Post on 06-Feb-2017
transcript
RĂZVAN PETRU MELINTE
REZUMATUL
TEZEI DE DOCTORAT
CONTRIBUłII LA STUDIUL SEMNIFICAłIEI GEOMETRICE A
DISTRIBUłIEI TEMPOROSPAłIALE A
SISTEMELOR LAMELARE DIN COMPACTA OSULUI
Conducător ştiinŃific Prof. univ. dr. med. Gh. S. Drăgoi, MD, PhD
Membru titular al Academiei de ŞtiinŃe Medicale din România
2009
MINISTERUL EDUCATIEI, CERCETARII SI INOVARII UNIVERSITATEA DE MEDICINA SI FARMACIE DIN
CRAIOVA
COMISIA PENTRU EVALUAREA ŞI SUSłINEREA PUBLICĂ A TEZEI DE DOTORAT
A fost aprobată în Biroul de Senat al UniversităŃii de Medicină şi
Farmacie din Craiova în următoarea componenŃă Preşedintele Comisiei Conducătorul tezei de doctorat ReferenŃi oficiali
Prof. Univ. Dr. Ion Rogoveanu, Decan al FacultăŃii de Medicină Generală a UniversităŃii de Medicină şi Farmacie din Craiova Prof. Univ. Dr. Gheorghe S. Drăgoi Membru titular al Academiei de ŞtiinŃe Medicale din Craiova 1. Prof. Univ. Dr. Doina Onicescu, Membru titular al Academiei de ŞtiinŃe Medicale, Conducător de Doctorat la Universitatea de Medicină şi Farmacie „Carol Davila” Bucureşti
2. Prof. Univ. Dr. Elena Lazăr, Conducător de Doctorat la Universitatea de Medicină şi Farmacie „Victor Babeş” Timişoara
3. Prof. Univ. Dr. Virgiliu Niculescu, Membru titular al Academiei de ŞtiinŃe Medicale, Conducător de Doctorat la Universitatea de Medicină şi Farmacie „Victor Babeş” Timişoara
Rector,
Prof. Univ. dr. Adrian Săftoiu
1
SINTEZE ALE CERCETĂRILOR PERSONALE DIN TEZA DE DOCTORAT
I. INTRODUCERE.................................................................................................................3
A. MOTIVAłIA CERCETĂRII...........................................................................3
B. PROBLEMATICA ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRII................................4 II. MATERIALE ŞI METODE.............................................................................................6
A. MATERIALE STUDIATE...............................................................................6
B. METODE UTILIZATE....................................................................................6 1. Recoltarea Ńesutului şi fixarea........................................................................6
a. Fixatori................................................................................................7 b. Timpul de fixare...................................................................................8 c. Fixatori şi coloraŃii..............................................................................9
2. Decalcificarea Ńesutului osos..........................................................................9 3. Deshidratarea, clarificarea, infiltrarea şi includerea în parafină...............11 4. Metode de colorare a secŃiunilor obŃinute prin prelucrarea fragmentelor osoase.............................................................................................................12
5. Izolarea celulelor Stem mesenchimale din măduva osoasa..........................14 6. Imunofenotiparea celulelor Stem mesenchimale prin citometrie in flux.................................................................................................................15
7. Metode de caracterizare a celulelor osteoprogenitoare................................17 III. REZULTATELE OBSERVAłIILOR PERSONALE..................................................20
A. ANALIZA MICROANATOMICĂ A SISTEMELOR DE LAMELE OSOASE.............................................................................................................20 1. Analiza microanatomică a raporturilor între sistemele lamelare ale
osului prin examinare în lumină polarizată...........................................20 2. Analiza microanatomică a hotarelor osteonale......................................21 3. Analiza microanatomică a genezei osteoanelor în cadrul procesului de
remaniere a osului matur.........................................................................22 4. Analiza genezei corelative a sistemului osteonovascular.......................23
B. ANALIZA MORFOLOGICĂ, FUNCłIONALĂ ŞI FENOTIPICĂ A
CELULELOR OSTEOPROGENITOARE DIFERENłIATE DIN CELULE STEM MESENCHIMALE EXTRASE DIN ASPIRATUL DE MADUVĂ OSOASĂ..........................................................................................23 1. Diferentierea celulelor Stem mesenchimale la osteoblaste primare in vitro si evaluarea markerilor moleculari specifici ai acestora........................................................................................................23
2. Efectuarea de co-culturi celule stem-osteoblaste diferentiate (MSC:OB)...................................................................................................25
3. Cultivarea MSC:OB şi investigarea proliferării acestora, morfologiei, markerilor de diferentiere ai osteoblastelor si expresiei proteinelor din complexul de adeziune................................................................................27
2
IV. DISCUłIA REZULTATELOR PERSONALE.............................................................35 V. CONCLUZII.......................................................................................................................39 VI. IMAGISTICA...................................................................................................................42
A. ANALIZA RAPORTURILOR ÎNTRE SISTEMELE DE LAMELE OSOASE ŞI OSTEONICE PRIN EXAMINARE ÎN LUMINĂ POLARIZATĂ……….......…............................................................................43
B. ANALIZA MICROANATOMICĂ A HOTARELOR OSTEOANELOR.................................................................................................58
C. ANALIZA MICROANATOMICĂ A GENEZEI OSTEOANELOR ÎN OSUL MATUR..............................................................................................................64
VII. BIBLIOGRAFIE.............................................................................................................83
3
I. INTRODUCERE
Teza de doctorat este structurată pe două părŃi: o parte generală şi o parte
specială de cercetări personale. În partea generală am consemnat probleme legate de
particularităŃile biostructurale ale genezei şi diferenŃierii oaselor şi de anatomia
funŃională a sistemelor de lamele osoase. În partea specială sunt prezentate
motivaŃia, scopul şi obiectivele cercetării, rezultatele observaŃiilor personale,
discuŃia reultatelor şi concluziile.
A. MOTIVAłIA CERCETĂRII
Fenomenul de reînoire permanentă a osteoanelor, nominalizat ca proces de
remodelare, deŃine încă numeroase necunoscute. Multiple studii au evaluat
particularităŃile anatomotopografice ale „remodelării”: Podenphant şi Engel (1987)
au descris variaŃiile regionale ale remodelării osoase; există deasemenea o variaŃie a
activităŃii de remodelare la nivelul diferitelor suprafeŃe osoase (Steiniche şi Hauge,
2003). Se cunoaşte în plus că activitatea de remodelare a spongioasei osului este de
5-10 ori mai mare decât corticalei osului. Harttner, Epker şi Frost (1965) consideră
că remodelarea se manifestă ca o secvenŃă de evenimente desfăşurate prin
contribuŃia unei echipe de celule ce formează o „Unitate Osoasă Multicelulară”
(UOM sin.: BMU=bone multicellular unit) prin care se realizează două procese
contrarii: rezorbŃie osteoclastică localizată şi formare osteoblastică care sunt strâns
interconectate în timp şi spaŃiu. 30IB denumeşte frecvenŃa cu care o anumită zonă a
suprafeŃei structurilor osului (periostală, endostală, canaliculară haversiană şi
trabeculară) suferă remodelarea – „frecvenŃa de activitate”.
Deşi există numeroase date asupra rolului central al osteoclastelor în geneza
şi reglarea masei structurilor osului totuşi există puŃine informaŃii asupra rolului său
în remodelarea osului. Numeroase întrebări au rămas fără răspuns: osteoclastele au
capacitatea de a recunoaşte locurile pe care vor acŃiona?; selecŃia acestor locuri este
bine determinată sau are un caracter aleatoriu?
4
Factorii determinanŃi ai apariŃiei secvenŃiale a celulelor din cadrul „unităŃii
multicelulare a osului” – osteoclastele şi osteoblastele – constituie una din cele mai
mari enigme ale biologiei osului.
Natura precisă a interrelaŃiilor dintre osteoclaste şi osteoblaste este încă puŃin
cunoscută. Progresele înregistrate în cunoaşterea biologiei osului permit realizarea
unei imagini mai precise asupra bazelor morfologice ale recăderilor în patologia
osului – ca exemplu în poliartrite.
La dezvoltarea osului participă trei mecanisme de bază: creşterea
longitudinală, modelarea şi remodelarea. În timpul creşterii se realizează o adaptare
continuă a formei macroscopice a osului. SuprafeŃele structurilor osului suferă
procese de modelare prin apariŃia rezorbŃiei continue pe unele suprafeŃe şi formării
continue pe alte suprafeŃe. Se realizează în acest fel sculptura formei osului prin
adăugarea de material osos în unele zone şi îndepărtarea lui în altele. În remodelare
structurile osului se reînoiesc permanent în os de a lungul vieŃii. Remodelarea este
un fenomen ce are loc pe toate suprafeŃele structurilor osoase.
Remodelarea osului, la adult, realizează reînoire continuă a matricei osoase
la nivelul unor regiuni mici ale osului numite „unităŃi de remodelare”. În acest caz
osteoclastele şi osteoblastele îşi desfăŃoară activitatea lor pe acelaşi loc într-o
coordonare riguroasă.
Se remarcă cu uşurinŃă diferenŃa anatomică dintre modelare şi remodelare.
Modelarea structurilor osului se realizează prin activitatea osteoclastelor şi
osteoblastelor situate pe structuri anatomice diferite. Remodelarea are loc prin
activitatea succesivă a osteoclastelor şi osteoblastelor situate pe aceeaşi structură
anatomică a osului.
B. PROBLEMATICA ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRII
Progresele înregistrate în cunoaşterea structurilor funcŃionale ale compactei
şi spongioasei osului, prin utilizarea metodelor de imunohistochimie şi
histomorfometrie, obligă la redefinirea unor noŃiuni clasice pentru o mai bună
înŃelegere a genezei şi diferenŃierii temporospaŃiale a unităŃilor morfofuncŃionale ale
osului şi pentru a răspunde la multiplele întrebări ce îşi caută răspunsul:
5
- există diferenŃe structurale şi morfogeneratoare între osteonul primar şi
osteonul secundar?;
- care sunt raporturile morfofuncŃionale stabilite în ontogeneză între
procesele de osificare, vasculogeneză şi osteonogeneză?;
- ce criterii folosim pentru definiŃia morfofuncŃională a osului?;
- ce este o „suprafaŃă osoasă” şi cum participă ea la geneza, modelarea şi
remodelarea osului?;
- care este semnificaŃia microtopografică a lamelelor osteonului şi a
lacunelor osteocitare?;
- ce este osteoclastul; când, unde şi cum intervine în geneza, modelarea şi
remodelarea osului?;
- ce reprezintă, în fapt, aşa zisul „proces de remodelare a osului”?;
- procesul genezei şi diferenŃierii „Ńesutului osos” este un proces finit în
timp şi spaŃiu sau are loc permanent în dinamica ontogenezei?;
- de ce grupăm oasele după criteriul genezei lor în „oase diferenŃiate prin
osificare endoconjunctivă” şi în „oase diferenŃiate prin osificare
endocondrală” atâta timp cât Ńesutul conjunctiv embrionar
(„mezenchimul”) este multipotent în geneza structurilor osului?;
- Care este factorul comun al genezei şi dezvoltării oaselor în ontogeneză,
indiferent de tipurile de osificare primară şi secundară sau
endoconjunctivă şi endocondrală?;
- Când, cum şi cine determină geneza şi evoluŃia formei oaselor?;
- Se poate vorbi de o moarte programată a osteonului în condiŃiile
ortologiei?;
- Se pot cuantifica: rezorbŃia osteoclastică, apoziŃia osteoblastică şi viteza
de mineralizare a structurilor osului?;
- Cum putem evalua intensitatea remanierilor osului?;
În desfăşurarea cercetărilor noastre am luat în considerare următoarele
obiective:
1. Analiza raporturilor între sistemele lamelare ale osului;
2. Analiza microanatomică a hotarelor osteonale şi semnificaŃia lor în
evaluarea genezei şi evoluŃiei osteoanelor;
6
3. ContribuŃia elementelor neurovasculare în dezvoltarea structurilor
funcŃionale ale osului.
4. Analiza morfologiei şi evaluarea celulelor osteoprogenitoare diferenŃiate
din celule Stem provenite din măduva osoasă
II. MATERIALE ŞI METODE
A. MATERIALE STUDIATE
Pentru studiul microanatomic am utilizat fragmente de os recoltate din
diafiza corticalei tibiale de la cadavre de adult (15 cazuri) şi făt (7 cazuri) la Catedra
de Anatomia Omului a UniversităŃii de Medicină şi Farmacie din Craiova.
Studiul morfologiei si caracteristilor fenotipice ale celulelor
osteoprogenitoare diferenŃiate din celule Stem a reprezentat o etapă intermediară a
proiectului de cercetare CEEX intitulat „Mecanisme moleculare ale adeziunii
osteoblastelor diferentiate din celule stem si a explantelor de tesut osos la
biomateriale ortopedice” condus de Petrescu Ştefana la Institutul de Biochimie
Bucureşti, la care am fost participant din partea UniversităŃii de Medicină şi
Farmacie din Craiova. Prelevarea măduvei osoase a fost posibilă în cursul unor
intervenŃii chirurgicale ortopedice: artroplastia totală sau parŃială a articulaŃiei
coxofemurale şi artroplastia articulaŃiei genunchiului, în cursul cărora se pot recolta
capul şi colul femural în întregime, respectiv fragmente osoase plane din suprafeŃele
articulare femurală şi tibială ale articulaŃiei genunchiului; osteosinteza
centromedulară pentru fracturi de tibie sau pertrohanteriene etc.; ne-am îndreptat
atenŃia asupra artroplastiei articulaŃiei coxofemurale.
B. METODE UTILIZATE
1. Recoltarea Ńesutului şi fixarea
Fixarea este procesul chimic sau fizic prin care secŃiunile de Ńesut pot fi
vizualizate într-o manieră foarte apropiată de Ńesutul in vivo. Procedeele de fixare
7
histologică au derivat din multe alte domenii, cum ar fi industria de prelucrare a
pielii. Fixarea este singurul factor cel mai important în obŃinerea unei secŃiuni
adecvate examinării în microscopia fotonică. Procedeele de fixare trebuiesc
standardizate pentru a putea permite detectarea unor schimbări microanatomice
foarte fine prin simpla comparare a secŃiunilor fixate în mod similar. Când Ńesutul
este prelevat de la organismul gazdă, un bun fixator stopează autoliza (dizolvarea
celulelor prin digestia enzimatică intracelulară) şi putrefacŃia (distrugerea Ńesutului
sub acŃiunea bacteriilor) prin inactivarea enzimelor şi bacteriilor. Protejează
deasemenea Ńesutul de contractare şi umflare excesivă, şi nu dizolvă sau
distorsionează Ńesutul. AgenŃii de deshidratare şi clarificare pot distorsiona Ńesutul,
astfel că agentul de fixare ales, va proteja constituenŃii celulari, astfel ca ei să nu fie
alteraŃi sub acŃiunea acestor substanŃe chimice. Fixatorul trebuie deasemenea să
protejeze Ńesutul în cursul procesului de includere, ce presupune impregnarea
polimerului la o temperatură înaltă. Şi în fine, fixatorul trebuie să protejeze Ńesutul în
timpul secŃionării când există risc crescut de distrugere tisulară mecanică.
Înaintea recoltării, trebuiesc bine alese fixatorul, metodele de fixare,
substanŃele chimice, mediile de includere şi tehnicile de secŃionare.
a. Fixatori
Marea majoritate a tehnicilor medicale folosesc fixarea chimică în principal
dar adaugă şi fixarea fizică pentru a creşte rata fixării. Sunt mulŃi fixatori chimici,
fiecare cu avantajele şi dezavantajele sale. Fixatorii chimici încrucişaŃi (cum ar fi
formaldehida şi glutaraldehida) formează legături între proteine şi între proteine şi
acizii nucleici. Fixatorii chimici care deshidratează, cum ar fi etanolul, metanolul şi
acetona, îndepărtează apa liberă din Ńesuturi şi astfel precipită şi coagulează
proteinele. AlŃi fixatori chimici, cum ar fi acidul acetic şi acetatul de zinc, determină
modificări de ph sau de concentraŃie a sării şi astfel denaturează proteinele şi acizii
nucleici. AlŃi fixatori cum ar soluŃia alcoolică de formol, fixează prin metode de
deshidratare şi reacŃii încrucişate.
Multe tratate menŃionează etanolul 70% ca fiind fixatorul ideal pentru
păstrarea pe timp îndelungat a osului. Acesta nu înseamnă însă că mostra originală
este fixată iniŃial în această soluŃie. Alcoolul este rar folosit ca fixator iniŃial, şi
numai pentru anumite aplicaŃii histologice; de exemplu, alcool 70% este excelent
8
pentru fixarea frotiurilor citologice, exudatelor, şi aspiratelor cu ac fin. Osul trebuie
adecvat fixat în NBF sau în alt fixator şi apoi stocat în etanol 70%. Stocarea în
etanol se foloseşte pentru eliminarea efectelor decalcificării, ce apar frecvent în
urma depozitării prelungite în fixatori pe bază de formol.
Fixarea chimică poate fi îmbunătăŃită prin fixarea fizică, cum ar fi căldura.
Fixarea prin căldură se foloseşte pentru a precipita proteinele, făcându-le mai puŃin
solubile în apă. Căldura se foloseşte în general petru a accelera fixarea şi nu ca
metodă singulară. Difuziunea moleculelor creşte cu creşterea temperaturii, astfel că
penetrarea Ńesutului de un fixator creşte cu creşterea temperaturii.
Se cunoaşte faptul că anumiŃi aditivi (sucroza, dextran, detergent, calciu
clorat, tiocianat de potasiu, sulfat de amoniu) pot îmbunătăŃi fixarea în anumite
cazuri. Aceşti aditivi inhibă denaturarea prin reacŃia cu proteinele, fixatorul sau
componentele celulare.
ConcentraŃiile fixatorilor sunt deasemenea foarte importante. Acesta va fi
determinată de cost, solubilitate şi utilitate. De exemplu, o concentraŃie de formol
peste 10% determnă o duritate care nu este necesară, în timp ce etanolul cu o
concentraŃie sub 70% nu deshidratează satisfăcător. Osmolaritatea sau concentraŃia
ionică vor influenŃa deasemenea fixarea. SoluŃiile hipertone vor determina
deshidratare, în timp ce soluŃiile hipotone vor determina îmbibare. SoluŃiile
recomandate sunt cele uşor hipertone. Este esenŃial să se folosească o concentraŃie
ionică cât mai apropiată de valorile fiziologice.
b. Timpul de fixare
Este important de amintit că Ńesutul osos nedecalcificat este mult mai dens
decât Ńesutul moale, iar timpul de fixare trebuie ajustat corespunzător. Osul este un
material compus; o mostră poate conŃine os cortical, os trabecular şi măduvă osoasă.
De fapt, s-a demonstrat că timpul de fixare corespunzătoare a măduvei osoase, este
aproximativ acelaşi cu cel al Ńesutului moale normal. Pentru mostre ce conŃin os
trabecular şi măduvă osoasă, o regulă este penetrarea a 10 mm pe 24 ore la presiunea
normală şi temperatura camerei. O mostră cu os cortical va avea o rată a fixării mai
mică, estimată la aproximativ 2 mm pe 24 ore.
9
Câteva reguli generale ale utilizării oricărui fixator:
� Se folosesc cel puŃin 15-20 de volume de fixator pentru fiecare
volum de Ńesut;
� Nici un fixator nu va penetra mai mult de 2-3 mm de Ńesut solid sau
0,5 cm de Ńesut poros în 24 ore. Se lasă cel puŃin 1 săptămână pentru
fixarea adecvată a unui cub de 3-4 mm de Ńesut osos;
� Grosimea depinde de tipul Ńesutului, dar nici o mostră nu va fi mai
groasă de 4 mm pentru a permite o bună fixare; se preferă 3 mm;
� Se fixează la temperatura camerei dacă nu este specificat altfel.
Căldura va creşte rata fixării, dar va creşte deasemenea rata
autolizei. Creşterea temperaturii de la 25 la 37 grade Celsius poate
dubla rata fixării.
c. ColoraŃii utilizate
Multe coloraŃii sunt dependente de fixatori. Trebuie luat foarte bine în
considerare alegerea coloraŃiei şi a fixatorilor înainte de recoltare şi prelucrare.
Tabelul 4 arată o listă de diferite coloraŃii cu fixatorul recomandat fiecăruia şi
fixatorii ce trebuie evitaŃi.
2. Decalcificarea osului
Osul este unul dintre cele mai dure şi mai dense Ńesuturi. Pentru a obŃine
secŃiuni osoase acceptabile de 3-6 microni, se înconjoară şi infiltrează materialul cu
o substanŃă de o densitate relativ similară, creând astel o structură mai omogenă.
Pentru studiul mineralizării, se poate alege dintr-o gamă variată de răşini polimerice,
care formează un bloc compact cu duritate foarte apropiată de ce a osului. Deoarece
procedeul de includere la parafină este pe departe cea mai utilizată metodă
histologică de pregătire a secŃiunilor, au fost imaginate noi modalităŃi de prelucrare a
mostrelor de Ńesut osos pentru a face posibil studiul prin includere la parafină. În
consecinŃă, mostrele osoase trebuie să devină compatibile cu mediul de includere şi
cu aparatul de secŃionat utilizat. Deoarece parafina este semnificativ mai puŃin dură
decât majoritatea tipurilor de Ńesut osos, mostra osoasă trebuie tratată pentru a căpăta
aceeaşi duritate şi a permite secŃionarea. Acest tratament special poartă denumirea
de decalcificare.
10
CompoziŃia osoasă poate fi reprezentată de următoarea ecuaŃie:
Cristale de săruri anorganice (Calciu)+Matrix organic=Ńesut osos
O definiŃie simplificată ce provine atât din tratale clasice cât şi din articole
recente, descrie decalcificarea ca pe o îndepărtare a componentelor organice din
Ńesutul osos. În termeni mai tehnici, reprezintă disoluŃia complexului de
hidroxiapatită Ca10(PO4)6(OH)2 ce poate fi reprezentată de următoarea ecuaŃie:
Ca10(PO4)6(OH)2 + 8H+=10Ca+2+6HPO4
-2+2H2O
Odată cu îndepărtarea acestor săruri, procesul de decalcificare ajunge la
final. Punctul final al decalcificării este momentul în care întreg materialul
anorganic este îndepărtat din Ńesut, lăsând matrixul organic intact. Determinarea
precisă a acestui punct final al decalcificării este crucială pentru succesul tehnicilor
de colorare. Expunerea suplimentară la o soluŃie care este mai acidă decât matrixul
organic rămas, va determina după un anumit interval de timp extragerea
componentelor organice din Ńesut, în special din celule. Aceasta este o primă
legătură între colorarea slabă şi decalcificarea exagerată. Deoarece acizii mai
puternici decalcifică în timp mai scurt, există un risc crescut de decalcificare
exagerată, pentru că intervalul de timp în care procesul de decalcificare poate fi oprit
în vederea obŃinerii unor rezultate corecte, este mai scurt.
Există numeroase fluide decalcificatoare, după cum alegerea lor este
influenŃată de foarte mulŃi factori. ObŃinerea unei mostre osoase de o duritate
suficient de scăzută care să permită secŃionarea, nu este singurul deziderat.
Conceptul conform căruia decalcificare îndelungată este de preferat, nu se suprapune
peste conceptul de cea mai bună pregătire a Ńesutului osos în vederea colorării.
Calitatea colorării după decalcificare atât în protocoalele de rutină cât şi în cele
specializate, a devenit un factor de mare importanŃă în alegerea agentului de
decalcificare. Timpul adiŃional ca urmare a pasului decalcificării este adeseori
factorul major ce contribuie la obŃinerea unui Ńesut slab decalcificat. Literatura
prezintă numeroase protocoale de decalcificare cu tot atât de multe nivele de
complexitate şi acurateŃe. Principiile şi tehnica adecvată obŃinerii unor rezultate
conform cu scopul laboratorului în care se efectuează cercetările, derivă adesea din
experienŃă. AtenŃia la detalii şi aplicarea în practică a unor tehnici ce au dat
rezultate, sunt de mare folos în stabilirea unui protocol de decalcificare.
11
3. Deshidratarea, clarificarea, infiltrarea şi includerea în parafină
După tăiere, fixare şi decalcificare, mostrele trebuie complet deshidratate
pentru prelucrarea ulerioară ce include clarificarea, infiltrarea şi includerea în
parafină. Deoarece multe medii de includere nu sunt solubile cu apa, este necesară
îndepărtarea fixatorilor.
Cel mai comun agent de deshidratare utilizat este alcoolul (etanol). Prin
trecerea prin o serie de soluŃii de alcool de concentraŃii crescânde, ce variază de
obicei de la 70% la 95% sau chiar alcool absolut, se îndepărtează toată apa din
mostră. Mostrele trebuie să rămână în fiecare soluŃie de alcool până la saturarea
completă deoarece imersia bruscă în soluŃii de concentraŃii crescute de alcool poate
determina deshidratarea excesivă şi întărirea Ńesutului. Un protocol de deshidratare
este afişat în tabelul 5, aplicabil mostrelor osoase de aproximativ 3 mm grosime.
Se pot folosi deasemenea şi alŃi agenŃi de deshidratare, cum ar fi acetona şi
dioxanul (dietilen dioxid). Cu toate că ultimul agent de deshidratare, este solubilatât
în apă cât şi în parafină şi nu necesită aplicarea unui agent de clarificare, vaporii săi
sut extrem de toxici, şi nu permite o bună tăiere a secŃiunilor. Alcoolul şi alŃi agenŃi,
trebuie utilizaŃi întrr-un raport volumetric alcool:Ńesut, de cel puŃin 10:1. Pentru o
bună deshidratare, se recomandă agitarea.
Clarificarea este un proces prin care fluidul de deshidratare din mostră este
înlocuit cu o substanŃă care este miscibilă cu alcoolul şi cu mediul de includere.
Există mulŃi agenŃi de clarificare, dar cea mai mare parte a laboratoarelor se bazează
doar pe câŃiva, cum ar fi xilenul, toluenul sau benzenul. Fiecare agent de clarificare
are avantajele şi dezavantajele sale. Toluenul şi benzenul cauzează o întărire mai
mică decât xilenul. Xilenul este cel mai utilizat agent,dar trebuie amintit faptul că
xilenul are tendinŃa de a sfărâma majoritatea Ńesuturilor.
Parafina este disponibilă într-o gamă variată de puncte de topire ce variază
între 45 şi 60 de grade celsius şi în ultimii ani s-au folosit aditivi pentru a îmbunătăŃi
calităŃile de tăiere ale cerii, oferind astfel o adezivitate mai mare. Infiltrarea
mostrelor cu parafină înaintea includerii necesită câteva schimbări (în mod normal
infiltrare timp de 2 ore cu o schimbare de paraină proaspătă la o oră) de ceară
proaspătă în cuptor la 60 de grade C, până la îndepărtarea completă a agentului de
clarificare.
12
După infiltrare, mostra este inclusă prin imersia în parafină proaspă topită (la
5-10 grade C peste punctul său de topire) în mulaje de includere şi apoi răcită rapid
la aproximativ -5 grade C pe suprafaŃa rece a centrului de includere. Trebuie avut
grijă în asigurarea orientării corecte a suprafeŃei de tăiere, în interiorul blocului.
4. Metode de colorare a secŃiunilor obŃinute prin prelucrarea fragmentelor osoase
Pentru analiza histotopografică şi morfometrică a sistemelor lamelare
haversiene (osteoanelor) am utilizat secŃiuni seriate transversale prin corticala
diafizei tibiale de adult. Pentru studiul morfogenezei sistemelor lamelare s-au folosit
secŃiuni seriate longitudinale şi transversale prin osul tibia de făt.
Vizualizarea fasciculelor de lamele s-a realizat prin metode histochimice (van
Gieson, Gömöri, Mac Mannus), metode histofizice (lumină polarizată, contrast de
fază şi interferenŃială contrast), precum şi prin transformarea în 3D prin metoda
Emboss cu ajutorul soft-ului Lucia Net. Imaginile obŃinute cu microscopul de
cercetare Nikon Eclipse E-600 au fost achiziŃionate cu camera digitală DN100,
prelucrarea realizându-se cu ajutorul soft-ului licenŃiat Lucia Net.
Metode microanatomice şi histochimice utilizate în studiul sistemelor lamelare haversiene
Nr. crt.
Metoda Abrevieri Structura evidenŃiată Tipul de examinare
1. Hematoxilină-eozină
HE
Structura generală a Ńesuturilor
Microscopie fotonică
2. Picrofuxină Van Gieson
VG Fibre colagene Microscopie fotonică
3 Impregnare argentică Gomori
IAG Fibre de reticulină Microscopie fotonică
4 ReacŃie acid periodic Schiff
PAS Mucopolizaharide neutre Microscopie fotonică
13
A B
C D
Figura nr. 1. Metode de vizualizare utilizate în studiul anatomic al osului. SecŃiuni transversale prin fragmente de os (tibia) decalcificate, examinate în lumină directă (A, B), contrast de fază (C) şi lumină polarizată (D) pentru studiul formei, structurii şi topografiei sistemelor de lamele osteonice, lamele osoase circumferenŃiale şi lamele osoase interstiŃiale. Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN
100 ataşată microscopului fotonic de cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea
soft-ului Lucia Net. ColoraŃie PAS, Oc. 7, Ob: 4 (A); 10 (B, C) şi 20 (D). x28 (A), x70 (B, C), x140 (D).
14
5. Izolarea celulelor Stem mesenchimale din măduva osoasă
Izolarea celulelor stem mezenchimale a fost realizata avand ca sursa
biologica aspiratul de maduva osoasa umana de la pacienŃi cu artroplastie de şold.
Pentru izolarea celulelor stem mezenchimale (MSC) din aspirate de maduva osoasa
au fost testate trei metode diferite. Pe scurt, maduva osoasa a fost impartita in trei
fractii din care s-au izolat celule stem in mod diferit. Prima metoda a constat in
cultivarea masei celulare din maduva ca atare in mediu de cultura; a doua metoda a
presupus diluarea aspiratului osos cu solutie PBS, urmata de centrifugarea celulelor
si cultivarea sedimentului iar a treia metoda a constat in separarea suspensiei de
celule medulare pe ficol pentru o concentrare a celulelor mononucleare si separarea
lor de alte populatii celulare din proba prelevata.
Celulele au fost cultivate si pasate de doua ori pentru expansiune. La finalul
acestui interval au fost caracterizate prin citometrie in flux pentru evaluarea
fenotipului lor si dupa confirmarea acestuia au fost diferentiate in mediu osteogenic.
Pe parcursul diferentierii au fost prelevate probe la intervale de 1zi, 7 si 14 zile
pentru caracterizare cu ajutorul markerilor specifici.
Dupa 10 zile de la separarea MSC, s-a efectuat primul pasaj al acestora
pentru expansiune. La transferul celulelor s-a tinut cont ca acestea sa fie cultivate in
densitatea de 5000 de celule pe cm2. In figura 16 sunt prezentate celulele obtinute
prin fiecare din cele 3 metode.
a b c
Figura nr. 2: Celule stem mezenchimale obtinute prin a) cultivarea directa a
aspiratului de maduva osoasa, b) concentrarea celulelor din aspirat prin centrifugare
si c) separarea pe ficol a celulelor din maduva osoasa.
15
In urma utilizarii celor trei metode de separare am concluzionat ca separarea
pe ficol este cea care da randamentul cel mai bun din punct de vedere al numarului
de MSC izolate din aceeasi cantitate de maduva osoasa.
În concluzie, măduva osoasa prelevata de la pacienti a fost separata pe Ficoll
(Amersham) pentru izolarea fractiei care contine celule stem mezenchimale. Inelul
de celule obtinut a fost apoi cultivat in mediu αMEM (Sigma) suplimentat cu 15%
ser fetal bovin inactivat, 50 unitati/ml penicilina (Gibco), 50 mg/ml streptomicina
(Gibco), 1% L-glutamina (Gibco) si mentinute la 37oC in atmosfera cu 5% CO2.
Dupa 10 zile, celule stem mezenchimale aderate la suparafata vasului de cultura au
fost pasate pentru expansiune si cultivate in mediu αMEM suplimentat cu 10% ser
fetal in densitatea de 5000 de celule/cm2.
6. Imunofenotiparea celulelor Stem mesenchimale prin citometrie in flux
Caracterizarea fenotipului prin FACS. Dupa alte 10 zile de la primul pasaj
celulele au fost recoltate pentru expansiune (pasajul 2) iar o parte din ele au fost
retinute pentru imunofenotipare cu ajutorul citometrului in flux. Se cunosc o serie de
markeri de suprafata exprimati de celulele stem mezenchimale si care le diferentiaza
de celelalte populatii celulare din maduva osoasa. Desi inca nu exista un set de
markeri universal recunoscuti ca fiind exprimati specific numai de catre acestea,
majoritatea cercetatorilor considera CD14, 34, si 45 markeri negativi iar CD13, 29 si
90 ca markeri pozitivi pentru fenotipul caracteristic celulelor stem mezenchimale. Pe
acestia i-am folosit si noi impreuna cu un control negativ nemarcat cu anticorpi
cuplati cu fluorofori pentru a valida metoda de izolare utilizata, dupa cum se observa
in figura nr. 3.
16
Figura nr. 3: Imunofenotiparea celulelor stem mezenchimale aflate in pasajul 2 prin citometrie in flux. Dot plot-ul indica marimea (FCS) si structura (SSC) celulelor. Cu
verde este definit controlul negativ iar cu mov expresia fiecarui CD in parte.
Validarea fenotipului MSC prin citometrie in flux – tehnica de lucru.
Celulele au fost desprinse de pe suprafata vaselor de cultura, spalate in solutie
tampon pentru FACS (ser fetal 2% in PBS) si apoi marcate timp de 30 de minute la
4°C cu anticorpi anti-CD13, 14, 29, 34, 45, 90 conjugati cu ficoeritrina (PE).
Probele au fixate in PFA 1% 20 de minute, spalate si resuspendate in solutie tampon
pentru FACS. Suspensia celulara astfel obtinuta a fost analizata la citometrul in flux
FACSCalibur (BD Biosciences) urmarind parametrii FSC/SSC si fluorescenta pe
canalul FL2. Cu ajutorul portilor au fost excluse celulele moarte iar expresia
markerilor specifici a fost evaluata ca intensitate medie a fluorescentei cu ajutorul
soft-ului CellQuest Pro (Institutul de Biochimie Bucureşti). Au fost achizitionate
10000 de celule pentru fiecare proba.
Diferentierea celulelor stem mezenchimale pentru obtinerea osteoblastelor
– tehnica de lucru. Pentru obtinerea de osteoblaste celulele stem aflate in pasajul 2
au fost cultivate in mediu osteogenic constand in mediu complet αMEM la care s-a
adaugat factorii de diferentiere acid ascorbic 82µg/ml, dexametazona 100nM si beta-
glicerofosfat10mM.
17
7. Metode de caracterizare a celulelor osteoprogenitoare
Diferentierea si confirmarea fenotipului osteoblastelor cu markeri specifici –
principiul metodei. Celulele stem mezenchimale aflate in pasajul doi au fost utilizate
pentru obtinerea de osteoblaste prin diferentiere in mediu osteogenic. Dupa 28 de
zile de la cultivarea in mediu cu dexametazona celulele au fost testate pentru
activitatea fosfatazei alcaline, enzima exprimata la nivele crescute in osteoblaste si
mai slab in MSC. De asemenea, am testat formarea centrilor de mineralizare in
monostratul confluent celular. Experimentele au fost efectuate in paralel pe celule
stem mezenchimale, osteoblaste diferentiate si fibroblaste dermale drept control
negativ, intrucat acestea nu apartin aceluiasi lineaj celular ca celulele studiate.
Pentru evidentierea fosfatazei alcaline active s-a folosit NBT-BCIP, substrat
specific al enzimei, care da o reactie de culoare. Astfel, celulele ce exprima ALP
activa se coloreaza in mov inchis, dupa cum se observa in figura nr. 4. Celulele
diferentiate sunt colorate intens cu NBT-BCIP, MSC prezinta o expresie bazala a
ALP, iar fibroblastele dermale deloc.
a b c
Figura nr. 4: Evidentierea activitatii fosfatazei alcaline in osteoblaste obtinute prin
diferentierea celulelor stem. a) Fibroblaste dermale, b) MSC si c) osteoblaste
diferentiate de la MSC P2 au fost marcate cu NBT-BCIP.
Prin diferentierea MSC se obtine un monostrat confluent de celule cu
proprietati de mineralizare. Am testat acest comportament al celulelor diferentiate
prin colorare cu Alizarin Red S, un colorant ce leaga specific calciul din tesuturi.
Dupa cum se observa din figura nr. 5, acesta coloreaza in mod evident celulele
diferentiate in proportie mai mare decat celulele stem de la care s-a pornit, ceea ce
18
demonstreaza ca osteoblastele obtinute sunt capabile sa formeze o structura de tip
tesut osos mineralizat.
a b c
Figura nr. 5: Prezenta centrelor de mineralizare in osteoblastele diferentiate de la
celule stem mezenchimale. A) Fibroblaste dermale, b) MSC si c) osteoblaste
diferentiate de la MSC P2 au fost marcate cu Alizarin Red care recunoaste specific
ionii de Ca2+.
Vizualizarea celulelor s-a realizat cu ajutorul unui microscop Nikon Eclipse
TS100 iar fotografiile s-au facut cu un aparat Nikon Digital Light DS-SM la
Institutul de Biochimie din Bucureşti. Pozele au fost preluate cu ajutorul
programului LuciaNet si prelucrate cu ajutorul Adobe Photoshop 7.0.1.
În continuare, am efectuat teste de viabilitate celulara, morfologie si
adeziune a celulelor osteoprogenitoare ulterior atasarii acestora la materiale utilizate
în chirurgia ortopedică: filmelor de biosticla depuse pe titan prin PLD si a filmelor
de HA depuse pe cuart prin MS.
In urma acestor studii s-au pus in evidenta efectele diferite ale interactiei
celulelor osteoprogenitoare cu doua tipuri de materiale. Biosticla 6P61 depusa in
film subtire pe titan nu este compatibila cu o aderare optima a celulelor cu scaderea
concomitenta a viabilitatii lor. In schimb, hidroxiapatita depusa pe cuart s-a dovedit
a fi optima interactiei cu celulele diferentiate promovand aderarea acestora,
intinderea lor pe suprafata materialului si viabilitatea lor comparativa cu cea a
celulelor crescute pe suport standard.
Testarea probelor a presupus: autoclavarea probelor, determinarea viabilităŃii
celulelor prin citometrie în flux, analiza in microscopie electronică de baleiaj şi
testarea adeziunii.
19
Autoclavare: Probele se dispun in vase Petri de sticla, se impacheteaza in
hartie si se autoclaveaza (sterilizare umeda la 121.1oC timp de 30 minute) in
aparatul Falcon 30 Autoclave (LTE Scientific).
Determinarea viabilitatii celulelor prin citometrie in flux: Celulele au fost
desprinse de pe suprafata probelor cu 500 µL de tripsina (Gibco), la care apoi s-au
adaugat 500 µL de mediu. Probele au fost centrifugate la 2000rpm 5 minute la 4°C
si resuspendate in 200 µL de PBS. Suspensia celulara astfel obtinuta a fost analizata
la citometrul in flux FACSCalibur (BD Biosciences) urmarind parametrii FSC/SSC.
Cu ajutorul portilor au fost excluse celulele moarte iar procentul de celule viabile a
fost determinat cu soft-ul Cell Quest Pro. Au fost achizitionate 10000 de celule
pentru fiecare proba.
Microscopie electronica de baleiaj (SEM): Probele au fost incubate cu
suspensii de celule osteoprogenitoare timp de 1h in mediu cu Dex. Apoi au fost
fixate 20 de minute cu 4% PFA la temperatura camerei, spalate de 3 ori in solutie
PBS si deshidratate prin imersare de 2 ori cate 15 minute in etanol 70%, 90% si
100%. Probele au fost apoi uscate in aer si conservate la 4°C pana in momentul
metalizarii pentru analiza SEM.
Adeziune: Replici ale probelor preparate pentru analiza SEM au fost testate
prin microscopie de fluorescenta din punct de vedere al atasarii initiale a celulelor la
suport cu ajutorul markerilor de adeziune. Dupa o ora de la cultivarea cu celule
osteoprogenitoare, probele testate impreuna cu standardul au fost spalate cu PBS
pentru indepartarea celulelor ne atasate. Celulele osteoprogenitoare aderate au fost
fixate cu solutie de PFA 4% 20 de minute la temperatura camerei. Dupa fixare,
celulele au fost permeabilizate cu Triton-X-100 0,2% 3 minute si apoi marcate cu
anticorpi primari anti-vinculina 30 de minute. Dupa indepartarea excesului de
anticorpi necuplati la moleculele de adeziune, celulele au fost incubate cu o solutie
continand anticorpul secundar conjugat cu AlexaFluor 488 si faloidina conjugata cu
Alexa Fluor 594 care leaga specific filamentele de actina. Dupa 20 de minute
celulele au fost spalate si apoi montate pe lame de fluorescenta pentru vizualizare la
microscop. Vizualizarea celulelor s-a realizat cu ajutorul unui microscop Nikon
Eclipse E600W iar fotografiile s-au facut cu un aparat Nikon Digital Light DS-SM.
20
Pozele au fost preluate cu ajutorul programului LuciaNet si prelucrate cu ajutorul
Adobe Photoshop 7.0.1.
III. REZULTATELE OBSERVAłIILOR PERSONALE
A. ANALIZA MICROANATOMICĂ A SISTEMELOR DE LAMELE
OSOASE
1. Analiza microanatomică a raporturilor între sistemele lamelare ale
osului prin examinare în lumină polarizată
Din analiza secŃiunilor seriate transversale efectuate prin fragmente
decalcificate, din osul tibia, examinate în lumină polarizată am remarcat existenŃa a
trei zone microtopografice: o zonă cu lamele osoase circumferenŃiale interne, o zonă
cu lamele osoase interstiŃiale şi o zonă cu lamele osoase circumferenŃiale externe.
Toate zonele sunt presărate cu osteoni a căror abundenŃă este variabilă cu zona luată
în consideraŃie. Densitatea cea mai mare de osteoni a fost remarcată în zona
intermediară (Planşa nr. 1).
La examinarea cu obiectivele 4, 10 şi 20 am constatat heterogenitate a formei
şi structurii osteoanelor determinată de variabilitatea distribuŃiei spaŃiale a
fasciculelor de lamele osoase şi osteonale (Planşele nr. 2-14):
- gruparea osteoanelor în perechi solidarizate prin „lamele osoase
interstiŃiale” (Planşele nr. 2; 4; 10, B);
- canalul central al osteoanelor diferă de la un osteon la altul prin forma şi
dimensiunile sale (Planşele nr. 3, A şi B; Figura nr. 4 A);
- lamelele osteonice descriu pe alocuri elipse deschise la una din
extremităŃi prin care canalul central comunică cu spaŃii cilindrice
limitrofe (Planşa nr. 4, A) sau cu canale centrale ale osteoanelor
învecinate (Planşele nr. 4 şi 6);
- participarea lamelelor osoase interstiŃiale la organizarea de unităŃi
structurale semilunare care contribuie la delimitarea de canale centrale
ale unor sisteme haversiene (Planşele nr. 4, A; 7, A; 13, A);
21
- existenŃa unor raporturi de continuitate între lamele osoase interstiŃiale şi
lamelele osteonale (Planşele nr. 4, B; 7, A; 9, B);
- identificarea de triplete osteonale care pe alocuri comunică cu un canal
perforant Volkman (Planşele nr. 5, A; 7, 8);
- prezenŃa de perechi osteonale pe traiectul fasciculelor de lamele
osteonale cicumferenŃiale interne (Planşele nr. 1, 6, 8);
- raporturi tangenŃiale sau secante ale lamelelor osteonale care adesea sunt
prezente pe plane diferite (Planşele nr. 7, A; 9, 10);
- participarea lamelelor osoase interstiŃiale la realizarea raporturilor de
contiguitate şi de continuitate între osteonii grupaŃi în dublete sau
triplete (Planşele nr. 9, 10);
- neoformare de osteoni în compacta osului în cadrul procesului de
remodelare a osului matur (Planşa nr. 11);
- distribuŃia biplanară a lamelelor osteonale cu realizarea imaginii de
pâlnie în osul remodelat (Planşele nr. 13, A, B; 14, A, B).
2. Analiza microanatomică a hotarelor osteonale
Examinarea în lumină polarizată a secŃiunilor prin osul decalcificat ne
permite doar intuirea hotarelor osteoanelor fără a oferi limita de certitudine a
circumferinŃei unui osteon (Planşa nr. 15, A). Prelucrarea acestor secŃiuni prin
metode histochimice – PAS, Gomori şi Van Gieson – oferă rigurozitatea vizualizării
graniŃelor osteonilor (Planşele nr. 15, B; 16, 17). Această graniŃă a fost nominalizată
ca „linea cementalis”. Pe secŃiunile de impregnare argentică Gomori linea
cementalis apare vizibilă ca un spaŃiu clar la periferia osteoanelor (Planşa nr. 15, B).
Examinarea secŃiunilor seriate colorate prin metoda PAS ne-a permis identificarea în
„spaŃiul clar” periosteonal (linea cementalis) a glicozaminoglicanilor prin tratare cu
Acid Periodic Schiff (PAS) (Planşa nr. 17, A, B).
Certitudinea graniŃei osteonului (linea cementalis) ca reper folosit în
determinările de morfometrie este oferită de examinarea secŃiunilor în lumină
interferenŃială sau transformarea imaginilor standard în sistemul 3D prin metoda
EMBOSS (Planşa nr. 18, B). Aceste aspecte pot fi evidenŃiate atât pentru osteonii
din compacta osului cât şi osteonii din spongioasa osului (Planşa nr. 19, A, B).
22
3. Analiza microanatomică a genezei osteoanelor în cadrul procesului de
remaniere a osului matur
În continuarea cercetării am analizat, pe secŃiunile transversale seriate,
microanatomia topografică a structurilor nou apărute în teritoriile osteonale şi/sau
interosteonale a căror evaluare ne-a determinat să le considerăm ca efecte ale
procesului de remaniere a osului matur.
Analiza comparativă a secŃiunilor colorate cu Hematoxilină Eosină, PAS,
impregnare argentică Gomori şi examinate în contrast de fază, lumină polarizată sau
prin transformarea în 3D prin metoda Emboss am remarcat următoarele aspecte:
- variabilitatea diametrelor canalelor centrale osteonale (Planşele nr. 21,
A, B; 23, B; 26, A, B; 28, A, B – 30, A, B; 32, A, B; 33, A, B);
- modificări ale formei şi structurii circumferinŃei canalului central prin
apariŃia unor elemente de remodelare şi geneză a unui nou osteon –
„linia de rezorbŃie”; o zonă de Ńesut osos în curs de mineralizare şi a unui
lizereu preosos (Planşele nr. 21, A şi 22, A, B); la examinarea cu
obiectivul 10 se remarcă conservarea hotarelor osteonului, supus
procesului de remodelare, prin prezenŃa intactă a „liniei cementalis”
(Planşele nr. 21, A; 22, A, B); la examinarea cu obiectivele 20 şi 40 am
identificat elementele care participă la construirea unui nou osteon în
cadrul proceselor de remaniere – remodelare, localizat la periferia
sistemului haversian secundar (Planşele nr. 22, B; 24, A, B) sau în zona
pericentrală (Planşa nr. 23, A, B); pe secŃiunile de impregnare argentică
se remarcă ondularea pronunŃată a „liniei cementalis” a osteonului
secundar şi existenŃa „liniei de rezorbŃie” sub forma unui spaŃiu clar,
circumferenŃial (Planşele nr. 24, A, B şi 25, A; 27, A, B; 28, A; 29); la
examinarea acestor secŃiuni în lumină polarizată apar fascicule colagene
slab birefringente central faŃă de „linia de rezorbŃie” şi fascicule de fibre
colagene centrifug faŃă de această linie (Planşa nr. 25, B).
- „linia de rezorbŃie” devine mai evidentă prin transformarea în 3D prin
metoda Emboss a secŃiunilor standard (Planşele nr. 26, B; 28, B);
- intersecŃii ale două sau trei sisteme haversiene (Planşele nr. 30 şi 31);
23
- reuniuni ale osteonilor în dublete, triplete sau qvadruplete (Planşa nr.
32, A, B);
- osteoni diferenŃiaŃi în plin perete al osteonului secundar (Planşa nr. 33,
A, B);
- orientarea biplanară a osteonilor (Planşa nr. 34, A, B).
4. Analiza genezei corelative a sistemului osteonovascular
Studiul secŃiunilor transversale şi longitudinale prin osul tibia de făt (8 luni
de viaŃă antepartum) ne-a permis observarea şi consemnarea următoarelor aspecte
anatomodescriptive şi topografice:
- neovasculogeneză asociată cu diferenŃierea fasciculelor colagene cu
distribuŃie perivasculară (Planşa nr. 35, C, D);
- săparea de tunele conoide orientate cu baza înspre periost (Planşa nr.
35, A, B);
- trasee longitudinale ale structurilor vasculare (Planşa nr. 36, A, B);
- diferenŃierea centripetă a fasciculelor colagene din structura peretelui
osteonului (Planşa nr. 37, A, B).
B. ANALIZA MORFOLOGICĂ, FUNCłIONALĂ ŞI FENOTIPICĂ A
CELULELOR OSTEOPROGENITOARE DIFERENłIATE DIN CELULE
STEM MESENCHIMALE EXTRASE DIN ASPIRATUL DE MADUVĂ
OSOASĂ
1. Diferentierea celulelor Stem mesenchimale la osteoblaste primare in
vitro si evaluarea markerilor moleculari specifici ai acestora
Într-o primă etapă am evalulat diferentierea celulelor Stem mesenchimale
(MSC) la osteoblaste primare in vitro, conform protocolului pus la punct in cadrul
proiectului de cercetare efectuat in colaborare cu Institutul de Biochimie din
Bucureşti si am investigat markerii moleculari specifici ai acestora: fosfataza
alcalina, colagen, BSP, osteocalcina, osteonectina, CD29.
Markerul definitoriu al lineajului osteoblastic este activitatea fosfatazei
alcaline. Aceasta poate fi testata prin mai multe metode dar noi am ales-o pe cea
prezentată la capitolul Materiale şi Metode. Astfel, dupa cultivarea celulelor osoase
pe suprafata biomaterialelor, am fixat preparatele si le-am incubat cu o solutie de
24
substrat al fosfatazei alcaline ELF 97 care devine fluorescent dupa activitatea de
clivare a gruparii fosfat a enzimei.
CTRL HATi HAQ
Figura nr. 6: Activitatea fosfatazei alcaline exprimate de celule osoase
dupa cultivarea pe suprafata materialelor testate versus standard
Osteoblastele sunt celule care secreta colagen de tip I si exprima proteine
ca osteocalcina, osteonectina, osteopontina, si BSP (bone sialoprotein). In cadrul
studiului nostru am testat expresia si localizarea unora dintre acestea in osteoblastele
primare diferentiate din MSC (figura nr. 7).
Figura nr. 7: Testarea expresiei markerilor lineajului osteoblastic prin
imunofluorescenta
Dupa cum se observa in figura de mai sus, osteoblastele obtinute in vitro
exprima osteocalcina, proteina din matricea extracelulara care are proprietatea de a
lega calciul si a participa la formarea matricei mineralizate. De asemenea, ele
exprima si osteonectina si sialoproteina osoasa cu localizarea preponderent
intracitoplasmatica. Aceste experimente demonstreaza ca celulele osoase obtinute
sunt functionale si au fenotipul asteptat.
OC BSP ON
25
Formarea de tesut osos mineralizat a fost observata in vasul de cultura dupa
diferentierea timp de o luna a celulelor si dupa atingerea confluentei totale a
monostratului celular.
2. Efectuarea de co-culturi celule stem-osteoblaste diferentiate (MSC:OB)
Intr-o a doua etapă am efectuat co-culturi celule stem-osteoblaste diferentiate
(MSC:OB) pentru a determina raportul optim de cultivare in scopul acoperirii
suprafetelor biomaterialelor, proliferarii celulare intr-un timp potrivit utilizarii lor in
clinica
Pentru folosirea biomaterialelor in clinica in aplicatii de implantologie, una
din variantele de terapie pe care le consideram, este acoperirea in prealabil a
suprafetei implantului cu celule stem sau celule osoase autologe obtinute in vitro de
la acestea. Se stie faptul ca celulele stem mezenchimale sunt de asemenea precursori
ai altor tipuri celulare decat osteoblastul. Ele se pot diferentia si in condrocite,
adipocite dar s-a observat si o transdiferentiere la celule neuronale sau hepatice care
sunt inca sub investigare. De asemenea, se stie ca celulele stem au un potential
proliferativ mai mare decat celulele diferentiate ele permitand obtinerea in timp util
a unei suprafete active a implantului potrivita interventiei chirurgicale. Aceste doua
premise si nu numai ne-au determinat sa alegem alternativa co-culturii celule stem-
osteoblaste primare.
Am ales sa marcam fluorescent diferit cele doua populatii celulare inainte
de a le insamanta pe suprafata materialelor. Pentru o astfel de abordare a trebuit sa
testam mai intai rezistenta emisiei fluorescente in timp. Am marcat celulele stem cu
Vybrant DiO care emite lumina fluorescenta verde si celulele diferentiate cu
Vybrant DiI care emite lumina fluorescenta rosie. Dupa marcarea celulelor in
suspensie acestea au fost insamantate in raport egal pe material standard si urmarite
timp de doua saptamani pentru a observa modificarea fluorescentei si distributia
celulelor.
Prima observatie a fost ca acesti coloranti pot fi utilizati pentru cultivarea
celulelor pe termen lung, ei ajutand la identificarea celulelor stem si a osteoblastelor
dupa amestecarea lor in raport egal. Astfel se poate urmari proliferarea celulara
26
(creste numarul celulelor de o anumita culoare), distributia celulelor pe suprafata
(uniforma sau in anumite zona) si formarea de agregate de celule de un anumit tip
(aglomerari de celule care emit aceeasi fluorescenta). Osteoblastul si celula stem
adulta s-au apropiat la nivelul membranelor plasmatice unde cei doi coloranti
colocalizeaza (formeaza culoarea galbena). Acest fapt se poate explica in doua
moduri: fie celulele ale caror membrane au fost colorate diferit tind sa faca schimb
de portiuni de membrana la zona de tangenta dintre ele; fie suntem martorii unui
fenomen de fuziune celulara in care cele doua celule se unesc formand o celula
hibrid.
Figura nr. 8: Co-cultura MSC:OB in raporturile de 1:2, 2:1 si 3:1 timp de 7 zile
Pentru a identifica raportul optim de cultivare a celulelor stem si a celulelor
diferentiate am testat mai multe variante: celule stem-osteoblaste 1:2, 2:1 si 3:1.
Co-cultura MSC:OB 7 zile
12.3
38.1
32.94.2
6.3
3.9
2
5.7
6.7
0
10
20
30
40
50
60
1:2 2:1 3:1
Raporturi de insamantare MSC:OB
Numar de celule/camp 10X
Fuzionate
OB
MSC
27
Toate variantele au fost analizate in duplicat pentru ca rezultatele sa fie
semnificative statistic. Dupa sapte zile de la marcare si cultivare celulele au fost
observate la microscop, s-au pozat cinci cadre la fiecare raport, in duplicat. Au fost
numarate celulele stem, osteoblastele si cele marcate in ambele culori („fuzionate”).
Rezultatele sunt prezentate ca medie aritmetica in diagrama de mai sus si poze
reprezentative pentru fiecare tip de cultura au fost asociate.
Am constatat ca o proportie mai mare de celule stem asigura o proliferarea
mai buna a celulelor pe suprafata. De asemenea, numarul de celule fuzionate creste
odata cu cresterea numarului de celule stem insamantate ceea ce inseamna ca acestea
sunt responsabile de posibila fuziune spontana sau schimb de membrane intre cele
doua tipuri celulare. Dar proliferarea nu mai creste deoarece suprafata avuta la
dispozitie este mai mica. Astfel, considerente aratate mai sus au dus la alegerea
raportului de 2:1 celule stem: celule diferentiate pentru cultivarea tuturor probelor
din loturile avute in studiu.
3. Cultivarea MSC:OB şi investigarea proliferării acestora, morfologiei,
markerilor de diferentiere ai osteoblastelor si expresiei proteinelor din complexul
de adeziune
Am trecut la cultivarea celulelor MSC:OB in raportul optim de 2:1 pe
suprafata materialelor in prezenta de factori de diferentiere (dex) pentru a investiga
proliferarea acestora, morfologia, markerii de diferentiere ai osteoblastelor si
expresia proteinelor din complexul de adeziune. Am marcat celulele fluorescent, le-
am insamantat pe suprafata biomaterialelor si standardului si am oprit cultura la 1 zi,
4 si 7 zile pentru a evalua morfologia şi interactia celulelor cu materialul dar si
adeziunea cu ajutorul faloidinei, pe care am adagat-o dupa fixarea celulelor.
Astfel, in prima zi de la cultivare, celulele au preponderent forma rotunda
sustinuta de distributia radiala si in cercuri concentrice a filamentelor de actina ale
citoscheletului. Markerii fluorescenti DiO si DiI se pot observa atat la periferia
celulei dar si in traficul lor spre zona perinucleara, unde se vor localiza la intervalele
urmatoare de timp. Spre deosebire de proba control, hidroxiapatita determina
generarea de dendrite lungi multiple care pornesc in explorarea micromediului
inconjurator. In timp ce pe HAQ acestea sunt mai scurte si dense, HA depusa PLD
28
determina aparitia unor prelungiri foarte lungi ce persista pe termen lung si pot fi
observate si la 7 zile. La 4 zile se observa ca celulele stem (verzi) capata morfologia
fusiforma caracteristica iar osteoblastele (rosii) au forma poligonala. Interactia dintre
acestea este evidenta de la 4 zile, ducand uneori la fuziune/colocalizare de markeri
membranari.
In cazul probelor PLD se observa la 7 zile ca fibrele de actina nu au o
distributie perfect ordonata paralela dar sustin adeziunea celulara si dezvoltarea
dendritelor lungi. In schimb, in cazul standardului si pobelor HAQ, actina este foarte
bine definita si filamentele paralele traverseaza celula de-a lungul axei principale si
participa la intinderea celulelor pe supafata substratului.
Atat markerii moleculari de diferentiere ai osteoblastelor cat si proteinele
din complexul de adeziune au fost investigati la sapte zile de la cultivare. In aceste
doua cazuri celulele au fost cultivate nemarcate pentru a putea adauga anticorpi
fluorescenti dupa oprirea cultivarii. S-au testat markerii osteoblastici colagen I,
osteocalcina, BSP si osteonectina.
Experimentele de imunofluorescenta prezentate mai jos au demonstrat ca
osteoblastele diferentiate in vitro exprima markerii caracteristici lineajului osos cand
sunt cultivate pe HA ca si pe substrat standard. In plus a fost investigata si expresia
proteinei nucleare Ki67 care indica celulele proliferante la momentul analizarii
celulelor. Osteocalcina este secretata masiv de celulele osoase si ea se poate observa
atat intracelular dar mai ales in jurul celulelor unde participa la formarea matricei
osoase mineralizate.
Colagenul de tip I poate fi observat intracelular in timpul traficului sau spre
membrana celulara unde formeaza fibre ale matricei extracelulare. Proteina BSP are
o localizare perinucleara iar osteonectina apare in toata citoplasma si prelungirile
dendritice ale membranei.
29
1zi 4 zile 7 zile
Ctrl
HAQ
HATi
Figura nr. 9: Imagini de microscopie de fluorescenta a osteoblastelor
diferentiate din celule stem la pasajul 2 pe HA.
30
BSP OC DAPI
COL I Ki67 DAPI
ON
Figura nr. 10: Imagini de microscopie de fluorescenta a osteoblastelor
diferentiate pe material standard care evidentiaza expresia markerilor osteocalcina,
BSP, osteonectina si colagen tip I la sapte zile dupa cultivare
In cazul materialului standard se poate observa expresia tuturor markerilor
testati si se poate vedea activitatea proliferativa a uneia din cele sase celule din
imaginea suprapusa de la figura 24 ColagenI/Ki67. Nucleul celulelor a fost colorat
cu DAPI. Hidroxiapatita depusa prin PLD sau MS este autofluorescenta ceea ce
ingreuneaza punerea in evidenta a expresiei markerilor si localizarea acestora.
Cu toate acestea pentru HA depusa PLD am putut pune in evidenta expresia
colagenului si a osteonectinei dar pe fundalul granulelor autofluorescente de
material. De asemenea, se poate observa o activitate proliferativa crescuta cu
ajutorul markerului Ki67.
31
COL I Ki67 DAPI
ON
Figura nr. 11: Imagini de microscopie de fluorescenta a osteoblastelor
diferentiate pe HATi care evidentiaza expresia markerilor osteonectina si colagen tip
I la sapte zile dupa cultivare
BSP OC DAPI
ON
Figura nr. 12: Imagini de microscopie de fluorescenta a osteoblastelor
diferentiate pe HAQ care evidentiaza expresia markerilor osteocalcina, BSP si
osteonectina si la sapte zile dupa cultivare
32
Pentru probele HAQ s-a reusit evidentierea expresiei BSP, a osteocalcinei
si osteonectinei, dupa cum se observa in figura de mai sus. Acest experiment este
intarit de rezultatele obtinute pe celule marcate cu colorantii Vybrant si prezentat
mai sus, in care se evidentiaza activitatea fosfatazei alcaline pentru ambele tipuri de
depuneri. Mecanismul de adeziune al celulelor la HA a fost testat prin studierea
localizarii intracelulare a proteinelor din complexul de adeziune: filamente de actina,
vinculina, FAK si inegrina beta 1. Interactia osteoblastelor cu materialele testate s-a
studiat prin marcarea fluorescenta a celulelor pentru a pune in evidenta morfologia
filamentelor de actina si colocalizarea partiala a acestora cu moleculele din
complexul de adeziune in punctele de contact cu materialul.
A
B
C
Figura nr. 13 : Imagini de microscopie de fluorescenta a celulelor cultivate 7 zile pe
material standard: actina/CD29 (A), actina/FAK (B) si actina/vinculina (C).
Dupa cum se observa in figura de mai sus, pe substratul standard actina este
organizata in filamentele dispuse paralel sau radial pornind din zona perinucleara
33
spre periferie pentru a sustine prelungirile membranei plasmatice (filopodiile). Ea
colocalizeaza partial in zona submembranara cu integrina beta 1/CD29, vinculina si
FAK. In cazul probelor depuse prin PLD, integrina beta 1 si vinculina continua sa
colocalizeze partial cu capetele periferice ale filamentelor de actina, dupa cum s-a
observat si in experimentele efectuate pana in prezent in cadrul proiectului. Insa
integrina apare punctat si in alte zone in citoplasma si nu numai ca terminatie a
actinei. Ea mai este observata si la nivelul lamelipodiilor unde se localizeaza
preponderent tot ca structuri punctiforme. De asemenea, FAK are o expresie scazuta
si se mentine in zona perinucleara dar si in filopodii, in zonele de maxima adeziune
celulara. Acest lucru poate afecta stabilitatea pe termen lung a interactiei celule
osoase-HA. In schimb, vinculina are o expresie crescuta si apare ca linii ingrosate la
periferia celulelor, chiar si a celor aflate in adeziune, care au forma rotunjita.
Aceasta ar putea compensa semnalul slab primit prin intermediul integrinelor care ar
putea fi ameliorat prin acoperirea materialului cu proteine din matricea extracelulara.
A
B
C
Figura nr. 14: Imagini de microscopie de fluorescenta a celulelor cultivate 7 zile pe
HA-Ti (PLD): actina/CD29 (A), actina/FAK (B) si actina/vinculina (C).
34
Celulele crescute pe suprafata probelor HAQ prezinta localizari
intracelulare ale proteinelor din complexul de adeziune comparative cu cele
observate pe standard. In cazul acesta apar dendrite celulare lungi in care se
localizeaza preponderent FAK. Filamnetele de actina sunt foarte bine definite si
strabat citoplasma de-a lungul axului central celular colocalizand la periferie cu
integrina, vinculina si FAK.
A
B
C
Figura nr. 15: Imagini de microscopie de fluorescenta a celulelor cultivate 7 zile pe
HAQ (MS): actina/CD29 (A), actina/FAK (B) si actina/vinculina (C).
Deci, din punct de vedere al mecanismului de adeziune, putem concluziona
ca nu depinde atat de structura chimica a substratului (hidroxiapatita) ci mai degraba
de nanostructura filmului rezultat care poate sa stimuleze variat integrinele,
proteinele membranare ce fac legatura cu actina si influenteaza adeziunea, migrarea,
proliferarea si diferentierea celulara. Daca in cazul HA depusa prin MS, celulele
secreta o matrice extracelulara bogata ce transmite mai departe semnale integrinelor
35
si FAK de la periferia celulei, HA depusa prin PLD induce o adeziune celulara
bazata pe interactia puternica a vinculinei cu actina care o activeaza pe cea din urma
sa polimerizeze pentru formarea citoscheletului celular. Aceasta explica probabil si
morfologia bogata in filopodii lungi observata la HATi. Semnalele provenite de la
integrine sunt mai slabe, fapt datorat probebil lipsei interactiilor integrina-integrina
induse de obicei de legarea la matricea extracelulara.
IV. DISCUłIA OBSERVAłIILOR PERSONALE
Organizarea Ńesutului osos haversian ca mijloc de adaptare funcŃională. După
Gebhardt, 1906, fiecare lamelă a osteonului conŃine fibrile de colagen paralele,
dispuse helicoidal în jurul canalului central, pe când în lamelele succesive,
dispozitivele helicoidale sunt orientate în sens contrar. Aceste dispoziŃii apar ca
adaptări la funcŃia de rezistenŃă a osului, Ńinând cont de faptul că fibrele de colagen
trebuie să reziste la tracŃiune, pe când osul trebuie să reziste la presiune. Fibrilele de
colagen sunt aşezate în sisteme spiralate alternând cu fibrilele care au o direcŃie
inversă în lamelele învecinate corectând defomarea fibrilelor la presiune
longitudinală.
O altă adaptare arhitectonică pentru a oferi rezistenŃă osului o constituie
osteoanele, care formează sisteme de tuburi cilindrice aşezate unul in altul (pentru ca
aceeaşi cantitate de material dispusă sub forma de tub este mai rezistentă decât dacă
ar fi dispusă in coloane, tubul suportând o greutate mai mare).
RepartiŃia osteoanelor şi orientarea lor constituie alte caracteristici ale
funcŃiei osului.
In osul compact numarul osteoanelor variaza intre 3-15 pe milimetru patrat,
pe cand in osul spongios sunt mai rare. Orientarea osteoanelor se face in directia
presiunii maxime suportate de os: astfel, in diafiza oaselor luni, ele sunt dispuse
longitudinal, iar in oasele plate sunt paralele cu suprafata osului, iar alteori pot
converge in directia unei proeminente osoase.
Studiile morfometrice au aratat ca in perioada de inceput a dezvoltarii
intrauterine, osul compact prezinta o densitate volumica mare de osteoni, cateva
36
lamele osoase si canale haversiene largi cu un volum si o densitate relativ ridicate si
o consistenta mica a osului intre canale. Mai tarziu in gestatie osul contine osteoni cu
multe lamele si cu densitate volumica relativ mica, canale Havers rare cu densitate
volumica scazuta si sisteme interhaversiene cu densitate mare (Baltadjiev G., 1995).
Unii autori (Petrtyl M., Hert J., Fiala P., 1996) au descris o organizare
spatiala a osului haversian. Osteonii sunt grupati in doua sisteme antirotatorii
helicoidale, de directii oblice opuse situate in peretii contralaterali ai diafizei. Cateva
argumente sustin ipoteza ca aceasta arhitectura speciala depinde de orientarea fortei
dominante. Modelul de studiu folosit a fost acel al unui tub cilindric, care a fost
supus unei combinatii de forte de incovoiere, de torsiune si compresiune. Sub
solicitarea combinata dintre momentul de indoire de la exterior spre interior si cu
momentul de torsiune in sensul rotarii externe, directia fortelor dominante
corespunde directiei osteonilor din diafiza. In ambele cazuri fortele dominante ca si
osteonii, au fost orientate in directii oblice opuse in peretii mediali si laterali ai
modelului si al osului. Intre cele doua campuri oblice exista o margine ascutita cu
organizare atipica a directiilor fortei dominante si a osteonilor. In osul atipic
(femurul din experiment) orientarea osteonilor era longitudinala (ca la un femur
nesolicitat) sau rotata la 90 de grade. Aceste observatii sustin ipoteza unei relatii
cauzale intre modul de solicitare si directia dominanta osteonala. Organizarea osului
haversian reprezinta un exemplu tipic de adaptare functionala.
Osteoclastul-celulă hematopoetică. Osul este terenul de manifestare a
genezei, creşterii şi diferenŃierii a două tipuri de structuri: osteoformatoare şi
hematoformatoare. Deşi numeroase studii au fost efectuate, în cadrul unor programe
de cercetare, asupra elementelor structurale ale osului şi/sau măduvei
hematoformatoarte, totuşi problema raporturilor dintre aceste structuri nu a constituit
o prioritate. Calea spre acest proiect a fost deschisă de cercetările asupra
osteoclastogenezei şi asupra cooperării între osteoblast şi osteoclast ca elemente cu
origini diferite: mezenchimală şi hematopoietică în procesul formării osului. Este
cunoscut faptul că osul se formează prin diferenŃierea Ńesutului mezenchimal
primitiv, fie direct prin transformare în structuri lamelare (formare
intramembranoasă) fie indirect printr-un stadiu intermediar de cartilaj (formare
endocondrală). O teorie interesantă a acestei dualităŃi în formarea osului a fost
37
elaborată de Holden (1882) şi preluată de Last (1973). Ei au sugerat că formarea
intramembranoasă conduce la diferenŃierea mai rapidă a osului în locurile unde este
nevoie de suport structural şi protecŃia unor sisteme (exemplu: oasele calvariei) sau
unde este nevoie de a asigura desfăşurarea unor funcŃii importante în momentul
naşterii (exemplu: mandibula pentru actul sucŃiunii şi coastele pentru dinamica
respiraŃiei) (Holden, 1882). Este încă neclar de ce anumite oase se formează
endocartilaginos iar altele intramembranos. Se pare că acest fenomen este fără
importanŃă de vreme ce rezultatul final este acelaşi.
Din analiza rezultatelor înregistrate de noi se impune discutarea raporturilor
dintre structurile osteo- şi hematoformatoare prin contribuŃia osteoblastului,
osteoclastului, limfocitelor B şi a procesului de angiogeneză la diferenŃierea
structurilor osului şi măduvei şi a raporturilor dintre ele.
Pentru remodelarea osoasă sunt necesare o serie de evenimente complexe şi
coordonate (Marcus 1987, Väänänen 1993). Osteoblastele, osteocitele şi
osteoclastele comunică una cu cealaltă în eleborarea unei balanŃe a rezorbŃiei şi
formării osoase.Sunt necesare acŃiuni bine-organizate ale osteoblastelor,
osteoclastelor şi osteocitelor. Această activiatate coordonată între celulele osoase
sugerează existenŃa unei comunicări intercelulare, dar mecanismul al acestei
comunicări nu a fost bine caracterizat. Comunicarea intercelulară poate să se
desfăşoare prin intermediul secreŃiei de factori solubili, contact direct celulo-celular,
direct prin moleculele de adeziune celulară sau metabolice şi cuplaj electric prin
joncŃiunile gap.
Cele mai multe celule comunică cu celulele de vecinătate prin moleculele
citosolice, aşa cum sunt ionii, mesagerii secundari şi metaboliŃii mici. Această
activitate este posibilă prin intermediul unui grup de canale intercelulare numite
joncŃiuni gap, care conectează celulele adiacente (Kumar et al. 1996). Astfel, în
afară de câteva celule diferenŃiate terminale, cum ar fi celulele musculare scheletale,
eritrocitele şi limfocitele circulante, cele mai multe celule în Ńesuturile normale în
general comunică prin intermediul joncŃiunilor gap. JoncŃiunile gap sunt regiuni
specializate ale membranei celulare, care conectează celulele şi furnizează canalele
intercelulare apoase pentru mişcarea bidirecŃională a moleculelor mici şi a ionilor
între celulele adiacente şi citoplasmă (Warner 1988). Fiecare por joncŃional gap este
38
format prin juxtapunerea a două hemicanale intercelulare între celulele învecinate,
care interacŃionează pe membranele plasmatice a două celule adiacente şi leagă
direct citoplasma unei celule cu cea a altei celule. Fiecare hemicanal este compus
dintr-un aranjament hexameric al proteinelor transmembranare numite conexine, o
familie multigenică înalt înrudită constând din cel puŃin 13 membrii (Beyer et al.
1990, Goodenough et al. 1996, Saez et al. 1993).
Canalele conexinice participă în reglarea semnalelor între dezvoltarea şi
diferenŃierea tipurilor celulare. Canalele gap-joncŃionale au o selectivitate aparentă
bazată în principal pe mărimea moleculară, permiŃând mişcări ale moleculelor mai
mici de 1000 Da, aşa cum este AMPc, dar prevenind mişcări ale proteinelor şi
acizilor nucleici. Moleculele informaŃionale mici, aşa cum sunt anumiŃi morfogeni
pot fi transmise direct între celule prin intermediul joncŃiunilor gap, ceea ce este
important în embriogeneză pentru reglarea evenimentelor dintre celule (Warner et
al. 1984).
Un număr de droguri s-a arătat că inhibă comunicările gap-joncŃionale cu
grade variate ale eficacităŃii şi specificităŃii. Acestea includ de exemplu anestezicile
volatile aşa cum este halotanul (Nedergaard), alcoolii cu lanŃuri-drepte heptanol şi
octanol (Donahue et al. 1995a, Nedergaard 1994), anandamide (Venance et al.
1995) şi acidul glycerrhetinic (Davidson et al. 1995). Deşi variate droguri au fost
folosite pentru blocarea comunicării gap-joncŃionale, specificitatea blocanŃilor
rămâne de rezolvat.
Celulele osoase mediază semnale cu fiecare alte celule direct prin
comunicările gap joncŃionale, care au fost găsite conectând osteoblastele dar în
acelaşi timp comunicări gap joncŃionale între osteoblaste şi celulele din apropiere
sau osteocyte .NutriŃia osteocitelor se face probabil peste joncŃiunile gap dintre
extensiile citoplasmatice ale osteocytelor vecine. Connexin-43 (Cx43) este
exprimată în mare măsură în diferite Ńesuturi, incluzând creierul, inima, rinichiul,
musculatura netedă, ovarul şi câteva epitelii iar mai recent se consideră cea mai
abundentă connexină (Cx45 şi Cx46 au fost identificate în oase, dar Cx43 este
proteina Pe celulele în contact, connexonii dintre celulele vecine pot forma
joncŃiunile gap în câteva minute sau chiar câteva secunde, sugerând că aceşti
connexoni pre-există în membrana plasmatică. Comunicările gap-joncŃionale ar fi
39
astfel o metodă excelentă pentru celulele osoase în propagarea rapidă a semnalelor
generate local peste tot în Ńesutul scheletal, aşa cum s-a arătat că se întâmplă în
osteoblaste (Civitelli et al. 1993). Mijlocul de comunicare este foarte important
pentru cuplajul corect al osteoclastelor şi osteoblastelor. Capacitatea de a schimba
moleculele nutritive şi reglatoare dintr-o celulă (sau dintr-un anumit tip de celulă) în
alta pretutindeni în mediul scheletic poate reprezenta un mijloc eficient de
coordonare a acŃiunii a unei varietăŃi de celule în complexul tisular.
V. CONCLUZII
1. Compacta osului are o structură heterogenă prin variabiltatea formei canalului
central şi a structurii peretelui osteonului;
2. Echilibrul morfologic al compactei osului este asigurat de activitatea
osteoclastelor şi osteoblastelor în cadrul unităŃii de remodelare. Dezechilibre în
acest sistem pot genera osteoporoză prin hiperactivitatea osteoclastelor,
osteopetroză prin hipoactivitatea osteoclastelor, boala Paget prin remodelare
excesivă şi în fine mielomul multiplu prin stimularea osteclastelor şi creşterea
rezorbŃiei osoase;
3. În lipsa unor markeri specifici pentru osteoclast considerăm că evaluarea
osteonilor în cadrul ciclurilor de remodelare se poate realiza prin utilizarea
metodelor clasice de examinare în lumină directă, lumină polarizată, contrast de
fază, câmp întunecat şi/sau transformarea acestor imagini prin metoda Emboss
în linii interferenŃiale;
4. Linea cementalis trebuie considerată ca hotarul osteonului matur aflat în repaus;
linia de rezorbŃie este o mărturie morfologică a începerii unui nou ciclu de
remodelare a osteonului matur şi de regeneză a unui nou osteon;
5. ObservaŃiile noastre au mari implicaŃii în studiile de biomecanică şi
biopatologie precum şi în expertiza medico-legală a fragmentelor de os.
6. Pentru folosirea biomaterialelor in clinica in aplicatii de implantologie, una din
variantele de terapie pe care le consideram, este acoperirea in prealabil a
suprafetei implantului cu celule stem sau celule osoase autologe obtinute in
vitro de la acestea, cea mai bună alternativă fiind însă efectuarea unei co-culturi
40
celule stem-osteoblaste primare. În urma analizei observaŃiilor noastre am
constatat că osteoblastul si celula stem adulta s-au apropiat la nivelul
membranelor plasmatice, acest fapt putând fi explicat în doua moduri: celulele
tind sa faca schimb de portiuni de membrana la zona de tangenta dintre ele, sau
suntem martorii unui fenomen de fuziune celulara in care cele doua celule se
unesc formand o celula hibrid.
7. Analizând morfologia culturilor celulare celule stem-osteoblaste primare am
constatat că o proportie mai mare de celule stem asigura o proliferarea mai buna
a celulelor pe suprafata; de asemenea, numarul de celule fuzionate creste odata
cu cresterea numarului de celule stem insamantate ceea ce inseamna ca acestea
sunt responsabile de posibila fuziune spontana sau schimb de membrane intre
cele doua tipuri celulare; dar proliferarea nu mai creste deoarece suprafata avuta
la dispozitie este mai mica, astfel că am considerat ca raportul optim de
cultivare este de 2:1 celule stem: celule diferentiate.
8. În prima zi de la cultivare, celulele din culturile celule stem-osteoblaste primare
au preponderent forma rotunda sustinuta de distributia radiala si in cercuri
concentrice a filamentelor de actina ale citoscheletului; substratul de
hidroxiapatita determina generarea de dendrite lungi multiple care pornesc in
explorarea micromediului inconjurator. La 4 zile se observa ca celulele stem
capata morfologia fusiforma caracteristica iar osteoblastele au forma poligonala;
interactia dintre acestea este evidenta de la 4 zile, ducand uneori la
fuziune/colocalizare de markeri membranari.
9. Experimentele de imunofluorescenta au demonstrat ca osteoblastele diferentiate
in vitro exprima markerii caracteristici lineajului osos cand sunt cultivate pe HA
ca si pe substrat standard; osteocalcina este secretata masiv de celulele osoase si
ea se poate observa atat intracelular dar mai ales in jurul celulelor unde participa
la formarea matricei osoase mineralizate; colagenul de tip I poate fi observat
intracelular in timpul traficului sau spre membrana celulara unde formeaza fibre
ale matricei extracelulare; proteina BSP are o localizare perinucleara iar
osteonectina apare in toata citoplasma si prelungirile dendritice ale membranei.
10. Din punct de vedere al mecanismului de adeziune, putem concluziona ca nu
depinde atat de structura chimica a substratului (hidroxiapatita) ci mai degraba
41
de nanostructura filmului rezultat care poate sa stimuleze variat integrinele,
proteinele membranare ce fac legatura cu actina si influenteaza adeziunea,
migrarea, proliferarea si diferentierea celulara. Daca in cazul HA depusa prin
MS, celulele secreta o matrice extracelulara bogata ce transmite mai departe
semnale integrinelor si FAK de la periferia celulei, HA depusa prin PLD induce
o adeziune celulara bazata pe interactia puternica a vinculinei cu actina care o
activeaza pe cea din urma sa polimerizeze pentru formarea citoscheletului
celular. Aceasta explica probabil si morfologia bogata in filopodii lungi
observata la HATi. Semnalele provenite de la integrine sunt mai slabe, fapt
datorat probebil lipsei interactiilor integrina-integrina induse de obicei de
legarea la matricea extracelulara.
42
IMAGISTICA
43
A. ANALIZA MICROANATOMICĂ A
RAPORTURILOR ÎNTRE SISTEMELE DE LAMELE
OSOASE ŞI OSTEONICE PRIN EXAMINARE ÎN LUMINĂ
POLARIZATĂ
44
Planşa nr. 1. DistribuŃia osteonilor pe zone de dominanŃă a lamelelor osoase circumferenŃiale şi interstiŃiale.
SuprafaŃa de secŃiune transversală a osului tibia este străbătută de lamele osoase cu orientare circumferenŃială, de lamele osoase interstiŃiale, şi presărată cu osteoni alcătuiŃi din lamele osteonice concentrice care la examinarea în lumină polarizată dau imaginea „crucii cavalerilor de la Malta”.
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
SecŃiune necolorată examinată în lumină polarizată. ReconstrucŃie în 2D, Oc. 7, Ob. 4.
45
A
B
Planşa nr. 2. Variabilitatea formei şi structurii osteonilor. Se remarcă heterogenitatea distribuŃiei lamelelor osteonice şi variabilitatea birefringenŃei lor în
lumină polarizată (A). La examinarea cu obiectivul 10 se constată cu uşurinŃă gruparea osteonilor în perechi solidarizate prin lamele osoase intens birefringente (B).
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
SecŃiune necolorată. Lumină polarizată. Oc. 7, Ob. 4 (A), 10 (B), x28 (A), x70 (B).
46
A
B Planşa nr. 3. Variabilitatea formei şi dimensiunilor canalului central al osteonilor.
Forma şi dimensiunile canalului central al osteonelor diferă de la un osteon la altul. Lamele osteonice descriu pe alocuri elipse deschise la una din extremităŃi, prin care comunică cu spaŃii cilindrice.
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
SecŃiune necolorată. Lumină polarizată. Oc. 7, Ob. 4 (A), 10 (B), x28 (A), x70 (B).
47
A
B
Planşa nr. 4. ModalităŃi de grupare a osteonilor în compacta osului tibia. Pe secŃiune transversală se identifică cu uşurinŃă prezenŃa a patru dublete osteonale (săgeată)
înconjurate de lamele osoase interstiŃiale ce contractă raporturi cu osteoni construiŃi din „unităŃi structurale semilunare” (S1, S2, S3) şi cu osteoni singulari susŃinuŃi de lamele osoase interstiŃiale reunite sub unghiuri diedre (A). La examinarea cu obiectivul 10 am observat raporturile pereŃilor osteoanelor cu fragmentele de lamele osoase interstiŃiale (B).
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
SecŃiune necolorată. Lumină polarizată. Oc. 7, Ob. 4 (A), 10 (B), x28 (A), x70 (B).
48
A
B Planşa nr. 5. ModalităŃi de grupare a osteonilor în compacta osului tibia.
Reuniuni de câte trei osteoni iar pe alocuri de câte doi osteoni prin fascicule de lamele osoase interstiŃiale (A) ce descriu la examinarea cu obiectivul 10 curbe cu curbură mică (B).
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
SecŃiune necolorată. Lumină polarizată. Oc. 7, Ob. 4 (A), 10 (B), x28 (A), x70 (B).
49
A
B Planşa nr. 6. Sisteme de comunicare interosteonală.
Perechi de osteoni amplasaŃi în lungul lamelelor osoase cicumferenŃiale. Se remarcă cu uşurinŃă canale de comunicare interosteonale deoarece secŃiunea interesează canalul interosteonal (canalis perforans) observăm o întrerupere a continuităŃii lamelelor osteonale.
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
SecŃiune necolorată. Lumină polarizată.Oc. 7, Ob. 10 (A), 20 (B), x70 (A), x140 (B).
50
A
B Planşa nr. 7. Sisteme de comunicare interosteonală.
Tripletă osteonală secŃionată la locul de confluenŃă în canalul interosteonal şi înconjurată de triplete osteonale cu raporturi tangenŃiale de contiguitate. Pe alocuri se observă perechi de osteoni intercomunicanŃi cu modificări ale raporturilor între lamelele osteonale (A). La examinarea cu obiectivul 10 a tripletei osteonale la locul de confluenŃă se constată variabilitatea razelor de curbură a lemelelor osteonilor (B).
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
SecŃiune necolorată. Lumină polarizată. Oc. 7, Ob. 4 (A), 10 (B), x28 (A), x70 (B).
51
A
B
Planşa nr. 8. Raporturile osteonilor cu lamelele osoase circumferenŃiale. Continuitatea lamelelor osoase circumferenŃiale este întreruptă prin prezenŃa de osteoni grupaŃi
în perechi şi/sau triplete. Unirea centrilor canalelor osteonale generează o reŃea cu ochiuri triunghiulare ce poate fi considerată o veritabilă structură de rezistenŃă.
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
SecŃiune necolorată. Lumină polarizată. Oc. 7, Ob. 4 (A), 10 (B), x28 (A), x70 (B).
52
A
B Planşa nr. 9. Raporturile osteonilor cu sistemul de lamele osoase interstiŃiale.
Participarea lamelelor osoase interstiŃiale la realizarea raporturilor de contiguitate între osteonii ce participă la constituirea tripletelor (A) şi qvadripletelor de osteoni (B).
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
SecŃiune necolorată. Lumină polarizată. Oc. 7, Ob. 4 (A), 10 (B), x28 (A), x70 (B).
53
A
B
Planşa nr. 10. Raporturile topografice interosteonale. Osteoni pe trei plane cu grosimi variabile a pereŃilor osteonali şi inegalităŃi ale birefringenŃei
fasciculelor de lamele osteonale (A). Osteoni pe două plane conectaŃi prin lamele interosteonale intens birefringente (B).
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
SecŃiune necolorată. Lumină polarizată. Oc. 7, Ob. 4 (A), 10 (B), x28 (A), x70 (B).
54
A
B Planşa nr. 11. Osteonogeneză pe model osos.
Aspect de osteon primar prezent în Ńesutul osos matur – în cadrul unui proces de „osteonogeneză pe model osos” în cadrul fenomenului de remodelare a osului.
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
SecŃiune necolorată. Lumină polarizată. Oc. 7, Ob. 4 (A), 10 (B), x28 (A), x70 (B).
55
A
B Planşa nr. 12. Topografia lamelelor osteonice concentrice.
„Osteon cilindroid” secŃionat transversal ce formează la examinarea în lumină polarizată imaginea crucii cu braŃe egale intens birefringente (aspectul „Crucii cavalerilor de la Malta”)(A). La o putere de mărire superioară devine posibilă numărarea lamelelor osteonale (B).
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
SecŃiune necolorată. Lumină polarizată. Oc. 7, Ob. 10 (A), 20 (B), x70 (A), x140 (B).
56
A
B Planşa nr. 13. InterrelaŃiile sistemelor osteonale
Raporturi biunivoce între osteoni prin interpătrunderea lamelelor osteonului „a” în structura osteonului „b”(A). Aspect bidimensional al orientării spaŃiale a lamelelor osteonale ce realizează imaginea unei pâlnii (B).
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
SecŃiune necolorată. Lumină polarizată. Oc. 7, Ob. 4 (A), 10 (B), x28 (A), x70 (B).
57
A
B Planşa nr. 14. InterrelaŃiile sistemelor osteonale
Imagine de pâlnie realizată de orientarea spaŃială a lamelelor osteonice. Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
SecŃiune necolorată. Lumină polarizată. Oc. 7, Ob. 10 (A), 20 (B), x70 (A), x140 (B).
58
B. ANALIZA MICROANATOMICĂ A
HOTARELOR OSTEOANELOR
59
A
B Planşa nr. 15. Identificarea, în planul secŃiunii microanatomice, a liniei cementale, ce reprezintă limitele osteonului, este mai lesne de realizat pe imaginile obŃinute prin metoda de impregnare argentică Gomori (B). Pe secŃinile examinate în lumină polarizată hotarele osteonilor pot fi intuite, dar o marcare riguroasă a lor devine imposibilă. 1. Canalis centralis; 2. Linea cementalis; 3. Lamele osoase interstiŃiale; 4. Lamele osoase concentrice ale osteonilor; 5. Lacuna osteocyti. A. Examinare în lumină polarizată; B. Vizualizarea linei cementale prin impregnarea argentică Gomori a secŃiunilor, Oc. 7, Ob. 20, x140.
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
SecŃiune necolorată. Lumină polarizată (A); Impregnare argentică Gömöri. Oc. 7, Ob. 20, x140 (A, B)
60
A
B Planşa nr. 16. Peretele cavităŃii medulare conŃine fascicule de „lamele osoase circumferenŃiale interne” străbătute de „canale perforante”. Numeroşi osteoni sunt bine vizibili pe coloraŃia PAS. Hotarul osteonului este marcat printr-o linie continuă – linea cementalis. Pe alocuri există canale de legătură între două canale centrale. 1. Cavitas medullaris et medulla ossium; 2. Lamella circumferentialis interna; 3. Canalis perforans (Volkmann); 4. Canalis centralis (Havers); 5. Linea cementalis; 6. Lacuna osteocyti.
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
ColoraŃia PAS, Oc. 7, Ob. 10 (A, B), x70 (A, B).
61
A
B C Planşa nr. 17. Heterogenitatea formei şi structurii osteoanelor din compacta osului tibia. SpaŃiile interosteonale conŃin glicosaminoglicani PAS pozitivi evidenŃiindu-se astfel zona „linea cementalis”. 1. Fascicul de lamele circumferenŃiale interne; 2. Canalis perforans; 3. Canalis centralis; 4. Linea cementalis; 5. Lacuna ostecyti.
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
ColoraŃia PAS, Oc. 7, Ob. 10, x70 (A, B, C).
62
A
B Planşa nr. 18. Transformarea imaginii din secŃiunea colorată pentru vizualizarea glicosaminoglicanilor prin metoda PAS (A), în sistemul 3D după tehnica EMBOSS, compatibilă cu imaginea obŃinută prin examinarea în lumină interferenŃială contrast, contribuie la cunoaşterea hotarelor circumferenŃiale ale osteonilor, marcarea reperelor pentru morfometria osteonilor, identificarea spaŃiilor interosteonale şi stabilirea criteriilor de evaluare a stadiilor de evoluŃie a osteonilor.
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
ColoraŃia PAS (A), Transformarea imaginii A în sistem 3D (B), Oc. 7, Ob. 10, x70 (A, B).
63
A
B Planşa nr. 19. Osteon dezvoltat în zona “lamelelor osoase circumferenŃiale interne”.
Se remarcă deschiderea canalului central al osteonului în cavitatea medulară a osului (A). La periferia osteonului de identifică cu uşurinŃă linea cementalis. La examinarea în lumină polarizată lamelele osteonice descriu curbe circumferenŃiale eliptice (B).
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
Impregnare argentică Gomori, Oc. 7, Ob. 10 (A), 20 (B), x 70 (A), x140 (B).
64
C. ANALIZA MICROANATOMICĂ A
GENEZEI OSTEOANELOR ÎN OSUL MATUR
65
A
B Planşa nr. 20. Grup de şase osteoni delimitaŃi la periferie prin linea cementalis; diametrul canalului central este variabil. UnităŃile osteonice sunt separate prin fascicule de lamele osoase circumferenŃiale (A). Osteoni suprapuşi şi cu modificări ale topografiei laminei cementalis şi a peretelui osteonului în zona limitrofă canalului central (B).
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
Impregnare argentică Gomori (A), ColoraŃie Hematoxilină Eosină (B), Oc. 7, Ob. 10; x70 (A, B)
66
A
B Planşa nr. 21. Modificarea structurii osteonului din osul matur prin apariŃia unor elemente de remodelare şi geneză a unui nou osteon: o nouă linie cementală (1). o zonă de Ńesut osos în curs de mineralizare (2) şi a unui lizereu preosos (3). Se remarcă conservarea hotarelor osteonului supus remodelării prin prezenŃa intactă a liniei cementale (A). TendinŃa de stratificare a osteonului prin prezenŃa unei noi linii cementale (1) a unei zone de Ńesut osos în curs de mineralizare (2) şi a liniei de rezorbŃie (4) (B).
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
ColoraŃie Hematoxilină Eosină(A), ColoraŃie PAS (B), Oc. 7, Ob. 10, x70 (A, B).
67
A
B Planşa nr. 22. La examinarea obiectivele 20x şi 40x se pot identifica cu uşurinŃă elementele care participă la construirea unui nou osteon în cadrul procesului de remaniere – remodelare. 1. Linea cementalis a unui osteon secundar pe cale de diferenŃiere în cadrul procesului de „remodelare” prin rezorbŃie; 2. łesut osos în curs de mineralizare; 3. Frontul de mineralizare; 4. Lizereu preosos; 5. Linia osteoblastelor; 6. Linea cementalis a unui osteon secundar în curs de dispariŃie; 7. Osteon secundar dintr-o generaŃie anterioară; 8. Con de rezorbŃie.
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
ColoraŃie Hematoxilină Eosină, Oc. 7, Ob. 20 (A), 40 (B), x140 (A), x280 (B).
68
A B
C Planşa nr. 23. Aspecte ale remanierilor structurilor osteonale.
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
Impregnare argentică Gomori (A, C), ColoraŃie Hematoxilină Eosină (B), Oc. 7, Ob. 10 (C), 20 (A, B), x70 (C), x140 (A, B)
69
A
B Planşa nr. 24. Microanatomia osteonului pe cale de remaniere: aspect de osteonogeneză pe model
osos. Se remarcă ondularea pronunŃată a liniei cementale, diferenŃierea structurilor primordiale ale
noului osteon pe cale de dezvoltare. 1. Linea cementalis a osteonului secundar remaniat în plin porces de remodelare; 2. Linea cementalis a osteonului de remaniere; 3. łesut osos nou format pe cale de mineralizare; 4. Lizereu preosos; 5. Linea osteoblastelor.
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
Impregnare argentică Gomori, Oc. 7, Ob. 10 (A), 20 (B), x70 (A), x140 (B).
70
Planşa nr. 25. Analiza comparativă a osteonului nou format prin examinarea secŃiunii de impregnare argentică în lumină directă (A) şi în lumină polarizată (B). 1. Linea cementalis a osteonului secundar în plin proces de remodelare; 2. Linea cementalis a osteonului terŃiar; 3. łesut osos nou format pe cale de mineralizare; 4. Lizereu preosos; 5. Linia osteoblaştilor.
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
Impregnare argentică Gomori, Oc. 7, Ob. 40, x280 (A, B).
B
A
71
A
B
Planşa nr. 26. Definirea graniŃelor structurilor osteonale prin transformarea imaginii de examinare în lumină directă (A) în imagine 3D prin tehnica EMBOSS.
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
Impregnare argentică Gomori, Oc. 7, Ob. 10, x70
72
A
B
Planşa nr. 27. Raporturile osteonilor cu sistemul de lamele osoase interosteonale şi a osteonului pe cale de diferenŃiere cu structurile „osteonului patern”. 1. Linea cementalis a osteonului primar; 2. Linea cementalis a osteonului secundar, nou format în procesul de remaniere; 3. łesut osos nou format, pe cale de mineralizare; 4. Linia osteoblastelor şi lizereul preosos.
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
Impregnare argentică Gomori, Oc. 7, Ob. 20 (A), 40 (B), x140 (A), x280 (B).
73
Planşa nr. 28. “FormaŃiuni semilunare” ce contribuie la edificarea unui nou osteon în cadrul procesului de remaniere-remodelare, veritabilă osteonogeneză pe model osos. 1. Linea cementalis a osteonului secundar în plin proces de remodelare; 2. Linea cemetalis a osteonului terŃiar; 3. łesut osos nou format pe cale de mineralizare; 4. Lamele osoase nou formate din structura viitorului osteon (terŃiar).
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
Impregnare argentică Gomori; prelucrarea imaginii prin tehnica EMBOSS (B). Oc. 7, Ob. 10, x70
B
A
74
A
B
C Planşa nr. 29. Raporturile interosteonale devin evidente prin studiul comparativ al secŃiunii de impregnare argentică (A), cu imaginile de transformare 3D EMBOSS (B) şi de examinare în lumină polarizată (C).
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
Impregnare argentică Gomori, Oc. 7, Ob. 10, x70.
75
A
B
Planşa nr. 30. IntersecŃii osteonale identificate pe secŃiunile de impregnare argentică prin examinare în contrast de fază (A) şi în lumină polarizată (B).
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
Impregnare argentică Gomori, Oc. 7, Ob. 10, x70 (A, B).
76
A
B Planşa nr. 31. Examinarea comparativă în lumină directă şi după transformare 3D EMBOSS a secŃiunilor de impregnare argentică ce intersectează o tripletă osteonală la locul de intercomunicare. 1. Linea cementalis a osteonului terŃiar; 2. Linea cementalis a osteonului secundar în plin proces de remodelare; 3. FormaŃiuni semilunare ce conŃin lamele colagene şi lacune osteocitare din structura osteonului terŃiar pe cale de diferenŃiere.
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
Impregnare argentică Gomori, Oc. 7, Ob. 10, x70 (A, B).
77
A
B
Planşa nr. 32. Analiza comparativă a reuniunirii osteonilor în dublete, triplete şi qvadruplete. Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
SecŃiune necolorată. Lumină polarizată (A). Transformarea 3D EMBOSS (B). Oc. 7, Ob. 4, x28 (A, B).
78
A
B
Planşa nr. 33. Topografia microanatomică a lamelelor osteonale şi raporturile lor cu canalele centrale ale sistemelor Havers.
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
SecŃiune necolorată. Lumină polarizată (A). Transformarea 3D EMBOSS (B). Oc. 7, Ob. 10, x70 (A, B).
79
A
B
Planşa nr. 34. Forme geometrice determinate de traiectul spaŃial al fasciculelor de lamele osteonale şi a lamelelor osoase interstiŃiale.
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
SecŃiune necolorată. Lumină polarizată (A). Transformarea 3D EMBOSS (B). Oc. 7, Ob. 10, x70 (A, B).
80
Planşa nr. 35. Imagini corelative de neovasculogeneză şi diferenŃiere a fasciculelor de fibre colagene
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
ColoraŃie Hematoxilină Eosină (A, B, C) şi examinare în lumină polarizată (D). Oc. 7, Ob.: 4 (A, D), 10 (C), 20 (B); x28 (A, D), x70 (C) şi x140 (B)
A B
C D
81
Planşa nr. 36. Topografia microanatomică a vaselor neoformate în compacta osului tibia secŃionat longitudinal (A) şi orientarea bidimensională a fasciculelor de fibre colagene (B)
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
ColoraŃie Hematoxilină Eosină (A) şi examinare în lumină polarizată (B). ReconstrucŃie bidimensională cu Ob. 4.
A B
82
A
B Planşa nr. 37. Osteon nou format examinat în lumină directă (A) şi lumină polarizată (B).
Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de
cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.
ColoraŃie Hematoxilină Eosină, Oc. 7, Ob. 20, x140 (A, B).
83
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1. Abbas S., Y. Abu-Amer, Dominant-negative IkappaB facilitates apoptosis of osteoclasts by tumor necrosis factor-alpha, J. Biol. Chem. 278 (2003) 20077–20082.
2. Abbasi Jahhromi S.H, Matayoshi A., Kimble R., Dimarogonas A., Pacifici R. Bone quality factor analysis a new noninvasive technique for the measurement of bone density and bone strength. În: J. Bone. Miner. Res., vol. 11 (1996), p. 594-599.
3. Acampora D, Merlo GR, Paleari L, Zerega B, Postiglione MP, Mantero S, Bober E, Barbieri O, Simeone A, Levi G 1999 Craniofacial, vestibular and bone defects in mice lacking the Distal-less-related gene Dlx5. Development 126:3795–3809
4. Adams J.M., Ways of dying: multiple pathways to apoptosis, Genes Dev. 17 (2003) 2481–2495.
5. Akiyama T., P. Bouillet, T. Miyazaki, Y. Kadono, H. Chikuda, U.I. Chung, A. Fukuda, A. Hikita, H. Seto, T. Okada, T. Inaba, A. Sanjay, R. Baron, H. Kawaguchi, H. Oda, K. Nakamura, A. Strasser, S. Tanaka, Regulation of osteoclast apoptosis by ubiquitylation of proapoptotic BH3-only Bcl-2 family member Bim, EMBO J. 22 (2003) 6653–6664.
6. Alliston T, Choy L, Ducy P, Karsenty G, Derynck R 2001 TGF- -induced repression of CBFA1 by Smad3 decreases cbfa1 and osteocalcin expression and inhibits osteoblast differentiation. EMBO J 20:2254 –2272
7. Ascenzi, A. and Bonucci, E. "Relationship between ultrastructure and "pin test" in osteons", Clin. Orth. Rel. Res., 121:275-294.
8. Ascenzi, A. and Bonucci, E. “The mechanical properties of the osteon in relation to its structural organisation", in E.A. Balazs (ed.) Chemistry and molecular biology of the intercellular matrix, Academic Press, New York, 1970.
9. Back J., A. Dierich, C. Bronn, P. Kastner, S. Chan, PU.1 determines the self-renewal capacity of erythroid progenitor cells, Blood 103 (2004) 3615–3623.
10. Baltadjev G. Micromorphometric characteristics of osteons in compact bone of growing of human fetusus. În: Acta Anat. Basel, vol. 154 (1995), p. 181-185.
11. Beedles K.E., P.T. Sharpe, E.F. Wagner, A.E. Grigoriadis, A putative role for c-Fos in the pathophysiology of Paget s disease, J. Bone Miner. Res. 14 (2) (1999) 21–28.
12. Bellido T. , A.A. Ali, L.I. Plotkin, Q. Fu, I. Gubrij, P.K. Roberson, R.S. Weinstein, C.A. O Brien, S.C. Manolagas, R.L. Jilka, Proteasomal degradation of Runx2 shortens parathyroid hormone-induced anti-apoptotic signaling in osteoblasts. A putative explanation for why intermittent administration is needed for bone anabolism, J. Biol. Chem. 278 (2003) 50259–50272.
13. Bellido T. , C.A. O Brien, P.K. Roberson, S.C. Manolagas, Transcriptional activation of the p21(WAF1,CIP1,SDI1) gene by interleukin-6 type cytokines. A prerequisite for their pro-differentiating and anti-apoptotic effects on human osteoblastic cells, J. Biol. Chem. 273 (1998) 21137–21144.
14. Bellido T., L. Han, S.C. Manolagas, Both membrane permeable and impermeable estrogenic compounds directly stimulate murine osteoclast apoptosis in vitro, J. Bone Miner. Res. 14, (1999) S451.
15. Bellido T., M. Huening, M. Raval-Pandya, S.C. Manolagas, S. Christakos, Calbindin-D28k is expressed in osteoblastic cells and suppresses their apoptosis by inhibiting caspase-3 activity, J. Biol. Chem. 275 (2000) 26328–26332.
16. Bhatt N.Y., T.W. Kelley, V.V. Khramtsov, Y. Wang, G.K. Lam, T.L. Clanton, C.B. Marsh, Macrophage-colony-stimulat- ing factor-induced activation of extracellular-regulated kinase involves phosphatidylinositol 3-kinase and reactive oxygen species in human monocytes, J. Immunol. 169 (2002) 6427–6434.
84
17. Bi W, Deng JM, Zhang Z, Behringer RR, de Crombrugghe B 1999 Sox9 is required for cartilage formation. Nat Genet 22:85– 89
18. Bialek P, Kern B, Yang X, Schrock M, Sosic D, Hong N, Wu H, Yu K, Ornitz DM, Olson EN, Justice MJ, Karsenty G 2004 A twist code determines the onset of osteoblast differentiation. Dev Cell 6:423– 435
19. Black D. , A. Schwarz, K. Ensrud, A. Rybak-Feigin, J. Gupta, A. Lombardi, R. Wallace, S. Levis, S. Ouandt, S. Satterfield, J. Cauley, S. Cummings, A 5 year randomized trial of the long- term efficacy and safety of Alendronate: then FIT long-term EXrension (FLEX), J. Bone Miner. Res. 19 (2004) S45.
20. Borton A.J., J.P. Frederick, M.B. Datto, X.F. Wang, R.S. Weinstein, The loss of Smad3 results in a lower rate of bone formation and osteopenia through dysregulation of osteoblast differentiation and apoptosis, J. Bone Miner. Res. 16 (2001), 1754–1764.
21. Bouillet P., D.C. Huang, L.A. O Reilly, H. Puthalakath, L. O Connor, S. Cory, J.M. Adams, A. Strasser, The role of the pro-apoptotic Bcl-2 family member bim in physiological cell death, Ann. N. Y. Acad. Sci. 926 (2000) 83–89.
22. Bouillet P., J.F. Purton, D.I. Godfrey, L.C. Zhang, L. Coultas, H. Puthalakath, M. Pellegrini, S. Cory, J.M. Adams, A. Strasser, BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes, Nature 415 (2002) 922–926.
23. Boyle W.J., W.S. Simonet, D.L. Lacey, Osteoclast differentiation and activation, Nature 423 (2003) 337–342.
24. Brandwood C.P., J.A. Hoyland, M.C. Hillarby, J.L. Berry, M. Davies, P.L. Selby, A.P. Mee, Apoptotic gene expression in Paget s disease: a possible role for Bcl-2, J. Pathol. 201 (2003), 504–512.
25. Bridgewater LC, Lefebvre V, de Crombrugghe B 1998 Chondrocyte-specific enhancer elements in the Col11a2 gene resemble the Col2a1 tissue-specific enhancer. J Biol Chem 273:14998 –15006
26. Brien C.A., D. Jia, L.I. Plotkin, T. Bellido, C.C. Powers, S.A. Stewart, S.C. Manolagas, R.S. Weinstein, Glucocorticoids act directly on osteoblasts and osteocytes to induce their apoptosis and reduce bone formation and strength, Endocrinology 145, (2004) 1835–1841.
27. Bu R., C.W. Borysenko, Y. Li, L. Cao, A. Sabokbar, H.C. Blair, Expression and function of TNF-family proteins and receptors in human osteoblasts, Bone 33 (2003) 760–770.
28. Calvi L.M., N.A. Sims, J.L. Hunzelman, M.C. Knight, A. Giovannetti, J.M. Saxton, H.M. Kronenberg, R. Baron, E. Schipani, Activated parathyroid hormone/parathyroid hormone- related protein receptor in osteoblastic cells differentially affects cortical and trabecular bone, J. Clin. Invest. 107 (2001) 277–286.
29. Cappellen D, Luong-Nguyen NH, Bongiovanni S, Grenet O, Wanke C, Susa, M 2002 Transcriptional program of mouse osteoclast differentiation governed by the macrophage colony-stimulating factor and the ligand for the receptor activator of NF B. J Biol Chem 277:21971–21982
30. Chae H.J., S.W. Chae, J.S. Kang, B.G. Bang, S.B. Cho, R.K. Park, H.S. So, Y.K. Kim, H.M. Kim, H.R. Kim, Dexametha- sone suppresses tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis in osteoblasts: possible role for ceramide, Endocrinology 141, (2000) 2904–2913.
31. Chen S., D.C. Guttridge, E. Tang, S. Shi, K. Guan, C.Y. Wang, Suppression of tumor necrosis factor-mediated apoptosis by nuclear factor kappaB-independent bone morphogenetic pro- tein/Smad signaling, J. Biol. Chem. 276 (2001) 39259–39263.
32. Cheng S.L., S.F. Zhang, S. Mohan, F. Lecanda, A. Fausto, A.H. Hunt, E. Canalis, L.V. Avioli, Regulation of insulin-like growth factors I and II and their binding
85
proteins in human bone marrow stromal cells by dexamethasone, J. Cell Biochem. 71, (1998) 449–458.
33. Chiusaroli R., A. Sanjay, K. Henriksen, M.T. Engsig, W.C. Horne, H. Gu, R. Baron, Deletion of the gene encoding c-Cbl alters the ability of osteoclasts to migrate, delaying resorption and ossification of cartilage during the development of long bones, Dev. Biol. 261 (2003) 537–547.
34. Chua C.C., B.H. Chua, Z. Chen, C. Landy, R.C. Hamdy, Dexamethasone induces caspase activation in murine osteoblas- tic MC3T3-E1 cells, Biochim. Biophys. Acta 1642 (2003) 79–85.
35. Ciarelli, M.J., Goldstein, S.A., Kuhn, J.L., Cody, D.D., and Brown, M.B. - Evaluation of orthogonal mechanical properties and density of human trabecular bone from the major metaphyseal regions with materials testing and computed tomography, J. Orthop. Res., 9:674-682.
36. Coen G., Leptin and bone metabolism, J. Nephrol. 17 (2004), 187–189. 37. Coqueret O 2002 Linking cyclins to transcriptional control. Gene 299:35–55 38. Cord Brakebusch, Reinhard Fässler, The EMBO Journal Vol. 22 No. 10 pp. 2324±2333,
2003 39. Cory S., D.C. Huang, J.M. Adams, The Bcl-2 family: roles in cell survival and
oncogenesis, Oncogene 22 (2003) 8590–8607. 40. Coxon F.P. , M.H. Helfrich, R. Van t Hof, S. Sebti, S.H. Ralston, A. Hamilton,
M.J. Rogers, Protein geranylgeranylation is required for osteoclast formation, function, and survival: inhibition by bisphosphonates and GGTI-298, J. Bone Miner. Res. 15 (2000) 1467–1476.
41. Crabtree G.R., E.N. Olson, NFAT signaling: choreographing the social lives of cells, Cell 109 (Suppl) (2002) S67–S79.
42. De Luca F, Barnes KM, Uyeda JA, De-Levi S, Abad V, Palese T, Mericq V, Baron J 2001 Regulation of growth plate chondrogenesis by bone morphoge- netic protein-2. Endocrinology 142:430 – 436
43. Debiais F., G. Lefevre, J. Lemonnier, S. Le Mee, F. Lasmoles, F. Mascarelli, P.J. Marie, Fibroblast growth factor-2 induces osteoblast survival through a phosphatidylinositol 3-kinase- dependent, -beta-catenin-independent signaling pathway, Exp. Cell Res. 297 (2004) 235–246.
44. Ducy P 2000 Cbfa1: a molecular switch in osteoblast biology. Dev Dyn 219:461– 471 45. Duque G., K.E. Abdaimi, M. Macoritto, M.M. Miller, R. Kremer, Estrogens (E2)
regulate expression and response of 1,25- dihydroxyvitamin D3 receptors in bone cells: changes with aging and hormone deprivation, Biochem. Biophys. Res. Commun., 299 (2002) 446–454.
46. Eberhardt A.W., A. Yeager-Jones, H.C. Blair, Regional trabec- ular bone matrix degeneration and osteocyte death in femora of glucocorticoid- treated rabbits, Endocrinology 142 (2001) 1333–1340.
47. Elefteriou F., S. Takeda, K. Ebihara, J. Magre, N. Patano, C.A. Kim, Y. Ogawa, X. Liu, S.M. Ware, W.J. Craigen, J.J. Robert, C. Vinson, K. Nakao, J. Capeau, G. Karsenty, Serum leptin level is a regulator of bone mass, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, (2004) 3258–3263.
48. Eltoum I., Fredenburgh J., Myers R.B.: Introduction to the theory and practice of fixtion of tissues, J. Histotechnol 24: 173-190, 2001.
49. Ferrari D, Kosher RA 2002 Dlx5 is a positive regulator of chondrocyte dif- ferentiation during endochondral ossification. Dev Biol 252:257–270
50. Fischer B.A., S. Mundle, A.A. Cole, Tumor necrosis factor- alpha induced DNA cleavage in human articular chondrocytes may involve multiple endonucleolytic activities during apoptosis, Microsc. Res. Tech. 50 (2000) 236–242.
51. Fleet. J.C. , Leptin and bone: does the brain control bone biology?, Nutr. Rev. 58 (2000) 209–211.
86
52. Fleischmann A, Hafezi F, Elliott C, Reme CE, Ruther U, Wagner EF 2000 Fra-1 replaces c-Fos-dependent functions in mice. Genes Dev 14:2695–2700
53. Garcia-Moreno C., M.P. Catalan, A. Ortiz, L. Alvarez, C. De la Piedra, Modulation of survival in osteoblasts from postmeno- pausal women, Bone 35 (2004) 170–177.
54. Glantschnig H., J.E. Fisher, G. Wesolowski, G.A. Rodan, A.A. Reszka, M-CSF, TNFalpha and RANK ligand promote osteo- clast survival by signaling through mTOR/S6 kinase, Cell Death Differ. 10 (2003) 1165–1177.
55. Glass D, P.M, Long F, Taketo MM, McMahon AP, Karsenty G 2003, Regulation of bone formation by wnt signaling. J Bone Miner Res 18:S14 (Abstract)
56. Gong Y, Slee RB, Fukai N, Rawadi G, Roman-Roman S, Reginato AM, Wang H, Cundy T, Glorieux FH, Lev D, Zacharin M, Oexle K, Marcelino J, Suwairi W, Heeger S, Sabatakos G, Apte S, Adkins WN, Allgrove J, Arslan-Kirchner M, Batch JA, Beighton P, Black GC, Boles RG, Boon LM, et al 2001 LDL receptor-related protein 5 (LRP5) affects bone accrual and eye development. Cell 107:513–523
57. Gordeladze J.O., C.A. Drevon, U. Syversen, J.E. Reseland, Leptin stimulates human osteoblastic cell proliferation, de novo collagen synthesis, and mineralization: Impact on differentiation markers, apoptosis, and osteoclastic signaling, J. Cell. Biochem., 85 (2002) 825–836.
58. Gori F., L.C. Hofbauer, C.R. Dunstan, T.C. Spelsberg, S. Khosla, B.L. Riggs, The expression of osteoprotegerin and RANK ligand and the support of osteoclast formation by stromal-osteoblast lineage cells is developmentally regulated, Endocrinology 141 (2000) 4768–4776.
59. Gronowicz G.A. , M.B. McCarthy, H. Zhang, W. Zhang, Insulin-like growth factor II induces apoptosis in osteoblasts, Bone 35 (2004) 621–628.
60. Gross A. , J.M. McDonnell, S.J. Korsmeyer, BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis, Genes Dev. 13, (1999) 1899–1911.
61. Gundersen HJ, Bendtsen TF, Korbo L, et al: Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis. APMIS 96: 379-394, 1988.
62. Guo X, Day TF, Jiang X, Garrett-Beal L, Topol L, Yang Y 2004 Wnt/ -catenin signaling is sufficient and necessary for synovial joint formation. Genes Dev 18:2404 –2417
63. Hall B.K. Histogenesis and morphogenesis of bone. În: Clin. Orthop., vol. 71 (1971), p. 249.
64. Hall BK, Miyake T 2000 All for one and one for all: condensations and the initiation of skeletal development. Bioessays 22:138 –147
65. Hartmann C, Tabin CJ 2000 Dual roles of Wnt signaling during chondrogen- esis in the chicken limb. Development 127:3141–3159
66. Hatakeyama S., N. Tomichi, Y. Ohara-Nemoto, M. Satoh, The immunohistochemical localization of Fas and Fas ligand in jaw bone and tooth germ of human fetuses, Calcif. Tissue Int. 66, (2000) 330–337.
67. Hay E., J. Lemonnier, O. Fromigue, P.J. Marie, Bone morpho- genetic protein-2 promotes osteoblast apoptosis through a Smad- independent, protein kinase C-dependent signaling pathway, J. Biol. Chem. 276 (2001) 29028–29036.
68. Hershey CL, Fisher DE 2004 Mitf and Tfe3: members of a b-HLH-ZIP tran- scription factor family essential for osteoclast development and function. Bone 34:689 – 696
69. Hirotani H., N.A. Tuohy, J.T. Woo, P.H. Stern, N.A. Clipstone, The calcineurin/nuclear factor of activated T cells signaling pathway regulates osteoclastogenesis in RAW264.7 cells, J. Biol. Chem. 279 (2004) 13984–13992.
70. Hock J.M., V. Krishnan, J.E. Onyia, J.P. Bidwell, J. Milas, D. Stanislaus, Osteoblast apoptosis and bone turnover, J. Bone Miner. Res. 16 (2001) 975–984.
71. Hofbauer L.C., F. Gori, B.L. Riggs, D.L. Lacey, C.R. Dunstan, T.C. Spelsberg, S. Khosla, Stimulation of osteoprotegerin ligand and inhibition of osteoprotegerin production by glucocorticoids in human osteoblastic lineage cells: potential paracrine
87
mecha- nisms of glucocorticoid-induced osteoporosis, Endocrinology, 140 (1999) 4382–4389.
72. Hu H, Hilton MJ, Tu X, Yu K, Ornitz DM, Long F 2005 Sequential roles of Hedgehog and Wnt signaling in osteoblast development. Development 132:49–60
73. Huang W, Chung UI, Kronenberg HM, de Crombrugghe B 2001 The chon- drogenic transcription factor Sox9 is a target of signaling by the parathyroid hormone-related peptide in the growth plate of endochondral bones. Proc Natl Acad Sci USA 98:160 –165
74. Igarashi K., H. Hirotani, J.T. Woo, P.H. Stern, Cyclosporine A and FK506 induce osteoclast apoptosis in mouse bone marrow cell cultures, Bone 35 (2004) 47–56.
75. Ishida N, Hayashi K, Hoshijima M, Ogawa T, Koga S, Miyatake Y, Ku- megawa M, Kimura T, Takeya T 2002 Large scale gene expression analysis of osteoclastogenesis in vitro and elucidation of NFAT2 as a key regulator. J Biol Chem 277:41147– 41156
76. Ishida N., K. Hayashi, M. Hoshijima, T. Ogawa, S. Koga, Y. Miyatake, M. Kumegawa, T. Kimura, T. Takeya, Large scale gene expression analysis of osteoclastogenesis in vitro and elucidation of NFAT2 as a key regulator, J. Biol. Chem. 277, (2002) 41147–41156.
77. Iwata T, Li CL, Deng CX, Francomano CA 2001 Highly activated Fgfr3 with the K644M mutation causes prolonged survival in severe dwarf mice. Hum Mol Genet 10:1255–1264
78. Kanaoka K., Y. Kobayashi, F. Hashimoto, T. Nakashima, M. Shibata, K. Kobayashi, Y. Kato, H. Sakai, A common down- stream signaling activity of osteoclast survival factors that prevent nitric oxide-promoted osteoclast apoptosis, Endocrinol- ogy 141 (2000) 2995–3005.
79. Karp SJ, Schipani E, St-Jacques B, Hunzelman J, Kronenberg H, McMahon AP 2000 Indian hedgehog coordinates endochondral bone growth and mor- phogenesis via parathyroid hormone related-protein-dependent and -inde- pendent pathways. Development 127:543–548
80. Karsenty G, Wagner EF 2002 Reaching a genetic and molecular understanding of skeletal development. Dev Cell 2:389 – 406
81. Kato M, Patel MS, Levasseur R, Lobov I, Chang BH, Glass 2nd DA, Hart- mann C, Li L, Hwang TH, Brayton CF, Lang RA, Karsenty G, Chan L 2002, Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and per- sistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt core- ceptor. J Cell Biol 157:303–314
82. Kim S, Koga T, Isobe M, Kern BE, Yokochi T, Chin YE, Karsenty G, Tan- iguchi T, Takayanagi H 2003 Stat1 functions as a cytoplasmic attenuator of Runx2 in the transcriptional program of osteoblast differentiation. Genes Dev 17:1979 –1991
83. Kobayashi T, Chung UI, Schipani E, Starbuck M, Karsenty G, Katagiri T, Goad DL, Lanske B, Kronenberg HM 2002 PTHrP and Indian hedgehog control differentiation of growth plate chondrocytes at multiple steps. Devel- opment 129:2977–2986
84. Koga T., M. Inui, K. Inoue, S. Kim, A. Suematsu, E. Kobayashi, T. Iwata, H. Ohnishi, T. Matozaki, T. Kodama, T. Taniguchi, H. Takayanagi, T. Takai, Costimulatory signals mediated by the ITAM motif cooperate with RANKL for bone homeostasis, Nature 428 (2004) 758–763.
85. Kousteni S. , T. Bellido, L.I. Plotkin, C.A. O Brien, D.L. Bodenner, L. Han, K. Han, G.B. DiGregorio, J.A. Katzenel- lenbogen, B.S. Katzenellenbogen, P.K. Roberson, R.S. Wein- stein, R.L. Jilka, S.C. Manolagas, Nongenotropic, sex- nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity, Cell 104 (2001) 719–730.
86. Kousteni S., J.R. Chen, T. Bellido, L. Han, A.A. Ali, C.A. O Brien, L. Plotkin, Q. Fu, A.T. Mancino, Y. Wen, A.M. Vertino, C.C. Powers, S.A. Stewart, R. Ebert,
88
A.M. Parfitt, R.S. Weinstein, R.L. Jilka, S.C. Manolagas, Reversal of bone loss in mice by nongenotropic signaling of sex steroids, Science, 298 (2002) 843–846.
87. Krammer P.H., CD95 s deadly mission in the immune system, Nature 407 (2000) 789–795.
88. Lacey D.L., H.L. Tan, J. Lu, S. Kaufman, G. Van, W. Qiu, A. Rattan, S. Scully, F. Fletcher, T. Juan, M. Kelley, T.L. Burgess, W.J. Boyle, A.J. Polverino, Osteoprotegerin ligand modulates murine osteoclast survival in vitro and in vivo, Am. J. Pathol., 157 (2000) 435–448.
89. Lee KS, Hong SH, Bae SC 2002 Both the Smad and p38 MAPK pathways play a crucial role in Runx2 expression following induction by transforming growth factor- and bone morphogenetic protein. Oncogene 21:7156 –7163
90. Lee S.E., W.J. Chung, H.B. Kwak, C.H. Chung, K.B. Kwack, Z.H. Lee, H.H. Kim, Tumor necrosis factor-alpha supports the survival of osteoclasts through the activation of Akt and ERK, J. Biol. Chem. 276 (2001) 49343–49349.
91. Lefebvre V, Huang W, Harley VR, Goodfellow PN, de Crombrugghe B 1997 SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro 1(II) collagen gene. Mol Cell Biol 17:2336 –2346
92. Liu W, Toyosawa S, Furuichi T, Kanatani N, Yoshida C, Liu Y, Himeno M, Narai S, Yamaguchi A, Komori T 2001 Overexpression of Cbfa1 in osteoblasts inhibits osteoblast maturation and causes osteopenia with multiple fractures. J Cell Biol 155:157–166
93. Long F, Zhang XM, Karp S, Yang Y, McMahon AP 2001 Genetic manipulation of hedgehog signaling in the endochondral skeleton reveals a direct role in the regulation of chondrocyte proliferation. Development 128:5099 –5108
94. Luchin A, Purdom G, Murphy K, Clark MY, Angel N, Cassady AI, Hume DA, Ostrowski MC 2000 The microphthalmia transcription factor regulates ex- pression of the tartrate-resistant acid phosphatase gene during terminal dif- ferentiation of osteoclasts. J Bone Miner Res 15:451– 460
95. Luckman S.P., D.E. Hughes, F.P. Coxon, R. Graham, G. Russell, M.J. Rogers, Nitrogen-containing bisphosphonates inhibit the mevalonate pathway and prevent post-translational prenylation of GTP-binding proteins, including Ras, J. Bone Miner. Res. 13 (1998) 581–589.
96. Martelli A.M. , P. Borgatti, R. Bortul, M. Manfredini, L. Massari, S. Capitani, L.M. Neri, Phosphatidylinositol 3-kinase translocates to the nucleus of osteoblast-like MC3T3-E1 cells in response to insulin-like growth factor I and platelet-derived growth factor but not to the proapoptotic cytokine tumor necrosis factor alpha, J. Bone Miner. Res. 15 (2000) 1716–1730.
97. Matsuo K, Galson DL, Zhao C, Peng L, Laplace C, Wang KZ, Bachler MA, Amano H, Aburatani H, Ishikawa H, Wagner EF 2004 Nuclear factor of activated T-cells (NFAT) rescues osteoclastogenesis in precursors lacking c- Fos. J Biol Chem 279:26475–26480
98. Matsuo K., D.L. Galson, C. Zhao, L. Peng, C. Laplace, K.Z. Wang, M.A. Bachler, H. Amano, H. Aburatani, H. Ishikawa, E.F. Wagner, Nuclear factor of activated T-cells (NFAT) rescues osteoclastogenesis in precursors lacking c-Fos, J. Biol. Chem. 279, (2004) 26475–26480.
99. Minina E, Wenzel HM, Kreschel C, Karp S, Gaffield W, McMahon AP, Vortkamp A 2001 BMP and Ihh/PTHrP signaling interact to coordinate chon- drocyte proliferation and differentiation. Development 128:4523– 4534
100. Miyazaki T., H. Katagiri, Y. Kanegae, H. Takayanagi, Y. Sawada, A. Yamamoto, M.P. Pando, T. Asano, I.M. Verma, H. Oda, K. Nakamura, S. Tanaka, Reciprocal role of ERK and NF-kappaB pathways in survival and activation of osteoclasts, J. Cell Biol. 148 (2000) 333–342.
101. Miyazawa K, Shinozaki M, Hara T, Furuya T, Miyazono K 2002 Two major Smad pathways in TGF- superfamily signalling. Genes Cells 7:1191–1204
89
102. Moser M., Balancing life and death, Nat. Immunol. 5 (2004), 559–560. 103. Motyckova G, Weilbaecher KN, Horstmann M, Rieman DJ, Fisher DZ, Fisher DE
2001 Linking osteopetrosis and pycnodysostosis: regulation of ca- thepsin K expression by the microphthalmia transcription factor family. Proc Natl Acad Sci USA 98:5798 –5803
104. Murakami S, Lefebvre V, de Crombrugghe B 2000 Potent inhibition of the master chondrogenic factor Sox9 gene by interleukin-1 and tumor necrosis factor- . J Biol Chem 275:3687–3692
105. Nakashima K, Zhou X, Kunkel G, Zhang Z, Deng JM, Behringer RR, de Crombrugghe B 2002 The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell 108:17–29
106. O Brien C.A., F.L. Swain, J.A. Crawford, L.I. Plotkin, S.C. Manolagas, R.S. Weinstein, 11b-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (11b-HSD2) overexpression prevents glucocorticoid- induced apoptosis of osteoblast cells: a novel strategy for dissecting the mechanism of steroid-induced osteoporosis, J. Bone Miner. Res. 15 (2000) S167.
107. O Reilly L.A., L. Cullen, J. Visvader, G.J. Lindeman, C. Print, M.L. Bath, D.C. Huang, A. Strasser, The proapoptotic BH3- only protein bim is expressed in hematopoietic, epithelial, neuronal, and germ cells, Am. J. Pathol. 157 (2000) 449–461.
108. Olmedo M.L., P.S. Landry, K.K. Sadasivan, J.A. Albright, A.A. Marino, Programmed cell death in post-traumatic bone callus, Cell Mol. Biol. (Noisy-le-grand) 46 (2000) 89–97.
109. Olmedo M.L., P.S. Landry, K.K. Sadasivan, J.A. Albright, W.D. Meek, R. Routh, A.A. Marino, Regulation of osteoblast levels during bone healing, J. Orthop. Trauma 13 (1999) 356–362.
110. Opperman L.A., K. Adab, P.T. Gakunga, Transforming growth factor-beta 2 and TGF-beta 3 regulate fetal rat cranial suture morphogenesis by regulating rates of cell proliferation and apoptosis, Dev. Dyn. 219 (2000) 237–247.
111. Ornitz DM, Marie PJ 2002 FGF signaling pathways in endochondral and intramembranous bone development and human genetic disease. Genes Dev 16:1446 –1465
112. Parfitt AM: The actions of parathyroid hormone on bone: relation to bone remodeling and turnover, calcium homeostasis, and metabolic bone disease. Part III of IV parts; PTH ad osteoblasts, the relationship between bone turnover and bone loss, and the state of the bones in primary hyperparathyroidism. Metabolism 25: 1033-1069, 1976.
113. Parfitt AM: The cellular basis of bone remodeling: the quantum concept reexamined in light of recent advances in the cell biology of bone. Calcif Tissue Int 36: S37-S45, 1984.
114. Partington GA, Fuller K, Chambers TJ, Pondel M 2004 Mitf-PU.1 interactions with the tartrate-resistant acid phosphatase gene promoter during osteoclast differentiation. Bone 34:237–245
115. Pavalko F.M., R.L. Gerard, S.M. Ponik, P.J. Gallagher, Y. Jin, S.M. Norvell, Fluid shear stress inhibits TNF-alpha-induced apoptosis in osteoblasts: a role for fluid shear stress-induced activation of PI3-kinase and inhibition of caspase-3, J. Cell Physiol. 194 (2003) 194–205.
116. Pechak DG, Kujawa MJ, Caplan AI: Morphological and histochemical events during first bone formation in embryonic chick limbs. Bone 7: 441-458, 1986.
117. Penolazzi L., E. Lambertini, M. Borgatti, R. Piva, M. Cozzani, I. Giovannini, R. Naccari, G. Siciliani, R. Gambari, Decoy oligodeoxynucleotides targeting NF-kappaB transcription factors: induction of apoptosis in human primary osteoclasts, Biochem. Pharmacol. 66 (2003) 1189–1198.
90
118. Pizette S, Niswander L 2000 BMPs are required at two steps of limb chon- drogenesis: formation of prechondrogenic condensations and their differen- tiation into chondrocytes. Dev Biol 219:237–249
119. Plotkin L.I., R.S. Weinstein, A.M. Parfitt, P.K. Roberson, S.C. Manolagas, T. Bellido, Prevention of osteocyte and osteoblast apoptosis by bisphosphonates and calcitonin, J. Clin. Invest. 104, (1999) 1363–1374.
120. Plotkin L.I., T. Bellido, Bisphosphonate-induced, hemichannel- mediated, anti-apoptosis through the Src/ERK pathway: a gap junction-independent action of connexin43, Cell Commun. Adhes. 8 (2001) 377–382.
121. Podenphant J, Engel U: Regional variations in histomorphometric bone dynamics from the skeleton of an osteoporotic woman. Calcif Tissue Int 40: 184-188, 1987.
122. Porter GA, Gurley M, Roth SI: Bone. In: Sternberg SS, ed:Histology for Pathologists, 2nd ed. Lippincott Raven, Philadelphia, PA, 1997: 85-105.
123. Recchia I., N. Rucci, A. Funari, S. Migliaccio, A. Taranta, M. Longo, M. Kneissel, M. Susa, D. Fabbro, A. Teti, Reduction of c-Src activity by substituted 5,7-diphenyl-pyr- rolo2,3-d.-pyrimidines induces osteoclast apoptosis in vivo and in vitro. Involvement of ERK1/2 pathway, Bone 34 (2004) 65–79.
124. Recker R. , K. Ensrud, S. Diem, E. Cheng, S. Bare, P. Masarachia, P. PRoschger, P. Fratzl, K. Klaushofer, A. Lom- bardi, D. Kimmel, Normal bone histomorphometry and 3D microarchitecture after 10 years Alendronate treatment of postmenopausal women, J. Bone Miner. Res. 19 (2004) S45.
125. Reid I.R. , Glucocorticoid osteoporosis—mechanisms and man- agement, Eur. J. Endocrinol. 137 (1997) 209–217.
126. Robledo RF, Rajan L, Li X, Lufkin T 2002 The Dlx5 and Dlx6 homeobox genes are essential for craniofacial, axial, and appendicular skeletal development. Genes Dev 16:1089 –1101
127. Rogers A.W. Textbook of anatomy. Edinburgh: Ed. Murchill and Livingstone, 1992. 128. Rose CS, Malcolm S 1997 A TWIST in development. Trends Genet 13:384 –387 129. Ross A., Romcell J. Histology: a text and atlas. 2-nd ed. Baltimore: Williams and
Wilkins, 1989. 130. Sabatakos G, Sims NA, Chen J, Aoki K, Kelz MB, Amling M, Bouali Y,
Mukhopadhyay K, Ford K, Nestler EJ, Baron R 2000 Overexpression of FosB transcription factor(s) increases bone formation and inhibits adipogenesis. Nat Med 6:985–990
131. Sahni M, Ambrosetti DC, Mansukhani A, Gertner R, Levy D, Basilico C 1999, FGF signaling inhibits chondrocyte proliferation and regulates bone devel- opment through the STAT-1 pathway. Genes Dev 13:1361–1366
132. Sato M, Morii E, Takebayashi-Suzuki K, Yasui N, Ochi T, Kitamura Y, Nomura S 1999 Microphthalmia-associated transcription factor interacts with PU.1 and c-Fos: determination of their subcellular localization. Biochem Bio- phys Res Commun 254:384 –387
133. Satokata I, Ma L, Ohshima H, Bei M, Woo I, Nishizawa K, Maeda T, Takano Y, Uchiyama M, Heaney S, Peters H, Tang Z, Maxson R, Maas R 2000 Msx2 deficiency in mice causes pleiotropic defects in bone growth and ectodermal organ formation. Nat Genet 24:391–395
134. Scott E.W., R.C. Fisher, M.C. Olson, E.W. Kehrli, M.C. Simon, H. Singh, PU.1 functions in a cell-autonomous manner to control the differentiation of multipotential lymphoid-myeloid progenitors, Immunity 6 (1997) 437–447.
135. Sekiya I, Tsuji K, Koopman P, Watanabe H, Yamada Y, Shinomiya K, Nifuji A, Noda M 2000 SOX9 enhances aggrecan gene promoter/enhancer activity and is up-regulated by retinoic acid in a cartilage-derived cell line, TC6. J Biol Chem 275:10738 –10744
91
136. Shevde, N. K. şi colaboratorii Estrogen suppress RANK ligand induced osteoclast differentiation via a stromal cell independent mechanism involvingc-Jun repression. Proc. Nati Acad. Sci. USA 97: 2000, p. 7829-7834.
137. Shibahara M. , K. Nishida, H. Asahara, T. Yoshikawa, S. Mitani, Y. Kondo, H. Inoue, Increased osteocyte apoptosis during the development of femoral head osteonecrosis in spontaneously hypertensive rats, Acta Med. Okayama 54, (2000) 67–74.
138. Sierra J, Villagra A, Paredes R, Cruzat F, Gutierrez S, Javed A, Arriagada G, Olate J, Imschenetzky M, Van Wijnen AJ, Lian JB, Stein GS, Stein JL, Montecino M 2003 Regulation of the bone-specific osteocalcin gene by p300 requires Runx2/Cbfa1 and the vitamin D3 receptor but not p300 intrinsic histone acetyltransferase activity. Mol Cell Biol 23:3339 –3351
139. Silvestrini G., P. Ballanti, F.R. Patacchioli, P. Mocetti, R. Di Grezia, B.M. Wedard, L. Angelucci, E. Bonucci, Evaluation of apoptosis and the glucocorticoid receptor in the cartilage growth plate and metaphyseal bone cells of rats after high-dose treatment with corticosterone, Bone 26 (2000) 33–42.
140. Silvestrini G., P. Mocetti, P. Ballanti, R. Di Grezia, E. Bonucci, In vivo incidence of apoptosis evaluated with the TdT FragEL DNA fragmentation detection kit in cartilage and bone cells of the rat tibia, Tissue Cell 30 (1998) 627–633.
141. Sims NA, Clement-Lacroix P, Minet D, Fraslon-Vanhulle C, Gaillard-Kelly M, Resche-Rigon M, Baron R 2003 A functional androgen receptor is not sufficient to allow estradiol to protect bone after gonadectomy in estradiol receptor-deficient mice. J Clin Invest 111:1319 –1327
142. Sitcheran R, Cogswell PC, Baldwin Jr AS 2003 NF- B mediates inhibition of mesenchymal cell differentiation through a posttranscriptional gene silencing mechanism. Genes Dev 17:2368 –2373
143. Smith T.H., Dgaard A., Schneider E. Structure and function of vertebral trabecular bone. În: Spine, vol. 22 (1997), p. 2823-2833.
144. Smits P, Li P, Mandel J, Zhang Z, Deng JM, Behringer RR, de Crombrugghe B, Lefebvre V 2001 The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Dev Cell 1:277–290
145. So H, Rho J, Jeong D, Park R, Fisher DE, Ostrowski MC, Choi Y, Kim N 2003, Microphthalmia transcription factor and PU.1 synergistically induce the leu- kocyte receptor osteoclast-associated receptor gene expression. J Biol Chem 278:24209 –24216
146. Sowa H, Kaji H, Hendy GN, Canaff L, Komori T, Sugimoto T, Chihara K 2004, Menin is required for BMP-2-and TGF- -regulated osteoblastic differentiation through interaction with Smads and Runx2. J Biol Chem 279:40267– 40275
147. Sowa H., H. Kaji, M.F. Iu, T. Tsukamoto, T. Sugimoto, K. Chihara, Parathyroid hormone-Smad3 axis exerts anti-apoptotic action and augments anabolic action of transforming growth factor beta in osteoblasts, J. Biol. Chem. 278 (2003) 52240–52252.
148. Steingrimsson E, Tessarollo L, Pathak B, Hou L, Arnheiter H, Copeland NG, Jenkins NA 2002 Mitf and Tfe3, two members of the Mitf-Tfe family of bHLH-Zip transcription factors, have important but functionally redundant roles in osteoclast development. Proc Natl Acad Sci USA 99:4477– 4482
149. Stout SD, Brunsden BS, Hildebolt CF, et al: Computer-assisted 3D reconstruction of serial sections of corticalbone to determine the 3D structure of osteons. Calcif Tissue Int 65: 280-4, 1999.
150. Sunyer T., J. Lewis, P. Collin-Osdoby, P. Osdoby, Estrogen s bone-protective effects may involve differential IL-1 receptor regulation in human osteoclast-like cells, J. Clin. Invest. 103, (1999) 1409–1418.
92
151. Takayanagi H, Kim S, Koga T, Nishina H, Isshiki M, Yoshida H, Saiura A, Isobe M, Yokochi T, Inoue J, Wagner EF, Mak TW, Kodama T, Taniguchi T, Induction and activation of the transcription factor NFATc1 (NFAT2) integrate RANKL signaling in terminal differentiation of osteoclasts. Dev Cell 3:889 –901
152. Takayanagi H., S. Kim, T. Koga, H. Nishina, M. Isshiki, H. Yoshida, A. Saiura, M. Isobe, T. Yokochi, J. Inoue, E.F. Wagner, T.W. Mak, T. Kodama, T. Taniguchi, Induction and activation of the transcription factor NFATc1 (NFAT2) inte- grate RANKL signaling in terminal differentiation of osteoclasts, Dev. Cell 3 (2002) 889–901.
153. Takeda S, Bonnamy JP, Owen MJ, Ducy P, Karsenty G 2001 Continuous expression of Cbfa1 in nonhypertrophic chondrocytes uncovers its ability to induce hypertrophic chondrocyte differentiation and partially rescues Cbfa1- deficient mice. Genes Dev 15:467– 481
154. Takeda S., F. Elefteriou, R. Levasseur, X. Liu, L. Zhao, K.L. Parker, D. Armstrong, P. Ducy, G. Karsenty, Leptin regulates bone formation via the sympathetic nervous system, Cell 111, (2002) 305–317.
155. Termie JD : Cellular activity, matrix proteins, and aging bone. Exp Gerontol 25: 217-221, 1990.
156. Tondravi MM, McKercher SR, Anderson K, Erdmann JM, Quiroz M, Maki R, Teitelbaum SL 1997 Osteopetrosis in mice lacking haematopoietic tran- scription factor PU.1. Nature 386:81– 84
157. Tsuboi M., A. Kawakami, T. Nakashima, N. Matsuoka, S. Urayama, Y. Kawabe, K. Fujiyama, T. Kiriyama, T. Aoyagi, K. Maeda, K. Eguchi, Tumor necrosis factor-alpha and inter- leukin-1beta increase the Fas-mediated apoptosis of human osteoblasts, J. Lab. Clin. Med. 134 (1999) 222–231.
158. Tsuda E, Goto M, Mochizuki S, Yano K, Kibayashi F, Morinaga T, Higashio K, -Isolation of a novel cytokine from human fibroblasts that specifically inhibits osteoclastogenesis.Biochem Biophys Res Commun 1997; 234:137-42)
159. Tsumaki N, Nakase T, Miyaji T, Kakiuchi M, Kimura T, Ochi T, Yoshikawa H 2002 Bone morphogenetic protein signals are required for cartilage forma- tion and differently regulate joint development during skeletogenesis. J Bone Miner Res 17:898 –906
160. Tsumaki N, Tanaka K, Arikawa-Hirasawa E, Nakase T, Kimura T, Thomas JT, Ochi T, Luyten FP, Yamada Y 1999 Role of CDMP-1 in skeletal morpho- genesis: promotion of mesenchymal cell recruitment and chondrocyte differ- entiation. J Cell Biol 144:161–173
161. Ueta C, Iwamoto M, Kanatani N, Yoshida C, Liu Y, Enomoto-Iwamoto M, Ohmori T, Enomoto H, Nakata K, Takada K, Kurisu K, Komori T 2001, Skeletal malformations caused by overexpression of Cbfa1 or its dominant negative form in chondrocytes. J Cell Biol 153:87–100
162. Urayama S., A. Kawakami, T. Nakashima, M. Tsuboi, S. Yamasaki, A. Hida, Y. Ichinose, H. Nakamura, E. Ejima, T. Aoyagi, T. Nakamura, K. Migita, Y. Kawabe, K. Eguchi, Effect of vitamin K2 on osteoblast apoptosis: vitamin K2 inhibits apoptotic cell death of human osteoblasts induced by Fas, proteasome inhibitor, etoposide, and staurosporine, J. Lab. Clin. Med. 136 (2000) 181–193.
163. Van Beek E., C. Lowik, I. Que, S. Papapoulos, Dissociation of binding and antiresorptive properties of hydroxybisphospho- nates by substitution of the hydroxyl with an amino group, J. Bone Miner. Res. 11 (1996) 1492–1497.
164. Van Wesenbeeck L, Cleiren E, Gram J, Beals RK, Benichou O, Scopelliti D, Key L, Renton T, Bartels C, Gong Y, Warman ML, De Vernejoul MC, Boller- slev J, Van Hul W 2003 Six novel missense mutations in the LDL receptor- related protein 5 (LRP5) gene in different conditions with an increased bone density. Am J Hum Genet 72:763–771
93
165. Verborgt O., G.J. Gibson, M.B. Schaffler, Loss of osteocyte integrity in association with microdamage and bone remodeling after fatigue in vivo, J. Bone Miner. Res. 15 (2000) 60–67.
166. Villunger A., C. Scott, P. Bouillet, A. Strasser, Essential role for the BH3-only protein Bim but redundant roles for Bax, Bcl-2, and Bcl-w in the control of granulocyte survival, Blood 101, (2003) 2393–2400.
167. Wahner H.W. Measurements of bone mass and bone density. În: Endocrinol Metab Clin North Am., vol. 18 (1989), p. 995-1012.
168. Wang W, Wang YG, Reginato AM, Glotzer DJ, Fukai N, Plotkina S, Karsenty G, Olsen BR 2004 Groucho homologue Grg5 interacts with the transcription factor Runx2-Cbfa1 and modulates its activity during postnatal growth in mice. Dev Biol 270:364 –381.
169. Weinstein R.S., J.R. Chen, C.C. Powers, S.A. Stewart, R.D. Landes, T. Bellido, R.L. Jilka, A.M. Parfitt, S.C. Manolagas, Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosph- onate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids, J. Clin. Invest. 109 (2002) 1041–1048.
170. Weinstein R.S., R.W. Nicholas, S.C. Manolagas, Apoptosis of osteocytes in glucocorticoid-induced osteonecrosis of the hip, J. Clin. Endocrinol. Metab. 85 (2000) 2907–2912.
171. Wernyj R.P. , M.P. Mattson, S. Christakos, Expression of calbindin-D28k in C6 glial cells stabilizes intracellular calcium levels and protects against apoptosis induced by calcium iono- phore and amyloid b-peptide, Brain Res. Mol. Brain Res. 64, (1999) 69–79.
172. Whitfield J.F., P. Morley, G.E. Willick, The control of bone growth by parathyroid hormone, leptin, & statins, Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 12 (2002) 23–51.
173. Windahl S.H., R. Chiusaroli, P. Clement-Lacroix, D. Minet, R. CGalien, W.C. JHorne, M. Resche-Rigon, R. Baron, Estrens are non-selective ligands of the androgen receptor, protecting bone in estrogen receptor a-deleted male mice whilst also affecting reproductive organs, J. Bone Miner. Res. 19 (2004) S31.
174. Wong B.R., D. Besser, N. Kim, J.R. Arron, M. Vologodskaia, H. Hanafusa, Y. Choi, TRANCE, a TNF family member, activates Akt/PKB through a signaling complex involving TRAF6 and c-Src, Mol. Cell 4 (1999) 1041–1049.
175. Woo K.M., H.M. Kim, J.S. Ko, Macrophage colony-stimulating factor promotes the survival of osteoclast precursors by up- regulating Bcl-X(L), Exp. Mol. Med. 34 (2002) 340–346.
176. Wu X., M.A. McKenna, X. Feng, T.R. Nagy, J.M. McDonald, Osteoclast apoptosis: the role of Fas in vivo and in vitro, Endocrinology 144 (2003) 5545–5555.
177. Wunderle VM, Critcher R, Hastie N, Goodfellow PN, Schedl A 1998 Deletion of long-range regulatory elements upstream of SOX9 causes campomelic dys- plasia. Proc Natl Acad Sci USA 95:10649 –10654
178. Xing L., T.P. Bushnell, L. Carlson, Z. Tai, M. Tondravi, U. Siebenlist, F. Young, B.F. Boyce, NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine- mediated osteoclastogenesis, J. Bone Miner. Res. 17 (2002) 1200–1210.
179. Xing L., A.M. Venegas, A. Chen, L. Garrett-Beal, B.F. Boyce, H.E. Varmus, P.L. Schwartzberg, Genetic evidence for a role for Src family kinases in TNF family receptor signaling and cell survival, Genes Dev. 15 (2001) 241–253.
180. Yamaguchi TP, Bradley A, McMahon AP, Jones S 1999 A Wnt5a pathway underlies outgrowth of multiple structures in the vertebrate embryo. Devel- opment 126:1211–1223
181. Yamashita T., L. Xing, K. Matsuo, E.F. Wagner, B.F. Boyce, Treatment of c-Fos over-expressing osteoclast precursors with cytokines induces osteoclast formation and abrogates bisphosph- onate-induced osteoclast apoptosis, J. Bone Miner. Res. 18, (2003) S17.
94
182. Yang X, Matsuda K, Bialek P, Jacquot S, Masuoka HC, Schinke T, Li L, Brancorsini S, Sassone-Corsi P, Townes TM, Hanauer A, Karsenty G 2004, ATF4 is a substrate of RSK2 and an essential regulator of osteoblast biology; implication for Coffin-Lowry syndrome. Cell 117:387–398
183. Yang Y, Topol L, Lee H, Wu J 2003 Wnt5a and Wnt5b exhibit distinct activities in coordinating chondrocyte proliferation and differentiation. Development 130:1003–1015
184. Yang Y, Topol L, Lee H, Wu J 2003 Wnt5a and Wnt5b exhibit distinct activities in coordinating chondrocyte proliferation and differentiation. Development 130:1003–1015
185. Yasuda H, Shima N,Nakagawa N, et.al – Osteoclast differentation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.Proc.Natl Acad Sci U S A 1998; 95.3597-602
186. Yeh S, Tsai MY, Xu Q, Mu XM, Lardy H, Huang KE, Lin H, Yeh SD, Altuwaijri S, Zhou X, Xing L, Boyce BF, Hung MC, Zhang S, Gan L, Chang C, Hung MC 2002 Generation and characterization of androgen receptor knockout (ARKO) mice: an in vivo model for the study of androgen functions in selective tissues. Proc Natl Acad Sci USA 99:13498 –13503
187. Yoshida CA, Yamamoto H, Fujita T, Furuichi T, Ito K, Inoue K, Yamana K, Zanma A, Takada K, Ito Y, Komori T 2004 Runx2 and Runx3 are essential for chondrocyte maturation, Runx2 regulates limb growth through induction of Indian hedgehog. Genes Dev 18:952–963
188. Yoshida H, Hayashi S, Kunisada T, Ogawa M, Nishikawa S, Okamura H, Sudo T, Shultz LD 1990 The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene. Nature 345:442– 444
189. Zalavras C., S. Shah, M.J. Birnbaum, B. Frenkel, Role of apoptosis in glucocorticoid-induced osteoporosis and osteone- crosis, Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 13 (2003) 221–235.
190. Zamurovic N, Cappellen D, Rohner D, Susa M 2004 Coordinated activation of Notch, Wnt and TGF- signaling pathways in BMP-2 induced osteogenesis: notch target gene Hey1 inhibits mineralization and Runx2 transcriptional activity. J Biol Chem 279:37704 –37715
191. Zhang Q., I. Badell, E.M. Schwarz, B.F. Boyce, L. Xing, TNF protects osteoclasts from alendronate-induced apoptosis by stimulating Bcl-xL expression through the transcription factor, Ets2, J. Bone Miner. Res. 19 (2004) S171.
192. Zhang YW, Yasui N, Ito K, Huang G, Fujii M, Hanai J, Nogami H, Ochi T, Miyazono K, Ito Y 2000 A RUNX2/PEBP2 A/CBFA1 mutation displaying impaired transactivation and Smad interaction in cleidocranial dysplasia. Proc Natl Acad Sci USA 97:10549 –10554
193. Zhao W., M.H. Byrne, Y. Wang, S.M. Krane, Osteocyte and osteoblast apoptosis and excessive bone deposition accompany failure of collagenase cleavage of collagen, J. Clin. Invest. 106, (2000) 941–949.
194. Zheng M.H., Bruining H.C., Cody S.H., Brankov B., Wood D.J., Papadimitrion J.M. A rapid method for the assessment of bone architecture by confocal microscope. În: Histochem J., vol. 29 (1997), p. 639-643.