1

Universitatea Academiei de Ştiinţe a Moldovei

OLEG BUDEANU şi VICTOR CROITORU

TEHNICI AVANSATE ȋn BIOLOGIA MOLECULARĂ

Chisinau, 2013

2

CUPRINS:

ȊNTRODUCERE ............................................................................. 6

CAPITOLUL 1. ............................................................................... 7

Prezentarea principiilor metodei de clonare şi exprimare a genelor în sistem procariot ........................................................................... 7

1.1. Amplificarea genei de interes. .............................................. 8

1.2. Enzime de restricţie ................................................................ 14

1.3. Ligarea fragmentelor de ADN ................................................ 16

1.4. Vectori de clonare ................................................................... 17

1.5. Introducerea moleculelor recombinate în celule gazdă .......... 22

1.6. Electroforeza acizilor nucleici ................................................ 24

1.7. Exprimarea genelor în sistem procariot .................................. 30

1.8. Purificarea proteinelor recombinate ....................................... 32

1.9. Utilizarea clonării de gene şi exprimării de proteine recombinate în studii interdisciplinare .......................................... 34

CAPITOLUL 2. ............................................................................. 37

Tehnici moleculare utilizate in selecţia asistată de markeri genetici ....................................................................................................... 37

2.1. TEHNICA PCR ..................................................................... 37

2.2. VARIANTE ALE TEHNICII PCR ........................................ 41

2.2.1. Tehnica RFLP ...................................................................... 41

2.2.2. Tehnica AFLP...................................................................... 44

2.2.3. Tehnicile MAAP.................................................................. 48

2.2.3.1. Tehnica RAPD .................................................................. 49

3

2.2.3.2. Tehnica DAF .................................................................... 52

2.2.3.3. Tehnica AP – PCR ............................................................ 52

2.2.4. Tehnica RT – PCR ............................................................... 53

2.2.5. Tehnica microsateliţilor - SSR ............................................ 54

2.2.6. Tehnica EST ........................................................................ 55

2.2.7. Tehnica SCAR ..................................................................... 56

2.2.8. Tehnica SNP ........................................................................ 56

2.2.9. Tehnica STS ........................................................................ 57

2.2.10. Tehnica ARMS –PCR ....................................................... 58

2.3. TEHNICA SSCP ................................................................... 59

2.4. TEHNICI BAZATE PE SECVENŢIERE .............................. 60

CAPITOLUL 3. ............................................................................. 64

Aplicaţii ale tehnicilor de biologie moleculară în studii interdisciplinare ............................................................................. 64

3.1. Clonarea genelor pentru aminoacid dehidrogenaze ................ 64

3.2. Producerea de proteine recombinate ....................................... 66

3.3. Măsurarea activităţii enzimatice a enzimelor ......................... 67

3.4. Sinteza de aminoacizi marcaţi cu 15N ..................................... 69

3.5. Purificarea aminoacizilor sintetizaţi ....................................... 70

3.6. Analiza aminoacizilor sintetizaţi prin spectrometrie de masă 71

3.7. Sinteza de aminoacizi marcaţi ................................................ 72

3.8. Tendinţe actuale în aplicarea bionanotehnologiilor................ 75

3.9. Aplicaţii ale bionanotehnologiilor .......................................... 75

3.10. Diagnostic ............................................................................. 76

CAPITOLUL 4. CULTURI CELULARE ..................................... 81

4

4.1. Prezentarea principiului tehnicii experimentale ..................... 81

4.2. Culturi primare ....................................................................... 83

4.3. Culturi secundare .................................................................... 83

4.4. Culturi de celule imortalizate ................................................. 84

4.5. Prezentarea informaţiilor care se pot obţine pe diferite sisteme de studiu ......................................................................................... 84

4.6. Anticorpii monoclonali ........................................................... 85

4.7. Celule stem ............................................................................. 88

CAPITOLUL 5. ............................................................................. 92

Aparatajul disponibil şi stabilirea parametrilor optimi de funcţionare pentru diverse tipuri de experimente .......................... 92

5.1. Echiparea laboratorului de culturi celulare ............................. 92

5.2. Strategii de lucru ..................................................................... 95

5.3. Instruirea personalului ............................................................ 97

5.4. Asigurarea asepsiei şi antisepsiei ........................................... 98

5.5. Cultivarea celulelor ................................................................. 99

5.6. Separarea prin centrifugare a celulelor din mediul de cultură şi stabilirea viabilităţii acestora ....................................................... 100

5.7. Îngheţarea şi dezgheţarea celuluor ....................................... 101

5.8. Subclonarea şi tripsinizarea .................................................. 103

CAPITOLUL 6. Producerea şi izolarea proteinelor recombinate din celule mamifere ........................................................................... 104

6.1. Anticorpii monoclonali bio-nano-functionalizaţi ................. 105

6.2. Recomandări pentru abordarea de noi tipuri de experimente şi metodologii a culturilor celulare. ................................................. 111

CAPITOLUL 7. ........................................................................... 119

5

Cromatografia şi cromatofocalizarea. Principii și metode .......... 119

7.1. Cromatografia de schimb ionic............................................. 119

7.2. Filtrare pe gel sau gel filtrarea. ............................................. 121

7.3. Interacțiunea hidrofobă ......................................................... 124

BIBLIOGRAFIA ......................................................................... 126

6

ȊNTRODUCERE Clonarea genelor a devenit o tehnică indispensabilă în

laboratoarele de biologie moleculară. Tehnica PCR sau reacţia în lanţ a polimerazei, dezvoltată la mijlocul anilor ’80, a revoluţionat genetica moleculară, făcând posibilă studierea şi analiza genelor prin metode mult mai accesibile şi uneori foarte simple.

Una dintre aplicaţiile clonării genelor, importante nu numai pentru biologie, dar şi pentru studii interdisciplinare, este utilizarea clonării în scopul obţinerii de proteine recombinate. Astfel, clonarea genelor şi exprimarea lor în celule gazdă reprezintă o sursă foarte preţioasă de proteine. Ulterior, aceste proteine recombinate pot fi purificate prin metode cromatografice, unde biomoleculele sunt etalonate folosind tehnici cromatografice care le separă potrivit diferențelor în proprietățile lor biochimice specifice. Se disting cateva variațiuni ale tehnicilor cromatografice ca gel filtrarea, interacțiunea hidrofobă, afinitatea cromatografică si faza cromatografică reversă.

In aceasta ediție, in paralel cu biosinteza proteinelor la procariote, prezentăm producerea si izolarea proteinelor recombinate din celule eucariote, cum ar fi culturile celulare primare, secundare, producerea anticorpilor monoclonali si policlonali, utilizarea celulelor stem in propagarea ADN-ului manipulat genetic.

In final, tendinţele actuale în aplicarea bionanotehnologiilor sunt prezentate, prin aplicații in diagnosticul molecular, implicații in medcina legala, genetica umana, markerii genetici, si diverse aspecte practice ale geneticii moleculare interdisciplinare.

Aceasta ediţie are ca auditoriu-ţinta tineri specialişti in biologia moleculară si genetica aplicată cu aspiraţii ȋnalte spre realizări de performanţa ȋn domeniul ales.

7

CAPITOLUL 1.

Prezentarea principiilor metodei de clonare şi exprimare a genelor în sistem procariot ADN în sine are doar două funcţii importante şi anume păstrarea

informaţiei genetice şi furnizarea acesteia pentru biosinteza de proteine.

Păstrarea include transmiterea materialului genetic nemodificat de la o

generaţie la alta. Acest fapt este realizat prin replicarea ADN-ului şi

împărţirea egală a celor două copii în timpul diviziunii celulare. A doua

funcţie este legată de descifrarea informaţiei pentru biosinteza de

proteine. Mesagerul informaţiei între ADN şi proteine este ARN-ul,

care este sintetizat în procesul de transcriere a ADN de către o enzimă

numită ARN polimeraza. ARNm rezultat serveşte ca matriţă în procesul

de traducere a ADN-ului, prin biosinteza proteinelor, care are loc în

ribozomi. Practic ARN-ul este purtatorul informaţiei din nucleu în

citoplasmă unde are loc biosinteza proteinelor. Dogma centrală a

biologiei moleculare presupune transmiterea unidirecţională a

informaţiei de la ADN – la proteine, prin intermediul ARN. Informaţia

genetică nu poate fi transmisă invers, de la proteine la ADN. Uneori,

informaţia genetică poate fi transmisă de la ARN la ADN în cazul

retrovirusurilor la care materialul genetic este ARN. Nu există cazuri de

transmitere a informaţiei de la ADN direct la proteine [2].

Clonarea genelor constă în izolarea unei gene dintr-un genom şi

introducerea ei în alte celule gazdă pentru multiplicare şi în unele cazuri

pentru exprimare. Prin multiplicarea celulelor cu genele clonate se pot

8

obţine milioane de copii ale unei singure gene. Sumar, procesul clonării

constă din următoarele etape:

• amplificarea genei de interes

• introducerea genei de interes într-un vector de clonare

• introducerea moleculelor recombinate în celule gazdă

• selecţia celulelor transformate (purtătoare ale moleculei

recombinate)

• verificarea moleculelor recombinate

1.1.Amplificarea genei de interes. O genă este considerat orice fragment de ADN care se transcrie

într-o moleculă de ARN. Moleculele de ARN rezultate în urma

transcrierii pot fi împărţite în 2 categorii: ARN funcţional si ARN

informaţional.

ARN funcţional este ARN care nu se traduce, îndeplineşte

anumite funcţii în celulă (în cea mai mare parte participă la procesul de

traducere) şi ocupă cea mai mare parte din ARN total din celulă: ARN

ribosomal (ARNr) şi ARN de transport (ARNt). Pentru asamblare in

ribosomi maturi ARNr are nevoie de proteine ribosomale structurale si

de ARN chaperoni [18].

ARN informaţional este ARN mesager (ARNm) care codifică un

polipeptid şi serveşte ca matriţă în procesul de traducere (biosinteză a

proteinelor). De cele mai multe ori genele de interes care sunt scopul

clonării codifică un polipeptid. În alte cazuri scopul clonării nu este

obligatoriu o genă, ci un fragment de ADN care nu poate fi separat

dintr-un amestec heterogen de molecule apropiate ca mărime. Din

9

această cauză în continuare se va utiliza doar termenul fragment ADN

de interes pentru a evita confuziile [2].

Deoarece fragmentul ADN de interes sau ţintă se află într-un

genom este necesară extragerea acestuia. Există două modalităţi de a

obţine fragmentul dorit, fie prin tăierea acestuia din genom, fie prin

copierea acestuia. Tăierea fragmentului din genom este mai dificilă

deoarece necesită prezenţa unor situsuri (secvenţe specifice) la capetele

fragmentului, care necesită apoi o izolare din amestecul de fragmente

generate, iar numărul moleculelor deci şi cantitatea de ADN este mică.

A doua opţiune de copiere a fragmentului din genom este cea

mai des utilizată. În acest scop se utilizează tehnica PCR (Polymerase

Chain Reaction) [44]. Această tehnică poate fi considerată un adevărat

copiator de gene. Tehnica este pe larg utilizată, este rapidă şi sensibilă

deoarece necesită cantităţi foarte mici de ADN matriţă. O condiţie

obligatorie pentru o amplificare reuşită este cunoaşterea secvenţei ţintă,

în special la capetele acesteia. Dacă secvenţa este necunoscută, atunci

se vor analiza cel puţin secvenţe ADN omoloage de la alte specii sau

secvenţa de aminoacizi a proteinei dacă este vorba despre o genă.

Principiul tehnicii PCR este o imitaţie a procesului de replicare a ADN

care are loc în celule. Dacă în celule pentru replicare se foloseşte o

întreagă serie de proteine, aici rolul unora dintre ele este preluat de unii

factori fizici, cum ar fi spre exemplu denaturarea ADN [2].

Denaturarea ADN presupune separarea celor două catene.

Procesul este reversibil, catenele complementare formând molecula

10

dublu catenară după înlăturarea agentului de denaturare. Reacţia de

amplificare este una ciclică, fiecare ciclu fiind alcătuit din 3 etape:

• denaturarea ADN

• alinierea amorselor

• sinteza catenei complementare de către ADN polimeraza.

Denaturarea ADN este necesară pentru separarea celor 2 catene.

Ca agent denaturant se utilizează temperaturi înalte de 94-98ºC.

Denaturarea din primul ciclu durează câteva minute (2-6) deoarece

pentru denaturarea moleculelor de ADN genomic, care sunt foarte mari,

e nevoie de mai mult timp. Etapele de denaturare după primul ciclu sunt

mai scurte, doar de 30-45 sec.

Amorsele (termenul englez este primer), denumite şi

oligonucleotide, sunt secvenţe scurte de ADN monocatenar. Aceste

amorse sunt complementare cu extremităţile secvenţei ţintă şi

formează cu acestea porţiuni scurte dublu catenare. Pentru alinierea

amorselor la secvenţele complementare, temperatura este coborâtă la

40-60ºC timp de câteva zeci de secunde. Această etapă este numită de

aliniere sau hibridizare. Temperatura de aliniere se stabileşte la câteva

grade (2-5ºC) mai puţin decât temperatura de topire (Tm) a amorsei.

Temperatura de topire se calculează în dependenţă de lungimea amorsei

şi de compoziţia ei. Există mai multe formule de calcul, cea mai simplă

formulă de calcul pentru o amorsă de până în 25 de nucleotide este:

Tm=4(G+C)+2(A+T),

unde G, C, A şi T sunt numărul de nucleotide ce conţin aceste baze

azotate. Numărul de G şi C se înmulţeşte dublu faţă de A şi T deoarece

11

între acestea există trei legături de hidrogen, în consecinţă moleculele

bogate în G şi C au o temperatură mai mare de topire [2].

Există câteva reguli pentru construirea amorselor şi anume:

• numărul de nucleotide este de 15-35,

• temperatura de topire a amorselor trebuie să fie între 40 ºC şi 70ºC,

• conţinutul de G şi C nu trebuie să depăşească 50-55%,

• la capătul 3' al amorsei este de dorit să fie o G sau C, deoarece oferă o

stabilitate mai mare,

• amorsele nu trebuie să prezinte complementaritate internă, în caz

contrar amorsa poate forma secvenţe interne dublu ca-tenare care au

aspect de stem sau buclă,

• cele două amorse sens (forward) şi antisens (reverse) nu tre-buie sa

fie complementare între ele, altfel se vor forma porţi-uni dublu catenare

sau dimeri de amorse, iar ca rezultat se vor amplifica porţiunile scurte

rămase monocatenare.

De la aceste porţiuni dublu catenare formate între catena matriţă

şi amorsa ADN, polimeraza poate iniţia sinteza catenei complementare.

ADN polimeraza catalizează sinteza catenei complementare în direcţia

5'→3' (Figura 1.1). Amorsele servesc în primul rând la delimitarea

fragmentului amplificat, dar şi ca punct start pentru ADN polimerază,

care nu poate porni sinteza de la zero şi are nevoie de un capăt liber 3'.

Iniţial la originea tehnicii PCR se folosea ADN polimeraza

izolată din bacteria Escherichia coli, care are activitatea optimă de

sinteză la 37°C. Cel mai mare dezavantaj al utilizării acestei enzime era

inactivarea termică în timpul denaturării ADN. În acest fel tuburile de

12

reacţie trebuiau schimbate de la o temperatură la alta şi după fiecare

ciclu era nevoie de un surplus de ADN polimerază.

Astfel, amplificarea fragmentelor de ADN era una foarte

costisitoare. Salvarea acestei metode a venit după descoperirea şi

descrierea ADN polimerazelor de la bacteriile termofile. Enzima

revoluţionară în acest sens, pe larg utilizată şi astăzi este Taq

polimeraza. Această enzimă este o ADN polimerază, izolată din o

bacterie termofilă Thermococcus aquaticus (de unde şi denumirea ei),

care sintetizează polimerizarea nucleotidelor trifosfat într-un lanţ

polinucleotidic în direcţia 5′→3′. Taq polimeraza are activitatea optimă

la 72°C şi nu se denaturează la temperaturi ridicate de peste 90°C

foarte repede, astfel după câteva ore la 95°C pierderea de activitate este

nesemnificativă. Viteza de polimerizare a Taq polimerazei este de

aproximativ 1000 de nucleotide per minut. Durata elongării necesare

sinte-zei va fi în dependenţă de mărimea fragmentului ţintă. Pentru un

fragment de 500 de nucleotide vor fi suficiente 30 sec, iar pentru un

fragment de 2000 de nucleotide – două minute [2].

Prin implementarea tehnicilor de mai sus este posibil de generat

mutații in ADN-ul genomic şi plasmidic, deleții ale genelor esenţiale si

caracterizarea mutanților funcţionali in gene esenţiale pentru viabilitatea

prokariotelor [16].

13

Figura 1.1. Reprezentarea schematică a primelor cicluri de PCR.

Un tip special de PCR este RT-PCR sau PCR de transcriere

inversă. Acest tip este asemănător PCR obişnuit, doar că foloseşte o

matriţă de ARN pentru a sintetiza ADN. Enzima responsabilă de

această sinteză este transcriptaza inversă, care este de fapt o ADN

polimerază ARN-dependentă. Taq polimeraza este o ADN polimerază

deoarece sintetizează ADN şi este ADN dependentă deoarece utilizează

o matriţă ADN pentru sinteză. Transcriptaza inversă a fost izolată de la

virusurile care au material genetic ARN şi în momentul intrării în celulă

necesită sinteza unei copii a materialului său genetic. RT-PCR se

utilizează pentru obţinerea copiilor de gene eucariote care nu conţin

introni şi analiza exprimării de gene. În ambele cazuri se porneşte de la

ARNm, fiind ARN informaţional care codifică proteine.

14

1.2. Enzime de restricţie Enzimele de restricţie sau restrictazele sunt enzime care taie

molecule monocatenare sau dublu catenare de ADN la anumite situsuri

specifice. Ele pot fi numite cu alte cuvinte adevărate foarfece de ADN.

Restrictazele recunosc doar anumite secvenţe scurte numite situsuri

specifice de recunoaştere, se fixează de acestea şi taie legăturile

fosfoesterice între nucleotide.

Aceste enzime au fost descoperite la bacterii şi se presupune că

funcţia lor este de apărare contra bacteriofagilor (virusuri ale

bacteriilor). În momentul intrării ADN fagic în bacterii, enzimele de

restricţie digeră aceste molecule. ADN bacterian propriu este protejat

contra enzimelor de restricţie prin metilarea unor baze azotate, enzimele

de restricţie, în general, nu taie ADN metilat. Până acum au fost

descrise 4000 de enzime de restricţie de la câteva sute de specii

bacteriene. Toate aceste enzime se împart în 3 clase: I, II şi III. Această

clasificare este în dependenţă de cofactorul utilizat şi de secvenţa de

recunoaştere. Enzimele cele mai utilizate în tehnicile moleculare sunt

cele de tip II, care au secvenţa de recunoaştere un palindrom şi

utilizează ioni de Mg2+ ca şi cofactor. Secvenţa palindrom este alcătuită

din 4-6 nucleotide şi citită pe ambele catene în direcţia 5′→3′ este

identică.

Nomenclatura enzimelor de restricţie porneşte de la denumirea

bacteriei de la care a fost izolată. Astfel, HindIII este izolată de

Heamophilus influenzae tulpina Rd, iar EcoRI de la Escherichia coli

tulpina RY13 [2].

15

Capetele libere după tăierea de către enzimele de restricţie pot fi

de 2 tipuri: coezive sau drepte. Enzima BamHI şi EcoRI generează

capete coezive după tăiere, iar enzimele SmaI şi EcoRV generează

capete drepte sau netede (Figura 1.2).

Figura 1.2. Secvenţele de recunoaştere pentru enzimele EcoRI (A) şi

SmaI (B) şi capetele libere după tăiere. Locurile de restricție sunt

indicate cu săgeţi [2].

Cu ajutorul unor programe specializate se pot alcătui hărţi de

restricţie care reprezintă situsurile de recunoaştere pentru diferite

restrictaze într-o secvenţă (Figura 1.3).

16

Figura 1.3. Harta de restricţie a unei gene de la drojdia Saccharomyces

cerevisiae. Cu cifre în parantezesunt indicate situsurile enzimelor de

restricţie [2].

1.3. Ligarea fragmentelor de ADN Deşi moleculele de ADN pot fi asemănate cu nişte fire, acestea

nu pot fi legate prin creare de noduri sau nu există nici un lipici special.

Pentru legarea fragmentelor de ADN se utilizează o enzimă numită

ADN ligaza. Această enzimă reface legăturile fosfoesterice între

gruparea hidroxil a unui nucleotid (capătul 3′) şi gruparea fosfat de la

nucleotidul altui fragment (capătul 5′) (Figura 1.4). Funcţia ligazei în

celule vii este legarea fragmentelor în timpul replicării, recombinării şi

după repararea ADN. Cea mai des utilizată este ADN ligaza T4 izolată

din bacteriofagul T4. In acțiune, ADN ligaza T4 utilizează ATP-ul ca şi

cofactor.

17

Figura 1.4. Reprezentarea schematică de legare de către ADN ligază a

două fragmente ADN care au capete netede [2].

1.4. Vectori de clonare Prin vectori de clonare subînţelegem molecule de ADN

transportatoare ale fragmentului de ADN străin în celulele gazdă.

Vectorii sunt de mai multe tipuri: cosmide, bacteriofagi, plasmide şi

vectori artificiali. Aceşti vectori sunt utilizaţi în dependenţă de scopul

clonării. Cele mai pe larg utilizate sunt plasmidele. Un plasmid este o

moleculă dublu catenară de ADN, care este circulară, închisă şi capabilă

de replicare autonomă în celule gazdă. Plasmidele comerciale utilizate

pe larg sunt plasmide naturale izolate de la bacterii care au fost

modificate. Plasmidele au nişte secvenţe specifice necesare replicării,

clonării, selecţiei şi uneori exprimării genelor. Pentru replicarea

autonomă în celule gazdă plasmidele conţin secvenţa ori, care este

originea de replicare. Nici o moleculă de ADN nu poate fi replicată fără

o origine de replicare. Originea de replicare este o regiune a moleculei

de ADN de unde poate începe replicarea şi care este recunoscută de

anumite proteine care iniţiază replicarea.

18

O regiune foarte importantă într-un vector de clonare este

Situsul Multiplu de Clonare (termenul englezesc este Multiple Cloning

Site). În această regiune se introduce fragmentul ţintă de ADN cu

ajutorul enzimelor de restricţie şi a ligazei. Atât vectorul cât şi

fragmentul ADN sunt tăiate cu aceleaşi enzime de restricţie şi legate

împreună cu ajutorul ligazei. SMC conţine secvenţele de recunoaştere

pentru mai multe enzime de restricţie care nu se conţin în altă regiune a

vectorului [2].

O altă componentă foarte importantă a plasmidelor sunt markerii

de selecţie care sunt de obicei nişte gene, a căror produs (enzimă) fac

posibilă selectarea celulelor cu plasmid de cele fără plasmid care sunt

mai numeroase. Cei mai frecvenţi markeri utilizaţi sunt genele ce

conferă rezistenţă la antibiotice, mai corect spus produsul genei conferă

rezistenţă. Spre exemplu, β-lactamaza conferă rezistenţă la ampicilină.

Plasmidele care conţin gena pentru această enzimă vor proteja celulele

bacteriene de efectul antibioticului. Astfel dacă un amestec de celule

transformate cu plasmide care vor conţine atât celule cu, cât şi fără

plasmid, se însămânţează pe un mediu cu ampicilină, vor supravieţui

doar celulele care conţin plasmidul.

Un alt fel de selecţie este selecţia celulelor transformate cu

plasmid recombinat adică cu insert de cele cu plasmid fără insert. Insert

se referă la fragmentul de ADN ţintă clonat. În acest scop situsul

multiplu de clonare se află într-o genă ce codifică o enzimă. Dacă în

SMC nu a fost introdus niciun fragment ADN atunci gena este intactă,

produsul ei este o proteină activă. Dacă în SMC a fost introdus un

19

fragment ADN atunci gena este modificată şi produsul ei este inactiv.

Spre exemplu dacă SMC se află în gena lacZ′ care codifică subunitatea

α a enzimei β-galactozidază, atunci produsul acestei gene împreună cu

subunităţile codificate din genomul celulei gazdă bacteriene vor forma o

enzimă activă capabilă să metabolizeze un derivat al galactozei numit

X-Gal (bromo-cloro-indolil galactopiranozid) care este adăugat în

mediu şi este incolor. Dacă β-galactozidaza este activă atunci va

metaboliza acest substrat, iar produsul format în urma reacţiei va avea o

culoare albastră. În acest fel coloniile rezultate după transformare care

conţin vectorul fără insert vor fi albastre, iar cele ce conţin vector

recombinat vor fi albe, deoarece ele nu produc enzimă activă capabilă

de metabolizarea substratului X-Gal. Un alt tip de selecţie utilizează o

enzimă toxică pentru celulele bacteriene. Astfel, celulele cu plasmid

fără insert au gena funcţională care va provoca moartea celulelor.

Celulele bacteriene care au plasmidul cu insert vor avea gena

nefuncţională şi vor supraveţui [2].

Vectorii de clonare au de obicei mărime mică, doar de câteva

mii de pb şi în care pot fi inserate fragmente de ADN de la 100 pb până

la 2000-5000 pb (Figura 1.5). O caracteristică importantă pentru

plasmide este numărul de copii per celulă. Vectorii de clonare mai mici

au de obicei un număr mai mare de copii per celulă. Acest fapt permite

obţinerea unei cantităţi mari de ADN plasmidic dintr-o cultură mică de

bacterii (din 3-5 ml de cultură se pot obţine câteva μg de ADN

plasmidic). Pentru vectorii mai mari numărul copiilor per celulă este

20

mai mic, în consecinţă şi pentru a obţine o cantitate mai mare de ADN

este necesară o cantitate mai mare de cultură.

Vectorii de exprimare sunt de asemenea vectori de clonare dar

care oferă în plus posibilitatea exprimării genei clonate. Plasmidele de

exprimare trebuie să mai conţină câteva elemente în plus faţă de vectorii

de clonare. Aceste elemente sunt cele care se găsesc în genom şi fac

parte dintr-o genă: promotorul, situsul de legare al ribosomilor, codonii

START şi STOP care delimitează cadrul deschis de citire (termenul

englez este Open Reading Frame). Promotorul este o secvenţă care se

află în amonte de genă şi este recunoscut de factorii de transcriere, care

se fixează la nivelul promotorului şi iniţiază transcrierea. Numai în

prezenţa promotorului exprimarea va fi foarte scăzută, de aceea situsul

de legare al ribozomilor (termenul englez este Ribosome Binding Site)

este o secvenţă care se transcrie dar care nu se traduce şi care este

recunoscută de ribosomi. Ribosomii se leagă la acest situs şi se

deplasează de-a lungul ARNm până întâlnesc primul codon START de

unde începe traducerea. Codonul START la procariote este în cele mai

dese cazuri AUG, urmat de codonul +2, care este necesar sa nu fie cu

frecvența de decodare rara, pentru a nu ȋncetini miscarea in vivo a

ribosomilor pe mARN [17]. Aceşti doi codoni sunt de obicei incluşi în

situsul multiplu de clonare, sau se pot introduce în fragmentul ţintă cu

ajutorul amorselor. In contrast, codonul STOP (UAA, UGA) este inclus

de obicei în situsul de clonare. Unerori UGA poate fi recodat in

selenocisteina [75]. În unele cazuri UAA este prezent după regiuni care

codifică anumite aşa-zisele etichete. Acestea din urmă facilitează

21

purificarea proteinelor recombinate prin cromatografie de afinitate. Cele

mai des utilizate sunt eticheta de 6 histidine (His-tag), Glutation S-

transferaza (GST) şi proteina de legare a maltozei (Maltose Binding

Protein, MBP este termenul în engleză). Aceste etichete vor fi parte

integrantă a proteinelor la capătul ei C-terminal sau N-terminal dacă

secvenţa ce codifică eticheta este prezentă după sau înainte de situsul de

clonare respectiv. Etichetele vor conferi proteinelor recombinate

afinitate faţă de anumite răşini cromatografice [2].

Figura.1.5 Reprezentarea a plasmidei pTN48 [9].

22

1.5. Introducerea moleculelor recombinate în celule gazdă Introducerea plasmidelor recombinate în celule gazdă se

numeşte transformare dacă sunt utilizate celule bacteriene sau

transfecţie dacă sunt utilizate celule eucariote. În continuare se va

detalia doar transformarea celulelor procariote, acestea având cea mai

mare aplicabilitate şi simplitate în scopul obţinerii clonelor şi

proteinelor recombinate. Există două tipuri de transformare a celulelor

bacteriene pe larg utilizate în laboratoarele de biologie moleculară:

• transformarea chimică

• transformare sub influenţa câmpului electric.

Ambele tipuri de transformare necesită inducerea unei

competenţe de transformare, deoarece E. coli nu are proprietăţi de

transformare naturală. Această competenţă în cazul transformării

chimice este indusă cu CaCl2. În acest scop se realizează o cultură de E.

coli şi prin tratarea celulelor cu clorură de calciu la rece se poate induce

transformarea celulelor bacteriene (Figura 1.6A). Apoi celulele sunt

şocate termic foarte scurt, timp de maxim două minute, la 42°C. Acest

timp este suficient pentru intrarea moleculelor recombinate în celulele

bacteriene.

Transformarea în câmp electric este mai eficientă decât

transformarea chimică. Prepararea celulelor competente presupune doar

creşterea lor până în faza logaritmică (D600nm = 0,6 - 0,8) şi înlăturarea

prin spălări repetate a mediului de cultură. Aceste spălări repetate vor

asigura eliminarea ionilor care pot afecta transformarea. Pentru acest tip

de transformare este necesar un aparat numit electroporator, care va

23

crea câmpul electric între doi electrozi. Amestecul de celule competente

şi plasmide recombinate vor fi depuse într-o cuvă specială de

electroporare, ai cărei pereţi laterali sunt electrozii. Transformarea are

loc la o tensiune de 1800 sau 2500 V timp de câteva msec (Figura

1.6B). După transformare celulele şocate sunt preluate în mediu de

cultură şi apoi însămânţate pe mediu selectiv cu antibiotice [2].

Doar unele celule bacteriene sunt transformate, cea mai mare

parte dintre ele fiind netransformate, adică fără plasmid. Eficienţa de

transformare a celulelor se poate măsura efectuând o transformare cu o

cantitate de 1 ng de ADN plasmidic şi apoi numărând coloniile

rezultate. Numărul de colonii va corespunde numărului de celulele

transformate deoarece fiecare colonie ia naştere dintr-o singură celulă.

Numărul obţinut de la transformarea a 1 ng de ADN plasmidic se

raportează la 1 μg de ADN (înmulţind valoarea la 1000). O eficienţă

bună de transformare este 106, ceea ce înseamnă ca la transformarea

unui μg de plasmid s-ar obţine 1 milion de colonii, o valoare foarte

mare ţinând cont de faptul că avem nevoie de o singură colonie sau de

câteva când avem un amestec eterogen de molecule ţintă. Desigur în

amestecul de ligare numărul de molecule recombinate este mic şi din

aceas-tă cauză este recomandată o eficienţă cât mai mare a celulelor

competente.

Fiecare dintre cele două metode de transformare prezintă

avantaje şi dezavantaje legate de eficienţa de transformare şi de costuri.

Transformarea chimică este mai puţin eficientă decât electroporarea, dar

mai ieftină deoarece nu necesită aparataj şi cuve costisitoare.

24

Figura 1.6. Transformarea celulelor bacteriene cu ADN plasmidic [2].

A – transformarea chimică cu CaCl2;

B – electroporarea celulelor bacteriene.

1.6. Electroforeza acizilor nucleici Electroforeza este procesul de migrare a moleculelor cu sarcină

într-un câmp electric. Migrarea moleculelor se realizează printr-o

matrice specifică. Metoda este aplicată pentru analiza proteinelor şi a

acizilor nucleici. Pentru proteine se aplică cel mai des electroforeza

proteinelor în condiţii denaturante în gel de poliacrilamidă (termenul

englezesc SDS-PAGE). Poliacrilamida se poate utiliza ca matrice şi

pentru electroforeza acizilor nucleici care oferă o rezoluţie foarte bună a

separării fragmentelor de ADN, mai ales în cazul fragmentelor mici.

Această matrice este folosită mai rar în laboratoarele de analize

genetice, deoarece este mai laborioasă. Primul loc în utilizarea

vizualizării acizilor nucleici aparţine electroforezei în gel de agaroză.

25

Deşi metoda oferă o rezoluţie inferioară celei din poliacrilamidă, ea este

utilizată cu succes deoarece este mai simplă.

Moleculele de acizi nucleici sunt încărcate negativ datorită

grupărilor fosfat. Această sarcină face posibilă migrarea moleculelor de

ADN şi ARN într-un câmp electric de la catod la anod. Amestecul de

molecule nu se va deplasa în câmp electric cu aceeaşi viteză.

Moleculele mici se vor deplasa mai repede prin porii matricei, iar cele

mai mari vor avansa mai lent. Astfel separarea moleculelor va fi în

dependenţă de masa lor moleculară. Pentru estimarea aproximativă a

mărimii fragmentelor în acelaşi gel, dar în godeu separat se va migra un

amestec de molecule cu mase moleculare diferite dar cunoscute. Acest

amestec de molecule se numeşte marker molecular ADN.

Agaroza este un poliglucid extras din alge marine roşii. Gelurile

de agaroză se realizează prin încălzirea agarozei într-un tampon

specific. Concentraţia agarozei în gel poate fi între 1% şi 3% în

dependenţă de scopul urmărit. Cu cât concentraţia agarozei este mai

mare, cu atât mărimea porilor va fi mai mică. La concentraţii mai mici

de agaroză, porii vor fi mai mari şi migrarea moleculelor mai rapidă. În

concluzie concentraţii mai mici se folosesc pentru fragmente mari

(câteva mii de pb), iar concentraţii mari pentru fragmente mici. Gelurile

de agaroză de 1% sunt cel mai des utilizate, oferind separarea

moleculelor între 0,1 şi 10 kpb. Gelurile de agaroză sunt plasate între

cei doi electrozi în cuve speciale care conţin tampon de migrare. Acest

tampon este acelaşi folosit şi pentru realizarea gelului. Cele mai folosite

tampoane sunt TAE (Tris/Acetat/EDTA) şi TBE (Tris/Borat/EDTA).

26

Deoarece ADN nu poate fi vizualizat cu ochiul liber este

necesară utilizarea unui colorant. Cel mai des folosită în acest scop este

bromura de etidiu, care fixată de ADN în lumină ultravioletă devine

fluorescentă şi are o culoare portocalie (Figura 1.7). Bromura de etidiu

se intercalează între bazele azotate din molecula dublu catenară de

ADN. Lungimea de undă a luminii ultraviolete la care este expus gelul

trebuie să fie cuprinsă între 260 şi 300 nm.

Figura 1.7. Separarea unor fragmente de ADN cu ajutorul electroforezei

în gel de agaroză.

Electroforeza în gel de agaroză este utilizată pentru vizualizarea

şi purificarea ADN. Vizualizarea ne oferă informaţii despre integritatea

ADN (ADN genomic, ADN plasmidic etc), rezultatul digestiilor

enzimatice, estimarea cantităţii de ADN obţinută în reacţiile PCR sau de

extracţie. ADN poate fi purificat din gel de agaroză după migrare prin

27

excizarea fragmentului ţintă şi purificarea din gel cu kituri special

predestinate acestui tip de purificări [2].

Verificarea moleculelor recombinate

Rezultatul ligării şi transformării se poate vedea doar după 12-

18 ore de la transformare când apar coloniile de E. coli pe mediu

selectiv. Apariţia coloniilor nu indică neapărat şi o reuşită deplină a

clonării, deoarece acestea pot conţine un amestec de colonii pozitive şi

colonii cu plasmid fără insert. Chiar dacă se foloseşte un sistem alb-

albastru de selecţie a coloniilor pozitive, acestea necesită totuşi o

dovadă în plus a prezenţei plasmidului recombinat. În acest scop se va

efectua o cultură lichidă de 3-5 ml de mediu cu antibiotic care se va

însămânţa cu o singură colonie. Cultura se va incuba peste noapte cu

agitare la 37°C. Ziua următoare din bacteriile rezultate se va purifica

ADN plasmidic cu ajutorul unor metode clasice sau cu ajutorul unor

kituri speciale. ADN plasmidic urmează a fi analizat iniţial prin digestie

enzimatică şi apoi prin secvenţializare. Digestia ADN plasmidic se va

realiza cu enzimele de restricţie cu care acesta a fost introdus în vector

sau care se află la extremele situsului multiplu de clonare. Această

digestie va confirma prezenţa insertului în plasmid şi aproximativ

mărimea acestuia, dar nu va furniza nicio informaţie despre secvenţa

fragmentului clonat.

Secvenţierea fragmentului ţintă este verificarea definitivă a

clonării. Această verificare este necesară deoarece ADN polimeraza

utilizată pentru amplificarea insertului prin PCR poate introduce erori

28

de sinteză. Pentru a evita erorile în produşii PCR se poate utiliza o ADN

polimerază care are proprietatea de a corecta erorile introduse. Astfel de

ADN polimeraze sunt Vent polimeraza, Pfu polimeraza, Tli polimeraza

ş. a. Taq polimeraza nu are activitate de corectare a erorilor, dar asigură

de obicei randamente de sinteză mai mari. În unele cazuri se utilizează

un amestec de 2 polimeraze (3 părţi de Taq polimerază şi o parte Pfu

polimerază) pentru a combina un randament mai mare cu o fidelitate

crescută [2].

Analizatoarele genetice din seria ABI Prism, produse de Applied

Biosystems (SUA), au laser cu detecţie pentru 5 fluorocromi, şi ȋn

actiunea sa utilizează principiul Sanger de secvenţiere. Acest principiu

presupune utilizarea unei variante de PCR pentru secvenţiere. Matriţa

ADN ce urmează a fi secvenţiată este denaturată, apoi la unul din

capetele sale are loc ataşarea unei amorse de la care ADN polimeraza

va porni sinteza catenei complementare. Amestecul PCR conţine

dezoxiribonucleozide trifosfat (dNTP) dar şi di-dezoxiribonucleozide

trifosfat (ddNTP) care nu conţin gruparea OH în poziţia 3' a

dezoxiribozei. Lipsa acestei grupări va face imposibilă continuarea

sintezei ADN, deoarece ADN polimeraza nu poate adăuga următorul

nucleotid. Rezultatul acestui PCR vor fi fragmente monocatenare

(deoarece se foloseşte o singură amorsă) de diferite mărimi. Numărul de

cicluri este de 40, ceea ce permite sinteza tuturor fragmentelor care se

opresc în toate punctele matriţei de ADN. Pentru detecţia fragmentelor,

fiecare ddNTP este marcat cu un fluorocrom. Amestecul de fragmente

rezultate sunt separate cu ajutorul electroforezei capilare, care

29

presupune utilizarea unui capilar cu un diametru de ordinul

micrometrilor. O cantitate de câţiva microlitri vor fi separaţi în gelul din

capilar. Migrarea fragmentelor în gel este în dependenţă de mărimea

lor, cele mai mici vor fi primele, iar la final cele mai mari. În ultima

parte a capilarului există o fereastră transparentă prin care un fascicol

laser va excita fluorocromii, iar fluorescenţa emisă va fi captată şi

prezentată sub forma unei electroforegrame (Figura 1.8).

Electroforegramele sunt apoi analizate şi comparate cu secvenţa

existentă în bazele de date. Mărimea fragmentelor de ADN care pot fi

secvenţializate variază între 600 şi 800 pb. Pentru fragmente mai mari

sau pentru matriţe dificile (cu secvenţe repetitive) este necesară

utilzarea unor kituri speciale [2].

Figura 1.8. Electroforegrama unei secvenţe obţinută cu ajutorul

analizorului ABI Prism 310.

30

1.7. Exprimarea genelor în sistem procariot Clonarea genelor vizează în principal două obiective posibile:

multiplicarea unui fragment ADN sau exprimarea genei clonate.

Clonarea în scopul multiplicării fragmentului este utilizată atunci când

ADN supus analizei este de fapt un amestec de fragmente care nu pot fi

separate cu ajutorul electroforezei şi la care se urmăreşte cunoaşterea

secvenţei. În acest scop amestecul de fragmente se clonează într-un

vector de clonare, iar clonele pozitive sunt apoi secvenţializate.

Celulele de E. coli sunt utilizate pe larg în obţinerea de proteine

recombinate. Ele pot fi numite adevărate fabrici de proteine la comandă,

care însă câteodată „refuză” să sintetizeze proteinele comandate şi de ce

cele mai dese ori străine celulei bacteriene. Clonarea în scopul

exprimării genei şi obţinerii de proteină recombinată include câteva

aspecte care sunt importante pentru exprimare. Gena codificatoare poate

fi clonată direct în vectorul de exprimare. Plasmidele de exprimare

conţin neapărat un promotor recunoscut de ARN polimeraza celulei

gazdă, un situs de legare a ribosomilor (rbs), un codon START (AUG) şi

unul STOP la capetele situsului multiplu de clonare. Foarte important în

acest caz este păstrarea cadrului deschis de citire, adică împărţirea

exactă pe codoni a genei de la primul codon tradus până la ultimul.

Promotorii din aceste tipuri de plasmide sunt de tip inductibil. Cel mai

des utilizat inductor este IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid),

care este un analog al galactozei. Spre exemplu, vectorii de tip pET de

la Novagen asigură de obicei o supraexprimare a genelor clonate.

Plasmidul pET21 conţine promotorul de la fagul T7, situsul de

31

recunoaştere a ribosomilor, codonul START în situsul multiplu de

clonare şi codonul STOP după o etichetă de 6 histidine. Dacă se optează

pentru prezenţa unei etichete 6×His la capătul C-terminal a proteinei

pentru facilitarea purificării, atunci din genă se va înlătura codonul

STOP. Dacă această etichetă nu este necesară, atunci în genă se va

păstra codonul STOP şi traducerea se va opri înainte de etichetă.

Promotorul T7 nu este recunoscut de către ARN polimeraza de la E.

coli şi simpla prezenţă a plasmidului în celulele bacteriene nu va sigura

o exprimare a genei. Vectorii pET necesită tulpini de E. coli care conţin

gena pentru ARN polimerază de la fagul T7. Această genă se află sub

controlul promotorului lac UV5 şi a operatorului lac.

Operatorul lac este o secvenţă recunoscută de către o proteină

numită represorul lac. Atunci când în mediu nu există lactoză (sau

analogi ai lactozei) represorul lac se fixează la operatorul lac şi

împiedică transcrierea genei pe care o reglează, care în acest caz este

gena pentru T7 ARN polimerază. În absenţa T7 ARN polimerazei nu va

exista nici transcrierea genei ţintă din plasmid. Represorul lac este

codificat de gena lacI care se află atât în genomul bacteriei gazdă cât şi

în plasmidul de exprimare. Agentul care induce exprimarea este un

analog al galactozei IPTG. Moleculele de IPTG se fixează de represorul

lac şi cauzează disocierea acestuia de la operatorul lac, astfel

promotorul lac devine accesibil pentru ARN polimeraza de E. coli care

va transcrie gena pentru T7 ARN polimerază. Aceasta din urmă va

recunoaşte promotorul T7 din plamsid şi va transcrie gena ţintă. Acest

sistem de exprimare este unul foarte puternic şi care poate asigura o

32

producţie de proteină care va alcătui până la 50% din proteinele totale

bacteriene.

Operatorul lac este o secvenţă recunoscută de către o proteină

numită represorul lac. Atunci când în mediu nu există lactoză (sau

analogi ai lactozei) represorul lac se fixează la operatorul lac şi

împiedică transcrierea genei pe care o reglează, care în acest caz este

gena pentru T7 ARN polimerază. În absenţa T7 ARN polimerazei nu va

exista nici transcrierea genei ţintă din plasmid. Represorul lac este

codificat de gena lacI care se află atât în genomul bacteriei gazdă cât şi

în plasmidul de exprimare. Agentul care induce exprimarea este un

analog al galactozei IPTG. Moleculele de IPTG se fixează de represorul

lac şi cauzează disocierea acestuia de la operatorul lac, astfel

promotorul lac devine accesibil pentru ARN polimeraza de E. coli care

va transcrie gena pentru T7 ARN polimerază. Aceasta din urmă va

recunoaşte promotorul T7 din plamsid şi va transcrie gena ţintă. Acest

sistem de exprimare este unul foarte puternic şi care poate asigura o

producţie de proteină care va alcătui până la 50% din proteinele totale

bacteriene [2].

1.8. Purificarea proteinelor recombinate Proteinele recombinate pot fi purificate prin metode

cromatografice. Pentru o purificare cât mai bună din amestecul total de

proteine este necesară purificarea în cel puţin două etape prin metode

cromatografice diferite.

Ataşarea unor etichete la proteinele recombinate asigură

purificarea proteinelor într-o singură etapă, ceea ce reduce timpul

33

necesar şi asigură randamente de purificare mai mari (Figura 1.9). Dacă

eticheta deranjează în analiza ulterioară a proteinei, atunci se poate

recurge la înlăturarea acesteia prin digestie cu peptidaze. În acest scop

pentru clonare şi exprimare se va alege un plasmid care conţine situsul

pentru peptidază, cum este spre exemplu situsul pentru trombină în

cazul plasmidului pET28 [2].

Figura 1.9. Reprezentarea schematică a purificării de proteine

recombinate prin cromatografie de afinitate.

34

1.9. Utilizarea clonării de gene şi exprimării de proteine recombinate în studii interdisciplinare

Clonarea genelor în ultimii ani a devenit o tehnică

indispensabilă în laboratoarele de biologie moleculară. Una dintre

aplicaţiile acestei tehnici, importante nu numai pentru biologie, dar şi

pentru studii interdisciplinare este utilizarea ei în scopul obţinerii de

proteine recombinate. Clonarea genelor şi exprimarea lor în celule

gazdă reprezintă o sursă foarte preţioasă de proteine. În cele mai multe

cazuri purificarea unei proteine din celulele în care aceasta se exprimă

în mod firesc natural prezintă mai multe dificultăţi:

• cantitatea de proteine în ţesuturi este foarte mică, spre

exemplu pentru purificarea unei proteine din bacterii este necesară o

cantitate de zeci de litri de cultură bacteriană, iar rezultatul purificărilor

în câteva etape pot fi sub 100 mg de proteină;

• obţinerea unei cantităţi mari de ţesut pentru purificare este

aproape imposibil, spre exemplu cum este cazul unor bacterii pe care nu

putem să le cultivăm în condiţii de laborator;

• obţinerea materialului pentru purificare implică probleme

etice, cum ar fi spre exemplu cazul unor proteine umane, obţinerea de

proteine din celule umane ar fi imposibilă;

• purificarea se face în mai multe etape care necesită timp,

consumabile şi are randamente mai mici.

Aceste dezavantaje ale purificării direct din material biologic

sunt eliminate în cazul exprimării genelor în celule gazdă. Un mare

avantaj al acestei metode este posibilitatea introducerii de mutaţii care

pot dezvălui rolul unor domenii sau aminoacizi particulari în activitatea

35

proteinei. Prin intermediul tehnicilor de mutageneză pot fi introduse

mai multe tipuri de mutaţii:

• mutaţii missens care schimbă un aminoacid cu altul;

• deleţii în care porţiuni întregi din lanţul polipeptidic pot fi

înlăturate;

• inserţii care constau în introducerea de fragmente noi în gena

codificatoare şi respectiv în proteina recombinată;

• fuzionării, se pot fuziona proteine între ele sau regiuni ale unei

proteine cu regiuni ale altei proteine, spre exemplu regiunea

N-terminală a unei proteine de la o specie se poate fuziona cu capătul

C-terminal al aceleiaşi proteine de la o specie înrudită;

• proteinele recombinate pot fi marcate. Proteinele pot fi marcate

cu anumite molecule care sunt introduse în proteine în procesul lor de

sinteză sau pot fi fuziuni. Un exemplu în acest sens este marcarea

proteinelor cu izotopi stabili sau radioactivi, în mod specific sau

randomizat. Un alt exemplu este marcarea proteinelor prin fuziunea lor

cu proteine fluorescente, care apoi facilitează detecţia lor.

Clonarea genelor şi exprimarea lor în sistem procariot este

tehnica la care se apelează cel mai des, deoarece este mai rapidă şi mai

puţin costisitoare. Proteinele sunt structuri cu mai multe nivele de

organizare, astfel o proteină are structură: primară, secundară, terţiară şi

cuaternară. Exprimarea genelor şi sinteza proteinelor în celulele

procariote asigură doar structura primară exactă a polipeptidului

sintetizat. În unele cazuri proteinele adoptă structura secundară

independent după sinteză, în alte cazuri este nevoie de condiţii speciale

36

şi alte proteine care contribuie la adoptarea conformaţiei proteinei

active. Unele proteine atât de la eucariote cât şi de la procariote

sintetizate în celule gazdă de E. coli nu reuşesc să adopte o structură

secundară corectă, iar ca rezultat polipeptidele acumulate în citoplasmă

formează corpi de incluziune. Există cazuri când acumularea proteinei

sub forma corpilor de incluziune este un avantaj. Corpii de incluziune

oferă posibilitatea unei purificări printr-o singură etapă în condiţii

denaturante.

Proteinele denaturate purificate în acest mod pot fi utilizate

pentru imunizarea de animale în scopul producerii de anticorpi. Cel mai

important aspect pentru imunizare este secvenţa de aminoacizi a

proteinei şi nu structura ei secundară sau terţiară. Exprimarea

proteinelor sub forma corpilor de incluziune nu poate fi prezisă pe baza

apartenenţei genei sau pe baza analizei structurii primare. O altă

problemă care poate apărea este neexprimarea genei. Cauzele

neexprimării pot fi toxicitatea proteinei asupra celulelor gazdă. Un alt

dezavantaj (deşi în unele cazuri este un avantaj) este lipsa modificărilor

post-traducere a polipeptidelor sintetizate în celule bacteriene.

Majoritatea proteinelor de la eucariote necesită nu numai adaptări

conformaţionale dar şi modificări post-traducere cum ar fi fosforilări,

glicozilări ş. a. Dacă prezenţa acestor modificări este absolut necesară,

atunci se va recurge la clonarea genei în sistem procariot şi exprimarea

ei în celule gazdă eucariote. Lipsa modificărilor post-traducere este un

avantaj atunci când este cunoscută funcţia proteinei active şi se doreşte

să se cunoască rolul grupărilor care sunt adăugate după sinteză. În acest

37

fel proteina recombinată nu va fi modificată şi se va putea deduce rolul

acestor grupări în activitatea proteinei [2].

CAPITOLUL 2.

Tehnici moleculare utilizate in selecţia asistată de markeri genetici

2.1. TEHNICA PCR Tehnica PCR sau reacţia în lanţ a polimerazei, dezvoltată la

mijlocul anilor ’80, a revoluţionat genetica moleculară, făcând

posibilă studierea şi analizarea genelor prin metode mult mai

accesibile şi foarte simple. Această tehnică a fost descoperită de Kary

Mullis în anul 1983, plecând de la caracteristicile replicării ADN şi

anume, cu ajutorul enzimei ADN polimeraza care utilizează o catenă a

ADN ca matriţă pentru sinteza unei noi catene complementare. Prin

această tehnică se produc un număr enorm de copii a unor

secvenţe de ADN (gene) fără a se apela la clonare [44].

Tehnica PCR exploatează unele caracteristici ale replicării

ADN, unde pentru amplificarea secvenţei de ADN dorite se utilizează

o secvenţă de oligonucleotide numită primer sau amorsă. Primerii sunt

secvenţe scurte de 15 – 35 nucleotide, complementare capetelor 3’

ale secvenţei de ADN ce se doreşte a fi amplificată; ei sunt specifici

fiecărei gene şi sunt sintetizaţi cu ajutorul unor sintetizatoare

automate de ADN. Pentru amplificarea secvenţelor specifice de

ADN, prin tehnica PCR, se foloseşte o soluţie tampon (PCR

buffer) în care se introduce ADN ce conţine gena de interes, primerii

38

sintetizaţi, Taq polimeraza şi cele patru tipuri de deoxinucleotid-

trifosfaţi (dATP, dGTP, dCTP şi dTTP).

Tehnica PCR presupune parcurgerea a trei etape principale, într-un

aparat în care realizarea ciclurilor termice este controlată automat de

Termocycler:

- Denaturarea ADN, presupune încălzirea soluţiei în care se

află ADN la 940 C timp de 5 minute, efectul fiind ruperea

legăturilor de hidrogen şi separarea celor două catene.

- Ataşarea primerilor se realizează prin răcirea pȋnă la 40°C –

60°C a soluţiei în care se află secvenţa de amplificat.

Primerii se leagă la capetele 3’a celor două catene de

ADN ale genei pe care dorim să o amplificăm. De

obicei, este nevoie de doi primeri numiţi sens şi antisens,

dar amplificarea se poate realiza şi cu un singur primer, în

cazul tehnicii PCR ancorat.

- Elongaţia se produce la temperatura de circa 72°C,

temperatură la care Taq-polimeraza funcţionează optim, în

faza de extensie, iar ciclul se repetă de 25 – 40 ori.

Amplificarea este aproximativ exponenţială, realizându-

se după 3 cicluri 2 copii, după 10 cicluri 256 copii, iar

după 32 cicluri 1,73 miliarde copii ale secvenţei supuse

amplificării [2]. După amplificare, gena de interes se

vizualizează în lumină ultravioletă, la nivelul gelului de

agaroză în care fragmentele au fost colorate cu bromură de

39

etidiu. Dacă amplificarea s-a produs, în gel se vor

observa una sau mai multe benzi, corespunzătoare

secvenţei specifice de ADN.

În tehnica PCR, alegerea primerilor este primordială şi putând fi

utilizaţi două tipuri de primeri:

- primeri specifici - sunt dirijaţi spre un situs foarte precis al

ADN, reprezentat de genele sau fragmentele de gene

cunoscute. Prin primer specific se înţelege o secvenţă

cunoscută de ADN utilizată pentru începerea sintezei unei

anumite gene, cu structură cel puţin parţial cunoscută. Primeri

specifici pot fi dirijaţi şi spre regiunile situate în amonte sau

aval de secvenţele unice, la nivelul secvenţelor minisatelit sau

microsatelit. Secvenţele de tip satelit, specifice fiecărui

individ sunt astfel amplificate. Evidenţierea acestor

polimorfisme se utilizează în momentul de faţă în

medicina criminalistică pentru identificarea suspecţilor,

pornind de la diferite mostre de ţesut (sânge, spermă, bulbi de

păr etc.), pentru marcarea cărnii, sau altfel spus, urmărirea ei

pe parcursul filierei de distribuţie şi consum.

- primeri aleatori - sunt de dimensiuni reduse (în medie 10

– 20 nucleotide ). Alegerea secvenţelor care constituie aceşti

primeri este complet arbitrară. În cursul reacţiei PCR aceşti

primeri se vor hibrida de fiecare dată când în ADN se vor găsi

secvenţe care le sunt complementare şi de orientare opusă.

40

Tehnica PCR şi-a găsit aplicare în cele mai diverse domenii:

- în selecţia animalelor: prin stabilirea genotipurilor la locii care

codifică sinteza cazeinei, β-lactoglobulinei, leptinei, factorului

de transcripţie pituitar (Pit1) care este responsabil pentru

expresia hormonului de creştere la mamifere, este posibilă

aplicarea selecţiei timpurii, reţinând la reproducţie numai

animalele a căror genotip se asociază cu producţii cantitative şi

calitative mai ridicate.

- în alimentaţie: se poate folosi pentru alegerea tulpinilor de levuri sau

mucegaiuri ce vor putea fi utilizate ca probiotice (aditivi

furajeri) în hrana animalelor.

- în reproducţie: se foloseşte pentru identificarea sexului încă din

faza de embrion. Utilizând primeri specifici pentru

amplificarea unor secvenţe de ADN de pe heterozomul Y, se

poate stabili sexul. Dacă embrionul este de sex mascul (XY) se

va produce amplificarea secvenţei specifice de pe

cromozomul Y şi va putea fi vizualizată în gelul de

agaroză. Dacă embrionul este de sex femel (XX) nu se va

produce amplificarea secvenţei respective, în gelul de

agaroză lipsind banda caracteristică.

- în medicină: se foloseşte pentru identificarea unor gene mutante

(oncogene), care conduc la apariţia unor tumori maligne, în

monitorizarea evoluţiei şi terapiei cancerului, în detectarea

infecţiilor bacteriene şi virale.

41

- în institutele medico - legale: se foloseşte pentru determinarea

paternităţii, sau pentru identificarea persoanelor care s-au făcut

vinovate de delicte penale: crimă, viol etc [38].

2.2. VARIANTE ALE TEHNICII PCR

2.2.1. Tehnica RFLP Această tehnică se bazează pe proprietăţile de hibridare

care există între două fragmente de ADN, prezentând un grad înalt de

omologie (RFLP- bazat pe hibridare) şi tehnica PCR – denumită PCR-

RFLP, în care se evidenţiază polimorfismele existente la nivelul

situsurilor enzimelor de restricţie.

a) Tehnica RFLP bazată pe hibridare cu o sondă, implică

parcurgerea următoarelor etape:

- extracţia ADN din organismele ce urmează să fie analizate;

- digestia ADN cu ajutorul enzimelor de restricţie;

- separarea fragmentelor obţinute în urma digestiei, în

funcţie de mărimea lor, prin electroforeză în gel de agaroză;

- transferul ADN sub formă denaturată pe o membrană de

nylon (Southern blotting) în care poziţia relativă a diferitelor

fragmente de ADN din gel se păstrează pe parcursul

transferului;

- hibridarea ADN cu sonda marcată prealabil, în regiunile în

care prezintă omologie;

42

- vizualizarea regiunilor hibridate cu ajutorul unui film

sensibil la radiaţii (autoradiografie) sau cu ajutorul unei reacţii

enzimatice, care dă o coloraţie specifică.

În tehnica RFLP pot fi utilizate diferite tipuri de sonde, care permit

evidenţierea unor tipuri diferite de polimorfism. Sondele mono- sau

oligogenice pun în evidenţă unul sau mai mulţi loci; ele dau un profil

simplu care include câteva benzi. Utilizarea acestui tip de sonde

permite vizualizarea polimorfismelor de secvenţă, localizate la

nivelul situsurilor de restricţie, precum şi a polimorfismelor de

inserţie/deleţie, situate între situsurile de restricţie. Acest tip de sondă a

fost utilizat pentru a alcătui hărţi genetice la om, pentru a identifica

unele varietăţi de măr şi pentru a pune la punct un test de

depistare a anemiei falciforme. Sondele poligenice sau multilocus

pot fi dirijate spre zonele care prezintă ariabilitate foarte mare, cum

sunt secvenţele de tip micro şi minisatelit, alcătuite de 2 până la 16

perechi de baze, repetate în tandem. Cu ajutorul sondelor

multilocus, se observă, în general un grad ridicat de polimorfism între

genotipurile înrudite. Acest tip de sondă a fost utilizat pentru prima dată

de Jeffreys şi colaboratorii in 1985 [33] la hibridarea cu ADN genomic

uman digerat şi amprentizarea genetică a fiecărui individ. Ulterior, au

fost descoperite alte secvenţe satelit şi la alte mamifere, la insecte

şi plante. Sondele multilocus permit evidenţierea polimorfismului

de secvenţă la nivelul situsurilor de restricţie, polimorfismului de

inserţie/deleţie precum şi polimorfismului determinat de numărul

unităţilor repetitive, pentru fiecare individ în parte [33].

43

b) Tehnica RFLP, bazată pe PCR, utilizează o enzimă de

restricţie pentru digerarea unui produs de amplificare, obţinut cu

primeri specifici, iar în gelul de agaroză se vor obţine benzi de

dimensiuni diferite, corespunzătoare celor trei genotipuri

(homozigoţi pe una din cele două alele şi heterozigoţi).

Markerii RFLP sunt markeri cu polimorfism limitat ce

identifică variaţiile secvenţei de ADN la nivelul unui situs de

restricţie, prin analiza RFLP. O sursă abundentă de markeri genetici,

utilizaţi în tehnicile de cartare a genomului animal au la bază

modificările unor secvenţe de ADN care se produc la nivelul situsurilor

de restricţie

De regulă aceste variaţii sunt cauzate de mutaţii punctiforme

(substituţia unei nucleotidecu o alta), inserţii sau deleţii, în

interiorul situsului de restricţie şi astfel, enzima de restricţie, nu

mai recunoaşte situsul respectiv şi nu mai taie. Aceasta va

determina obţinerea unor fragmente de restricţie de lungimi diferite

(polimorfice) care pot fi uşor vizualizate şi identificate în gelul de

agaroză datorită lungimii lor diferite. Din această cauză ele se vor

separa în gelul de electroforeză sub forma unor benzi situate în diferite

regiuni. Greutatea moleculară se apreciază cu ajutorul unui ADN

standard de etalonare - ladder. În practică, mărimea unui fragment ce se

detectează prin Southern blotting este de 300 pb – 15 kb cu

diferenţe detectabile mai mici de 50 pb.

44

Prin tehnica PCR se detectează produşi între 60 pb-2kb, cu

diferenţe chiar de câteva baze. Indivizii diferiţi genetic pentru un anumit

locus, vor prezenta fragmente de restricţie de lungimi diferite, într-un

număr diferit pentru un anumit cuplu format din sonda moleculară –

enzimă de restricţie. În acest context, fiecare sistem format din ADN

genomic – enzimă de restricţie, poate defini un locus polimorf care are

cel mult două alele diferite [38].

Cu ajutorul RFLP se pot identifica variaţiile genetice dintre indivizi

doar la nivelul situsurilor de recunoaştere a enzimelor de restricţie,

respectiv dintre indivizii care posedă unul din cele trei genotipuri

existente în locusul de interes (AA, Aa, aa) şi nu se pot detecta

variaţiile la nivelul întregului genom, care la mamifere este de ordinul

3x 109 pb.

2.2.2. Tehnica AFLP Tehnicile moleculare care permit obţinerea amprentelor

genetice şi vizualizarea polimorfismelor, a diferenţelor dintre

eşantioane la nivel de ADN, se bazează pe două principii: hibridare cu

sonde sau amplificare prin reacţia PCR. Polimorfismul bazat pe

numărul de repetiţii în tandem, a motivelor de tip satelit, este azi

cel mai utilizat în studiul diversităţii genetice a raselor de animale şi a

soiurilor de plante.

AFLP este o tehnică bazată pe punerea în evidenţă a polimorfismelor

tot la nivelul situsurilor de restricţie. Această tehnică a fost descrisă de

Vos şi colaboratorii în anul 1995 şi se bazează pe amplificarea

selectivă, cu ajutorul PCR, a unei categorii de fragmente obţinute

45

printr-o restricţie particulară, care utilizează 2 enzime de restricţie şi

adaptori, marele avantaj al metodei este acela că nu necesită

informaţii preliminare despre genom.

Tehnica AFLP se bazează pe amplificarea selectivă a fragmentelor

de restricţie, obţinute din ADN genomic total digerat şi ea parcurge trei

etape:

- restricţia ADN genomic şi legarea adaptorilor

oligonucleotidici;

- amplificarea selectivă a seturilor de fragmente de restricţie;

- analiza fragmentelor amplificate, în gel de poliacrilamidă.

Pentru prepararea unei matriţe AFLP, ADN genomic este izolat şi

digerat simultan cu 2 enzime de restricţie, de exemplu: EcoRI şi MseI.

EcoRI are un situs de recunoaştere de 6 pb (taie rar) iar, MseI are un

situs de recunoaştere de 4 pb (taie frecvent).

Fragmentele obţinute prin restricţie pot fi grupate în 3 clase:

- marea majoritate (90%) prezintă două situsuri MseI la

extremităţile lor;

- aproximativ 10% prezintă un situs EcoRI şi un situs MseI;

- câteva fragmente prezintă 2 situsuri EcoRI.

Procedeul AFLP se bazează pe detecţia predominantă a

fragmentelor EcoRI - MseI care au o extremitate tăiată cu o enzimă care

taie rar şi o extremitate tăiată de o enzimă care taie des. Succesul

tehnicii AFLP depinde de digestia completă a ADN genomic.

Pentru aceasta trebuie acordată o importanţă sporită izolării ADN de

înaltă calitate, intact şi fără contaminări cu nucleaze sau inhibitori [39].

46

Legarea adaptorilor, după inactivarea prin căldură a endonucleazelor de

restricţie, de tip Eco RI şi MseI, dublu catenari, se face la extremităţile

fragmentelor de ADN.

Structura adaptorilor este următoarea:

- secvenţă nouă, care va servi ca situs ţintă pentru ataşarea

primerilor PCR în etapa următoare a AFLP;

- o secvenţă care permite restaurarea situsului de restricţie;

Sunt utilizate două tipuri de adaptori: cei care restaurează situsul

EcoRI şi cei care restaurează situsul MseI. Primerii care sunt utilizaţi în

reacţia PCR nu se fixează pe ADN genomic, dar se vor fixa pe adaptori.

După digestia ADN genomic şi legarea adaptorilor, fragmentele de

restricţie vor fi amplificate prin PCR. În structura primerilor PCR vom

regăsi de o parte secvenţa adaptorilor şi un situs de restricţie (este acela

la nivelul căruia se vor fixa primerii PCR în următoarea reacţie PCR),

iar de cealaltă parte o nucleotidă selectivă, adăugată la extremitatea 3’ a

primerilor PCR.

Numărul nucleotidelor selective poate varia de la 0 la 3 pe primer.

Fixarea nucleotidelor specifice determină ca un singur subansamblu de

fragmente de restricţie să fie recunoscut şi amplificat. Condiţiile de

reacţie sunt alese de aşa natură ca singurele fragmente de ADN care

corespund perfect cu primerul să fie amplificate. Dacă se lucrează cu

genoame complexe, cum sunt cele de la plante sau animale, PCR-ul este

realizat în două etape consecutive. În prima reacţie, numită

preamplificare, ADN genomic este amplificat cu doi primeri AFLP,

având câte o singură nucleotidă selectivă şi produsul PCR al

47

preamplificării este diluat şi utilizat ca matriţă pentru a 2-a

amplificare selectivă, iar în al doilea PCR se vor utiliza primeri AFLP,

ce conţin câte trei nucleotide selective.

Această strategie, de amplificare în două etape, permite obţinerea

unei amprente genetice foarte clare, care poate fi analizată pentru

detectarea polimorfismelor şi între indivizii strâns înrudiţi. Unul din

marile avantaje ale tehnicii AFLP este permisivitatea modulării

numărului de profiluri genetice. Este posibilă creşterea sau

reducerea complexităţii profilului, adaptând diferiţi parametrii, iar

factorul cel mai important pentru determinarea numărului de

fragmente, amplificate într-o reacţie simplă AFLP, este numărul de

nucleotide selective din primerii selectivi. Numărul de fragmente

detectate în gel, pentru o amprentă genetică, scade când numărul

nucleotidelor selective creşte.

Alegerea numărului de nucleotide selective este strâns legată de

mărimea genomului, cu cât mărimea genomului este mai redusă cu

atât numărul fragmentelor amplificate este mai restrâns şi amprenta

genetică mai simplă. Pentru organismele cu genoame mari (5x108-

5x109pb) se utilizează primeri selectivi cu câte trei nucleotide, astfel

încât să se amplifice în medie 50 fragmente pe probă şi pe perechea de

primeri selectivi, acest număr poate varia însă între 10 şi 100, în funcţie

de secvenţa nucleotidică şi complexitatea genomului. Al doilea factor,

ce determină numărul de fragmente amplificate, este compoziţia în baze

G şi C a nucleotidelor selective din primeri. În general, se amplifică mai

puţine fragmente când nucleotidele selective sunt G şi C.

48

Tehnicile amprentelor genetice sunt multiple, fiecare are

caracteristici particulare de specificitate de locus, nivel de polimorfism,

tehnicitate. Alegerea unei metode trebuie întotdeauna să fie luată în

considerare în funcţie de obiectivul cercetării:

- pentru studii de diversitate ca şi pentru măsurarea

variaţiilor inter sau intrapopulaţionale, distanţei genetice,

pentru clasificarea în sistematică a populaţiilor distincte genetic.

- pentru clonarea poziţională ca şi pentru obţinerea unei

densităţi mari de markeri moleculari, într-o regiune

precisă din genom (hipervariabilă), din vecinătatea unei gene

care urmează să fie clonată;

- pentru stabilirea hărţilor genetice la speciile puţin studiate

sau acolo unde sondele şi primerii PCR nu au fost încă

dezvoltaţi.

Marele avantaj al tehnicii AFLP este sensibilitatea în detectarea

polimorfismului la nivelul genomului total. Cu toate acestea, tehnica

AFLP a devenit un standard molecular pentru clasificarea în sistematică

a populaţiilor distincte genetic. Polimorfismele identificate în ADN sunt

transmise mendelian şi utilizate apoi pentru genotipizare,

identificarea markerilor moleculari şi cartografierea genelor [2].

2.2.3. Tehnicile MAAP Din categoria tehnicilor MAAP (Multiple Arbitrary Amplicon

Profiling) face parte tehnica RAPD (Random Amplified Polymorphic

49

DNA), alături de tehnicile DAF (Amplification Fingerprinting ) şi AP-

PCR (Arbitrary Primed PCR).

2.2.3.1. Tehnica RAPD Tehnica RAPD se bazează pe determinarea polimorfismului la

nivel alelic în ceea ce priveşte producerea unor produşi de amplificare

sau lipsa lor, în urma utilizării unui primer oligonucleotidic, arbitrar,

într-o poziţie care să-i permită realizarea amplificării.

Această variantă a tehnicii PCR nu necesită clonarea sau

secvenţierea ADN şi poate detecta mai mulţi loci simultan.

Principiul tehnicii este simplu: ADN izolat de la un individ este

supus unei reacţii PCR utilizând primeri oligonucleotidici, de

secvenţă arbitrară, care vor hibrida la secvenţele sale

complementare, în cazul în care acestea există. Dacă din întâmplare, doi

primeri consecutivi, aflaţi în vecinătate, se ataşează la matriţă în sensuri

opuse, fiecare pe una din cele două catene, la o distanţă nu prea mare

unul de celălalt, fragmentul delimitat de ele va fi amplificat, iar dacă

unul din cele două situsuri este absent la unul din indivizi, la acesta

amplificarea nu va avea loc, evidenţiindu-se un polimorfism de

prezenţă/absenţă. Secvenţele de primeri scurţi, împerecheaţi aleator (8 –

12 perechi de baze) sunt folosiţi la amplificarea ADN de tip RAPD, de

obicei rezultând un polimorfism de prezenţă/absenţă, în gel. O astfel de

situaţie, care permite amplificarea randomizat, în mai multe puncte,

poate fi realizată la nivelul întregului genom.

50

Deoarece RAPD este o tehnică bazată pe PCR, vom prezenta

câteva din particularităţile definitorii ale acesteia. Modificarea unei

singure baze în genom este suficientă pentru a împiedica ataşarea

primerului în acel loc şi a împiedica amplificarea fragmentului delimitat

de acel primer. Analiza RAPD poate detecta modificarea unei singure

baze în ADN genomic, în anumite condiţii [39].

Polimorfismul detectat de RAPD poate rezulta din câteva tipuri de

modificări:

- inserţia unei secvenţe mari de ADN, între secvenţele de

ataşare a primerilor, care fac fragmentul delimitat de aceste

secvenţe prea mare pentru a fi amplificat;

- deleţia unui fragment de ADN ce conţine unul din situsurile de

ataşare a primerilor duce de asemenea la lipsa amplificării

segmentului;

- substituţia unui nucleotid poate afecta hibridarea

primerului la un anumit situs de ataşare, putând evidenţia

sau nu un polimorfism (dispariţia unei benzi);

- inserţia sau deleţia unui mic fragment de ADN poate duce la

modificarea mărimii unui fragment amplificat şi a poziţiei

benzii în gel.

Modificările de mărime se observă rar, dar cel mai adesea

polimorfismul se manifestă prin aceea că un fragment amplificat poate

fi prezent sau absent. Polimorfismul detectat prin RAPD este folosit ca

şi marker molecular. Markerii RAPD se comportă ca markeri dominanţi

51

când sunt urmăriţi în descendenţă. Acest comportament rezultă din

faptul că un fragment amplificat este prezent în gel (ca o alelă

dominantă A) sau absent (ca alelă recesivă a). În analiza

descendenţilor, un fragment este observat în stare homozigotă

(analog cu AA), fiind amplificat atât ADN de la un părinte, cât şi de la

celălalt, sau în stare heterozigotă (analog cu Aa), când este amplificat

numai ADN provenit de la unul din părinţi, celălalt prezentând un

polimorfism reperezentat prin absenţa fragmentului.

În stare heterozigotă, absenţa fragmentului de la unul din

părinţi este mascată de prezenţa benzii datorată fragmentului

amplificat de la celălalt părinte. Prin urmare, analiza RAPD nu

poate discerne între starea homozigotă (AA) şi cea heterozigotă (Aa).

În cazul markerilor codominanţi însă (în care fiecare părinte

posedă o bandă distinctă, pe care celălalt nu o posedă), starea

heterozigotă (AB) în descendenţă (prezenţa ambelor benzi în hibridul

din F1) poate fi deosebită de stările homozigote (AA) şi (BB). In anii

`90 s-a arătat că 95% din fragmentele RAPD se comportă ca markeri

dominanţi (un singur fragment amplificat distinctiv la unul sau ambii

părinţi şi descendenţi) şi sub 5% se comportă ca markeri codominanţi.

Calculul numărului de fragmente care poate fi aşteptat teoretic la

folosirea unui primer care hibridează 100% cu matriţa, poate fi

calculat din lungimea primerului şi din complexitatea genomului

ţintă, presupunând că nucleotidele sunt prezente în proporţii egale.

Produşii de amplificare se separă prin electroforeză în gel de agaroză

şi se evidenţiază după colorare în bromură de etidiu .

52

2.2.3.2. Tehnica DAF In 1991, Caetano-Anolles şi colaboratorii [13], au introdus o

metodă numită DNA Amplification Fingerprinting (DAF). Ei au

folosit primeri scurţi, cel mai adesea de lungime între 5 – 8

nucleotide. De asemenea, ei au modificat anumiţi parametrii PCR,

folosind paşi atât de joasă cât şi de înaltă stringenţă, precum şi un

program al ciclurilor cu numai două temperaturi în loc de standardul

cu trei. Produşii de amplificare au fost separaţi prin electroforeză în

gel de poliacrilamidă şi vizualizaţi prin colorare cu argint. Nivelul

complexităţii profilului benzilor poate fi predeterminat prin

manipularea condiţiilor de reacţie. Ca urmare a apariţiei mai

multor variante de amprentare a întregului genom, bazate pe PCR

cu primeri arbitrari, Caetano-Anolles şi colab., au propus în

(1994), denumirea acestor metode înrudite cu numele generic de

Multiple Arbitrary Amplicon Profiling (MAAP) [13].

Totuşi, datorită simplităţii şi utilităţii, numele şi metoda

originală RAPD, cunoaşte cea mai largă răspândire. Această tehnică

permite amplificarea unui număr mai mare de fragmente de dimensiuni

foarte mici, care ulterior vor fi separate într-un gel de poliacrilamidă.

2.2.3.3. Tehnica AP – PCR Lungimea primerului utilizat, este un criteriu principal de

distincţie între cele trei tehnici descrise anterior; astfel că pentru

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) sunt primerii

decameri (9-10 pb), pentru DAF (DNA Amplification Fingerprint)

53

primerii au 5-15 pb, iar pentru AP-PCR (Arbitrary Primed PCR)

primerii au lungimea de18-32 pb. Tehnicile AP-PCR şi DAF pot releva

numeroase benzi (până la 100) în timp ce RAPD-ul produce un număr

mic de benzi, până la zece [56] .

Avantajele tehnicilor Multiple Arbitrary Amplicon Profiling

(MAAP) rezidă din: simplitate, rapiditate, costuri scăzute, şi faptul că

nu necesită cunoştinţe anterioare despre genom, nu necesită digestie

sau transfer pe o membrană, marcare radioactivă sau fluorescentă,

cu ajutorul lor fiind generaţi markeri moleculari utilizând markerii

deja disponibili [52] . Tehnica RAPD fiind rapidă, poate fi utilizată în

hibridări interspecifice, introgresia genelor, identificarea clonelor,

descoperirea markerilor sex-linkaţi, măsurarea distanţelor genetice la

plante, animale şi om.

Dezavantajele tehnicii constau în reproductibilitatea scăzută,

iar schimbările de scurtă durată a condiţiilor de reacţie pot cauza

benzi nereproductibile. O singură procedură cuprinde trei etape

importante. Tehnica AP-PCR utilizează primeri de 18 pb şi a fost

dezvoltată şi utilizată ca metodă reprezentativă [32].

2.2.4. Tehnica RT – PCR Această tehnică este tot o variantă a tehnicii PCR, în care

amplificarea porneşte de la ARN mesager (ARNm). În prezenţa

enzimei revers transcriptaza, ARNm devine matriţă pentru sinteza

ADN complementar (ADNc), după care procesul de amplificare

decurge în mod normal. Cuantificarea expresiei genice se bazează pe

54

presupunerea că se păstrează o anumită proporţionalitate între cantitatea

de ADN de la începutul reacţiei şi cantitatea produsului de amplificare

[56].

Trebuie subliniat faptul că aplicarea reacţiei PCR la moleculele de

ARN necesită o modificarea a reacţiei PCR în prima etapă. Pentru

că molecula de ARN nu poate fi copiată în prezenţa Taq

polimerazei, această etapă este catalizată de revers transcriptază, enzimă

în prezenţa căreia este sintetizată molecula de ADN de pe matriţa de

ARN. Copia de ADN este apoi amplificată în prezenţa Taq

polimerazei.

Descoperirea enzimelor termostabile (ex. ADN-polimeraza -

obţinută din bacteria Thermus thermophilus) cu ajutorul cărora pot fi

obţinute copii termostabile de ADN atât de pe matriţe de ADN cât şi de

pe matriţe de ARN face posibilă aplicarea RT – PCR în

condiţiile în care va fi necesară o singură reacţie în prezenţa unei

singure enzime [11]. Această tehnică oferă o informaţie mai detaliată

referitoare la detectarea cu sensibilitate ridicată a unor gene exprimate

în cantităţi reduse, într-o anumită celulă.

2.2.5. Tehnica microsateliţilor - SSR La organismele procariote şi eucariote o parte din ADN genomic

este reprezentat de secvenţe de ADN înalt repetitive, de

complexitate mică şi considerate noninformaţionale. Microsateliţii

sau SSR (Simple Sequence Repeats) sunt secvenţe înalt repetate,

care conţin motive de 2 – 5 perechi de baze, repetate în tandem şi care

55

flanchează o secvenţă unică de ADN. Se pare că aceştia sunt

rezultatul crossing-overului inegal. Tehnica PCR este aceea care va

fi utilizată pentru relevarea profilurilor individuale, furnizând

markeri specifici de locus ce se transmit codominant.

Un microsatelit nu este specific la un locus particular, dar

regiunile flancatoare sunt specifice [19]. Aceşti markeri bazaţi pe PCR

necesită investiţii considerabile pentru a putea fi generaţi, dar sunt

înalt polimorfici pentru folosirea lor în aplicaţiile MAS (selecţia

asistată de markeri moleculari). Polimorfismul este determinat de

diferenţele existente în lungimea produşilor de amplificare. Acest

polimorfism va duce la evidenţierea mai multor alele la acest locus.

Fiind o regiune înalt polimorfică se pot distinge foarte multe

alele, dar care pot determina diferenţele chiar şi între indivizi înrudiţi.

Motivele repetate în tandem pot fi utilizate şi ca sonde, dirijate către

ADN genomic, unde să-şi găsească regiunile complementare.

2.2.6. Tehnica EST Această reacţie bazată pe PCR necesită atât clonare cât şi

informaţii despre secvenţă, utilizând informaţiile proiectului de

secvenţiere a genelor, când sunt generate clone de ADNc. Această

secvenţă este folosită pentru designul unor primeri de 18 – 20 pb cu

care se vor amplifica secvenţe învecinate.

Markerul EST este de obicei detectat după mărime în produsul

de amplificare şi este un marker codominant. Crearea acestor primeri se

realizează cu costuri foarte mari, dar aceştia sunt foarte utili prin

56

diversele aplicaţii în cartare, descoperirea genelor asociate cu locii

caracterelor cantitative - QTL (Quantitative Traits Loci) şi ar trebui

să contribuie considerabil la înţelegerea mecanismelor la aceşti loci

[11].

2.2.7. Tehnica SCAR În cadrul acestei tehnici, fragmentele de ADN amplificate

prin tehnica PCR-RAPD, sunt clonate şi pe baza lor se construiesc

primeri specifici care vor avea lungime mai mare decât primerii RAPD.

Prin utilizarea primerilor SCAR în PCR, nu se rezolvă problema

reproductibilităţii reduse, deseori întâmpinată de markerii RAPD.

Obţinerea unui marker codominant poate deveni un avantaj în plus,

în convertirea markerilor RAPD în markeri SCAR [11].

Totuşi, markerii SCAR pot manifesta dominanţă completă când

unul sau ambii primeri coincid parţial cu variaţia din secvenţa unui

anumit locus. Markerii SCAR dominanţi pot fi făcuţi deseori

codominanţi, prin digestia produsului PCR cu diferite enzime de

restricţie.

2.2.8. Tehnica SNP Această tehnică se caracterizează prin detectarea mutaţiilor

punctiforme la un locus particular, mutaţii determinate de substituţia

unei singure nucleotide cu alta. Prin această tehnică pot fi evidenţiate

diferenţele de secvenţă existente între alele, cum ar fi substituţia A în T

57

de exemplu AAGGCTAA în ATGGCTAA [23]. Pentru ca o variaţie de

secvenţă să fie considerată SNP ea trebuie să apară cu o frecvenţă de

până în 1% în populaţie, ceea ce în populaţia umană va detemina mai

mult de 90% din întreaga variaţie genetică [23].

Aceasta înseamnă apariţia mutaţiei la fiecare 100 până la 300

perechi de baze din totalul de 3 miliarde. Două din trei polimorfisme

SNP sunt determinate de înlocuirea citozinei cu timina, ce apar

atât în regiunile codificatoare cât şi necodificatoare, polimorfisme de

tip citozină – timină au fost descrise şi de Schenkel F.S. şi colaboratorii

în anul 2005 [63].

2.2.9. Tehnica STS Această tehnică bazată pe PCR, detectează o secvenţă unică într-

un punct definit din genom. Pe baza acestei tehnici pot fi convertiţi

markerii genetici RAPD în markeri STS, pentru acelaşi locus. Tehnica

nu necesită clonare dacă există informaţii anterioare despre secvenţă,

pentru definirea primerilor. Designul primerilor de 18 – 20 pb, poate fi

conceput după secvenţa fragmentelor RAPD excizate din gel, pentru a

amplifica ulterior fragmente de ADN unice (de exemplu poate fi

secvenţa unui produs PCR - RAPD sau a sondelor RFLP).

Polimorfismul este în general detectat ca o diferenţă de mărime

în produsul de amplificare STS faţă de produsul RAPD, de la

acelaşi locus. Dacă nu există nici o diferenţă de mărime, se

apelează la restricţia enzimatică pentru a tăia produşii de

amplificare şi pentru identificarea polimorfismului lor. Poate fi

58

astfel detectat un polimorfism de câteva nucleotide. Din moment

ce primerii STS sunt mai lungi decât primerii RAPD şi bazaţi pe

o secvenţă specifică, această metodă detectează polimorfismul de la

acelaşi locus, fiind potrivită pentru studii de cartare genică.

Dezavantajul metodei este că proiectarea şi crearea primerilor poate

implica o investiţie importantă [11].

2.2.10. Tehnica ARMS –PCR O modificare a metodei PCR, care permite detecţia

mutaţiilor punctiforme cunoscute, prin amplificare cu primeri

specifici de alelă, este metoda ARMS-PCR. Aceasta este o metodă

care nu implică utilizarea izotopilor radioactivi, iar genotipizarea este

posibilă prin simpla examinare a migrării produsului PCR prin

elecroforeză în gel de agaroză. Tehnica este cunoscută ca detectarea

mutaţiilor prin amplificare refractară, descrisă pentru prima dată de

Newton C.R. şi colab., 1989. Metoda constă în utilizarea a doi

primeri care prezintă aceeaşi secvenţă de nucleotide cu excepţia

nucleotidei terminale 3’ – unul complementar cu alela normală, iar

celălat cu alela mutantă.

Pentru amplificarea enzimatică se foloseşte Taq-polimeraza,

enzimă care nu are activitate exonucleazică 3’-5’, ceea ce implică

necesitatea unei perfecte complementarităţi a primerului cu capatul

3’ al matriţei ADN. Rezultatul se obţine în urma electroforezei în gel

de agaroză prin prezenţa sau absenţa produsului de amplificare

respectiv.

59

Specificitatea este obţinută dacă primerul oligonucleotidic este

complementar cu secvenţa alelei dorite, dar nu este complementar cu

cealaltă alelă la capătul 3’, sau în imediata vecinătate a capătului 3'

al primerului specific de alelă. Neamplificarea este rezultatul

nepotrivirii dintre ADN matriţă şi oligonucleotidul din primer. Pentru

că Taq-polimeraza nu are activitate exonucleoazică în direcţia 3'-5',

această nepotrivire împiedică eficient elongarea la capatul 3' cu

ajutorul Taq polimerazei. Metoda este aplicabilă, în general, în

detecţia mutaţiilor punctiforme cunoscute, mici deleţii şi inserţii,

polimorfisme şi alte variaţii în secvenţa ADN.

De aceea, o mutaţie (sau un polimorfism) poate fi detectată prin

utilizarea unui construct oligonucleotidic adecvat, care permite o

elongare eficientă, în cazul unui cromozom mutant şi o elongare

ineficientă, în cazul unui cromozom normal [11].

2.3. TEHNICA SSCP Această tehnică este utilă în detectarea polimorfismului

determinat de cel puţin o nucleotidă. Evidenţierea polimorfismului se

face în timpul electroforezei în gel de poliacrilamidă. Acest

polimorfism se bazează pe diferenţele de conformaţie ale unei

singure catene (mutantă) ce diferă de cealaltă într-un singur punct,

datorită unei substituţii, deleţii sau inserţii [6]. În anumite condiţii,

acizii nucleici dintr-o catenă de ADN formează în soluţie o

structură secundară. Structura secundară depinde de compoziţia în

baze, structură care poate fi alterată şi de substituţia unei singure

60

nucleotide. Această diferenţă va determina o mobilitate

electroforetică diferită în condiţiile unui gel nedenaturat (gel de

poliacrilamidă nedenaturat). Vizualizarea fragmentelor ce urmează a fi

detectate se face după o prealabilă colorare cu argint sau după marcarea

radioactivă [1].

2.4. TEHNICI BAZATE PE SECVENŢIERE Prima secvenţă descifrată a fost ARNt-ul purtator de alanina

publicată de către Robert Holley şi colegii săi de la Universitatea

Cornell in 1964 [26]. Aceştia au utilizat enzime specifice care au rupt

molecula de ARNt în segmente mici până când s-a reuşit secvenţierea

directă prin metode de degradare enzimatică. Abia în 1976 a fost

descifrată secvenţa completă a ARN monocatenar de la fagul MS2,

de către Walter Fiers în laboratorul său din Ghent. S-a stabilit atunci

structura completă a genomului viral şi organizarea acestuia,

corespondenţa dintre codoni şi cele trei proteine codificate de genele

fagului MS2 şi că un codon stop cauzează terminarea transcripţiei

[58].

Secvenţierea ADN poate fi făcută prin procedee chimice

- metoda Maxam şi Gilbert sau cu ajutorul terminatorilor de lanţ

- metoda dideoxi sau Sanger, aceasta din urma fiind astăzi utilizată mai

mult. Prima metodă a fost pusă la punct de către Maxam si Gilbert ȋn

1977 şi este de fapt o clivare chimică [40]. Cea de-a doua, metoda

dideoxi sau Sanger, a fost pusă la punct în acelaşi an de către Sanger şi

61

se bazează pe întreruperea controlată a sintezei enzimatice a ADN,

amplificat prin PCR [62].

În ambele cazuri, fragmentele obţinute sunt supuse marcării

radioactive (cu 32P, de exemplu) înaintea separării pe baza greutăţii

moleculare într-un gel de poliacrilamidă. Vizualizarea şi analizarea

produşilor rezultaţi se face prin autoradiografie.

O metodă mult mai convenabilă şi mai precisă este marcarea

fluorescentă a fragmentelor şi secvenţierea automată. Fragmentele de

ADN sunt migrate într-un gel de poliacrilamidă iar aparatul

(secvenţiatorul), prevăzut cu un fascicul laser, excită fiecare

moleculă marcată fluorescent şi transformă valorile fluorescente în

secvenţa în nucleotidice a fragmentului analizat. Un astfel de aparat

(ALFexpress Auto Read) poate detecta 200 pb pe oră. Fiecărei secvenţe

de acizi nucleici îi corespunde o diagramă a succesiunii de baze

numită electroforegramă. În această diagramă fiecărei baze îi

corespunde un vârf şi o coloraţie caracteristică.

O altă tehnică este secvenţierea automată, în cazul căreia, catena

de ADN care va intra în reacţia de secvenţiere depinde de primerul

utilizat, putând fi supusă secvenţierii atât catena sens cât şi cea

antisens. În studiile de secvenţiere a genelor, pentru precizia

rezultatelor obţinute sau atunci când sunt căutate mutaţii

punctiforme, se recomandă secvenţierea ambelor catene şi

compararea rezultatelor obţinute. În acest caz, este necesară

cunoaşterea ambilor primeri, care să iniţieze sinteza genei ce urmează

să fie descifrată.

62

În cazul în care se doreşte descifrarea structurii unui fragment

de ADN, sau a unei gene, de la specii a căror genom nu este saturat în

hărţi genetice, pentru amplificare se utilizează primeri universali, cum

este cel de la fagul M13 [72]. Pentru fragmente de dimensiuni diferite

se aleg vectori corespunzători pentru clonare, de exemplu: plasmide

(0,1-10 kb), fagi (8-20 kb), cosmide (35-50 kb), BAC (cromozom

artificial bacterian 75-300 kb) şi YAC (cromozom artificial de drojdie

100-1000 kb) la care genomul este complet descifrat şi sunt întocmite

hărţile de restricţie.

Etapele secvenţierii:

1. Izolarea ADN genomic sau a fragmentului (genei) de interes ce

urmează să fi clonat sau secvenţiat;

2. Purificarea ADN izolat;

3. Amplificarea prin PCR a fragmentului de analizat cu ajutorul

primerilor specifici sau a primerilor universali, în prezenţa celor

patru dNTP marcaţi florescent, fiecare cu altă culoare - (adenina în

verde, timina în roşu, guanina în negru şi citozina în albastru) şi a

polimerazei ;

4. Vizualizarea produşilor de amplificare prin migrarea în gel de

agaroză (procedeu care face posibilă atât identificarea produşilor

de amplificare, determinarea lungimii fragmentelor amplificate şi a

calităţii produsului de amplificare;

5. Purificarea produşilor de amplificare; pentru ca produşii de

amplificare să poată fi utilizaţi în reacţii de secvenţiere trebuie să

63

aibă un grad înalt de puritate (evitându-se contaminarea cu inhibitori

şi prezenţa rezultatelor eronate) ;

6. Secvenţierea automată;

7. Citirea secvenţelor pe catena analizată;

8. Alinierea secvenţelor de pe cele două catene sens şi antisens;

Reacţia de secvenţiere începe întotdeauna după ce ADN supus

secvenţierii a fost iniţial amplificat prin PCR, purificat şi cuantificat

[2].

64

CAPITOLUL 3.

Aplicaţii ale tehnicilor de biologie moleculară în studii interdisciplinare

3.1. Clonarea genelor pentru aminoacid dehidrogenaze Genele ce codifică leucin dehidrogenaza de la Bacillus

sterothermophilus, alanin dehidrogenaza de la Bacillus subtilis, glucoz

dehidrogenaza de la Bacillus subtilis şi aspartaza de la Escherichia coli

au fost amplificate prin metoda PCR utilizând amorse specifice. În

secvenţa amorselor au fost incluse situsurile pentru enzime de restricţie

necesare inserării genei în vectorul de exprimare. Pentru clonarea

genelor ce codifică leucin dehidrogenaza, alanin dehidrogenaza şi

aspartaza s-a utilizat vectorul de exprimare pET21b (Novagen). Acest

vector oferă posibilitatea exprimării genelor la inducere cu IPTG.

Produşii PCR au fost purificaţi din gel şi digeraţi cu enzimele de

restricţie corespunzătoare (Tabel 3.1). Vectorii de exprimare au fost

digeraţi cu aceleaşi enzime de restricţie. Produşii de digestie (produşii

PCR şi vectorii) au fost separaţi cu ajutorul electroforezei în gel de

agaroză.

65

Tabelul 3.1. Amorsele utilizate pentru amplificarea prin PCR a

genelor.

Enzima Amorsele utilizate Organism sursă Enzime

de

restricţie

Vector

utilizat

AlaDH

Q08352

5΄-GAGGGATCCGATGAT

CATAGGGGTTCCTAAAG-3΄

5΄-GGTCTCGAGTATAGCA

CCCGCCACAGATGATT-3΄

Bacillus subtilis BamHI

XhoI

pET21b

LeuDH

P13154

5΄-GGTGGATCCGATGGAA

TTGTTCAAATATATGG-3’

5΄-TATTCTCGAGTATTGC

CGAAGCACCTGC-3΄

Bacillus

stearothermo -

philus

BamHI

XhoI

pET21b

ALL

P0AC38

5' –GGTAGGATCCGATGTCA

AACAACATTCGTATCG– 3'

5' –GCTACTCGAGTTACTGT

TCGCTTTCATCAGTA– 3'

Escherichia coli NdeI

BamHI

pET21b

GalM

GalM

P0A9C3

5'-GGAATTCCATATGCTGA

ACGAAACTCCCGCAC-3'

5'-CGCGGATCCTCACTCAG

CAATAAACTGATATTCCG-3'

Escherichia coli NdeI

BamHI

pET24a

GlucDH

P12310

5΄-GGAATTCCATATGTATC

CGGATTTAAAAGGAAAAG-3΄

5΄-CGCGGATCCTCAAC

CGCGGCCTGCCTGG-3

Bacillus subtilis NdeI

BamHI

pET24a

Fragmentele ADN au fost purificate din gelul de agaroză. Pentru inserea

genelor în vectori s-a utilizat ADN ligaza, care are proprietatea de a

66

reface legăturile fosfoesterice. Moleculele recombinate rezultate după

ligare (vector + gena) au fost introduse prin transformare în tulpina de

Escherchia coli DH5α. Secvenţele genelor clonate au fost verificate

prin secvenţializare cu un aparat ABI Prism 310 Genetic Analyzer

utilizând kitul de secvenţializare BigDye Terminator v3.1 (Applied

Biosystems).

3.2. Producerea de proteine recombinate Pentru exprimarea genelor, moleculele corect recombinate au

fost introduse prin transformare în tulpina de Escherichia coli

BL21(DE3). Pentru obţinerea de proteine recombinate s-au realizat

culturi mai mari (0,5-1L). După ce densitatea optică (DO) la 600 nm a

atins valorile de ~1, s-a indus exprimarea genelor cu izopropil-β D-

tiogalactopiranozid (IPTG) 1 mM [2]. După câteva ore de la inducere

(3-5 ore) bacteriile au fost centrifugate şi păstrate la -80°C până la

utilizare. Sintezele enzimatice au fost realizate cu extracte celulare

bacteriene. O purificare a proteinelor recombinate ar implica costuri şi

timp suplimentar, iar orice proces biotehnologic este cu atât mai valoros

cu cât implică mai puţine costuri. Celulele bacteriene au fost preluate în

tampon Tris HCl pH=8,0 50 mM. Pereţii celulelor bacteriene au fost

distruse prin sonicare. După sonicare extractul bacterian a fost

centrifugat (20 min la 21 000×g la 4°C), iar supernatantul cu proteinele

solubile a fost utilizat pentru măsurarea activităţii enzimatice. Analiza

exprimării genelor şi sintezei de proteine recombinate în celulele de E.

coli a fost urmărită cu ajutorul electroforezei în gel de poliacrilamidă în

condiţii denaturante în prezenţă de SDS (Figura 3.1).

67

΄

Figura 3.1. Sinteza de proteine recombinate în celulele gazdă de E. coli. Cu cifre sunt indicate masele moleculare ale proteinelor din markerul molecular, preum şi masele moleculare ale proteinelor recombinate. Se poate observa cantitatea mare de proteine recombinate raportată la cantitatea de proteine totale din celulele bacteriene [2].

3.3. Măsurarea activităţii enzimatice a enzimelor Măsurătorile de activitate enzimatică a dehidrogenazelor s-au

efectuat la 30ºC cu un spectrofotometru urmărindu-se scăderea

absorbanţei NADH (reacţia de aminare a cetoacizilor) sau formarea

acestuia (reacţia de dezaminare a aminoacizilor) la 340nm. La această

lungime de undă NADH prezintă maximul de absorbanţă şi are un

coeficient molar de extincţie de 6,22 ·103 ·M-1 ·cm-1. Activitatea

enzimatică s-a calculat după formula:

A=[(DO/min)/6,22]*(Vr/Vp) *FD *103 U/l DO/min – variaţia densităţii optice pe minut la 340 nm

Vr – volumul reacţiei

Vp – volumul probei

FD – factorul de diluţie

O unitate enzimatică (1U) corespunde formării unui µmol de

produs într-un minut. Mediile de reacţie pentru enzime au fost

următoarele:

Ala DH LeuDH AAL

68

a) LeuDH (leucin dehidrogenaza): cetoacid 10 mM, NADH

0,15 mM, NH4Cl 1 M, Tris HCl 50 mM pH 8,0 în reacţia de aminare;

L-leucină 10 mM, NAD 2 mM, glicocol 50 mM pH 10,5 în reacţia de

dezaminare

b) AlaDH (alanin dehidrogenaza): piruvat 10 mM, NADH 0,15

mM, NH4Cl 1 M, Tris HCl 50 mM pH 8,0 în reacţia de aminare; L-

alanină 10 mM, NAD 2 mM, glicocol 50 mM pH 10,5 în reacţia de

dezaminare

c) GDH (glucozo dehidrogenaza): glucoză 10 mM, NAD 2 mM,

Tris HCl 50 mM pH 8,0

d) GalM (galacto mutarotaza): glucoză 10 mM, NAD 2 mM,

Tris HCl 50 mM pH 8,0, GDH 1 U

e) LDH (lactat dehidrogenaza): piruvat 1 mM, NADH 0,15 mM,

Tris HCl 50 mM pH 8,0

f) AAL (aspartat amoniuliaza): acid L-aspartic 100 mM, Tris

HCl 50 mM pH8,5, MgCl2 6 mM Pentru măsurarea activităţii

enzimatice a aspartzei s-a urmărit formarea acidului fumaric la 240 nm,

care are un coeficient molar de extincţie la aceasă lungime de undă egal

cu 2,54 ·103 ·M-1 ·cm-1.

Pentru măsurarea activităţii enzimatice s-au folosit câţiva µl de

enzimă purificată sau extract brut bacterian, astfel încât valorile

DO/min să fie cuprinse între 0,05 şi 0,3. S-a ales porţiunea dreptei cu

activitatea cea mai mare.

69

3.4. Sinteza de aminoacizi marcaţi cu 15N Mediul de reacţie pentru sintezele de aminoacizi marcaţi cu 15N

a conţinut:

• cetoacid 100 mM

• 15NH4Cl 100 mM

• NADH 1 mM

• glucoză 670 mM

Amestecul de sinteză a fost ajustat la pH 8,0 cu NaOH. Reacţia

s-a declanşat prin adăugarea enzimelor. Sintezele de aminoacizi marcaţi

au fost efectuate la 30ºC cu urmărirea pH-lui şi agitare. Pe parcursul

sintezei s-a urmărit consumul de NH4Cl prin metoda Berthelot. Această

metodă constă în formarea unui compus de culoare, la interacţiunea

ionului de amoniu, a fenolnitroprusiatului şi a cloraminei. Probele s-au

preparat după următoarea procedură: 10 µl de probă diluată de 20 ori,

200 µl de fenolnitroprusiat, 200 µl de hipoclorit de sodiu şi 590 µl apă.

Developarea culorii s-a făcut prin incubarea probelor timp de 2-3 min la

100ºC. S-a măsurat absorbanţa la 623 nm. Înainte de declanşarea

sintezelor s-a preluat o probă care a servit la alcătuirea unei curbe

etalon. Ca martor a servit amestecul de sinteză fără clorură de amoniu

(din care cauză se adăuga la sfârşit). În Figura 3.2 este prezentată curba

etalon de la sinteza de [15N]-L-metionină. Pe baza curbelor etalon s-a

calculat cantitatea de ion de amoniu rămas în mediul de sinteză.

Sintezele au fost oprite prin denaturarea termică a enzimelor, timp de 15

min la 85ºC.

70

Figura 3.2. Curba etalon de la sinteza [15N] L-Metionină [2].

3.5. Purificarea aminoacizilor sintetizaţi Aminoacizii sintetizaţi au fost purificaţi pe o coloană cu răşină

schimbătoare de ioni Dowex 50W x 8, în forma H+. Activarea

umpluturii s-a făcut prin tratare cu HCl2N, după care s-a spălat până la

un pH neutru. Amestecul de sinteză filtrat s-a încărcat pe coloană şi

apoi s-a spălat cu apă (10 volume). Aminoacidul s-a eluat cu NH4OH

1M. Controlul eluării s-a făcut cu ninhidrină pentru aminoacizi.

Fracţiunea cu aminoacid s-a concentrat pe baia de apă, după care s-a

precipitat cu etanol absolut. Precipitarea s-a lăsat peste noapte, iar

precipitatul obţinut s-a filtrat şi uscat. În continuare, aminoacizii astfel

obţinuţi au fost supuşi determinării structurii, purităţii şi concentraţiei

izotopice.

71

3.6. Analiza aminoacizilor sintetizaţi prin spectrometrie de masă Pentru analiza calitativă prin metoda spectrometriei de masă a

aminoacizilor este necesară o derivatizare a produsului de reacţie.

Derivatizarea, care trebuie facută la ambele funcţiuni polare ale

moleculei de aminoacid, la carboxil şi amină, s-a facut prin sililare,

utilizând metoda Das Neves şi Vasconcelos, care introduce la fiecare

funcţiune polară din moleculă câte o grupare terţ-butil-dimetilsilil

(TBDMS). Acest tip de derivatizare are avantajul că, datorită

substituentului terţ-butil voluminos, la amină se introduce o singură

grupare silil, şi nu una sau două în mod statistic, cum se întâmplă în

cazul derivatizării cu grupări trimetilsilil. Derivatizarea s-a făcut

utilizând ca reactiv N-metil-N-(terţ-butil-dimetilsilil) triflouroacetamida

(MTBSTFA) în calitate de donor al grupării silil, reactivul având şi un

conţinut de 1% terţ-butil-dimetil-clorsilan, în calitate de catalizator.

Derivatizarea s-a făcut pe cantitaţi de probă de ordinul 0.5-1 mg de

probă, cu 150 µl de acetonitril ca solvent şi 50 µl reactiv MTBSTFA, la

120ºC timp de 20 minute.

Separarea gaz-cromatografică a produşilor de sinteză sub formă

de TBDMS-derivaţi s-a făcut pe o coloană capilară cu fază staţionară

DB5 de 30 m lungime, cu hidrogen ca şi gaz purtător şi cu temperatură

programată între 55 şi 250ºC. La ionizarea cu impact de electroni,

aminoacizii sub formă de TBDMS-derivaţi se produc în cea mai mare

parte sub formă de ioni prin fragmentarea moleculelor. Masele ionilor

fragment fiind caracteristice fiecărui aminoacid. Prin ruperea în diferite

poziţii din gruparea tert-butil-dimetilsilil se formează ioni cu masele M-

72

43, M-57 şi M-85, iar prin ruperea legăturii dintre carboxil şi atomul de

carbon alfa, adiacent, ia naştere un fragment cu masa M-159. Pentru

analize s-a utilizat un cromatograf de gaze Hewlett Packard 5840 A, iar

spectrele s-au înregistrat cu un spectrometru de masă cuadrupolar HP

5985.

3.7. Sinteza de aminoacizi marcaţi Marcarea aminoacizilor cu izotopi stabili se poate realiza prin

sinteze chimice şi enzimatice. În primele etape de marcare a acizilor

aminaţi cu izotopi stabili s-au folosit metode de sinteză chimică. Aceste

metode prezintă un şir întreg de dezavantaje, cum ar fi consumul unei

cantităţi mari de amoniac, randamente scăzute datorită mai multor etape

de sinteză, obţinerea racemicului.

Folosirea enzimelor în sinteze de aminoacizi marcaţi cu izotopi

stabili prezintă mai multe avantaje faţă de metodele chimice, datorită

faptului că decurg stereoselectiv şi au randamente superioare. O metodă

relativ simplă şi mai utilizată pentru obţinerea de aminoacizi marcaţi cu 15N este sinteza enzimatică pornind de la cetoacizi şi săruri de amoniu

(15N). Reacţiile de sinteză sunt cuplate cu reacţii de regenerare a

cofactorilor costisitori.

Majoritatea enzimelor utilizate în sinteza diverşilor compuşi

necesită coenzime (NADH sau NADP). Din cauza preţului mare a

acestora utilizarea lor în cantităţi stoichiometrice nu este eficientă.

Pentru a evita acest fenomen există câteva căi de regenerare continuă a

coenzimelor pe parcursul sintezelor:

73

• regenerarea în vivo, cu utilizare de celule în creştere. Această

metodă prezintă dezavantajul manipulării laborioase a celulelor şi

caracterul enantioselectiv scăzut al reacţiei;

• regenerarea enzimatică în vitro, cele mai utilizate enzime

pentru regenerarea coenzimelor în sinteze fiind alcool dehidrogenaza şi

formiat dehidrogenaza [27];

• regenerarea electrochimică, care constă în oxidarea unui

mediator şi transferul electronului la NAD(P)+. Un dezavantaj al

metodei îl prezintă specificitatea şi viteza de regenerare reduse.

Modalitatea cea mai eficientă pentru regenerarea coenzimelor

rămâne metoda enzimatică. Sursele enzimelor utilizate în regenerarea

coenzimelor sunt destul de variate, marea majoritate provenind de la

bacterii. Piridin nucleotid transhidrogenaza de la Pseudomonas

fluorescens a fost utilizată în regenerarea atât a NAD cât şi a NADP

pentru producerea de hidromorfonă [10]. Schema de sinteză a

aminocizilor marcaţi cu 15N utilizată în prezenta lucrare este

reprezentată în Figura 3.3.

74

Figura 3.3. Schema de sinteză a acizilor aminaţi cu 15N. AADH –

aminoacid dehidrogenză

Aminoacid dehidrogenazele catalizează reacţia de formare a

aminoacizilor pornind de la 15NH4Cl şi cetoacizii corespunzători.

Sinteza de aminoacizi a fost cuplată cu reacţia catalizată de glucozo-

dehidrogenaza (GlucDH) de la B. subtilis. GlucDH a servit la

regenerarea NADH, utilizând ca sub-strat glucoza cu formare de acid

gluconic. În unele sinteze s-a folosit galac-tozo-mutarotaza pentru

transformarea α-glucozei în β-glucoză. Enzimele utilizate în sintezele

de aminoacizi marcaţi nu au fost purificate. Enzimele recombinate,

exprimate în celule de E. coli, reprezintă aproximativ 50% din

proteinele totale existente în lizatul bacterian. Purificarea acestora este

o etapă suplimentară care, în general, nu conduce la mărirea

randamentului reacţiei. Honorat şi colaboratorii [24] au testat sinteza de

15NH4Cl

Cetoacid

L-(15

N)- Aminoacid

AADH

NAD+

NADH

GDH

GalM

β- glucoză

Acid gluconic

α- glucoză

75

L-alanină şi L-valină cu enzime (alanin dehidrogenază şi valin

dehidrogenază) purificate şi în lizat bacterian. Acest fapt nu a influenţat

randamentul sintezelor.

3.8. Tendinţe actuale în aplicarea bionanotehnologiilor Bionanotehnologiile moderne se inspiră din organizarea celulară

a lumii vii. Astfel, structurile nano la fel ca şi structurile vii, sunt

alcătuite din componente de natură organică şi anorganică. Aceste

structuri sunt speranţa pentru tratarea a numeroase cancere, existând în

prezent deja aplicaţii ale nanoparticulelor în tratamentul unor cancere.

Nanoparticulele sunt o speranţă nu numai pentru tratamentul

numeroaselor boli, dar şi pentru stabilirea unor diagnostice. Utilizarea

nanoparticulelor în medicină este axa prioritară în aplicarea

bionanotehnologiilor.

Limitările bionanotehnologiilor sunt: incapacitatea de a sintetiza

particule de aceleaşi dimensiuni cu aceeaşi suprafaţă, controlul

organizării lor. Ţesuturile tari, cum ar fi ţesutul osos, cochiliile la

moluşte, conţin una sau mai multe componente organice de natură

proteică care controlează organizarea structurală .

3.9. Aplicaţii ale bionanotehnologiilor Nanoparticulele de aur (NP-Au) sunt o adevărată speranţă în

diagnosticul şi tratamentul cancerelor.

76

Au a fost utilzat timp de câteva decenii în diverse aplicaţii în

medicină (implanturi dentare) datorită caractersticilor sale neutre.

Nanoparticulele de Au au început să fie din ce în ce mai des utilizate în

depistarea şi chiar tratamentul unor celule canceroase datorită faptului

că acestea sunt inerte, non-toxice, au stabilitate mare, dimensiuni mici şi

capacitate de legare mare. NP-Au sunt capabile de a acţiona asupra unor

anumite tipuri de celule chiar în absenţa oricăror grupe funcţionalizate.

NP-Au induc moartea celulară liniei de celule de carcinom pulmonar

A549 de la om, dar nu au nici un efect asupra altor linii de celule

HepG2 (carcinom hepatic hepatocelular uman) şi BHK21 (celule

juvenile din rinichi de hamster) [57].

3.10. Diagnostic Diagnosticul nanomolecular al cancerului poate asigura

depistarea celulelor canceroase în faze incipiente ale bolii.

Nanoparticule de aur derivatizate cu nucleotide tiolate au fost utilizate

pentru depistarea celulelor canceroase [15]. NP-Au la care s-au ataşat

oligonucleotide de ADN au fost utilizate pentru diagnosticul timpuriu al

leucemiilor mieloide acute. Oligonucleotidele ADN utilizate în acest

scop reprezentau un fragment din joncţiunea care rezultă în urma

translocaţiiei t(9;22)(q34;q11). Un fragment dintr-un cromozom este

translocat la un alt cromozom, în acest caz fragmentul de la

cromozomul 9 este transferat pe cromozomul 22, cromozomul find

cunoscut sub denumirea de cromozom Philadelphia. Această

77

translocaţie este cauza leucemiilor mieloide cronice şi care sunt cauzate

de fuziunea a 2 gene BCR(22)-Abl(9) (Figura 3.14).

Figura 3.14. Formarea cromozomului Philadelphia – translocaţia

reciprocă între cromozomul 9 şi 22.

Produsul acestei gene este o proteină himeră cu activitate

tirozin-kinazică. Metoda de detecţie cu ajutorul nanoparticulelor se

bazează pe formarea de porţiuni hibride ADN:ARN (ADN sonda:

ARNm din celulele canceroase) dublu catenare, care vor împiedica

agregarea nanoparticulelor de Au odată cu creşterea concentraţiei de

săruri. Metoda nanosondelor pentru diagnosticul acestui tip particular

de cancer oferă avantaje faţă de metodele utilizate actual în diagnostic

BCR

Translocație reciprocă

Abi

Comozomul 9 Comozomul 22 Comozomul 9

Comozomul Philadelphia

Abi BCR

78

(FISH, transcrierea inversă a ARNm şi amplificarea prin PCR) prin

faptul că este mai ieftină şi mai rapidă (~30 min) şi necesită cantităţi

mici de ARNm (10 ng/μl). Diagnosticul timpuriu în asemenea cazuri

este foarte important, în fazele ulterioare celulele canceroase devenind

rezistente la chemoterapice.

Nanoparticulele de argint (NP-Ag) au devenit atractive în

domeniul bionanotehnologic după descoperirea efectului lor

antibactericid [66]. Acest efect este unul de importanţă majoră datorită

faptului că bacteriile capătă din ce în ce mai multă rezistenţă la

antibiotice. Nanoparticulele de argint par a avea o influenţă nu numai

asupra bacteriilor, dar şi asupra virusurilor. Astfel NP-Ag la

concentraţii non-toxice pentru celule inhibă replicarea virală (sinteza

materialului genetic ai virusului) atunci când nanoparticulele sunt

administrate înainte de infectare sau ime-diat după (2-4 ore) aceasta

[67].

Unele substanţe chimice s-au dovedit a avea un efect inhibitor

asupra proliferării celulare, angiogenezei şi rol antiinflamator. Un astfel

de exem-plu este colorantul DCPIP (2,6-diclorofenol-indofenol) care

induce apoptoza (moartea celulară) în celule umane de melanom A375

şi G361 [12]. DCPIP s-a dovedit a avea acţiune antiangiogeneză şi

antiinflamatoare asupra celulelor canceroase umane de colon HCT116.

Efectul acestuia este mai intens dacă este încapsulat în particule de

polia-cizi (lactic şi glicolic). Concentraţiile de ≥6 μg/ml de colorant

(DCPIP) induc moartea celulară prin apoptoză [41].

79

Nanobiotehnologiile urmăresc nu numai crearea de nano-

vehicule pen-tru transportarea diferitor substanţe, dar şi crearea şi

manipularea unor adevărate nano-motoare, utile în nanomanipulare

celulară. F1-ATP-aza este un veritabil nano-motor rotativ, a cărei

mişcări pot fi controlate cu ajutorul unor stimuli optici şi chimici [60].

Sisteme particulare capabile de transport ţintit şi eficient a

diferitor substanţe, cu puţine efecte adverse, se datorează probabil

endocitozei transportorilor. Nanoparticule cationice formate din lipide

cationice şi polielectroliţi s-au dovedit a fi cărăuşi excelenţi pentru

transportul amfotericinei B – un antifungicid pentru Candida albicans

[71].

Nanodiscurile de HDL (High Density Lipoprotein) sunt un strat

bifosfolipidic cu aspect de disc (ND-HDL). Este cunoscut faptul că

HDL este numit “colesterolul bun” deoarece este implicat în transportul

molecu-lelor hidrofobe (colesterol) în fluxul sangvin care este un

mediu hidrofil. Structura HDL (liporoteine cu densitate mare) este una

simplă, fiind alcătu-it din fosfolipide şi apolipoproteină (apo). Cea mai

abundentă formă de lipoproteină din plasma sanguină umană este apoA-

I, care este alcătuită din 243 de aminoacizi, este bine caracterizată şi la

incubarea cu vezicule de fosfolipide în vitro formează HDL revers,

capabil de transportul molecule-lor hidrofobe [61]. Fosfolipidele cele

mai frecvent utilizate pentru asamblarea veziculelor sunt DMPC

(dimirisstoil-fosfatidil colina) şi DMPG (dimirisstoil-fosfatidil glicerol).

Incubarea acestor vezicule cu apoA-I se autoasamblează ND-HDL.

Aceste nano-discuri se pot autoasambla chiar dacă nu este utilizată

80

enzima integrală, ci numai fragmente de apolipoproteine [73]. ND-HDL

reprezintă astfel un mediu favorabil pentru studierea proteinelor

transmembranare, transportul unor substanţe hidrofobe.

Stratul bilipidic este un mediu natural pentru proteinele

transmembranare care îşi păstrează proprietăţile sale conformaţionale şi

activitatea. Suprafaţa unui nanodisc cu diametrul de 20nm este de ~300

nm2, o suprafaţă suficientă pentru integrarea câtorva molecule proteice.

Avantajul utilizării acestor structuri comparativ cu miceliile de

detergenţi, este că asigură un mediu natural apropiat, fără prezenţa

detergenţilor care pot schimba conformaţiile proteinelor. ND-HDL au

fost utilizate în studierea a numeroase proteine transmembranare cum ar

fi bacteriorodopsina [7,8], citoromul p450 3A4 [3], toxina antraxului

[35], hidrogenaze enzime de membrană produse de Pyrococcus furiosus

care pot sintetiza H2 [5]. ND-HDL au fost testate în utilizarea lor pentru

transportul diferitor substanţe hidrofobe, care sunt insolubile în mediu

sangvin hidrofil. Un exemplu în acest sens este transportul de către ND-

HDL a amfotericinei B un potenţial antifungicid care inhibă creşterea

Saccharomyces cerevisiae şi a altor fungi patogene, care administrat

sub această formă nu mai este toxic la anumite concentraţii [51]. ND-

HDL ce conţineau cucurmină (un polifenol hidrofob natural obţinut din

Curcuma longa) au inhibat creşterea liniei celulare hepatice HepG2

comparativ cu administrarea curcuminei libere [22]. O altă aplicaţie a

nanodiscurilor de HDL a fost încorporarea de lipide cu ioni bivalenţi de

Ni2+, care au capacitatea de a fixa proteinele cu etichetă de 6-His

(histidine). Proteina din învelişul virusului West Nile [28].

81

CAPITOLUL 4. CULTURI CELULARE

4.1. Prezentarea principiului tehnicii experimentale Multe dintre tehnicile introduse la un moment dat în diferite

ştiinţe au revoluţionat felul în care acea ştiinţă a fost percepută ulterior.

Culturile celulare sunt un asemenea exemplu în biologie. Introducerea

acestei tehnici în urmă cu aproximativ 100 de ani a permis practic

importul naturii în laborator, ceea ce a dus la standardizarea tehnicilor

şi generalizarea strategiilor de studiu între cercetătorii din diverse

instituţii, urmată de o explozie informaţională în lumea biologică.

Avansarea cunoaşterii biomedicale din ultimele decenii nu ar fi fost

posibilă fără dezvoltarea printre altele a metodelor de lucru cu celulele.

Cercetarea biomedicală actuală foloseşte tehnicile de lucru cu celulele

pentru investigarea unor probleme din domenii ca: biofizica, biochimie,

biologie celulară şi moleculară, genetica, biologia dezvoltării

organismelor, evolutionism, medici-na moleculară, farmacologia,

bionano-tehnologia, inteligent drug design etc. Este practic de

neimaginat desfăşurarea activităţii într-un centru de cercetare

biomedical lipsit de laboratorul de culturi celulare. Aplicaţii curente

sunt legate de: folosirea culturilor celulare pentru elaborarea

vaccinurilor, producţia glicoproteinelor recombinante (cytokine,

hormoni, anticorpi monoclonali folosiţi în cercetare şi clinica medicală,

interferoni, eritropoietina), testarea agenţilor anticanceroşi, studii de

genomică, metabolism, apoptoză. Într-un sens mai larg, cultura celulară

poate cuprinde cultura ţesuturilor şi organelor. Pe de altă parte, celulele

pot fi folosite ca şi model pentru studiul răspunsurilor fiziologice la

82

diferiţi factori de stres din mediu. Avansarea cercetării din domeniul

celulelor stem şi lucrul cu celulele embrionare face posibilă,

deocamdată teoretic, cultivarea organelor şi ţesuturilor cu aplicaţii în

bolile cronice degenerative, cancere şi altele. Din punct de vedere al

tipului de cultură se poate vorbi despre:

- cultura de organe - presupune prelevarea şi cultivarea unui organ în

totalitate. Aceasta include şi cultivarea unor embrioni întregi;

- cultura de ţesuturi - presupune prelevarea unor fragmente de ţesuturi şi

cultivarea lor;

- cultura de celule - presupune prelevarea unor ţesuturi şi digestia lor

pentru obţinerea unei suspensii unicelulare care este apoi cultivată mai

departe.

Dacă ne referim la cultura de celule, există trei tipuri de celule

animale care sunt cultivate în laborator: primare, secundare şi

imortalizate (tabel 4.1).

Proprietăți primare secundare imortale/canceroase Inhibiţia de contact1 Da Da Unele/nu

Fenotipul faţă de situaţia in vivo

Identic Asemănător Asemănător/ rotunde

Genotipul faţă de situaţia in vivo

Identic Identic Asemănător/ diferit

Necesarul factorilor de creştere

Crescut Crescut Crescut/limitat

Diferenţiate Da Da Da/nediferențiate

Număr de diviziuni 2-3 <100 Nelimitat

Timp necesar cultivării Crescut Scăzut Scăzut

Reproductibilitatea rezultatelor

Scăzută crescută crescută

83

Tabel 4.1. Caracteristicile celulelor primare, secundare şi

imortale/canceroase [2]. 1 în mod normal, celulele cresc în vasul de cultură până când stabilesc contact cu vecinele lor, moment în care îşi opresc creşterea. Celulele canceroase pierd această caracteristică fenotipică şi după ce ajung să fie confluente încep să crească una peste cealaltă formând ghemuri de celule uşor de distins la microscopul optic.

4.2. Culturi primare Majoritatea celulelor din culturile primare necesită ancoraj.

Cultivarea celulelor provenite din piele (keratinocite, fibroblaste) se

face prin biopsierea ţesutului şi formarea unei suspensii unicelulare.

Aceste celule vor creşte aderente de suprafaţa vasului de cultură. Pentru

a le separa de acesta şi pentru separarea celulelor unele de altele se

folosesc de obicei enzime proteolitice (tripsina). Pe de altă parte,

cultivarea celulelor prelevate din sângele periferic se face într-o manieră

care nu necesită ancorarea acestora de pereţii vasului de cultură. Este

posibil ca celulele să formeze aderenţe între ele dar de obicei acestea

sunt de o mică intensitate. Diferite substanţe (factori de creştere ai

diferitelor populaţii leucocitare şi/sau mitogeni – substanţe care

stimulează mitoza) pot fi utilizate pentru diferenţierea şi înmulţirea

celulelor în cultură [2].

4.3. Culturi secundare Prin subcultivarea celulelor dintr-o cultură primară se pot obţine

aşa-numitele culturi secundare. Celulele dintr-o cultură secundară pot

parcurge până la 100 de diviziuni înainte de a-şi pierde potenţialul

84

proliferativ. Deşi nu prezintă alterări ale setului de cromozomi

(karyotipului), aceste celule acumulează anumite caracteristici

fenotipice care le fac să devină o linie celulară distinctă. Pe lângă

derivarea culturilor secundare, subcultura are ca scop menţinerea

celulelor în faza logaritmică de creştere, evitarea confluenţei care poate

avea ca rezultat inhibarea creşterii, îndepărtarea celulelor moarte şi a

produşilor de metabolism celular şi adăugarea substanţelor nutritive [2].

4.4. Culturi de celule imortalizate Este posibil ca unele celule din culturile secundare să sufere

anumite transformări care le conferă caracterul de imortalitate adică

posibilitatea de a se divide la nesfârşit. Aceste celule pot apărea ca

urmare a unor modificări (transformări) la nivelul cromozomului prin

factori chimici, fizici (radiaţii) sau biologici (virusurile oncogene).

Unele dintre aceste celule imortale (transformate) pot avea caracter

oncogenic; cu alte cuvinte transplantarea lor la animalele de laborator

este urmată de apariţia tumorilor la acestea. După cum se poate observa

din tabelul 4.1, celulele canceroase au unele proprietăţi care le

diferenţiază de celelalte celule imortale necancreoase: nu mai prezintă

inhibiţia de contact; pot creşte cu mai puţini nutrienţi etc [2].

4.5. Prezentarea informaţiilor care se pot obţine pe diferite sisteme de studiu

Aplicaţiile culturilor celulare îşi găsesc utilitatea în producerea:

vaccinurilor (antirubeolic, antiparotidita epidemică, antivaricela,

85

antirabic); hormonilor şi factorilor de creştere (insulina,

eritropoietina), factorilor de coagulare, enzimelor, anticorpilor

monoclonali şi altor substanţe imunomodulatoare (interferoni,

interleukine), agenţilor anticanceroşi etc. Mai mult, dezvoltarea în

ultimii ani a cunoştinţelor şi tehnologiei de lucru cu celulele stem

constituie una dintre temele cele mai actuale în domeniul biomedical.

Este de aşteptat ca acest domeniu să revoluţioneze tratamentul

diferitelor afecţiuni. În plus, celulele animale sunt deosebit de utile în

testarea citotoxicităţii diferitelor substanţe incluzând noile terapii

anticanceroase. Nu în ultimul rând, prin folosirea tehnologiei AND-ului

recombinat este posibilă crearea celulelor transgene care constituie per

se un model de studiu pentru investigarea metabolismului energetic,

traficului de membrană, ciclului celular, diferenţierii, îmbătrânirii şi

apoptozei [2].

4.6. Anticorpii monoclonali Una dintre aplicaţtiile culturilor celulare cu cel mai mare impact

pentru societate la ora actuală este reprezentată de tehnologia de

obţinere a anticorpilor monoclonali prin folosirea hibridoamelor.

Această tehnologie a fost inventată de către Milstein şi Koehler în urma

cu aproape patru decenii. În 1975 cei doi cercetători au publicat

rezultatele prin care pot fi obtinuţi anticorpii monoclonali. Pe scurt

tehnica presupune imunizarea unui animal de experienţă cu un antigen

şi recoltarea celulelor B (cele care produc anticorpii) la un anumit

interval de timp după imunizare (figura 4.3). Aceste celule sunt

86

fuzionate apoi în prezenţa polietilenglicolului (PEG) cu o linie celulară

canceroasă de mielom (cancer al plasmocitelor). În urma acestei

fuziuni, se formează celule hibrid (de unde şi numele de hibridoame)

dintre care unele produc anticorpii cu specificitatea dorită (caracter

dobândit de la celula B a animalului imunizat) într-o manieră continuă

(dobândind caracterul imortal de la celulele de mielom). Prin diferite

metode de screening se pot găsi aceste celule care sunt ulterior

subclonate dând naştere astfel unor linii celulare pure şi stabile are

produc anticorpii monoclonali.

Datorită specificităţii deosebit de mari (se consideră că un

anticorp poate distinge antigenul pereche între 108 molecule), anticorpii

monoclonali şi-au găsit foarte rapid aplicaţii în domenii variate cum ar

fi: diagnosticul şi trata mentul clinic, cercetare fundamentală [59] şi cea

aplicată prin metode de izolare a diferitelor substanţe recunoscute,

anticorpi catalizatori ai reacţiilor chimice (abzymes).

Folosirea terapeutică a anticorpilor monoclonali în diferite

afecţiuni umane urmează două direcţii: markeri diagnostici care pot

identifica diferite tipuri de antigene din populaţii celulare in vivo şi

terapia ţintită a diferite-lor afecţiuni în care anticorpului monoclonal îi

sunt ataşate substanţe chimice toxice sau radioactive [2].

87

Figura 4.3. Producerea anticorpilor monoclonali [2].

Splina este izolată la câteva saptămâni (timp necesar pentru

îmbogăţi-rea repertoriului de celule B specifice) după imunizarea

animalului cu anti-genul faţă de care se doreşte producerea anticorpilor

monoclonali. Celulele B sunt izolate şi combinate cu mieloamele

(partea stângă) în prezenţa PEG care mediază fuziunea celulelor.

Celulele hibrid sunt singurele care vor supravieţui în mediul

suplimentat cu Hypoxanthine Aminopterin Thymidine (HAT).

Screeningul face posibilă identificarea coloniilor care produc anticorpi

faţă de antigenul dorit. Urmează apoi subclonarea realizată prin diluarea

Screening

Subclonare

Linie celulară producătoare de anticorpi monoclonali

PEG

HAT

Antigen

88

celulelor din coloniile producătoare în aşa fel încât fiecare recipient să

conţină teoretic o singură celulă. Se obţin în acest fel colonii în care

toate celule provin dintr-o singură celulă mamă şi deci vor produce

acelaşi anticorp ca şi aceasta.

Această abordare a permis medicilor oncologi să obţină rezultate

spectaculoase în diferite forme de cancere. Se poate vorbi la ora actuală

de cancere tratate cu anticorpi monoclonali în care pacienţii

supravieţuiesc fără recidivă la 30 de ani de la administrarea terapiei.

Deşi nu sunt toxici, anticorpii monoclonali produşi în şoarece

prezintă neajunsul de a fi străini organismului uman. Ajunşi în

organism aceşti anticorpi ca orice altă substanţă străină iniţiază un

răspuns imun din partea gazdei care se poate manifesta prin secreţia de

anticorpi umani anti-anticorpi monoclonali de şoarece. Cu timpul

anticorpii umani pot neutraliza şi distruge anticorpii monoclonali

injectaţi anulându-le efectele terapeutice. Din acest motiv, în ultimii ani,

anticorpii de şoarece au fost umanizaţi. Tehnologia ADN-ului

recombinat a făcut posibilă ataşarea părţii specifice (cea care recunoaşte

antigenul) derivată de la şoarece cu un braţ constant (care constituie

cea mai mare parte) de la om. Există la ora actuală şi peste 30 de

anticorpi monoclonali folosiţi ca şi agenți terapeutici în diferite

afecţiuni umane; numărul celor aflaţi în diferite stadii de testare

depăşeşte 100.

4.7. Celule stem Următorul pas în revoluţia din domeniul biomedical a fost

reprezentat de posibilitatea cultivării celulelor stem în laborator. Prin

89

definiţie celulele stem sunt acele celule care prin diviziune dau naştere

unei celule fiică identică şi unei alte celule care poate fi diferită. După

sursa de provenienţă există două tipuri de celule stem: celule stem

embrionare şi celule stem adulte. După numărul de precursori ai liniilor

diferenţiate pe care le poate produce, celule stem pot fi clasificate în:

totipotente, pluripotente, multipotente, oligopotente. După cum implică

numele, celulele totipotente sunt capabile să formeze un organism în

totalitate. Aceste celule sunt reprezentate de către ovulul fertilizat şi

celulele obţinute din primele diviziuni ale acestuia. O schiţă a

diferenţierii celulare se găseşte în figura 4.4. Cele mai bine studiate

celule stem sunt cele derivate din măduva osoasă şi care constituie

precursorii tuturor celulelor din sânge. Interesul major pentru biologia

celulelor stem este explicat de potenţialul de diferenţiere al acestora în

orice tip de ţesuturi şi organele dintr-un organism. Deşi cercetarea în

acest domeniu este relativ la început, cercetătorii au reuşit să izoleze şi

cultive cu succes anumite celule stem din diferite surse unele dintre ele

fiind apoi diferenţiate în numeroase celule finale. Pe lângă potenţialul

terapeutic enorm, celulele stem prezintă şi aplicaţii diagnostice. Este

posibil ca una dintre cele opt celule ale embrionului rezultat în urma

fertilizării in vitro a unui ovul să fie îndepărtată şi analizată din punct de

vedere genetic (celula este dispensabilă deoarece restul celulelor rămase

refac embrionul). În urma analizelor care pot să depisteze diferite

defecte genetice se poate decide neimplantarea embrionului în uterul

viitoarei mame.

90

Folosirea acestor celule face posibilă şi obţinerea animalelor

modificate genetic prin introducerea unor gene în embrionul tânăr. Se

pot produce astfel animale „chimera” care exprimă genele implantate în

diferite organe. Dacă aceste organe sunt chiar gonadele, atunci urmaşii

unei împerecheri dintre doi astfel de şoareci chimera pot produce un

knock-out/knock-in pentru acea genă. Deşi deosebit de atractivă,

tehnologia cultivării celulelor stem embrionare este puternic îngrădită

de normele actuale ale eticii cercetării.

Figura 4.4 Celulele stem pot da nastere unui numar mare de celule diferentiate final [2].

Disputele asupra aspectelor etice ale lucrului cu celule stem

embrionare au încurajat dezvoltarea tehnicilor de lucru cu celulele stem

91

adulte. Rămâne de văzut dacă potenţialul unor astfel de celule stem

adulte este la fel de nelimitat ca şi al celor embrionare. Recent au fost

descrise şi celule stem canceroase. Această nouă descoperire pune sub

semnul întrebării principiile actuale care stau la baza tratamentului

cancerului. Existenţa acestor celule canceroase stem poate explica

apariţia recidivelor prin participarea unui număr redus de celule care nu

pot fi distinse/distruse prin tehnicile actuale. Experimental s-a dovedit

că un număr de doar 200 de celule considerate ca fiind celule stem

canceroase este suficient pentru a transfera cancerul de la un animal la

un altul în timp ce un număr de câteva sute de ori mai mare de celule

canceroase care nu prezintă caracteristicile celulelor stem sunt

incapabile să transfere boala.

Succesul în lucrul cu celule depinde de factori variaţi cum ar fi:

utilarea laboratorului, calitatea celulelor şi a reactivilor, tehnica

asepteică (prezentate în cele ce urmează) şi experienţa personală a

operatorului care contribuie decisiv la primele trei [2].

92

CAPITOLUL 5.

Aparatajul disponibil şi stabilirea parametrilor optimi de funcţionare pentru diverse tipuri de experimente

5.1. Echiparea laboratorului de culturi celulare Organizarea generală a laboratorului de culturi celulare include

următoarele echipamente de bază:

a. Hota cu flux laminar

• Serveşte lucrului efectiv cu celulele; aranjarea spaţiului de lucru este

descrisă în figura 4;

• este prevazută în mod obligatoriu cu o lampă de UV care va fi pornită

5-10 minute înainte de începerea lucrului şi repornită pentru

5-10 minute după încheierea lucrului;

• tipul de hotă folosită pe scară largă în cultura celulelor animale este

hota cu flux de aer vertical care oferă o protecţie bună atât pentru

celule cât şi pentru operator.

b. Incubator cu sursa de CO2

• creşterea celulelor; în funcţie de tipul de celulp, concentraţia de CO2

este în general ajustată între 5% şi 7% pentru a obţine un sistem

tampon optimal în combinaţie cu substanţele din mediul de cultură;

• responsabil pentru menţinerea unei atmosfere sterile (filtre HEPA -

high efficiency particulate air), umede şi cu temperatura constantă.

c. Microscop optic inversat cu contrast de fază (opţional aparat

foto)

• serveşte la observarea celulelor;

93

• deoarece în cultura de celule animale, celulele sunt în general situate

pe suprafaţa bazei recipientului se foloseşte microscopul inversat;

• contrastul de fază îmbunătăţeşte vizualizarea specimenelor transpa-

rente (celulelor).

d. Centrifuga de masă cu răcire

• centrifugarea suspensiilor de celule în diverse scopuri.

e. Recipient cu azot lichid

• stocarea celulelor pe termen lung; de obicei se găseşte într-o incintă

anexată;

• o precauţie deosebită trebuie acordată faptului că recipientul este

extrem de rece (-196 grade Celsisus) şi azotul poate produce arsuri

în urma contactului cu pielea sau mucoasele; de aceea este necesară

utilizarea echipamentului de protecţie (ochelari/mască facială,

manuşi, halat).

f. Frigider/congelator

• stocarea reactivilor (medii cultură, stocuri de antibiotice, L-glutamina

etc.)

g. Alte componente

• Baie de apă

păstrarea mediilor şi altor reactivi la temperatura de 37°C;

o alternativă este înlocuirea apei cu perle metalice care

prezintă următoarele avantaje: reducerea contaminării

reactivilor cu care vin în contact, igienizare uşoară,

economisirea consumului de energie, stabilitate în timp.

• Autoclav şi sterilzor cu aer uscat

94

Folosite pentru sterilizarea diferitelor soluţii şi recipiente

folosite.

• Pompa de vid şi sisteme de sterilfiltrare

pentru lichidele instabile la autoclavare (de ex. DMSO) se

poate folosi şi ca sistem de aspirare a mediilor folosite.

h. Consumabile

• pipete serologice, pot fi din plastic (de unică folosinţă) sau din sticlă

(refolosibile după sterilizare);

• vase de cultură - codate în funcţie de aria utilă de cultivare şi de vo-

lumul maxim de mediu care poate fi conţinut;

• medii de cultură (multe celule pot fi cultivate în

DMEM/RPMI+10%FBS la care se adaugă diferite concentraţii de L-

glutamina şi antibiotice).

Cronologic se poate vorbi de existenţa a două categorii de medii;

cele na-turale care includ serul sanguin şi alte secreţii de origine

animală şi medii sintetice în care componentele de bază sunt produse

separat şi apoi amestecate de obicei de către firme specializate. Chiar

dacă este vorba de un mediu sintetic, cu unele excepţii serul este

considerat un component de bază. La ora actuală, serul provine de la

animale mari, în gene-ral de la vacă - de unde şi numele de fetal bovine

serum (FBS). Mediile de cultură sunt soluţii saline tamponate.

Compoziţia mediilor de cultură este complexă incluzând: aminoacizi,

acizi graşi, carbohidraţi, săruri, microelemente, vitamine, hormoni,

factori de creştere şi alte componente. Cele mai multe medii conţin şi

phenol red, un indicator al pH-ului care trebuie să rămână între 7 şi 7,4.

95

Dacă acesta virează spre galben indicând un mediu acid este cazul ca

mediul să fie schimbat.

• suplimente pentru mediile de cultură: antibiotice – uzual se foloseşte

un amestec de penicilină/streptomicină, L-glutamină, Na-piruvat,

bicarbonat, glucoză şi altele în funcţie de particularităţile

experimentului [2].

5.2. Strategii de lucru Din punct de vedere tehnic, există câteva principii de bază ale

lucrului cu celulele:

• culturile celulare vor fi făcute într-o cameră dedicată acestui scop.

Este de dorit ca această încăpere să fie oarecum izolată faţă de restul

laboratoarelor pentru a limita riscul de contaminare. Tot din acest

motiv, accesul personalului în această cameră va fi restricţionat pe

cât posibil; de aceea se va permite doar accesul celor care sunt direct

implicaţi în procesul de lucru cu celulele;

• personalul care urmează să lucreze cu celulele va fi instruit

corespunzător (vezi mai jos);

• acele încăperi care sunt dedicate lucrului cu celule prezintă risc

infecţios pentru cei implicaţi; de aceea încăperile vor fi semnalizate

corespunzător;

• toate mediile şi suplimentele care urmează a fi folosite în cultura

celulară trebuie să fie certificate pentru lucrul pe culturi de celule

(indicaţia cell culture certified/approved trebuie să apară pe

96

ambalaj/descrierea produsului); toate acestea trebuie adaptate liniilor

celulare cu care urmează a se lucra în laborator;

• spre deosebire de celulele vegetale şi bacterii, celulele animale sunt

pretenţioase în ceea ce priveşte condiţiile în care pot sa crească; există

riscul contaminării cu diferite microorganisme care datorită ratei de

creştere mult superioară celulelor animale vor deveni majoritare în scurt

timp; în plus factori ca spre exemplu temperatura (37oC pentru celule

mamifere), pH-ul, osmolaritatea (290-310mOsm), şi o concentraţie a

CO2 între 5 şi 7% condiţionează cultura celulelor animale (sistemul de

tampon cel mai frecvent utilizat este cel cu bicarbonat de sodiu sau

potasiu din mediul de cultură + CO2 din incubatorul folosit);

• celulele animale sunt limitate în ceea ce priveşte numărul de generaţii

pe care le produc. Chiar şi în condiţii optime, celulele animale se vor

opri din creştere după un număr de generaţii care depinde de sursa

primară a celulelor;

• creşterea celulelor animale urmează o curbă cu trei faze:

o faza de echilibrare (primele 24h) în care celulele se acomodează

cu noul mediu în care sunt introduse;

o faza de creştere exponenţială care durează în jur de 7-10 zile;

o faza de inhibare a creşterii datorită inhibiţiei de contact, creşterii

densităţii peste un nivel critic, scăderii potenţialului de metabolizare a

mediului;

• substanţele pot fi preîncălzite fie la 22, fie la 37 grade Celsius (10-20

min e suficient; se poate porni un cronometru pentru a evita „uitarea”

97

mediilor pentru un timp îndelungat şi degradarea lor (L-glutamina,

tripsina).;

• lucrul bine organizat şi desfăşurat fără grabă este esenţial pentru o

eficienţă maximă:

o mişcările vor fi măsurate şi sigure;

o imediat după adăugarea suplimentelor în mediile de cultură se

notează acest fapt pe recipientul respectiv;

o nimic din ceea ce vine în contact direct cu celulele nu se deschide în

afara hotei sterile; înainte de scoaterea din hotă se verifică etanşeitatea

închiderii [2].

5.3. Instruirea personalului Cultivarea celulelor este un lucru care se poate învăța repede. Cu

alte cuvinte, oricine poate învăța să menţină culturile de celule după

doar câteva zile petrecute în laborator dacă respectă protocoalele şi are

la dispoziţie echipamentul necesar. Singurul lucru care este şi mai uşor

şi nici măcar nu necesită învățare este să contaminezi celulele. De aceea

desfăşurarea activităţii în linişte este esenţială în laboratorul de culturi

celulare. Odată apărută, contaminarea se poate propaga din aproape în

aproape şi duce în final la compromiterea nu doar a celulelor la care

contaminarea a fost iniţial semnalată ci a întregului stoc de celule. Pe

lângă considerentele financiare, contaminarea recipientelor cu conţinut

original (celule produse în laborator şi care nu pot fi achiziţionate de la

companiile specializate sau transferate de

98

la alţi investigatori) reprezintă cel mai neplăcut aspect care poate afecta

un laborator de culturi celulare. Toţi cei care urmează să lucreze cu

celule vor fi în prealabil instruiţi teoretic înainte de a pătrunde pentru

prima dată în laborator. Practic, ei vor începe prin a observa manoperele

de lucru şi a le discuta cu un coleg familiarizat deja cu tehnicile. Doar

după această perioadă este permis lucrul direct, mai întâi sub

supravegherea directă a celor familiarizaţi şi mai apoi în mod

independent. Chiar şi după câştigarea in-dependenţei în lucru, cel

proaspăt iniţiat va fi supravegheat din umbră de către un coleg cu

experienţă care ar putea observa anumite manopere executate

neconform cu normele curente [2].

5.4. Asigurarea asepsiei şi antisepsiei Există anumite măsuri care asigură igiena în lucrul cu celulele:

• Utilizarea echipamentului de protecţie - pentru evitarea contaminării

celulelor şi operatorului:

halat cu mâneci lungi

pantofi închişi

mănuşi de unică folosinţă

• Spălatul pe mâini înainte şi după lucrul cu celulele;

• O soluţie antimicrobiană de etanol 70% trebuie să fie în permanență

la îndemână;

• Instrumentele de lucru trebuie igienizate la intervale regulate. Orice

obiect (pipeta, recipient etc.) care urmează să fie introdus în hota pentru

lucrul steril trebuie dezinfectat înainte sau imediat după introducere;

99

• Orice pipetă trebuie folosită o singură dată; nu este permisă păstrarea

pipetei în mediu sau folosirea unei pipete pentru a transfera

mediu de la un recipient la altul;

• Orice mediu sau obiect contaminat din greşeală va fi aruncat;

• Orice lichid care ajunge în contact cu suprafaţa de lucru sterilă va fi

îndepărtat imediat cu ajutorul unui prosop de hârtie îmbibat în

etanol 70%;

• Este necesară investigarea stării de sănătate a celulelor în fiecare zi.

Se pot astfel observa caracteristicile normale sau abateri de la acestea.

Se pot de asemenea observa contaminări cu alte celule sau

microorganisme. Se pot lua probe care sunt analizate pentru stabilirea

prin diferite tehnici a gradului de puritate/contaminare [2].

5.5. Cultivarea celulelor • după felul în care cresc în flacoanele de cultură, celulele eucariote pot

fi împărțite în două mari categorii: cele care cresc aderent pe vasul de

cultură şi cele care cresc în suspensie. Modul de lucru este asemănător

pentru toate celulele dar există anumite particularităţi de care trebuie

ţinut cont în cazul fiecărei grupe;

• evaluarea celulelor se face în mod normal în fiecare zi prin

vizualizarea lor sub microscopul optic; celulele care cresc aderent

trebuie să apară distribuite pe suprafaţa de contact cu vasul în care cresc

şi de cele mai multe ori capătă o formă poligonală, iar celulele care

cresc în suspensie rămân rotunde şi uneori (în funcţie de linia cultivată)

100

pot forma aglomerări de celule (asemănător cu o ciorchină de struguri);

starea de sănătate a celulelor este confirmată şi de creşterea numărului

de la o zi la alta; o evaluare de primă instanţă a celulelor se realizează

prin vizualizarea macroscopică a culorii mediului din sticlele de cultură;

• culoarea standard a mediilor este roşu-orange; o culoare care virea ză

spre galben indică necesitatea schimbării mediului;

• subcultivarea celulelor: deoarece aglomerarea celulară poate influenţa

negativ vitalitatea celulelor (a se vedea mai sus), se recomandă ca

celulele să fie subcultivate; această procedură care se aplică în faza

logaritmică de creştere a celulelor permite obţinerea unor cantităţi

crescute de celule prin împărţirea/transferul acestora dintr-un recipient

de cultură în mai multe recipiente fiecare reprezentând o nouă sursă de

celule; există anumite formule de calcul care permit aflarea cu precizie

a combinaţiilor optime; de asemenea se pot planifica în acest fel

anumite experimente pentru anumite date; în anumite situaţii este

nevoie de utilizarea unor soluţii de tripsina/EDTA pentru crearea

suspensiilor unicelulare (vezi Tripsinizarea) [2].

5.6. Separarea prin centrifugare a celulelor din mediul de cultură şi stabilirea viabilităţii acestora

Pentru a subcultiva celulele/folosi celulele într-un anumit

protocol este nevoie de stabilirea numărului de celule pe unitatea de

volum. Mediul de cultură conţinând celulele este transferat unor tuburi

în care se centrifughează (centrifuga trebuie echilibrată în prealabil -

dacă avem un singur tub cu celule va trebui să folosim un al doilea tub

101

cu aceeaşi greutate care poate să conţină apă distilată sau orice alt lichid

cu densitate asemănătoare). Pentru o separare bună este nevoie de 10

minute la 200-250g/min (într-o centrifugă de masă cu rotor standard

1000rpm). După centrifugare celulele se resuspendă în mediu proaspăt

şi apoi 10 microlitri sunt combinaţi cu 10 microlitri de soluţie Trypan

blue 0,5% şi pipetate în camera de numărat. Sub microscopul optic,

leucocitele apar ca şi celule gălbui/transparente cu o membrană brună.

Soluţia de trypan blue va pătrunde în celulele moarte care apar albastre.

În funcţie de tipul camerei de numărat, există formule de calcul după

care putem să aflăm numărul total de celule. O viabilitate de peste 90-

95% este în general acceptată pentru toate manipulările ulterioare [2].

5.7. Îngheţarea şi dezgheţarea celuluor Doi paşi critici ai lucrului cu celulele sunt constituiţi de către

îngheţarea şi dezgheţarea celulelor. Îngheţarea este indispensabilă din

următoarele considerente:

• Celulele sunt supuse în permanenţă variaţiilor în compoziţia

cromozomilor. De aceea cea mai sigură metodă de prezervare a liniilor

celulare este cryoprezervarea care opreşte procesele metabolice

nelăsând astfel loc modificărilor genotipului.

• În plus, cryoconservarea este o metodă practică din punct de

vedere economic: este mult mai simplu să păstrezi un tub cu celule

îngheţate care nu au nevoie decât de o completare periodică a rezervei

de azot decât să cultivi în mod repetat celulele în laborator; de

102

asemenea transportul între laboratoare este mai uşor dacă celulele sunt

îngheţate.

• Nu în ultimul rând, metoda face posibilă revenirea la celule cu

un număr mai mic de pasaje.

Este esenţial ca înainte de începerea procedurii respective să

notăm următoarele detalii pe fiecare tub: tipul de celulă, numărul de

celule, numărul de pasaj şi data la care a fost creat stocul.

Îngheţarea va fi lentă şi constantă pentru a minimaliza efectele

adverse asupra viabilităţii celulelor. Mediul de îngheţare cel mai

frecvent folosit conţine mediul de cultură recomandat pentru linia

celulară + 20% FCS + 5-10% cryoprotector -Dimethyl sulfoxid

(DMSO) sau 10-15% glicerol care are rolul de a scădea temperatura de

îngheţ permiţând apei să iasă din celulă şi împiedicând astfel formarea

cristalelor de gheaţă care ar putea distruge membrana. După

centrifugarea şi verificarea vitalităţii (se recomandă folosirea celulelor

vitale în proporţie de >90-95% la colorarea cu trypan blue), celulele vor

fi resuspendate direct în mediul de îngheţare răcit în prealabil la 4 grade

la o concentraţie de 1x106-1x107/ml6 şi transferate imediat la -20 oC

pentru 1-2 ore. Urmează apoi transferul peste noapte la -80 oC şi apoi

stocarea de lungă durată în azot lichid.

Dezgheţarea celulelor trebuie făcută extrem de rapid (ideal în

mai puţin de un minut) prin transferul acestora din recipientul cu azot,

pe gheaţa uscată, direct în baia de apă la 37 de grade Celsius. Odată ce

103

dezgheţarea permite pipetarea suspensiei (>75% dezgheţată) aceasta se

transferă într-un tub de 15ml peste care se adaugă picătură cu picătură8

o cantitate de mediu preîncălzit echivalentă cu de două-trei ori

cantitatea suspensiei, după care se poate adăuga mai rapid mediu până

la 10ml. Se centrifughează în general la 200rpm timp de 2-5 min pentru

a elimina urmele mediului de îngheţare. Se resuspendă în 10 ml de

mediu şi se transfera în sticlele de cultură etichetate. Prin mişcări fine

se distribuie celulele. După câteva ore (cel târziu a doua zi dimineaţa) se

verifică starea celulelor prin vizualizarea la microscop. Mediul va fi

schimbat pentru a înlătura celulele moarte şi resturile de cryoprotector

(DMSO – sterilfiltrat sau glycelor - autoclavat).

5.8. Subclonarea şi tripsinizarea Celulele formează aderenţe între ele şi suprafaţa vasului de

cultură (celule aderente) şi/sau între ele (celulele aderente, unele celule

care cresc în suspensie). Pentru cele mai multe protocoale/manopere

este necesară obţinerea unei suspensii unicelulare. Cea mai frecventă

combinaţie folosită în acest scop este tripsina/EDTA.

Dacă este vorba de celule aderente protocolul de lucru

presupune îndepărtarea mediului, spălarea cu o soluţie salină tampon

fără calciu şi magneziu şi adăugarea unei cantităţi de trispină/EDTA

care să acopere stratul de celule. Celulele nu trebuie lăsate neacoperite

timp îndelungat. Pentru a ajuta separarea este posibilă uşoara bătaie a

sticlei de podul palmei. Urmărind sub microscop separarea celulelor

(durează câteva minute) se poate evita efectul nociv al unei incubări

104

prea îndelungate. Celulele devin rotunde odată ce pierd aderenţele.

Imediat, acţiunea trispinei este antagonizată prin adăugarea de ser

urmată de transferul într-un tub adecvat şi centrifugarea. După

centrifugare celulele sunt resuspendate în mediu pentru a obţine o

suspensie unicelulară şi apoi numărate/investigate la microscop prin

colorarea cu trypan blue (proporţia celulelor moarte). Dacă tripsinizarea

s-a făcut în cadrul protocolului de subcultivare, celulele sunt apoi

transferate vaselor noi de cultură şi incubate până a doua zi. A doua zi

se recomandă schimbarea mediului care permite înlăturarea celulelor

moarte şi a resturilor de tripsină/EDTA. Dacă manopera s-a făcut în alt

scop, se urmează paşii din protocolul respectiv.

La celulele neaderente nu se face tripsinizarea; celule pot fi

direct numărate iar densitatea lor este ajustată prin adăugarea mediului

proaspăt. La fiecare 2-4 săptămâni se centrifughează şi resuspendă

celulele neaderente în mediu proaspăt [2].

CAPITOLUL 6. Producerea şi izolarea proteinelor recombinate din celule mamifere

Tehnica de bază pentru producerea acestor proteine implică mai

multe etape care sunt menţionate în tabelul 3. După întocmirea

strategiei de lucru, fragmentele de interes sunt amplificate prin tehnica

PCR. Pe scurt, ţesutul care conţine antigenul ţintă este prelevat de la

sursa de interes după care ARN-ul mesager obţinut în urma extracţiei

este folosit ca şi matriţă pentru sinteza ADN-ului complementar [2]. Cu

105

ajutorul amorselor specifice, folosind acest ADN complementar pot fi

amplificate secvenţele de interes prin reacţia de PCR. După clonarea

acestor fragmente în celule, urmează exprimarea proteinelor codate şi

purificarea acestora [2]. Apoi în funcţie de aplicaţia dorită, acestea vor

fi utilizate fie la imunizarea pentru modelul activ de boală fie pentru cel

pasiv.

6.1. Anticorpii monoclonali bio-nano-functionalizaţi Terapia biologică cu ajutorul anticorpilor este considerată la ora

actuală ca fiind cea mai activă branşă a industriei biotehnologice [57].

Din punct de vedere istoric, prevenţia/terapia cu ajutorul anticorpilor

este o procedură folosită de câteva mii de ani. Chinezii şi indienii sunt

cei cărora li se atribuie folosirea terapeutică a serurilor (fracţiunea

sângelui în care se găsesc anticorpii alături de alte proteine) încă

înaintea erei noastre. În urmă cu câteva secole, este semnalată folosirea

serurilor pentru protejarea persoanelor în Turcia şi apoi odată cu

experimentele doctorului Edward Jenner de la sfârşitul secolului al

XVIII şi în Anglia. Totusi folosirea pe scară mai largă a anticorpilor în

scop terapeutic a început să fie practicată începând cu secolul XX. În

ciuda efectelor terapeutice extraordinare, folosirea anticorpilor a fost

însă limitată de anumite aspecte dintre care cele mai neconvenabile au

fost:

• lipsa unei surse constante de anticorpi omogeni;

• anumite aspecte adverse (apriţia unui răspuns imun faţă de

însuşi anticorpii) datorită utilizării anticorpilor de la alte specii;

106

• dificultăţilor tehnice în izolarea/producerea lor şi

• necunoaşterea posibilelor ţinte terapeutice esenţiale pentru

diferite afecţiuni.

Descoperirea antibioticelor în anii 30-40 ai secolului trecut

alături de celelalte inconveniente amintite au dus la intrarea anticorpilor

într-un con de umbră. Începând cu 1975 situaţia avea însă să se

schimbe. Într-o lucrare de referinţă pentru literatura biomedicală, doi

cercetători anunţă în revista Nature o metodă prin care se pot obţine

cantităţi teoretic nelimitate de anticorpi cu specificitatea dorită.

Diferenţa între anticorpii policlonali (cei care erau la acea oră în uz

medical) şi noii anticorpi (numiţi monoclonali) poate fi comparată,

chiar şi numai pentru a face lucrurile mai uşor de înţeles, cu diferenţa

dintre două persoane, prima purtând haine de diferite mărimi, forme şi

culori şi a doua purtând haine personalizate de către un croi-tor

profesionist, începând de la lenjerie şi până la ultimul nasture al

paltonului. Chiar dacă uşor exagerată şi poate nu cea mai potrivită din

punct de vedere biomedical, folosirea acesteia are un substrat uşor de

înţeles şi anume în literatura de specialitate de limba engleză termenii

„tailor made antibodies” sunt folosiţi pentru a descrie producerea de

anticorpi monoclonali specifici pentru diferite situaţii [57]. Dezvoltarea

acestei noi tehnici, a dus la înlăturarea primului din cele două mari

dezavantaje ale folosirii anticorpilor policlonali, şi anume lipsa unei

surse constante de anticorpi cu caracteristici omogene; de asemenea, cu

timpul, noua tehnologie a permis obţinerea lor prin tehnici relativ

107

simple şi cu costuri substanţial diminuate înlăturând astfel cel de-al

treilea dintre dezavantajele amintite anterior. Anticorpii monoclonali

produşi iniţial au păstrat neajunsul de a fi produşi în alte specii ducând

la declanşarea unui răspuns imun masiv din partea primitorului (cel de-

al doilea neajuns). Cel mai probabil din acest motiv, lumea biomedicală

şi industria farmaceutică a fost în prima instanţă rezervată la posibila

utilizare a acestora pe scară largă. Această temere a fost dublată şi de

avansarea tehnicilor industriale de producere a molecule-lor cu masă

moleculară mică care păreau să fi rezolvat în sfârşit problema

inexistenţei unor medicamente perfecte. În ciuda acestor piedici,

entuziaştii au continuat însă lucrul la producerea anticorpilor

monoclonali ducând la aprobarea utilizării primului anticorp produs în

acest fel nu însă mai repede de un deceniu de la publicarea

metodologiei de către Koehler şi Milstein [37]. Totuşi în anii care au

urmat, potenţialul imens al noii tehnologii a incitat atât curiozitatea

comunităţii ştiinţifice (interesată în definirea noilor aplicaţii pentru care

anticorpii monoclonali reprezentau unealta mult-căutată, cel de-al

patrulea neajuns amintit mai sus) cât şi de către pragmatismul

industriei farmaceutice (care găsea o nouă mină de aur în

comercializarea noilor „gloanţe magice” aşa cum le numea Paul

Ehrlich, părintele hematologiei şi chemoterapiei, acesta din urmă fiind

un termen pe care l-a introdus chiar el, cu mai bine de un secol în urmă

[69]. După unii, dezvoltarea tehnologiei producerii anticorpilor

monoclonali reprezintă inovaţia secolului trecut în ceea ce priveste

importanţa terapeutică, diagnostică şi preventivă a îmbolnăvirilor

108

umane. Dacă în anul 2000, în topul primelor zece produse folosite în

tratamentul diverselor afecţiuni existau, cu o singură excepţie, doar

substanţe cu greutate moleculară mică, se estimează că cinci din cele

zece substanţe vor fi reprezentate de anticorpi în viitor [57, 66]. Desigur

această turnură a fost posibilă prin îmbunătăţirea permanentă a

protocoalelor de lucru şi obţinerea unor anticorpi modificaţi prin

tehnologia ADN recombinat, tehnici care au cunoscut o dezvoltare

extraordinară în ultimele două – trei decenii. La ora actuală, anticorpii

sunt în aproape toate situaţiile luaţi în calcul la stabilirea strategiei

terapeutice alternative sau câteodată constituie chiar terapia de primă

alegere. Dintre cei peste 25 de anticorpi monoclonali aflaţi la ora

actuală pe lista medicamentelor aprobate pentru tratamentul afecţiunilor

umane, majoritatea sunt destinaţi tratării cancerelor. De asemenea dintr-

un total de 1500 de studii clinice în care sunt testaţi noi anticorpi

monoclonali peste75% sunt axate pe folosirea acestora în tratarea

cancerelor. Majoritatea sunt folosiţi ca atare (neconjugati), urmaţi de cei

conjugaţi cu material radioactiv şi o mică proporţie sunt reprezentaţi de

cei conjugaţi cu toxine. Aceste date au menirea de a sublinia interesul

major al comunităţii biomedicale şi al guvernelor statelor

industrializate (din moment ce majoritatea studiilor sunt finanţate din

bani publici) pentru găsirea unor strategii terapeutice specifice pentru

tratarea acestei maladii.

După cum aminteam anterior la 11 ani de la publicarea lucrării

lui Koehler şi Milstein [37], în 1986 este aprobată utilizarea primului

anticorp monoclonal pentru prevenirea rejetului de transplant. Folosirea

109

pe scară largă a Orthoclone OKT3 (muronomab CD3) a fost însă

limitată de faptul că acest anticorp de origine murină (produs în celule

de şoarece care diferă suficient de celulele umane) induce un răspuns

imun amplu în organismul uman [68]. Mai mult, administrarea acestui

anticorp a dus la apariţia sindromului eliberării sistemice de cytokine

datorită interacţiunii OKT3 cu receptorii pentru porţiunea Fc a IgG.

Datorită eşecului relativ al utilizării acestui medicament şi datorită

timpului îndelungat necesar dezvoltării unui nou medicament, timpul

scurs până la aprobarea celui de-al doilea anticorp monoclonal a fost de

încă opt ani de la aprobarea OKT3. În 1997, rituxan (rituximab), un

anticorp monoclonal împotriva CD20 de pe celulele B devine cel de-al

treilea medicament admis pe piaţa din SUA pentru tumori ale celulelor

B. Între timp acest medicament este folosit şi în tratamentul unor boli

autoimune cum ar fi artrita reumatoidă, bolile buloase (pemfigusul,

pemfigoidul), diabetul zaharat de tip I, anemia hemolitică autoimună,

vasculita autoimună etc. Acest anticorp chimer (combinaţie între uman

şi murin) are multiple mecanisme de acţiune dintre care merită amintite:

inducerea toxicităţii celulare indusă de anticorpi (ADCC) şi

citotoxicitatea mediată de complement (CDC), alături de un mecanism

de inducere a apoptozei celulelor care exprimă CD20 pe suprafaţă. În

general, anticorpii sunt substanţe care interacţionează cu structuri

extracelulare sau de pe suprafaţa celulelor. Mare parte dintre eforturile

actuale au menirea de a creşte penetranţa acestor glicoproteine pentru

ţinte din interiorul celulelor. În plus dacă anticorpii iniţiali aparţineau

clasei IgG1, investigaţii actuale sunt concentrate asupra diversificării

110

activităţii prin schimbarea clasei şi deci a paletei de efecte posibile. Mai

mult, există câteva direcţii prin care se urmăreşte creşterea posibilelor

interacţiuni terapeutice. Dintre acestea amintim:

- o modificarea porţiunii Fc a anticorpilor pentru:

- îmbunătăţirea interacţiunii cu receptorii Fc sau Fc de tip

neonatal (FcRn) de pe celulele efectoare;

- îmbunătăţirea proprietăţilor efectoare prin optimizarea in-

teracţiunii cu sistemul complement;

o prelungirea duratei de injumătăţire cu efecte favorabile

datorate reducerii dozajului fie prin PEG-ylarea fragmentelor (scFv,

Fab) fie prin fuzionarea lor pe domenii de Ig;

o multispecificitatea, adică adăugarea unei alte specificităţi în

zona de recunoaştere a Fab.

Pe scurt, anticorpul păstrează specificitatea pentru care a fost

creat pe unul dintre fragmentele Fab cu care se va lega de ţinta dorită

urmând ca pe celalalt fragment Fab să lege un receptor de pe o celulă

efectoare (spre exemplu CD3 de pe celula T) care are proprietatea de a

distruge celula recunoscută specific.

111

6.2. Recomandări pentru abordarea de noi tipuri de experimente şi metodologii a culturilor celulare.

Una dintre direcţiile de cercetare care vor fi abordate în viitor se

va concentra pe producerea de fragmente recombinate ale diferitelor

protei-ne autoantigen cu ajutorul culturilor celulare eucariote. Atenţia

va fi concentrată pe producerea acelor autoantigene a căror patogenitate

este încă incomplet elucidată, contribuind astfel într-un mod inovativ la

definirea naturii autoimune a diferitelor entităţi clinice. Un exemplu în

acest sens îl constituie clonarea fragmentelor de integrine. Integrinele

sunt o clasă heterogenă de proteine implicate în diverse procese de la

asigurarea contac-telor dintre celule şi mediul înconjurător, la funcţii de

recrutare şi transducerea semnalului. Un interes primar pentru

preocupările noastre îl constituie producerea fragmentelor recombinate

ale proteinelor care asigu-ră adeziunea keratinocitelor de stratul dermal.

Defecte ale acestor integrine sunt considerate a fi implicate în

patogeneza bolilor autoimune. Nu este deocamdată clar în ce fel şi în ce

măsură autoanticorpii faţă de aceste mole-cule sunt implicaţi în

patogeneza autoimună. De aceea, odată produse aceste fragmente ar

putea fi folosite în diferite combinaţii pentru a reproduce caracteristicile

bolii umane în animalele de experienţă. Ca şi metodologie de lucru,

producerea unui model de boală şi modularea acestuia în scop

preventiv/terapeutic implică mai multe etape (Tabelul 6.1).

112

Tabelul 6.1. Etape recomandate pentru modelare în scop

preventiv/terapeutic a unei boli autoimune în animalele de

experienţă

Denumire etapă activități

Obţinerea

fragmentelor

recombinate ale

autoantigenului

Stabilirea planului de clonare

Designul şi producerea de amorse specifice Izolarea

ARN-ului mesager

RT-PCR Clonarea produşilor obținuți prin PCR

Exprimarea proteinelor recombinate

Producerea

modelului activ de

boală

Imunizarea animalelor de experienţă cu diferite

combinaţii de proteine recombinate Evaluarea clinică

şi paraclinică a inducerii bolii Dezvoltarea unor

strategii de prevenţie, diagnostic şi tratament a bolii

induse:

- folosirea diverselor căi de administrare, adjuvanţi,

cantităţi variabile de autoanitgen, folosirea

autoantigilor modificaţi

- folosirea anticorpilor monoclonali cruzi sau

funcţionalizaţi cu nanosfere

- folosirea nanosferelor direcţionate specific

împotriva celulelor imune autoreactive

Producerea

modelului

pasiv de boală

Imunizarea unor animale intermediare cu diferite

combinaţii de proteine recombinate şi izolarea

anticorpilor specifici produşi

Transferul pasiv al acestor anticorpi în şoarecii de

113

laborator

Dezvoltarea strategiilor de prevenţie, diagnostic şi

tratament:

- folosirea anticorpilor din diferite surse şi

evaluarea mecanismelor patogenetice

specifice fiecăruia (sistem complement,

granulocite prin FcR etc.)

- izolarea claselor şi subclaselor din sursa de

anticorpi policlonali şi investigarea meca-

nismelor efectoare prin care aceştia produc

boala

- modificarea anticorpilor prin tehnica

ADN-ului recombinat (se urmăreşte în acest

fel modularea interacţiunii cu diferite

mecanisme efectoare prin modificarea spre

exemplu a porţiunii Fc a anticorpului)

În ultimii ani, un accent deosebit a fost pus pe studierea

interacţiunilor dintre porţiunea Fc a anticorpilor şi alte proteine

efectoare din sistemul imun (receptorii pentru Fc de la nivelul celulelor

imunităţi înnăscute, sistemul complement). Cercetări recente au arătat

că există diferenţe esenţiale între acţiunea diverşilor anticorpi care la

prima vedere sunt identici. Explicaţia propusă a fost că diferenţa este

datorată unor modificări postranslaţionale apărute în porţiunea Fc a

anticorpilor. Este vorba despre adăugarea diferitelor lanţuri glucidice

care fac anticorpii entităţi glicoproteice. Deşi acest lucru era cunoscut

114

de mai multă vreme, semnifica-ţia funcţională a acestui detaliu

structural a rămas un mister până de cu-rând. S-a dovedit recent că o

scădere a syalilarii lanţului glucidic din aceas-tă porţiune duce la

creşterea activării celulelor efectoare cu receptror Fcgamma. De

asemenea structura primară a lanţului polipeptidic care formează

porţiunea Fc a anticorpilor este implicată în reactivităţile diferite

observate la folosirea diverselor preparaţii de anticorpi. De altfel

interesul tot mai mare în explicarea la nivel molecular a susceptibilităţii

la anumite afecţiuni a dus din ce în ce mai frecvent la obţinerea

secvenţelor de nucleotide care codează pentru anticorpi. S-a dovedit

astfel existenţa unei concordanţe între aceste secvenţe şi capacitatea

lanţurilor codate de a activa anumite mecanisme efectoare. Tendinţa

actuală este de a grupa aceste polimorfisme de la nivelul ADN în

funcţie de capacitatea anticorpilor de a activa/inhiba o anumită clasă de

celule efectoare cu implicare în terapia afecţiunilor autoimune şi

cancerelor. Astfel, interesul extraordinar în găsirea combinaţiilor optime

de anticorpi care să identifice celulele tumorale ţintă şi în acelaşi timp

să angajeze un răspuns prin modificare celui de-al doilea fragment Fab

a început să fie balansată de interesul pentru modifica-rea porţiunii Fc

în vederea creşterii efectivităţii. Ideea de bază este că un sistem imun

„acordat” perfect reuşeşte să distrugă celulele nedorite prin implicarea

la timpul şi momentul potrivit a potenţialului uriaş pe care celu-lele

imunităţii il posedă. Se vorbeşte în acest sens despre anticorpi

trispecifici/multispecifici în care pe lângă specificitatea porţiunii Fab

pen-tru ţinta dorită, cea de-a doua porţiune Fab poartă specificitatea

115

agentului terapeutic (nanosfera radioactivă sau toxina; specificitate

pentru un alt re-ceptor de pe o celulă citotoxică spre exemplu), iar o a

treia, patra etc. speci-ficitate este adusă de

cătremodificarea/modificările din porţiunea Fc astfel încât acestea să

poată activa cu succes diverse mecanisme imune (Figura 6.1).

Figura 6.1. Mecanisme de acţiune ale anticorpilor multispecifici.

Pe lângă specificitatea pentru celula tumorală ţintă şi cea

pentru nanoparticule, anticorpii multispecifici posedă şi alte specificităţi

care să le crească capacitatea funcţională benefică. Spre exemplu, prin

modificarea porţiunii Fc pe partea stângă a figurii, anticorpul capătă

116

proprietăţi sporite de activare a sistemului complement care fie direct

(2) fie indirect (3) duce la distrugerea celulei canceroase/autoimune. În

plus, folosirea unei duble specificităţi a porţiunii variabile a

fragmentului Fab face posibilă recrutarea în vecinătatea tumorii a

celulelor T citotoxice (4). De asemenea, prin „personalizarea”

interacţiunii fragmentului Fc cu celulele care poartă receptori pentru

acesta (partea dreapta jos) sunt transduse semnale puternice care pot

avea ca rezultat o activare crescută a acestor celule cu producerea

speciilor reactive de oxigen şi eliberarea proteazelor efectoare (5,6).

În prezent se urmăreşte lărgirea paletei de experimente şi

metodologii care pot fi oferite la nivelul laboratorului. Numeroşi

membri ai acestuia se află în prezent în diverse laboratoare partenere

unde deprind metode şi tehnici noi pe care dorim să le implementăm

odată cu reintegrarea acestora în laboratorul de origine.

Dintre avantajele folosirii anticorpilor ca şi agenţi biologici în

tratamentul cancerului amintim:

- timpul de înjumătăţire crescut faţă de moleculele cu greutate moleculară mică ceea ce face posibilă scăderea dozei utilizate

- specificitatea şi afinitatea mare

- multiple mecanisme de acţiune care pot fi combinate (vezi anticorpi

multispecifici pentru ADCC şi CDC)

- posibilitatea folosirii acestora ca şi terapie complementară/alternativă oricărei forme de terapie anti-canceroasă tradiţională

117

- utilizarea lor ca şi vehicul specific pentru transportul diverselor

substanţe anticanceroase spre diverse destinaţii (vezi anticorpi

bispecifici)

- utilizarea lor ca şi markeri de diagnostic/prognostic pentru diferite afecţiuni.

- în anumite cazuri anticorpii pot per se să controleze creşterea tumorii prin interferarea cu căile de semnalizare celulară, fie prin inducerea apoptozei fie prin antagonizarea efectelor factorilor de creştere [49].

Tabelul 6.2. Diferite mecanisme de acţiune ale anticorpilor

monoclonali

Mecanism de acţiune propus Reprezentant

ADCC Anti-CD20

CDC Anti-CD20

Inducerea apoptozei Anti-CD20

Blocarea interacţiunii factorilor de creştere

cu receptorii specifici

Anti-EGFR

Blocarea fizică a dimerizării receptorilor

pentru factorii de creştere

Anti-EGFR Anti-Her2/neu

Inhibarea neoformării vaselor sangvine Anti-VEGF-A

Anti-EGFR

Blocarea factorilor de creştere în forma solubilă Anti-EGFR

Funcţionalizarea/conjugarea cu radioizo-topi, toxine,

enzime sau cytokine

Diverşi

118

Majoritatea anticorpilor monoclonali utilizaţi acţionează asupra

ţintelor specifice prin acest mecanism; legarea concomitentă a Fv

(partea a Fab) de antigenul ţintă şi a Fc de o celulă cum ar fi

macrofagul sau celula NK care posedă receptori pentru această porţiune

duce la activarea celulei imune urmată de distrugerea celulei ţintită

specific. Cercetări recente au arătat că ADCC este mai eficientă la acei

indivizi care prezintă anumite polimorfisme în porţiunea Fc

(respondenţi cu grad înalt)

119

CAPITOLUL 7.

Cromatografia şi cromatofocalizarea. Principii și metode Biomoleculele sunt purificate folosind tehnici cromatografice

care le separă potrivit diferențelor în proprietățile lor specifice, astfel

cum se arată în figura 7.1.

7.1. Cromatografia de schimb ionic (Ion exchange

chromatography - IEX) separă biomolecule in funcție de variația

suprafeței moleculare (figura 7.1.).

Gel filtrare Interacțiune

hidrofobă

Schimb de

ioni

Afinitate Faza reversă

Figura 7.1. Principii de separare în purificarea cromatografică

IEX pentru separarea biomoleculelor a fost introdusă în 1960 și

continuă să joace un rol important în separarea și purificare. Astăzi, IEX

este una dint tehnicile cele mai frecvent utilizate pentru purificarea de

proteine, peptide, acizi nucleici și alte biomolecule, oferind o înaltă

rezoluție de separare de grup și cu încărcări de mare capacitate. Tehnica

120

este capabilă de a separa specii moleculare, care au cele mai minore

diferențe de sarcină, de exemplu două proteine care diferă prin un

aminoacid. Aceste caracteristici fac IEX bine potrivită pentru captarea,

purificare intermediară într-un protocol de purificare tehnică și este

utilizată la purificarea microcantităților și purificarea pentru analize a

cantităților de ordinul kilogramelor de produs.

IEX separa moleculele pe baza diferențelor de sarcină pe

suprafață. Molecule variază considerabil în proprietățile lor de încărcare

și expun diferite grade de interacțiune cu faza fixă a cromatografiei în

funcție de diferențele în sarcina lor, densitatea și distribuția sarcinii pe

suprafață. Grupurile intramoleculare care posedă diferite valori pKa, în

funcție de structura acestora și micromediul chimic.

Deoarece toate moleculele cu grupări ionizabile poate fi titrate,

sarcina lor externă depinde de pH. În cazul proteinelor, care sunt

construite din mai mulți aminoacizi conținând grupări acide și bazice

slabe. Fiecare proteină are propria sa încărcare unică față de relația pH

care poate fi vizualizată ca o curbă de titrare. Această curbă reflectă

modul de încărcare general al modificărilor de proteine în funcție de

pH-ul mediului. Figura 7.2 ilustrează mai multe curbe teoretice titrare

proteice (aceste curbe pot fi generate folosind o combinație de

focalizarea izoelectrică și electroforeza). Cromatografia IEX are un

avantaj deoarece relația dintre pH și sarcina moleculară externă este

specifică fiecărei substanțe [48].

121

Figura 7.2. Curba ipotetică de titrare a proteinelor, care arată modul în

care sarcina superficială a moleculei variază în funcție de pH.

7.2. Filtrare pe gel sau gel filtrarea. Filtrarea pe gel, mentionat ca cromatografia de excluziune

sterică – SEC, separă moleculele conform diferențe în dimensiune ca acestea trec printr-un mediu de filtrare în gel ambalat în o coloană. Spre deosebire de schimbători de ioni sau cromatografie de afinitate, moleculele nu se leagă de mediul pentru cromatografie. Prin urmare, un avantaj semnificativ de filtrare pe gel este că condițiile pot fi variate pentru a se potrivi tipului de probă sau cerințele pentru purificare ulterioară, analiză sau de depozitare fără a modifica separarea.

Filtrarea pe gel este un procedeu foarte potrivit pentru biomolecule care pot fi sensibile la modificarea pH-ului, concentrația ionilor metalici sau co-factori și condițiile dure de mediu. Separarea

Sarcina superfi

cială

122

poate fi realizată în prezența ionilor esențiali sau cofactori, detergenți, uree, guanidina clorhidrat, la tăria ionică ridicată sau scăzută, la 37°C sau în camera frigorifică conform cerințelor experimentului. Proteine purificate pot fi colectate în orice soluție tampon.

Acest capitol oferă sfaturi generale aplicabile pentru orice separare filtrare gel. Un pas cheie față de separarea de succes este selectarea mediului corect.

Pentru a realiza o separare, filtrare pe gel, mediul este ambalat într-o coloană, pentru a forma un strat tasat. Mediul este o matrice poroasă de particule sferice cu stabilitatea chimică și fizică și Inert (lipsit de reactivitate și proprietăți de adsorbție). Stratul tasat este echilibrat cu tampon care umple porii matricei și spațiul dintre particule. Lichide în interiorul porilor, sau faza staționară, este în echilibru cu lichidul din afara particulei, sau fază mobilă. Eșantioanele sunt eluați izocratic deci nu este nevoie de a utiliza diferite tampoane în timpul separare. Cu toate acestea, un pas de spălare folosind tampon de rulare este, de obicei, la sfârșitul unei separare a elimina molecule care poate au fost păstrate la coloană și a pregăti coloană pentru o nouă centrare.

Filtrare pe gel poate fi folosită direct după schimbul de ioni, cromatofocalizare, interacțiune hidrofobă, sau afinitate, deoarece compoziția tampon nu va afecta în general, separarea finală. Figura 7.3 ilustrează procedeul de separare de filtrare pe gel [47].

123

Figura 7.3. Procesul de gel filtrare. (A) Schema unui șirag de mărgele, cu o extindere de microscopie electronică. (B) Schema desen de molecule de probă difuzarea în porii șirag de mărgele. (C) descrierea grafică a separării I. Proba este aplicat pe coloană, II. Cea mai mică moleculă (galben) este mai întârziată decât cea mai mare molecula (roșu). III. Cea mai mare molecula este eluată prima din coloană. Banda lărgită produce diluarea semnificativă a

124

zonelor de proteine în timpul cromatografie. (D) cromatogramă schematică.

7.3. Interacțiunea hidrofobă Apa este un bun solvent pentru substanțele polare, și un solvent

slab pentru substanțele nepolare. În apă lichidă o majoritate a moleculelor de apă apar in grupuri datorită legături de hidrogen între ele însele (Figura 7.4). Deși timpul de semidezintegrare al clusterilor aquatici este foarte scurt, efectul net este o coeziune foarte puternică între moleculele de apă, reflectată, de exemplu, printr-un punct de fierbere ridicat.

Figura 7.4. Proprietățile de solubilizare ale apei apărute în capacitatea sa de a interacționa cu dipoli și pentru a forma legături de hidrogen.

La o interfață aer-apa, moleculele de apa se vor aranja într-o structură foarte ordonat. Aici, posibilitatea de a forma legături de hidrogen nu mai este în echilibru, dar este dominată de partea lichidă a interfeței. Acest lucru dă naștere la o structură ordonată, care se manifestă ca o tensiune de suprafață puternică. Orice lucru care influențează stabilitatea apei afectează și tensiunea superficială.

Atunci când o substanță hidrofobă, cum ar fi o proteină sau un ligand hidrofob este scufundat în apă se întâmplă ceva analog

125

fenomenului de tensiune superficială. Moleculele de apă nu pot ”umezi” suprafața substanței hidrofobe. În schimb, se formeaza un înveliș foarte ordonat în jurul substanței, din cauza incapacității lor de a forma legături de hidrogen în toate direcțiile (figura 7.5).

Figura 7.5. Apă structurată înconjoară suprafețele hidrofobe de liganzi și proteine. Substanțe hidrofobe sunt forțate să fuzioneze pentru a minimiza suprafața totală a acestor structuri (maximizarea entropiei). Sărurile sporesc interacțiunea hidrofobă. B) echilibru de interacțiune hidrofobă este controlat în special de concentrația de sare.

Per ansamblu, toate tehnicile cromatografice prezentate mai sus

sunt o modalitate foarte eficientă de a separa molecule anorganice, cȋt si macromoleculele organice de interes cercetatorilor preocupaţi de genetica moleculară, ȋn studii biomedicale, aplicaţii biotehnologice si nanotehnologiile viitorului. Aceasta editie are ca auditoriu-ţinta tineri specialişti ȋn biologia moleculară si genetica aplicată cu aspiraţii inalte spre realizări de performanta ȋn domeniul ales.

126

BIBLIOGRAFIA 1. Abba M.C., Gómez M.A., Golijow C.D., (2001). HLA-DQA1 allele

typing by nonisotopic PCR-LIS-SSCP. Braz. J. Med. Biol. Res. Jul;34(7):867-9.

2. Aluaş M., Simon S., (2012). Metode experimentale avansate pentru studiul si analiza bio-nano-sistemelor. Cluj-Napoca: Casa Cărţii de Ştiinţă, ISBN 978-606-17-0115-5.

3. Baas B. J., Denisov I. G., Sligar S. G., (2004). Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 în a nanoscale native bilayer environment, Archives of Biochemistry and Biophysics, 430(2), 218-28.

4. Baker S. E., Hopkins R. C., Blanchette C. D., Walsworth V. L., Sumbad R., Fischer N. O., Kuhn E. A., Coleman M., Chromy B. A., Letant S. E., Hoeprich P. D., Adams M. W., Henderson P. T., (2009). Hydrogen production by a hyperthermophilic membrane-bound hydrogenase în water-soluble nanolipoprotein particles. Journal of the American Chemical Society, 131(22), 7508-7509.

5. Baker P., Sawa Y., Shibata H., Sedelnikova S., Rice D., (1998). Analysis of the structure and substrate binding of Phormidium lapideum alanine dehydrogenase. Nature Structural Biology, 5, 561-67.

6. Barroso A, Dunner S, Cañón J., (1998). Technical note: Detection of bovine kappa-casein variants A, B, C, and E by means of polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP). J. Anim. Sci. Jun;76(6):1535-8.

7. Bayburt T. H., Grinkova Y. V., Sligar S. G., (2006). Assembly of single bacteriorhodopsin trimers în bilayer nanodiscs, Archives of Biochemistry and Biophysics, 450(2), 215-22.

8. Blanchette C. D., Cappuccio J. A., Kuhn E. A., Segelke B. W., Benner W. H., Chromy B. A., Coleman M. A., Bench G., Hoeprich P. D., Sulchek T. A., (2008). Atomic force microscopy differentiates discrete size distributions between membrane protein containing and empty nanolipoprotein particles, Biochimica et Biophysica Acta, 1788(3), 724-31.

9. Billard-Pomares T, Tenaillon O, Le Nagard H, Rouy Z, Cruveiller S, Médigue C, Arlet G, Denamur E, Branger C., (2011). Complete

127

nucleotide sequence of plasmid pTN48, encoding the CTX-M-14 extended-spectrum β-lactamase from an Escherichia coli O102-ST405 strain. Antimicrob. Agents Chemother.;55:1270-1273.

10. Boonstra B., Rathborne D. A., French C. E., Walker E. H., Bruce N. C., (2000). Cofactor regeneration by a soluble pyridine nucleotide transhydrogenase for biological production of hydromorphone. Applied Enviromental Microbiology, 66, 5161-66.

11. Brown T.A., (2002). Genomes. 2nd edition. Oxford: Wiley-Liss. 12. Cabello C. M., Warner B. Bair W. B., Bause A. S., Wondrak G. T.,

(2009). Antimelanoma activity of the redox dye DCPIP (2,6-Dichlorophenolindophenol) is antagonized by NQO1, Biochemical Pharmacology, 78(4), 344-54.

13. Caetano-Anollés G, Bassam BJ, Gresshoff PM., (1991). DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers. Biotechnology (NY). 1991 Jun; 9(6):553-7.

14. Chibata I., Tosa T., Sato T., (1976). Production of L-aspartic acid by microbial cells entrapped în polyacrylamide gels. Methods în Enzymology, 44, 739-746.

15. Conde J., de la Fuente J. M., Baptista P. V., (2010). RNA quantification using gold nanoprobes - application to cancer diagnostics. Journal of Nanobiotechnology, 8:5.

16. Croitoru V., Bucheli-Witschel M., Hägg P., Abdulkarim F., Isaksson L.A., (2004). Generation and characterization of functional mutants in the translation initiation factor IF1 of Escherichia coli. Eur. J. Biochem. Feb;271(3):534-44.

17. Croitoru V., Bucheli-Witschel M., Isaksson L.A., (2005). In vivo involvement of mutated initiation factor IF1 in gene expression control at the translational level. FEBS Lett. Feb 14;579(5):995-1000.

18. Croitoru V., Semrad K., Prenninger S., Rajkowitsch L., Vejen M., Laursen B.S., Sperling-Petersen H.U., Isaksson L.A., (2006). RNA chaperone activity of translation initiation factor IF1. Biochimie. Dec;88(12):1875-82

19. Dakin E.E., Avise J.C., (2004). Microsatellite null alleles in parentage analysis. Heredity (Edinb). Nov;93(5):504-9.

20. Deconttignies-Le Maréchal P., Calderon-Seguin R., Vandecasteele J.,P., Azerad R., (1979). Synthesis of L-tryptophan by immobilized

128

Escherichia coli cells. European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, 7, 33-44.

21. Delforge D., Devreese B., Dieu M., Delaivre E., Beeumen J., Remacle J., (1997). Identification of lysine 74 în pyruvate bineding of alanine dehydrogenase from Bacillus subtilis. Journal of Biological Chemistry, 272, 2276-84.

22. Ghosh M., Singh A. T., Xu W., Sulchek T., Gordon L. I., Ryan R. O., (2010). Curcumin nanodisks: formulation and characterization, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine.

23. Heaton MP, Harhay GP, Bennett GL, Stone RT, Grosse WM, Casas E, Keele JW, Smith TP, Chitko-McKown CG, Laegreid WW. (2002) Selection and use of SNP markers for animal identification and paternity analysis in U.S. beef cattle. Mamm. Genome. May;13(5):272-81.

24. Honorat A., Monot F., Ballerini D., (1990). Synthesis of L-alanine and L-valine by enzyme system from Bacillus megaterium. Enzyme and Microbial Technology, 12, 515-20.

25. Honorat-Pascal A., Monot F., Ballerini D., (1990). Coparative stady of the enzymatic synthesis of L-valine by purified enzymes, crude extract or permeabilized cells from Bacillus megaterium. Applied Microbiology and Biotechnology, 34, 236-41.

26. Holley R.W., Everett G.A., Madison J.T, Zamir A., (1965). Nucleotide Sequences In The Yeast Alanine Transfer Ribonucleic Acid. J. Biol. Chem. 240 (5): 2122–8.

27. Hummel W., Kula M-R., (1989). Dehydrogenases for the synthesis of chiral compounds. European Journal of Biochemistry, 184, 1-13.

28. Fischer N.O., Infante E., Ishikawa T., Blanchette C.D., Bourne N., Hoeprich P.D., Mason P.W., (2010). Conjugation to nickel-chelating nanolipoprotein particles increases the potency and efficacy of subunit vaccines to prevent West Nile encephalitis, Bioconjugate Chemistry, 21(6), 1018-22.

29. Fukui S., Ikeda S., Fujimura M., Yamada H., Kumagai H., (1974). Production of L-tryptophan, L-tyrosine and their analogues by immobilized tryptophanase and immobilized β-tyrosinase. European Journal of Applied Microbiology, 1, 25-39.

129

30. Fusee M., Swann W., Calton G., (1981). Immobilization of Escherichia coli cells containing aspartase activity with polyurethane and its application for L-aspartic acid production. Applied Enviromental Microbiology, 42, 672-76.

31. Fusee M., Weber J., (1984). Immobilization by polyurethane of Pseudomonas dacunhae cells containing L-aspartat β-decarboxylase activity and application to L-alanine production. Applied Enviromental Microbiology, 48, 694-98.

32. Iacobazzi V, Castegna A, Infantino V, Andria G.(2013). Mitochondrial DNA methylation as a next-generation biomarker and diagnostic tool. Mol. Genet. Metab. Sep-Oct;110(1-2):25-34.

33. Jeffreys A.J., Royle N.J., Patel I., Armour J.A., MacLeod A., Collick A., Gray I.C., Neumann R., Gibbs M., Crosier M., (1991). Principles and recent advances in human DNA fingerprinting. EXS.;58:1-19

34. Karsten W.E., Viola R.E., (1991). Kinetic studies of L-aspartase from Escherichia coli: pH-dependent activity changes. Archives of Biochemistry and Biophysics, 287, 60-67.

35. Katayama H., Wang J., Tama F., Chollet L., Gogol E. P., Collier R. J., Fisher M. T., (2010). Three-dimensional structure of the anthrax toxin pore inserted into lipid nanodiscs and lipid vesicles, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 107(8), 3453-57

36. Katoh R., Nagata S., Ozawa A., Ohshima T., Kamekura M., Misono H., (2003). Purification and characterization of leucine dehydrogenase from an alkaliphilic halophile, Natronobacterium magadii MS-3. Journal of Molecular Catalysis, 23, 231-38.

37. Köhler G, Milstein C. (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. Aug 7;256(5517):495-7.

38. Landegren U., (1996). The challengers to PCR: a proliferation of chain reactions. Curr Opin Biotechnol. 1996 Feb;7(1):95-7.

39. Liu Q., Liu A., Gao F., Weng S., Zhong G., Liu J., Lin X., Lin J.H., Chen X., (2011) Coupling technique of random amplified polymorphic DNA and nanoelectrochemical sensor for mapping pancreatic cancer genetic fingerprint. Int. J. Nanomedicine.;6:2933-9.

130

40. Maxam A.M, Gilbert W., (1992). A new method for sequencing DNA. 1977. Biotechnology.; 24:99-103.

41. Mondalek F. G., Ponnurangam S., Govind J., Houchen C., Anant S., Pantazis P., Rama P Ramanujam R. P., (2010). Inhibition of angiogenesis- and inflammation-inducing factors în human colon cancer cells in vitro and in ovo by free and nanoparticle-encapsulated redox dye, DCPIP, Journal of Nanobiotechnology, 8:17, 1-9.

42. Monot F., Benoit Y., Lemal J., Honorat A., Ballerini D., (1988). Simultaneous production of amino acid dehydrogenase and glucose dehydrogenase by Bacillus megaterium and their utilization for L-valine synthesis with NADH regeneration. Biocatalysis, 2, 161-74.

43. Mueller U.G, Wolfenbarger L.L. (1999). AFLP genotyping and fingerprinting. Trends Ecol. Evol. Oct;14(10):389-394.

44. Mullis K.B., (1990). Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction. Ann. Biol. Clin. (Paris).;48(8):579-82.

45. Nagata S., Misono H., Nagasaki S., Esaki N., Tanaka H., Soda K., (1989). Thermostable alanine dehydrogenase of Bacillus sp.DSM730: gene cloning, purification, and characterization. Biochemistry, 71, 559-63.

46. Nagata S., Tanizawa K., Esaki N., Sakamoto Y., Ohshima T., Tanaka H., Soda K., (1988). Gene cloning and sequence determination of leucine dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus and structural comparison with other NAD(P)+-dependent dehydrogenases. Biochemistry, 27, 9056-62.

47. Nagore L.I., Nadeau R.J., Guo Q., Jadhav Y.L., Jarrett H.W., Haskins W.E. (2013). Purification and characterization of transcription factors. Mass Spectrom. Rev. Sep;32(5):386-98

48. Nakatani N., Kozaki D., Mori M., Tanaka K. (2012). Recent progress and applications of ion-exclusion/ion-exchange chromatography for simultaneous determination of inorganic anions and cations. Anal. Sci.;28(9):845-52

49. Nakamura T., Mizuno S. (2010). The discovery of hepatocyte growth factor (HGF) and its significance for cell biology, life sciences and clinical medicine. Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci.;86(6):588-610

131

50. Norbert M., Brunhuber W., Blanchard J.S., (1994). The biochemistry and enzymology of amino acids dehydrogenases. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 29, 415-67.

51. Oda M. N., Hargreaves P. L., Beckstead J. A., Redmond K. A., van Antwerpen R., Ryan R. O., (2006). Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B, Journal of Lipid Research, 47(2), 260-67.

52. Ohshima T., Nishida N., Bakthavatsalam S., Kataoka K., Takada H., Yoshimura T., Esaki N., Soda K., (1994). The purification, characterization, cloning and sequencing of the gene for a halostable and thermostable leucine dehydrogenase from Thermoactinomyces intermedius. European Journal of Biochemistry, 222, 305-12.

53. Ohshima T., Wandrey C., Conrad D., (1988). Continous production of 3-fluoro-L-alanine with alanine dehydrogenase. Biotechnology and Bioengineering, 34, 394-97.

54. Ohshima T., Wandrey C., Kula M-R., Soda K., (1985). Impovement for L-leucine production în a continously operated enzyme membrane reactor. Biotechnology and Bioengineering, 26, 1616-18.

55. Oka M., Yang Y.S., Nagata S., Esaki N., Tanaka H., Soda K., (1989). Overproduction of thermostable leucine dehydrogenase of Bacillus stearothermophilus and its one-step purification from recombinant cells of Escherichia coli. Biotchnology and Applied Biochemestry, 11, 307-11.

56. Park D.J., (2004). 3' RACE LaNe: a simple and rapid fully nested PCR method to determine 3'-terminal cDNA sequence. Biotechniques. Apr;36(4):586-8, 590.

57. Patra H.K., Banerjee S., Chaudhuri U., Lahiri P., Dasgupta A., (2007). Cell selective response to gold nanoparticles, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 3, 111–19

58. Pierrel J. (2012). An RNA Phage Lab: MS2 in Walter Fiers' laboratory of molecular biology in Ghent, from genetic code to gene and genome, 1963-1976. J. Hist. Biol.;45(1):109-38

59. Rasmussen L.C., Jensen J.M., Croitoru V., Sperling-Petersen H.U., Mortensen K.K., (2007). Production and epitope characterization of mAbs specific for translation factor IF1. Biochem. Biophys. Res. Commun. Dec 7;364(1):72-8.

132

60. Ristic Z., Vitali M., Duci A., Goetze C., Kemnitz K., Zuschratter W., LillH., Bald D., (2009). Two-stimuli manipulation of a biological motor, Journal of Nanobiotechnology, 7:3.

61. Ryan R. O., (2010). Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein, Journal of Nanobiotechnology, 8:28.

62. Sanger F., Nicklen S., Coulson AR., (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Dec;74(12):5463-7.

63. Schenkel F.S., Miller S.P., Ye X., Moore S.S., Nkrumah J.D., Li C., Yu J., Mandell I.B., Wilton J.W., Williams J.L., (2005). Association of single nucleotide polymorphisms in the leptin gene with carcass and meat quality traits of beef cattle. J. Anim. Sci. Sep;83(9):2009-20.

64. Schütte H., Flossdorf J., Sahm H., Kul, M. R., (1976). Purification and properties of formaldehyde dehydrogenase and fromate dehydrogenase from Candida boidinii. European Journal of Biochemistry, 62, 151.

65. Siranosian J.K., Ireton, K., Grossamn D.A., (1993). Alanine dehydrogenase (ald) is required for normal sporulation in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 175, 6789-96.

66. Sondi I., and Salopek-Sondi B., (2004). Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E. coli as a model for Gram-negative bacteria, Journal of Colloid and Interface Science, 275, 177–82.

67. Speshock J. L., Murdock R. C., Braydich-Stolle L. K., Schrand A. M., Hussain S. M., (2010). Interaction of silver nanoparticles with Tacaribe virus, Journal of Nanobiotechnology, 8:19.

68. Starzl T.E., Fung J.J., (1986). ORTHOCLONE OKT3 in Treatment of Allografts Rejected Under Cyclosporine-Steroid Therapy. Transplant Proc. Aug;18(4):937-941.

69. Strebhardt K, Ullrich A. (2008) Paul Ehrlich's magic bullet concept: 100 years of progress. Nat. Rev. Cancer. Jun;8(6):473-80.

70. Tosa T., Sato T., Mori T., Chibata I., (1974). Basic studies for continous production of L-aspartic acid by immobilized Escherichia coli Cells. Applied Microbiology, 27, 886-89.

133

71. Vieira D. B., Carmona-Ribeiro A. M., (2008). Cationic nanoparticles for delivery of amphotericin B: preparation, characterization and activity in vitro, Journal of Nanobiotechnology, 6:6.

72. Vieira J, Messing J. (1982). The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene. Oct;19(3):259-68.

73. Weers P. M., Narayanaswami V., Ryan R. O., (2001). Modulation of the lipid binding properties of the N-terminal domain of human apolipoprotein E3, European Journal of Biochemistry, 268, 3728-35.

74. Welsh J., McClelland M., (1991). Genomic fingerprinting using arbitrarily primed PCR and a matrix of pairwise combinations of primers. Nucleic Acids Res. Oct 11;19(19):5275-9

75. Xu J., Croitoru V., Rutishauser D., Cheng Q., Arnér E.S., (2013). Wobble decoding by the Escherichia coli selenocysteine insertion machinery. Nucleic Acids Res. 2013 Aug 27. [Epub ahead of print].