UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ … filelaborator obligatorii ale sistemului...

Dr. Duma Mihaela Teză de doctorat 2011

[249]

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ

VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

FACULTATEA DE MEDICINĂ VETERINARĂ

DUMA MIHAELA

REZUMAT TEZĂ DE DOCTORAT

STUDII DE LABORATOR PRIVIND SISTEMUL NERVOS CENTRAL LA OVINE,

ÎN SCOP DE SUPRAVEGHERE ŞI DIAGNOSTIC AL BOLILOR CU LOCALIZARE NERVOASĂ

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC

Prof. Univ. Dr. Dr. H.C. ALECSANDRU IOAN BABA

Membrul titular al Academiei de Ştiinţe Agricole şi Silvice

CLUJ-NAPOCA

-2011-


[250]

Rezumat

Factorii de ordin infecţios, traumatic, toxic sau degenerativ din alte organe induc

fie leziuni patognomonice în structurile sistemului nervos central (exemplu: rabia,

scrapia), fie modificări ale organizării cito-histologice complexe a ţesutului nervos şi

determină apariţia unor procese patologice caracterizate, în special, prin modificări la

nivelul neuronilor şi la nivelul elementelor celulare gliale ca leziuni asociate, cu

semnificaţie diagnostică în coroborare cu datele epizootologice şi alte investigaţii de

laborator.

Prin examen histopatologic se urmăreşte punerea în evidenţă a modificărilor

structurale esenţiale sub aspect morfologic şi histologic, în vederea identificării

mecanismelor generatoare de tulburări la nivel local şi impactul acestora asupra

întregului organism, corelând manifestările clinice ale animalului bolnav (când acestea au

fost surprinse) cu leziunile decelate.

Modificările structurale evidenţiate la nivel macroscopic şi microscopic stau la

baza interpretării leziunilor produse de agenţii patogeni sau vulneranţi, ierarhizând

contribuţia lor la dezvoltarea leziunilor în dinamică sau prin efect cumulativ când acesta

există.

Formele nervoase sunt semnalate frecvent la ovine, dar în acelaşi timp sunt foarte

uniforme ca manifestare clinică şi morfopatologică. Pentru acest motiv, cercetarea

modificărilor histopatologice ale sistemului nervos central în vederea stabilirii frecvenţei,

localizărilor preferenţiale, tipului lezional predominant sau descoperirii unor leziuni

specific etiologice, au importanţă practică în stabilirea diagnosticului diferenţial.

Encefalopatiile spongiforme transmisibile, alături de altă zoonoză majoră cu

localizare nervoasă la ovine, rabia, sunt bolile pentru care sunt prevăzute investigaţii de

laborator obligatorii ale sistemului nervos central la ovine în cadrul Programul acţiunilor

de supraveghere, prevenire, control şi eradicare a bolilor la animale, a celor

transmisibile de la animale la om, elaborat de Autoritatea Naţională Sanitară Veterinară

Bucureşti.


[251]

Din 1990 până în prezent, Comisia Europeană a adoptat o serie de măsuri de

protecţie a sănătăţii umane şi animale de riscul de contaminare cu encefalopatii

spongiforme transmisibile (EST). Aceste măsuri au avut la bază dispoziţiile de

salvgardare ale directivelor privind măsurile de control veterinar.

Având în vedere magnitudinea riscului pe care îl reprezintă anumite forme de

EST, Comisia prevede programe de monitorizare sporită pentru caprine şi ovine, în urma

detectării cazurilor de encefalopatie spongiformă bovină (ESB) la o capră în 2005 şi a trei

cazuri neobişnuite de EST la oi, cazuri pentru care nu putea fi exclusă ESB.

Structura cercetărilor. Teza cuprinde un număr de 248 pagini şi este structurată în

conformitate cu prevederile legale actuale; în conţinutul acesteia sunt inserate un număr

de 121 figuri (imagini, grafice, diagrame) şi 23 de tabele. În partea I sunt prezentate cele

mai importante şi concludente date din literatura de specialitate referitoare la aspecte

histologice, fiziologice, citopatologice ale țesutului nervos şi aspecte referitoare la

encefalopatiile spongiforme transmisibile la rumegătoarele mici – etiologia prionică,

patogeneză, diagnostic clinic şi de laborator. În partea a II-a sunt prezentate cercetările

proprii ce au vizat studii de laborator pentru monitorizarea scrapiei (capitolul II.1),

studiul histopatologic (capitolul II.2) al sistemului nervos central efectuat pe un număr

determinat de probe de creier, în vederea identificării de modificări/leziuni ale ţesutului

nervos, altele decât cele specifice encefalopatiilor spongiforme transmisibile şi, în final,

confirmarea a două focare de scrapie (capitolul II.3). Partea bibliografică cuprinde un

număr de 201 titluri de lucrări ştiinţifice din literatura de specialitate autohtonă şi străină.

Studii de laborator pentru monitorizarea scrapiei

În capitolul II.1. sunt evaluate rezultatele investigaţiilor de laborator în direcţia

scrapiei şi sunt comparate metodele de diagnostic între ele sub aspectul sensibilităţii şi

specificităţii, respectiv decelarea şi cuantificarea acumulărilor de proteină prionică

anormală PrPres rezistentă la proteinaza K în ţesutul nervos, prin teste imunoenzimatice şi

evidenţierea prezenţei/absenţei leziunilor provocate de convertirea PrP în PrPres şi

acumularea acesteia, prin examene histopatologice.


[252]

Studiul a avut în vedere testele de laborator la care au fost supuse probele de creier

de ovine pentru supravegherea şi/sau monitorizarea formelor de encefalopatii

spongiforme transmisibile la rumegătoarele mici, în judetul Cluj între anii 2004-2010.

Pe parcursul anilor luaţi în studiu a fost examinat un număr total de 1540 ovine, cu

respectarea grupelor „ţintă” stabilite de prevederile legislaţiei referitoare la EST.

Astfel, un număr de 610 probe au provenit de la ovine moarte, 594 probe de la

ovine sacrificate de urgenţă (în această categorie înscriindu-se şi ovinele sacrificate în

scop de confirmare de diagnostic sau ca urmare a necesităţii eliminării din efectiv, cum

este cazul celor cu diagnostic de epididimită infecţioasa, maedi-visna), iar un număr de

336 probe au provenit de la ovine clinic sănătoase sacrificate pentru consum uman

(sacrificare tradiţională pentru consum familial).

Urmărind precizările tehnice ale Programului pentru eradicarea şi monitorizarea

encefalopatiilor spongiforme transmisibile, în cazul probelor de creier recoltate de la

animalele moarte şi de la animalele sacrificate de urgenţă (cu excepţia celor improprii

procesării histologice) s-a efectuat atât screening-ul rapid, cât şi examenul histologic,

conform procedurii specifice.

Screening-ul rapid s-a făcut utilizând metoda BIO-RAD TeSeE, metodă validată în

laboratorul de histopatologie al LSVSA Cluj şi acreditată de către Organismul Naţional de

Acreditare din România (RENAR.). Este o metodă imunoenzimatică ce utilizează 2 anticorpi

monoclonali şi permite determinarea calitativă a proteinei anormale prionice PrPres

rezistentă la proteinaza K, în ţesutul nervos central, după denaturarea şi concentrarea

proteinelor.

Histopatologic, pentru fiecare probă s-au examinat în total câte 20 de secţiuni din

bulb rahidian, protuberanţă anullară, mezencefal cu zona de colliculus anterior, cerebel,

cortex cerebral şi măduva rahidiană din zona cervicală, procesate prin tehnica la parafină

şi colorate Hematoxilină Eozină.

Astfel, din totalul de 1540 probe de creier supuse examinarii prin teste rapide, un

număr total de 541 au fost supuse şi examenului histopatologic pentru evidenţierea

leziunilor caracteristice scrapiei, după cum urmează: 330 probe de creier prelevate de la

cadavre (ovine moarte în ferme, gospodăriile populaţiei, pe păşune, în timpul

transportului, în abator, sau în cazul unor accidente, indiferent de natura acestora), 208


[253]

probe creier prelevate de la ovine sacrificate de urgenţă (ovine la care examenul clinic

ante-mortem a stabilit prezenţa unor manifestări nervoase sau faptul că nu se pot deplasa,

stau culcate, incapabile să se ridice sau să meargă fără asistenţă; ovine identificate de

medicul oficial în abator la inspecţia ante-mortem cu semne clinice de boală, indiferent

de natura bolii: boli infecţioase, medicale etc ) şi un număr de 3 probe creier recoltate de

la ovine sacrificate pentru consum uman (familial).

Din totalul de 1540 teste imunoenzimatice, 1527 teste au prezentat densităţile

optice mai mici decât valoarea prag (cut-off-ul), înregistrând deci rezultate negative la

prima testare. Un număr de 13 teste au prezentat iniţial densităţi optice situate chiar sub

valoarea prag şi au fost retestate în duplicat pornind de la omogenatul iniţial. Pentru toate

cele 13 cazuri rezultatele au fost negative pentru ambele duplicate.

În cazul celor 541 probe de creier procesate histopatologic prin tehnica la parafină

nu s-au evidenţiat leziuni specifice encefalopatiilor spongiforme transmisibile, în niciunul

din fragmentele de ţesut nervos examinate.

În urma acestor examene (screening rapid, examene histopatologice) s-a stabilit că

probele de creier analizate în perioada 2004-2010 proveneau de la ovine libere de

encefalopatii spongiforme transmisibile (scrapie clasică, scrapie atipică).

Studiu histopatologic

În capitolul II.2. sunt prezentate rezultatele unui studiu histopatologic al sistemului

nervos central pe un număr determinat de probe de creier (100) prelucrate histologic

pentru monitorizarea scrapiei, urmărind analiza incidenţei modificărilor / leziunilor

(altele decât cele specifice EST) în sistemul nervos central la categoriile “ţintă” de ovine

examinate, clasificarea acestora în funcţie de caracteristicile histologice predominante,

realizarea unei ierarhizări comparative, evaluarea repartiţiei şi frecvenţei leziunilor

microscopice în diferitele segmente de ţesut nervos examinate, stabilirea unei corelaţii

între modificările/leziunile identificate şi starea de sănătate sau/şi existenţa unor leziuni la

distanţă.

Studiul a identificat modificări/leziuni de diferite tipuri ale ţesutului nervos la 73%

din cazurile examinate, grupate în funcţie de predominanţa aspectelor histopatologice

degenerative, vasculare, reacţii celulare neinflamatorii/inflamatorii.


[254]

Sintetic, rezultatele examinării microscopice au identificat modificări degenerative

ale corpului celulei nervoase (modificări ale nucleului, citoplasmei), tulburări vasculare

(edem, congestii, hemoragii, proliferări ale celulelor endoteliale, tromboze vasculare),

reacţii celulare (infiltraţii cu mononucleare, infiltraţii cu granulocite, proliferări ale

celulelor gliale, ale macrofagelor, prezenţa celulelor gigante), prezenţa incluziilor virale,

imagini de moarte celulară (tigroliză, satelitoză, neuronofagie), tulburări metabolice cu

acumulare de pigment melanic, prezenţa granuloamelor de tip parazitar.

Realizând o ierarhizare descrescândă a tipurilor de modificări/leziuni din diferitele

segmente de sistem nervos central pentru cele 100 cazuri analizate au fost constatate

următoarele:

Cele mai numeroase leziuni au fost cele de tip vascular, rezultatul examinării

microscopice fiind un total de 177, din care imaginile de edem au fost întâlnite de 84 de

ori, congestiile de 53 de ori, hemoragiile de 8 ori; au fost surprinse 29 de imagini cu

proliferări ale celulelor endoteliului vascular şi 3 imagini de tromboză vasculară.

În ierarhie urmează modificările degenerative ale pericarionilor cu un număr total

de 93 de imagini, de tip “cromatolitic“(45 imagini care frecvent au putut fi interpretate

ca indicator al unor degenerescenţe nespecifice combinate cu pierderea afinităţii

tinctoriale), degenerescenţe granulare şi vacuolare (31) şi atrofie neuronală cu pierderea

volumului citoplasmatic şi reducerea în volum (17).

Reacţiile celulare au fost surprinse în număr total de 84 şi au constat în infitraţii cu

mononucleare (37), infiltraţii cu granulocite neutrofile (16), gliocitoză (14), inifiltraţii cu

eozinofile (13), proliferări ale macrofagelor (2), prezenţa celulelor gigante (2).

Incluziile virale au fost surprinse de 2 ori, situate intracitoplasmatic.

Au fost surprinse 28 de imagini de moarte celulară cu satelitoză (11), neuronofagie

(9), tigroliză (8).

Acumularea de pigment melanic a fost surprinsă de 3 ori la nivelul

leptomeningelui.

Analizând repartizarea tipurilor de modificări/leziuni pe categorii de ovine, la

ovinele moarte şi la cele sacrificate de urgenţă care reprezintă 97% din materialul de

studiu, au rezultat următoarele:


[255]

La ambele categorii de ovine au predominat leziunile de tip vascular, urmate de

modificările degenerative ale pericarionilor.

În cazul probelor de creier provenite de la ovinele sacrificate de urgenţă s-au

înregistrat reacţii celulare pentru toate tipurile celulare (mononucleare, granulocite

neutrofile, celule gliale, eozinofile). Prezenţa celulelor macrofage şi a celulelor gigante

de tip parazitar a fost surprinsă în aceeaşi măsură pentru ambele categorii.

Imaginile de moarte celulară au fost mai frecvent întâlnite la sacrificările de

urgenţă, comparativ cu preparatele histologice provenite de la cadavre.

Acumularea de pigment melanic a fost întâlnită la preparatele histologice de la

cadavre, dar nu a fost întâlnită la preparatele obţinute de la ovinele sacrificate de urgenţă.

Granuloamele parazitare au fost întâlnite în egală măsură la cele două categorii de

ovine.

În cazul examinării preparatelor histologice provenite de la ovinele sacrificate

pentru consum uman, s-au întâlnit: imagini de tip cromatolitic (2), congestii (2), infiltraţii

cu mononucleare (2), edem (1), satelitoză (1), melanoză (1).

Evaluarea statistică privind incidenţa localizării principalelor tipuri de leziuni

microscopice în segmentele de sistem nervos central examinate a relevat următoarele:

Modificările degenerative ale pericarionului au afectat în primul rând bulbul

rahidian (22,31%), apoi, aproximativ în egală măsură, cortexul cerebral (19,83%),

cerebelul (19%), puntea (18,18%) şi tuberculii cvadrigemeni (16,53%). Într-o măsură

mult mai redusă au fost afectaţi neuronii din hipocamp sau măduva rahidiană cervicală.

Se constată o incidenţă mai crescută a leziunilor neinflamatorii, constând în edem,

congestii, hemoragii, cu precădere în zona tuberculilor cvadrigemeni (29,37%), bulbului

(22,03%), cerebelului (19,21%), cortexului cerebral (12,99%,) şi punţii (11,30%), în timp

ce preponderenţa acestora este mult mai mică în măduva rahidiană cervicală (3,38%) şi

hipocamp (1,69%).

În cazul leziunilor inflamatorii bulbul rahidian a fost cel mai afectat, în proporţie

de 34,14%, apoi tuberculii cvadrigemeni, în proporţie de 24,39%, cortexul cerebelos şi

cortexul cerebral în proporţie de 19,31%, respectiv, 12,50%, În procent mult mai redus au

fost sediul leziunilor inflamatorii, hipocampul cu 4,55%, măduva rahidiană şi puntea cu

câte 3,41% şi 2,27%.


[256]

Depunerea de pigment melanic a fost identificată în 100% din cazuri cu localizare

în leptomeningele cerebelului şi al emisferelor cerebrale.

Nu există diferenţe semnificative statistic sub raportul frecvenţei cu care se

localizează modificările/leziunile în segmentele de ţesut nervos examinate. Bulbul

rahidian şi tuberculii cvadrigemeni sunt segmentele afectate în cea mai mare măsură, în

timp ce hipocampul şi măduva rahidiană sunt afectate în cea mai mică măsură. Cortexul

cerebral şi cerebelul sunt sediul modificărilor aproximativ cu aceeaşi frecvenţă. În punte

se remarcă prezenţa modificărilor degenerative ale pericarionilor şi a leziunilor

neinflamatorii şi într-o măsură mult mai mică se produc leziuni inflamatorii.

Leziunile de tip vascular au predominat la 41% din cazuri, urmate în ierarhie de

leziunile inflamatorii, cu un procent de 16%. În această categorie s-au încadrat

inflamaţiile de natură parazitară (8%), inflamaţiile de natură bacteriană (6%) şi

inflamaţiile de natură virală (2%). La 11% din cazuri au fost identificate modificări a

căror etiologie nu a putut fi precizată şi care au fost atribuite unor afecţiuni şi stări

patologice la nivelul unor organe viscerale, de natură metabolică, infecţioasă şi/sau

parazitară. A fost observată acumularea de pigment melanic în 3% din cazuri şi

modificări ale lichidului cefalo-rahidian în 2% din cazuri. Nu s-au observat modificări ale

ţesutului nervos în segmentele de sistem nervos central examinate în 27% din cazuri.

Edemul neinflamator a fost diagnosticat ca modificare predominantă la 37 de

cazuri şi a constat în imagini de lărgire a spaţiului Wircoff-Robin, uneori cu prezenţa

unui lichid slab colorat, cu aspect vacuolar; capilarele sau arteriolele aveau lumenul redus

datorită transsudatului. Baza edemului vasogenic o reprezintă lezionarea endoteliului

vascular, cu o severitate care permite creşterea permeabilităţii vasculare. Fluidul se

dispersează între celule, ca răspuns la presiunea hidrostatică de la nivelul circulaţiei

cerebrale şi a celei de la nivelul altor ţesuturi

S-au constatat diferenţe de susceptibilitate la edem, între materia cenuşie şi cea

albă, iar vulnerabilitatea diferitelor zone cu materie cenuşie sau albă a fost, de asemenea,

diferită şi a constat în imagini de edem intracelular tradus prin hipertrofia astrocitelor,

acompaniată uneori de reacţia oligodendrocitelor de la nivelul materiei albe (nucleu

mărit, mai puţin dens, hipocrom); edem vasogenic (intercelular) fără modificări majore la


[257]

nivelul substanţei cenuşii, dar materia albă, care oferă o rezistenţă mai scăzută la trecerea

fluidului de edem, apare texturată, cu aspect vacuolar.

Frecvent, s-a constatat edem sub epiteliul canalului ependimar, celulele epiteliale

fiind invadate de lichid, nucleul celulelor împins spre polul apical, uneori chiar picnotic;

alteori, celulele epiteliale erau desprinse, iar substanţa nervoasă limitrofă avea aspect

spongios.

Cerebelul, mai cu seamă în zona celulelor Purkinje, a fost sediul unui edem ce

disloca şi compresa celulele. Adesea edemul a fost acompaniat de o discretă gliocitoză

şi/sau limfocitoză.

Hemoragiile au predominat la 4 cazuri, fiind întâlnite aspecte de hemoragii prin

diapedeză, fără specificitate în distribuţia topografică, cu eritrocitele rămase în spaţiul

perivascular, însoţite sau nu de hipertrofia celulelor endoteliale şi a nucleilor, dar şi

hemoragii per rexis cu localizare bilaterală şi simetrică în cortexul cerebral. La două

dintre aceste cazuri examenul bacteriologic a fost pozitiv pentru Clostridium spp., iar un

caz prezenta infestaţie masivă cu larve de Oestrus ovis ajunse eratic în circulaţia

craniană. Imaginile de edem şi hemoragii nu au fost însoţite de modificări de tip

inflamator.

S-a acordat atenţie deosebită leziunilor inflamatorii ale sistemului nervos central,

foarte importante pentru patologia veterinară deoarece majoritatea lor sunt fatale şi pentru

că examenul histologic trebuie să orienteze sau să stabilească diagnosticul etiologic.

Inflamaţiile parazitare au reprezentat jumătate (50%) din leziunile inflamatorii

identificate. Inflamaţiile bacteriene au fost diagnosticate ca şi inflamaţii listerelice în

proporţie de 25% şi inflamaţii purulente de alt tip 12,5%. Inflamaţiile virale au fost

identificate în proporţie de 12,5% şi au avut etiologie rabică.

Diagnosticarea histopatologică a encefalitelor parazitare s-a corelat, în cazul a 6

ovine sacrificate de urgenţă, cu semnalarea tulburărilor nervoase de focar cu învârtiri în

manej şi tulburări de echilibru ca urmare a compresiunii exercitate în emisferele

cerebrale, respectiv în cerebel sau în bulbul rahidian.

Tabloul morfopatologic a fost în raport cu stadiul evolutiv al bolii, prezentând un

polimorfism accentuat. Am identificat prezenţa infiltratului de tip neutrofilic şi

eozinofilic; în plus, la două dintre cazuri, granuloame parazitare cu celule gigante, reacţie


[258]

vasculo-conjunctivă şi macrofage cu citoplasmă ‘spumoasă‘, fiind surprinse şi resturi de

paraziţi; 3 dintre cazuri au fost diagnosticate ca encefalite parazitare de migrare, cu

focare neregulate de necroză, infiltraţie eozinofilică; la 2 cazuri encefalita parazitară a

fost acompaniată de leptomeningită eozinofilică. Leziunile produse de paraziţi au fost

întâlnite în bulb, tuberculii cvadrigemeni, cortexul cerebral, punte, hipocamp şi măduva

rahidiană cervicală.

La 2 ovine moarte, documentele sanitar veterinare insoţitoare nu au precizat

simptomatologie nervoasă, probele de creier fiind procesate doar pentru monitorizarea

scrapiei, deşi studiul histopatologic a evidenţiat leziuni în stadii avansate, soldate cu

dezvoltarea celulelor gigante, multinucleate, cu citoplasma axată pe masa de detritus şi

încărcată de vacuole şi resturi tisulare, precum şi prezenţa de trombi parazitari.

Encefalitele de natură bacteriană au reprezentat 37,5% din leziunile inflamatorii,

din care, 25% au fost identificate ca fiind de natură listerelică.

La o ovină fără semne clinice, sacrificată pentru consum uman inflamaţia a fost

predominant monocitară, ceea ce denotă un stadiu acut al infecţiei care, în mod logic, ar

fi trebuit să fie însoţit de simptomatologie nervoasă. Bulbul rahidian prezenta

perivascularită monocitară sub formă de manşoane groase, iar în cerebel s-a identificat

focar masiv şi infiltraţie difuză, intensă de limfocite, edem în neuropil şi perivascular,

neuronoliză, perivascularită monocitară.

La ovinele sacrificate de urgenţă deoarece prezentau clinic poziţii anormale ale

capului, leziunile au fost localizate la nivelul bulbului rahidian şi cerebelului şi au constat

în focare de necroză de lichefiere, cu prezenţa constantă a infiltratului neutrofilic,

monocitar şi a manşoanelor perivasculare limfohistiocitare.

Un procent de 12,5% din inflamaţiile de natură bacteriană au fost observate la

ovine sacrificate de urgenţă (2 cazuri) şi au fost encefalite purulente, cu infiltraţie masivă

cu granulocite neutrofile, leptomeningită şi prezenţa de bacterii dispuse în cuiburi, cu

localizare în bulbul rahidian la un caz şi în cerebel la cel de-al doilea caz; în ambele

cazuri examenul bacteriologic a fost pozitiv pentru tulpini β-hemolitice de E. Coli.

Stadiul infiltrativ cu caracter de exudat purulent s-a corelat cu durata bolii, ambele cazuri

diagnosticate clinic manifestându-se prin simptomatologie nervoasă şi decubit prelungit.


[259]

Diagnosticul de encefalită virală respectiv, rabie a fost stabilit la 2 cazuri care au

prezentat simptomatologie nervoasă şi care au fost sacrificate de urgenţă. În ambele

cazuri, pe lângă encefalita limfohistiocitară, au fost identificaţi corpusculii Babeş Negri.

Leziunile alterative şi de proliferare celulară au fost de intensitate moderată comparativ

cu manifestările clinice.

Encefalitele nespecifice au fost descrise la 5 ovine sacrificate de urgenţă şi la 6

ovine moarte, cu intensitate puţin relevantă şi au fost considerate ca fiind asociate unor

stări de boală cu localizări în alte organe. Au fost identificate modificări degenerative ale

pericarionilor (imagini de nuclei poziţionaţi excentric, cromatoliză periferică şi/sau

central cu evidenţierea granulelor Nissl, picnoză, rexă şi liză neuronală cu modificări la

nivelul astrocitelor şi endoteliilor capilare din vecinătatea neuronilor afectaţi) din bulbul

rahidian, tuberculii cvadrigemeni, cortexul cerebral şi cerebelos, proliferări gliale,

neuronofagie cu fagocite microgliale adunate în jurul fragmentelor degenerate ale

corpilor neuronali, edem perivascular şi/sau în substanţa nervoasă, hemoragii prin

diapedeză, prezenţa infiltratului eozinofilic în lumenul capilarelor şi arteriolelor.

Melanoza a fost surprinsă la 2 cadavre şi la o ovină sacrificată pentru consum

uman. Depunerea de pigment melanic s-a manifestat într-o manieră analogă cu alte boli

de depozitare lizozomală, o membrană limitatoare bine definită nefiind evidentă şi a fost

identificată in leptomeningele cerebelului şi al emisferelor cerebrale; la un caz

melanocitele au fost prezente si perivascular; la niciunul dintre cazuri nu s-au identificat

melanocite în substanţa nervoasă.

La 2 cadavre am constatat o creştere a lichidului cefalorahidian, tradus prin

dilatarea aqveductului, uneori asociat cu edemul substanţei nervoase limitrofe.

În sinteză, cele mai afectate de modificările/leziunile ţesutului nervos au fost

ovinele moarte, respectiv 40 de cazuri, apoi ovinele sacrificate de urgenţă, 31 de cazuri,

iar dintre ovinele sacrificate pentru consum uman, deşi au fost identificate 2 cazuri cu

leziuni, trebuie subliniat numărul extrem de mic de examene histopatologice efectuate la

această categorie de ovine şi anume, 3. Mai mult, cele trei cazuri au fost procesate

histologic în scopul obţinerii unor preparate de ţesut nervos de referinţă pentru

examinarea microscopică, ele fiind recepţionate în laboratorul de morfopatologie cu


[260]

documente însoţitoare care atestau starea de clinic sănătos, sacrificate pentru consum

uman, iar capetele au fost dirijate pentru screening rapid prin test imunoenzimatic.

Modificări/leziuni în ţesutul nervos au fost diagnosticate la ovine sacrificate de

urgenţă care nu au manifestat simptomatologie nervoasă sau modificări macroscopice ale

sistemului nervos central şi la ovine clinic sănătoase sacrificate pentru consum.

Studiul histopatologic a scos în evidenţă o incidenţă mai ridicată a

modificărilor/leziunilor sistemului nervos central faţă de cazuistica clinică; acestea sunt

frecvent întâlnite la ovine, de multe ori evoluând asimptomatic sau semnele clinice sunt

puţin evidente, ceea ce duce la nesemnalarea lor de către proprietar sau chiar de către

medicii veterinari.

Prezenţa modificărilor/leziunilor asociate din sistemul nervos central cu leziuni

primare din alte ţesuturi şi organe arată că bariera hematoencefalică există, dar nu pentru

orice stare patogenă din organism.

Confirmarea a două focare de scrapie

Din totalul de 158 probe creier examinate în anul 2011 prin testul imunoenzimatic

BIO-RAD, un procent de 39,24%, adică un număr de 62 de probe au fost procesate şi

histologic pentru evidenţierea leziunilor specifice encefalopatiilor spongiforme

transmisibile (scrapie clasică, scrapie atipică).

Diagnosticarea primelor cazuri pozitive de scrapie în Laboratorul de

Morfopatologie specializat pentru Diagnosticul Encefalopatiilor Spongiforme

transmisibile din LSVSA Cluj, în anul 2011, a fost motivaţia continuării cercetărilor

privind formele de encefalopatii spongiforme transmisibile la rumegătoarele mici.

În capitolul II.3 sunt prezentate rezultatele evaluării protocolului de diagnostic

adoptat în cele 2 cazuri pozitive, reprezentante a 2 categorii “ţintă”, rezultatele comparării

performanţelor testelor de laborator efectuate la aceste cazuri pozitive, precum şi aspecte

epidemiologice ale scrapiei în judeţul Cluj, în contextul evoluţiei acestei boli pe teritoriul

României.

Categoriile “ţintă” reprezentate de cele 2 cazuri pozitive au fost ovinele clinic

sănătoase sacrificate pentru consum uman şi ovinele sacrificate de urgenţă în urma

examenului clinic la care s-a constatat simptomatologie nervoasă cu ataxie, anteropulsie


[261]

cu sprijinul capului de diferite obiecte, tremor generalizat, torticolis, prurit accentuat

automutilant la nivelul membrelor superioare, ataxie, bruxism, slăbire progresivă,

decubit.

Ca urmare a încadrării în cele 2 categorii “ţintă”, conform protocolului obligatoriu

de lucru, s-a procedat la prelevarea diferită de probe şi direcţionarea pentru investigaţii de

laborator.

De la ovina cu simptomatologie nervoasă a fost prelevat creierul în întregime

după decalotare, iar protocolul de lucru a constat în prelevarea eşantionului de ţesut

nervos din regiunea obex pentru screening rapid scrapie prin test imunoenzimatic;

fragmente punte, cortex cerebral, cerebel pentru examen histopatologic scrapie,

fragmente trunchi cerebral (ţesut nefixat, conservat prin congelare) pentru testul de

confirmare Western Blot şi fragmente din punte pentru imunohistochimie scrapie.

De la ovina clinic sănătoasă a fost recoltat trunchiul cerebral prin tehnica foramen

magnum şi s-au prelevat: eşantion de ţesut nervos din regiunea obex pentru test

imunoenzimatic scrapie şi fragmente trunchi cerebral pentru testul de confirmare Western

Blot.

Testul de confirmare Western Blot s-a realizat prin digestia proteinei prionice

celulare (PrPc), urmată de purificarea şi concentrarea PrPres specifică de boală. Detecţia

PrPres s-a efectuat prin migrare electroforetică urmată de imunoblotare.

Testul de imunohistochimie scrapie s-a realizat pe secţiunile histologice

permanente folosind un anticorp monoclonal cu specificitate înalta pentru PrPres -

anticorp primar monoclonal pe şoarece antiPrPSC.

Testele imunoenzimatice au avut ca rezultat la testarea iniţială, pentru ambele

probe, valori ale densităţilor optice peste valoarea prag (cut-off-ul), rezultând rapoarte

mari în favoarea densităţilor optice înregistrate de probele în cauză, comparativ cu cut-

off-ul (OD/C.OFF- 1.768/0.218 cazul cu simptomatologie nervoasă; 1.692/0.220 cazul

fără semne clinice).

Pentru verificarea acurateţii rezultatelor obţinute, pornind de la omogenatul iniţial,

s-au retestat ambele probe prin test imunoenzimatic, în duplicat. La cazul cu

simptomatologie nervoasă valoarea densităţilor optice a fost cu mult peste valoarea prag,

rezultând rapoarte over în favoarea densităţilor optice înregistrate ale probei, comparativ


[262]

cu cut-off-ul (3.601, 3.634/0.219). S-au obţinut densităţi optice peste valoarea prag (cut-

off-ul) şi la cazul fără semne clinice (1.670, 2.306/0.220). Rezultatele obţinute, au fost

interpretate ca pozitive pentru scrapie.

Valoarea foarte mare a densităţilor optice obţinute la eşantioanele de ţesut nervos

prelevate de la cazul cu simptomatologie nervoasă se datorează cantităţii mult mai

crescute de PrPres detectată în ţesutul nervos, comparativ cu cantitatea de PrPres prezentă

în ţesutul nervos la cazul fără semne clinice.

Obţinerea densităţilor optice cu valoare mare, peste valoarea prag, la ovina clinic

sănătoasă, sacrificată pentru consum uman, demonstrează sensibilitatea şi specificitatea

testului imunoenzimatic de screening rapid în detecţia proteinei prionice anormale PrPres

în ţesutul nervos infectat.

Pentru ambele probe, imunoblotarea a dus la obţinerea profilelor specifice cu

prezenţa unei pete mari doar pe banda corespunzătoare proteinelor cu greutate moleculară

de 27-30 kDa, prezente în proba tratată cu proteinază K. Profilele rezultate prin migrare

electroforetică, urmată de imunoblotare, demonstrează digestia PrPc şi transformarea

proteinei prionice specifice de boală într-un fragment rezistent la proteinază, cu masă

moleculară redusă prin îndepartarea capătului amino-terminal al proteinei; cele 2 benzi

superioare corespund formelor mono şi di-glicozilate (27-30 kDa), iar banda inferioară

corespunde formei neglicozilate.

Examinarea histopatologică a identificat prezenţa de vacuolizări specifice

localizate în pericarionul neuronilor şi în neuropilul substanţei cenuşii, cu distribuţie

simetrică, bilaterală. Pericarionii s-au prezentat destinşi de una sau mai multe vacuole,

rotunde sau ovale, cu contur net şi regulat care fuzionează, rezultând aspectul spongiform

al materiei cenuşii. S-au întâlnit şi imagini de necroză neuronală, neuroni cu nuclei

picnotici, citoplasmă omogenă, intens eozinofilă, discretă proliferare glială, precum şi

depuneri de amiloid perivascular; nu s-au observat reacţii inflamatorii. Nucleul dorsal al

vagului s-a dovedit a fi sediu de elecţie pentru vacuolizările specifice.

Evidenţierea leziunilor demonstrează că pătrunderea prionilor în sistemul nervos

central este urmată de convertirea proteinei normale PrPc, produsă de neuroni şi celule

gliale, în PrPsc şi acumularea acesteia, urmată apoi de modificările histopatologice

caracteristice, responsabile de tulburările clinice.


[263]

Imunohistochimia efectuată la cazul cu simptomatologie nervoasă, în secţiunile

histologice realizate din fragmentele de trunchi cerebral a identificat depozite

punctiforme, în granule de PrPres, dispuse arbitrar, în mai multe focare sau difuze în

neuropil şi pericarioni, cu o intensitate şi distribuţie a imunoreactivităţii diferite.

Analiza rezultatelor demonstrează sensibilitatea şi specificitatea testului

imunoenzimatic de screening rapid în detecţia proteinei prionice anormale PrPres în

ţesutul nervos infectat, prin detectarea bolii la ovina clinic sănătoasă, sacrificată pentru

consum uman şi că există corelaţie între cantitatea de proteină prionică anormală PrPres

acumulată în ţesutul nervos şi declanşarea semnelor clinice, fapt evidenţiat de valoarea

foarte mare a densităţilor optice obţinute la eşantioanele de ţesut nervos prelevate de la

cazul cu simptomatologie nervoasă, comparativ cu cele obţinute la cazul fără semne

clinice.

Studiul a scos în evidenţă că scrapia poate evolua şi în absenţa semnelor clinice

ceea ce înseamnă că infecţiile prionice oculte la animale sunt mult mai răspândite decât

cazurile clinice cunoscute. Având în vedere că diagnosticarea cazului pozitiv la ovinele

sacrificate pentru consum uman s-a făcut în cadrul monitorizării de rutină, subliniază

importanţa acesteia.

Concluzii generale

1. Studiul histopatologic, soldat cu depistarea de modificări/leziuni ale sistemului

nervos central la 73% din cazurile examinate, scoate în evidenţă importanţa

examinării acestui ţesut cu mai mare atenţie, atât macroscopic, cât şi prin

prelevare de probe pentru studiu histopatologic în vederea identificării leziunilor

primare, dar şi a celor asociate.

2. Modificări/leziuni în ţesutul nervos au fost diagnosticate la ovine sacrificate de

urgenţă care nu au manifestat simptomatologie nervoasă sau modificări

macroscopice ale sistemului nervos central şi la ovine clinic sănătoase sacrificate

pentru consum uman.

3. Factorii de ordin infecţios, traumatic, toxic sau degenerativ din alte organe induc

modificări ale organizării cito-histologice complexe a ţesutului nervos cu apariţia


[264]

unor procese patologice, demonstrând că bariera hematoencefalică există, dar nu

pentru orice stare patogenă din organism.

4. Identificarea encefalitelor purulente la ovine sacrificate pentru consum ridică

probleme cu grave implicaţii pentru sănătatea publică prin consumul de produse

obţinute de la astfel de animale. Prezenţa coloniilor bacteriene în structurile

sistemului nervos central atrage atenţia asupra necesităţii completării

investigaţiilor obligatorii pentru acest ţesut cu investigaţii

histologice/bacteriologice efectuate mai des decât până în prezent.

5. Din evaluarea statistică a incidenţei modificărilor/leziunilor în diferitele segmente

de sistem nervos central rezultă importanţa practică a obligativităţii examinării

microscopice a trunchiului cerebral, nu numai pentru evidenţierea

prezenţei/absenţei leziunilor specifice encefalopatiilor spongiforme transmisibile.

6. Ar fi oportună revizuirea circumstanţelor în care examenul histopatologic este

prevăzut ca examen obligatoriu în cadrul Programului acţiunilor de supraveghere,

prevenire, control şi eradicare a bolilor la animale, a celor transmisibile de la

animale la om.

7. Diagnosticarea cazului pozitiv de scrapie la ovina sacrificată pentru consum uman,

în condiţiile unui număr în creştere de probe recoltate de la această categorie

“ ţintă”, este un argument pentru monitorizarea sporită a ovinelor sacrificate în

sistem tradiţional, în condiţiile în care, structura sectorului ovinelor în România

are specificul său.

8. Fără a considera analiza situaţiei infecţiei prionice în judeţul Cluj un studiu

epidemiologic de anvergură, se deduc câteva aspecte utile, în condiţiile în care, la

ora actuală, foaia de parcurs pentru encefalopatii spongiforme transmisibile a

Comisiei Europene stabileşte că unul dintre obiectivele strategice este revizuirea

măsurilor de eradicare în ce ceea priveşte rumegătoarele de talie mică, ţinând cont

de instrumentele de diagnosticare existente şi asigurând nivelul de protecţie al

consumatorului.


[265]

UNIVERSITY OF AGRICULTURAL SCIENCES AND

VETERINARY MEDICINE CLUJ-NAPOCA

FACULTY OF VETERINARY MEDICINE

DUMA MIHAELA

SUMMARY OF THE Ph-D THESIS LABORATORY STUDIES REGARDING THE CENTRAL NERVOUS

SYSTEM IN SHEEP, FOR SUPERVISION AND DIAGNOSIS OF NERVOUS DISEASES

SCIENTIFIC COORDINATOR

Prof Univ. Dr. Dr. H.C. ALECSANDRU IOAN BABA

Member of the Academy of Agricultural Sciences

CLUJ-NAPOCA

-2011-


[266]

Summary

Infectious, traumatic, toxic or degenerative factors from other organs, can induce

pathognomonic lesions in the central nervous system structures (eg, rabies, scrapie) or

cyto-histological changes in the organization of complex nervous tissue and cause

pathological processes characterized in particular by changes in neurons and glial cell

elements at that lesions associated with diagnostic significance in conjunction with

epidemiological data and other laboratory investigations.

The histopathology is aimed at highlighting the key structural changes in the

morphological and histological appearance, in order to identify the mechanisms that

generate local disturbances and their impact on the whole body, correlating clinical

manifestations of sick animals (when they were captured) with lesions detected.

Structural changes, highlighted by macroscopic and microscopic examinations, are

leading to the interpretation of injuries caused by pathogens or aggressors, prioritizing

their contribution to the development of lesions in dynamic or cumulative effect when it

exists.

Nervous forms are frequently reported in sheep, but also very uniform in clinical

manifestation and pathology. For this reason, examination of histopathological changes

of the central nervous system to determine the frequency, preferential localization, the

predominant type of lesion, or the discovery of specific etiological injuries have practical

importance in differential diagnosis.

Transmissible spongiform encephalopathies, along with other major zoonotic

disease localized to the nervous system in sheep, rabies, are diseases for which laboratory

investigations of the central nervous system in sheep are mandatory – specified in the

program of supervision, prevention, control and eradication of animals diseases, those

transmissible from animals to humans, developed the "National Sanitary Veterinary

Authority, Bucharest".

Since 1990 the European Commission adopted a series of measures to protect

human and animal health, the risk of contamination with transmissible spongiform


[267]

encephalopathies (TSEs). These measures were based on the safeguard provisions of the

Directives on veterinary control measures.

Given the magnitude of risk posed by certain TSEs, the Commission provides for

increased monitoring programs for goats and sheep, following detection of cases of

bovine spongiform encephalopathy (BSE) in a goat in 2005 and three unusual cases of

TSE in sheep, from which BSE could not be excluded.

Research structure. The thesis comprises 248 pages and is structured in accordance with

current legal provisions; the content includes a number of 121 figures (pictures, graphs,

charts) and 23 tables. In Part I, are the most important and conclusive data in the

literature concerning the histology, physiological and cytopathological regarding the

nervous tissue and aspects of transmissible spongiform encephalopathies in small

ruminants - prion etiology, pathogenesis, clinical and laboratory diagnosis. Part II

includes personal research, laboratory studies aiming to monitor scrapie (Chapter II.1),

histopathological study (Chapter II.2) of the central nervous system, conducted on a fixed

number of brain samples in order identify changes/damages of the nerve tissue, other

than those specific to transmissible spongiform encephalopathies and finally to confirm

two outbreaks of scrapie (Chapter II.3). The bibliography includes 201 titles of scientific

papers from domestic and foreign literature.

Laboratory studies to monitor the scrapie

Chapter II.1. Evaluates the results of laboratory investigations towards scrapie,

comparing each diagnostic method, in terms of sensitivity and specificity, ie detection

and quantification of abnormal PrPres prion protein accumulation in the nervous tissue,

resistant to proteinase K, by immunoassay tests and highlight the presence/absence of

lesions caused by the conversion of PrP in PrPres and its accumulation, by histopathology.

The study looked at lab tests on brain samples from sheep, for supervision and / or

monitoring of transmissible spongiform encephalopathies in small ruminants in Cluj

County, between years 2004-2010.

During the period under study, we examined a total of 1540 sheep, observing the

"target" groups established by legislation on TSEs.


[268]

Thus, a total of 610 samples came from dead sheep, 594 samples from emergency

slaughtered sheep (in this category enrolling and sheep slaughtered for diagnostic

confirmation or for the need of elimination from the population, as those with a diagnosis

of infectious epididymitis, Maedi-Visna) and a total of 336 samples came from clinically

healthy sheep slaughtered for human consumption (traditional slaughter for family

consumption).

Following the technical details of the Program for the eradication and monitoring of

transmissible spongiform encephalopathies, for the brain samples collected from dead

and from the emergency slaughter animals (except those unfit for histological processing)

rapid screening was performed and histological examination according to specific

procedure.

Rapid screening method was performed by BIO-RAD TeSeE, which is the

validated method of LSVSA Cluj histopathology laboratory, and accredited by National

Accreditation Body of Romania (RENAR.). It is an immunoassay method which uses

two monoclonal antibodies that allow the qualitative determination of abnormal prion

protein PrPRes, resistant to proteinase K, in the central nervous tissue after distortion and

protein concentration.

Histopathological, for each sample 20 sections were examined from the spinal

bulb, midbrain, cerebellum, cerebral cortex and spinal marrow, processed by paraffin

technique and hematoxylin eosin stained.

Thus, out of 1540 samples undergo brain examination by rapid tests, a total of 541

were subjected to histopathological examination for evidence of lesions characteristic to

scrapie, as follows: 330 samples of brain taken from cadavers (dead sheep on farms,

households, on pasture, during transport, slaughter, or in case of accidents, regardless of

their nature), 208 brain samples taken from emergency slaughtered sheep (in which ante-

mortem clinical examination established the presence of nervous symptoms, or that

cannot move, recumbent, unable to stand or walk without assistance; sheep identified by

the physician, with ante-mortem clinical signs of disease, regardless of disease: infectious

diseases, etc.) and a number of 3 brain samples taken from sheep slaughtered for human

consumption (family).


[269]

Of the 1540 tests immuno-enzymatic tests in 1527 showed optical densities below

the threshold (cut-off), thus recording the first negative test results. A total of 13 tests

were initially located just below the optical density threshold and were retested in

duplicate from the original homogenate. For all 13 cases the results were negative for

both duplicates.

The 541 brain samples, processed through paraffin for histopathology, revealed no

specific lesions of transmissible spongiform encephalopathies, in none of the examined

fragments of nervous tissue.

Following these tests (rapid screening, histopathology) has been established that

the brain samples analyzed in 2004-2010 came from sheep free of transmissible

spongiform encephalopathies (classical scrapie, atypical scrapie).

Histopathological study

Chapter II.2 presents the results of a histopathological study of the central nervous

system of a fixed number of brain samples (100) processed histologically for monitoring

scrapie, following the analysis of incidence changes/injuries (other than the specific TSE)

in the central nervous system, the "target" categories of examined sheep, their

classification according to the predominant histological features, development of a

comparative scale assessment, of the distribution and frequency of microscopic lesions in

various parts of the nervous tissue examined, establishing a correlation between

changes/lesions identified and health and/or any distance damage.

The study identified changes / lesions of different types of nervous tissue in 73% of the

examined cases, grouped according to the prevalence of degenerative histopathological

aspects, vascular, non-inflammatory or inflammatory cell reaction.

Briefly, the results of microscopic examination, identified degenerative changes of

the nerve cell body (changes in the nucleus, cytoplasm), vascular disorders (edema,

congestion, hemorrhage, proliferation of endothelial cells, vascular thrombosis), cellular

responses (infiltration with mononuclear infiltration of granulocytes , proliferation of

glial cells, the macrophages, giant cells present), the presence of viral inclusions, images

of cell death (chromatolysis, satellitosis, neuronophagia), metabolic disorders with

accumulation of pigment, presence of parasitic type granulomas.


[270]

Making a descending hierarchy of the types of changes/lesions in different

segments of the central nervous system for the 100 reviewed cases, were found the

following:

The most frequent injuries were the vascular type, the result of microscopic

examination is a total of 177, in which images of edema were encountered 84 times, 53

times of congestion, hemorrhage 8 times, in 29 images the vascular endothelial cell

proliferation was captured, and 3 images of thrombosis.

In the hierarchy, are degenerative changes perykarions with a total of 93 images of

"chromatolysis" (45 images that often could be interpreted as nonspecific indicator of

degeneration combined with loss of tinctorial affinity), granular and vacuolar

degeneration (31) and neuronal atrophy with loss of cytoplasmic volume and reduced in

volume (17).

Cellular reactions were found in total of 84, and consisted of mononuclear

infiltration (37), granulocyte infiltration with neutrophils (16), gliocytosis (14),

infiltration with eosinophils (13), and proliferation of macrophages (2) presence of giant

cells (2).

Viral inclusions were captured by two times, intracytoplasmic located.

Were captured: 28 images with cell death with satellitosis (11), neuronophagia (9), and

tigrolysis (8).

Melanic pigment accumulation was found 3 times in the leptomeninges.

Analyzing the distribution of types of changes/lesions on the sheep categories, the

dead and the emergency slaughter represents 97% of the study material, as following:

In both sheep categories, vascular lesions predominated, followed by degenerative

changes of perykarions.

In the case of brain samples from emergency slaughtered sheep, the cell responses

were recorded for all cell types (mononuclear, neutrophil granulocytes, glial cells,

eosinophils). The presence of macrophages and giant cells, parasite-like was found

equally in both categories.

Images of cell death were more common in emergency slaughter sheep, compared

with histological preparations from corpses.


[271]

Melanic pigment accumulation was seen in histological preparations from corpses,

but was not seen in preparations obtained from emergency slaughtered sheep.

Parasitic granulomas were found equally in the two categories of sheep.

On histological examination, from sheep slaughtered for human consumption,

were met: chromatolysis type images (2), congestion (2), infiltration with mononuclear

(2), edema (1), satellitosis (1), melanosis (1).

Statistical evaluation of location within the main types of microscopic lesions in

the central nervous system examined segments revealed the following:

Degenerative changes of perykarion, primarily affecting the spinal bulb (22.31%),

then about equally cerebral cortex (19.83%), cerebellum (19%), pons (18.18%) and

quadrigeminal tubercles (16.53%). In a much smaller extent, were affected neurons in the

hippocampus or cervical spinal marrow.

There is an increased incidence of non-inflammatory lesions consisting of edema,

congestion, hemorrhage, especially in the quadrigeminal tubercles (29.37%), bulb

(22.03%), cerebrum (19.21%), cerebral cortex (12.99%) and pons (11.30%), while their

prevalence is much lower in cervical spinal marrow (3.38%) and hippocampus (1.69%).

If inflammatory lesions, spinal bulb was the most affected, the proportion of

34.14%, then quadrigeminal tubercles, in a proportion of 24.39%, cerebellar cortex and

cerebral cortex at a rate of 19.31%, respectively, 12, 50%, much lower percentage of

inflammatory lesions were located: in the hippocampus up to 4.55%, spinal marrow and

pons, each with 3.41% and 2.27%.

Melanic pigment deposition was identified in 100% of cases, with localization in

leptomeninges, in the cerebellum and cerebral hemispheres.

There is no statistically significant difference, in terms of frequency of localized

changes/lesions in the nervous tissue segments examined. Bulbs and quadrigeminal

tubercles are mostly affected, while the hippocampus and spinal marrow are affected in

the slightest degree. Cerebral cortex and cerebellum are changed approximately with the

same frequency. The pons stands the presence of degenerative changes and non-

inflammatory injuries of perykarion and to a much lesser extent inflammatory lesion

occur.


[272]

Vascular lesions were predominant in 41% of cases, followed in the hierarchy by

inflammatory lesions, with a rate of 16%. These include inflammation of parasitic nature

(8%), bacterial inflammation (6%) and inflammation of viral nature (2%). For 11% of

cases, changes were identified whose etiology could not be determined and were

attributed to diseases and pathological conditions in the visceral organs, such as

metabolic, infectious and/or parasitic. Accumulation of melanic pigment was observed in

3% of cases and changes in cerebrospinal fluid in 2% of cases. No changes were

observed in nerve tissue in the central nervous system segments examined in 27% of

cases.

Non-inflammatory edema was diagnosed as the predominant change in 37 cases,

and consisted of images showing the enlarging of Wircoff-Robin space, sometimes with

the presence of poorly colored liquid with vacuolar appearance, capillaries or arterioles

having a reduced lumen due to transudation. Base edema, is the vascular endothelial

injury with a severity that increase vascular permeability. The fluid will disperse between

cells in response to hydrostatic pressure from the movement of the brain and from other

tissues.

They found differences in susceptibility to edema, between gray and white matter

and the vulnerability of different areas was also different and consisted of images of

intracellular edema, hypertrophy translated into astrocytes, oligodendrocytes

accompanied sometimes by the reaction of the white matter (nucleus increased, less

dense, hypochromic) vasogenic edema (intercellular) without major changes in the gray

matter, but white matter, which provides a low resistance to passage of edema fluid, is

textured with vacuolar appearance.

Frequently, there was swelling in the ependymal channel epithelium, epithelial

cells are invaded by liquid, cell nucleus pushed to the apical pole, sometimes pyknotic,

other times the epithelial cells were detached, and the substance surrounding nerve had

spongy appearance.

Cerebellum, particularly in the area of Purkinje cells, was the seat of the displace

and compress of the cells. Often, the swelling was accompanied by a discreet gliocytosis

and/or lymphocytosis.


[273]

Hemorrhage, has prevailed in four cases, the issues encountered by diapedesis,

bleeding without specificity in the topographic distribution with perivascular remaining

erythrocytes, with or without hypertrophy and endothelial cell nucleus, and bleeding per

rexis with bilateral and symmetric location in the cortex brain. For two of these cases, the

bacteriological examination was positive for Clostridium spp, and another case, showed

this massive infestation of Oestrus ovis larvae that were in the circulation that reached

skull. Images of edema and hemorrhage were not accompanied by inflammatory changes.

Attention was paid to central nervous system inflammatory lesions, very important

for veterinary pathology since most of them are fatal and that histological examination

should guide or determine etiologic diagnosis.

Parasitic inflammation represented half (50%) of the inflammatory identified

lesions. Bacterial inflammations were diagnosed in 25% because of Listeria and other

purulent inflammation 12.5%. Viral inflammations have been identified in a proportion

of 12.5% due to rabies.

Histopathological diagnosis of parasitic encephalitis was correlated, in the case of

6 emergency slaughtered sheep, with nervous signaling disorders, with spins in the riding

and balance disorders as a result of compression exerted in the cerebral hemispheres,

respectively cerebellum or spinal bulb.

The picture was pathologically correlated with the stage of disease evolution,

showing a pronounced polymorphism. We identified the presence of neutrophilic and

eosinophilic infiltrate, in addition, in two of the cases, parasitic granuloma with giant

cell, vascular-conjunctiva and macrophage reaction with the cytoplasm 'sparkling', the

remains of parasites, three of the cases were diagnosed as parasite migration encephalitis,

with irregular foci of necrosis, eosinophilic infiltration, the two encephalitis cases were

accompanied by leptomeningitis eosinophilia. Damage caused by parasites was found in

the bulb, quadrigeminal tubercles, cerebral cortex, deck, hippocampus and cervical spinal

bone.

For two dead sheep, veterinary documents did not specify the nervous symptoms,

brain samples were processed only for monitoring scrapie, although histopathological

study revealed advanced lesions, resulting in giant cell development, multinucleated,

with the cytoplasm focused on detritus and loaded with vacuoles and tissue debris, and


[274]

the presence of parasitic thrombus.

Bacterial encephalitis, accounted for 37.5% of inflammatory lesions, of which

25% were identified as listeria-like.

At a sheep without clinical signs, slaughtered for human consumption,

inflammation was predominantly with monocytes, which indicates an acute stage of

infection which, logically, should be accompanied by nervous symptoms.

At the emergency slaughter sheep, because they had clinically abnormal head

position, the lesions were located in the spinal bulb and cerebellum, and consisted of foci

of liquefaction necrosis with neutrophilic infiltration with monocytes and lympho-

histiocytic perivascular sleeves.

A percentage of 12.5% of bacterial inflammation were observed in emergency

slaughtered sheep (2 cases), and were purulent encephalitis with massive infiltration of

granulocytes neutrophils, leptomeningitis, and the presence of bacteria arranged in nests,

in a case with localization in the spinal bulb, and in the second case in the cerebellum, in

both cases bacteriological examination was positive for β-hemolytic strains of E. coli.

Infiltrating stage, with purulent exudate character were correlated with disease duration,

both clinically diagnosed cases manifested by nervous symptoms and prolonged

decubitus.

The diagnosis of viral encephalitis, respectively, rabies was established in two

cases showed nervous symptoms, which were slaughtered by emergency. In both cases,

in addition to lympho-histiocytic encephalitis, Babes Negri corpuscles were identified.

Alterative lesions and cell proliferation were moderate compared with clinical

manifestations.

Nonspecific encephalitis has been described in five sheep, emergency slaughtered,

and 6 dead sheep. Intensity was less relevant and considered to be associated with disease

states with locations in other organs. Degenerative changes were identified perykarions

(eccentric nuclei, cromatolisis, outlining Nissl granules, pyknosis, neuronal lysis, with

changes in astrocytes and capillary endothelium in the vicinity of affected neurons) of the

spinal bulb, quadrigeminal tubercle, cerebral cortex and cerebellum, glial proliferation,

neuronophagia with microglial phagocytes gathered around the body fragments,


[275]

degenerate neural perivascular edema and / or nervous substance, the diapedesis

bleeding, presence of eosinophilic infiltrate in the lumen of capillaries and arterioles.

Melanosis was found in two bodies, and a sheep slaughtered for human

consumption. Pigment deposition was shown in a manner analogous to other lysosomal

storage diseases; a well-defined limiting membrane is not obvious and was identified in

cerebellum and leptomeninges of the hemispheres. In one case perivascular melanocytes

were present but in no cases melanocytes were identified in the nervous substance.

In two bodies, we found an increase in cerebrospinal fluid, translated by dilating

aqueduct, sometimes associated with edema surrounding brain substance.

In summary, the most affected by changes/lesions in nervous tissue were dead

sheep, i.e. 40 cases, and emergency slaughter sheep, 31 cases, and of sheep slaughtered

for human consumption, although two cases were identified with lesions, should be noted

the very small number of histopathological examinations were performed on sheep in this

category namely, 3. Moreover, three cases were processed to obtain histological

preparations of nervous tissue for microscopic examination of reference, which are

received in the pathology laboratory with accompanying documents, certifying the state

of clinical healthy animals slaughtered for human consumption, and heads were been

submitted for rapid screening by immuno-enzyme test.

Changes/injuries were diagnosed in the nervous tissue from emergency

slaughtered sheep, which do not have nervous symptoms or macroscopic changes in

central nervous system, and clinically healthy sheep slaughtered for human consumption.

Histopathological study revealed a higher incidence of changes / central nervous

system lesions, compared with clinical case studies, which are commonly found in sheep,

often asymptomatic or evolving clinical signs are less obvious, leading to their non-

reporting by the owner or by veterinarians.

Presence of changes / lesions in the central nervous system, associated with

primary lesions in other tissues and organs, indicate that blood-brain barrier exists, but

not for any of the pathogenic organism.


[276]

Confirmation of two outbreaks of scrapie

Of the 158 brain samples examined in 2011 by immune-enzyme test BIO-RAD, a

rate of 39.24%, i.e. a total of 62 samples were histologically processed for evidence of

specific lesions of transmissible spongiform encephalopathies (classical scrapie, atypical

scrapie).

The first positive diagnosis of scrapie cases, the Pathology Laboratory,

specializing in the diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies in LSVSA

Cluj, in 2011, was the motivation for further research on forms of transmissible

spongiform encephalopathies in small ruminants.

In Chapter II.3 we presents the results of the diagnostic protocol adopted in the

two positive cases, representing the two "target" categories, comparing the performance

results of laboratory tests performed on these positive cases, and epidemiological aspects

of scrapie in the Cluj county, in the context of evolution of the disease in Romania.

'Target' categories, represented by the two positive cases were: clinically healthy

sheep, slaughtered for human consumption, and emergency slaughter sheep following

clinical examination that was showing: nervous symptoms that are seen with ataxia, head

support on various objects, generalized tremors, stiff neck, increased self-mutilated

pruritus in the upper limbs, ataxia, progressive weakness, lying on the ground.

As a result of framing in the two "target" categories, according to the compulsory

work protocol - we proceeded to the taking of samples that were targeted for laboratory

investigations.

From sheep with nervous symptoms was taken the whole brain, and the working

protocol consisted of nervous tissue sampling, from the obex region, for rapid screening

of scrapie by immuno-enzyme test, pons fragments, cerebral cortex, cerebellum for

scrapie histopathology, brainstem fragments (loose tissue, preserved by freezing) for

Western Blot confirmatory test, and pons fragments for scrapie immunohistochemistry.

From clinically healthy sheep, we collected brainstem by foramen magnum

technique, and have taken: nervous tissue sample for scrapie immunoassay test from obex

region and brain stem fragments for Western blot confirmatory test.


[277]

Western Blot confirmatory test was done by digesting the cellular prion protein

(PrPc), followed by purification and concentration of PrPres specific for this disease. PrPres

detection was done by electrophoretic migration followed by immunoblotting.

Immunohistochemistry test for scrapie was performed on histological sections

using a highly specific monoclonal antibody for PrPres - monoclonal primary antibody on

anti PrPSC mouse.

Immunoassay tests - had resulted in initial testing, for both samples, optical

density values above the threshold (cut-off), resulting in large reports in favor of optical

density recorded for those samples compared to cut-off (1.768/0.218 OD/C.OFF for the

case with nervous signs, 1.692/0.220 for the case without clinical signs).

To check the accuracy of the results from the initial homogenate, both samples

were retested by immuno-enzymatic test in duplicate. In the case with nervous

symptoms, the optical density was well above the threshold, resulting in reports over

optical densities recorded for the sample, compared with cut-off (3.601, 3.634/0.219).

Optical densities were obtained over the threshold (cut-off) even if no clinical symptoms

(1.670, 2.306/0.220). The results were interpreted as positive for scrapie.

High value of optical densities obtained in nervous tissue samples taken from the

case with nervous symptoms, is due to more increased quantity of PrPres detected in

nervous tissue compared to the amount of PrPres if present in nervous tissue without

clinical signs.

Obtain optical density above the threshold in the clinically healthy sheep

slaughtered for human consumption, shows sensitivity and specificity of immuno-

enzymatic test for rapid screening in detecting PrPres abnormal prion protein in infected

nervous tissue.

For both samples, immunoblotting yielded specific profiles, with the presence of

large patches only on molecular weight protein band of 27-30 kDa, present in the sample

treated with proteinase K. Electrophoretic migration resulting profiles, followed by

immunoblotting, demonstrating digestion of PrPc, and disease-specific prion protein

transformation into a fragment resistant to proteinase, with low molecular weight by

removing amino-terminal end of the protein, the two upper bands correspond to mono-


[278]

and di-glycosylated forms (27-30 kDa) and lower band corresponds to non-glycosylated

form.

Histopathological examination identified the presence of specific vacuolation,

located in neurons perykarion, and in the gray matter neuropile with symmetric

distribution, bilateral. Perykarions look relaxed, with one or more vacuoles, round or

oval, with net and regularly shape, that merging, resulting in spongiform appearance of

gray matter. Images are found with neuronal necrosis, neurons with pyknotic nuclei,

homogeneous cytoplasm, intense eosinophilia, discrete glial proliferation and

perivascular amyloid deposits, no inflammatory reactions were observed. Dorsal nucleus

of the vague proved to be the place of choice for specific vacuolation.

Highlighting lesions demonstrate that prions penetration in the central nervous

system is followed by conversion of normal PrPc protein produced by neurons and glial

cells in PrPsc, and its accumulation, followed by characteristic histopathological changes

responsible for clinical disorders.

Immunohistochemistry performed on the case with nervous symptoms, in

histological sections made from fragments of brain stem, were identified the storage

points, PrPres granules arbitrarily arranged in several foci or diffuse in neuropile and

perykarions, with different intensity and distribution of immuno-reactivity.

The analysis results show the sensitivity and specificity of the immuno-enzymatic

test for rapid screening in the detection of abnormal prion protein PrPres in infected

nervous tissue by detecting the disease in sheep clinically healthy slaughtered for human

consumption, and that there is correlation between the amount of abnormal prion protein

PrPres accumulated in nervous tissue, and the onset of clinical signs, as evidenced by the

high value of optical densities obtained in samples of nervous tissue, taken from the case

with nervous symptoms, compared with those obtained in the case without clinical

evidence.

The study revealed that scrapie can evolve in the absence of clinical signs, which

means that occult prion infection in animals are much more widespread than known

clinical cases. Given that the positive diagnosis of the sheep slaughtered for human

consumption was made through routine monitoring, emphasizes its importance.


[279]

General conclusions

1. Histopathological study, resulted in detection of changes / lesions of the central

nervous system in 73% of the cases examined, highlights the importance of

examining the tissue with greater attention, both macroscopically and by sampling

for histopathological study to identify primary lesions and those associated.

2. Changes / lesions in nervous tissue were diagnosed in emergency slaughter sheep,

which showed no nervous symptoms or macroscopic changes in central nervous

system, and in clinically healthy sheep slaughtered for human consumption.

3. Factors as: infectious, traumatic, toxic or degenerative, in other organs induce

cyto-histological changes in the complex organization of nervous tissue, with the

emergence of pathological processes, showing that blood-brain barrier exists, but

not for any of the pathogenic organism.

4. Identification of purulent encephalitis in sheep slaughtered for consumption raises

serious public health implications by eating products from such animals. The

presence of bacterial colonies in the central nervous system structures, points out

the need for mandatory investigations of this tissue, with

histological/bacteriological investigations performed more frequently than at

present.

5. For statistical evaluation of the changes/lesions incidence, in different segments of

the central nervous system is resulting the practical importance of the obligation to

perform the microscopic examination of brain stem, not only for the

presence/absence of specific lesions of transmissible spongiform

encephalopathies.

6. It would be appropriate to review the circumstances in which histopathology is

said mandatory - in the "Program of the surveillance, prevention, control and

eradication of animal diseases, those transmitted from animals to humans."

7. Positive case of scrapie diagnosis in sheep slaughtered for human consumption, in

an increasing number of samples collected from this "target" category is an

argument for increased monitoring of sheep slaughtered in the traditional system,

while the structure of the sheep sector in Romania has its specifics.


[280]

8. Without considering the situation of prion infection in Cluj County as a large

epidemiological study, several useful aspects to be deducted, provided that, at

present, the roadmap for transmissible spongiform encephalopathies of the

European Commission states that one of the strategic objectives is to review the

eradication measures for small ruminants which by taking into account the

existing diagnostic tools and ensuring the protection of the consumers.

Date post:	01-Sep-2019
Category:	Documents
Upload:	others
View:	5 times
Download:	0 times

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ … filelaborator obligatorii ale sistemului...

Documents