melinte v. petru răzvan

RĂZVAN PETRU MELINTE

REZUMATUL

TEZEI DE DOCTORAT

CONTRIBUłII LA STUDIUL SEMNIFICAłIEI GEOMETRICE A

DISTRIBUłIEI TEMPOROSPAłIALE A

SISTEMELOR LAMELARE DIN COMPACTA OSULUI

Conducător ştiinŃific Prof. univ. dr. med. Gh. S. Drăgoi, MD, PhD

Membru titular al Academiei de ŞtiinŃe Medicale din România

2009

MINISTERUL EDUCATIEI, CERCETARII SI INOVARII UNIVERSITATEA DE MEDICINA SI FARMACIE DIN

CRAIOVA

COMISIA PENTRU EVALUAREA ŞI SUSłINEREA PUBLICĂ A TEZEI DE DOTORAT

A fost aprobată în Biroul de Senat al UniversităŃii de Medicină şi

Farmacie din Craiova în următoarea componenŃă Preşedintele Comisiei Conducătorul tezei de doctorat ReferenŃi oficiali

Prof. Univ. Dr. Ion Rogoveanu, Decan al FacultăŃii de Medicină Generală a UniversităŃii de Medicină şi Farmacie din Craiova Prof. Univ. Dr. Gheorghe S. Drăgoi Membru titular al Academiei de ŞtiinŃe Medicale din Craiova 1. Prof. Univ. Dr. Doina Onicescu, Membru titular al Academiei de ŞtiinŃe Medicale, Conducător de Doctorat la Universitatea de Medicină şi Farmacie „Carol Davila” Bucureşti

2. Prof. Univ. Dr. Elena Lazăr, Conducător de Doctorat la Universitatea de Medicină şi Farmacie „Victor Babeş” Timişoara

3. Prof. Univ. Dr. Virgiliu Niculescu, Membru titular al Academiei de ŞtiinŃe Medicale, Conducător de Doctorat la Universitatea de Medicină şi Farmacie „Victor Babeş” Timişoara

Rector,

Prof. Univ. dr. Adrian Săftoiu

1

SINTEZE ALE CERCETĂRILOR PERSONALE DIN TEZA DE DOCTORAT

I. INTRODUCERE.................................................................................................................3

A. MOTIVAłIA CERCETĂRII...........................................................................3

B. PROBLEMATICA ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRII................................4 II. MATERIALE ŞI METODE.............................................................................................6

A. MATERIALE STUDIATE...............................................................................6

B. METODE UTILIZATE....................................................................................6 1. Recoltarea Ńesutului şi fixarea........................................................................6

a. Fixatori................................................................................................7 b. Timpul de fixare...................................................................................8 c. Fixatori şi coloraŃii..............................................................................9

2. Decalcificarea Ńesutului osos..........................................................................9 3. Deshidratarea, clarificarea, infiltrarea şi includerea în parafină...............11 4. Metode de colorare a secŃiunilor obŃinute prin prelucrarea fragmentelor osoase.............................................................................................................12

5. Izolarea celulelor Stem mesenchimale din măduva osoasa..........................14 6. Imunofenotiparea celulelor Stem mesenchimale prin citometrie in flux.................................................................................................................15

7. Metode de caracterizare a celulelor osteoprogenitoare................................17 III. REZULTATELE OBSERVAłIILOR PERSONALE..................................................20

A. ANALIZA MICROANATOMICĂ A SISTEMELOR DE LAMELE OSOASE.............................................................................................................20 1. Analiza microanatomică a raporturilor între sistemele lamelare ale

osului prin examinare în lumină polarizată...........................................20 2. Analiza microanatomică a hotarelor osteonale......................................21 3. Analiza microanatomică a genezei osteoanelor în cadrul procesului de

remaniere a osului matur.........................................................................22 4. Analiza genezei corelative a sistemului osteonovascular.......................23

B. ANALIZA MORFOLOGICĂ, FUNCłIONALĂ ŞI FENOTIPICĂ A

CELULELOR OSTEOPROGENITOARE DIFERENłIATE DIN CELULE STEM MESENCHIMALE EXTRASE DIN ASPIRATUL DE MADUVĂ OSOASĂ..........................................................................................23 1. Diferentierea celulelor Stem mesenchimale la osteoblaste primare in vitro si evaluarea markerilor moleculari specifici ai acestora........................................................................................................23

2. Efectuarea de co-culturi celule stem-osteoblaste diferentiate (MSC:OB)...................................................................................................25

3. Cultivarea MSC:OB şi investigarea proliferării acestora, morfologiei, markerilor de diferentiere ai osteoblastelor si expresiei proteinelor din complexul de adeziune................................................................................27

2

IV. DISCUłIA REZULTATELOR PERSONALE.............................................................35 V. CONCLUZII.......................................................................................................................39 VI. IMAGISTICA...................................................................................................................42

A. ANALIZA RAPORTURILOR ÎNTRE SISTEMELE DE LAMELE OSOASE ŞI OSTEONICE PRIN EXAMINARE ÎN LUMINĂ POLARIZATĂ……….......…............................................................................43

B. ANALIZA MICROANATOMICĂ A HOTARELOR OSTEOANELOR.................................................................................................58

C. ANALIZA MICROANATOMICĂ A GENEZEI OSTEOANELOR ÎN OSUL MATUR..............................................................................................................64

VII. BIBLIOGRAFIE.............................................................................................................83

3

I. INTRODUCERE

Teza de doctorat este structurată pe două părŃi: o parte generală şi o parte

specială de cercetări personale. În partea generală am consemnat probleme legate de

particularităŃile biostructurale ale genezei şi diferenŃierii oaselor şi de anatomia

funŃională a sistemelor de lamele osoase. În partea specială sunt prezentate

motivaŃia, scopul şi obiectivele cercetării, rezultatele observaŃiilor personale,

discuŃia reultatelor şi concluziile.

A. MOTIVAłIA CERCETĂRII

Fenomenul de reînoire permanentă a osteoanelor, nominalizat ca proces de

remodelare, deŃine încă numeroase necunoscute. Multiple studii au evaluat

particularităŃile anatomotopografice ale „remodelării”: Podenphant şi Engel (1987)

au descris variaŃiile regionale ale remodelării osoase; există deasemenea o variaŃie a

activităŃii de remodelare la nivelul diferitelor suprafeŃe osoase (Steiniche şi Hauge,

2003). Se cunoaşte în plus că activitatea de remodelare a spongioasei osului este de

5-10 ori mai mare decât corticalei osului. Harttner, Epker şi Frost (1965) consideră

că remodelarea se manifestă ca o secvenŃă de evenimente desfăşurate prin

contribuŃia unei echipe de celule ce formează o „Unitate Osoasă Multicelulară”

(UOM sin.: BMU=bone multicellular unit) prin care se realizează două procese

contrarii: rezorbŃie osteoclastică localizată şi formare osteoblastică care sunt strâns

interconectate în timp şi spaŃiu. 30IB denumeşte frecvenŃa cu care o anumită zonă a

suprafeŃei structurilor osului (periostală, endostală, canaliculară haversiană şi

trabeculară) suferă remodelarea – „frecvenŃa de activitate”.

Deşi există numeroase date asupra rolului central al osteoclastelor în geneza

şi reglarea masei structurilor osului totuşi există puŃine informaŃii asupra rolului său

în remodelarea osului. Numeroase întrebări au rămas fără răspuns: osteoclastele au

capacitatea de a recunoaşte locurile pe care vor acŃiona?; selecŃia acestor locuri este

bine determinată sau are un caracter aleatoriu?

4

Factorii determinanŃi ai apariŃiei secvenŃiale a celulelor din cadrul „unităŃii

multicelulare a osului” – osteoclastele şi osteoblastele – constituie una din cele mai

mari enigme ale biologiei osului.

Natura precisă a interrelaŃiilor dintre osteoclaste şi osteoblaste este încă puŃin

cunoscută. Progresele înregistrate în cunoaşterea biologiei osului permit realizarea

unei imagini mai precise asupra bazelor morfologice ale recăderilor în patologia

osului – ca exemplu în poliartrite.

La dezvoltarea osului participă trei mecanisme de bază: creşterea

longitudinală, modelarea şi remodelarea. În timpul creşterii se realizează o adaptare

continuă a formei macroscopice a osului. SuprafeŃele structurilor osului suferă

procese de modelare prin apariŃia rezorbŃiei continue pe unele suprafeŃe şi formării

continue pe alte suprafeŃe. Se realizează în acest fel sculptura formei osului prin

adăugarea de material osos în unele zone şi îndepărtarea lui în altele. În remodelare

structurile osului se reînoiesc permanent în os de a lungul vieŃii. Remodelarea este

un fenomen ce are loc pe toate suprafeŃele structurilor osoase.

Remodelarea osului, la adult, realizează reînoire continuă a matricei osoase

la nivelul unor regiuni mici ale osului numite „unităŃi de remodelare”. În acest caz

osteoclastele şi osteoblastele îşi desfăŃoară activitatea lor pe acelaşi loc într-o

coordonare riguroasă.

Se remarcă cu uşurinŃă diferenŃa anatomică dintre modelare şi remodelare.

Modelarea structurilor osului se realizează prin activitatea osteoclastelor şi

osteoblastelor situate pe structuri anatomice diferite. Remodelarea are loc prin

activitatea succesivă a osteoclastelor şi osteoblastelor situate pe aceeaşi structură

anatomică a osului.

B. PROBLEMATICA ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRII

Progresele înregistrate în cunoaşterea structurilor funcŃionale ale compactei

şi spongioasei osului, prin utilizarea metodelor de imunohistochimie şi

histomorfometrie, obligă la redefinirea unor noŃiuni clasice pentru o mai bună

înŃelegere a genezei şi diferenŃierii temporospaŃiale a unităŃilor morfofuncŃionale ale

osului şi pentru a răspunde la multiplele întrebări ce îşi caută răspunsul:

5

- există diferenŃe structurale şi morfogeneratoare între osteonul primar şi

osteonul secundar?;

- care sunt raporturile morfofuncŃionale stabilite în ontogeneză între

procesele de osificare, vasculogeneză şi osteonogeneză?;

- ce criterii folosim pentru definiŃia morfofuncŃională a osului?;

- ce este o „suprafaŃă osoasă” şi cum participă ea la geneza, modelarea şi

remodelarea osului?;

- care este semnificaŃia microtopografică a lamelelor osteonului şi a

lacunelor osteocitare?;

- ce este osteoclastul; când, unde şi cum intervine în geneza, modelarea şi

remodelarea osului?;

- ce reprezintă, în fapt, aşa zisul „proces de remodelare a osului”?;

- procesul genezei şi diferenŃierii „Ńesutului osos” este un proces finit în

timp şi spaŃiu sau are loc permanent în dinamica ontogenezei?;

- de ce grupăm oasele după criteriul genezei lor în „oase diferenŃiate prin

osificare endoconjunctivă” şi în „oase diferenŃiate prin osificare

endocondrală” atâta timp cât Ńesutul conjunctiv embrionar

(„mezenchimul”) este multipotent în geneza structurilor osului?;

- Care este factorul comun al genezei şi dezvoltării oaselor în ontogeneză,

indiferent de tipurile de osificare primară şi secundară sau

endoconjunctivă şi endocondrală?;

- Când, cum şi cine determină geneza şi evoluŃia formei oaselor?;

- Se poate vorbi de o moarte programată a osteonului în condiŃiile

ortologiei?;

- Se pot cuantifica: rezorbŃia osteoclastică, apoziŃia osteoblastică şi viteza

de mineralizare a structurilor osului?;

- Cum putem evalua intensitatea remanierilor osului?;

În desfăşurarea cercetărilor noastre am luat în considerare următoarele

obiective:

1. Analiza raporturilor între sistemele lamelare ale osului;

2. Analiza microanatomică a hotarelor osteonale şi semnificaŃia lor în

evaluarea genezei şi evoluŃiei osteoanelor;

6

3. ContribuŃia elementelor neurovasculare în dezvoltarea structurilor

funcŃionale ale osului.

4. Analiza morfologiei şi evaluarea celulelor osteoprogenitoare diferenŃiate

din celule Stem provenite din măduva osoasă

II. MATERIALE ŞI METODE

A. MATERIALE STUDIATE

Pentru studiul microanatomic am utilizat fragmente de os recoltate din

diafiza corticalei tibiale de la cadavre de adult (15 cazuri) şi făt (7 cazuri) la Catedra

de Anatomia Omului a UniversităŃii de Medicină şi Farmacie din Craiova.

Studiul morfologiei si caracteristilor fenotipice ale celulelor

osteoprogenitoare diferenŃiate din celule Stem a reprezentat o etapă intermediară a

proiectului de cercetare CEEX intitulat „Mecanisme moleculare ale adeziunii

osteoblastelor diferentiate din celule stem si a explantelor de tesut osos la

biomateriale ortopedice” condus de Petrescu Ştefana la Institutul de Biochimie

Bucureşti, la care am fost participant din partea UniversităŃii de Medicină şi

Farmacie din Craiova. Prelevarea măduvei osoase a fost posibilă în cursul unor

intervenŃii chirurgicale ortopedice: artroplastia totală sau parŃială a articulaŃiei

coxofemurale şi artroplastia articulaŃiei genunchiului, în cursul cărora se pot recolta

capul şi colul femural în întregime, respectiv fragmente osoase plane din suprafeŃele

articulare femurală şi tibială ale articulaŃiei genunchiului; osteosinteza

centromedulară pentru fracturi de tibie sau pertrohanteriene etc.; ne-am îndreptat

atenŃia asupra artroplastiei articulaŃiei coxofemurale.

B. METODE UTILIZATE

1. Recoltarea Ńesutului şi fixarea

Fixarea este procesul chimic sau fizic prin care secŃiunile de Ńesut pot fi

vizualizate într-o manieră foarte apropiată de Ńesutul in vivo. Procedeele de fixare

7

histologică au derivat din multe alte domenii, cum ar fi industria de prelucrare a

pielii. Fixarea este singurul factor cel mai important în obŃinerea unei secŃiuni

adecvate examinării în microscopia fotonică. Procedeele de fixare trebuiesc

standardizate pentru a putea permite detectarea unor schimbări microanatomice

foarte fine prin simpla comparare a secŃiunilor fixate în mod similar. Când Ńesutul

este prelevat de la organismul gazdă, un bun fixator stopează autoliza (dizolvarea

celulelor prin digestia enzimatică intracelulară) şi putrefacŃia (distrugerea Ńesutului

sub acŃiunea bacteriilor) prin inactivarea enzimelor şi bacteriilor. Protejează

deasemenea Ńesutul de contractare şi umflare excesivă, şi nu dizolvă sau

distorsionează Ńesutul. AgenŃii de deshidratare şi clarificare pot distorsiona Ńesutul,

astfel că agentul de fixare ales, va proteja constituenŃii celulari, astfel ca ei să nu fie

alteraŃi sub acŃiunea acestor substanŃe chimice. Fixatorul trebuie deasemenea să

protejeze Ńesutul în cursul procesului de includere, ce presupune impregnarea

polimerului la o temperatură înaltă. Şi în fine, fixatorul trebuie să protejeze Ńesutul în

timpul secŃionării când există risc crescut de distrugere tisulară mecanică.

Înaintea recoltării, trebuiesc bine alese fixatorul, metodele de fixare,

substanŃele chimice, mediile de includere şi tehnicile de secŃionare.

a. Fixatori

Marea majoritate a tehnicilor medicale folosesc fixarea chimică în principal

dar adaugă şi fixarea fizică pentru a creşte rata fixării. Sunt mulŃi fixatori chimici,

fiecare cu avantajele şi dezavantajele sale. Fixatorii chimici încrucişaŃi (cum ar fi

formaldehida şi glutaraldehida) formează legături între proteine şi între proteine şi

acizii nucleici. Fixatorii chimici care deshidratează, cum ar fi etanolul, metanolul şi

acetona, îndepărtează apa liberă din Ńesuturi şi astfel precipită şi coagulează

proteinele. AlŃi fixatori chimici, cum ar fi acidul acetic şi acetatul de zinc, determină

modificări de ph sau de concentraŃie a sării şi astfel denaturează proteinele şi acizii

nucleici. AlŃi fixatori cum ar soluŃia alcoolică de formol, fixează prin metode de

deshidratare şi reacŃii încrucişate.

Multe tratate menŃionează etanolul 70% ca fiind fixatorul ideal pentru

păstrarea pe timp îndelungat a osului. Acesta nu înseamnă însă că mostra originală

este fixată iniŃial în această soluŃie. Alcoolul este rar folosit ca fixator iniŃial, şi

numai pentru anumite aplicaŃii histologice; de exemplu, alcool 70% este excelent

8

pentru fixarea frotiurilor citologice, exudatelor, şi aspiratelor cu ac fin. Osul trebuie

adecvat fixat în NBF sau în alt fixator şi apoi stocat în etanol 70%. Stocarea în

etanol se foloseşte pentru eliminarea efectelor decalcificării, ce apar frecvent în

urma depozitării prelungite în fixatori pe bază de formol.

Fixarea chimică poate fi îmbunătăŃită prin fixarea fizică, cum ar fi căldura.

Fixarea prin căldură se foloseşte pentru a precipita proteinele, făcându-le mai puŃin

solubile în apă. Căldura se foloseşte în general petru a accelera fixarea şi nu ca

metodă singulară. Difuziunea moleculelor creşte cu creşterea temperaturii, astfel că

penetrarea Ńesutului de un fixator creşte cu creşterea temperaturii.

Se cunoaşte faptul că anumiŃi aditivi (sucroza, dextran, detergent, calciu

clorat, tiocianat de potasiu, sulfat de amoniu) pot îmbunătăŃi fixarea în anumite

cazuri. Aceşti aditivi inhibă denaturarea prin reacŃia cu proteinele, fixatorul sau

componentele celulare.

ConcentraŃiile fixatorilor sunt deasemenea foarte importante. Acesta va fi

determinată de cost, solubilitate şi utilitate. De exemplu, o concentraŃie de formol

peste 10% determnă o duritate care nu este necesară, în timp ce etanolul cu o

concentraŃie sub 70% nu deshidratează satisfăcător. Osmolaritatea sau concentraŃia

ionică vor influenŃa deasemenea fixarea. SoluŃiile hipertone vor determina

deshidratare, în timp ce soluŃiile hipotone vor determina îmbibare. SoluŃiile

recomandate sunt cele uşor hipertone. Este esenŃial să se folosească o concentraŃie

ionică cât mai apropiată de valorile fiziologice.

b. Timpul de fixare

Este important de amintit că Ńesutul osos nedecalcificat este mult mai dens

decât Ńesutul moale, iar timpul de fixare trebuie ajustat corespunzător. Osul este un

material compus; o mostră poate conŃine os cortical, os trabecular şi măduvă osoasă.

De fapt, s-a demonstrat că timpul de fixare corespunzătoare a măduvei osoase, este

aproximativ acelaşi cu cel al Ńesutului moale normal. Pentru mostre ce conŃin os

trabecular şi măduvă osoasă, o regulă este penetrarea a 10 mm pe 24 ore la presiunea

normală şi temperatura camerei. O mostră cu os cortical va avea o rată a fixării mai

mică, estimată la aproximativ 2 mm pe 24 ore.

9

Câteva reguli generale ale utilizării oricărui fixator:

� Se folosesc cel puŃin 15-20 de volume de fixator pentru fiecare

volum de Ńesut;

� Nici un fixator nu va penetra mai mult de 2-3 mm de Ńesut solid sau

0,5 cm de Ńesut poros în 24 ore. Se lasă cel puŃin 1 săptămână pentru

fixarea adecvată a unui cub de 3-4 mm de Ńesut osos;

� Grosimea depinde de tipul Ńesutului, dar nici o mostră nu va fi mai

groasă de 4 mm pentru a permite o bună fixare; se preferă 3 mm;

� Se fixează la temperatura camerei dacă nu este specificat altfel.

Căldura va creşte rata fixării, dar va creşte deasemenea rata

autolizei. Creşterea temperaturii de la 25 la 37 grade Celsius poate

dubla rata fixării.

c. ColoraŃii utilizate

Multe coloraŃii sunt dependente de fixatori. Trebuie luat foarte bine în

considerare alegerea coloraŃiei şi a fixatorilor înainte de recoltare şi prelucrare.

Tabelul 4 arată o listă de diferite coloraŃii cu fixatorul recomandat fiecăruia şi

fixatorii ce trebuie evitaŃi.

2. Decalcificarea osului

Osul este unul dintre cele mai dure şi mai dense Ńesuturi. Pentru a obŃine

secŃiuni osoase acceptabile de 3-6 microni, se înconjoară şi infiltrează materialul cu

o substanŃă de o densitate relativ similară, creând astel o structură mai omogenă.

Pentru studiul mineralizării, se poate alege dintr-o gamă variată de răşini polimerice,

care formează un bloc compact cu duritate foarte apropiată de ce a osului. Deoarece

procedeul de includere la parafină este pe departe cea mai utilizată metodă

histologică de pregătire a secŃiunilor, au fost imaginate noi modalităŃi de prelucrare a

mostrelor de Ńesut osos pentru a face posibil studiul prin includere la parafină. În

consecinŃă, mostrele osoase trebuie să devină compatibile cu mediul de includere şi

cu aparatul de secŃionat utilizat. Deoarece parafina este semnificativ mai puŃin dură

decât majoritatea tipurilor de Ńesut osos, mostra osoasă trebuie tratată pentru a căpăta

aceeaşi duritate şi a permite secŃionarea. Acest tratament special poartă denumirea

de decalcificare.

10

CompoziŃia osoasă poate fi reprezentată de următoarea ecuaŃie:

Cristale de săruri anorganice (Calciu)+Matrix organic=Ńesut osos

O definiŃie simplificată ce provine atât din tratale clasice cât şi din articole

recente, descrie decalcificarea ca pe o îndepărtare a componentelor organice din

Ńesutul osos. În termeni mai tehnici, reprezintă disoluŃia complexului de

hidroxiapatită Ca10(PO4)6(OH)2 ce poate fi reprezentată de următoarea ecuaŃie:

Ca10(PO4)6(OH)2 + 8H+=10Ca+2+6HPO4

-2+2H2O

Odată cu îndepărtarea acestor săruri, procesul de decalcificare ajunge la

final. Punctul final al decalcificării este momentul în care întreg materialul

anorganic este îndepărtat din Ńesut, lăsând matrixul organic intact. Determinarea

precisă a acestui punct final al decalcificării este crucială pentru succesul tehnicilor

de colorare. Expunerea suplimentară la o soluŃie care este mai acidă decât matrixul

organic rămas, va determina după un anumit interval de timp extragerea

componentelor organice din Ńesut, în special din celule. Aceasta este o primă

legătură între colorarea slabă şi decalcificarea exagerată. Deoarece acizii mai

puternici decalcifică în timp mai scurt, există un risc crescut de decalcificare

exagerată, pentru că intervalul de timp în care procesul de decalcificare poate fi oprit

în vederea obŃinerii unor rezultate corecte, este mai scurt.

Există numeroase fluide decalcificatoare, după cum alegerea lor este

influenŃată de foarte mulŃi factori. ObŃinerea unei mostre osoase de o duritate

suficient de scăzută care să permită secŃionarea, nu este singurul deziderat.

Conceptul conform căruia decalcificare îndelungată este de preferat, nu se suprapune

peste conceptul de cea mai bună pregătire a Ńesutului osos în vederea colorării.

Calitatea colorării după decalcificare atât în protocoalele de rutină cât şi în cele

specializate, a devenit un factor de mare importanŃă în alegerea agentului de

decalcificare. Timpul adiŃional ca urmare a pasului decalcificării este adeseori

factorul major ce contribuie la obŃinerea unui Ńesut slab decalcificat. Literatura

prezintă numeroase protocoale de decalcificare cu tot atât de multe nivele de

complexitate şi acurateŃe. Principiile şi tehnica adecvată obŃinerii unor rezultate

conform cu scopul laboratorului în care se efectuează cercetările, derivă adesea din

experienŃă. AtenŃia la detalii şi aplicarea în practică a unor tehnici ce au dat

rezultate, sunt de mare folos în stabilirea unui protocol de decalcificare.

11

3. Deshidratarea, clarificarea, infiltrarea şi includerea în parafină

După tăiere, fixare şi decalcificare, mostrele trebuie complet deshidratate

pentru prelucrarea ulerioară ce include clarificarea, infiltrarea şi includerea în

parafină. Deoarece multe medii de includere nu sunt solubile cu apa, este necesară

îndepărtarea fixatorilor.

Cel mai comun agent de deshidratare utilizat este alcoolul (etanol). Prin

trecerea prin o serie de soluŃii de alcool de concentraŃii crescânde, ce variază de

obicei de la 70% la 95% sau chiar alcool absolut, se îndepărtează toată apa din

mostră. Mostrele trebuie să rămână în fiecare soluŃie de alcool până la saturarea

completă deoarece imersia bruscă în soluŃii de concentraŃii crescute de alcool poate

determina deshidratarea excesivă şi întărirea Ńesutului. Un protocol de deshidratare

este afişat în tabelul 5, aplicabil mostrelor osoase de aproximativ 3 mm grosime.

Se pot folosi deasemenea şi alŃi agenŃi de deshidratare, cum ar fi acetona şi

dioxanul (dietilen dioxid). Cu toate că ultimul agent de deshidratare, este solubilatât

în apă cât şi în parafină şi nu necesită aplicarea unui agent de clarificare, vaporii săi

sut extrem de toxici, şi nu permite o bună tăiere a secŃiunilor. Alcoolul şi alŃi agenŃi,

trebuie utilizaŃi întrr-un raport volumetric alcool:Ńesut, de cel puŃin 10:1. Pentru o

bună deshidratare, se recomandă agitarea.

Clarificarea este un proces prin care fluidul de deshidratare din mostră este

înlocuit cu o substanŃă care este miscibilă cu alcoolul şi cu mediul de includere.

Există mulŃi agenŃi de clarificare, dar cea mai mare parte a laboratoarelor se bazează

doar pe câŃiva, cum ar fi xilenul, toluenul sau benzenul. Fiecare agent de clarificare

are avantajele şi dezavantajele sale. Toluenul şi benzenul cauzează o întărire mai

mică decât xilenul. Xilenul este cel mai utilizat agent,dar trebuie amintit faptul că

xilenul are tendinŃa de a sfărâma majoritatea Ńesuturilor.

Parafina este disponibilă într-o gamă variată de puncte de topire ce variază

între 45 şi 60 de grade celsius şi în ultimii ani s-au folosit aditivi pentru a îmbunătăŃi

calităŃile de tăiere ale cerii, oferind astfel o adezivitate mai mare. Infiltrarea

mostrelor cu parafină înaintea includerii necesită câteva schimbări (în mod normal

infiltrare timp de 2 ore cu o schimbare de paraină proaspătă la o oră) de ceară

proaspătă în cuptor la 60 de grade C, până la îndepărtarea completă a agentului de

clarificare.

12

După infiltrare, mostra este inclusă prin imersia în parafină proaspă topită (la

5-10 grade C peste punctul său de topire) în mulaje de includere şi apoi răcită rapid

la aproximativ -5 grade C pe suprafaŃa rece a centrului de includere. Trebuie avut

grijă în asigurarea orientării corecte a suprafeŃei de tăiere, în interiorul blocului.

4. Metode de colorare a secŃiunilor obŃinute prin prelucrarea fragmentelor osoase

Pentru analiza histotopografică şi morfometrică a sistemelor lamelare

haversiene (osteoanelor) am utilizat secŃiuni seriate transversale prin corticala

diafizei tibiale de adult. Pentru studiul morfogenezei sistemelor lamelare s-au folosit

secŃiuni seriate longitudinale şi transversale prin osul tibia de făt.

Vizualizarea fasciculelor de lamele s-a realizat prin metode histochimice (van

Gieson, Gömöri, Mac Mannus), metode histofizice (lumină polarizată, contrast de

fază şi interferenŃială contrast), precum şi prin transformarea în 3D prin metoda

Emboss cu ajutorul soft-ului Lucia Net. Imaginile obŃinute cu microscopul de

cercetare Nikon Eclipse E-600 au fost achiziŃionate cu camera digitală DN100,

prelucrarea realizându-se cu ajutorul soft-ului licenŃiat Lucia Net.

Metode microanatomice şi histochimice utilizate în studiul sistemelor lamelare haversiene

Nr. crt.

Metoda Abrevieri Structura evidenŃiată Tipul de examinare

1. Hematoxilină-eozină

HE

Structura generală a Ńesuturilor

Microscopie fotonică

2. Picrofuxină Van Gieson

VG Fibre colagene Microscopie fotonică

3 Impregnare argentică Gomori

IAG Fibre de reticulină Microscopie fotonică

4 ReacŃie acid periodic Schiff

PAS Mucopolizaharide neutre Microscopie fotonică

13

A B

C D

Figura nr. 1. Metode de vizualizare utilizate în studiul anatomic al osului. SecŃiuni transversale prin fragmente de os (tibia) decalcificate, examinate în lumină directă (A, B), contrast de fază (C) şi lumină polarizată (D) pentru studiul formei, structurii şi topografiei sistemelor de lamele osteonice, lamele osoase circumferenŃiale şi lamele osoase interstiŃiale. Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN

100 ataşată microscopului fotonic de cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea

soft-ului Lucia Net. ColoraŃie PAS, Oc. 7, Ob: 4 (A); 10 (B, C) şi 20 (D). x28 (A), x70 (B, C), x140 (D).

14

5. Izolarea celulelor Stem mesenchimale din măduva osoasă

Izolarea celulelor stem mezenchimale a fost realizata avand ca sursa

biologica aspiratul de maduva osoasa umana de la pacienŃi cu artroplastie de şold.

Pentru izolarea celulelor stem mezenchimale (MSC) din aspirate de maduva osoasa

au fost testate trei metode diferite. Pe scurt, maduva osoasa a fost impartita in trei

fractii din care s-au izolat celule stem in mod diferit. Prima metoda a constat in

cultivarea masei celulare din maduva ca atare in mediu de cultura; a doua metoda a

presupus diluarea aspiratului osos cu solutie PBS, urmata de centrifugarea celulelor

si cultivarea sedimentului iar a treia metoda a constat in separarea suspensiei de

celule medulare pe ficol pentru o concentrare a celulelor mononucleare si separarea

lor de alte populatii celulare din proba prelevata.

Celulele au fost cultivate si pasate de doua ori pentru expansiune. La finalul

acestui interval au fost caracterizate prin citometrie in flux pentru evaluarea

fenotipului lor si dupa confirmarea acestuia au fost diferentiate in mediu osteogenic.

Pe parcursul diferentierii au fost prelevate probe la intervale de 1zi, 7 si 14 zile

pentru caracterizare cu ajutorul markerilor specifici.

Dupa 10 zile de la separarea MSC, s-a efectuat primul pasaj al acestora

pentru expansiune. La transferul celulelor s-a tinut cont ca acestea sa fie cultivate in

densitatea de 5000 de celule pe cm2. In figura 16 sunt prezentate celulele obtinute

prin fiecare din cele 3 metode.

a b c

Figura nr. 2: Celule stem mezenchimale obtinute prin a) cultivarea directa a

aspiratului de maduva osoasa, b) concentrarea celulelor din aspirat prin centrifugare

si c) separarea pe ficol a celulelor din maduva osoasa.

15

In urma utilizarii celor trei metode de separare am concluzionat ca separarea

pe ficol este cea care da randamentul cel mai bun din punct de vedere al numarului

de MSC izolate din aceeasi cantitate de maduva osoasa.

În concluzie, măduva osoasa prelevata de la pacienti a fost separata pe Ficoll

(Amersham) pentru izolarea fractiei care contine celule stem mezenchimale. Inelul

de celule obtinut a fost apoi cultivat in mediu αMEM (Sigma) suplimentat cu 15%

ser fetal bovin inactivat, 50 unitati/ml penicilina (Gibco), 50 mg/ml streptomicina

(Gibco), 1% L-glutamina (Gibco) si mentinute la 37oC in atmosfera cu 5% CO2.

Dupa 10 zile, celule stem mezenchimale aderate la suparafata vasului de cultura au

fost pasate pentru expansiune si cultivate in mediu αMEM suplimentat cu 10% ser

fetal in densitatea de 5000 de celule/cm2.

6. Imunofenotiparea celulelor Stem mesenchimale prin citometrie in flux

Caracterizarea fenotipului prin FACS. Dupa alte 10 zile de la primul pasaj

celulele au fost recoltate pentru expansiune (pasajul 2) iar o parte din ele au fost

retinute pentru imunofenotipare cu ajutorul citometrului in flux. Se cunosc o serie de

markeri de suprafata exprimati de celulele stem mezenchimale si care le diferentiaza

de celelalte populatii celulare din maduva osoasa. Desi inca nu exista un set de

markeri universal recunoscuti ca fiind exprimati specific numai de catre acestea,

majoritatea cercetatorilor considera CD14, 34, si 45 markeri negativi iar CD13, 29 si

90 ca markeri pozitivi pentru fenotipul caracteristic celulelor stem mezenchimale. Pe

acestia i-am folosit si noi impreuna cu un control negativ nemarcat cu anticorpi

cuplati cu fluorofori pentru a valida metoda de izolare utilizata, dupa cum se observa

in figura nr. 3.

16

Figura nr. 3: Imunofenotiparea celulelor stem mezenchimale aflate in pasajul 2 prin citometrie in flux. Dot plot-ul indica marimea (FCS) si structura (SSC) celulelor. Cu

verde este definit controlul negativ iar cu mov expresia fiecarui CD in parte.

Validarea fenotipului MSC prin citometrie in flux – tehnica de lucru.

Celulele au fost desprinse de pe suprafata vaselor de cultura, spalate in solutie

tampon pentru FACS (ser fetal 2% in PBS) si apoi marcate timp de 30 de minute la

4°C cu anticorpi anti-CD13, 14, 29, 34, 45, 90 conjugati cu ficoeritrina (PE).

Probele au fixate in PFA 1% 20 de minute, spalate si resuspendate in solutie tampon

pentru FACS. Suspensia celulara astfel obtinuta a fost analizata la citometrul in flux

FACSCalibur (BD Biosciences) urmarind parametrii FSC/SSC si fluorescenta pe

canalul FL2. Cu ajutorul portilor au fost excluse celulele moarte iar expresia

markerilor specifici a fost evaluata ca intensitate medie a fluorescentei cu ajutorul

soft-ului CellQuest Pro (Institutul de Biochimie Bucureşti). Au fost achizitionate

10000 de celule pentru fiecare proba.

Diferentierea celulelor stem mezenchimale pentru obtinerea osteoblastelor

– tehnica de lucru. Pentru obtinerea de osteoblaste celulele stem aflate in pasajul 2

au fost cultivate in mediu osteogenic constand in mediu complet αMEM la care s-a

adaugat factorii de diferentiere acid ascorbic 82µg/ml, dexametazona 100nM si beta-

glicerofosfat10mM.

17

7. Metode de caracterizare a celulelor osteoprogenitoare

Diferentierea si confirmarea fenotipului osteoblastelor cu markeri specifici –

principiul metodei. Celulele stem mezenchimale aflate in pasajul doi au fost utilizate

pentru obtinerea de osteoblaste prin diferentiere in mediu osteogenic. Dupa 28 de

zile de la cultivarea in mediu cu dexametazona celulele au fost testate pentru

activitatea fosfatazei alcaline, enzima exprimata la nivele crescute in osteoblaste si

mai slab in MSC. De asemenea, am testat formarea centrilor de mineralizare in

monostratul confluent celular. Experimentele au fost efectuate in paralel pe celule

stem mezenchimale, osteoblaste diferentiate si fibroblaste dermale drept control

negativ, intrucat acestea nu apartin aceluiasi lineaj celular ca celulele studiate.

Pentru evidentierea fosfatazei alcaline active s-a folosit NBT-BCIP, substrat

specific al enzimei, care da o reactie de culoare. Astfel, celulele ce exprima ALP

activa se coloreaza in mov inchis, dupa cum se observa in figura nr. 4. Celulele

diferentiate sunt colorate intens cu NBT-BCIP, MSC prezinta o expresie bazala a

ALP, iar fibroblastele dermale deloc.

a b c

Figura nr. 4: Evidentierea activitatii fosfatazei alcaline in osteoblaste obtinute prin

diferentierea celulelor stem. a) Fibroblaste dermale, b) MSC si c) osteoblaste

diferentiate de la MSC P2 au fost marcate cu NBT-BCIP.

Prin diferentierea MSC se obtine un monostrat confluent de celule cu

proprietati de mineralizare. Am testat acest comportament al celulelor diferentiate

prin colorare cu Alizarin Red S, un colorant ce leaga specific calciul din tesuturi.

Dupa cum se observa din figura nr. 5, acesta coloreaza in mod evident celulele

diferentiate in proportie mai mare decat celulele stem de la care s-a pornit, ceea ce

18

demonstreaza ca osteoblastele obtinute sunt capabile sa formeze o structura de tip

tesut osos mineralizat.

a b c

Figura nr. 5: Prezenta centrelor de mineralizare in osteoblastele diferentiate de la

celule stem mezenchimale. A) Fibroblaste dermale, b) MSC si c) osteoblaste

diferentiate de la MSC P2 au fost marcate cu Alizarin Red care recunoaste specific

ionii de Ca2+.

Vizualizarea celulelor s-a realizat cu ajutorul unui microscop Nikon Eclipse

TS100 iar fotografiile s-au facut cu un aparat Nikon Digital Light DS-SM la

Institutul de Biochimie din Bucureşti. Pozele au fost preluate cu ajutorul

programului LuciaNet si prelucrate cu ajutorul Adobe Photoshop 7.0.1.

În continuare, am efectuat teste de viabilitate celulara, morfologie si

adeziune a celulelor osteoprogenitoare ulterior atasarii acestora la materiale utilizate

în chirurgia ortopedică: filmelor de biosticla depuse pe titan prin PLD si a filmelor

de HA depuse pe cuart prin MS.

In urma acestor studii s-au pus in evidenta efectele diferite ale interactiei

celulelor osteoprogenitoare cu doua tipuri de materiale. Biosticla 6P61 depusa in

film subtire pe titan nu este compatibila cu o aderare optima a celulelor cu scaderea

concomitenta a viabilitatii lor. In schimb, hidroxiapatita depusa pe cuart s-a dovedit

a fi optima interactiei cu celulele diferentiate promovand aderarea acestora,

intinderea lor pe suprafata materialului si viabilitatea lor comparativa cu cea a

celulelor crescute pe suport standard.

Testarea probelor a presupus: autoclavarea probelor, determinarea viabilităŃii

celulelor prin citometrie în flux, analiza in microscopie electronică de baleiaj şi

testarea adeziunii.

19

Autoclavare: Probele se dispun in vase Petri de sticla, se impacheteaza in

hartie si se autoclaveaza (sterilizare umeda la 121.1oC timp de 30 minute) in

aparatul Falcon 30 Autoclave (LTE Scientific).

Determinarea viabilitatii celulelor prin citometrie in flux: Celulele au fost

desprinse de pe suprafata probelor cu 500 µL de tripsina (Gibco), la care apoi s-au

adaugat 500 µL de mediu. Probele au fost centrifugate la 2000rpm 5 minute la 4°C

si resuspendate in 200 µL de PBS. Suspensia celulara astfel obtinuta a fost analizata

la citometrul in flux FACSCalibur (BD Biosciences) urmarind parametrii FSC/SSC.

Cu ajutorul portilor au fost excluse celulele moarte iar procentul de celule viabile a

fost determinat cu soft-ul Cell Quest Pro. Au fost achizitionate 10000 de celule

pentru fiecare proba.

Microscopie electronica de baleiaj (SEM): Probele au fost incubate cu

suspensii de celule osteoprogenitoare timp de 1h in mediu cu Dex. Apoi au fost

fixate 20 de minute cu 4% PFA la temperatura camerei, spalate de 3 ori in solutie

PBS si deshidratate prin imersare de 2 ori cate 15 minute in etanol 70%, 90% si

100%. Probele au fost apoi uscate in aer si conservate la 4°C pana in momentul

metalizarii pentru analiza SEM.

Adeziune: Replici ale probelor preparate pentru analiza SEM au fost testate

prin microscopie de fluorescenta din punct de vedere al atasarii initiale a celulelor la

suport cu ajutorul markerilor de adeziune. Dupa o ora de la cultivarea cu celule

osteoprogenitoare, probele testate impreuna cu standardul au fost spalate cu PBS

pentru indepartarea celulelor ne atasate. Celulele osteoprogenitoare aderate au fost

fixate cu solutie de PFA 4% 20 de minute la temperatura camerei. Dupa fixare,

celulele au fost permeabilizate cu Triton-X-100 0,2% 3 minute si apoi marcate cu

anticorpi primari anti-vinculina 30 de minute. Dupa indepartarea excesului de

anticorpi necuplati la moleculele de adeziune, celulele au fost incubate cu o solutie

continand anticorpul secundar conjugat cu AlexaFluor 488 si faloidina conjugata cu

Alexa Fluor 594 care leaga specific filamentele de actina. Dupa 20 de minute

celulele au fost spalate si apoi montate pe lame de fluorescenta pentru vizualizare la

microscop. Vizualizarea celulelor s-a realizat cu ajutorul unui microscop Nikon

Eclipse E600W iar fotografiile s-au facut cu un aparat Nikon Digital Light DS-SM.

20

Pozele au fost preluate cu ajutorul programului LuciaNet si prelucrate cu ajutorul

Adobe Photoshop 7.0.1.

III. REZULTATELE OBSERVAłIILOR PERSONALE

A. ANALIZA MICROANATOMICĂ A SISTEMELOR DE LAMELE

OSOASE

1. Analiza microanatomică a raporturilor între sistemele lamelare ale

osului prin examinare în lumină polarizată

Din analiza secŃiunilor seriate transversale efectuate prin fragmente

decalcificate, din osul tibia, examinate în lumină polarizată am remarcat existenŃa a

trei zone microtopografice: o zonă cu lamele osoase circumferenŃiale interne, o zonă

cu lamele osoase interstiŃiale şi o zonă cu lamele osoase circumferenŃiale externe.

Toate zonele sunt presărate cu osteoni a căror abundenŃă este variabilă cu zona luată

în consideraŃie. Densitatea cea mai mare de osteoni a fost remarcată în zona

intermediară (Planşa nr. 1).

La examinarea cu obiectivele 4, 10 şi 20 am constatat heterogenitate a formei

şi structurii osteoanelor determinată de variabilitatea distribuŃiei spaŃiale a

fasciculelor de lamele osoase şi osteonale (Planşele nr. 2-14):

- gruparea osteoanelor în perechi solidarizate prin „lamele osoase

interstiŃiale” (Planşele nr. 2; 4; 10, B);

- canalul central al osteoanelor diferă de la un osteon la altul prin forma şi

dimensiunile sale (Planşele nr. 3, A şi B; Figura nr. 4 A);

- lamelele osteonice descriu pe alocuri elipse deschise la una din

extremităŃi prin care canalul central comunică cu spaŃii cilindrice

limitrofe (Planşa nr. 4, A) sau cu canale centrale ale osteoanelor

învecinate (Planşele nr. 4 şi 6);

- participarea lamelelor osoase interstiŃiale la organizarea de unităŃi

structurale semilunare care contribuie la delimitarea de canale centrale

ale unor sisteme haversiene (Planşele nr. 4, A; 7, A; 13, A);

21

- existenŃa unor raporturi de continuitate între lamele osoase interstiŃiale şi

lamelele osteonale (Planşele nr. 4, B; 7, A; 9, B);

- identificarea de triplete osteonale care pe alocuri comunică cu un canal

perforant Volkman (Planşele nr. 5, A; 7, 8);

- prezenŃa de perechi osteonale pe traiectul fasciculelor de lamele

osteonale cicumferenŃiale interne (Planşele nr. 1, 6, 8);

- raporturi tangenŃiale sau secante ale lamelelor osteonale care adesea sunt

prezente pe plane diferite (Planşele nr. 7, A; 9, 10);

- participarea lamelelor osoase interstiŃiale la realizarea raporturilor de

contiguitate şi de continuitate între osteonii grupaŃi în dublete sau

triplete (Planşele nr. 9, 10);

- neoformare de osteoni în compacta osului în cadrul procesului de

remodelare a osului matur (Planşa nr. 11);

- distribuŃia biplanară a lamelelor osteonale cu realizarea imaginii de

pâlnie în osul remodelat (Planşele nr. 13, A, B; 14, A, B).

2. Analiza microanatomică a hotarelor osteonale

Examinarea în lumină polarizată a secŃiunilor prin osul decalcificat ne

permite doar intuirea hotarelor osteoanelor fără a oferi limita de certitudine a

circumferinŃei unui osteon (Planşa nr. 15, A). Prelucrarea acestor secŃiuni prin

metode histochimice – PAS, Gomori şi Van Gieson – oferă rigurozitatea vizualizării

graniŃelor osteonilor (Planşele nr. 15, B; 16, 17). Această graniŃă a fost nominalizată

ca „linea cementalis”. Pe secŃiunile de impregnare argentică Gomori linea

cementalis apare vizibilă ca un spaŃiu clar la periferia osteoanelor (Planşa nr. 15, B).

Examinarea secŃiunilor seriate colorate prin metoda PAS ne-a permis identificarea în

„spaŃiul clar” periosteonal (linea cementalis) a glicozaminoglicanilor prin tratare cu

Acid Periodic Schiff (PAS) (Planşa nr. 17, A, B).

Certitudinea graniŃei osteonului (linea cementalis) ca reper folosit în

determinările de morfometrie este oferită de examinarea secŃiunilor în lumină

interferenŃială sau transformarea imaginilor standard în sistemul 3D prin metoda

EMBOSS (Planşa nr. 18, B). Aceste aspecte pot fi evidenŃiate atât pentru osteonii

din compacta osului cât şi osteonii din spongioasa osului (Planşa nr. 19, A, B).

22

3. Analiza microanatomică a genezei osteoanelor în cadrul procesului de

remaniere a osului matur

În continuarea cercetării am analizat, pe secŃiunile transversale seriate,

microanatomia topografică a structurilor nou apărute în teritoriile osteonale şi/sau

interosteonale a căror evaluare ne-a determinat să le considerăm ca efecte ale

procesului de remaniere a osului matur.

Analiza comparativă a secŃiunilor colorate cu Hematoxilină Eosină, PAS,

impregnare argentică Gomori şi examinate în contrast de fază, lumină polarizată sau

prin transformarea în 3D prin metoda Emboss am remarcat următoarele aspecte:

- variabilitatea diametrelor canalelor centrale osteonale (Planşele nr. 21,

A, B; 23, B; 26, A, B; 28, A, B – 30, A, B; 32, A, B; 33, A, B);

- modificări ale formei şi structurii circumferinŃei canalului central prin

apariŃia unor elemente de remodelare şi geneză a unui nou osteon –

„linia de rezorbŃie”; o zonă de Ńesut osos în curs de mineralizare şi a unui

lizereu preosos (Planşele nr. 21, A şi 22, A, B); la examinarea cu

obiectivul 10 se remarcă conservarea hotarelor osteonului, supus

procesului de remodelare, prin prezenŃa intactă a „liniei cementalis”

(Planşele nr. 21, A; 22, A, B); la examinarea cu obiectivele 20 şi 40 am

identificat elementele care participă la construirea unui nou osteon în

cadrul proceselor de remaniere – remodelare, localizat la periferia

sistemului haversian secundar (Planşele nr. 22, B; 24, A, B) sau în zona

pericentrală (Planşa nr. 23, A, B); pe secŃiunile de impregnare argentică

se remarcă ondularea pronunŃată a „liniei cementalis” a osteonului

secundar şi existenŃa „liniei de rezorbŃie” sub forma unui spaŃiu clar,

circumferenŃial (Planşele nr. 24, A, B şi 25, A; 27, A, B; 28, A; 29); la

examinarea acestor secŃiuni în lumină polarizată apar fascicule colagene

slab birefringente central faŃă de „linia de rezorbŃie” şi fascicule de fibre

colagene centrifug faŃă de această linie (Planşa nr. 25, B).

- „linia de rezorbŃie” devine mai evidentă prin transformarea în 3D prin

metoda Emboss a secŃiunilor standard (Planşele nr. 26, B; 28, B);

- intersecŃii ale două sau trei sisteme haversiene (Planşele nr. 30 şi 31);

23

- reuniuni ale osteonilor în dublete, triplete sau qvadruplete (Planşa nr.

32, A, B);

- osteoni diferenŃiaŃi în plin perete al osteonului secundar (Planşa nr. 33,

A, B);

- orientarea biplanară a osteonilor (Planşa nr. 34, A, B).

4. Analiza genezei corelative a sistemului osteonovascular

Studiul secŃiunilor transversale şi longitudinale prin osul tibia de făt (8 luni

de viaŃă antepartum) ne-a permis observarea şi consemnarea următoarelor aspecte

anatomodescriptive şi topografice:

- neovasculogeneză asociată cu diferenŃierea fasciculelor colagene cu

distribuŃie perivasculară (Planşa nr. 35, C, D);

- săparea de tunele conoide orientate cu baza înspre periost (Planşa nr.

35, A, B);

- trasee longitudinale ale structurilor vasculare (Planşa nr. 36, A, B);

- diferenŃierea centripetă a fasciculelor colagene din structura peretelui

osteonului (Planşa nr. 37, A, B).

B. ANALIZA MORFOLOGICĂ, FUNCłIONALĂ ŞI FENOTIPICĂ A

CELULELOR OSTEOPROGENITOARE DIFERENłIATE DIN CELULE

STEM MESENCHIMALE EXTRASE DIN ASPIRATUL DE MADUVĂ

OSOASĂ

1. Diferentierea celulelor Stem mesenchimale la osteoblaste primare in

vitro si evaluarea markerilor moleculari specifici ai acestora

Într-o primă etapă am evalulat diferentierea celulelor Stem mesenchimale

(MSC) la osteoblaste primare in vitro, conform protocolului pus la punct in cadrul

proiectului de cercetare efectuat in colaborare cu Institutul de Biochimie din

Bucureşti si am investigat markerii moleculari specifici ai acestora: fosfataza

alcalina, colagen, BSP, osteocalcina, osteonectina, CD29.

Markerul definitoriu al lineajului osteoblastic este activitatea fosfatazei

alcaline. Aceasta poate fi testata prin mai multe metode dar noi am ales-o pe cea

prezentată la capitolul Materiale şi Metode. Astfel, dupa cultivarea celulelor osoase

pe suprafata biomaterialelor, am fixat preparatele si le-am incubat cu o solutie de

24

substrat al fosfatazei alcaline ELF 97 care devine fluorescent dupa activitatea de

clivare a gruparii fosfat a enzimei.

CTRL HATi HAQ

Figura nr. 6: Activitatea fosfatazei alcaline exprimate de celule osoase

dupa cultivarea pe suprafata materialelor testate versus standard

Osteoblastele sunt celule care secreta colagen de tip I si exprima proteine

ca osteocalcina, osteonectina, osteopontina, si BSP (bone sialoprotein). In cadrul

studiului nostru am testat expresia si localizarea unora dintre acestea in osteoblastele

primare diferentiate din MSC (figura nr. 7).

Figura nr. 7: Testarea expresiei markerilor lineajului osteoblastic prin

imunofluorescenta

Dupa cum se observa in figura de mai sus, osteoblastele obtinute in vitro

exprima osteocalcina, proteina din matricea extracelulara care are proprietatea de a

lega calciul si a participa la formarea matricei mineralizate. De asemenea, ele

exprima si osteonectina si sialoproteina osoasa cu localizarea preponderent

intracitoplasmatica. Aceste experimente demonstreaza ca celulele osoase obtinute

sunt functionale si au fenotipul asteptat.

OC BSP ON

25

Formarea de tesut osos mineralizat a fost observata in vasul de cultura dupa

diferentierea timp de o luna a celulelor si dupa atingerea confluentei totale a

monostratului celular.

2. Efectuarea de co-culturi celule stem-osteoblaste diferentiate (MSC:OB)

Intr-o a doua etapă am efectuat co-culturi celule stem-osteoblaste diferentiate

(MSC:OB) pentru a determina raportul optim de cultivare in scopul acoperirii

suprafetelor biomaterialelor, proliferarii celulare intr-un timp potrivit utilizarii lor in

clinica

Pentru folosirea biomaterialelor in clinica in aplicatii de implantologie, una

din variantele de terapie pe care le consideram, este acoperirea in prealabil a

suprafetei implantului cu celule stem sau celule osoase autologe obtinute in vitro de

la acestea. Se stie faptul ca celulele stem mezenchimale sunt de asemenea precursori

ai altor tipuri celulare decat osteoblastul. Ele se pot diferentia si in condrocite,

adipocite dar s-a observat si o transdiferentiere la celule neuronale sau hepatice care

sunt inca sub investigare. De asemenea, se stie ca celulele stem au un potential

proliferativ mai mare decat celulele diferentiate ele permitand obtinerea in timp util

a unei suprafete active a implantului potrivita interventiei chirurgicale. Aceste doua

premise si nu numai ne-au determinat sa alegem alternativa co-culturii celule stem-

osteoblaste primare.

Am ales sa marcam fluorescent diferit cele doua populatii celulare inainte

de a le insamanta pe suprafata materialelor. Pentru o astfel de abordare a trebuit sa

testam mai intai rezistenta emisiei fluorescente in timp. Am marcat celulele stem cu

Vybrant DiO care emite lumina fluorescenta verde si celulele diferentiate cu

Vybrant DiI care emite lumina fluorescenta rosie. Dupa marcarea celulelor in

suspensie acestea au fost insamantate in raport egal pe material standard si urmarite

timp de doua saptamani pentru a observa modificarea fluorescentei si distributia

celulelor.

Prima observatie a fost ca acesti coloranti pot fi utilizati pentru cultivarea

celulelor pe termen lung, ei ajutand la identificarea celulelor stem si a osteoblastelor

dupa amestecarea lor in raport egal. Astfel se poate urmari proliferarea celulara

26

(creste numarul celulelor de o anumita culoare), distributia celulelor pe suprafata

(uniforma sau in anumite zona) si formarea de agregate de celule de un anumit tip

(aglomerari de celule care emit aceeasi fluorescenta). Osteoblastul si celula stem

adulta s-au apropiat la nivelul membranelor plasmatice unde cei doi coloranti

colocalizeaza (formeaza culoarea galbena). Acest fapt se poate explica in doua

moduri: fie celulele ale caror membrane au fost colorate diferit tind sa faca schimb

de portiuni de membrana la zona de tangenta dintre ele; fie suntem martorii unui

fenomen de fuziune celulara in care cele doua celule se unesc formand o celula

hibrid.

Figura nr. 8: Co-cultura MSC:OB in raporturile de 1:2, 2:1 si 3:1 timp de 7 zile

Pentru a identifica raportul optim de cultivare a celulelor stem si a celulelor

diferentiate am testat mai multe variante: celule stem-osteoblaste 1:2, 2:1 si 3:1.

Co-cultura MSC:OB 7 zile

12.3

38.1

32.94.2

6.3

3.9

2

5.7

6.7

0

10

20

30

40

50

60

1:2 2:1 3:1

Raporturi de insamantare MSC:OB

Numar de celule/camp 10X

Fuzionate

OB

MSC

27

Toate variantele au fost analizate in duplicat pentru ca rezultatele sa fie

semnificative statistic. Dupa sapte zile de la marcare si cultivare celulele au fost

observate la microscop, s-au pozat cinci cadre la fiecare raport, in duplicat. Au fost

numarate celulele stem, osteoblastele si cele marcate in ambele culori („fuzionate”).

Rezultatele sunt prezentate ca medie aritmetica in diagrama de mai sus si poze

reprezentative pentru fiecare tip de cultura au fost asociate.

Am constatat ca o proportie mai mare de celule stem asigura o proliferarea

mai buna a celulelor pe suprafata. De asemenea, numarul de celule fuzionate creste

odata cu cresterea numarului de celule stem insamantate ceea ce inseamna ca acestea

sunt responsabile de posibila fuziune spontana sau schimb de membrane intre cele

doua tipuri celulare. Dar proliferarea nu mai creste deoarece suprafata avuta la

dispozitie este mai mica. Astfel, considerente aratate mai sus au dus la alegerea

raportului de 2:1 celule stem: celule diferentiate pentru cultivarea tuturor probelor

din loturile avute in studiu.

3. Cultivarea MSC:OB şi investigarea proliferării acestora, morfologiei,

markerilor de diferentiere ai osteoblastelor si expresiei proteinelor din complexul

de adeziune

Am trecut la cultivarea celulelor MSC:OB in raportul optim de 2:1 pe

suprafata materialelor in prezenta de factori de diferentiere (dex) pentru a investiga

proliferarea acestora, morfologia, markerii de diferentiere ai osteoblastelor si

expresia proteinelor din complexul de adeziune. Am marcat celulele fluorescent, le-

am insamantat pe suprafata biomaterialelor si standardului si am oprit cultura la 1 zi,

4 si 7 zile pentru a evalua morfologia şi interactia celulelor cu materialul dar si

adeziunea cu ajutorul faloidinei, pe care am adagat-o dupa fixarea celulelor.

Astfel, in prima zi de la cultivare, celulele au preponderent forma rotunda

sustinuta de distributia radiala si in cercuri concentrice a filamentelor de actina ale

citoscheletului. Markerii fluorescenti DiO si DiI se pot observa atat la periferia

celulei dar si in traficul lor spre zona perinucleara, unde se vor localiza la intervalele

urmatoare de timp. Spre deosebire de proba control, hidroxiapatita determina

generarea de dendrite lungi multiple care pornesc in explorarea micromediului

inconjurator. In timp ce pe HAQ acestea sunt mai scurte si dense, HA depusa PLD

28

determina aparitia unor prelungiri foarte lungi ce persista pe termen lung si pot fi

observate si la 7 zile. La 4 zile se observa ca celulele stem (verzi) capata morfologia

fusiforma caracteristica iar osteoblastele (rosii) au forma poligonala. Interactia dintre

acestea este evidenta de la 4 zile, ducand uneori la fuziune/colocalizare de markeri

membranari.

In cazul probelor PLD se observa la 7 zile ca fibrele de actina nu au o

distributie perfect ordonata paralela dar sustin adeziunea celulara si dezvoltarea

dendritelor lungi. In schimb, in cazul standardului si pobelor HAQ, actina este foarte

bine definita si filamentele paralele traverseaza celula de-a lungul axei principale si

participa la intinderea celulelor pe supafata substratului.

Atat markerii moleculari de diferentiere ai osteoblastelor cat si proteinele

din complexul de adeziune au fost investigati la sapte zile de la cultivare. In aceste

doua cazuri celulele au fost cultivate nemarcate pentru a putea adauga anticorpi

fluorescenti dupa oprirea cultivarii. S-au testat markerii osteoblastici colagen I,

osteocalcina, BSP si osteonectina.

Experimentele de imunofluorescenta prezentate mai jos au demonstrat ca

osteoblastele diferentiate in vitro exprima markerii caracteristici lineajului osos cand

sunt cultivate pe HA ca si pe substrat standard. In plus a fost investigata si expresia

proteinei nucleare Ki67 care indica celulele proliferante la momentul analizarii

celulelor. Osteocalcina este secretata masiv de celulele osoase si ea se poate observa

atat intracelular dar mai ales in jurul celulelor unde participa la formarea matricei

osoase mineralizate.

Colagenul de tip I poate fi observat intracelular in timpul traficului sau spre

membrana celulara unde formeaza fibre ale matricei extracelulare. Proteina BSP are

o localizare perinucleara iar osteonectina apare in toata citoplasma si prelungirile

dendritice ale membranei.

29

1zi 4 zile 7 zile

Ctrl

HAQ

HATi

Figura nr. 9: Imagini de microscopie de fluorescenta a osteoblastelor

diferentiate din celule stem la pasajul 2 pe HA.

30

BSP OC DAPI

COL I Ki67 DAPI

ON


diferentiate pe material standard care evidentiaza expresia markerilor osteocalcina,

BSP, osteonectina si colagen tip I la sapte zile dupa cultivare

In cazul materialului standard se poate observa expresia tuturor markerilor

testati si se poate vedea activitatea proliferativa a uneia din cele sase celule din

imaginea suprapusa de la figura 24 ColagenI/Ki67. Nucleul celulelor a fost colorat

cu DAPI. Hidroxiapatita depusa prin PLD sau MS este autofluorescenta ceea ce

ingreuneaza punerea in evidenta a expresiei markerilor si localizarea acestora.

Cu toate acestea pentru HA depusa PLD am putut pune in evidenta expresia

colagenului si a osteonectinei dar pe fundalul granulelor autofluorescente de

material. De asemenea, se poate observa o activitate proliferativa crescuta cu

ajutorul markerului Ki67.

31

COL I Ki67 DAPI

ON


diferentiate pe HATi care evidentiaza expresia markerilor osteonectina si colagen tip

I la sapte zile dupa cultivare

BSP OC DAPI

ON


diferentiate pe HAQ care evidentiaza expresia markerilor osteocalcina, BSP si

osteonectina si la sapte zile dupa cultivare

32

Pentru probele HAQ s-a reusit evidentierea expresiei BSP, a osteocalcinei

si osteonectinei, dupa cum se observa in figura de mai sus. Acest experiment este

intarit de rezultatele obtinute pe celule marcate cu colorantii Vybrant si prezentat

mai sus, in care se evidentiaza activitatea fosfatazei alcaline pentru ambele tipuri de

depuneri. Mecanismul de adeziune al celulelor la HA a fost testat prin studierea

localizarii intracelulare a proteinelor din complexul de adeziune: filamente de actina,

vinculina, FAK si inegrina beta 1. Interactia osteoblastelor cu materialele testate s-a

studiat prin marcarea fluorescenta a celulelor pentru a pune in evidenta morfologia

filamentelor de actina si colocalizarea partiala a acestora cu moleculele din

complexul de adeziune in punctele de contact cu materialul.

A

B

C

Figura nr. 13 : Imagini de microscopie de fluorescenta a celulelor cultivate 7 zile pe

material standard: actina/CD29 (A), actina/FAK (B) si actina/vinculina (C).

Dupa cum se observa in figura de mai sus, pe substratul standard actina este

organizata in filamentele dispuse paralel sau radial pornind din zona perinucleara

33

spre periferie pentru a sustine prelungirile membranei plasmatice (filopodiile). Ea

colocalizeaza partial in zona submembranara cu integrina beta 1/CD29, vinculina si

FAK. In cazul probelor depuse prin PLD, integrina beta 1 si vinculina continua sa

colocalizeze partial cu capetele periferice ale filamentelor de actina, dupa cum s-a

observat si in experimentele efectuate pana in prezent in cadrul proiectului. Insa

integrina apare punctat si in alte zone in citoplasma si nu numai ca terminatie a

actinei. Ea mai este observata si la nivelul lamelipodiilor unde se localizeaza

preponderent tot ca structuri punctiforme. De asemenea, FAK are o expresie scazuta

si se mentine in zona perinucleara dar si in filopodii, in zonele de maxima adeziune

celulara. Acest lucru poate afecta stabilitatea pe termen lung a interactiei celule

osoase-HA. In schimb, vinculina are o expresie crescuta si apare ca linii ingrosate la

periferia celulelor, chiar si a celor aflate in adeziune, care au forma rotunjita.

Aceasta ar putea compensa semnalul slab primit prin intermediul integrinelor care ar

putea fi ameliorat prin acoperirea materialului cu proteine din matricea extracelulara.

A

B

C

Figura nr. 14: Imagini de microscopie de fluorescenta a celulelor cultivate 7 zile pe

HA-Ti (PLD): actina/CD29 (A), actina/FAK (B) si actina/vinculina (C).

34

Celulele crescute pe suprafata probelor HAQ prezinta localizari

intracelulare ale proteinelor din complexul de adeziune comparative cu cele

observate pe standard. In cazul acesta apar dendrite celulare lungi in care se

localizeaza preponderent FAK. Filamnetele de actina sunt foarte bine definite si

strabat citoplasma de-a lungul axului central celular colocalizand la periferie cu

integrina, vinculina si FAK.

A

B

C

Figura nr. 15: Imagini de microscopie de fluorescenta a celulelor cultivate 7 zile pe

HAQ (MS): actina/CD29 (A), actina/FAK (B) si actina/vinculina (C).

Deci, din punct de vedere al mecanismului de adeziune, putem concluziona

ca nu depinde atat de structura chimica a substratului (hidroxiapatita) ci mai degraba

de nanostructura filmului rezultat care poate sa stimuleze variat integrinele,

proteinele membranare ce fac legatura cu actina si influenteaza adeziunea, migrarea,

proliferarea si diferentierea celulara. Daca in cazul HA depusa prin MS, celulele

secreta o matrice extracelulara bogata ce transmite mai departe semnale integrinelor

35

si FAK de la periferia celulei, HA depusa prin PLD induce o adeziune celulara

bazata pe interactia puternica a vinculinei cu actina care o activeaza pe cea din urma

sa polimerizeze pentru formarea citoscheletului celular. Aceasta explica probabil si

morfologia bogata in filopodii lungi observata la HATi. Semnalele provenite de la

integrine sunt mai slabe, fapt datorat probebil lipsei interactiilor integrina-integrina

induse de obicei de legarea la matricea extracelulara.

IV. DISCUłIA OBSERVAłIILOR PERSONALE

Organizarea Ńesutului osos haversian ca mijloc de adaptare funcŃională. După

Gebhardt, 1906, fiecare lamelă a osteonului conŃine fibrile de colagen paralele,

dispuse helicoidal în jurul canalului central, pe când în lamelele succesive,

dispozitivele helicoidale sunt orientate în sens contrar. Aceste dispoziŃii apar ca

adaptări la funcŃia de rezistenŃă a osului, Ńinând cont de faptul că fibrele de colagen

trebuie să reziste la tracŃiune, pe când osul trebuie să reziste la presiune. Fibrilele de

colagen sunt aşezate în sisteme spiralate alternând cu fibrilele care au o direcŃie

inversă în lamelele învecinate corectând defomarea fibrilelor la presiune

longitudinală.

O altă adaptare arhitectonică pentru a oferi rezistenŃă osului o constituie

osteoanele, care formează sisteme de tuburi cilindrice aşezate unul in altul (pentru ca

aceeaşi cantitate de material dispusă sub forma de tub este mai rezistentă decât dacă

ar fi dispusă in coloane, tubul suportând o greutate mai mare).

RepartiŃia osteoanelor şi orientarea lor constituie alte caracteristici ale

funcŃiei osului.

In osul compact numarul osteoanelor variaza intre 3-15 pe milimetru patrat,

pe cand in osul spongios sunt mai rare. Orientarea osteoanelor se face in directia

presiunii maxime suportate de os: astfel, in diafiza oaselor luni, ele sunt dispuse

longitudinal, iar in oasele plate sunt paralele cu suprafata osului, iar alteori pot

converge in directia unei proeminente osoase.

Studiile morfometrice au aratat ca in perioada de inceput a dezvoltarii

intrauterine, osul compact prezinta o densitate volumica mare de osteoni, cateva

36

lamele osoase si canale haversiene largi cu un volum si o densitate relativ ridicate si

o consistenta mica a osului intre canale. Mai tarziu in gestatie osul contine osteoni cu

multe lamele si cu densitate volumica relativ mica, canale Havers rare cu densitate

volumica scazuta si sisteme interhaversiene cu densitate mare (Baltadjiev G., 1995).

Unii autori (Petrtyl M., Hert J., Fiala P., 1996) au descris o organizare

spatiala a osului haversian. Osteonii sunt grupati in doua sisteme antirotatorii

helicoidale, de directii oblice opuse situate in peretii contralaterali ai diafizei. Cateva

argumente sustin ipoteza ca aceasta arhitectura speciala depinde de orientarea fortei

dominante. Modelul de studiu folosit a fost acel al unui tub cilindric, care a fost

supus unei combinatii de forte de incovoiere, de torsiune si compresiune. Sub

solicitarea combinata dintre momentul de indoire de la exterior spre interior si cu

momentul de torsiune in sensul rotarii externe, directia fortelor dominante

corespunde directiei osteonilor din diafiza. In ambele cazuri fortele dominante ca si

osteonii, au fost orientate in directii oblice opuse in peretii mediali si laterali ai

modelului si al osului. Intre cele doua campuri oblice exista o margine ascutita cu

organizare atipica a directiilor fortei dominante si a osteonilor. In osul atipic

(femurul din experiment) orientarea osteonilor era longitudinala (ca la un femur

nesolicitat) sau rotata la 90 de grade. Aceste observatii sustin ipoteza unei relatii

cauzale intre modul de solicitare si directia dominanta osteonala. Organizarea osului

haversian reprezinta un exemplu tipic de adaptare functionala.

Osteoclastul-celulă hematopoetică. Osul este terenul de manifestare a

genezei, creşterii şi diferenŃierii a două tipuri de structuri: osteoformatoare şi

hematoformatoare. Deşi numeroase studii au fost efectuate, în cadrul unor programe

de cercetare, asupra elementelor structurale ale osului şi/sau măduvei

hematoformatoarte, totuşi problema raporturilor dintre aceste structuri nu a constituit

o prioritate. Calea spre acest proiect a fost deschisă de cercetările asupra

osteoclastogenezei şi asupra cooperării între osteoblast şi osteoclast ca elemente cu

origini diferite: mezenchimală şi hematopoietică în procesul formării osului. Este

cunoscut faptul că osul se formează prin diferenŃierea Ńesutului mezenchimal

primitiv, fie direct prin transformare în structuri lamelare (formare

intramembranoasă) fie indirect printr-un stadiu intermediar de cartilaj (formare

endocondrală). O teorie interesantă a acestei dualităŃi în formarea osului a fost

37

elaborată de Holden (1882) şi preluată de Last (1973). Ei au sugerat că formarea

intramembranoasă conduce la diferenŃierea mai rapidă a osului în locurile unde este

nevoie de suport structural şi protecŃia unor sisteme (exemplu: oasele calvariei) sau

unde este nevoie de a asigura desfăşurarea unor funcŃii importante în momentul

naşterii (exemplu: mandibula pentru actul sucŃiunii şi coastele pentru dinamica

respiraŃiei) (Holden, 1882). Este încă neclar de ce anumite oase se formează

endocartilaginos iar altele intramembranos. Se pare că acest fenomen este fără

importanŃă de vreme ce rezultatul final este acelaşi.

Din analiza rezultatelor înregistrate de noi se impune discutarea raporturilor

dintre structurile osteo- şi hematoformatoare prin contribuŃia osteoblastului,

osteoclastului, limfocitelor B şi a procesului de angiogeneză la diferenŃierea

structurilor osului şi măduvei şi a raporturilor dintre ele.

Pentru remodelarea osoasă sunt necesare o serie de evenimente complexe şi

coordonate (Marcus 1987, Väänänen 1993). Osteoblastele, osteocitele şi

osteoclastele comunică una cu cealaltă în eleborarea unei balanŃe a rezorbŃiei şi

formării osoase.Sunt necesare acŃiuni bine-organizate ale osteoblastelor,

osteoclastelor şi osteocitelor. Această activiatate coordonată între celulele osoase

sugerează existenŃa unei comunicări intercelulare, dar mecanismul al acestei

comunicări nu a fost bine caracterizat. Comunicarea intercelulară poate să se

desfăşoare prin intermediul secreŃiei de factori solubili, contact direct celulo-celular,

direct prin moleculele de adeziune celulară sau metabolice şi cuplaj electric prin

joncŃiunile gap.

Cele mai multe celule comunică cu celulele de vecinătate prin moleculele

citosolice, aşa cum sunt ionii, mesagerii secundari şi metaboliŃii mici. Această

activitate este posibilă prin intermediul unui grup de canale intercelulare numite

joncŃiuni gap, care conectează celulele adiacente (Kumar et al. 1996). Astfel, în

afară de câteva celule diferenŃiate terminale, cum ar fi celulele musculare scheletale,

eritrocitele şi limfocitele circulante, cele mai multe celule în Ńesuturile normale în

general comunică prin intermediul joncŃiunilor gap. JoncŃiunile gap sunt regiuni

specializate ale membranei celulare, care conectează celulele şi furnizează canalele

intercelulare apoase pentru mişcarea bidirecŃională a moleculelor mici şi a ionilor

între celulele adiacente şi citoplasmă (Warner 1988). Fiecare por joncŃional gap este

38

format prin juxtapunerea a două hemicanale intercelulare între celulele învecinate,

care interacŃionează pe membranele plasmatice a două celule adiacente şi leagă

direct citoplasma unei celule cu cea a altei celule. Fiecare hemicanal este compus

dintr-un aranjament hexameric al proteinelor transmembranare numite conexine, o

familie multigenică înalt înrudită constând din cel puŃin 13 membrii (Beyer et al.

1990, Goodenough et al. 1996, Saez et al. 1993).

Canalele conexinice participă în reglarea semnalelor între dezvoltarea şi

diferenŃierea tipurilor celulare. Canalele gap-joncŃionale au o selectivitate aparentă

bazată în principal pe mărimea moleculară, permiŃând mişcări ale moleculelor mai

mici de 1000 Da, aşa cum este AMPc, dar prevenind mişcări ale proteinelor şi

acizilor nucleici. Moleculele informaŃionale mici, aşa cum sunt anumiŃi morfogeni

pot fi transmise direct între celule prin intermediul joncŃiunilor gap, ceea ce este

important în embriogeneză pentru reglarea evenimentelor dintre celule (Warner et

al. 1984).

Un număr de droguri s-a arătat că inhibă comunicările gap-joncŃionale cu

grade variate ale eficacităŃii şi specificităŃii. Acestea includ de exemplu anestezicile

volatile aşa cum este halotanul (Nedergaard), alcoolii cu lanŃuri-drepte heptanol şi

octanol (Donahue et al. 1995a, Nedergaard 1994), anandamide (Venance et al.

1995) şi acidul glycerrhetinic (Davidson et al. 1995). Deşi variate droguri au fost

folosite pentru blocarea comunicării gap-joncŃionale, specificitatea blocanŃilor

rămâne de rezolvat.

Celulele osoase mediază semnale cu fiecare alte celule direct prin

comunicările gap joncŃionale, care au fost găsite conectând osteoblastele dar în

acelaşi timp comunicări gap joncŃionale între osteoblaste şi celulele din apropiere

sau osteocyte .NutriŃia osteocitelor se face probabil peste joncŃiunile gap dintre

extensiile citoplasmatice ale osteocytelor vecine. Connexin-43 (Cx43) este

exprimată în mare măsură în diferite Ńesuturi, incluzând creierul, inima, rinichiul,

musculatura netedă, ovarul şi câteva epitelii iar mai recent se consideră cea mai

abundentă connexină (Cx45 şi Cx46 au fost identificate în oase, dar Cx43 este

proteina Pe celulele în contact, connexonii dintre celulele vecine pot forma

joncŃiunile gap în câteva minute sau chiar câteva secunde, sugerând că aceşti

connexoni pre-există în membrana plasmatică. Comunicările gap-joncŃionale ar fi

39

astfel o metodă excelentă pentru celulele osoase în propagarea rapidă a semnalelor

generate local peste tot în Ńesutul scheletal, aşa cum s-a arătat că se întâmplă în

osteoblaste (Civitelli et al. 1993). Mijlocul de comunicare este foarte important

pentru cuplajul corect al osteoclastelor şi osteoblastelor. Capacitatea de a schimba

moleculele nutritive şi reglatoare dintr-o celulă (sau dintr-un anumit tip de celulă) în

alta pretutindeni în mediul scheletic poate reprezenta un mijloc eficient de

coordonare a acŃiunii a unei varietăŃi de celule în complexul tisular.

V. CONCLUZII

1. Compacta osului are o structură heterogenă prin variabiltatea formei canalului

central şi a structurii peretelui osteonului;

2. Echilibrul morfologic al compactei osului este asigurat de activitatea

osteoclastelor şi osteoblastelor în cadrul unităŃii de remodelare. Dezechilibre în

acest sistem pot genera osteoporoză prin hiperactivitatea osteoclastelor,

osteopetroză prin hipoactivitatea osteoclastelor, boala Paget prin remodelare

excesivă şi în fine mielomul multiplu prin stimularea osteclastelor şi creşterea

rezorbŃiei osoase;

3. În lipsa unor markeri specifici pentru osteoclast considerăm că evaluarea

osteonilor în cadrul ciclurilor de remodelare se poate realiza prin utilizarea

metodelor clasice de examinare în lumină directă, lumină polarizată, contrast de

fază, câmp întunecat şi/sau transformarea acestor imagini prin metoda Emboss

în linii interferenŃiale;

4. Linea cementalis trebuie considerată ca hotarul osteonului matur aflat în repaus;

linia de rezorbŃie este o mărturie morfologică a începerii unui nou ciclu de

remodelare a osteonului matur şi de regeneză a unui nou osteon;

5. ObservaŃiile noastre au mari implicaŃii în studiile de biomecanică şi

biopatologie precum şi în expertiza medico-legală a fragmentelor de os.

6. Pentru folosirea biomaterialelor in clinica in aplicatii de implantologie, una din

variantele de terapie pe care le consideram, este acoperirea in prealabil a

suprafetei implantului cu celule stem sau celule osoase autologe obtinute in

vitro de la acestea, cea mai bună alternativă fiind însă efectuarea unei co-culturi

40

celule stem-osteoblaste primare. În urma analizei observaŃiilor noastre am

constatat că osteoblastul si celula stem adulta s-au apropiat la nivelul

membranelor plasmatice, acest fapt putând fi explicat în doua moduri: celulele

tind sa faca schimb de portiuni de membrana la zona de tangenta dintre ele, sau

suntem martorii unui fenomen de fuziune celulara in care cele doua celule se

unesc formand o celula hibrid.

7. Analizând morfologia culturilor celulare celule stem-osteoblaste primare am

constatat că o proportie mai mare de celule stem asigura o proliferarea mai buna

a celulelor pe suprafata; de asemenea, numarul de celule fuzionate creste odata

cu cresterea numarului de celule stem insamantate ceea ce inseamna ca acestea

sunt responsabile de posibila fuziune spontana sau schimb de membrane intre

cele doua tipuri celulare; dar proliferarea nu mai creste deoarece suprafata avuta

la dispozitie este mai mica, astfel că am considerat ca raportul optim de

cultivare este de 2:1 celule stem: celule diferentiate.

8. În prima zi de la cultivare, celulele din culturile celule stem-osteoblaste primare

au preponderent forma rotunda sustinuta de distributia radiala si in cercuri

concentrice a filamentelor de actina ale citoscheletului; substratul de

hidroxiapatita determina generarea de dendrite lungi multiple care pornesc in

explorarea micromediului inconjurator. La 4 zile se observa ca celulele stem

capata morfologia fusiforma caracteristica iar osteoblastele au forma poligonala;

interactia dintre acestea este evidenta de la 4 zile, ducand uneori la

fuziune/colocalizare de markeri membranari.

9. Experimentele de imunofluorescenta au demonstrat ca osteoblastele diferentiate

in vitro exprima markerii caracteristici lineajului osos cand sunt cultivate pe HA

ca si pe substrat standard; osteocalcina este secretata masiv de celulele osoase si

ea se poate observa atat intracelular dar mai ales in jurul celulelor unde participa

la formarea matricei osoase mineralizate; colagenul de tip I poate fi observat

intracelular in timpul traficului sau spre membrana celulara unde formeaza fibre

ale matricei extracelulare; proteina BSP are o localizare perinucleara iar

osteonectina apare in toata citoplasma si prelungirile dendritice ale membranei.

10. Din punct de vedere al mecanismului de adeziune, putem concluziona ca nu

depinde atat de structura chimica a substratului (hidroxiapatita) ci mai degraba

41

de nanostructura filmului rezultat care poate sa stimuleze variat integrinele,

proteinele membranare ce fac legatura cu actina si influenteaza adeziunea,

migrarea, proliferarea si diferentierea celulara. Daca in cazul HA depusa prin

MS, celulele secreta o matrice extracelulara bogata ce transmite mai departe

semnale integrinelor si FAK de la periferia celulei, HA depusa prin PLD induce

o adeziune celulara bazata pe interactia puternica a vinculinei cu actina care o

activeaza pe cea din urma sa polimerizeze pentru formarea citoscheletului

celular. Aceasta explica probabil si morfologia bogata in filopodii lungi

observata la HATi. Semnalele provenite de la integrine sunt mai slabe, fapt

datorat probebil lipsei interactiilor integrina-integrina induse de obicei de

legarea la matricea extracelulara.

42

IMAGISTICA

43

A. ANALIZA MICROANATOMICĂ A

RAPORTURILOR ÎNTRE SISTEMELE DE LAMELE

OSOASE ŞI OSTEONICE PRIN EXAMINARE ÎN LUMINĂ

POLARIZATĂ

44

Planşa nr. 1. DistribuŃia osteonilor pe zone de dominanŃă a lamelelor osoase circumferenŃiale şi interstiŃiale.

SuprafaŃa de secŃiune transversală a osului tibia este străbătută de lamele osoase cu orientare circumferenŃială, de lamele osoase interstiŃiale, şi presărată cu osteoni alcătuiŃi din lamele osteonice concentrice care la examinarea în lumină polarizată dau imaginea „crucii cavalerilor de la Malta”.

Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.

SecŃiune necolorată examinată în lumină polarizată. ReconstrucŃie în 2D, Oc. 7, Ob. 4.

45

A

B

Planşa nr. 2. Variabilitatea formei şi structurii osteonilor. Se remarcă heterogenitatea distribuŃiei lamelelor osteonice şi variabilitatea birefringenŃei lor în

lumină polarizată (A). La examinarea cu obiectivul 10 se constată cu uşurinŃă gruparea osteonilor în perechi solidarizate prin lamele osoase intens birefringente (B).

Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de

cercetare Nikon Eclipse E-600, asistat de calculator prin folosirea soft-ului Lucia Net.

SecŃiune necolorată. Lumină polarizată. Oc. 7, Ob. 4 (A), 10 (B), x28 (A), x70 (B).

46

A

B Planşa nr. 3. Variabilitatea formei şi dimensiunilor canalului central al osteonilor.

Forma şi dimensiunile canalului central al osteonelor diferă de la un osteon la altul. Lamele osteonice descriu pe alocuri elipse deschise la una din extremităŃi, prin care comunică cu spaŃii cilindrice.



47

A

B

Planşa nr. 4. ModalităŃi de grupare a osteonilor în compacta osului tibia. Pe secŃiune transversală se identifică cu uşurinŃă prezenŃa a patru dublete osteonale (săgeată)

înconjurate de lamele osoase interstiŃiale ce contractă raporturi cu osteoni construiŃi din „unităŃi structurale semilunare” (S1, S2, S3) şi cu osteoni singulari susŃinuŃi de lamele osoase interstiŃiale reunite sub unghiuri diedre (A). La examinarea cu obiectivul 10 am observat raporturile pereŃilor osteoanelor cu fragmentele de lamele osoase interstiŃiale (B).




48

A

B Planşa nr. 5. ModalităŃi de grupare a osteonilor în compacta osului tibia.

Reuniuni de câte trei osteoni iar pe alocuri de câte doi osteoni prin fascicule de lamele osoase interstiŃiale (A) ce descriu la examinarea cu obiectivul 10 curbe cu curbură mică (B).




49

A

B Planşa nr. 6. Sisteme de comunicare interosteonală.

Perechi de osteoni amplasaŃi în lungul lamelelor osoase cicumferenŃiale. Se remarcă cu uşurinŃă canale de comunicare interosteonale deoarece secŃiunea interesează canalul interosteonal (canalis perforans) observăm o întrerupere a continuităŃii lamelelor osteonale.



SecŃiune necolorată. Lumină polarizată.Oc. 7, Ob. 10 (A), 20 (B), x70 (A), x140 (B).

50

A

B Planşa nr. 7. Sisteme de comunicare interosteonală.

Tripletă osteonală secŃionată la locul de confluenŃă în canalul interosteonal şi înconjurată de triplete osteonale cu raporturi tangenŃiale de contiguitate. Pe alocuri se observă perechi de osteoni intercomunicanŃi cu modificări ale raporturilor între lamelele osteonale (A). La examinarea cu obiectivul 10 a tripletei osteonale la locul de confluenŃă se constată variabilitatea razelor de curbură a lemelelor osteonilor (B).




51

A

B

Planşa nr. 8. Raporturile osteonilor cu lamelele osoase circumferenŃiale. Continuitatea lamelelor osoase circumferenŃiale este întreruptă prin prezenŃa de osteoni grupaŃi

în perechi şi/sau triplete. Unirea centrilor canalelor osteonale generează o reŃea cu ochiuri triunghiulare ce poate fi considerată o veritabilă structură de rezistenŃă.




52

A

B Planşa nr. 9. Raporturile osteonilor cu sistemul de lamele osoase interstiŃiale.

Participarea lamelelor osoase interstiŃiale la realizarea raporturilor de contiguitate între osteonii ce participă la constituirea tripletelor (A) şi qvadripletelor de osteoni (B).



53

A

B

Planşa nr. 10. Raporturile topografice interosteonale. Osteoni pe trei plane cu grosimi variabile a pereŃilor osteonali şi inegalităŃi ale birefringenŃei

fasciculelor de lamele osteonale (A). Osteoni pe două plane conectaŃi prin lamele interosteonale intens birefringente (B).



54

A

B Planşa nr. 11. Osteonogeneză pe model osos.

Aspect de osteon primar prezent în Ńesutul osos matur – în cadrul unui proces de „osteonogeneză pe model osos” în cadrul fenomenului de remodelare a osului.




55

A

B Planşa nr. 12. Topografia lamelelor osteonice concentrice.

„Osteon cilindroid” secŃionat transversal ce formează la examinarea în lumină polarizată imaginea crucii cu braŃe egale intens birefringente (aspectul „Crucii cavalerilor de la Malta”)(A). La o putere de mărire superioară devine posibilă numărarea lamelelor osteonale (B).




56

A

B Planşa nr. 13. InterrelaŃiile sistemelor osteonale

Raporturi biunivoce între osteoni prin interpătrunderea lamelelor osteonului „a” în structura osteonului „b”(A). Aspect bidimensional al orientării spaŃiale a lamelelor osteonale ce realizează imaginea unei pâlnii (B).




57

A

B Planşa nr. 14. InterrelaŃiile sistemelor osteonale

Imagine de pâlnie realizată de orientarea spaŃială a lamelelor osteonice. Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de



58

B. ANALIZA MICROANATOMICĂ A

HOTARELOR OSTEOANELOR

59

A

B Planşa nr. 15. Identificarea, în planul secŃiunii microanatomice, a liniei cementale, ce reprezintă limitele osteonului, este mai lesne de realizat pe imaginile obŃinute prin metoda de impregnare argentică Gomori (B). Pe secŃinile examinate în lumină polarizată hotarele osteonilor pot fi intuite, dar o marcare riguroasă a lor devine imposibilă. 1. Canalis centralis; 2. Linea cementalis; 3. Lamele osoase interstiŃiale; 4. Lamele osoase concentrice ale osteonilor; 5. Lacuna osteocyti. A. Examinare în lumină polarizată; B. Vizualizarea linei cementale prin impregnarea argentică Gomori a secŃiunilor, Oc. 7, Ob. 20, x140.



SecŃiune necolorată. Lumină polarizată (A); Impregnare argentică Gömöri. Oc. 7, Ob. 20, x140 (A, B)

60

A

B Planşa nr. 16. Peretele cavităŃii medulare conŃine fascicule de „lamele osoase circumferenŃiale interne” străbătute de „canale perforante”. Numeroşi osteoni sunt bine vizibili pe coloraŃia PAS. Hotarul osteonului este marcat printr-o linie continuă – linea cementalis. Pe alocuri există canale de legătură între două canale centrale. 1. Cavitas medullaris et medulla ossium; 2. Lamella circumferentialis interna; 3. Canalis perforans (Volkmann); 4. Canalis centralis (Havers); 5. Linea cementalis; 6. Lacuna osteocyti.


ColoraŃia PAS, Oc. 7, Ob. 10 (A, B), x70 (A, B).

61

A

B C Planşa nr. 17. Heterogenitatea formei şi structurii osteoanelor din compacta osului tibia. SpaŃiile interosteonale conŃin glicosaminoglicani PAS pozitivi evidenŃiindu-se astfel zona „linea cementalis”. 1. Fascicul de lamele circumferenŃiale interne; 2. Canalis perforans; 3. Canalis centralis; 4. Linea cementalis; 5. Lacuna ostecyti.



ColoraŃia PAS, Oc. 7, Ob. 10, x70 (A, B, C).

62

A

B Planşa nr. 18. Transformarea imaginii din secŃiunea colorată pentru vizualizarea glicosaminoglicanilor prin metoda PAS (A), în sistemul 3D după tehnica EMBOSS, compatibilă cu imaginea obŃinută prin examinarea în lumină interferenŃială contrast, contribuie la cunoaşterea hotarelor circumferenŃiale ale osteonilor, marcarea reperelor pentru morfometria osteonilor, identificarea spaŃiilor interosteonale şi stabilirea criteriilor de evaluare a stadiilor de evoluŃie a osteonilor.



ColoraŃia PAS (A), Transformarea imaginii A în sistem 3D (B), Oc. 7, Ob. 10, x70 (A, B).

63

A

B Planşa nr. 19. Osteon dezvoltat în zona “lamelelor osoase circumferenŃiale interne”.

Se remarcă deschiderea canalului central al osteonului în cavitatea medulară a osului (A). La periferia osteonului de identifică cu uşurinŃă linea cementalis. La examinarea în lumină polarizată lamelele osteonice descriu curbe circumferenŃiale eliptice (B).



Impregnare argentică Gomori, Oc. 7, Ob. 10 (A), 20 (B), x 70 (A), x140 (B).

64

C. ANALIZA MICROANATOMICĂ A

GENEZEI OSTEOANELOR ÎN OSUL MATUR

65

A

B Planşa nr. 20. Grup de şase osteoni delimitaŃi la periferie prin linea cementalis; diametrul canalului central este variabil. UnităŃile osteonice sunt separate prin fascicule de lamele osoase circumferenŃiale (A). Osteoni suprapuşi şi cu modificări ale topografiei laminei cementalis şi a peretelui osteonului în zona limitrofă canalului central (B).



Impregnare argentică Gomori (A), ColoraŃie Hematoxilină Eosină (B), Oc. 7, Ob. 10; x70 (A, B)

66

A

B Planşa nr. 21. Modificarea structurii osteonului din osul matur prin apariŃia unor elemente de remodelare şi geneză a unui nou osteon: o nouă linie cementală (1). o zonă de Ńesut osos în curs de mineralizare (2) şi a unui lizereu preosos (3). Se remarcă conservarea hotarelor osteonului supus remodelării prin prezenŃa intactă a liniei cementale (A). TendinŃa de stratificare a osteonului prin prezenŃa unei noi linii cementale (1) a unei zone de Ńesut osos în curs de mineralizare (2) şi a liniei de rezorbŃie (4) (B).



ColoraŃie Hematoxilină Eosină(A), ColoraŃie PAS (B), Oc. 7, Ob. 10, x70 (A, B).

67

A

B Planşa nr. 22. La examinarea obiectivele 20x şi 40x se pot identifica cu uşurinŃă elementele care participă la construirea unui nou osteon în cadrul procesului de remaniere – remodelare. 1. Linea cementalis a unui osteon secundar pe cale de diferenŃiere în cadrul procesului de „remodelare” prin rezorbŃie; 2. łesut osos în curs de mineralizare; 3. Frontul de mineralizare; 4. Lizereu preosos; 5. Linia osteoblastelor; 6. Linea cementalis a unui osteon secundar în curs de dispariŃie; 7. Osteon secundar dintr-o generaŃie anterioară; 8. Con de rezorbŃie.



ColoraŃie Hematoxilină Eosină, Oc. 7, Ob. 20 (A), 40 (B), x140 (A), x280 (B).

68

A B

C Planşa nr. 23. Aspecte ale remanierilor structurilor osteonale.



Impregnare argentică Gomori (A, C), ColoraŃie Hematoxilină Eosină (B), Oc. 7, Ob. 10 (C), 20 (A, B), x70 (C), x140 (A, B)

69

A

B Planşa nr. 24. Microanatomia osteonului pe cale de remaniere: aspect de osteonogeneză pe model

osos. Se remarcă ondularea pronunŃată a liniei cementale, diferenŃierea structurilor primordiale ale

noului osteon pe cale de dezvoltare. 1. Linea cementalis a osteonului secundar remaniat în plin porces de remodelare; 2. Linea cementalis a osteonului de remaniere; 3. łesut osos nou format pe cale de mineralizare; 4. Lizereu preosos; 5. Linea osteoblastelor.



Impregnare argentică Gomori, Oc. 7, Ob. 10 (A), 20 (B), x70 (A), x140 (B).

70

Planşa nr. 25. Analiza comparativă a osteonului nou format prin examinarea secŃiunii de impregnare argentică în lumină directă (A) şi în lumină polarizată (B). 1. Linea cementalis a osteonului secundar în plin proces de remodelare; 2. Linea cementalis a osteonului terŃiar; 3. łesut osos nou format pe cale de mineralizare; 4. Lizereu preosos; 5. Linia osteoblaştilor.



Impregnare argentică Gomori, Oc. 7, Ob. 40, x280 (A, B).

B

A

71

A

B

Planşa nr. 26. Definirea graniŃelor structurilor osteonale prin transformarea imaginii de examinare în lumină directă (A) în imagine 3D prin tehnica EMBOSS.


Impregnare argentică Gomori, Oc. 7, Ob. 10, x70

72

A

B

Planşa nr. 27. Raporturile osteonilor cu sistemul de lamele osoase interosteonale şi a osteonului pe cale de diferenŃiere cu structurile „osteonului patern”. 1. Linea cementalis a osteonului primar; 2. Linea cementalis a osteonului secundar, nou format în procesul de remaniere; 3. łesut osos nou format, pe cale de mineralizare; 4. Linia osteoblastelor şi lizereul preosos.



Impregnare argentică Gomori, Oc. 7, Ob. 20 (A), 40 (B), x140 (A), x280 (B).

73

Planşa nr. 28. “FormaŃiuni semilunare” ce contribuie la edificarea unui nou osteon în cadrul procesului de remaniere-remodelare, veritabilă osteonogeneză pe model osos. 1. Linea cementalis a osteonului secundar în plin proces de remodelare; 2. Linea cemetalis a osteonului terŃiar; 3. łesut osos nou format pe cale de mineralizare; 4. Lamele osoase nou formate din structura viitorului osteon (terŃiar).



Impregnare argentică Gomori; prelucrarea imaginii prin tehnica EMBOSS (B). Oc. 7, Ob. 10, x70

B

A

74

A

B

C Planşa nr. 29. Raporturile interosteonale devin evidente prin studiul comparativ al secŃiunii de impregnare argentică (A), cu imaginile de transformare 3D EMBOSS (B) şi de examinare în lumină polarizată (C).



Impregnare argentică Gomori, Oc. 7, Ob. 10, x70.

75

A

B

Planşa nr. 30. IntersecŃii osteonale identificate pe secŃiunile de impregnare argentică prin examinare în contrast de fază (A) şi în lumină polarizată (B).



76

A

B Planşa nr. 31. Examinarea comparativă în lumină directă şi după transformare 3D EMBOSS a secŃiunilor de impregnare argentică ce intersectează o tripletă osteonală la locul de intercomunicare. 1. Linea cementalis a osteonului terŃiar; 2. Linea cementalis a osteonului secundar în plin proces de remodelare; 3. FormaŃiuni semilunare ce conŃin lamele colagene şi lacune osteocitare din structura osteonului terŃiar pe cale de diferenŃiere.



77

A

B

Planşa nr. 32. Analiza comparativă a reuniunirii osteonilor în dublete, triplete şi qvadruplete. Imagini achiziŃionate cu camera video digitală DN 100 ataşată microscopului fotonic de


SecŃiune necolorată. Lumină polarizată (A). Transformarea 3D EMBOSS (B). Oc. 7, Ob. 4, x28 (A, B).

78

A

B

Planşa nr. 33. Topografia microanatomică a lamelelor osteonale şi raporturile lor cu canalele centrale ale sistemelor Havers.



79

A

B

Planşa nr. 34. Forme geometrice determinate de traiectul spaŃial al fasciculelor de lamele osteonale şi a lamelelor osoase interstiŃiale.



80

Planşa nr. 35. Imagini corelative de neovasculogeneză şi diferenŃiere a fasciculelor de fibre colagene


ColoraŃie Hematoxilină Eosină (A, B, C) şi examinare în lumină polarizată (D). Oc. 7, Ob.: 4 (A, D), 10 (C), 20 (B); x28 (A, D), x70 (C) şi x140 (B)

A B

C D

81

Planşa nr. 36. Topografia microanatomică a vaselor neoformate în compacta osului tibia secŃionat longitudinal (A) şi orientarea bidimensională a fasciculelor de fibre colagene (B)


ColoraŃie Hematoxilină Eosină (A) şi examinare în lumină polarizată (B). ReconstrucŃie bidimensională cu Ob. 4.

A B

82

A

B Planşa nr. 37. Osteon nou format examinat în lumină directă (A) şi lumină polarizată (B).



ColoraŃie Hematoxilină Eosină, Oc. 7, Ob. 20, x140 (A, B).

83

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. Abbas S., Y. Abu-Amer, Dominant-negative IkappaB facilitates apoptosis of osteoclasts by tumor necrosis factor-alpha, J. Biol. Chem. 278 (2003) 20077–20082.

2. Abbasi Jahhromi S.H, Matayoshi A., Kimble R., Dimarogonas A., Pacifici R. Bone quality factor analysis a new noninvasive technique for the measurement of bone density and bone strength. În: J. Bone. Miner. Res., vol. 11 (1996), p. 594-599.

3. Acampora D, Merlo GR, Paleari L, Zerega B, Postiglione MP, Mantero S, Bober E, Barbieri O, Simeone A, Levi G 1999 Craniofacial, vestibular and bone defects in mice lacking the Distal-less-related gene Dlx5. Development 126:3795–3809

4. Adams J.M., Ways of dying: multiple pathways to apoptosis, Genes Dev. 17 (2003) 2481–2495.

5. Akiyama T., P. Bouillet, T. Miyazaki, Y. Kadono, H. Chikuda, U.I. Chung, A. Fukuda, A. Hikita, H. Seto, T. Okada, T. Inaba, A. Sanjay, R. Baron, H. Kawaguchi, H. Oda, K. Nakamura, A. Strasser, S. Tanaka, Regulation of osteoclast apoptosis by ubiquitylation of proapoptotic BH3-only Bcl-2 family member Bim, EMBO J. 22 (2003) 6653–6664.

6. Alliston T, Choy L, Ducy P, Karsenty G, Derynck R 2001 TGF- -induced repression of CBFA1 by Smad3 decreases cbfa1 and osteocalcin expression and inhibits osteoblast differentiation. EMBO J 20:2254 –2272

7. Ascenzi, A. and Bonucci, E. "Relationship between ultrastructure and "pin test" in osteons", Clin. Orth. Rel. Res., 121:275-294.

8. Ascenzi, A. and Bonucci, E. “The mechanical properties of the osteon in relation to its structural organisation", in E.A. Balazs (ed.) Chemistry and molecular biology of the intercellular matrix, Academic Press, New York, 1970.

9. Back J., A. Dierich, C. Bronn, P. Kastner, S. Chan, PU.1 determines the self-renewal capacity of erythroid progenitor cells, Blood 103 (2004) 3615–3623.

10. Baltadjev G. Micromorphometric characteristics of osteons in compact bone of growing of human fetusus. În: Acta Anat. Basel, vol. 154 (1995), p. 181-185.

11. Beedles K.E., P.T. Sharpe, E.F. Wagner, A.E. Grigoriadis, A putative role for c-Fos in the pathophysiology of Paget s disease, J. Bone Miner. Res. 14 (2) (1999) 21–28.

12. Bellido T. , A.A. Ali, L.I. Plotkin, Q. Fu, I. Gubrij, P.K. Roberson, R.S. Weinstein, C.A. O Brien, S.C. Manolagas, R.L. Jilka, Proteasomal degradation of Runx2 shortens parathyroid hormone-induced anti-apoptotic signaling in osteoblasts. A putative explanation for why intermittent administration is needed for bone anabolism, J. Biol. Chem. 278 (2003) 50259–50272.

13. Bellido T. , C.A. O Brien, P.K. Roberson, S.C. Manolagas, Transcriptional activation of the p21(WAF1,CIP1,SDI1) gene by interleukin-6 type cytokines. A prerequisite for their pro-differentiating and anti-apoptotic effects on human osteoblastic cells, J. Biol. Chem. 273 (1998) 21137–21144.

14. Bellido T., L. Han, S.C. Manolagas, Both membrane permeable and impermeable estrogenic compounds directly stimulate murine osteoclast apoptosis in vitro, J. Bone Miner. Res. 14, (1999) S451.

15. Bellido T., M. Huening, M. Raval-Pandya, S.C. Manolagas, S. Christakos, Calbindin-D28k is expressed in osteoblastic cells and suppresses their apoptosis by inhibiting caspase-3 activity, J. Biol. Chem. 275 (2000) 26328–26332.

16. Bhatt N.Y., T.W. Kelley, V.V. Khramtsov, Y. Wang, G.K. Lam, T.L. Clanton, C.B. Marsh, Macrophage-colony-stimulating factor-induced activation of extracellular-regulated kinase involves phosphatidylinositol 3-kinase and reactive oxygen species in human monocytes, J. Immunol. 169 (2002) 6427–6434.

84

17. Bi W, Deng JM, Zhang Z, Behringer RR, de Crombrugghe B 1999 Sox9 is required for cartilage formation. Nat Genet 22:85– 89

18. Bialek P, Kern B, Yang X, Schrock M, Sosic D, Hong N, Wu H, Yu K, Ornitz DM, Olson EN, Justice MJ, Karsenty G 2004 A twist code determines the onset of osteoblast differentiation. Dev Cell 6:423– 435

19. Black D. , A. Schwarz, K. Ensrud, A. Rybak-Feigin, J. Gupta, A. Lombardi, R. Wallace, S. Levis, S. Ouandt, S. Satterfield, J. Cauley, S. Cummings, A 5 year randomized trial of the long- term efficacy and safety of Alendronate: then FIT long-term EXrension (FLEX), J. Bone Miner. Res. 19 (2004) S45.

20. Borton A.J., J.P. Frederick, M.B. Datto, X.F. Wang, R.S. Weinstein, The loss of Smad3 results in a lower rate of bone formation and osteopenia through dysregulation of osteoblast differentiation and apoptosis, J. Bone Miner. Res. 16 (2001), 1754–1764.

21. Bouillet P., D.C. Huang, L.A. O Reilly, H. Puthalakath, L. O Connor, S. Cory, J.M. Adams, A. Strasser, The role of the pro-apoptotic Bcl-2 family member bim in physiological cell death, Ann. N. Y. Acad. Sci. 926 (2000) 83–89.

22. Bouillet P., J.F. Purton, D.I. Godfrey, L.C. Zhang, L. Coultas, H. Puthalakath, M. Pellegrini, S. Cory, J.M. Adams, A. Strasser, BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes, Nature 415 (2002) 922–926.

23. Boyle W.J., W.S. Simonet, D.L. Lacey, Osteoclast differentiation and activation, Nature 423 (2003) 337–342.

24. Brandwood C.P., J.A. Hoyland, M.C. Hillarby, J.L. Berry, M. Davies, P.L. Selby, A.P. Mee, Apoptotic gene expression in Paget s disease: a possible role for Bcl-2, J. Pathol. 201 (2003), 504–512.

25. Bridgewater LC, Lefebvre V, de Crombrugghe B 1998 Chondrocyte-specific enhancer elements in the Col11a2 gene resemble the Col2a1 tissue-specific enhancer. J Biol Chem 273:14998 –15006

26. Brien C.A., D. Jia, L.I. Plotkin, T. Bellido, C.C. Powers, S.A. Stewart, S.C. Manolagas, R.S. Weinstein, Glucocorticoids act directly on osteoblasts and osteocytes to induce their apoptosis and reduce bone formation and strength, Endocrinology 145, (2004) 1835–1841.

27. Bu R., C.W. Borysenko, Y. Li, L. Cao, A. Sabokbar, H.C. Blair, Expression and function of TNF-family proteins and receptors in human osteoblasts, Bone 33 (2003) 760–770.

28. Calvi L.M., N.A. Sims, J.L. Hunzelman, M.C. Knight, A. Giovannetti, J.M. Saxton, H.M. Kronenberg, R. Baron, E. Schipani, Activated parathyroid hormone/parathyroid hormone- related protein receptor in osteoblastic cells differentially affects cortical and trabecular bone, J. Clin. Invest. 107 (2001) 277–286.

29. Cappellen D, Luong-Nguyen NH, Bongiovanni S, Grenet O, Wanke C, Susa, M 2002 Transcriptional program of mouse osteoclast differentiation governed by the macrophage colony-stimulating factor and the ligand for the receptor activator of NF B. J Biol Chem 277:21971–21982

30. Chae H.J., S.W. Chae, J.S. Kang, B.G. Bang, S.B. Cho, R.K. Park, H.S. So, Y.K. Kim, H.M. Kim, H.R. Kim, Dexametha- sone suppresses tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis in osteoblasts: possible role for ceramide, Endocrinology 141, (2000) 2904–2913.

31. Chen S., D.C. Guttridge, E. Tang, S. Shi, K. Guan, C.Y. Wang, Suppression of tumor necrosis factor-mediated apoptosis by nuclear factor kappaB-independent bone morphogenetic protein/Smad signaling, J. Biol. Chem. 276 (2001) 39259–39263.

32. Cheng S.L., S.F. Zhang, S. Mohan, F. Lecanda, A. Fausto, A.H. Hunt, E. Canalis, L.V. Avioli, Regulation of insulin-like growth factors I and II and their binding

85

proteins in human bone marrow stromal cells by dexamethasone, J. Cell Biochem. 71, (1998) 449–458.

33. Chiusaroli R., A. Sanjay, K. Henriksen, M.T. Engsig, W.C. Horne, H. Gu, R. Baron, Deletion of the gene encoding c-Cbl alters the ability of osteoclasts to migrate, delaying resorption and ossification of cartilage during the development of long bones, Dev. Biol. 261 (2003) 537–547.

34. Chua C.C., B.H. Chua, Z. Chen, C. Landy, R.C. Hamdy, Dexamethasone induces caspase activation in murine osteoblastic MC3T3-E1 cells, Biochim. Biophys. Acta 1642 (2003) 79–85.

35. Ciarelli, M.J., Goldstein, S.A., Kuhn, J.L., Cody, D.D., and Brown, M.B. - Evaluation of orthogonal mechanical properties and density of human trabecular bone from the major metaphyseal regions with materials testing and computed tomography, J. Orthop. Res., 9:674-682.

36. Coen G., Leptin and bone metabolism, J. Nephrol. 17 (2004), 187–189. 37. Coqueret O 2002 Linking cyclins to transcriptional control. Gene 299:35–55 38. Cord Brakebusch, Reinhard Fässler, The EMBO Journal Vol. 22 No. 10 pp. 2324±2333,

2003 39. Cory S., D.C. Huang, J.M. Adams, The Bcl-2 family: roles in cell survival and

oncogenesis, Oncogene 22 (2003) 8590–8607. 40. Coxon F.P. , M.H. Helfrich, R. Van t Hof, S. Sebti, S.H. Ralston, A. Hamilton,

M.J. Rogers, Protein geranylgeranylation is required for osteoclast formation, function, and survival: inhibition by bisphosphonates and GGTI-298, J. Bone Miner. Res. 15 (2000) 1467–1476.

41. Crabtree G.R., E.N. Olson, NFAT signaling: choreographing the social lives of cells, Cell 109 (Suppl) (2002) S67–S79.

42. De Luca F, Barnes KM, Uyeda JA, De-Levi S, Abad V, Palese T, Mericq V, Baron J 2001 Regulation of growth plate chondrogenesis by bone morphogenetic protein-2. Endocrinology 142:430 – 436

43. Debiais F., G. Lefevre, J. Lemonnier, S. Le Mee, F. Lasmoles, F. Mascarelli, P.J. Marie, Fibroblast growth factor-2 induces osteoblast survival through a phosphatidylinositol 3-kinase- dependent, -beta-catenin-independent signaling pathway, Exp. Cell Res. 297 (2004) 235–246.

44. Ducy P 2000 Cbfa1: a molecular switch in osteoblast biology. Dev Dyn 219:461– 471 45. Duque G., K.E. Abdaimi, M. Macoritto, M.M. Miller, R. Kremer, Estrogens (E2)

regulate expression and response of 1,25- dihydroxyvitamin D3 receptors in bone cells: changes with aging and hormone deprivation, Biochem. Biophys. Res. Commun., 299 (2002) 446–454.

46. Eberhardt A.W., A. Yeager-Jones, H.C. Blair, Regional trabecular bone matrix degeneration and osteocyte death in femora of glucocorticoid- treated rabbits, Endocrinology 142 (2001) 1333–1340.

47. Elefteriou F., S. Takeda, K. Ebihara, J. Magre, N. Patano, C.A. Kim, Y. Ogawa, X. Liu, S.M. Ware, W.J. Craigen, J.J. Robert, C. Vinson, K. Nakao, J. Capeau, G. Karsenty, Serum leptin level is a regulator of bone mass, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, (2004) 3258–3263.

48. Eltoum I., Fredenburgh J., Myers R.B.: Introduction to the theory and practice of fixtion of tissues, J. Histotechnol 24: 173-190, 2001.

49. Ferrari D, Kosher RA 2002 Dlx5 is a positive regulator of chondrocyte differentiation during endochondral ossification. Dev Biol 252:257–270

50. Fischer B.A., S. Mundle, A.A. Cole, Tumor necrosis factor- alpha induced DNA cleavage in human articular chondrocytes may involve multiple endonucleolytic activities during apoptosis, Microsc. Res. Tech. 50 (2000) 236–242.

51. Fleet. J.C. , Leptin and bone: does the brain control bone biology?, Nutr. Rev. 58 (2000) 209–211.

86

52. Fleischmann A, Hafezi F, Elliott C, Reme CE, Ruther U, Wagner EF 2000 Fra-1 replaces c-Fos-dependent functions in mice. Genes Dev 14:2695–2700

53. Garcia-Moreno C., M.P. Catalan, A. Ortiz, L. Alvarez, C. De la Piedra, Modulation of survival in osteoblasts from postmenopausal women, Bone 35 (2004) 170–177.

54. Glantschnig H., J.E. Fisher, G. Wesolowski, G.A. Rodan, A.A. Reszka, M-CSF, TNFalpha and RANK ligand promote osteoclast survival by signaling through mTOR/S6 kinase, Cell Death Differ. 10 (2003) 1165–1177.

55. Glass D, P.M, Long F, Taketo MM, McMahon AP, Karsenty G 2003, Regulation of bone formation by wnt signaling. J Bone Miner Res 18:S14 (Abstract)

56. Gong Y, Slee RB, Fukai N, Rawadi G, Roman-Roman S, Reginato AM, Wang H, Cundy T, Glorieux FH, Lev D, Zacharin M, Oexle K, Marcelino J, Suwairi W, Heeger S, Sabatakos G, Apte S, Adkins WN, Allgrove J, Arslan-Kirchner M, Batch JA, Beighton P, Black GC, Boles RG, Boon LM, et al 2001 LDL receptor-related protein 5 (LRP5) affects bone accrual and eye development. Cell 107:513–523

57. Gordeladze J.O., C.A. Drevon, U. Syversen, J.E. Reseland, Leptin stimulates human osteoblastic cell proliferation, de novo collagen synthesis, and mineralization: Impact on differentiation markers, apoptosis, and osteoclastic signaling, J. Cell. Biochem., 85 (2002) 825–836.

58. Gori F., L.C. Hofbauer, C.R. Dunstan, T.C. Spelsberg, S. Khosla, B.L. Riggs, The expression of osteoprotegerin and RANK ligand and the support of osteoclast formation by stromal-osteoblast lineage cells is developmentally regulated, Endocrinology 141 (2000) 4768–4776.

59. Gronowicz G.A. , M.B. McCarthy, H. Zhang, W. Zhang, Insulin-like growth factor II induces apoptosis in osteoblasts, Bone 35 (2004) 621–628.

60. Gross A. , J.M. McDonnell, S.J. Korsmeyer, BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis, Genes Dev. 13, (1999) 1899–1911.

61. Gundersen HJ, Bendtsen TF, Korbo L, et al: Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis. APMIS 96: 379-394, 1988.

62. Guo X, Day TF, Jiang X, Garrett-Beal L, Topol L, Yang Y 2004 Wnt/ -catenin signaling is sufficient and necessary for synovial joint formation. Genes Dev 18:2404 –2417

63. Hall B.K. Histogenesis and morphogenesis of bone. În: Clin. Orthop., vol. 71 (1971), p. 249.

64. Hall BK, Miyake T 2000 All for one and one for all: condensations and the initiation of skeletal development. Bioessays 22:138 –147

65. Hartmann C, Tabin CJ 2000 Dual roles of Wnt signaling during chondrogenesis in the chicken limb. Development 127:3141–3159

66. Hatakeyama S., N. Tomichi, Y. Ohara-Nemoto, M. Satoh, The immunohistochemical localization of Fas and Fas ligand in jaw bone and tooth germ of human fetuses, Calcif. Tissue Int. 66, (2000) 330–337.

67. Hay E., J. Lemonnier, O. Fromigue, P.J. Marie, Bone morphogenetic protein-2 promotes osteoblast apoptosis through a Smad- independent, protein kinase C-dependent signaling pathway, J. Biol. Chem. 276 (2001) 29028–29036.

68. Hershey CL, Fisher DE 2004 Mitf and Tfe3: members of a b-HLH-ZIP transcription factor family essential for osteoclast development and function. Bone 34:689 – 696

69. Hirotani H., N.A. Tuohy, J.T. Woo, P.H. Stern, N.A. Clipstone, The calcineurin/nuclear factor of activated T cells signaling pathway regulates osteoclastogenesis in RAW264.7 cells, J. Biol. Chem. 279 (2004) 13984–13992.

70. Hock J.M., V. Krishnan, J.E. Onyia, J.P. Bidwell, J. Milas, D. Stanislaus, Osteoblast apoptosis and bone turnover, J. Bone Miner. Res. 16 (2001) 975–984.

71. Hofbauer L.C., F. Gori, B.L. Riggs, D.L. Lacey, C.R. Dunstan, T.C. Spelsberg, S. Khosla, Stimulation of osteoprotegerin ligand and inhibition of osteoprotegerin production by glucocorticoids in human osteoblastic lineage cells: potential paracrine

87

mechanisms of glucocorticoid-induced osteoporosis, Endocrinology, 140 (1999) 4382–4389.

72. Hu H, Hilton MJ, Tu X, Yu K, Ornitz DM, Long F 2005 Sequential roles of Hedgehog and Wnt signaling in osteoblast development. Development 132:49–60

73. Huang W, Chung UI, Kronenberg HM, de Crombrugghe B 2001 The chondrogenic transcription factor Sox9 is a target of signaling by the parathyroid hormone-related peptide in the growth plate of endochondral bones. Proc Natl Acad Sci USA 98:160 –165

74. Igarashi K., H. Hirotani, J.T. Woo, P.H. Stern, Cyclosporine A and FK506 induce osteoclast apoptosis in mouse bone marrow cell cultures, Bone 35 (2004) 47–56.

75. Ishida N, Hayashi K, Hoshijima M, Ogawa T, Koga S, Miyatake Y, Ku- megawa M, Kimura T, Takeya T 2002 Large scale gene expression analysis of osteoclastogenesis in vitro and elucidation of NFAT2 as a key regulator. J Biol Chem 277:41147– 41156

76. Ishida N., K. Hayashi, M. Hoshijima, T. Ogawa, S. Koga, Y. Miyatake, M. Kumegawa, T. Kimura, T. Takeya, Large scale gene expression analysis of osteoclastogenesis in vitro and elucidation of NFAT2 as a key regulator, J. Biol. Chem. 277, (2002) 41147–41156.

77. Iwata T, Li CL, Deng CX, Francomano CA 2001 Highly activated Fgfr3 with the K644M mutation causes prolonged survival in severe dwarf mice. Hum Mol Genet 10:1255–1264

78. Kanaoka K., Y. Kobayashi, F. Hashimoto, T. Nakashima, M. Shibata, K. Kobayashi, Y. Kato, H. Sakai, A common down- stream signaling activity of osteoclast survival factors that prevent nitric oxide-promoted osteoclast apoptosis, Endocrinol- ogy 141 (2000) 2995–3005.

79. Karp SJ, Schipani E, St-Jacques B, Hunzelman J, Kronenberg H, McMahon AP 2000 Indian hedgehog coordinates endochondral bone growth and morphogenesis via parathyroid hormone related-protein-dependent and -independent pathways. Development 127:543–548

80. Karsenty G, Wagner EF 2002 Reaching a genetic and molecular understanding of skeletal development. Dev Cell 2:389 – 406

81. Kato M, Patel MS, Levasseur R, Lobov I, Chang BH, Glass 2nd DA, Hart- mann C, Li L, Hwang TH, Brayton CF, Lang RA, Karsenty G, Chan L 2002, Cbfa1-independent decrease in osteoblast proliferation, osteopenia, and per- sistent embryonic eye vascularization in mice deficient in Lrp5, a Wnt core- ceptor. J Cell Biol 157:303–314

82. Kim S, Koga T, Isobe M, Kern BE, Yokochi T, Chin YE, Karsenty G, Tan- iguchi T, Takayanagi H 2003 Stat1 functions as a cytoplasmic attenuator of Runx2 in the transcriptional program of osteoblast differentiation. Genes Dev 17:1979 –1991

83. Kobayashi T, Chung UI, Schipani E, Starbuck M, Karsenty G, Katagiri T, Goad DL, Lanske B, Kronenberg HM 2002 PTHrP and Indian hedgehog control differentiation of growth plate chondrocytes at multiple steps. Devel- opment 129:2977–2986

84. Koga T., M. Inui, K. Inoue, S. Kim, A. Suematsu, E. Kobayashi, T. Iwata, H. Ohnishi, T. Matozaki, T. Kodama, T. Taniguchi, H. Takayanagi, T. Takai, Costimulatory signals mediated by the ITAM motif cooperate with RANKL for bone homeostasis, Nature 428 (2004) 758–763.

85. Kousteni S. , T. Bellido, L.I. Plotkin, C.A. O Brien, D.L. Bodenner, L. Han, K. Han, G.B. DiGregorio, J.A. Katzenel- lenbogen, B.S. Katzenellenbogen, P.K. Roberson, R.S. Wein- stein, R.L. Jilka, S.C. Manolagas, Nongenotropic, sex- nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity, Cell 104 (2001) 719–730.

86. Kousteni S., J.R. Chen, T. Bellido, L. Han, A.A. Ali, C.A. O Brien, L. Plotkin, Q. Fu, A.T. Mancino, Y. Wen, A.M. Vertino, C.C. Powers, S.A. Stewart, R. Ebert,

88

A.M. Parfitt, R.S. Weinstein, R.L. Jilka, S.C. Manolagas, Reversal of bone loss in mice by nongenotropic signaling of sex steroids, Science, 298 (2002) 843–846.

87. Krammer P.H., CD95 s deadly mission in the immune system, Nature 407 (2000) 789–795.

88. Lacey D.L., H.L. Tan, J. Lu, S. Kaufman, G. Van, W. Qiu, A. Rattan, S. Scully, F. Fletcher, T. Juan, M. Kelley, T.L. Burgess, W.J. Boyle, A.J. Polverino, Osteoprotegerin ligand modulates murine osteoclast survival in vitro and in vivo, Am. J. Pathol., 157 (2000) 435–448.

89. Lee KS, Hong SH, Bae SC 2002 Both the Smad and p38 MAPK pathways play a crucial role in Runx2 expression following induction by transforming growth factor- and bone morphogenetic protein. Oncogene 21:7156 –7163

90. Lee S.E., W.J. Chung, H.B. Kwak, C.H. Chung, K.B. Kwack, Z.H. Lee, H.H. Kim, Tumor necrosis factor-alpha supports the survival of osteoclasts through the activation of Akt and ERK, J. Biol. Chem. 276 (2001) 49343–49349.

91. Lefebvre V, Huang W, Harley VR, Goodfellow PN, de Crombrugghe B 1997 SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro 1(II) collagen gene. Mol Cell Biol 17:2336 –2346

92. Liu W, Toyosawa S, Furuichi T, Kanatani N, Yoshida C, Liu Y, Himeno M, Narai S, Yamaguchi A, Komori T 2001 Overexpression of Cbfa1 in osteoblasts inhibits osteoblast maturation and causes osteopenia with multiple fractures. J Cell Biol 155:157–166

93. Long F, Zhang XM, Karp S, Yang Y, McMahon AP 2001 Genetic manipulation of hedgehog signaling in the endochondral skeleton reveals a direct role in the regulation of chondrocyte proliferation. Development 128:5099 –5108

94. Luchin A, Purdom G, Murphy K, Clark MY, Angel N, Cassady AI, Hume DA, Ostrowski MC 2000 The microphthalmia transcription factor regulates expression of the tartrate-resistant acid phosphatase gene during terminal differentiation of osteoclasts. J Bone Miner Res 15:451– 460

95. Luckman S.P., D.E. Hughes, F.P. Coxon, R. Graham, G. Russell, M.J. Rogers, Nitrogen-containing bisphosphonates inhibit the mevalonate pathway and prevent post-translational prenylation of GTP-binding proteins, including Ras, J. Bone Miner. Res. 13 (1998) 581–589.

96. Martelli A.M. , P. Borgatti, R. Bortul, M. Manfredini, L. Massari, S. Capitani, L.M. Neri, Phosphatidylinositol 3-kinase translocates to the nucleus of osteoblast-like MC3T3-E1 cells in response to insulin-like growth factor I and platelet-derived growth factor but not to the proapoptotic cytokine tumor necrosis factor alpha, J. Bone Miner. Res. 15 (2000) 1716–1730.

97. Matsuo K, Galson DL, Zhao C, Peng L, Laplace C, Wang KZ, Bachler MA, Amano H, Aburatani H, Ishikawa H, Wagner EF 2004 Nuclear factor of activated T-cells (NFAT) rescues osteoclastogenesis in precursors lacking c- Fos. J Biol Chem 279:26475–26480

98. Matsuo K., D.L. Galson, C. Zhao, L. Peng, C. Laplace, K.Z. Wang, M.A. Bachler, H. Amano, H. Aburatani, H. Ishikawa, E.F. Wagner, Nuclear factor of activated T-cells (NFAT) rescues osteoclastogenesis in precursors lacking c-Fos, J. Biol. Chem. 279, (2004) 26475–26480.

99. Minina E, Wenzel HM, Kreschel C, Karp S, Gaffield W, McMahon AP, Vortkamp A 2001 BMP and Ihh/PTHrP signaling interact to coordinate chondrocyte proliferation and differentiation. Development 128:4523– 4534

100. Miyazaki T., H. Katagiri, Y. Kanegae, H. Takayanagi, Y. Sawada, A. Yamamoto, M.P. Pando, T. Asano, I.M. Verma, H. Oda, K. Nakamura, S. Tanaka, Reciprocal role of ERK and NF-kappaB pathways in survival and activation of osteoclasts, J. Cell Biol. 148 (2000) 333–342.

101. Miyazawa K, Shinozaki M, Hara T, Furuya T, Miyazono K 2002 Two major Smad pathways in TGF- superfamily signalling. Genes Cells 7:1191–1204

89

102. Moser M., Balancing life and death, Nat. Immunol. 5 (2004), 559–560. 103. Motyckova G, Weilbaecher KN, Horstmann M, Rieman DJ, Fisher DZ, Fisher DE

2001 Linking osteopetrosis and pycnodysostosis: regulation of ca- thepsin K expression by the microphthalmia transcription factor family. Proc Natl Acad Sci USA 98:5798 –5803

104. Murakami S, Lefebvre V, de Crombrugghe B 2000 Potent inhibition of the master chondrogenic factor Sox9 gene by interleukin-1 and tumor necrosis factor- . J Biol Chem 275:3687–3692

105. Nakashima K, Zhou X, Kunkel G, Zhang Z, Deng JM, Behringer RR, de Crombrugghe B 2002 The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell 108:17–29

106. O Brien C.A., F.L. Swain, J.A. Crawford, L.I. Plotkin, S.C. Manolagas, R.S. Weinstein, 11b-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (11b-HSD2) overexpression prevents glucocorticoid- induced apoptosis of osteoblast cells: a novel strategy for dissecting the mechanism of steroid-induced osteoporosis, J. Bone Miner. Res. 15 (2000) S167.

107. O Reilly L.A., L. Cullen, J. Visvader, G.J. Lindeman, C. Print, M.L. Bath, D.C. Huang, A. Strasser, The proapoptotic BH3- only protein bim is expressed in hematopoietic, epithelial, neuronal, and germ cells, Am. J. Pathol. 157 (2000) 449–461.

108. Olmedo M.L., P.S. Landry, K.K. Sadasivan, J.A. Albright, A.A. Marino, Programmed cell death in post-traumatic bone callus, Cell Mol. Biol. (Noisy-le-grand) 46 (2000) 89–97.

109. Olmedo M.L., P.S. Landry, K.K. Sadasivan, J.A. Albright, W.D. Meek, R. Routh, A.A. Marino, Regulation of osteoblast levels during bone healing, J. Orthop. Trauma 13 (1999) 356–362.

110. Opperman L.A., K. Adab, P.T. Gakunga, Transforming growth factor-beta 2 and TGF-beta 3 regulate fetal rat cranial suture morphogenesis by regulating rates of cell proliferation and apoptosis, Dev. Dyn. 219 (2000) 237–247.

111. Ornitz DM, Marie PJ 2002 FGF signaling pathways in endochondral and intramembranous bone development and human genetic disease. Genes Dev 16:1446 –1465

112. Parfitt AM: The actions of parathyroid hormone on bone: relation to bone remodeling and turnover, calcium homeostasis, and metabolic bone disease. Part III of IV parts; PTH ad osteoblasts, the relationship between bone turnover and bone loss, and the state of the bones in primary hyperparathyroidism. Metabolism 25: 1033-1069, 1976.

113. Parfitt AM: The cellular basis of bone remodeling: the quantum concept reexamined in light of recent advances in the cell biology of bone. Calcif Tissue Int 36: S37-S45, 1984.

114. Partington GA, Fuller K, Chambers TJ, Pondel M 2004 Mitf-PU.1 interactions with the tartrate-resistant acid phosphatase gene promoter during osteoclast differentiation. Bone 34:237–245

115. Pavalko F.M., R.L. Gerard, S.M. Ponik, P.J. Gallagher, Y. Jin, S.M. Norvell, Fluid shear stress inhibits TNF-alpha-induced apoptosis in osteoblasts: a role for fluid shear stress-induced activation of PI3-kinase and inhibition of caspase-3, J. Cell Physiol. 194 (2003) 194–205.

116. Pechak DG, Kujawa MJ, Caplan AI: Morphological and histochemical events during first bone formation in embryonic chick limbs. Bone 7: 441-458, 1986.

117. Penolazzi L., E. Lambertini, M. Borgatti, R. Piva, M. Cozzani, I. Giovannini, R. Naccari, G. Siciliani, R. Gambari, Decoy oligodeoxynucleotides targeting NF-kappaB transcription factors: induction of apoptosis in human primary osteoclasts, Biochem. Pharmacol. 66 (2003) 1189–1198.

90

118. Pizette S, Niswander L 2000 BMPs are required at two steps of limb chondrogenesis: formation of prechondrogenic condensations and their differentiation into chondrocytes. Dev Biol 219:237–249

119. Plotkin L.I., R.S. Weinstein, A.M. Parfitt, P.K. Roberson, S.C. Manolagas, T. Bellido, Prevention of osteocyte and osteoblast apoptosis by bisphosphonates and calcitonin, J. Clin. Invest. 104, (1999) 1363–1374.

120. Plotkin L.I., T. Bellido, Bisphosphonate-induced, hemichannel- mediated, anti-apoptosis through the Src/ERK pathway: a gap junction-independent action of connexin43, Cell Commun. Adhes. 8 (2001) 377–382.

121. Podenphant J, Engel U: Regional variations in histomorphometric bone dynamics from the skeleton of an osteoporotic woman. Calcif Tissue Int 40: 184-188, 1987.

122. Porter GA, Gurley M, Roth SI: Bone. In: Sternberg SS, ed:Histology for Pathologists, 2nd ed. Lippincott Raven, Philadelphia, PA, 1997: 85-105.

123. Recchia I., N. Rucci, A. Funari, S. Migliaccio, A. Taranta, M. Longo, M. Kneissel, M. Susa, D. Fabbro, A. Teti, Reduction of c-Src activity by substituted 5,7-diphenyl-pyr- rolo2,3-d.-pyrimidines induces osteoclast apoptosis in vivo and in vitro. Involvement of ERK1/2 pathway, Bone 34 (2004) 65–79.

124. Recker R. , K. Ensrud, S. Diem, E. Cheng, S. Bare, P. Masarachia, P. PRoschger, P. Fratzl, K. Klaushofer, A. Lom- bardi, D. Kimmel, Normal bone histomorphometry and 3D microarchitecture after 10 years Alendronate treatment of postmenopausal women, J. Bone Miner. Res. 19 (2004) S45.

125. Reid I.R. , Glucocorticoid osteoporosis—mechanisms and man- agement, Eur. J. Endocrinol. 137 (1997) 209–217.

126. Robledo RF, Rajan L, Li X, Lufkin T 2002 The Dlx5 and Dlx6 homeobox genes are essential for craniofacial, axial, and appendicular skeletal development. Genes Dev 16:1089 –1101

127. Rogers A.W. Textbook of anatomy. Edinburgh: Ed. Murchill and Livingstone, 1992. 128. Rose CS, Malcolm S 1997 A TWIST in development. Trends Genet 13:384 –387 129. Ross A., Romcell J. Histology: a text and atlas. 2-nd ed. Baltimore: Williams and

Wilkins, 1989. 130. Sabatakos G, Sims NA, Chen J, Aoki K, Kelz MB, Amling M, Bouali Y,

Mukhopadhyay K, Ford K, Nestler EJ, Baron R 2000 Overexpression of FosB transcription factor(s) increases bone formation and inhibits adipogenesis. Nat Med 6:985–990

131. Sahni M, Ambrosetti DC, Mansukhani A, Gertner R, Levy D, Basilico C 1999, FGF signaling inhibits chondrocyte proliferation and regulates bone development through the STAT-1 pathway. Genes Dev 13:1361–1366

132. Sato M, Morii E, Takebayashi-Suzuki K, Yasui N, Ochi T, Kitamura Y, Nomura S 1999 Microphthalmia-associated transcription factor interacts with PU.1 and c-Fos: determination of their subcellular localization. Biochem Bio- phys Res Commun 254:384 –387

133. Satokata I, Ma L, Ohshima H, Bei M, Woo I, Nishizawa K, Maeda T, Takano Y, Uchiyama M, Heaney S, Peters H, Tang Z, Maxson R, Maas R 2000 Msx2 deficiency in mice causes pleiotropic defects in bone growth and ectodermal organ formation. Nat Genet 24:391–395

134. Scott E.W., R.C. Fisher, M.C. Olson, E.W. Kehrli, M.C. Simon, H. Singh, PU.1 functions in a cell-autonomous manner to control the differentiation of multipotential lymphoid-myeloid progenitors, Immunity 6 (1997) 437–447.

135. Sekiya I, Tsuji K, Koopman P, Watanabe H, Yamada Y, Shinomiya K, Nifuji A, Noda M 2000 SOX9 enhances aggrecan gene promoter/enhancer activity and is up-regulated by retinoic acid in a cartilage-derived cell line, TC6. J Biol Chem 275:10738 –10744

91

136. Shevde, N. K. şi colaboratorii Estrogen suppress RANK ligand induced osteoclast differentiation via a stromal cell independent mechanism involvingc-Jun repression. Proc. Nati Acad. Sci. USA 97: 2000, p. 7829-7834.

137. Shibahara M. , K. Nishida, H. Asahara, T. Yoshikawa, S. Mitani, Y. Kondo, H. Inoue, Increased osteocyte apoptosis during the development of femoral head osteonecrosis in spontaneously hypertensive rats, Acta Med. Okayama 54, (2000) 67–74.

138. Sierra J, Villagra A, Paredes R, Cruzat F, Gutierrez S, Javed A, Arriagada G, Olate J, Imschenetzky M, Van Wijnen AJ, Lian JB, Stein GS, Stein JL, Montecino M 2003 Regulation of the bone-specific osteocalcin gene by p300 requires Runx2/Cbfa1 and the vitamin D3 receptor but not p300 intrinsic histone acetyltransferase activity. Mol Cell Biol 23:3339 –3351

139. Silvestrini G., P. Ballanti, F.R. Patacchioli, P. Mocetti, R. Di Grezia, B.M. Wedard, L. Angelucci, E. Bonucci, Evaluation of apoptosis and the glucocorticoid receptor in the cartilage growth plate and metaphyseal bone cells of rats after high-dose treatment with corticosterone, Bone 26 (2000) 33–42.

140. Silvestrini G., P. Mocetti, P. Ballanti, R. Di Grezia, E. Bonucci, In vivo incidence of apoptosis evaluated with the TdT FragEL DNA fragmentation detection kit in cartilage and bone cells of the rat tibia, Tissue Cell 30 (1998) 627–633.

141. Sims NA, Clement-Lacroix P, Minet D, Fraslon-Vanhulle C, Gaillard-Kelly M, Resche-Rigon M, Baron R 2003 A functional androgen receptor is not sufficient to allow estradiol to protect bone after gonadectomy in estradiol receptor-deficient mice. J Clin Invest 111:1319 –1327

142. Sitcheran R, Cogswell PC, Baldwin Jr AS 2003 NF- B mediates inhibition of mesenchymal cell differentiation through a posttranscriptional gene silencing mechanism. Genes Dev 17:2368 –2373

143. Smith T.H., Dgaard A., Schneider E. Structure and function of vertebral trabecular bone. În: Spine, vol. 22 (1997), p. 2823-2833.

144. Smits P, Li P, Mandel J, Zhang Z, Deng JM, Behringer RR, de Crombrugghe B, Lefebvre V 2001 The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Dev Cell 1:277–290

145. So H, Rho J, Jeong D, Park R, Fisher DE, Ostrowski MC, Choi Y, Kim N 2003, Microphthalmia transcription factor and PU.1 synergistically induce the leu- kocyte receptor osteoclast-associated receptor gene expression. J Biol Chem 278:24209 –24216

146. Sowa H, Kaji H, Hendy GN, Canaff L, Komori T, Sugimoto T, Chihara K 2004, Menin is required for BMP-2-and TGF- -regulated osteoblastic differentiation through interaction with Smads and Runx2. J Biol Chem 279:40267– 40275

147. Sowa H., H. Kaji, M.F. Iu, T. Tsukamoto, T. Sugimoto, K. Chihara, Parathyroid hormone-Smad3 axis exerts anti-apoptotic action and augments anabolic action of transforming growth factor beta in osteoblasts, J. Biol. Chem. 278 (2003) 52240–52252.

148. Steingrimsson E, Tessarollo L, Pathak B, Hou L, Arnheiter H, Copeland NG, Jenkins NA 2002 Mitf and Tfe3, two members of the Mitf-Tfe family of bHLH-Zip transcription factors, have important but functionally redundant roles in osteoclast development. Proc Natl Acad Sci USA 99:4477– 4482

149. Stout SD, Brunsden BS, Hildebolt CF, et al: Computer-assisted 3D reconstruction of serial sections of corticalbone to determine the 3D structure of osteons. Calcif Tissue Int 65: 280-4, 1999.

150. Sunyer T., J. Lewis, P. Collin-Osdoby, P. Osdoby, Estrogen s bone-protective effects may involve differential IL-1 receptor regulation in human osteoclast-like cells, J. Clin. Invest. 103, (1999) 1409–1418.

92

151. Takayanagi H, Kim S, Koga T, Nishina H, Isshiki M, Yoshida H, Saiura A, Isobe M, Yokochi T, Inoue J, Wagner EF, Mak TW, Kodama T, Taniguchi T, Induction and activation of the transcription factor NFATc1 (NFAT2) integrate RANKL signaling in terminal differentiation of osteoclasts. Dev Cell 3:889 –901

152. Takayanagi H., S. Kim, T. Koga, H. Nishina, M. Isshiki, H. Yoshida, A. Saiura, M. Isobe, T. Yokochi, J. Inoue, E.F. Wagner, T.W. Mak, T. Kodama, T. Taniguchi, Induction and activation of the transcription factor NFATc1 (NFAT2) integrate RANKL signaling in terminal differentiation of osteoclasts, Dev. Cell 3 (2002) 889–901.

153. Takeda S, Bonnamy JP, Owen MJ, Ducy P, Karsenty G 2001 Continuous expression of Cbfa1 in nonhypertrophic chondrocytes uncovers its ability to induce hypertrophic chondrocyte differentiation and partially rescues Cbfa1- deficient mice. Genes Dev 15:467– 481

154. Takeda S., F. Elefteriou, R. Levasseur, X. Liu, L. Zhao, K.L. Parker, D. Armstrong, P. Ducy, G. Karsenty, Leptin regulates bone formation via the sympathetic nervous system, Cell 111, (2002) 305–317.

155. Termie JD : Cellular activity, matrix proteins, and aging bone. Exp Gerontol 25: 217-221, 1990.

156. Tondravi MM, McKercher SR, Anderson K, Erdmann JM, Quiroz M, Maki R, Teitelbaum SL 1997 Osteopetrosis in mice lacking haematopoietic transcription factor PU.1. Nature 386:81– 84

157. Tsuboi M., A. Kawakami, T. Nakashima, N. Matsuoka, S. Urayama, Y. Kawabe, K. Fujiyama, T. Kiriyama, T. Aoyagi, K. Maeda, K. Eguchi, Tumor necrosis factor-alpha and interleukin-1beta increase the Fas-mediated apoptosis of human osteoblasts, J. Lab. Clin. Med. 134 (1999) 222–231.

158. Tsuda E, Goto M, Mochizuki S, Yano K, Kibayashi F, Morinaga T, Higashio K, -Isolation of a novel cytokine from human fibroblasts that specifically inhibits osteoclastogenesis.Biochem Biophys Res Commun 1997; 234:137-42)

159. Tsumaki N, Nakase T, Miyaji T, Kakiuchi M, Kimura T, Ochi T, Yoshikawa H 2002 Bone morphogenetic protein signals are required for cartilage formation and differently regulate joint development during skeletogenesis. J Bone Miner Res 17:898 –906

160. Tsumaki N, Tanaka K, Arikawa-Hirasawa E, Nakase T, Kimura T, Thomas JT, Ochi T, Luyten FP, Yamada Y 1999 Role of CDMP-1 in skeletal morphogenesis: promotion of mesenchymal cell recruitment and chondrocyte differentiation. J Cell Biol 144:161–173

161. Ueta C, Iwamoto M, Kanatani N, Yoshida C, Liu Y, Enomoto-Iwamoto M, Ohmori T, Enomoto H, Nakata K, Takada K, Kurisu K, Komori T 2001, Skeletal malformations caused by overexpression of Cbfa1 or its dominant negative form in chondrocytes. J Cell Biol 153:87–100

162. Urayama S., A. Kawakami, T. Nakashima, M. Tsuboi, S. Yamasaki, A. Hida, Y. Ichinose, H. Nakamura, E. Ejima, T. Aoyagi, T. Nakamura, K. Migita, Y. Kawabe, K. Eguchi, Effect of vitamin K2 on osteoblast apoptosis: vitamin K2 inhibits apoptotic cell death of human osteoblasts induced by Fas, proteasome inhibitor, etoposide, and staurosporine, J. Lab. Clin. Med. 136 (2000) 181–193.

163. Van Beek E., C. Lowik, I. Que, S. Papapoulos, Dissociation of binding and antiresorptive properties of hydroxybisphospho- nates by substitution of the hydroxyl with an amino group, J. Bone Miner. Res. 11 (1996) 1492–1497.

164. Van Wesenbeeck L, Cleiren E, Gram J, Beals RK, Benichou O, Scopelliti D, Key L, Renton T, Bartels C, Gong Y, Warman ML, De Vernejoul MC, Boller- slev J, Van Hul W 2003 Six novel missense mutations in the LDL receptor- related protein 5 (LRP5) gene in different conditions with an increased bone density. Am J Hum Genet 72:763–771

93

165. Verborgt O., G.J. Gibson, M.B. Schaffler, Loss of osteocyte integrity in association with microdamage and bone remodeling after fatigue in vivo, J. Bone Miner. Res. 15 (2000) 60–67.

166. Villunger A., C. Scott, P. Bouillet, A. Strasser, Essential role for the BH3-only protein Bim but redundant roles for Bax, Bcl-2, and Bcl-w in the control of granulocyte survival, Blood 101, (2003) 2393–2400.

167. Wahner H.W. Measurements of bone mass and bone density. În: Endocrinol Metab Clin North Am., vol. 18 (1989), p. 995-1012.

168. Wang W, Wang YG, Reginato AM, Glotzer DJ, Fukai N, Plotkina S, Karsenty G, Olsen BR 2004 Groucho homologue Grg5 interacts with the transcription factor Runx2-Cbfa1 and modulates its activity during postnatal growth in mice. Dev Biol 270:364 –381.

169. Weinstein R.S., J.R. Chen, C.C. Powers, S.A. Stewart, R.D. Landes, T. Bellido, R.L. Jilka, A.M. Parfitt, S.C. Manolagas, Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids, J. Clin. Invest. 109 (2002) 1041–1048.

170. Weinstein R.S., R.W. Nicholas, S.C. Manolagas, Apoptosis of osteocytes in glucocorticoid-induced osteonecrosis of the hip, J. Clin. Endocrinol. Metab. 85 (2000) 2907–2912.

171. Wernyj R.P. , M.P. Mattson, S. Christakos, Expression of calbindin-D28k in C6 glial cells stabilizes intracellular calcium levels and protects against apoptosis induced by calcium iono- phore and amyloid b-peptide, Brain Res. Mol. Brain Res. 64, (1999) 69–79.

172. Whitfield J.F., P. Morley, G.E. Willick, The control of bone growth by parathyroid hormone, leptin, & statins, Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 12 (2002) 23–51.

173. Windahl S.H., R. Chiusaroli, P. Clement-Lacroix, D. Minet, R. CGalien, W.C. JHorne, M. Resche-Rigon, R. Baron, Estrens are non-selective ligands of the androgen receptor, protecting bone in estrogen receptor a-deleted male mice whilst also affecting reproductive organs, J. Bone Miner. Res. 19 (2004) S31.

174. Wong B.R., D. Besser, N. Kim, J.R. Arron, M. Vologodskaia, H. Hanafusa, Y. Choi, TRANCE, a TNF family member, activates Akt/PKB through a signaling complex involving TRAF6 and c-Src, Mol. Cell 4 (1999) 1041–1049.

175. Woo K.M., H.M. Kim, J.S. Ko, Macrophage colony-stimulating factor promotes the survival of osteoclast precursors by up- regulating Bcl-X(L), Exp. Mol. Med. 34 (2002) 340–346.

176. Wu X., M.A. McKenna, X. Feng, T.R. Nagy, J.M. McDonald, Osteoclast apoptosis: the role of Fas in vivo and in vitro, Endocrinology 144 (2003) 5545–5555.

177. Wunderle VM, Critcher R, Hastie N, Goodfellow PN, Schedl A 1998 Deletion of long-range regulatory elements upstream of SOX9 causes campomelic dysplasia. Proc Natl Acad Sci USA 95:10649 –10654

178. Xing L., T.P. Bushnell, L. Carlson, Z. Tai, M. Tondravi, U. Siebenlist, F. Young, B.F. Boyce, NF-kappaB p50 and p52 expression is not required for RANK-expressing osteoclast progenitor formation but is essential for RANK- and cytokine- mediated osteoclastogenesis, J. Bone Miner. Res. 17 (2002) 1200–1210.

179. Xing L., A.M. Venegas, A. Chen, L. Garrett-Beal, B.F. Boyce, H.E. Varmus, P.L. Schwartzberg, Genetic evidence for a role for Src family kinases in TNF family receptor signaling and cell survival, Genes Dev. 15 (2001) 241–253.

180. Yamaguchi TP, Bradley A, McMahon AP, Jones S 1999 A Wnt5a pathway underlies outgrowth of multiple structures in the vertebrate embryo. Devel- opment 126:1211–1223

181. Yamashita T., L. Xing, K. Matsuo, E.F. Wagner, B.F. Boyce, Treatment of c-Fos over-expressing osteoclast precursors with cytokines induces osteoclast formation and abrogates bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis, J. Bone Miner. Res. 18, (2003) S17.

94

182. Yang X, Matsuda K, Bialek P, Jacquot S, Masuoka HC, Schinke T, Li L, Brancorsini S, Sassone-Corsi P, Townes TM, Hanauer A, Karsenty G 2004, ATF4 is a substrate of RSK2 and an essential regulator of osteoblast biology; implication for Coffin-Lowry syndrome. Cell 117:387–398

183. Yang Y, Topol L, Lee H, Wu J 2003 Wnt5a and Wnt5b exhibit distinct activities in coordinating chondrocyte proliferation and differentiation. Development 130:1003–1015

184. Yang Y, Topol L, Lee H, Wu J 2003 Wnt5a and Wnt5b exhibit distinct activities in coordinating chondrocyte proliferation and differentiation. Development 130:1003–1015

185. Yasuda H, Shima N,Nakagawa N, et.al – Osteoclast differentation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL.Proc.Natl Acad Sci U S A 1998; 95.3597-602

186. Yeh S, Tsai MY, Xu Q, Mu XM, Lardy H, Huang KE, Lin H, Yeh SD, Altuwaijri S, Zhou X, Xing L, Boyce BF, Hung MC, Zhang S, Gan L, Chang C, Hung MC 2002 Generation and characterization of androgen receptor knockout (ARKO) mice: an in vivo model for the study of androgen functions in selective tissues. Proc Natl Acad Sci USA 99:13498 –13503

187. Yoshida CA, Yamamoto H, Fujita T, Furuichi T, Ito K, Inoue K, Yamana K, Zanma A, Takada K, Ito Y, Komori T 2004 Runx2 and Runx3 are essential for chondrocyte maturation, Runx2 regulates limb growth through induction of Indian hedgehog. Genes Dev 18:952–963

188. Yoshida H, Hayashi S, Kunisada T, Ogawa M, Nishikawa S, Okamura H, Sudo T, Shultz LD 1990 The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene. Nature 345:442– 444

189. Zalavras C., S. Shah, M.J. Birnbaum, B. Frenkel, Role of apoptosis in glucocorticoid-induced osteoporosis and osteonecrosis, Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 13 (2003) 221–235.

190. Zamurovic N, Cappellen D, Rohner D, Susa M 2004 Coordinated activation of Notch, Wnt and TGF- signaling pathways in BMP-2 induced osteogenesis: notch target gene Hey1 inhibits mineralization and Runx2 transcriptional activity. J Biol Chem 279:37704 –37715

191. Zhang Q., I. Badell, E.M. Schwarz, B.F. Boyce, L. Xing, TNF protects osteoclasts from alendronate-induced apoptosis by stimulating Bcl-xL expression through the transcription factor, Ets2, J. Bone Miner. Res. 19 (2004) S171.

192. Zhang YW, Yasui N, Ito K, Huang G, Fujii M, Hanai J, Nogami H, Ochi T, Miyazono K, Ito Y 2000 A RUNX2/PEBP2 A/CBFA1 mutation displaying impaired transactivation and Smad interaction in cleidocranial dysplasia. Proc Natl Acad Sci USA 97:10549 –10554

193. Zhao W., M.H. Byrne, Y. Wang, S.M. Krane, Osteocyte and osteoblast apoptosis and excessive bone deposition accompany failure of collagenase cleavage of collagen, J. Clin. Invest. 106, (2000) 941–949.

194. Zheng M.H., Bruining H.C., Cody S.H., Brankov B., Wood D.J., Papadimitrion J.M. A rapid method for the assessment of bone architecture by confocal microscope. În: Histochem J., vol. 29 (1997), p. 639-643.

Date post:	06-Feb-2017
Category:	Documents
Upload:	buinhi
View:	250 times
Download:	0 times

melinte v. petru răzvan

Documents