Post on 24-Jul-2018
transcript
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE
„GRIGORE T. POPA” IAȘI
MICROMEDIUL TUMORAL ŞI
PROGNOSTICUL CANCERULUI
COLORECTAL OPERAT, RECIDIVAT
TEZĂ DE DOCTORAT
REZUMAT
CONDUCĂTORI ȘTIINȚIFICI:
PROF. UNIV. DR. EUGEN TÂRCOVEANU
PROF. UNIV. DR. EUGEN CARASEVICI
DOCTORAND:
SILVIU-TIBERIU MAKKAI-POPA
2013
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
1
Cercetare realizată în cadrul proiectului “Burse doctorale pentru creşterea
competitivităţii în domeniul medical şi farmaceutic”
POSDRU/88/1.5/S/58965, cofinanţat din Fondul Social European prin
Programul Operaţional Sectorial pentru Dezvoltarea Resurselor Umane 2007
– 2013
Teza de doctorat cuprinde:
141 de pagini (partea generală - 40 pagini, partea
personală - 96 pagini);
21 tabele;
102 figuri;
273 referinţe bibliografice;
5 anexe;
2 articole ştiinţifice publicate în articole cotate
B+ și un articol acceptat spre publicare într-o
revistă cotată ISI
Notă: prezentul rezumat redă selectiv bibliografia şi
iconografia în text, respectând numerotarea şi cuprinsul din teză.
Cuvinte cheie: cancer colorectal, infiltrat inflamator,
micromediu tumoral, izolare simultană de ADN și ARN,
oncogenetică, PCR cantitativ
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
2
Cuprinsul tezei de doctorat
Cuprins ............................................................................................................ ............. 1
Mulțumiri ..................................................................................................... ................. 5
Lista de abrevieri........................................................................................... ................ 7
Capitolul 1. Elemente de oncogeneză în cancerul de colon și de rect .......................... 9
1.1 Tipuri de defecte genetice în cancerul de colon ................................................... 10
A. Oncogenele ............................................................................................ 10
B. Genele supresor-tumorale .................................................................... .. 11
1.2 Modele genetice ale oncogenzei în cancerul colorectal ....................................... 12
1.2.1 Biologia moleculară a cancerului colorectal sporadic (non-ereditar)
..................................................................................................................... 12
1.2.1.1 Elemente de oncogenetică a neoplasmului colorectal .................... 12
1.2.1.2 Rolul sistemului imun în carcinogeneza neoplasmelor colorectale
................................................................................................................... .. 14
A. Tipuri de inflamație în cancer – generalități........................... 14
B. Rolul celulelor sistemului imun în carcinogeneza colorectală....
.............. .............. .............. .............. .............. .............. .............15
C. Carcinogeneza colorectală și moleculele de tip DAMP (disease
associated molecular patterns) și PAMP (pathogen associated
molecular patterns) ...................................................................... 16
1.2.2 Biologia moleculară a cancerului colorectal ereditar ........................ 17
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
3
A. Polipoza adenomatoasă familială .......................................................... 17
B. Polipoza ereditară mixtă ........................................................................ 18
C. Sindromul Peutz-Jeghers ....................................................................... 18
D. Cancere colonice ereditare non-polipozice ............................................ 18
Capitolul 2. Principii ale managementului terapeutic multimodal al cancerului de
colon și de rect .............................................................................................................21
2.1 Abordarea multimodală a terapiei cancerului de colon și de rect ........................ 21
2.2 Rolul chirurgiei în tratamentul actual al cancerului de colon și de rect ............... 21
2.2.1 Anatomia chirurgicală a cancerului de colon și de rect ..................... 22
2.2.2 Principii tehnice ale abordului chirurgical în cancerul de colon ....... 27
2.2.3 Principii tehnice ale abordului chirurgical în cancerul de rect .......... 28
2.3 Rolul chimioterapiei în tratamentul actual al cancerului de de colon și de rect ... 30
2.4 Rolul radioterapiei în tratamentul actual al cancerului de colon și de rect .......... 32
2.5 Rolul terapiei biologice în tratamentul actual al cancerului de de colon și de
rect............................................................................................................................. .. 32
2.6 Algoritm de tratament al cancerului de colon funcție de stadializarea TNM ...... 33
2.7 Algoritm de tratament al cancerului de rect funcție de stadializarea TNM ......... 34
2.8 Supravegherea postoperatorie a pacienților cu cancer de colon și de rect ........... 36
2.8.1 Supravegherea pacientului cu cancer de colon operat ....................... 36
2.8.2 Supravegherea pacientului cu cancer rectal operat ........................... 36
2.9 Algoritm de tratament al recidivei cancerului de colon ....................................... 37
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
4
2.9.1 Tratamentul recidivei locale a cancerului de colon ........................... 37
2.9.2 Tratamentul metastazelor metacrone după chirurgia cancerului de
colon ........................................................................................................... 37
2.9.2.1 Metastaze hepatice sau pulmonare rezecabile ................ 37
2.9.2.2 Metastaze nerezecabile +/- recidivă locoregională: IP
(ECOG)=0-2 ............................................................................... 37
2.9.2.3 Metastaze nerezecabile +/- recidivă locoregională: IP
(ECOG)=3-4 ....... ...................... ...................... ......................... 38
2.10 Algoritm de tratament al recidivei după chirurgia cancerului de rect ................ 38
2.10.1 Tratamentul recidivei locale după chirurgia cancerului de rect ....... 38
2.10.2 Tratamentul metastazelor hepatice metacrone după chirurgia
cancerului de rect ... .....................................................................................39
2.10.2.1 Metastaze hepatice sau pulmonare rezecabile: ............. 39
2.10.2.2 Metastaze nerezecabile +/- recidivă locoregională:
IP(ECOG)=0-2 ...... ...................... ...................... ....................... 39
2.10.2.3 Metastaze nerezecabile +/- recidivă locoregională:
IP(ECOG)=3-4 .... ...................... ...................... ......................... 40
Capitolul 3. Factori de prognostic și de predicție în cancerul de colon și de rect ...... 41
3.1 Factori de predicție sau factori de prognostic? ..................................................... 41
3.2 Factori de prognostic în cancerul de colon și de rect............................................ 42
3.2.1 Statusul ganglionar și prognosticul în cancerul de colon și de rect.... 42
3.2.2 Caracteristicile morfo-patologice ale tumorii și prognosticul
cancerului colorectal . ..................................................................................43
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
5
3.2.3 Markeri de prognostic serologici ....................................................... 43
3.2.4 Markeri moleculari de prognostic ...................................................... 44
A. Mutațiile genei p53 ................................................................ 44
B. Mutațiile genei KRAS ............................................................ 44
C. Instabilitatea microsateliților .................................................. 44
D. Alți markeri moleculari de prognostic ................................... 45
3.3 Factori de predicție ai răspunsului la terapia adjuvantă în cancerul de colon și de
rect .. ............................................................................................................................45
3.3.1 Timidilat sintaza ............................................................ .................... 46
3.3.2 Survivina ............................................................................................ 46
3.3.3 Aurora kinaza A ................................................................................. 46
3.3.4 Bcl-xl ................................................................................................. 47
3.3.5 Cyclina D1 ......................................................................................... 47
3.3.6 Mcl 1................................................................................................... 47
3.3.7 Instabilitatea microsateliților ............................................................. 48
3.3.8 KRAS ................................................................................................. 48
Capitolul 4. Motivația studiului doctoral ................................................................... 49
Capitolul 5. Studiul unor posibili factori de prognostic pentru recidiva cancerului de
colon și de rect operat ................................................................................................. 51
5. 1 Algoritmul de selecție al pacienților incluși în studiu ........................................ 51
5.2 Organizarea bazei de date în vederea evaluării unor parametri clinici și
morfologici ca și posibili factori de prognostic ai recidivei ...................................... 52
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
6
5.3 Studiul componentei stromale inflamatorii ca și sursă de factori de prognostic în
recidiva cancerului de colon și de rect ....................................................................... 54
5.3.1 Algoritmul de studiu al tipului de infiltrat inflamator în cancerele de
colon și de rect operate și recidivate ........................................................... 54
5.3.2 Tehnica colorării cu hematoxilin-eozină a secțiunilor obținute din
blocuri de țesut incluse la parafină ............................................................. 55
5.3.3 Tehnica colorării prin metoda imunohistochimiei în cazul secțiunilor
obținute din blocuri de țesut incluse la parafină ......................................... 57
5.3.4 Descrierea metodei de achiziție în format electronic a lamelor obținute
în urma colorării prin metoda imunohistochimiei ...................................... 62
5.3.5 Descrierea metodei de analiză cantitativă automată a colorației
imunohistochimice .......................................................................................65
5.4 Analiza statistică a rezultatelor ............................................................................ 74
5.5 Rezultate ............................................................... ................................................ 75
5.6 Discuții .................................................................................................... ............. 93
5.7 Concluzii ............................................................ ................................................ 107
Capitolul 6. Studiul unor posibili factori de predicție moleculari ai răspunsului la
terapia neoadjuvantă în cancerul rectal ......................................................... ........... 109
6.1 Algoritmul de studiu ................................................................. ......................... 109
6.2 Selecția lotului de studiu ............................................................................ ........ 110
6.3 Descrierea metodelor utilizate în cadrul studiului ............................................. 111
6.3.1 Descrierea tehnicii de colorare imunohistochimică automată a
secțiunilor obținute din blocuri de țesut incluse la parafină ..................................... 111
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
7
6.3.2 Extracția simultană de ADN și ARNm din blocuri de țesut incluse la
parafină ...... ...............................................................................................................115
A. Deparafinarea pe lamă a țesuturilor incluse în parafină
(formalin fixed, paraffin – embedded – F.F.P.E.) ..................... 117
B. Microdisecția manuală ......................................................... 117
C. Izolarea de ARN cu ajutorul kitului QIAGEN AllPrep
DNA/RNA FFPE ...................................................................... 117
D. Izolarea de ADN cu ajutorul kitului QIAGEN AllPrep
DNA/RNA FFPE ...................................................................... 119
E. Tehnica evaluării purității și concentrației acizilor nucleici
izolați din fragmente de țesut incluse la parafină ...................... 120
F. Sinteza de ADN complementar (ADNc) din ARN-ul mesager
(ARNm) izolat din fragmente de țesut incluse la parafină........ 122
G. Analiza cantitativă a nivelului de expresie genică pe probe de
ADNc obținute din ARNm extras din blocuri de țesut incluse la
parafină ..................................................................................... 124
6.3.3 Descrierea algoritmului de analiză a rezultatelor obținute în urma
reacției de polimerizare în lanț ................................................................................. 127
6.3.4 Analiza statistică a rezultatelor ........................................................ 130
6.4 Rezultate ............................................................................................................. 130
6.5 Discuții ............................................................................... ................................ 137
6.6 Concluzii ............................................................................................................ 141
Capitolul 7. Concluzii generale ale studiului doctoral ............................................. 143
Bibliografie: ............................................................................................................. 145
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
8
Capitolul 4. Motivația studiului doctoral
În ciuda cantității mari de informatie adunate inclusiv din studiile
moleculare stadializarea Dukes enunțată în 1954, bazată doar pe criterii
histopatologice este în continuare singurul instrument folosit pentru a descrie
prognosticul în cancerul de colon și implicit abordarea terapeutică a fiecărui
pacient, în ciuda neomogenităților de prognostic chiar la pacienții din același
stadiu Dukes. Găsirea de factori de prognostic capabili să stratifice într-un
mod mai bun pacienții ar trebui să reprezinte o preocupare constantă a
studiilor care implică neoplaziile colo-rectale, motiv pentru care studiul meu
doctoral își propune:
investigarea detaliată a micromediului tumoral ca și posibilă
sursă de factori de prognostic;
studiul cu ajutorul tehnicilor de biologie moleculară al unor
factori de predicție pentru răspunsul la terapia adjuvantă;
Deși la o primă vedere ar putea părea ciudat interesul meu, ca și
medic rezident în specialitatea chirurgie generală, pentru o temă de studiu
care presupune aprofundarea unor tehnici de laborator ce presupun destul de
multă finețe, această preocupare vine din convingerea mea că abordarea
clinică a unei boli presupune cunoașterea amănunțită a fiziopatologiei chiar
până la nivelul studiului patologiei moleculare.
Un motiv în plus pentru care am considerat importantă deprinderea
unor tehnici de laborator, este faptul că pentru mine studiul doctoral ar trebui
să reprezinte doar piatra de temelie a dezvoltării mele ulterioare ca și medic
într-o perioadă dominată de conceptul medicinei bazate pe dovezi.
Capitolul 5. Studiul unor posibili factori de prognostic
pentru recidiva cancerului de colon și de rect operat
Acest studiu își propune studiul comparativ al unor factori de
prognostic folosiți în mod curent în practica medicală cu noi factori de
prognostic pentru a vedea aplicabilitatea acestora în predicția
comportamentului agresiv al unei tumori, descris prin intervalul de timp scurs
între o intervenție cu viză radicală și recidiva locală sau apariția unei
metastaze metacrone. Pentru selecția factorilor de prognostic incluși în studiu
am urmat următoarele direcții:
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
9
studiul unor parametri clinici și morfologici derivați din
studiul dosarului clinic al pacientului, inclusiv un raport
simplu de ganglioni limfatici (LNR) și un raport logaritmic
de ganglioni limfatici (LODDS);
descrierea micromediului tumoral al tumorilor provenite de
la pacienții incluși în studiu, în vederea verificării unor
posibile corelații între tipul de micromediu tumoral și
agresivitatea tumorii - figurile 5.2 – 5.6;
Fig. 5.2 Exemplu de colorație imunohistochimică pentru care anticorpul
primar folosit a fost anti-cd3 (20x).
Fig. 5.3 Exemplu de colorație imunohistochimică pentru care anticorpul
primar folosit a fost anti-cd4 (20x).
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
10
Fig. 5.4 Exemplu de colorație imunohistochimică pentru care anticorpul
primar folosit a fost anti-cd8 (20x).
Fig. 5.5 Exemplu de colorație imunohistochimică pentru care anticorpul
primar folosit a fost anti-cd45ro (20x).
Fig. 5.6 Exemplu de colorație imunohistochimică pentru care anticorpul
primar folosit a fost anti-cd68 (20x).
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
11
Studiul componentei stromale inflamatorii ca și sursă de
factori de prognostic în recidiva cancerului de colon și de rect
Ulterior realizării colorațiilor imunohistochimice studiul a presupus
achiziționare imaginii lamelor în format digital și analiza digitală a
imaginilor pentru a putea cuantifica colorația imunohistochimică în baza
următorilor parametri:
numărul de celule pozitive/mm2;
numărul de celule negative/mm2;
procentul de celule pozitive/mm2;
intensitatea medie a culorii markerului;
intensitatea medie a culorii nucleului;
Pe fiecare lamă am selectat în afara regiunii folosite ca și control
negativ câte 9 regiuni cu o suprafață constantă de 0.1910 mm2, astfel:
3 regiuni de interes din zona de țesut normal peritumoral (figura 5.19);
3 regiuni de interes de la nivelul frontului de invazie (figura 5.20);
3 regiuni de interes de la nivelul tumorii propriu-zise (figura 5.21);
Fig. 5.19 Exemplu de regiune de interes situată la nivelul zonei de țesut normal –
celulele pozitive sunt conturate în roșu (marcaj anti-cd3, 20x).
Fig. 5.20 Exemplu de regiune de interes situată la nivelul frontului de invazie –
celulele pozitive sunt conturate în roșu (marcaj anti-cd3, 20x).
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
12
Fig. 5.21 Exemplu de regiune de interes situată intratumoral – celulele pozitive sunt
conturate în roșu (marcaj anti-cd3, 20x).
Fig. 5.48 Imagine comparativă între selectarea pragului de discriminare de către un
anatomopatolog (stânga), selectarea automată a pragului prin împărțirea celuleor în
două clase funcție de intensitatea medie de culoare a markerului în pixelii care
alcătuiesc imaginea unei celule (centru) și selectarea pragului folosind o regiune de
control (dreapta) - imaginile prelucrate nu prezintă zgomot de fond și se poate observa
echivalența metodelor investigate.
Un pas important a fost reprezentat de asemenea de validarea unei
metode de cuantificare automată care să fie comparabilă ca și rezultate cu
cuantificarea realizată de către un anatomopatolog. În acest sens am
comparat 2 metode de cuantificare automată cu cuantificarea realizată de
către un anatomopatolog (figura 5.48).
Rezultate
Din punct de vedere al analizei statistice inferențiale am urmărit
corelații între intervalul liber de recidivă tratat ca și variabilă continuă, tipul
de recidivă și următoarele grupe de parametri:
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
13
parametri clinici (tabel 5.III):
parametri morfopatologici – fără a găsi corelații
semnificative statistic;
parametri care evaluează statusul ganglionar (tabel 5.V);
scorurile de noduli limfatici și numărul de ganglioni
limfatici invadați, respectiv numărul total de ganglioni
limfatici rezecați. (tabel 5.VI);
Tabel 5.IV
Corelații între parametrii morfopatologici investigați și intervalul liber de boală.
Interval liber
de boală
Tip de
recidivă
pT rho -0.032 -0.055
p 0.861 0.766
pN rho 0.162 0.255
p 0,564 0.359
Gradul de diferențiere al
tumorii
rho 0.349* -0.064
p 0.047 0.724
Prezența modificărilor
macroscopice ale seroasei
rho -0.157 0.086
p 0.382 0.635
Distanța până la tranșă rho -0.148 0.034
p 0.418 0.852
Dimensiunea tumorii rho 0.057 0.073
p 0.757 0.693
Abundența necrozei rho -0.039 -0.219
p 0.830 0.220
Prezența emboliilor
tumorale intravasculare
rho -0.170 -0.115
p 0.344 0.524
Prezența emboliilor
tumorale în vasele limfatice
rho 0.030 0.033
p 0.868 0.854
Prezența invaziei
perineurale
rho -0.207 -0.097
p 0.248 0.590
Prezența unei componente
coloide
rho -0.343 -0.144
p 0.054 0.431
Prezența unui abces
peritumoral
rho 0.034 -0.011
p 0.851 0.950
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
14
Tabel 5. V
Corelații între scorurile de noduli limfatici investigate și intervalul liber de boală.
Interval liber de
boală Tip de recidivă
Numărul de ganglioni invadați rho -0.338 -0.209
p 0.054 0.243
Nr total de ganglioni rezecați rho -0.297 0.044
p 0.094 0.807
LNR rho -0.290 -0.319
p 0.102 0.070
LODDS rho -0.117 -0.235
p 0.518 0.188
LNR categorii rho -0.269 -0.240
p 0.130 0.178
LODDS categorii rho -0.149 -0.339
p 0.409 0.054
Tabel 5.VI
Corelații între scorurile de noduli limfatici și numărul de ganglioni limfatici
invadați, respectiv numărul total de ganglioni limfatici rezecați.
Nr de ganglioni
invadați
Nr total de
ganglioni
rezecați
LNR rho 0.713 -0.,209
p <0.001 0.244
LODDS rho 0.717 -0.293
p <0.001 0.098
LNR categorii rho 0.710 -0.130
p <0.001 0.472
LODDS categorii rho 0.686 -0.284
p <0.001 0.109
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
15
Discuții
A. Corelații între posibili factori clinici de prognostic și
supraviețuirea liberă de boală
Din punct de vedere al localizării tumorii primare există în literatura
de specialitate concepția conform căreia agresivitatea tumorii poate fi legată
de localizarea tumorii. Explicația acestui fapt rezidă în aceea că tumorile
localizate la nivelul colonului drept și cele localizate la nivelul colonului
stâng par să urmeze modele de carcinogeneză diferite [1, 2]. În studiul nostru
nu am găsit nici o corelație semnificativă statistic (p=0.327) între topografia
tumorii primare și intervalul liber de boală.
În cadrul studiului de față însă nu am găsit nicio corelație
semnificativă statistic între intervalul liber de boală și prezența anemiei
(p=0.569) sau valorile hemoglobinei (p=0.824) și de asemenea analiza de
supraviețuire pentru supraviețuirea liberă de boală nu a relevat o diferență
semnificativă statistic între curbele de supraviețuire ale pacienților care
prezintă anemie și ale pacienților care nu prezintă anemie.
Nici leucocitoza nu a prezentat o corelație semnificativă statistic cu
intervalul liber de boală nici analiza de supraviețuire pentru supraviețuirea
liberă de boală nu a relevat o diferență semnificativă statistic între curbele de
supraviețuire ale pacienților care prezintă leucocitoză și ale pacienților care
nu prezintă leucocitoză.
B. Corelații între posibili factori morfopatologici și
supraviețuirea liberă de boală
Stadializare TNM este în acest moment criteriul cel mai important
de stabilire al conduitei terapeutice în cancerul colorectal și de asemenea
includerea pacienților în grupe de risc este determinată de aceleași criterii ale
stadializării TNM [3-7].
Din acest punct de vedere în cadrul studiului nostru nici criteriu pT,
nici criteriul pN al stadializării TNM nu au prezentat corelații semnificative
statistic cu intervalul liber de boală (p= 0.86 pentru pT, respectiv p= 0.56
pentru pN) și nici din punct de vedere al analizei supraviețuirii libere de
boală nu s-au distins ca și factori de stratificare al pacienților (figura 5.55).
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
16
Un posibil motiv pentru care criteriul pN nu a putut fi folosit ca și
factor de prognostic în studiul nostru este faptul că 18 dintre pacienții incluși
în studiu au fost încadrați ca și pNx datorită numărului insuficient de
ganglioni pentru a afirma stadiul pN conform recomadărilor AJCC [4].
Gradul de diferențiere al tumorii se corelează pozitiv cu intervalul
liber de boală (p=0.046), ceea ce este în acord cu literatura de specialitate,
având în vedere faptul că prezența unei tumori bine diferențiate implică un
risc mai mic de evoluție nefavorabilă [8]. Din punct de vedere al analizei de
supraviețuire Kaplan-Meier însă gradul de diferențiere al tumorii nu poate fi
folosit ca și criteriu de stratificare al pacienților.
Fig. 5.55 Curbe de supraviețuire Kaplan-Meier pentru analiza supraviețuirii libere de
boală, grupele analizate fiind rezultate prin trierea pacienților funcție de criteriul pN
(p=0.119).
Din punct de vedere al criteriilor morfopatologice, singurul criteriu
care poate fi folosit pentru stratificarea pacienților din punct de vedere al
supraviețuirii libere de boală este prezența sau absența unei componente
mucinoase.
C. Corelații între statusul ganglionar și supraviețuirea
liberă de boală
Din punct de vedere al evaluării statusului ganglionar am ales să
studiem doi parametri definiți anterior în literatura de specialitate și LNR și
LODDS. Fiecare dintre acesta a fost corelat în studii diferite cu prognosticul
cancerului de colon și de rect [9-19], însă niciunul dintre aceste studii nu a
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
17
tentat folosirea acestor scoruri de noduli limfatici pentru a prezice reluarea de
evoluție în cancerul de colon și de rect. Pentru aceasta am folosit următoarele
categorii [20]:
pentru LNR
LNR 0 = 0
LNR 1: 0 < LNR ≤ 0.11
LNR 2: 0 < LNR ≤ 0.36
LNR 3: 0.36 < LNR ≤ 0.66
LNR 4: LNR > 0.66
pentru LODDS:
LODDS 1 ≤ -2.51
-2.51 LODDS 2 ≤ -1.68
-1.68 LODDS 3 ≤ -0.51
-0.51 LODDS 4 ≤ 0.73
LODDS 5 > 0.73
Pentru început ne-am propus a determina care dintre cele două
scoruri aduc maximum de informație despre statusul ganglionar și așa după
cum se poate vedea în tabelul 5.VI, concluzia studiului nostru în acest caz
fiind că atât LNR cât și LODDS se corelează cu numărul de ganglioni
limfatici invadați (p<0.001 în ambele cazuri), dar nu cu numărul total de
ganglioni rezecați.
Următoarea etapă a studiului nostru a fost reprezentată de analiza
supraviețuirii libere de boală și am constat că pacienții pot fi stratificați
conform categoriilor LODDS definite mai sus (p=0,026), dar nu și conform
categoriilor LNR (p=0,126).
D. Corelații între tipul de infiltrat inflamator și
supraviețuirea liberă de boală
Studiul de față se deosebește de alte studii de acest fel prin 2
caracteristici:
cercetarea corelațiilor dintre tipul de infiltrat inflamator și
riscul evoluției către o recidivă locală sau la distanță, in loc
de evoluția globală;
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
18
cercetarea infiltratului inflamator atât la nivel intratumoral
și la nivelul frontului de invazie, dar și la nivelul țesutului
normal histopatologic din jurul tumorii.
Tabel 5.VII
Corelații între prezența de celule cd3 pozitive în zonele de interes analizate și
intervalul liber de boală.
Procent de
celule
pozitive
Densitate de
celule
pozitive
Număr
absolut de
celule
pozitive
Zona de interes
Interval
liber de
boală
Coeficient de corelație
0.057 0.092 -0.205 intratumoral
p 0.754 0.611 0.253
Interval
liber de
boală
Coeficient de corelație
0.402 0.392 0.009 front de invazie
p 0.020 0.024 0.962
Interval
liber de
boală
Coeficient de corelație
0.156 0.138 -0.167 peritumoral
p 0.395 0.452 0.362
Așa după cum se poate vedea din tabelul 5.VII, în cadrul studiul
nostru am putut evidenția prezența unei corelații semnificative statistic între
procentul și respectiv densitatea de celule cd3 pozitive la nivelul frontului de
invazie ceea ce coincide cu ipoteza conform căreia inflamația dezvoltată la
nivelul frontului de invazie ar fi responsabilă în mare măsură de agresivitatea
tumorii [21, 22].
Nu am putut evidenția în cadrul studiului nostru o corelație între
celulele cd4 pozitive și intervalul liber de boală posibil și din cauza
zgomotului de fond crescut în cazul acestei colorații, însă nici evaluarea
lamelor de către un anatomo-patolog nu a evidențiat corelații între abundența
de celule cd4 pozitive și intervalul liber de boală.
Așa după cum se poate observa în tabelul 5.IX am găsit corelații
semnificative statistic între densitatea de celule cd8 pozitive și intervalul liber
de boală (p=0,017), ceea ce coincide cu datele din literatură care spun că
prezența unui infiltrat abundent în celule T citotoxice poate fi asociat cu un
interval liber de boală mai lung [23-25].
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
19
Elementul de noutate al studiului nostru în ceea ce privește
abundența infiltratului cd8 pozitiv la nivelul țesutului normal peritumoral se
poate observa de asemenea din tabelul 5.IX, din care reiese prezența unei
corelații inverse între procentul de celule cd8 pozitive și intervalul liber de
boală. O posibilă explicație poate fi dată de influența acestor celule asupra
balanței citokinelor de la acest nivel, cunoscut fiind echilibrul fin dintre
efectele promotorii tumorale și cele limitante ale proliferării tumorale.
Pe de altă parte studiul nostru nu a evidențiat niciun fel de corelație
între abundența de celule cd45ro pozitive și intervalul liber de boală [26].
Tabel 5.IX
Corelații între prezența de celule cd8 pozitive în zonele de interes analizate
și intervalul liber de boală.
Procent de
celule
pozitive
Densitate
de celule
pozitive
Număr
absolut
de celule
pozitive
Zona de interes
Interval
liber de
boală
Coeficient de
corelație 0.335 0.418 -0.,026
intratumoral
p-value ,061 ,017 ,886
Interval
liber de
boală
Coeficient de
corelație 0.175 0.196 -0.102
front de invazie
p-value ,354 ,298 ,593
Interval
liber de
boală
Coeficient de
corelație -0.565 0.,009 -0.198
Peritumoral
p-value 0.009 0.929 0.295
Capitolul 6. Studiul unor posibili factori de predicție moleculari ai
răspunsului la terapia neoadjuvantă în cancerul rectal
Studiul de față este un studiu retrospectiv în care au fost implicați 89
pacienți care s-au prezentat în Spitalul Clinic Universitar Freiburg și în
Spitalul ”St. Vincentius” din Karlsruhe Germania cu tumori rectale pentru
care au urmat terapie neoadjuvantă după protocolul standard, urmată de
rezecție chirurgicală cu viză curativă a tumorii.
Scopul studiului a fost determinarea unor corelații între expresia
genică la nivel de ARN a unor proteine, ținte intracelulare ale radioterapiei și
mai ales chimioterapiei neoadjuvante, și răspunsul la terapia neoadjuvantă, și
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
20
respectiv evaluarea aceluiași tip de corelații între abundența celulelor marcate
imunohistochimic pentru aceleași proteine și răspunsul la terapia
neoadjuvantă. În același timp s-a urmărit și studierea gradului de corelație
statistică între gradul de expresie genică și abundența celulelor marcate
imunohistochimic.
Evaluarea lamelor a fost făcută de dr. Helene Geddert, medic
specialist anatomo-patolog în cadrul Institutului de Patologie a Spitalului „St.
Vincentius” din Karlsruhe (figurile 6.5 – 6.7). În afară de evaluarea colorației
imunohistochimice medicul anatomo-patolog a efectuat și urmărirea gradului
de regresie a tumorii pe secțiunile obținute din probele de rezecție față de
probele de biopsie.
Fig. 6.1 Reprezentare schematică a distribuției lotului de pacienți.
Fig. 6.2 Exemplu de pacient considerat responder și de pacient considerat non-
responder în studiul nostru (HE, 2,5x).
Din punct de vedere molecular, microdisecția, izolarea de acizi
nucleici și procesarea lor ulterioară a fost realizată în Institutul de Patologie
„Ludwig-Aschoff-Haus” al Spitalului Clinic Universitar Freiburg, în cadrul
grupul de lucru al prof. dr. Martin Werner și prof. dr. Silke Lassmann (AG
Werner-Lassmann). Prelucrarea moleculară a acizilor nucleici izolați ulterior
microdisecției a presupus cuantificarea expresiei genice la nivel de ARN,
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
21
prin sinteza de ADNc din mARN-ul și PCR cantitativ pe ADN-ul astfel
obținut.
Fig. 6.5 Exemplu de colorație imunohistochimică pentru evidențierea timidilat
sintazei (10x).
Fig. 6.6 Exemplu de colorație imunohistochimică pentru evidențierea survivinei
(10x).
Fig. 6.7 Exemplu de colorație imunohistochimică pentru evidențierea Aurora kinazei
A (10x).
În ceea ce privește evaluarea cantitativă a expresiei genice la nivel
de ARN, metoda a presupus inițial o etapă de microdisecție manuală pe lamă,
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
22
urmată de izolare simultană de ADN și ARN cu ajutorul unui kit de izolare
QIAGEN AllPrep DNA/RNA FFPE, după un protocol derivat din protocolul
pus la dispoziție de firma producătoare, dar ajustat printr-un număr mare de
tatonări pentru a crește concentrațiile de ADN și ARN. Ulterior izolării, din
ARN-ul extras s-a practicat sinteza de ADN complementar utilizat apoi în
cadrul unei reacții PCR real-time cantitative.
Din punct de vedere al analizei statistice, o primă etapă a avut ca
obiectiv verificarea faptului că între valorile dCt ale pacienților din lotul de
studiu și valorile dCt ale pacienților din lotul de control, care nu au efectuat
terapie neoadjuvantă nu există diferențe semnificative statistic. Această etapă
a necesitat utilizarea testului t-student.
Ulterior am utilizat testul Spearman pentru a evalua corelațiile dintre
nivelul de expresie genică și răspunsul la terapia neoadjuvantă.
În fine, ultima etapă de analiză statistică a presupus utilizarea
testului t-student pentru a vedea dacă nivelul de expresie genică la nivel de
ARN pentru genele testate diferă la același pacient înainte și după terapia
neoadjuvantă.
Rezultate
Din punct de vedere al repartiției pe sexe a pacienților 71 de pacienți
au fost reprezentați de femei (65.75%), în timp ce 37 au fost reprezentați de
pacienți de sex masculin (34.25%).
În ceea ce privește vârsta, media a fost de 64.32 de ani cu o eroare
standard de 11.14 ani, vârsta minimă fiind de 36 de ani și vârsta maximă de
88 de ani.
Din punct de vedere al analizei de statistică descriptivă am constatat
că în medie procentul de celule tumorale viabile rămase după terapia
neoadjuvantă a fost de 31.67% ± 3.11, cu o minimă de 0% și o maximă de
95%. Mediana acestui parametru a fost de 20%, această valoare fiind folosită
în prelucrarea statistică ulterioară ca și valoare prag pentru încadrarea
pacientului în grupul de pacienți care răspund la terapia neoadjuvantă.
Din punct de vedere al statisticii inferative, aplicarea testului
Spearman pentru a evalua corelațiile între valoarea dCt pentru fiecare genă și
răspunsul histologic cuantificat prin procentul de celule tumorale viabile
restante a arătat că nivelul de expresie genică a Aurora kinazei A, cyclinei D1
și a Mcl 1 se corelează negativ cu răspunsul la terapia neoadjuvantă la un
nivel de semnificați statistică mai mic de 5% (p<0.05) – tabel 6.VI. Pe de altă
parte atunci când analizăm corelațiile expresiei genice cu numărul de celule
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
23
viabile restante tratat ca și variabilă continuă și nu doar prin prisma încadrării
pacienților în grupul de responderi sau de non-responderi Aurora A este
singura pentru care găsim o astfel de corelație la un nivel de semnificație
statistică mai mic de 5% (p<0.05) tabel 6. VII.
Tabel 6.VI
Rezultatele testului de corelație Spearman între valoarea dCt pentru genele studiate
și statutul de responder sau non-responder.
Responder vs. Non-responder
dCt Aurora kinază A Rho -0.195
p 0.034
dCt Timidilat sintază Rho -0.139
p 0.099
dCt Survivină Rho -0.090
p 0.203
dCt Cyclină D1 Rho -0.218
p 0.021
dCt Bcl-xl
Rho -0.165
P 0.064
dCt Mcl1 Rho -0.196
p 0.033
În cele din urmă am încercat să urmărim dacă terapia neoadjuvantă
afectează nivelul de expresie genică și în acest sens am folosit testul t-student
care a demonstrat că nivelul de expresie genică al Aurora kinazei A scade
după radioterapie (p = 0.002).
Discuții
Din punct de vedere al rezultatelor studiului nostru poate cea mai
surpinzătoare a fost lipsa corelației dintre nivelul expresiei genice a timidilat
sintazei (dCt) și răspunsul histopatologic la terapia neoadjuvantă, evaluat prin
procentul de celule tumorale viabile restante după aplicarea terapiei (p=
0.186). Acest fapt este surprinzător în contextul în care timidilat sintaza este
bine cunoscută ca țintă intracelulară a 5-fluorouracilului și a 5-
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
24
fluorodeoxiuridinei [27-29], fiind o enzimă limitantă de viteză în reacția de
trecere de la deoxiuridin monofosfat la deoxitimidin monofosfat necesar în
sinteza timidilatului și implicit a ADN-ului (figura 6.30).
Tabel 6.VII
Rezultatele testului de corelație Spearman între valoarea dCt pentru genele studiate
și procentul de celule viabile restante după terapia neoadjuvantă.
Procentul de celule viabile restante după terapia neoadjuvantă
dCt Aurora
kinaza A
Rho 0.199*
P 0.032
dCt Timidilat sin
tază
Rho 0.097
P 0.186
dCt Survivină Rho 0.102
P 0.172
dCt Cyclina D1 Rho 0.173
P 0.053
dCt Bclxl Rho 0.135
P 0.105
dCt Mcl1 Rho 0.169
P 0.058
Aurora kinaza A este o moleculă recent descoperită și relativ puțin
studiată din punct de vedere al puterii ei de a prezice răspunsul la terapie sau
de a prognostica evoluția pacientului [30-33]. Până în acest moment
majoritatea studiilor referitoare la Aurora kinaza A sunt studii care se referă
la studiul rolului ei în carcinogeneză și la asocierea sa cu mecanisme pe larg
studiate de carcinogeneză colorectală cum ar fi instabilitatea microsateliților
[31].
În studiul nostru Aurora kinaza A a fost singura genă al cărui nivel
de expresie genică la nivel de ARN s-a corelat semnificativ (p= 0.032) cu un
răspuns pozitiv la terapia neoadjuvantă (figura 6.31). Acest aspect pare a fi în
acord cu datele actuale din literatura de specialitate [30, 33].
În plus, atunci când am studiat efectul pe care radio-chimioterapia îl
are asupra gradului de expresie genică a Aurora kinazei A în ARN-ul extras
din probe de țesut incluse la parafină, am ajuns la concluzia că terapia
neoadjuvantă se asociază cu o scădere semnificativă statistic a nivelului
Aurora kinazei A (p= 0.002).
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
25
Fig. 6.30 Imagine cu obiectiv 20x, colorație imunohistochimică pentru timidilat
sintază.
Fig. 6.31 Imagine cu obiectiv 20x, colorație imunohistochimică pentru Aurora kinaza
A.
Fig. 6.32 Imagine cu obiectiv 20x, colorație imunohistochimică pentru survivină.
Cyclina D1 a fost la rândul ei corelată la un nivel de
semnificație statistică mai mic de 5% (p= 0.021) cu încadrarea pacienților în
grupul pacienților care manifestă răspuns histopatologic la terapia
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
26
neoadjuvantă. Această constatare este în acord cu datele din literatura de
specialitate [34].
În studiul de față însă survivina nu a putut fi corelată în niciun fel cu
procentul de celule tumorale viabile după terapia adjuvantă (p=0.172) și deci
nici cu existența unui răspuns la radio-chimioterapia preoperatorie (figura
6.32).
Capitolul 7. Concluzii generale ale studiului doctoral
Studiind posibilitatea de a determina noi factori de prognostic pentru
apariția reluării de evoluție în cancerul de colon și de rect, studiu de față a
evidențiat următoarele:
1. Niciunul dintre parametrii clinici considerați în acest studiu nu pot fi
utilizați ca și factori de prognostic pentru recidiva cancerului de
colon;
2. Dintre parametri morfopatologici luați în calcul gradul de
diferențiere al tumorii se corelează cu intervalul liber de boală la un
nivel de semnificație statistică p<0.05, iar prezența componentei
coloide poate fi utilizată pentru a stratifica pacienții din punct de
vedere al supraviețuirii libere de boală;
3. În studiul nostru pN, un factor de prognostic a cărui utilitate a fost
dovedită în repetate studii și care este folosit de rutină în activitatea
clinică, nu se corelează nici cu intervalul liber de boală, nici nu
poate fi folosit pentru a stratifica pacienții în cadrul analizei de
supraviețuire, o posibilă explicație fiind faptul că la 18 dintre cei 33
de pacieți incluși în studiu, adică la 54.54% dintre pacienții incluși
în studiu numărul de ganglioni limfatici a fost sub 12 ceea ce,
conform normelor AJCC face imposibilă stadializarea din punct de
vedere al criteriului pN. Acest fapt subliniază necesitatea definirii
unor noi scoruri care să definească statusul ganglionar și în astfel de
situații;
4. Atât LNR cât și LODDS se corelează cu numărul de ganglioni
limfatici invadați (p<0.001);
5. LODDS poate fi utilizat pentru a stratifica pacienții din punct de
vedere al supraviețuirii libere de boală (p=0.026) ceea ce îl face un
candidat la rolul de factor de prognostic în recidiva cancerului de
colon și de rect;
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
27
6. Am putut valida în cadrul studiului nostru o metodă de evaluare
cantitativă automată a colorației imunohistochimice, utilizând un
sistem TissueGnostics și pachetul software TissueQuest ceea ce ne-a
permis obținerea de date precum procentul de celule pozitive,
densitatea de celule pozitive și numărul absolut de celule pozitive
pentru diverse arii de pe lamă considerate zone de interes (țesut
normal peritumoral, front de invazie, intratumoral);
7. Am evidențiat cu ajutorul sistemului TissueGnostics, prin metoda
validată în cadrul studiului următoarele corelații:
a. corelație inversă între procentul și densitatea de celule cd68
pozitive la nivel intratumoral și intervalul liber de boală la
un nivel de semnificație statistică p = 0,005;
b. corelație directă între procentul și densitatea de celule cd3
pozitive la nivelul frontului de invazie și intervalul liber de
boală la un nivel de semnificație statistică p = 0,020;
c. corelație directă între densitatea de celule cd8 pozitive la
nivel intratumoral și intervalul liber de boală la un nivel de
semnificație statistică p = 0,017;
d. corelație inversă între procentul, dar nu și densitatea de
celule cd8 pozitive la nivel peritumoral și intervalul liber de
boală la un nivel de semnificație statistică p=0,021,
investigarea infiltratului inflamator la nivelul țesutului
morfologic normal peritumoral fiind și unul dintre
elementele de noutate ale studiului, întrucât studiul
infiltratului inflamator în literatura de specialitate ia în
calcul doar regiunea intratumorală și frontul de invazie.
În ceea ce privește componenta studiului de față referitoare la
testarea unor posibili factori de predicție ai răspunsului la terapia
neoadjuvantă putem concluziona următoarele:
8. Studiul nostru a demonstrat prezența unei corelații semnificative
statistic între expresia la nivel de ARN a Aurora kinazei A și
gradul de răspuns histologic la terapia neoadjuvantă.
9. În plus am demonstrat o scădere semnificativă statistic a
nivelului expresiei genice a Aurora kinazei A după terapia
neoadjuvantă;
10. Cyclina D1 este o altă proteină implicată în ciclul celular care în
cadrul studiului nostru prezintă corelații semnificative statistic
cu răspunsul la radio-chimioterapia preoperatorie;
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
28
11. Timidilat sintaza, deși este o enzimă a căror interacțiuni cu 5-
fluorouracilul sunt extrem de bine stabilite, nu s-a distins în
studiul nostru ca posibil factor de predicție al răspunsului la
terapia adjuvantă;
12. Survivina, o proteină care datorită rolurilor ei ca membru al
familiei inhibitorilor apoptozei ar fi putut fi un candidat la rolul
de factor predictiv pentru răspunsul la chimio-radioterapie, nu a
demonstrat prezența unei corelații semnificative statistic între
expresia ei la nivel de ARN răspunsul histologic la terapia
neoadjuvantă.
13. Studiul de față a demonstrat posibilitatea modificării
protocolului standard recomandat de firma producătoare pentru
izolarea simultană de ADN și ARN, în așa fel încât cantitatea de
acizi nucleici izolați să fie sporită, fără a influența puritatea sau
calitatea acizilor nucleici astfel izolați.
Bibliografie selectivă:
1. Bullard, K.M., Rothenberger, D.A., Colon, rectum and anus, in Schwartz's
Principles of Surgery, F.C. Brunicardi, Andersen, D.K., Billiar T.R., Dunn,
D.L., Hunter J.G., Pollock R.E., Editor. 2005, McGraw-Hill: International
Edition. p. 1084-1097.
2. Weyemi, U., Lagente-Chevallier, O., Boufraqech, M., Prenois, F., Courtin,
F., Caillou, B., Talbot, M., et al., ROS-generating NADPH oxidase NOX4 is
a critical mediator in oncogenic H-Ras-induced DNA damage and
subsequent senescence. Oncogene, 2012. 31(9): p. 1117-29.
3. Tratamentul cancerului colo-rectal - curs pentru rezidenți. [cited 2013
February]; Available from:
http://www.umfiasi.ro/Rezidenti/suporturidecurs/Facultatea%20de%20Medi
cina/Oncologie/oncologie%20medicala-
%20tematica%20curs%20rezidenti/47.%20C%20colonului.pdf.
4. Edge, S.B., Byrd, D.R.,Compton, C.C., Fritz, A.G., Greene, F.L., Trotti, A.,
AJCC Cancer Staging Manual. 2010.
5. N.C.C.N. National Comprehensive Cancer Network Guideines for Rectal
Cancer. 2013 [cited 2013 february]; Available from:
http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/rectal.pdf.
6. N.C.C.N. National Comprehensive Cancer Network Guidelines for Colon
Cancer. 2013 [cited 2013 february]; Available from:
http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/colon.pdf.
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
29
7. Petitjean, A., Mathe, E., Kato, S., Ishioka, C., Tavtigian, S.V., Hainaut,
P.Olivier, M., Impact of mutant p53 functional properties on TP53 mutation
patterns and tumor phenotype: lessons from recent developments in the
IARC TP53 database. Hum Mutat, 2007. 28(17311302): p. 622-629.
8. Langner, C., Harbaum, L., Pollheimer, M.J., Kornprat, P., Lindtner, R.A.,
Schlemmer, A., Vieth, M., et al., Mucinous differentiation in colorectal
cancer--indicator of poor prognosis? Histopathology, 2012. 60(7): p. 1060-
72.
9. Persiani, R., Cananzi, F.C.M., Biondi, A., Paliani, G., Tufo, A., Ferrara, F.,
Vigorita, V., et al., Log odds of positive lymph nodes in colon cancer: a
meaningful ratio-based lymph node classification system. World J Surg,
2012. 36(22270984): p. 667-674.
10. Sun, Z., Xu, Y., Li, D.M., Wang, Z.N., Zhu, G.L., Huang, B.J., Li, K., et al.,
Log odds of positive lymph nodes: a novel prognostic indicator superior to
the number-based and the ratio-based N category for gastric cancer
patients with R0 resection. Cancer, 2010. 116(20336791): p. 2571-2580.
11. Vinh-Hung, V., Verschraegen, C., Promish, D.I., Cserni, G., Van De
Steene, J., Tai, P., Vlastos, G., et al., Ratios of involved nodes in early
breast cancer. Breast Cancer Res, 2004. 6(6): p. R680-8.
12. Wang, J., Hassett, J.M., Dayton, M.T.Kulaylat, M.N., The prognostic
superiority of log odds of positive lymph nodes in stage III colon cancer. J
Gastrointest Surg, 2008. 12(18709510): p. 1790-1796.
13. Edler, D., Ohrling, K., Hallstrom, M., Karlberg, M.Ragnhammar, P., The
number of analyzed lymph nodes - a prognostic factor in colorectal cancer.
Acta Oncol, 2007. 46(17917828): p. 975-981.
14. Huh, J.W., Kim, C.H., Kim, H.R.Kim, Y.J., Factors predicting oncologic
outcomes in patients with fewer than 12 lymph nodes retrieved after
curative resection for colon cancer. J Surg Oncol, 2012. 105(21837680): p.
125-129.
15. Huh, J.W., Kim, Y.J.Kim, H.R., Ratio of metastatic to resected lymph nodes
as a prognostic factor in node-positive colorectal cancer. Ann Surg Oncol,
2010. 17(20300967): p. 2640-2646.
16. Kim, J.-Y., Chung, S.-M., Choi, B.-O., Lee, I.-K., An, C.-H., Won, J.-
M.Ryu, M.-R., Prognostic significance of the lymph node ratio regarding
recurrence and survival in rectal cancer patients treated with postoperative
chemoradiotherapy. Gut Liver, 2012. 6(22570749): p. 203-209.
17. Manilich, E.A., Kiran, R.P., Radivoyevitch, T., Lavery, I., Fazio,
V.W.Remzi, F.H., A novel data-driven prognostic model for staging of
colorectal cancer. J Am Coll Surg, 2011. 213(5): p. 579-588, 588 e1-2.
18. Rosenberg, R., Engel, J., Bruns, C., Heitland, W., Hermes, N., Jauch, K.-
W., Kopp, R., et al., The prognostic value of lymph node ratio in a
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
30
population-based collective of colorectal cancer patients. Ann Surg, 2010.
251(20485149): p. 1070-1078.
19. Wang, J., Kulaylat, M., Rockette, H., Hassett, J., Rajput, A., Dunn,
K.B.Dayton, M., Should total number of lymph nodes be used as a quality
of care measure for stage III colon cancer? Ann Surg, 2009.
249(19300237): p. 559-563.
20. Song, Y.X., Gao, P., Wang, Z.N., Tong, L.L., Xu, Y.Y., Sun, Z., Xing,
C.Z., et al., Which is the most suitable classification for colorectal cancer,
log odds, the number or the ratio of positive lymph nodes? PLoS One, 2011.
6(12): p. e28937.
21. Holten-Andersen, M.N., Hansen, U., Brunner, N., Nielsen, H.J., Illemann,
M.Nielsen, B.S., Localization of tissue inhibitor of metalloproteinases 1
(TIMP-1) in human colorectal adenoma and adenocarcinoma. Int J Cancer,
2005. 113(2): p. 198-206.
22. Laghi, L., Bianchi, P., Miranda, E., Balladore, E., Pacetti, V., Grizzi, F.,
Allavena, P., et al., CD3+ cells at the invasive margin of deeply invading
(pT3-T4) colorectal cancer and risk of post-surgical metastasis: a
longitudinal study. Lancet Oncol, 2009. 10(19656725): p. 877-884.
23. Galon, J., Costes, A., Sanchez-Cabo, F., Kirilovsky, A., Mlecnik, B.,
Lagorce-Pages, C., Tosolini, M., et al., Type, density, and location of
immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome.
Science, 2006. 313(17008531): p. 1960-1964.
24. Pages, F., Kirilovsky, A., Mlecnik, B., Asslaber, M., Tosolini, M., Bindea,
G., Lagorce, C., et al., In situ cytotoxic and memory T cells predict outcome
in patients with early-stage colorectal cancer. J Clin Oncol, 2009. 27(35):
p. 5944-51.
25. Swann, J.B.Smyth, M.J., Immune surveillance of tumors. J Clin Invest,
2007. 117(17476343): p. 1137-1146.
26. Gallimore, A.M.Simon, A.K., Positive and negative influences of
regulatory T cells on tumour immunity. Oncogene, 2008. 27(18836469): p.
5886-5893.
27. Van Triest, B.Peters, G.J., Thymidylate synthase: a target for combination
therapy and determinant of chemotherapeutic response in colorectal
cancer. Oncology, 1999. 57(3): p. 179-94.
28. Van Triest, B., Pinedo, H.M., Van Hensbergen, Y., Smid, K., Telleman, F.,
Schoenmakers, P.S., Van Der Wilt, C.L., et al., Thymidylate synthase level
as the main predictive parameter for sensitivity to 5-fluorouracil, but not for
folate-based thymidylate synthase inhibitors, in 13 nonselected colon
cancer cell lines. Clin Cancer Res, 1999. 5(3): p. 643-54.
29. Munro, A.J., Lain, S.Lane, D.P., P53 abnormalities and outcomes in
colorectal cancer: a systematic review. Br J Cancer, 2005. 92(15668707): p.
434-444.
Micromediul tumoral şi prognosticul cancerului colorectal operat,
recidivat
31
30. Agnese, V., Bazan, V., Fiorentino, F.P., Fanale, D., Badalamenti, G.,
Colucci, G., Adamo, V., et al., The role of Aurora-A inhibitors in cancer
therapy. Ann Oncol, 2007. 18 Suppl 6(17591831): p. 47-52.
31. Baba, Y., Nosho, K., Shima, K., Irahara, N., Kure, S., Toyoda, S., Kirkner,
G.J., et al., Aurora-A expression is independently associated with
chromosomal instability in colorectal cancer. Neoplasia, 2009. 11(5): p.
418-25.
32. Belt, E.J.T., Brosens, R.P.M., Delis-Van Diemen, P.M., Bril, H., Tijssen,
M., Van Essen, D.F., Heymans, M.W., et al., Cell cycle proteins predict
recurrence in stage II and III colon cancer. Ann Surg Oncol, 2012. 19
Suppl 3(22311118): p. 682-692.
33. Dotan, E., Meropol, N.J., Zhu, F., Zambito, F., Bove, B., Cai, K.Q.,
Godwin, A.K., et al., Relationship of increased aurora kinase A gene copy
number, prognosis and response to chemotherapy in patients with
metastatic colorectal cancer. Br J Cancer, 2012. 106(22240781): p. 748-
755.
34. Myklebust, M.P., Li, Z., Tran, T.H., Rui, H., Knudsen, E.S., Elsaleh, H.,
Fluge, O., et al., Expression of cyclin D1a and D1b as predictive factors for
treatment response in colorectal cancer. Br J Cancer, 2012. 107(23099809):
p. 1684-1691.