele de citokine la pacientii inclusi in studiu

pana la data raportarii.

Au fost publicate patru articole in reviste cotate ISI :

1. Fractal-like kinetics of intracellular enzymatic reactions: a chemical framework of

endotoxin tolerance and a possible non-specific contribution of macromolecular crowding to

cross-tolerance., autori: Vasilescu C, Olteanu M, Flondor P, Calin GA in Theor Biol Med Model.

2013 Sep 14;10:55. doi: 10.1186/1742-4682-10-55. IMPACT FACTOR 1,46, SCOR

RELATIV DE INFLUENTA 0,753.

2. Robotic Splenectomy: What is the Real Benefit? Giza DE, Tudor S, Purnichescu-

Purtan RR, Vasilescu C. World J Surg. 2014 Dec;38(12):3067-73. doi: 10.1007/s00268-014-

2697-6. IMPACT FACTOR 2,348, SCOR RELATIV DE INFLUENTA 1,793

3. MicroRNAs and ceRNAs: therapeutic implications of RNA networks. Giza DE,

Vasilescu C, Calin GA. Expert Opin Biol Ther. 2014 Sep;14(9):1285-93. doi:

10.1517/14712598.2014.920812. IMPACT FACTOR 3,653, SCOR RELATIV DE

INFLUENTA 1,362

4. Cellular and Kaposi's sarcoma-associated herpes virus microRNAs in sepsis and

surgical trauma: Stefan Tudor, Dana Elena Giza, Catalin Vasilecu et. al. Cell Death & Disease,

(2014)5, e1559; doi:10.1038/cddis.2014.515. IMPACT FACTOR 5,014, SCOR RELATIV DE

INFLUENTA 1,639.

Directorul de proiect a efectuat o vizita in vederea schimbului de experienta, in cadrul

laboratorului Experimetal Therapeutics din cadrul MD Anderson Cancer Centre, Houston, USA;

laborator condus de catre Prof. Dr. George Calin, un specialist cu recunoastere internationala, in

domeniul microRNA. In cadrul acestei vizite Conf. Dr. Catalin Vasilescu a sustinut o prezentare

orala cu titlul “MicroRNAs and the Dysfunction of the Innate Immune System in Sepsis” in

cadrul manifestarii “MD Anderson Cancer Center Seminars”.

Au fost prezentate cinci comunicari orale la congrese internationale de prestigiu:

- Minimally invasive splenectomy - twenty years, single team experience. C. Vasilescu,

S. Tudor, Monica Lacatus, Dana Elena Giza. MINIMALLY INVASIVE SURGERY WEEK 2014

ANNUAL MEETING & ENDO EXPO, 10-13 Septembrie, 2014. USA.

- Robotic Versus Laparoscopic Splenectomy. Overcoming Technical Challenges with

Robotic Surgery in Minimally Invasive Splenectomy. C. Vasilescu, S. Tudor, Monica Lacatus,

V. Nacev. The International Congress of Endoscopic and Laparoscopic Surgeons of Asia (ELSA

2014). 8-11 Octombrie, 2014. Indonesia

- Partial laparoscopic splenectomy C. Vasilescu. 23rd INTERNATIONAL CONGRESS

OF THE EUROPEAN ASSOCIATION FOR ENDOSCOPIC SURGERY (EAES), 4 – 6 iulie,

2015. Romania

- Minimally Invasive Partial Splenectomy – from laparoscopic to robotic surgery. C.

Vasilescu, S. Tudor, B. Trandafir MINIMALLY INVASIVE SURGERY WEEK 2014 ANNUAL

MEETING & ENDO EXPO, 2-5 Septembrie, 2015. USA.

- Robotic Partial and Total Splenectomy - Experience of a Single Team in a Series of 95

Cases. Monica Lacatus, C. Vasilescu. THE 4TH INTERNATIONAL CONGRESS IN ROBOTIC

SURGERY. 29-31 Octombrie, 2015, Romania

Au fost prezentate trei comunicari orale la congrese nationale de prestigiu:

- Why Do We Love da Vinci? Robotic Surgery: Myths and Realities. C. Vasilescu.

CONFERINȚA NAȚIONALĂ DE CHIRURGIE. 14-17 Octombrie 2015, Romania

- Chirurgia in bolile hematologice. C. Vasilescu. A XXIII-A CONFERINTA

NATIONALA DE HEMATOLOGIE CLINICA SI MEDICINA TRANSFUZIONALA. 15-18

Octombrie, 2015, Romania

- Splenectomia la pacientul cu PTI. C. Vasilescu. ACTUALITĂŢI ÎN

MANAGEMENTUL AFECŢIUNILOR HEMATOLOGICE RARE. 21 Noiembrie, 2015.

Romania

References

Abbas, A.K., Lichtman, A.H., and Pillai, S. Cellular and Molecular Immunology, Elsevier

Saunders Philadelphia 2012.

Altamura, M., Caradonna, L., Amati, L., Pellegrino, N.M., Urgesi, G., and Miniello, S.

Splenectomy and sepsis: the role of the spleen in the immune-mediated bacterial

clearance, Immunopharmacol.Immunotoxicol., 2001 23(2):153-161.

Berger, D., Boelke, E., Seidelmann, M., Vasilescu, C., & Beger, H.G. 1997. Endotoxin-induced

cytokine release from whole blood - similarities between monocyte dysfunction in

septic disease and during post-operative acute phase response. J Endotox Res, 4, (1)

17-24

Cannon, J.G., Tompkins, R.G., Gelfand, J.A., Michie, H.R., Stanford, G.G., van der Meer, J.W.,

Endres, S., Lonnemann, G., Corsetti, J., Chernow, B., & . 1990. Circulating

interleukin-1 and tumor necrosis factor in septic shock and experimental endotoxin

fever. J Infect.Dis., 161, (1) 79-84 available from: PM:2295861

Crandall, M., Shapiro, M.B., & West, M.A. 2009. Does splenectomy protect against immune-

mediated complications in blunt trauma patients? Mol.Med., 15, (7-8) 263-267

available from: PM:19593410

Croce, C.M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer, Nat.Rev.Genet.,

2009 10(10):704-714.

de Porto, A.P., Lammers, A.J., Bennink, R.J., ten Berge, I.J., Speelman, P., and Hoekstra, J.B.

Assessment of splenic function, Eur.J Clin.Microbiol.Infect.Dis., 2010 29(12):1465-

1473.

Du, T. and Zamore, P.D. Beginning to understand microRNA function, Cell Res., 2007

17(8):661-663.

Ertel, W., Kremer, J.P., Kenney, J., Steckholzer, U., Jarrar, D., Trentz, O., and Schildberg, F.W.

Downregulation of proinflammatory cytokine release in whole blood from septic

patients, Blood, 1995 85(5):1341-1347.

Jirillo, E., Mastronardi, M.L., Altamura, M., Munno, I., Miniello, S., Urgesi, G., and Amati, L.

The immunocompromised host: immune alterations in splenectomized patients and

clinical implications, Curr.Pharm.Des, 2003 9(24):1918-1923.

Lewis, B.P., Burge, C.B., and Bartel, D.P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines,

indicates that thousands of human genes are microRNA targets, Cell, 2005

120(1):15-20.

Lu, L.F. and Liston, A. MicroRNA in the immune system, microRNA as an immune system,

Immunology, 2009 127(3):291-298.

Mebius, R.E. and Kraal, G. Structure and function of the spleen, Nat.Rev.Immunol., 2005

5(8):606-616.

Moeniralam, H.S., Bemelman, W.A., Endert, E., Koopmans, R., Sauerwein, H.P., & Romijn, J.A.

1997. The decrease in nonsplenic interleukin-6 (IL-6) production after splenectomy

indicates the existence of a positive feedback loop of IL-6 production during

endotoxemia in dogs. Infect.Immun., 65, (6) 2299-2305 available from: PM:9169767

Murphy, K., Travers, P., and Walport, M. Janeways Immunology, Garland Science 2008.

O'Connell, R.M., Taganov, K.D., Boldin, M.P., Cheng, G., and Baltimore, D. MicroRNA-155 is

induced during the macrophage inflammatory response, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,

2007 104(5):1604-1609.

Okabayashi, T. and Hanazaki, K. Overwhelming postsplenectomy infection syndrome in adults -

a clinically preventable disease, World J.Gastroenterol., 2008 14(2):176-179.

Rodrick, M.L., Moss, N.M., Grbic, J.T., Revhaug, A., O'Dwyer, S.T., Michie, H.R., Gough, D.B.,

Dubravec, D., Manson, J.M., Saporoschetz, I.B., & . 1992. Effects of in vivo

endotoxin infusions on in vitro cellular immune responses in humans. J

Clin.Immunol., 12, (6) 440-450 available from: PM:1287036

Selbach, M., Schwanhausser, B., Thierfelder, N., Fang, Z., Khanin, R., and Rajewsky, N.

Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs, Nature, 2008

455(7209):58-63.

Taganov, K.D., Boldin, M.P., Chang, K.J., and Baltimore, D. NF-kappaB-dependent induction of

microRNA miR-146, an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune

responses, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 2006 103(33):12481-12486.

Tili, E., Michaille, J.J., Cimino, A., Costinean, S., Dumitru, C.D., Adair, B., Fabbri, M., Alder,

H., Liu, C.G., Calin, G.A., and Croce, C.M. Modulation of miR-155 and miR-125b

levels following lipopolysaccharide/TNF-alpha stimulation and their possible roles

in regulating the response to endotoxin shock, J.Immunol., 2007 179(8):5082-5089.

Timens, W. The human spleen and the immune system: not just another lymphoid organ,

Res.Immunol., 1991 142(4):316-320.

Tiron, A. and Vasilescu, C. [Role of the spleen in immunity. Immunologic consequences of

splenectomy], Chirurgia.(Bucur.), 2008 103(3):255-263.

Vasilescu, C., Stanciulea, O., Colita, A., Stoia, R., Moicean, A., and Arion, C. [Laparoscopic

subtotal splenectomy in the treatment of hereditary spherocytosis],

Chirurgia.(Bucur.), 2003 98(6):571-576.

Vasilescu, C., Stanciulea, O., Tudor, S., Stanescu, D., Colita, A., Stoia, R., Coriu, D., Colita, A.,

and Arion, C. Laparoscopic subtotal splenectomy in hereditary spherocytosis : to

preserve the upper or the lower pole of the spleen?, Surg.Endosc., 2006 20(5):748-

752.

Date post:	07-Jan-2020
Category:	Documents
Upload:	others
View:	4 times
Download:	0 times

Proiecte de Cercetare Exploratorie tip PCE PN-II-ID-PCE...

Documents