1
SUPORT DE CURS
STRATEGII PRIVIND
PREVENIREA SI
REDUCEREA EFECTULUI
CONTAMINĂRII FUNGICE
ASUPRA CALITĂȚII
CEREALELOR ȘI A
SIGURANȚEI ALIMENTARE
Program Erasmus+ - Parteneriat strategic
Proiect Nr: 2017-1-RO01-KA202-037215
,,Conţinutul prezentului material reprezintă responsabilitatea exclusivă a autorilor, iar Agenţia Naţională şi Comisia Europeană nu sunt responsabile pentru modul în care va fi folosit conţinutul
informaţiei”.
2
AUTORI
1. PATRONATUL ROMAN DIN INDUSTRIA DE MORARIT, PANIFICATIE SI
PRODUSE FAINOASE ROMPAN - ROMANIA Dr. ing. Daniela Voica
Ing. Dana Avram Ing. Virgil Pavel
2. UNIVERSITET U NOVOM SADU - SERBIA
Dr. Ferenc Bagi Dr. Sanja Lazić Dr. Mila Grahovac Dr. Dragana Budakov Dr. Marija Bodroža Solarov Dr. Vera Stojšin
3. SVEUČILISTE JOSIPA JURJA STROSSMAYERA U OSIJEKU, FAKULTET AGROBIOTEHNIČKIH ZNANOSTI OSIJEK. – CROATIA
Prof. KAROLINA VRANDEČIĆ Prof. JASENKA ĆOSIĆ Prof. ANITA LIŠKA Prof. JELENA ILIĆ
4. UNIVERSITATEA DE STIINTE AGRICOLE SI MEDICINA VETERINARA A BANATULUI „REGELE MIHAI I AL ROMANIEI” – TIMISOARA
Prof. ALEXA ERSILIA Prof. RADULOV ISIDORA Conf. SUMALAN RENATA Prof. POP GEORGETA Asist. Monica NEGREA
5. UNIVERSITA DEGLI STUDI DI BARI ALDO MORO – ITALY
Dr. STEFANIA POLLASTRO Prof. F. FARETRA Dr. R.M. DE MICCOLIS ANGELINI Prof. DE LILLO Dr. GIUSEPPE BARI Prof. MARIA DE ANGELIS Dr. PASQUALE FILANNINO
3
SUMAR
MODULE Pagina I MODULUL 1 – MĂSURI DE PREVENIRE PENTRU
CONTAMINAREA FUNGICĂ
6
1. CAPITOLUL 1. PRINCIPALELE MICOTOXINE PRODUSE DE FUNGI, ÎN CÂMP ȘI ÎN DEPOZITE
6
1.1 Introducere 6 1.2 Caracteristicile morfologice și de cultură ale principalelor fungi producătoare de micotoxine
7
1.3 Metode de determinare a fungiilor principale producătoare de micotoxine
10
1.4 Micotoxinele principale produse în cereale 14 1.5 Condiții de mediu care influențează dezvoltarea fungilor și producerea de micotoxine
18
1.6 Producerea aflatoxinelor și producerea fungilor 18 1.7 Producerea ochratoxinei și producerea fungilor 19 1.8 Producerea citrininei și producerea fungilor 19 1.9 Producerea fumonizinei și producerea fungilor 19 1.10 Producerea zearalenonei și producerea fungilor 20 1.11 Producerea Trichocetenelor și producerea fungilor
20
2. Capitolul 2. STRATEGII RELEVANTE LA PRE-RECOLTARE, RECOLTARE SI POST-RECOLTARE PENTRU REDUCEREA INFECTIEI CU FUNGI PRODUCATORI DE MICOTOXINE IN CEREALE, ALIMENTE DERIVATE DIN CEREALE SI FURAJE
21
2.1 Introducere 21 2.2 Factori de mediu 22 2.3 Rotatia culturilor 22 2.4 Managementul reziduurilor (solului) 23 2.5 Fertilizare 24 2.6 Plantarea de semințe sănătoase 24 2.7 Influența stresului hidric asupra dezvoltării bolilor 25 2.8 Culturi rezistente genetic 25 2.9 Produse pentru protecția plantelor 26 2.10 Măsuri preventive împotriva atacului fungilor asupra
cerealelor depozitate 28
2.10.1 Grupuri ecologice de fungi ale cerealelor 28 2.10.2 Factori ce afectează dezvoltarea mucegaiurilor de cereale 29 2.10.3 Temperatura cerealelor și umiditatea 30 2.10.4 Concentrația de dioxid de carbon (CO2) 30 2.10.5 Prezența insectelor în produsele depozitate 30
4
2.10.6 Tratament preventinv impotriva deteriorii datorate mucegaiurilor – uscarea cerealelor umede
31
2.10.7 Prevenirea atacurilor insectelor 31 2.11 Concluzii 32
3. Capitolul 3. METODE OFICIALE PENTRU EȘANTIONAREA ȘI CUANTIFICAREA MICOTOXINELOR ÎN CEREALE
36
3.1 Introducere 36 3.2 Metode pentru determinarea conținutului de micotoxine 40 3.2.1 Cromatografia de gaze (CG) 41 3.2.2 Cromatografia lichidă (CL) 41 3.2.3 Cromatografia lichidă de performanță înaltă (HPLC) 41 3.2.4 Cromatografia în strat subțire 42 3.2.5 Metode bazate pe anticorpi 43 3.2.6 ELISA – Test privind imuni-absorbția enzimelor 43 3.2.7 Testul fluxului lateral 44 3.2.8 Test fluorometric 45 3.2.9 Tehnica minicoloanelor 45 3.2.10 Fluorescență în soluție 45 3.2.11 Imunoanaliză de polarizare prin fluorescență 45 3.3. Alte metode utilizate în cercetare 46 3.3.1 Fluorescență indusă cu ajutorul laser-ului (LIF) 46 3.3.2 Spectroscopie aproape de infraroșu (NIR) 46 3.3.3 Tehnologie Microarray 46 3.3.4 Tehnologie Luminex xMAP 46 3.3.5 Tehnici cu biosenzori 46 3.3.6. Nas electronic 47 3.3.7. Niosenzori pe baza de ADN si aptameri 47
II MODULUL II – METODE DE DECONTAMINARE 48 4. Capitolul 4. METODE DE DECONTAMINARE A
PRODUSELOR DIN CEREALE 48
4.1 Introducere 48 4.2. Metode fizice pentru detoxifierea micotoxinelor 49 4.2.1. Metode ce conduc la eliminarea fracțiilor alterate 49 4.2.2. Metode ce determină denaturarea toxinelor 51 4.3. Metode chimice pentru detoxifierea micotoxinelor 53 4.3.1. Tratament cu acizi și baze 53 4.3.2. Amoniere 53 4.3.3. Nixtamalizare 54 4.3.4. Decontaminarea chimică utilizând gaz de dioxid de sulf 54 4.4.Adsorbția toxinelor 55 4.4.1. Adsorbția toxinelor pe argilă 55 4.4.2. Adsorbția toxinelor pe carbon activ 57 4.3.3. Adsorbția pe rășini 57 4.4. Decontaminare biologică 58
5
4.4.1. Controlul microbiologic al aflatoxinelor (AFB1) 59 4.4.2. Controlul microbiologic al Deoxinivalenolului (DON) 60 4.4.3. Controlul microbiologic al Ochratoxinelor 61 4.4.4. Controlul microbiologic al Fumonizinelor 62 4.4.5. Controlul microbiologic al Zearalenonei 62
III MODULUL III – TEHNOLOGII DE PROCESARE A CEREALELOR PENTRU MINIMIZAREA INTRARII MICOTOXINELOR IN LANTUL ALIMENTAR
63
5. Capitolul 5. TEHNOLOGII DE PROCESARE PENTRU MINIMIZAREA INTRĂRII MICOTOXINELOR ÎN LANȚUL ALIMENTAR/FURAJER
63
5.1. Procesul tehnologic în industria de morărit și panificație 63 5.1.1. Măcinarea, decojirea cerealelor, înmuierea și separarea
fracțiilor 63
5.1.2. Procese tehnice 65 5.2. Procese tehnologice 68
IV MODULUL IV – DEZVOLTAREA SISTEMELOR DE CONTROL INTEGRAT PENTRU CEREALE (HACCP: ANALIZA RISCURILOR IN PUNCTELE CRITICE DE CONTROL)
72
6. Capitolul 6. DEZVOLTAREA SISTEMELOR INTEGRATE DE CONTROL (HACCP: ANALIZA RISCURILOR ÎN PUNCTE CRITICE DE CONTROL) ÎN CEREALE SI PLANTE MEDICINALE
72
6.1 Introducere 72 6.2 Practici recomandate 72 6.2.1 Practici recomandate înainte de recoltare 74 6.2.2 Practici recomandate în timpul recoltării 76 6.2.3 Practici recomanddate în timpul uscării cerealelor 77 6.2.4 Practici recomandate de depozitare pentru cereale 77 6.2.5 Practici recomandate în timpul transportului produselor 77 6.2.6 Evitarea pătrunderii insectelor, a păsărilor ți a rozătoarelor în
timpul transportului 78
6.3 Măsuri de control 78 6.4 Determinarea punctelor critice de control – PCC 79 6.5 Stabilirea limitelor critice 80 6.6 Stabilirea sistemelor de monitorizare pentru PCC 81 6.7 Stabilirea actiunilor corective în cazul abaterilor de la limitele
critice 82
6.8 Tipuri de documente 83 6.9 Mentinerea documentelor sub control 84 7. Capitolul 7. LEGISLAȚIA COMISIEI EUROPENE
PRIVIND CONTAMINAREA CEREALELOR CU FUNGI ȘI MICOTOXINE
85
8. Referințe 94
6
MODULUL I – MĂSURI DE PREVENIRE PENTRU CONTAMINAREA FUNGICĂ
1.1 Introducere Micotoxinele sunt produşi metabolici secundari ai fungilor, fiind toxice pentru animale și oameni [1]. Aceşti produşi reprezintă contaminanți ai alimentelor și hranei pentru animale. Consumul de alimente și furaje contaminate cu micotoxine poate provoca probleme grave de sănătate la animale și la oameni, deoarece unele dintre ele s-au dovedit a fi cancerigene, vasoactive și dăunătoare sistemului nervos central [2]. Contaminarea cu microorganisme a produselor agricole este de importanță majoră, deoarece afectează siguranța alimentelor și a hranei pentru animale, securitatea alimentară și comerțul internațional [3]. În mod obișnuit, ciupercile producătoare de micotoxine, care contaminează produsele agricole sunt împărțite în două grupe:
1. Fungi de "câmp" care infectează cerealele în timpul dezvoltării plantelor în câmp (de exemplu, Fusarium )
2. Fungi de "Depozit" care contaminează boabele în timpul depozitării (de exemplu, Aspergillus, Penicillium )
Cu toate acestea, această clasificare nu este strictă, deoarece se bazează pe condițiile de mediu care sunt necesare pentru dezvoltarea fungilor. Unele ciuperci, cum ar fi Aspergillus, sunt clasificate ca fungi de depozitare în zone temperate, dar cu capacitatea de a infecta boabele în camp, dacă există o creștere a temperaturii [4]. Cei mai cunoscuți și cei mai importanți producători de micotoxine sunt ciupercile (fungi) din trei genuri: Aspergillus, Fusarium și Penicillium [1, 5].
a) Genul Aspergillus
Aspergillus este un gen mare, incluzând mai mult de 100 de specii. Unele dintre aceste specii sunt prezente în mod obișnuit în sol sau în vegetația care se descompune, în timp ce altele pot provoca boli ale plantelor și daune asupra produselor depozitate. Multe specii produc micotoxine periculoase pentru sănătatea organismului animal și uman. Specia Aspergillus poate contamina produsele vegetale cu micotoxine în timpul perioadei de recoltare, la recoltare, depozitare și procesare [6]. Cele mai semnificative specii micotoxigene sunt:
1) Specii care produc aflatoxine (AF):
7
- Aspergillus flavus este cel mai comun producător de aflatoxine. Acesta poate fi găsit
într-o gamă largă de produse agricole, în special în porumb, arahide și semințe de bumbac. Cu toate acestea, numai aproximativ 40% din fungii izolaţi, produc aflatoxine. Diferitele tulpini de A. flavus pot produce 18 aflatoxine diferite, dar de obicei sunt produse doar aflatoxinele B (AFB) [5, 7].
- Aspergillus parasiticus este mai puțin cunoscut decât A. flavus, dar aproape toate izolatele cunoscute sunt micotoxigene. Acestea pot produce aflatoxinele B1, B2, G1 și G2 [5, 7].
2) Specii care produc ochratoxina A (OTA):
- Aspergillus ochraceus și speciile conexe. Pentru o lungă perioadă de timp, A.
ochraceus a fost considerat cel mai comun și persistent producător de OTA dintre toate speciile Aspergillus. Recent, două specii noi, Aspergillus westerdijkiae și
Aspergillus steynii, au fost separate de A. ochraceus și s-au dovedit a fi producători de OTA mult mai puternici [1, 8]. OTA se găsește în diferite produse agricole, cum ar fi porumb, grâu, orz, făină, fasole, mazăre, ovăz, secară și în special în cafea și vin [5, 9, 10].
- Aspergillus carbonarius și Aspergillus niger . Aproape toate izolatele de A.
carbonarius produc OTA, dar într-o măsură diferită. Pe de altă parte, doar 1-2% din izolatele A. niger produc OTA, deși A. niger este o specie foarte frecventă. Prin urmare, izolarea fungilor de A. niger din produsele alimentare nu este o dovadă a prezenței OTA în acestea [11].
b) Genul Penicillium Genul Penicillium este format din peste 200 de specii și aproximativ 100 dintre acestea produc micotoxine [11, 12]. Cele mai semnificative specii care produc micotoxine în timpul depozitării, sunt: 1) Specii care produc OTA: - Penicillium verrucosum este cel mai important producător de OTA în cereale cum ar fi grâul, orzul, ovăzul și secara. Este frecvent prezent în zone cu climă temperată și rece [13]. 2) Specii care produc citrinina: - Penicillium citrinum poate fi prezent în mod natural în aer, sol, rizosferă și apă. Este bine adaptat la diverse condiții ecologice și poate contamina porumbul, grâul, secara, orzul, ovăzul și orezul [1, 14, 15].
c) Genul Fusarium
Speciile de Fusarium sunt fungi patogeni semnificativi ai plantelor, care provoacă ofiliri, decolorări, necrozări ale rădăcinilor şi cancere la multe specii de plante în multe specii de plante. Ele pot contamina produsele agricole cu micotoxine în câmp [16].
8
Cele mai semnificative specii sunt:
1) Specii care produc Fumonisina - Fusarium verticillioides este agentul cauzal al fuzariozei și putregaiului la porumb. - Fusarium proliferatum are o gamă remarcabil de mare de gazde. Pe lângă porumb,
afectează sparanghelul, smochinele, ceapa, grâul, palmierul etc. [17]. 2) Speciile care produc Zearalenona (ZEA) și Tricotecene -Deoxynivalenol (DON)):
- Fusarium graminearum provoacă mălura la boabele de cereal mici, în special grâu, orz și triticale. Este cea mai comună specie toxicogenă a specie Fusarium și produce micotoxine semnificative: deoxynivalenol (DON) și zearalenonă (ZEA)
- Fusarium culmorum , ca F. graminearum, provoacă albirea spicelor la speciile de graminee și produc micotoxinele DON și ZEA.
3) Specii care produc Tricotecene: - Fusarium sporotrichioides este prezent în întreaga lume și produce toxina T2. Poate
contamina grâul, porumbul, orzul, ovăzul, secara și alte culturi [12, 18].
1.2 Caracteristicile morfologice și culturale ale principalilor fungi producători de micotoxine
Genul Aspergillus
Culturile fungice Aspergillus se reproduc prin conidii formate din celule alungite numite fialide, care sunt formate în grupuri strânse în jurul vârfurilor umflate (vezicule) ale tulpinilor lungi (sterigme) care pot avea celule suport (metule). Cele mai multe specii cresc și sporulează bine pe medii sintetice. Coloniile pot fi negre, galben, maro, alb sau verde [11, 19].
Cercetătorii Pitt și Hocking (2009) în lucrarea “Fungi and Food Spoilage” descriu fungii din genul Aspergillus crescute pe agar pe bază de extract de drojdie Czapek (CYA) și agar pe bază de extract de malț (MEA) la temperatura de 25 ⁰C și CYA la 37 ⁰C timp de 7 zile [20].
Aspergillus flavus și speciile derivate se dezvoltă ușor pe orice mediu antibacterian cu inhibitori adecvați pentru restricționarea răspândirii coloniilor. Cel mai favorabil mediu este Dichloran Rose Bengal chloramphenicol agar (DRBC) sau Dichloran 18 agar cu adaus de 18% glicerol (DG18) [19, 20].
Coloniile de A. flavus pe mediul CYA sunt gri-verzui, cateodată galbene devenind verzi pe măsura învechirii atingand un diametru de 60-70 mm. Coloniile crescute pe MEA sunt asemanatoare în ce priveste culoarea dar mai puțin dense decât cele crescute pe mediul CYA, putând fi generați scleroti sferici de un diametru cuprins între 400-800 µm. Veziculele sunt sferice pe suprafața lor putându-se forma sterigme sau metule. Cu toate acestea, metulele nu sunt prezente în unele izolate. Conidiile de formă sferică sau aproape sferică au diametrul de 3,5-5,0 µm și pereții subțiri, fin ab și sau rar. Conidiile sunt în general sferice de 3.5-5.0 µm în diametru cu pereți subțiri si suprafața ușor rugoasă, mai rar netedă.
Coloniile de Aspergillus parasiticus sunt de culoare galben verzui-închis. Ocazional formează scleroți sferici cu un diametru cuprins între 400-800 µm. Veziculele sunt sferice, în
9
mod obisnuit fară metule. În general doar 20 % din izolate prezinta metule dispuse pe vezicule, conidiile fiind sferice cu pereti groși și rugoși.
Aspergillus ochraceus și speciile derivate (A. westerdijkiae and A. steynii) sunt specii xerofile si cresc lent pe medii cu coeficient ridicat de apa activă (aw) ca atare Potato dextrose agar PDA (cartof-dextroză-agar), sau alte medii similare nu sunt recomandate.
Mediul DG18 ofera rezultate mai bune. Aspergillus ochraceus pe mediul CYA are o crestere densă cu colonii galben deschis -aurii cu diametru între 40-55 mm. Pe mediul MEA coloniile sunt similare, usor mai dispersate.
Veziculele sunt sferice cu diametru între 25-50 µm. Sunt prezente și metule. Conidiile sunt sferice cu diametru de 3.5-5.0 µm având pereți netezi sau ușor rugoși. Aspergillus ochraceus creste intensiv la 37⁰C, comparativ cu A. westerdijkiae and A. steynii. Conidiile produse de A.
westerdijkiae sunt conidii sferice cu pereti fin rugoși în timp ce la A. steynii conidiile au formă ellipsoidală cu pereții netezi.
Aspergillus carbonarius și speciile derivate se dezvolta bine pe orice mediu antibacterial cu inhibitori care vor împiedica răspândirea coloniilor, cum ar fi DRBC sau DG18 [11, 19]. Aspergillus carbonarius crește rapid pe mediul CYA formand colonii negre, cu diametre de 60 mm sau mai mult, în mod normal ocupând întreaga suprafață a cutiei Petri. Pe mediul MEA, coloniile sunt similare, dar mai mici de 50-60 mm diametru. Veziculele sunt sferice cu diametre cuprinse între 60-85 µm. Conidiile sunt negre, sferice, cu diametru între 7-10 µm și pereți foarte rugoși.
Aspergillus niger poate forma colonii mari negre pe mediul antibacterian CYA, de obicei, pe întreaga suprafață a cutiei Petri, diametrul coloniei fiind mai mare de 60 mm. Colonii similare dar mai puțin dense (30-60 mm) se formează pe mediul MEA. Veziculele sunt sferice, 50-75µm în diametru, având metule. Conidiile sunt sferice cu 4-5 µm în diametru, de culoare maronie, cu pereții rugoși căteodată cu dungi.
Genul Penicillium
Penicillium este un gen de fungi comun, răspândit pe scară largă. Este caracterizat de
conidii sferice formate de fialide generate de grupuri de stipele scurte cu sau fără una sau două rânduri de celule suport (metule și rami). Conidiile sunt verzi și de obicei imprimă culoarea coloniei fungice pe mediile de identificare, dar uneori și alți pigmenți sunt prezenți fiind sintetizați de miceliu și secretați de colonii [11].
Descrierea fungilor Penicillium crescuți pe mediul MEA la 25 °C și CYA la 25 °C și 37 °C pentru 7 zile este redata în lucrarea “Fungi and Food Spoilage” de către autorii Pitt and Hocking (2009) [20].
Penicillium verrucosum pe mediul de cultura CYA generează coloni cu diametrul cuprins între 15-25 mm. Conidiile sunt de obicei rotunde cu pereți netezi, de 2.5-3.0 µm diametru, gri-verzui pana la verde șters. Stipelele au pereți rugoși, fialidele pot fi susținute de două sau trei celule suport. Miceliul este alb, în timp ce pe verso este galben-maroniu până la maro închis. Pe mediul MEA, coloniile sunt de 12-20 mm diametru; similar creste pe mediul CYA dar pe verso culoarea e maro șters sau oliv. Nu a fost identificată creștere la 370 C.
Penicillium citrinum pe mediul CYA formeaza colonii cu diametru de 27-33 mm la 25 ⁰C, cu o creștere slabă la 37 ⁰C (2-12 mm diametru). Miceliul este alb până la gri-oranj iar pe verso colonia este maro-gălbuie. Adesea produce și pigment solubil gălbui-brun-roșcat pe mediul antibacterian. Pe mediul MEA coloniile sunt mai mici, 18-25 mm diametru, cu exudate gri-
10
albăstrii. Conidiile sunt sferice până la subsferice cu pereți netezi sau usor rugoși de culoare gri-verzui până la albastru –verzui cu diametru de 2.2-3.0 µm. Stipelele sunt netede, fiind prezente și metule ramificate(3-5). [21]. Genul Fusarium
Fungul Fusarium produce trei tipuri de spori: macroconidii, microconidii, și clamidospori. Macroconidiile sunt spori mari în formă de semilună multiseptați, care sunt produși de monofialide (fialide cu o singură zonă de eliberare de spori) sau polifialide (fialide cu deschideri multiple pentru eliberare de spori) în miceliul aerian sau în sporodochie (structură specializată cu aspect de perniță formată din monofialide scurte). Microcondiile diferitelor specii variază din punct de vedere al formei și dimensiunii. De obicei, acestea sunt produse în miceliul aerian în grupuri sau lanțuri, atât în monofialide cât și în polifialide. Clamidosporii sunt sporii asexuali derivați din hife, cu pereți groși și cu un conținut ridicat de lipide, capabili să supraviețuiască unor condiții severe [22].Mediile comerciale preparate pentru drojdii și mucegaiuri cu o activitate ridicată a apei, cum ar fi Agarul Carnation Leaf-piece (CLA), promovează creșterea speciilor de Fusarium, în timp ce mediile mai bogate, cum ar fi PDA, sunt potrivite pentru stimularea producției de pigmenți. Pitt și Hocking (2009) descriu speciile de
Fusarium cultivate pe CLA și PDA la 25 ° C [20]. Fusarium verticillioides pe PDA la 25 ° C are o creștere moderat rapidă; coloniile au
diametrul de 3,5-5,5 cm în 4 zile. Produce miceliu aerian abundent și revers este purpuriu. Pe CLA, sporodochia este slab formată sau nu este prezentă deloc. Macroconidiile sunt de obicei de 30-45 µm lungime, 3-5 septate, aproape drepte, și mai largi la mijloc, rareori formate în cultură. Microconidiile sunt elipsoidale, 0-1septate , formate abundent în miceliul aerian pe ramuri de conidiofori din monofialide în formă de lanțuri lungi înfășurate.
Fusarium proliferatum pe PDA la 25 ° C crește moderat rapid, formând colonii de 3,5-5,5 cm în diametru în 4 zile. Miceliul aerian este abundent, de culoare albă până la roz sau de culoare portocalie deschisă iar revers este purpuriu. Pe CLA, sporodochia nu este de obicei prezentă. Macroconidia este în mod normal aproape dreaptă, 3-5 septată și cea mai largă la mijloc. Microconidia este ovoidă sau elipsoidală, 0-1 septată , produsă în lanțuri scurte, mai ales din monofialide, dar până la 20% formată din polifialide.
Fusarium graminearum pe PDA la 25 ° C crește rapid și formează colonii de 7,5-9,0 cm în diametru în 4 zile. Miceliul aerian este abundent, roșu sau galben-maroniu. În mod normal, reversul este roșu, foarte rar portocaliu-maroniu. Sporodochia este aproape incoloră pe CLA. Conidioforii sunt ramificați, terminându-se cu 1-4 fialide. Macroconidia are lungimea de 40-60 µm, septată 4-6 , de obicei dreaptă. Microconidia nu este produsă. Peritecii sunt adesea produse pe CLA. Sunt aproape negre, cu diametrul de 200 µm și care descarcă nori portocalii de ascospori. Ascosporii sunt de obicei fusiformi sau în formă de fasole, de culoare maronie, de 20-30 µm.
Fusarium culmorum pe PDA la 25 ° C crește rapid, formând colonii de 7,5-9,0 cm în diametru în 4 zile. Miceliul aerial poate fi alb până la portocaliu, maro sau roșu. Reversul este
roșu, foarte rar maro sau bronz. La CLA se formează sporodochii roșu-maro sau portocalii. Macroconidiile sunt groase, în formă de pene, mai mari în zona de mijloc, septate 3-6, de 30-45 µm lungime. Microconidia este absentă.
11
Fusarium sporotrichioides pe PDA crește rapid și formează miceliu dens, alb-roșu palid care se întunecă cu vârsta. Inițial este roșu. Pe CLA, clamidosporii se formează abundent. Ei sunt la început portocalii, dar mai întunecați cu vârsta. Macroconidiile au o celulă apicală curbată, septate 3-5. Microconidia poate fi 0-septată și în formă de pară, sau 1-septată și fusoidă. Atât monofialidele cât și polifialidele pot fi prezente.
1.3 Metodele de determinare a principalilor fungi producători de micotoxine a) Genul Aspergillus
Genul Aspergillus este alcătuit din șapte subgenuri care sunt subdivizate în mai multe secțiuni [23]. Pentru o lungă perioadă de timp, identificarea speciei Aspergillus s-a bazat exclusiv pe caracteristicile morfologice, însă în zilele noastre se bazează mai mult pe tehnici moderne, cum ar fi caracterizarea moleculară și chemotaxonomică. Explicația detaliată privind determinarea speciei Aspergillus este dată în "Filogenia, identificarea și nomenclatura genului Aspergillus" de Samson și colab. (2014) și este rezumat mai jos [19].
Caracterele morfologice
Speciile de Aspergillus pot fi caracterizate pe baza caracteristicilor coloniilor: ratele de creștere a coloniilor, textura, gradul de sporulare, culoarea miceliei, inversarea coloniilor, producția și caracteristicile sporilor, sclerotia, cleistotecia și celulele Hülle, pigmenții și exudații. Caracteristicile conidioporilor care sunt importante pentru identificare includ forma capetelor conidiene, prezența sau absența metule pe vezicule, culoarea, dimensiunea, forma și textura stipelor, veziculelor, metulelor, fialidelor, conidiilor și celulelor Hülle, precum și a cleistoteciilor, ascilor și ascosporilor. În plus, pentru cleistotecie, caracteristicile distinctive importante includ dezvoltarea ascomatei și modul în care sunt realizați pereții. Mărimea și morfologia ascosporilor, în special aspectul lor (aripi, brăzdate) sunt elementele semnificative.
Mediile recomandate ca standard pentru identificarea Aspergillus sunt CYA și MEA (Oxoid sau Difco). Suplimentele suplimentare care pot fi utilizate pentru a examina variația caracterelor morfologice sunt agarul Czapek (CZ), 20% zaharoză CYA (CY20S), 20% zaharoză MEA (MEA20S), agar de zaharoză de extract de drojdie (DA), DG18, agar de ovăz ), Agar de zaharoză creatină (CREA).Suspensiile de spori pentru inoculare pot fi preparate în tampon SS de glicerol 30% sau în agar 0,2% și soluție Tween 80 0,05%.
Preparatul inocul este transferat în plăci prin metaoda de spotare în trei puncte (0,5-1 µl pe spot).Plăcile CYA inoculate trebuie incubate la 25 ° C, 30 ° C și 37 ° C și plăcile MEA la 25 ° C timp de 7 zile, fără parafilm. După această perioadă, se pot evalua caracterele morfologice. Cu toate acestea, pentru a observa anumite caracteristici cum ar fi sclerotia sau ascomata, este adesea necesară o perioadă mai lungă de incubare.
Observațiile microscopice se efectuează după 7-10 zile la conidiofori pe MEA, deși pot fi utilizate și alte medii. Acidul lactic (70%) sau soluția Shear pot fi utilizate pentru etalare, în timp ce lactofenolul nu, datorită efectului său coroziv și toxic.
12
A. flavus și A. parasiticus pot fi recunoscute prin creșterea rapidă la toate cele trei temperaturi (25 ° C, 30 ° C și 37 ° C) și culoarea conidiilor lor: verde-gălbui deschis. Aceste specii pot fi diferențiate în funcție de forma și mărimea conidiană. Conidiile de A. flavus nu sunt uniforme în formă și dimensiune și au pereți subțiri, netezi până la moderat. Dimpotrivă, A. parasiticus produce conidii sferice cu ziduri groase. În plus, veziculele de A. flavus sunt mai mari (până la 50µm) și de obicei cu metulae, în timp ce A. parasiticus are vezicule mai mici (de până la 30µm), de regulă fără metulae [11,24]. A. ochraceus și speciile înrudite pot fi determinate datorită faptului că ele cresc relativ lent pe CYA și MEA, formând colonii de culoare maro deschis până la galben. A. ochraceus crește bine la 37 ° C, în timp ce A. westerdijkiae și A. steynii nu cresc, prin urmare, acest lucru poate fi folosit ca un caracter distinctiv între ele. În plus, A. westerdijkiae produce conidii sferice cu pereți fin groși, în timp ce A. steynii formează conidii elipsoidale cu pereți netezi [11, 24]. A. carbonarius și A. niger se disting ușor de alte specii, datorită creșterii rapide a acestora și a conidiilor negre de culoare maroniu închis până la negru. Conidiile de A. niger sunt mai mici (4-5 µm în diametru) decât conidiile de A. carbonarius (diametrul de 7 µm sau mai mare). În plus, A. niger se dezvoltă mai repede (diametrul coloniilor: 60 mm sau mai mult) decât A. carbonarius
(diametrul coloniilor: până la 20 mm) atunci când este crescut pe CYA, timp de 7 zile la temperatura 37 ° C [11,24].
Tehnici moleculare
Codul de bare oficial al ADN-ului pentru fungi, regiunea rADN de transcriere internă (ITS1-5.8S-ITS2) nu poate fi folosit[ pentru a distinge între toate speciile de Aspergillus deoarece există o lipsă de variație [19, 25]. Prin urmare, este nevoie de markeri suplimentari. Teoretic pot fi utilizate calmodulina (CaM), tubulina β (BenA) sau cea de-a doua subunitate cea mai mare a ARN polimerazei II (RPB2). Cu toate acestea, există unele dificultăți: RPB2 este dificil de amplificat, în timp ce BenA șiCaM poate duce la amplificarea genelor paralogice [19, 26].
Cu toate acestea, CaM este ușor de amplificat și se poate distinge între toate speciile de
Aspergillus (cu excepția A. elegans și A. steynii, dar ITS distinge între ele) [19, 27]. Mai mult decât atât, baza de date a secvenței CaM este aproape completă pentru toate speciile, prin urmare CaM este recomandată pentru a fi utilizată ca marker temporar secundar pentru Aspergillus [19].
b) Genul Penicillium Speciile Penicillium se pot distinge pe baza morfologiei, filogenezei multigenelor și profilării extroliților. Procedurile de determinare sunt descrise în "Identificarea și nomenclatura genului Penicillium" de Visagie și colab. (2014) și sunt rezumate mai jos [28].
13
Caracterele morfologice
Caracteristicile importante pentru identificarea speciilor includ caracterele și diametrele coloniilor pe diferite suporturi. Mediile standard de identificare pentru Penicillium sunt CYA și MEA (Oxoid sau Difco). Caracterele taxonomice suplimentare pot fi examinate pe alte suporturi: CZ, DA (pentru profilarea extroliților), OA (pentru reproducere sexuală), CREA (pentru producția acidă), DG18 și CYAS (pentru rate de creștere pe medii cu activitate redusă a apei).Se poate adăuga sulfat de zinc și sulfat de cupru pentru a obține o culoare conidiană constantă (1 g ZnS04.7H2O și 0,5 g CuSO4.5H2O în 100 ml apă distilată).
Mediile preparate (20 ml) se toarnă în plăci Petri de 90 mm. Suspensiile de spori sunt în soluții semi-solide de agar (0,2% agar și 0,05% Tween80). Inoculările cu suspensie se fac în trei spotări (0,5-1 µl pe spot). Mediile inoculate sunt păstrate fără parafilm timp de 7 zile la 25 ° C, cu CYA suplimentar la 30 și 37 ° C.
Caracteristicile examinate după 7 zile de incubare includ: diametrul coloniei, textura coloniei, gradul de sporulare, culoarea conidiei, abundența, textura și culoarea miceliului, prezența și culorile pigmenților, culoarea coloniilor în revers, a gradului de creștere și a producției de acid (în unele specii producția de acid urmată de producția de bază) pe CREA.
Caracterele microscopice semnificative pentru identificare includ numărul de puncte de ramificație între stipe și fialide, dimensiunea, forma și textura stipilor, vezicule, metulae / ramificații (atunci când sunt prezente), fialide, conidii, cleistotecii, asci și ascosporii (când sunt prezenți). Preparatele sunt făcute din colonii pe MEA. Acidul lactic sau soluția Shear sunt utilizate ca lichide de etalare, în timp ce etanol 70% este utilizat pentru spălarea excesului de conidii. Caracteristicilor morfologice ale P. verrucosum sunt: creșterea lentă pe CYA și chiar mai lentă pe MEA, fără creștere la 37 ° C. Conidiile sunt verzi, fără alte pigmentări vizibile. Stipii sunt cu pereți aspri [20]. Caracteristicile ale Penicillium citrinum sunt grupuri de 3-5 metulae, creștere insuficientă pe CYA la 37 ° C (2-12 mm diametru), producție de pigment galben în revers, producție de pigment solubil pe CYA, conidii sferice, pereți netezi. [21, 24]. Tehnici moleculare
ITS, fiind cel mai comun marker secvențiat pentru fungi, poate fi utilizat pentru atribuirea izolatelor de Penicillium în secțiuni sau specii complexe, dar nu este suficient de variabilă pentru caracterizarea tuturor speciilor înrudite. BenA, CaM și RPB2 sunt propuse ca markeri secundari de identificare. PCR standard poate fi utilizat pentru amplificarea ITS, BenA și CaM cu temperatura de 55 ° C, în timp ce PCR de completare este utilizat pentru amplificarea RPB2 (48-50-52 °C). Secvențele obținute sunt utilizate pentru identificarea tulpinilor prin efectuarea căutării BLAST în baza de date NCBI. Totuși, baza de date NCBI conține multe secvențe neidentificate sau identificate greșit. Alternativ, secvențele ITS pot fi comparate cu baza de date
14
ITS verificată RefSeq pe NCBI. Pentru genele alternative, fișierele Local Blast pot fi configurate utilizând date publicate verificate [28]. Analiza extroliților
Extroliții sunt compuși chimici semnificativi din punct de vedere funcțional sau ecologic, care sunt produși de miceli și structuri sporulante ale fungilor. Exudatele, pigmenții difuzabili și culorile în revers sunt folosite ca trăsături distinctive morfologice, dar reprezintă amestecuri de extroliți, ceea ce implică faptul că analizele extroliților pot fi valoroase pentru identificare. Pentru a folosi extroliții în studiile de identificare, acestea trebuie izolate, separate prin HPLC și identificate utilizând tehnologia bazată pe spectroscopia de masă [29]. Producția optimă de extrolit este obținută din izolate cultivate pe agar CYA și YES în întuneric timp de șapte zile la 25 ° C. În zilele noastre, identificarea speciilor Penicillium exclusiv pe bază de extroliți nu este posibilă, dar are un potențial pentru viitor. Condiția preliminară este de a determina cel mai bun mediu și condițiile de mediu pentru producerea de extroliți și de a îmbunătăți bazele de date [28, 29].
c) Genul Fusarium Pentru o lungă perioadă de timp, identificarea și taxonomia speciilor Fusarium au fost ambigue din cauza lipsei unor caractere distinctive morfologice între specii. În prezent, identificarea este mai ușoară deoarece se iau în considerare nu numai criteriile morfologice, ci și moleculare și de fertilitate. Determinarea speciilor de Fusarium este descrisă în detaliu în "The Fusarium Laboratory Manual" de Leslie și Summerell (2006) și este rezumată mai jos [30]. Caracterele morfologice
Cele mai comune medii standard de identificare pentru Fusarium sunt CLA și PDA. Mediul (20 ml) se distribuie intr-o placă Petri de 90 ml. Inocularea se face cu un singur conidient de germinare. Blocul de agar care conține o conidie germinativă singulară este transferat în mediul de testare. Caracteristicile principale sunt observate după o perioadă de incubație de 7-10 zile la 25 ° C și includ: rata de creștere, diametrul coloniei, consistența, abundența, textura, culoarea culturii și pigmenților pe PDA, prezența și culoarea sporodochiei, prezența microconidiei, , mărimea și formarea, tipul de fialide, prezența macroconidiei, forma, mărimea, numărul de septe, forma celulelor apicale și bazale. În plus, datele fiziologice privind toxinele și alți metaboliți pot fi utile în diagnosticare. Trăsăturile caracteristice ale F. verticillioides sunt culoarea purpurie pe PDA și lanțurile lungi înfășurate de microconidii formate din monofialide în miceliul aerial. Caracteristicile proliferative reprezentative ale lui Fusarium sunt culoarea purpurie pe PDA și lanțurile scurte de microconidii care sunt uneori produse nu numai de monofialide, ci și de polifialide. Aceste lanțuri scurte de microconidii și apariția polifialidelor sunt caracteristici care disting F.proliferatum de F. verticillioides. Fusarium subglutinans este, de asemenea, similar cu
15
F. proliferatum, dar nu produce fumonisine și produce microconidii. În plus, produce macroconidii mai des decât F. proliferatum. Fusarium nygamai este o altă specie similară, dar produce clamidospori care o disting ușor de F.prolieratum.
Fusarium graminearum are macroconidia dreaptă, creștere rapidă și culoare roșie. Caracteristica distinctivă suplimentară este apariția peritecii. Fusarium culmorum se caracterizează prin macroconidia groasă, în formă de pană, cu celule scurte apicale și bazale. Speciile înrudite, F. sambucinum, pot fi deosebite de F. culmorum prin macrocondia sa îngustă. Fusarium sporotrichioides diferă de speciile similare F. poae și F. tricinctum prin prezența polifialidelor, în timp ce prezența a două tipuri de microconidii o deosebește de F.
chlamidosporum.
Fertilitatea sexuală încrucișată
Testul de fertilitate sexuală încrucișată poate fi efectuat pentru a ajuta identificarea exactă a speciilor. Prin urmare, se testează dacă o tulpină necunoscută poate traversa și produce telemorfa (starea sexuală) cu tulpina standard de testare cunoscută (până acum circa 18 pentru nouă specii biologice). Dacă rezultatul este pozitiv, tulpinile sunt compatibile și, prin urmare, de aceeași specie.
Tehnici moleculare
Studiile ADN pot fi utilizate pentru identificarea speciilor de Fusarium, prin amplificarea PCR cu primeri de identificare sau prin tehnici AFLP sau prin tehnici similare de amprentare, precum și secvențierea ADN-ului. Gena factorului de alungire a factorului de translație 1-α (TEF) este recomandată ca un prim primer de identificare a locusului pentru Fusarium. Este potrivit deoarece are un nivel ridicat de polimorfism între specii, fără copii non-ortoloage în genul respectiv. Mai mult, sunt disponibili primeri universali și baze de date cu secvențe verificate
(Fusarium-ID și Fusarium MLST) [31].
AFLP-urile sunt utilizate pentru gruparea tulpinilor similare sau pentru identificarea unui izolat necunoscut prin asocierea acestuia cu tulpinile de referință ale speciilor cunoscute. Tulpinile care au> 65-70% din benzile din profilul AFLP aparțin aceleiași specii, iar cele care împart <40% aparțin unor specii diferite [30].
1.4 Principalele micotoxine cu incidență în boabe de cereale
a)Aflatoxinele
Aflatoxinele au fost descoperite în Marea Britanie în 1960, când moartea a peste 100 000 de pui de curcan (Turkey-x-disease) a fost asociată cu consumul de făină de arahide cu mucegai (producător de fungi). Aflatoxinele majore sunt B1, B2, G1 și G2. Numele derivă din fluorescența albastră (B) sau verde (G) sub lumina UV a acestor compuși, în timp ce numerele 1 sau 2 indică, compușii majori și minori [32]. Aflatoxina B1 este considerată a fi cea mai puternică substanță cancerigenă naturală și este studiată cel mai mult. Cu toate acestea, există multe alte aflatoxine care au fost descrise, cum ar fi P1, Q1, B2a și G2a [33].
16
Aflatoxinele M1 și M2 sunt produse metabolice ale aflatoxinelor B1 și B2, formate în organismul vacilor de lapte. Acestea sunt de o importanță deosebită deoarece apar în laptele care este consumat pe scară largă de către sugari [32].
Din punct de vedere chimic, AF sunt derivați ai difuranocumarinei. Acestea sunt produse pe calea policetidică prin mai multe tulpini de A. flavus și A. parasiticus [1]. Aceste ciuperci se pot dezvolta pe o mare varietate de alimente, cum ar fi cerealele (porumb, orez, orz, ovăz și sorg), arahide, arahide, migdale, nuci, semințe de bumbac etc. AF M1 se găsește în lapte și produse lactate, cum ar fi brânza [5].
Culturile pot fi contaminate cu AF în câmp, înainte de recoltare. Temperatura ridicată, stresul la secetă și deteriorarea insectelor sporesc riscul de contaminare cu AF [33, 34, 18]. Culturile grav afectate prezintă simptome de infecție carev pot fi vizual identificate: o masă de spori verde gălbuie poate fi văzută pe părțile deteriorate ale boabelor. Contaminarea poate apărea uneori în timpul manipulării și depozitării produselor. Dacă boabele sunt depozitate la temperaturi ridicate (> 20 ° C) și umiditate ridicată (> 14%) sau dacă nu sunt uscate în mod corespunzător înainte de depozitare, riscul de contaminare cu aflatoxine este ridicat [33, 18].
Aflatoxinele pot afecta sever sănătatea animalelor și a oamenilor. Agenția Internațională de Cercetare a Cancerului (IARC) a clasificat AF (B1, B2, G1, G2 și M1) drept grupul carcinogeni de grad I cu risc crescut de carcinom hepatocelular (HCC) [35,36]. Boala cauzată de aflatoxine se numește aflatoxicoză. Acestea pot avea efecte acute și cronice.
Toxicozele acute apar mai rar în țările dezvoltate, dar apar în țările în curs de dezvoltare, în special în Africa, ducând la vărsături, dureri abdominale, edem pulmonar și cerebral, comă, convulsii și chiar moarte. Forma cronică este o problemă la nivel mondial și are efecte cancerigene, teratogene, hepatotoxice, mutagene și imunosupresive [33, 5]. Ficatul este afectat în primul rând și există mai multe rapoarte care confirmă faptul că expunerea la aflatoxine este legată de cancerul hepatic, în special la persoanele cu hepatită B pozitivă [33, 32]. Țările dezvoltate au legi stricte privind contaminarea cu aflatoxine a produselor alimentare și a hranei pentru animale. Tehnicile de prelevare standard și analizele de aflatoxine împreună cu proceduri riguroase de sortare și curățare sunt utilizate pentru a reduce conținutul de aflatoxine la un nivel acceptabil. Cu toate acestea, țările în curs de dezvoltare, rămân în pericol de aflatoxicoză. Există o lipsă de rezerve de hrană, consumul de alimente se realizeaza la nivel local, fără control sau sortare a produselor, ceea ce duce la un aport ridicat de aflatoxine, în special în mediul rural [32].
b) Ochratoxina A
Ochratoxinele A, B și C pot fi produse de unele specii de Aspergillus, în special A.
ochraceus și speciile înrudite, precum și A. carbonarius și A. niger (într-un climat mai cald) și Penicillium verrucosum (în zone mai reci). Acestea pot fi găsite în întreaga lume, într-o varietate de mărfuri alimentare, inclusiv porumb, cereale, cafea, vin și produse din carne [36]. Chiar și atunci când produsele alimentare sunt contaminate cu ochratoxine, este dificil de observat prezența ciupercilor producătoare de ochratoxină în ele. Vizibilitatea mucegaiului gălbui pe produse este un semn al A. ochraceus și speciilor înrudite, mucegaiul albastru-verde indică prezența P. verrucosum, în timp ce mucegaiul negru este asociat cu A. niger și A. carbonarius.
17
Uneori, mucegaiul vizibil este absent, dar dacă boabele au miros "mucegai", indică infecția fungică și posibila prezență de ochratoxine.
OTA este cea mai toxică ochratoxină și poate avea efecte genotoxice, hepatotoxice, imunotoxice și carcinogene asupra animalelor și a oamenilor [36]. Principalele organe afectate sunt rinichii, iar studiile sugerează legătura OTA cu patologia renală [33]. IARC a evaluat OTA ca un posibil agent cancerigen (Grupul 2B) [33, 35].
OTA este termostabil și poate tolera medii acide, astfel că este dificil de eliminat prin procesarea și gătitul obișnuit al alimentelor [5]. Prezența OTA în mai multe tipuri de produse alimentare este reglementată din punct de vedere juridic în UE și variază de la 5-50 părți per miliard (ppb) [5, 18].
c) Citrinina
Citrinina este un compus benzopiren galben produs de P. citrinum și alte specii de Penicillium, inclusiv P. camemberti (utilizate în producția de brânză), precum și unele specii de Aspergillus (de exemplu A. terreus și A. niveus) și Monascus (M. ruber și M. purpureus, utilizate în producția de pigmenți roșii) [1, 33].
O gamă largă de alimente pot fi contaminate cu citrinină: grâu, ovăz, secară, porumb, orz, orez [33]. Acesta apare frecvent împreună cu OTA și are un posibil efect toxigen asupra oamenilor [36]. Acționează ca nefrotoxină la toate animalele testate [33]. Deși rinichii sunt afectați în mod deosebit, pot fi de asemenea afectate de toxicitatea lor și alte de organe, ficatul și măduva osoasă [1].
Citrinina este sensibilă la căldură; de aceea este prezentă în cantități mici în produsele alimentare prelucrate. Cu toate acestea, în timpul descompunerii citrininei la temperaturi înalte, pot fi produși alți compuși cu toxicitate mai mare și mai scăzută [37].
IARC a clasificat citrinina în grupul 3 (ceea ce înseamnă că nu este clasificat în ceea ce privește carcinogenitatea sa la om) [35]. Semnificația pentru sănătatea umană rămâne necunoscută și trebuie investigată în continuare [33].
d) Fumonisinele
Fumonizinele sunt sintetizate de unele specii de Fusarium, în special F. verticillioides și
F. proliferatum, în special în zonele umede la temperaturi ridicate [36]. Ele sunt contaminanți obișnuiți ai porumbului, dar prezența lor a fost observată și în sorg, orez, grâu, orz, soia, smochine, ceai negru și plante medicinale [18, 5].
Fumonizinele sunt responsabile pentru problemele de sănătate la cai (leukoencefalomalacia) și la porcine (edem pulmonar) [18]. Acestea pot provoca defecte ale tubului neural și cancer hepatic și esofagian la om [36].
Există diferite tipuri de fumonisine, dar Fumonisina B1 (FB1) este cea mai frecventă și cea mai toxigenică dintre toate. Conform unor estimări, mai mult de jumătate din produsele din porumb sunt contaminate cu FB1 [36, 33].
18
IARC a clasificat FB1 ca fiind posibil carcinogen pentru om (Grupa B2) [33, 35]. Organizația Mondială a Sănătății (OMS) a recomandat o doză zilnică maximă tolerabilă de 2 µg / kg greutate corporală. În UE, nivelul maxim de fumonisine din porumb neprelucrat este de 4 ppm și de 1 ppm la porumb pentru consumul uman direct [5].
Concentrația fumonisinelor în timpul depozitării nu va crește, dacă boabele sunt recoltate cu atenție, cu o deteriorare minimă a miezului, sitate pentru a elimina miezurile deteriorate și depozitate corespunzător cu un nivel de umiditate <14% [18].
e) Zearalenona
Zearalenona poate fi produsă de speciile Fusarium, în principal de F. graminearum și F.
culmorum. Boabele infectate cu ciuperci producătoare de ZEA au adesea coloare roz [18]. Infecția are loc pe teren, iar ZEA poate fi produsă înainte de recoltare sau chiar după recoltare, dacă boabele nu sunt manipulate și păstrate în condiții optime [1]. Produsul cel mai frecvent contaminat este porumbul, dar ZEA poate fi găsită în întreaga lume în grâu, orz, sorg și secară [18, 36]. Condițiile meteorologice umede și temperate sunt favorabile pentru infecția fungică Fusarium și producția ZEA [33, 36].
ZEA are efecte estrogenice; se poate lega de receptorii estrogenici și poate provoca modificări hormonale [5, 18]. Aceste modificări includ probleme genitale, cum ar fi simptomele hiperestrogenice, prolapsul vaginului și rectului, problemele cu concepția și avortul la porcine [32, 33]. Deși porcii sunt cei mai sensibili la ZEA, au fost raportate și probleme de reproducere la bovine și ovine [33]. La om, ZEA poate provoca pubertate precoce la fete și poate avea toxicitate indirectă prin producerea de specii reactive la oxigen (ROS) [36].
IARC clasifică ZEA la substanțele cancerigene din grupa 3. Cu toate acestea, preocuparea majoră cu privire la ZEA este legată de activitatea sa ca estrogen. UE a legiferat nivelul maxim de ZEA în diferite produse alimentare, variind între 20-100 ppb [5].
f) Tricotecenele
Trichothecenele includ mai mult de șaizeci de metaboliți de sesquiterpenoid produși de diferite ciuperci, în special Fusarium, Phomopsis, Trichoderma și alții [33].
DON este unul dintre cele mai frecvente micotoxine din boabe. Este produs în principal de F. graminearum și F. culmorum. Fungii Fusarium apar în condiții de umezeală, frig și infectează planta gazdă, provocând putregaiul în porumb și fuzarioza (aspectul albicios) boabelor mici. Cu toate acestea, dacă boabele maturate sunt recoltate și depozitate în condiții adecvate (umiditate <14%) cantitatea de DON nu va crește în timpul depozitării [18].
DON este cel mai frecvent dintre toate tricotecenele și poate fi găsit în orz, porumb, secară, grâu și furaje mixte [33]. Poate provoca greață, vărsături și diaree sau pierderea în greutate și refuzul alimentar la animale. Datorită acestor efecte, DON se numește adesea vomitoxină. Expunerea umană la DON poate determina greață, vărsături, diaree, durere abdominală, cefalee, amețeli și febră [5, 32]. IARC a clasificat DON în grupa 3 de substanțe
19
cancerigene. În UE, nivelul maxim DON permis în diferite produse alimentare variază între 200 și 1750 µg / kg [38].
Toxina T-2 este mai toxică decât DON, este produsă în principal de F. sporotrichioides și contaminează porumb, grâu, orz, ovăz, orez și secară. Cea mai intensă producție are loc când nivelul de umiditate este ridicat și temperatura variază de la 6 la 24 ⁰C. Simptomul vizibil al ciupercilor producătoare de toxine T-2 pe porumb include mucegai de culoare albă până la roz-roșie care se dezvoltă de obicei din vârful urechii. Controlul scăzut al umezelii și al insectelor în timpul depozitării va reduce la minimum producția de toxine T-2 după recoltare [18].
Toxina T-2 are un efect imunosupresiv și cauzează diferite simptome gastro-intestinale, dermatologice și neurologice [33]. Pierderea în greutate, diareea sângeroasă, necroza dermică și leziunile la nivelul gurii sunt unele dintre simptomele toxicozei T-2 [18].
În UE, se recomandă ca doza zilnică tolerabilă pentru toxina T-2 și toxina HT-2 tricotecena derivată, să fie de 100 ng / kg greutate corporală [38].
1.5 Condițiile de mediu care influențează dezvoltarea fungică și producția de micotoxine
Creșterea fungică și producția de micotoxine depind de factorii de mediu, de practicile agricole și de condițiile de depozitare. Temperatura, conținutul de umiditate, nutriția disponibilă și umiditatea sunt factorii de mediu care influențează creșterea fungilor și producerea de micotoxine pe teren [36]. În timpul depozitării, factorii de mediu importanți sunt activitatea apei (wa), temperatura, tensiunea gazelor, consistența, valoarea nutritivă, fungicidele și alți factori, cum ar fi cerealele deteriorate și prezența insectelor [39].
Temperatura și wa au cea mai mare influență asupra creșterii fungice și asupra producerii de micotoxine [40, 41].
1.6 Producerea de aflatoxine și fungii producători
Dezvoltarea producătorilor de aflatoxine (A. flavus și A. parasiticus) este sporită de condițiile calde, prin urmare, încălzirea globală poate provoca o problemă potențială cu aflatoxinele, în special în zonele temperate, în prezent. De obicei, culturile sunt rezistente la aceste ciuperci, dar în condiții de secetă și stres de căldură, ele devin mai sensibile.
Mai mult, dacă plantele sunt lezate de animale (insecte, păsări sau mamifere), de vânt sau practicile agricole mecanice, ele devin mai sensibile la infecții și la contaminarea cu aflatoxine [41]. Întârzierea recoltării, irigarea târzie și ploaia în perioadele calde conduc la creșterea nivelului de aflatoxine. De asemenea, dacă recoltarea se face în timpul sau imediat după ploaie, riscul de contaminare cu aflatoxine crește [42].
Temperaturile minime pentru creșterea A. flavus sunt 10-12 ⁰C, maxim 43-48 ⁰C, cu o temperatură optimă de aproximativ 33 ⁰C. Activitatea apei (aw ) minimă pentru creștere este de 0,82 la 25°C, 0,81 la 30°C și 0,80 la 37°C. Creșterea A. flavus poate să apară în intervalul larg de pH (2.1-11.2), cu o creștere optimă în intervalul pH 3.4-10 [11, 20].
A.parasiticus are preferințe similare cu factorii fizici ca în cazul A. flavus, deși crește la temperaturi mai scăzute, până la 42 ° C.
20
Condițiile optime pentru producerea de aflatoxine atât pentru A. flavus cât și pentru A.
parasiticus sunt la 33°C și 0,99 aw [41].
1.7 Producerea de ochratoxine și fungii producători
Producerea ochratoxinei este favorizată dacă culturile sunt recoltate în condiții de umiditate ridicată și depozitate în spații cu umezeală [41]. Speciile Aspergillus producătoare de OTA sunt prezente mai ales în zone calde și temperate, în timp ce Penicillium predomină în zone mai reci [40].
A. ochraceus și speciile derivate sunt xerofile mezofile. Creșterea lor are loc între 8-37 °C, cu optimul la 24-31 °C [20]. Intervalul optim de creștere pentru activitatea apei (aw) a fost de 0.95-0.99. Acestea cresc lent la pH 2,2 și bine peste intervalul de pH 3-10 [11].
Temperatura minimă pentru creșterea A. carbonarius este de 10°C, optimă este de 30°C și maximă de aproape 41°C. Activitatea apei (aw) optimă pentru creștere este de 0,96-0,98 și minimă este de 0,85 la 25°C [11]. Aspergillus carbonarius este rezistent la lumina soarelui[41].
Aspergillus niger crește la 45 °C, cu un interval de temperatură optim de 35-37˚C. Valoarea minimă pentru aw necesară pentru creșterea sa este de 0,77 [20].
Penicillium verrucosum poate crește în intervalul de temperatură 0-31°C, cu o temperatură optimă la 20°C. Activitatea apei minime pentru creștere este de aproximativ 0,80 [20]. Creșterea are loc în intervalul de pH 2,1-10,0. Are capacitatea de a produce OTA la temperaturi scăzute (4 ° C) și aw (0.86) [11].
Cele mai mari cantități de OTA sunt produse la aw 0,98, indiferent de temperatură. Temperatura optimă pentru producerea de OTA este de 25-30 °C [41].
1.8 Producerea de citrinină și fungii producători
Citrinina este produsă în intervalul de temperatură de 20-30 ° C și 0,75-0,85 aw [41]. Producătorul citrinic, Penicillium citrinum crește cel mai bine la 30°C și 0,90 aw pe prăjituri pe bază de orez [43].
1.9 Producerea de fumonisine și fungii producători
Creșterea fungică și producția de fumonisine sunt mai mari în climatele tropicale și subtropicale.
Temperatura optimă pentru creșterea F. verticillioides este aproape 25°C, minimă este de 2,5 - 5°C și maximă de 32-37°C. Valoarea minimă a activității apei (aw) este de aproximativ 0,87.
Pentru F. proliferatum, aceste valori sunt în esență identice [20].
21
Condițiile optime pentru producerea de fumonisină includ intervalul de temperatură cuprins între 15-30 ° C și 0.9-0.995 aw [41].
1.10 Producerea de Zearalenonă și fungii producători
Condițiile umede și calde sunt favorabile producției de ZEA. Cele mai mari cantități de ZEA sunt produse dacă temperatura este sub 25°C la variații mari ale temperaturilor zilnice și la 16% umiditate (0.97 aw) [41].
Temperatura optimă pentru creșterea F. graminearum este de 25°C, în timp ce temperatura maximă este sub 37°C. Valoarea minimă necesară pentru creștere este de aproape 0,90.
Fusarium culmorum este o specie psihotropică, crescând la temperaturi scăzute, până la 0°C, și apoi doar la 31°C [20].
1.11 Producerea de tricotecene și fungii producători
Perioadele umede din timpul vegetației pot avea o influență semnificativă asupra DON și a producției de micotoxine derivate, în boabele de grâu ajunse la maturitatea fiziologică [40]. Cele mai mari cantități de DON sunt produse la 0,995 aw după o perioadă de incubație de șase săptămâni la 30°C [41]. Fungii responsabili pentru producția DON (F. graminearum și F.
culmorum) și preferințele lor sunt menționate mai sus.
Producerea toxinei T-2 este favorizată de climatul moderat cald și umed [44]. Temperatura optimă pentru producerea micotoxinelor este de 15-35 °C [45], iar umiditatea optimă este de 40 [46].
Intervalul optim de temperatură pentru creșterea F. sporotrichioides este de 25-30°C. Cu toate acestea, o temperatură optimă poate varia în funcție de compusul izolat și regiunea de origine [45]. Se dezvoltă bine în intervalul de pH 4-10 [47].
Este important să existe informații relevante despre influențele mediului asupra producției de micotoxine pentru a lua măsuri de control adecvate [40]. Prevenirea dezvoltării fungice și a biosintezei micotoxinelor prin recoltarea boabelor la momentul potrivit (maturitate completă cu conținut scăzut de umiditate) și păstrarea lor în condiții răcoroase (<20 ° C) și uscate (umiditate <14%) este cea mai bună modalitate de a reduce riscul de contaminare cu micotoxine în boabele de cereale
22
Capitolul 2. STRATEGII RELEVANTE APLICATE ÎNAINTE DE RECOLTARE, ÎN TIMPUL RECOLTĂRII ŞI POST RECOLTARE, PENTRU REDUCEREA CONTAMINĂRII CU MICOTOXINELE PRODUSE DE FUNGI, ÎN CEREALE, PRODUSE DERIVATE ŞI FURAJE
2.1 Introducere
Un număr important de ciuperci saprofite și parazitare pot fi găsite în boabele de cereale în câmp și unii dintre aceștia sunt mari producători de micotoxine. Cele mai importante specii parazitare sunt Fusarium sp., iar speciile toxigene saprofite sunt Aspergillus și Penicillium.
În ceea ce privește momentul infectării cu speciile de Fusarium și partea din plantă care este infectată, sunt recunoscute următoarele tipuri de boli: fuzarioza rădăcinilor, coletului si plantulelor de grâu, putregai și fuzarioza spicelor de grâu (Fusarium head blight). Sursele de infestare sunt părți ale plantelor rămase în câmp, gazde alternative și semințe infectate (Ćosić 2001) [65].
Boabele de cereale pot fi infectate de la înflorire până la sfârșitul vegetației. Boabele infectate în timpul înfloririi sunt mai mici, scorbite și adesea își pierd capacitatea de germinare (figura 1). Simptomele bolii ) pot fi recunoscute cu ușurință în etapa de lapte (Figura 2) atunci când capetele sănătoase sunt verzi și puțin îndoite din cauza greutății cerealelor, în timp ce capetele bolnave sau părțile capului sunt galbene și stau drept. În cazul în care umiditatea relativă a aerului este ridicată, sporodochiile de culoare roz sau portocalie, pot fi observate la baza frunzelor de grâu, la colet. Simptomele pot fi observate pe coletele individuale, la baza spiculetelor şi pe rahis. Ulterior, infecțiile dau mai multe boabe "normale" cu greutate normală a cerealelor și de obicei pot germina bine. Sporii de Fusarium pot contamina boabele deja formate, care pot fi o sursă de inocul în timpul depozitării, dar daunele directe sunt de obicei nesemnificative.
Figura 1. Boabe de grâu afectate de Fusarium
Figura 2. Fuzarioza spicelor produsă de Fusarium
23
Speciile fungice predominante care contaminează cerealele în timpul vegetației aparțin genului Fusarium. Alte specii fungice, cum ar fi Aspergillus și Penicillium, sunt predominante în timpul procesului de depozitare.
Măsurile de reducere a contaminării cu micotoxine sunt clasificate în metode de prevenire aplicabile înainte de a se produce contaminarea și metode de decontaminare utilizate pentru a reduce conținutul de micotoxine
Metodele de prevenire se referă la măsurile luate în câmp sau la depozitarea cerealelor pentru a elimina riscul de contaminare cu micotoxine
2.2 Factori de mediu
Factorii de mediu au un impact semnificativ asupra bolilor produse de Fusarium în cerealele cu bob mic și porumb și sintetizarea micotoxinelor.
Conform studiilor efectuate de Ferrigo şi colab,. (2016) [77] clima este unul dintre cei mai importanți factori care influențează apariția și răspândirea bolilor produse de Fusarium. Epidemiile de fuzarioză (Fusarium head blight) apar în mod regulat dacă umiditatea aerului la înflorirea grâului este ridicată (peste 85%), cu temperaturi cuprinse între 20 și 25°C, cu suficientă cantitate de inocul (de exemplu, conidii sau ascospori pe reziduurile de plante de pe suprafața solului). Umiditatea și temperatura care pot fi optime pentru creșterea fungilor pot fi diferite de cele optime pentru producerea de micotoxine (Schmidt și colab., 2011, 127, Medina et al., 2013, 104). Fiecare specie de Fusarium are cerințe diferite față de condițiile de temperatură și umiditate, iar prevalența lor în câmp este direct influenţată de condițiile climatice.
Xu şi colab., (2008) [143] au studiat influența condițiilor de mediu asupra incidenței fungilor Fusarium asupra grâului în patru țări europene: Ungaria, Irlanda, Italia și Regatul Unit. Fusarium poae a fost izolat în zone cu condiții mai uscate și mai calde, iar pe de altă parte F.
graminearum a preferat condiții mai calde / umede. F. avenaceum și F. culmorum au predominat în condiții mai reci şi umede.
În cele din urmă, două specii de Microdochium au fost izolate în regiuni cu temperaturi scăzute / moderate și precipitații scurte și frecvente. M. nivale, produc fuzarioza la răsaduri și la spice, putregai cenuşiu care apare la rădăcina cerealelor cu bob mic, care preferă condiții mai reci. Majoritatea fungilor care provoacă boli ale cerealelor preferă temperaturi calde și condiții umede (Doohan et al., 2003) [71].
Nu este cazul putregaiului ştiuleţilor de porumb, boală produsă de F. moniliforme and F.
proliferatum, boală care se dezvoltă în condiții calde şi uscate ale mediului. Potrivit mai multor autori, perioada de creştere şi dezvoltare, cu umiditate ridicată și precipitații intensive, ar putea fi crucială pentru incidența bolii și creșterea producției DON (Hooker et al. 2002 [85]; Schaafsma et al. 2001[126]; Moschini et al., 1996[108]; Klem et al. 2007[95]; Kriss et al. 2012[96]; Landschoot et al. 2012 [98]; Lindblad et al. 2012 [101]; Gourdain et al. 2011[80]).
Condițiile meteorologice influențează de asemenea cantitatea de inoculum fungic produs în timpul vegetației, ceea ce reprezintă un parametru important care determină incidența Fusarium și producția DON.
24
2.3 Rotația culturilor
Rotația culturilor este o măsură fitosanitară importantă care reduce incidența bolii și este foarte eficientă în protecția plantelor împotriva agenților patogeni din sol. Cu cât crește numărul de culturi în rotație, crește și eficiența rotației culturilor.
Chiar și în cazurile în care răspândirea bolii este minimă, eficiența rotației culturilor există în continuare. Perioada de rotație obișnuită este de cel puțin 4 ani. Pentru anumiți agenți patogeni (care formează spori permanenți sau structuri eficiente pentru supraviețuirea în condiții nefavorabile) și culturi, se recomandă perioade de rotație mai îndelungate, dar greu de implementat în realitate.
Jurković (2003) menționează rotația culturilor ca fiind eficace în tratamentul brunificării, boală provoacată de ciuperca Gaeumannomyces graminis (Sacc.) von Arx et Olivier (syn. Ophiobolus graminis Sacc.). Ciuperca atacă rădăcinile, după care avansează spre baza tulpinii, unde provoacă de asemenea, o brunificare, pe care apoi un miceliu de culoare închisă şi strălucitoare. Boala se manifestă prin atacarea rădăcinilor şi tulpinilor şi înnegrirea la bază, iar la spice se manifestă prin înălbirea şi uscarea prematură a acestora precum şi prin dispariţia plantelor în vetre.
În multe zone de cultură există foarte des rotația culturilor între grâu și porumb, dar, din păcate, ambele culturi sunt cunoscute ca şi gazde pentru aceleași specii de Fusarium care provoacă diferite boli pe porumb și grâu. F graminearum și F. oxysporum sunt specii adesea găsite pe grâu, iar cercetările actuale arată că soia poate fi, de asemenea, infectată cu aceste ciuperci (Duvnjak et al. 2016 and 2017 [73]).
F. graminearum poate supraviețui pe resturile de plante de rapiță, dejectii de bovine, dar și pe numeroase specii de buruieni găsite pe câmp sau în apropierea câmpului care pot servi drept sursă potențială de inocul (Chongo et al., 2001[60], Poštić et al. 2012[121]). Resturile vegetative de porumb pot servi pentru o perioadă mai lungă ca sursă de infecție pentru diferite specii de Fusarium (Cotten and Munkvold, 1998 [68]) iar aceste resturi sunt considerate a fi cea mai bună sursă de inocul pentru ascospori și pot conduce la infecții semnificative și contaminarea cu micotoxine (Tillmann et al., 2017[135]). Conform studiilor lui Inch and Gilbert (2003) [89] F.
graminearum poate supraviețui pe suprafața solului sau în diferite adâncimi ale solului până la doi ani.
Investigarea interacțiunii dintre diferitele strategii de protecție a plantelor (rotația culturilor, genotipul și a aplicarea fungicidului) a determinat faptul că rotația culturilor (combinații diferite de porumb, soia și grâu) și alte măsuri de protecție nu au influențat semnificativ populațiile de Fusarium oxysporum și F. Vrguliforme, dar, în același timp, populația de F. graminearum a fost mai mult de trei ori mai mică dacă cultura de grâu nu a fost urmată tot de grâu în rotația culturilor sau dacă s-au aplicat fungicide (Marburger et al. 2015.) [103].
Rotația culturilor de grâu de toamnă, de porumb, de sfeclă de zahăr și de rapiță nu influențează colonizarea tulpinii inferioare de grâu și a cerealelor cu Fusarium, care a rămas aceeași. Cu toate acestea, cel mai înalt nivel de infecție cu Fusarium a fost determinat când grâul a fost cultivat după porumb și specia dominantă a fost Fusarium graminarum (Tillmann et al., 2017.) [135].
Rotația culturilor trebuie planificată individual de către fiecare agricultor, deoarece nu există o soluție unică. Rotația culturilor depinde de sol, de climă, de resursele umane disponibile,
25
de mecanizare și de cererea pieței. Respectarea măsurilor agrotehnice generale poate reduce contaminarea cerealelor cu ciuperci și micotoxine. 2.4 Managementul reziduurilor
Una dintre cele mai importante componente ale managementului solului este lucrarea
solului care, în același timp, are o mare influență asupra intensității bolilor plantelor. Diferitele sisteme de prelucrare a solului lasă o cantitate diferită de resturi vegetale pe suprafața solului (Jug et al., 2011) [92] și au efecte diferite asupra dăunătorilor, bolilor și buruienilor (Jordan and Hutcheon, 2003) [91]. Mai mulți autori au studiat relațiile dintre patogenii plantelor și cultivarea plantelor fără arătură sau "zero lucrări". (Supronienė et al., 2012, Perez-Brandan et al., 2012[119]). Resturile vegetale au un rol important în epidemiologia bolilor plantelor, deoarece mulți patogeni din plante pot supraviețui pe acestea (Poštić at al., 2012) [121].
Arătura a fost folosită în mod tradițional pentru a încorpora resturile de cultură în sol. Sistemul fără cultivare oferă cele mai bune condiții pentru conservarea și îmbunătățirea structurii solului, contribuie la buna calitate a solului, crește nivelul activității microbiene, diversitatea microbiană și sporește supresia naturală a bolii (Perez-Brandan at al., 2012.) [119]. Resturile vegetale și incidenţa bolii sunt legate, dar este necesar să se ia în considerare și alți parametri implicați în epidemiologia bolii (Almeida et al., 2001). Există diferențe în ceea ce privește infecția cu specia Fusarium și producția de micotoxine în funcție de soi, locație, an și gestionarea solului (Scala et al. 2016) [125].
Rezultatele studiilor privind efectul practicilor de cultivare, asupra infestării cu Fusarium
la grâu sunt contradictorii. Lori şi colab., (2009) [102] au concluzionat că, cultivarea fără arătură nu poate avea ca rezultat creșterea incidenței Fusarium, dar vremea favorabilă pentru apariţia fuzariozei este mai importantă decât tehnica de prelucrare a pământului și tratamentele cu îngrășăminte. Fernandez et al. (2005) [76] a concluzionat că mediul înconjurător a fost cel mai important factor care afectează dezvoltarea bolii.
O contaminare semnificativ mai mare cu Fusarium sp. a fost găsită în sistemul de fără arătură, dar nu a avut un efect semnificativ asupra contaminării cu micotoxine a boabelor (Baliukoniene et al., 2011) [54]. Sistemul conventional de lucrare a solului este considerat a fi cauza infecției epidemice de fuzarioză (Fusarium Head Blight) în America Centrală (Dill-Macky and Jones, 2000) [70], din cauza sistemului de producție în care porumbul este produs în rotație cu grâul.
Contaminarea semnificativ mai mare a boabelor de cereale cu Fusarium sp. a fost găsită în sistemul fără arătură de prelucrare a solului și în sistemul cu arături reduse, în timp ce tratamentele de fertilizare cu azot nu au influențat semnificativ populațiile fungice (Vrandecic et al., 2013) [139]. Rotația ecologică a culturilor și rotația convențională a culturilor nu influențează conținutul de DON în cerealele de grâu de toamnă (Vanova et al., 2008) [138].
2.5 Fertilizarea
De obicei, se acceptă faptul că azotul aplicat suplimentar creşte incidența infecției cu Fusarium. Infecția poate fi redusă semnificativ prin utilizarea azotului suplimentar în cantități recomandate (Petcu si Ionitã, 1998) [120].
26
Efectul aplicării azotului înainte de etapa de formare a spicului, a arătat că procentul de
spicuri bolnave a crescut de la 2,2% la varianta fără aplicare de azot, până la 6,6% la varianta cu 160 kg N suplimentar pe hectar (Lemmens et al. 2004) [99]. De asemenea, Lemmens et al. 2004 a raportat o creștere semnificativă a intensității fuzariozei (FHB) și a contaminării cu deoxinivalenol (DON) în cereale, odată cu creșterea azotului suplimentar de la 0 la 80 kg / ha.
Fertilizarea excesivă cu azot poate conduce la creşterea incidenţei fuzariozei și acumularea de micotoxine chiar și în condiții nefavorabile pentru Fusarium spp. (Heier et al. 2005). Altii au descoperit un efect redus sau deloc la suplimentarea cu N.
Deși fuzarioza a crescut ușor cu creșterea ratei de aplicare a azotului, în antiteză, efectele inconsecvente ale ratelor de aplicare a azotului asupra conținutului de fuzarioză și DON în cereale au fost raportate şi de Burgt şi colab., (2011). Azot la doze mai mari (75 -150 kg ha−1) nu a crescut intensitatea fuzariozei (Krnjaja et al. 2015) [97].
2.6 Plantarea de semințe sănătoase
Plantarea de sămânță sănătoasă și de calitate este o măsură agrotehnică extrem de importantă în protecția împotriva bolilor cerealelor. Peste 30 de agenți patogeni pot fi transmiși prin semințele de grâu (Čizmić 2003) [63]. Toți agenții patogeni transmiși prin sămânță nu produc daune egale cu speciile de Fusarium.
Patogenii care cauzează boli la semințe pot fi găsite :
1. Pe suprafața semințelor ca miceliu sau spori (contaminarea semințelor) 2. În apropierea suprafeței semințelor sau a stratului de semințe mai adânc, în interior, de
obicei sub formă de miceliu. 3. În interiorul semințelor.
Deși semințele de grâu pot fi infectate cu mai mult de 10 specii de Fusarium (Wilcoxon et al. 1988, Ćosić 2006 [66], Alkadri et al. 2013[49]) cele mai frecvent izolate și cele mai patogene sunt Fusarium graminearum (Figura 3) şi Fusarium culmorum.
Plantarea de semințe sănătoase tratate cu fungicide asigură germinația egală a semințelor și apariția acestora, creșterea și dezvoltarea inițială a plantelor, creând în același timp condiții bune pentru un randament ridicat şi de bună calitate.
Figura 3. F. graminearum pe boabele de grâu
27
2.7 Influența stresului apei asupra dezvoltării bolilor
Condițiile de stres abiotic (secetă, temperatură înaltă și joasă, salinitate) pot influența semnificativ apariția și răspândirea agenților patogeni. Aceste condiții afectează, de asemenea, în mod direct relația dintre plante și patogeni prin modificarea răspunsurilor de apărare ale plantelor (Scherm and Coakley 2003) [128].
De exemplu, speciile de Fusarium sunt patogeni care există în sol și pe resturile vegetale pentru o perioadă lungă de timp. Stresul vegetal, cum ar fi seceta, este un factor foarte important care poate crește semnificativ incidența și severitatea bolilor. Umflarea cornelor de Fusarium de cereale cauzată de diferite specii de Fusarium și putregaiul rădăcinos cauzat de Bipolaris sorokiniana poate provoca pierderi semnificative de producție și pierderi de calitate în condiții de secetă.
Putregaiul cerealelor produs de diferite specii de Fusarium şi putregaiul comun produs de Bipolaris sorokiniana poate provoca pierderi semnificative ale producției și al calității în condiții de secetă. Mai multe dovezi arată că stresul apei în timpul perioadelor de secetă este strâns legat de concentraţiile ridicate de infectare cu F. verticillioides și acumulare de fumonisină în boabe (Miller 2001) [101]. Pe de altă parte, excesul de precipitații în timpul înfloririi favorizează condițiile de infectare cu ciuperci producătoare de micotoxine, prin urmare irigarea în timpul înfloririi și în timpul maturării culturilor, trebuie evitată. Irigarea este o metodă valoroasă de reducere a stresului vegetal în unele situații de creștere a plantelor.
2.8 Rezistența genetică a culturilor
Creșterea soiurilor cu o rezistenţă ridicată pentru bolile produse de Fusarium este cel mai economic, mai practic și mai ecologic mijloc de control al acestora. Trebuie să se ia în considerare faptul că, numai soiuri recomandate pentru a fi utilizate într-o anumită zonă a unei țări ar trebui să fie plantate în zona respectivă (Figura 4).
Figura 4. Reacția infectării artificiale cu Fusarium asupra diferitelor soiuri de grâu
28
2.9 Produse fitosanitare
Protecția plantelor cu fungicide chimice poate fi aplicată de la început până la sfârșitul înfloririi cerealelor (BBCH 61-65). În condiții ideale de creștere, timpul de la înspicare până la începutul înfloririi este de doar trei zile, deci este foarte important să se urmărească îndeaproape când spicul de grâu începe să iasă din burduf.
Toate fungicidele înregistrate pentru protecția spicului vor reduce intensitatea infestării și incidența bolii, alți factori cum ar fi susceptibilitatea cultivarului, prezența inoculului și condițiile meteorologice favorabile pentru dezvoltarea bolii, jucând, de asemenea, un rol important în dezvoltarea bolii.
Pentru a evalua riscurile asociate cu fuzarioza spicului produsă de Fusarium și a determina deciziile de utilizare a fungicidului, mulți oameni de știință au dezvoltat modele de prognoză bazate pe vreme.
Modelele de prognoză pot fi empirice și mecanice. Modelele empirice sunt mai ușor de folosit, expun relațiile dintre condițiile meteorologice și fuzarioză folosind modele statistice și sunt, de obicei, fiabile pentru producția de cereale în regiunile unde au fost dezvoltate. În conformitate cu acestea, aceste modele ar putea necesita ajustări pentru a fi eficiente în alte regiuni de producție (Prandini et al. 2009) [122].
Controlul biologic, acceptabil din punct de vedere ecologic, pentru gestionarea fuzariozei spicului produsă de Fusarium, ar putea juca un rol important în producția de culturi organice.Au fost testaţi pentru a reduce fuzarioza şi acumularea de micotoxine, diferiți agenți de biocontrol, cum ar fi bacteriile din genul Bacillus (Luz 2000, Crane et al. 2013) , Pseudomonas (Khan and Doohan 2009) [94], Streptomyces (Pallazini et al. 2017) [116] Lysobacter (Jochum et al. 2006) [90] şi Paenibacillus (Luz (2000), drojdii cum ar fi Cryptococcus flavescens (Schisler et al. 2014), şi ciuperci cum ar fi Clonostachys rosea (Xue et al. 2009) .
Conform lui Luz (2000) câţiva compuşi din genurile Bacillus şi Paenibacillus pot reduce incidenţa fuzariozei în câmp cu 50-60% și creșterea producţiei cu un randamentmai mare de 700 kg / ha. Pallazini et al. (2016) [115] a evaluat efectul de biocontrol a două tulpini bacteriene (Bacillus subtilis RC 218 și Brevibacillus sp. RC 263) asupra incidenței fuzariozei și acumulării de DON. Aceste izolate au redus incidenţa fuzariozei cu până la 76% și nu s-a observat acumulare de DON în boabele de grâu.
Compușii biologici extrași din plante, cum ar fi uleiurile esențiale, ar putea fi, de asemenea, una din alternativele importante care nu au efecte periculoase asupra sănătății umane și a mediului. Mulți oameni de știință din ultimii ani au studiat efectul uleiurilor esențiale și al compușilor lor asupra diferitelor ciuperci fitopatogene.
Uleiurile esențiale reduc sinteza ergosterolului în celulele fungice, modifică permeabilitatea membranei, provoacă degenerări morfologice cum ar fi coagularea citoplasmatică, vasculizarea, scufundarea hipofizilor și scurgerea de protoplaste (Harris 2002[82], Bakkali et al. 2008[53]), și inhibă creșterea fungilor, sporularea și alungirea tuburilor germinative ale multor agenți patogeni din plante, inclusiv speciile Fusarium (Nguefack and Amvam Zollo 2004 [112], Ćosić et al. 2010 [67] (Figure 5 and 6), Novak 2012 [113], Bajpai and Kang 2012[52]).
29
Uleiurile esenţiale din Thymus vulgaris, Thymus kotschyanus şi Zataria multiflora sunt eficiente împotriva Fusarium graminearum cu inhibare a creșterii de 100% la concentrație de 200 µl l-1 (Amini et al. 2012[51]). Uleiurile esenţiale de Ocimum basilicum var. minimum, Cuminum cyminum şi Pelargonium graveolens au prezentat o activitate antifungică semnificativă împotriva Fusarium
oxysporum, Fusarium verticillioides, Fusarium dimerum, Fusarium solani, Fusarium equiseti şi Fusarium lateritium în condiții in vitro (Hashem et al. 2010) [83]. Sumalan et al. (2013) [133] au arătat că, tratamentele la boabele de grâu cu uleiuri esențiale provenite din Melissa officinalis, Salvia officinalis, Coriandrum sativum, Thymus
vulgaris, Mentha piperita şi Cinnamomum verum determină un conținut scăzut al micotoxinelor produse de Fusarium. Cel mai bun control al biosintezei fumonisinei, cu reducere de peste 90%, a fost înregistrat pentru uleiurile de Cinnamomum, Mentha and Thymus.
Figura 5. Influența uleiurilor esențiale asupra F.
graminearum
Figura 6. Influenţa uleiurilor esenţiale asupra F. subglutinans
30
În multe cazuri, rezultatele activităţii antifungice ale uleiurilor esențiale sau a componentelor acestora într-un studiu in vitro, sunt mult mai bune decât rezultatele obținute atunci când uleiurile și componentele acestora se aplică alimentelor și hranei pentru animale (Hyldgaard et al. 2012) [88]. Prin urmare, este necesar să se efectueze cercetări viitoare în condiții in vitro și in
vivo. Costul ridicat al producției de uleiuri esențiale și concentrația scăzută a componentelor active limitează semnificativ posibilitatea utilizării lor în producția de plante. Pe de altă parte, uleiurile esențiale promit o sursă naturală de compuși antifungici și, în viitor, ar putea fi o sursă importantă pentru dezvoltarea de noi fungicide. 2.10 MĂSURI PREVENTIVE ÎMPOTRIVA MUCEGAIULUI PRODUS DE FUNGI PE CERELALE DIN DEPOZITE
2.10.1 Grupuri ecologice de ciuperci ale cerealelor
În timpul depozitării pe termen lung a cerealelor, fungi sunt, pe lângă insecte, principala cauză a degradării, de aceea trebuie efectuat un control eficient al temperaturii și al umidității boabelor depozitate (Christensen and Kaufmann, 1969[61]; Wicklow, 1995[140]) (Fig 1).
Mucegaiurile pot provoca încălzirea boabelor cu consecința formării punctelor fierbinți și a crustei, a pierderii substanței uscate, a reducerii valorii nutritive și a pierderii capacităţii de germinare a semințelor (Mills, 1992) [107]. Prin urmare, apariția ciupercilor toxigenice și a micotoxinelor în cereale este una dintre cele mai importante probleme sociale și economice din țările producătoare de cereale (Fleurat-Lessard, 2017) [78].
Conform condițiilor de umiditate și temperatură, există trei tipuri majore de ciuperci micotoxigene care se pot dezvolta în boabe depozitate (Miller, 1995) [105]:
I. Ciuperci patogene din plante higrofile– (ca de exemplu: Fusarium graminearum
Schwabe, numiţi şi “fungi de câmp”) II. Ciuperci saprofite și termofile – contaminează spicul de cereale și boabele de plante
stresate sau rănite înainte și după recoltare (de exemplu: Fusarium proliferatum
(Matsushima) Nirenberg sau Aspergilus flavus Link, numită şi “microfloră intermediară”)
III. Ciuperci xerofile - colonizează boabele după recoltare la umiditate optimă a cerealelor (de exemplu Erotium chevalieri L. Mangin, Penicillium verrucosum
Dierckx, Aspergillus ochraceus Wilhelm, numite şi “ microfloră de depozit”)
În momentul recoltării, boabele ar putea fi deja colonizate de ciuperci din câmp. Dar speciile care aparțin acelui grup sunt higrofile și vor dispărea după două-patru luni de depozitare (Pelhate, 1988) [118]. Microflora higrofilă este înlocuită în primul rând de speciile mezofile din microflora intermediară. Această microfloră intermediară va persista în timpul depozitării numai dacă umiditatea boabelor rămâne ridicată, mai mult decât 18%.
În această stare de umiditate ridicată (mai mult de 20%) după 6-10 luni de depozitare, se poate dezvolta, de asemenea, specia Trichoderma viride Persoon și grupul de ciuperci mucoroase. Atunci când umiditatea boabelor rămâne între 15,5% și 17%, microflora
31
intermediară este înlocuită după depozitarea timp de 4-6 luni de către speciile xerotolerante din genul Aspergillus și Penicillia (Fleurat-Lessard et al. 2010 [79], Fleurat-Lessard, 2017) [78].
2.10.2 Factorii care afectează dezvoltarea mucegaiului pe cereale
O abordare post-recoltare pentru prevenirea contaminării cu micotoxine a boabelor depozitate începe deja la recoltare. Intensitatea contaminării cu micotoxine depinde în mare măsură de momentul recoltării (Neme and Mohammed, 2017) [111]. De exemplu, recoltarea întârziată a crescut semnificativ nivelul de aflatoxină din porumb (Kaaya et al., 2005) [93].
Este esențial să se evite factorii care provoacă stresul culturilor în timpul recoltării, cum ar fi recoltarea timpurie și a boabelor deteriorate. De asemenea, cerealele recoltate trebuie curățate pentru a elimina boabele deteriorate și alte materii străine (Neme and Mohammed, 2017) [111]. Dacă 10% din cultură este contaminată în proporţie de 10-20% cu mucegai, ar trebui recoltată cât mai curând posibil (Munkwold, 2014) [110]. Containerele, inclusiv vagoanele și camioanele pentru transportul cerealelor din câmp în instalațiile de uscare și depozitare, trebuie să fie curățate, nedeteriorate, uscate și fără insecte. Potrivit Comisiei Codex Alimentarius (CAC, 2012), există o recomandare pentru prevenirea și reducerea micotoxinei în timpul depozitării; instalațiile de depozitare trebuie să fie structuri uscate, bine ventilate, care să asigure protecția împotriva ploii, drenajul apelor subterane, protecția pătrunderii rozătoarelor și a păsărilor, fluctuațiile de temperatură, aerarea cerealelor prin circulația aerului pentru a menține nivelurile uniforme ale temperaturii în zona de depozitare.
2.10.3 Temperatura cerealelor și umiditatea
Cei mai critici factori, care favorizează creșterea mucegaiului și producția de micotoxine în timpul depozitării sunt conținutul de temperatură și umiditatea boabelor.
Dacă cerealele, după recoltare au o umiditate mai mare decât limita pentru depozitare în condiții de siguranță, uscarea trebuie realizată cât mai curând posibil (cel mult 24-48 de ore). Pe de altă parte, atunci când umiditatea cerealelor recoltate este deja optimă pentru depozitarea în condiții de siguranță, se recomandă răcirea cerealelor sub 15°C în câteva luni după momentul recoltării, pentru a prelungi perioada de depozitare în condiții de siguranță și pentru a preveni decontaminarea fungică (Fleurat-Lessard, 2017) [78].
Recomandarea pentru majoritatea speciilor de cereale, pentru o depozitare în condiţii de siguranţă, în care incidenţa fungică nu poate avea loc, include un interval al conținutului de umiditate, de la 15,5% la 30°C până la 6,5% la 15°C.
Următorul conținut de umiditate este considerat sigur în timpul depozitării: 14-14,5% pentru grâu, orz și ovăz; 14% pentru porumb; 13-14% pentru orez și 7-8% pentru rapiță (Channaiah, 2011) [58].
Un alt parametru critic relevant pentru creșterea mucegaiului în cerealele depozitate este temperatura. Cerealele trebuie răcite după uscare și depozitate la 1°C - 4 ° C sau la 10°C - 15°C în timpul lunilor de vară (Munkvold, 2003) [109].
La temperaturi scăzute, creşterea ciupercilor și metabolismul sunt minime (Neme and Mohammed, 2017) [111]. Aflatoxinele sunt produse la temperaturi cuprinse între 12°C și 40°C
32
(Sweeney and Dobson, 1998) [134], în timp ce producția de OTA de P. verrucosum care aparține "microflorei de depozitare" are loc între 10°C și 25 °C (Olsen et al., 2004) [114].
Pentru a controla temperatura, aerarea este esențială pentru menținerea temperaturilor joase uniforme ale boabelor și evitarea focarelor localizate care pot rezulta din creșterea ciupercilor de depozit (Channaiah and Maier, 2014) [59].
2.10.4 Concentraţia de dioxid de carbon (CO2)
Depozitarea producţiei de grâu, în buncăre, cu un conținut critic de umiditate este principala cauză a respirației cerealelor și a creșterii producției de dioxid de carbon, care asigură condiții optime pentru creșterea mucegaiului. Astfel, monitorizarea dioxidului de carbon (CO2) în vrac poate fi utilă pentru depistarea precoce a deteriorării cerealelor depozitate de orice ciupercă (Fleurat-Lessard, 2017).
În acest scop, un microsensor poate fi setat în interiorul buncărelor de cereale pentru a măsura aerul intergranular și, în special, concentrația de CO2. Nivelul concentrației de CO2 (ppm; v / v) care indică riscul apariţiei mucegaiului este (Fleurat-Lessard, 2017) [78]:
• 400 şi 500 ppm (depozitarea în siguranță a cerealelor) • ~ 1000 ppm (problema ar putea apărea) • 3000 ppm ˃ (mucegaiul de fungi se produce cu siguranță dacă conținutul de umiditate ˃14.5%)
2.10.5 Prezența insectelor în timpul depozitării cerealelor
Insectele sunt un alt factor care influențează inocularea fungică și contaminarea cu micotoxine (Abbas et al., 2013) [48] în boabele depozitate.
Relația dintre insectele produselor depozitate și ciuperci, este reciprocă. Unele specii de insecte de depozitare sunt diseminatoare de ciuperci de depozit, iar unele sunt exterminatoare de ciuperci, în timp ce, pe de altă parte, unele ciuperci de depozitare resping insectele, iar unele dintre ele secretă toxine dăunătoare creșterii și dezvoltării lor (Dunkel, 1988) [72].
În timpul depozitării, insectele, datorită procesului lor metabolic, ridică temperatura cerealelor, ducând la "focare sau puncte fierbinți", uneori ajungând până la 57°C (Mills, 1989) [107].
Aceste focare, conduc la creșterea umidității în produs, asigurând astfel condiții optime pentru creșterea fungilor. De exemplu, când densitatea gărgăriţei de orez (Sitophilus oryzae L.) a crescut de la 15 adulți la 2100 într-un recipient închis umplut cu 138 g de grâu, conținutul de umiditate a crescut de la 15% la 35% (Sinha, 1984) [129]. Pande & Mehrotra (1988) au analizat probele de boabe de grâu atacate de gărgăriţă S. oryzae şi au decoperit ca A. flavus a fost cea mai frecventă specie din sistemul lor digestiv. Aceasta indică posibilitatea ca S. oryzae să transmită spori de ciuperci din boabe infectate în cele sănătoase. Spărturile de grâu obținute prin hrănirea insectelor permit accesul ciupercilor la endosperm. Deci, insectele reprezintă vectori de spori fungici (Jouany et al., 2009). Speciile de gărgăriţe din depozite (Sitophilus zeamais Motsch., Sitophilus granarius L., S.
oryzae) promovează creșterea și răspândirea ciupercilor de depozit în găurile grăunțelor, printr-o combinație de inoculare în timpul ovipoziției și prin activități metabolice și hrănire în staiul de larvă (Dunkel, 1988) [72], Further, Beti et al. (1995) au arătat că boabele de porumb infestate cu
33
A. flavus atacate de gărgăriţe au avut nivele mai ridicate de aflatoxină decât porumbul inoculat cu A. flavus fără gărgăriţe. Prezența gărgăriţelor de porumb S. zeamais a dus la creșterea conținutului de umiditate al boabelor care a fost corelat pozitiv cu conținutul de aflatoxină. Eugenio et al. (1970) a constatat că zearalenona (F2) a persistat prin metamorfoză de la larve până la stadiul adult al gandacul de grajd negru-roscat (Alphitobius diaperinus Panzer) și a gândacului de făină (Tribolium confusum DuVal.).
Pe de altă parte, unele insecte inhibă creșterea fungilor. Gărgăriţele, mai ales gărgăriţa grâului depozitat (Tribolium castaneum Herbst) secretă chinona, etil, metil și hidrochinona. S-a constatat că T. confusum, singur și chinonele lor adăugate la făină și grâu pot conduce la supresia fungică (Van Wyk et al., 1959) [137]. La randul sau, ciupercile afecteaza comportamentul, cresterea si reproducerea insectelor in ecosistemul depozitului (Dunkel, 1988) [72], care se referă direct la insectele fungivore, cum ar fi gândacul de cereale străin (Ahasverus advena L.) și gândacul păducel (Typhea stercorea L.).
În caz contrar, unele ciuperci precum A. flavus și A. parasiticus produc metaboliți (aflatoxina și acidul kojic, ochratoxina, citrinina, patulina) care sunt insecticide (Roberts și Yendol, 1971) [123] sau au efect inhibitor asupra T. confusum și a gândacului de tutun (Lasioderma serricorne Fab.) (Wright, 1979) [142]. 2.10.6 Tratamentul preventiv împotriva dezvoltării mucegaiului - uscarea cerealelor umede
Tratamentele preventive care limitează dezvoltarea mucegaiului în depozitele de cereale sunt reducerea umidității cerealelor prin uscarea la temperaturii scăzute sau moderate și răcirea cerealelor prin aerare forțată (Fleurat-Lessard, 2017) [78].
Principalele tipuri de sisteme de uscare în celulele de cereale, sunt (Brooker et al., 1992) [57]:
1. Condiționarea completă a recipientelor (celulelor), inclusiv operațiile de uscare, răcire, aerare și depozitare în același recipient.
2. Rezervor complet (celulă) cu dispozitive de agitare pentru amestecare verticală cu uscare la temperatura intermediară
3. Uscarea succesivă strat cu strat: încărcare secvențială a recipientului 4. Recircularea cerealelor uscate din fundul stratului sau al recipientului, la suprafață în
timpul procesului de uscare continuă 5. Procesul de aerisire uscată: cerealele sunt uscate în primul rând la temperaturi ridicate cu
procente de 2-3% umiditate mai mare decât umiditatea finală, apoi transferate fierbinți într-un recipient temperat unde restul de umiditate este îndepărtat prin aerare forțată 2.10.7 Prevenirea atacurilor insectelor
Artropodele și ciupercile produselor depozitate interacționează strict între ele (Sinha, 1979) [130], iar creșterea lor necesită condiții similare pentru temperatură (20-30 ° C) și pentru umiditatea cerealelor(> 14%)(Collins, 2012) [64]. Artropodele se pot hrăni cu ciuperci și dispersează sporii fungici, prin lipirea lor pe corpul lor sau prin trecerea lor prin intestin (Smrž & Čatská, 1989) [131], chiar dacă sporii unor fungi colonizează produse depozitate fără prezenţa artropodelor. În consecință, strategiile aplicate pre-recoltare, recoltare și depozitare (vezi: Tratament preventiv împotriva dezvoltării mucegaiului - uscarea cerealelor umede) pentru
34
reducerea dezvoltării ciupercilor și a contaminării micotoxice asupra boabelor poate preveni și infestarea cu artropode.
Depozitarea cerealelor curate, uscate și de bună calitate reprezintă o practică preventivă fundamentală. Cerealele curate, păstrate timp de mai multe luni în hambarele relativ neperturbate, cu 14% umiditate și temperatură moderată, arată o densitate scăzută a artropodelor a căror fluctuație depinde în principal de temperatura și de interacțiunile dintre prădător și pradă. În mod obișnuit, companiile au echipamente pentru îndepărtarea prafului, a impurităților, a semințelor deteriorate și a dăunătorilor înainte de depozitarea sau prelucrarea cerealelor.
Salubritatea instalațiilor de depozitare și a mediului înconjurător este principala acțiune preventivă (https://entomology.ca.uky.edu/ef145). De obicei, infestările cu artropode ale cerealelor depozitate se dezvoltă din numărul mic de dăunători care există deja în sau în apropierea instalațiilor de depozitare. Un program eficient de salubritate trebuie să elimine sau să diminueze foarte mult potențialul de infestare prin curățarea atentă și prin aplicarea pesticidelor a echipamentelor de manipulare a cerealelor, a recipientelor goale, a morilor sau a altor instalații, zonele care înconjoară containerele și instalațiile, sub podele false ori sisteme de ventilaţie. Fisurile sau găurile trebuie reparate deoarece pot servi ca surse de infestare.
Aplicarea agenţilor de protecţie la cerealele depozitate în vrac și fumigațiile oferă o protecție pe termen scurt împotriva artropodelor din depozite, care pot recupera sau reinvada produsele ca fiind degradate chimic și sunt afectate de dezvoltarea rezistenței la multe substanțe active sintetice (Stejskal et al., 2014) [132]. Fumigațiile necesită o atenție deosebită (nivelul de boabe în recipiente, controlul temperaturii, integritatea containerelor, conținutul de umiditate) pentru a obține cea mai mare eficiență a tratamentelor trebuie realizate de operatori instruiți.
O abordare integrată se dezvoltă în prezent și ar putea oferi mai multe șanse în controlul preventiv și curativ al artropodelor din depozitele de cereale (Stejskal, 2014) [132].
2.11 Concluzii
Prevenirea infestării cu ciuperci micotoxice a cerealelor depozitate poate fi gestionată printr-o strategie preventivă. Aceasta include prevenirea dezvoltării mucegaiului prin menținerea umidității boabelor sub limita critică pentru creșterea fungilor; monitorizarea umidității boabelor și a schimbărilor de temperatură în timpul perioadei de depozitare; reducerea umidității și a temperaturii în buncărele de depozitare; produse de monitorizare a insectelor și măsuri de combatere a insectelor .
DEPOZITE DE CEREALE
Spaţiile de depozitare sunt împărțite în trei grupe: 1. Cerealele sunt depozitate pe pământ neprotejate. 2. În saci adunati sub orice adăpost convenabil. 3. Silozuri de cereale.
În funcție de scop, echipament și mărime, silozurile de cereale sunt împărțite în patru grupuri. Primul grup include coşuri situate în apropierea fermelor și sunt utilizate pentru intrarea și păstrarea cerealelor până la preluare.
35
Cel de-al doilea grup cuprinde colectarea depozitelor, în formă de siloz, amplasate pe rute importante de trafic. Al treilea grup de depozite are ascensoare (hambar), situate de obicei în porturi și zone cu trafic intens. Are o capacitate mare (1000 t pe oră) și depozitează cerealele într-un timp foarte scurt, până la livrarea ulterioară de la nave către facilități de metrou. Al patrulea grup include depozite pentru fabricile de prelucrare, cum ar fi mori, fabrici de furaje, fabrici de ulei și altele. Acestea sunt echipate cu dispozitiv pentru îndepărtarea impurităților, a scalei de curgere și a dispozitivelor pentru prepararea amestecurilor de măcinare.
Silozurile de cereale sunt cele mai frecvent utilizate tipuri de depozite a cerealelor. Ele diferă în funcție de forma celulei de stocare și de aranjarea celulelor din baterii. Betonul armat este utilizat pentru construcția de silozuri de mare capacitate și material metalice pentru construirea unor coşuri de depozitare mai mici specifice fermelor. Părţile componente standard pentru silozurile celulă includ: Gura de aerisire, Gura de alimentare, Acoperișul silozului, Peretele silozului, Ventilator, Fundația silozului, Placa circulară din beton, Suporți pentru podea complet perforată, şi benzi transportoare pentru umplerea și golirea silozului. Cea mai obișnuită formă a silozurilor celulă, este cilindrică cu secțiune transversală rotundă sau secțiune transversală pătrată și hexagonală. Lungimea celulei este de la 4 la 10 m, dar cel mai adesea este de la 7 la 8 m. Volumul silozului celular este de la 700 la 2000 m3, și în general este de 1000-1500 m3.
Silozurile celule sunt formate dintr-o parte cilindrică și o pâlnie, care sunt acoperite de un panou prevăzut cu orificii de încărcare. Există, de asemenea, sonde care măsoară temperatura la diferite înălțimi ale celulei. Celulele cu diametrul mare au mai multe canale în partea de jos și un orificiu pentru golire.
Sub gaura de intrare există un difuzor pentru împrăștierea cerealelor, astfel încât nu există posibilitatea de a forma un blocaj și prevenirea auto-sortării cerealelor. Există una sau mai multe găuri de intrare pentru umplerea celulelor. Diferențe mari de calitate pot apărea între prima și ultima cantitate, dacă se formează blocaj. Acest lucru poate fi evitat prin efectuarea corectă a orificiilor de admisie și de evacuare. Galeria de deasupra este un spațiu deasupra silozului și există transportoare cu tuburi de încărcare silo-celulare care sunt conectate la maşinărie. Galeria de dedesubt este un spațiu sub pâlnie, care este de asemenea conectată la maşinărie prin tunel.
Moduri de aranjare a cerealelor în silozurile
celulă şi în baterie.
36
Maşinăria este o parte integrantă a silozului și este construită în interiorul silozului sau separat. Se compune din dulap de control al procesului, capete de ascensor și camere de deșeuri.
Buncărele de umplere sunt situate în apropierea silozului și au grilaje de protecție pentru a preveni căderea obiectelor dure în echipamentele de transport. În partea de jos a buncărului este un canal, cu un transportor cu lanț al cărui rol este de a extrage cerealele din buncăr. Sunt utilizate lamele mecanice sau echipamente mecanice speciale pentru agitare, pentru golirea cerealelor din vagon. Acest proces implică toate măsurile tehnice și tehnologice de la recepţia la livrarea cerealelor, pentru a menține calitatea cerealelor cu cât mai puține pierderi și costuri. Se bazează pe pregătirea cerealelor și, dacă aceste măsuri sunt finalizate, cerealele sunt pur și simplu depozitate și păstrate în condiţii optime.
Echipamentul silozului constă din: dispozitive de recepţie a cerealelor, dispozitive de transport, mașini de curățat, balanțe de debit, echipamente pentru livrarea cerealelor, dispozitive de aspirație, dispozitive de reglare a sistemelor de cântarire.
Echipamente de recepţie a cerealelor. Cerealele sunt livrate la depozit de vehicule rutiere, căi ferate sau nave. Recepţia cerealelor din vehiculele rutiere se realizează prin recepționarea buncărelor cu o platformă de descărcare, ca în figura de mai jos.
Recepția cerealelor de pe calea ferată se realizează prin lopeți mecanice sau dispozitive
speciale cu vibrații, în funcție de capacitate. Recepţia cerealelor de la echipamentele plutitoare se face prin ciocane pneumatice, care sunt scufundate în masa de cereale și transportă cereale către separatoarele ciclonice. O altă modalitate este de a utiliza redresoare verticale speciale.
Dispozitivele de transport, sunt reprezentate de ascensoare, transportoare cu lanț și
benzile transportoare. Există posibilitatea de a utiliza și tuburi de gravitație. Se utilizează echipamente cu o capacitate de până la 1000t / h.
Ascensoarele cu găleți sunt folosite pentru transportul cerealelor pe verticală. Pentru transportul orizontal al cerealelor se folosesc transportoare cu lanț care ocupă puțin spațiu, dar cheltuiesc multă energie.
37
Sunt utilizate diferite benzi transportoare pentru căderi orizontale și înclinate, pod rulou, benzi transportoare reversibile și speciale. Alte tipuri de transport în silozuri sunt transportoarele cu tracțiune, vibrații, aerogravitații și transportoarele cu airbag-uri.
Sunt utilizate echipamentele de curățare pentru îndepărtarea întregii părți a impurităților din silozuri, atât impurități dure cât și impurități mari, mici și particule ușoare, care sunt îndepărtate prin aspirație. Sunt utilizate în acest scop diferite tipuri de aspiratoare de siloz.
Cântarele de flux. Acestea sunt situate deasupra aspiratorului. Ele oferă informații despre cantitatea de cereale din celule și din siloz. Cantitatea probelor depinde de capacitate. Pentru a realiza un flux continuu, buncărele sunt plasate sub și peste sistemele de cântărire
Există, de asemenea, buncăre de anumite capacităţi (5 până la 70 tone) și buncăre de capacităţi continue.
Echipament pentru livrarea cerealelor. Cerealele sunt livrate în același mod în care sunt aduse. Soluțiile tehnologice de livrare depind de modul de livrare și capacitate, precum și tipul de depozitare. Sistemul constă în prelevare automată, care ar trebui să furnizeze un eșantion reprezentativ care intră într-un buncăr de cântărire. Dacă boabele nu corespund condiţiilor de calitate, se întoarc la siloz utilizându-se caseta de comutare.
Sunt instalate două buncăre dacă este necesar un control mai bun al calității. Conductele flexibile sunt folosite pentru umplerea camioanelor și bărcilor, iar aspirația este conectată pentru a preveni împrăștierea prafului. Vagoanele sunt umplute prin ferestre sau prin partea superioară a ușii. Transportoarele sau tuburile de gravitație sunt utilizate pentru livrarea cerealelor în silozurile din vecinătate. Există, de asemenea, deschideri în partea de jos a celulei din siloz, pentru descărcarea celulelor în caz de dezastru.
Echipamente pentru aspirație în depozite. O cantitate mare de praf care poate fi găsită în siloz are un efect negativ asupra oamenilor și asupra funcționării echipamentului.
Praful din depozit este împărțit în trei clase: 1.Praf care devine exploziv la o concentrație de 15 g / m3. Este praful care are loc în timpul măcinării cerealelor. 2. Praful dur care conține materii organice și anorganice care ard mai greu. Concentrația minimă care duce la inflamare este de 15-65 g/m3 și temperatura de 350-450°C. 3. Praful de origine anorganică care necesită o concentrație de 65g / m3 și o temperatură de peste 450˚C pentru a provoca inflamația.
Cantitatea de aer necesară pentru aspirație este determinată în funcție de cantitatea de praf separată. Aspirația poate fi individuală sau grupată. Fiecare sistem de aspirație constă dintr-o plasă de aspirație (conectori, conducte, regulatoare de debit de aer), separatoare de praf (separatoare ciclonice, simple, în baterie sau combinate) și ventilatoare.
Echipamente de măsurare a depozitării
Datorită acestui echipament este posibil să se monitorizeze starea cerealelor în depozit și să se gestioneze procesul tehnologic de depozitare.
38
Acest echipament este automat și de obicei, măsoară și reglează: umiditatea și sortarea cerelalelor din punct de vedere al umidităţii, temperatura de depozitare a cerealelor, nivelul de cereale în spaţiile și celulele buncărului, fluxul de cereale și prelevarea automată a probelor. Este important să se controleze umiditatea cerealelor pentru a evita autoîncălzirea boabelor și daunele ulterioare. Prin urmare, dispozitivele sunt setate pentru a determina în mod automat conținutul de umiditate al cerealelor în cele mai potrivite locații și de adaptare a sistemului tehnologic. Temperatura este cel mai bun indicator al stării cerealelor depozitate. Sondele cu senzori sunt utilizate pentru măsurarea temperaturii. Problema majoră în măsurarea și controlul temperaturii în siloz este rezistența mare la căldură a cerealelor. Din acest motiv, senzorii trebuie să fie poziționați dens. Cele mai frecvent utilizate dispozitive de măsurare a nivelului de boabe sunt membrana, vibrațiile și dispozitive cu aripi. Ele sunt plasate în partea de jos și în partea superioară a celulei și se înregistrează starea celulelor pline și goale. Pot fi de asemenea utilizate dispozitivele ultrasonice și radioactive.
Controlul constant al calității cerealelor, precum și prelevarea corectă și reprezentativă, sunt foarte importante în depozite. Dispozitivul din imaginea de mai jos este utilizat pentru prelevarea automată a probelor.
39
Capitolul 3. METODE OFICIALE PENTRU EȘANTIONARE ȘI CUANTIFICAREA A MICOTOXINELOR ÎN CEREALE
3.1 Introducere Deoarece micotoxinele sunt invizibile, fără miros și fără gust, singura modalitate de a
determina dacă cerealele conțin acești compuși nedoriți este de a le analiza, dar nu este întotdeauna ușor, mai ales dacă se utilizau în trecut metode analitice pentru detectarea micotoxinelor. Studiile realizate de cațiva cercetători au arătat că eșantionarea este de obicei cea mai mare sursă de variație asociată cu procedura de analiză a micotoxinelor [1, 2, 3, 4, 5, 6]. De exemplu, aproape 90% din erorile asociate cu testarea aflatoxinelor poate fi asociată eșantionării.
Un plan de eșantionare a micotoxinelor este definit de procedura de analiză a micotoxinelor (dimensiunea probei, metoda de pregătire sau metoda analitică) si limita de acceptare/respingere. Deoarece variabilitatea asociată cu fiecare etapă a procedurii de analiză a micotoxinelor, concentrația reală a unui lot întreg nu poate fi determinată cu o certitudine de 100%. Ca rezultat, anumite loturi vor fi clasificate incorect datorită programului de eșantionare.
Anumite loturi corespunzătoare vor fi respinse de planul de eșantionare (riscul vânzătorului sau rezultate fals pozitive) și anumite loturi necorespunzătoare vor fi acceptate de planul de eșantionare (riscul cumpărătorului sau rezultate fals negative). Amploarea acestor riscuri este legată direct de amploarea variabilității asociate cu procedura de determinare a conținutului de micotoxine. Este dificil pentru un exportator să dețină un program eficient de control atunci când limitele de reglementare și metodele de eșantionare diferă atât de mult între țările care desfășoară activități comerciale. Pentru a facilita comerțul și pentru a oferi protecție consumatorului, ar fi de dorit pentru toate țările implicate în comerț să aibă aceleași limite pentru micotoxine și același plan de eșantionare.
Deși standardizarea planurilor de eșantionare între țările ce participă la activități comerciale este importantă, orice plan de eșantionare standardizat trebuie să fie elaborat pentru a minimiza atât riscurile vânzătorului cât și ale cumpărătorului până la cele mai mici niveluri posibile pe care le vor permite resursele. Reducerea variabilității procedurilor de analiză a micotoxinelor va reduce atât riscul cumpărătorului cât și pe cel al vânzătorului. Este important să înțelegem că sursele de eroare din procedura de analiză a micotoxinelor pentru a putea reduce eficient erorile.[6] Eșantionarea este de obicei cea mai mare sursă de eroare ce rezultă dintr-un pas crucial al planului de cuantificare ce joacă un rol foarte important în precizia determinării nivelurilor de micotoxine, ce sunt distribuite heterogen intr-un lot. Cu toate acestea, deși sunt disponibile metode analitice excelente, este dificil să estimăm precis concentrația de micotoxine. Rezultatele fals negative sunt foarte comune în testarea micotoxinelor, în special datorită eșantionării necorespunzătoare și a pregătirii probelor. Atunci când sunt prelevate prea puține probe sau când numărul total este prea mic, este mult mai comun să ”ratezi” o probă contaminată. Acest tip de rezultat este comun și atunci când întreaga probă eșantionată este divizată înainte de măcinare. Numărul de rezultate fals negative poate varia de la 5% până la 90%. Pe de altă parte, rezultatele fals pozitive reflectă un răspuns mai mare decât cel reprezentativ. Acest tip de rezultat nu este la fel de comun ca cel fals negativ. Totuși, atât rezultatele fals negative cât și cele fals pozitive sunt defavorabile. (Tabelul 1) [3].
40
Tabelul 1. Consecințele rezultatelor fals negative sau fals pozitive Fals negativ Fals pozitiv Cheltuielile pentru analizarea micotoxinelor pierdute. Implică costuri suplimentare pentru transport atunci când procesatorul de cereale constată contaminarea cu cereale, respinge lotul și îl returnează vânzătorului. Vânzătorul își pierde credibilitatea și încrederea. Pot urma procese costisitoare dacă marfa este procesată și apar efecte negative asupra sănătății datorită consumului alimentelor sau a furajelor.
Cerealele corespunzătoare sunt vândute la un pret mai mic. Amestecarea sau tratarea cerealelor corespunzătoare implică costuri inutile. Rezultatele necorespunzătoare reflectă neadecvat programul general de testare și împiedică vânzătorii potențiali de cereale să ofere cereale pentru achiziție.
În Regulamentul (CE) nr. 401/2006 al Comisiei din 23 februarie 2006 de stabilire a modalităților de prelevare de probe și a metodelor de analiză pentru controlul oficial al conținutului de micotoxine din produsele alimentare și alte amendamente, criteriile generale privind metodele de eșantionare și metodele de analiză au fost determinate pentru a asigura obținerea unor niveluri comparabile de performanță și rezultate. De aceea, metodele de eșantionare și criteriile de performanță pentru metodele de analiză utilizate pentru controlul oficial al micotoxinelor fiind cuprinse intr-un singur act legal pentru a fi mai ușor de aplicat. Luând în considerare toate aceste aspecte, procedurile trebuie sa fie adoptate in eșantionarea pentru controlul oficial al nivelurilor pntru micotoxine precum și în cele privind pregătirea procelor și metodele de analiză sunt detaliate in Reglementarea Comisiei nr. 401/2006 și alte amendamente (Tabelul 2). Tabelul 2 Lista de regulamente și link-ul către site
Regulamentul privind eșantionarea Link Regulamentul Comisiei (CE) Nr. 401/2006 din 23 februarie 2006 ce conține metodele de stabilire a modalităților de prelevare de probe și a metodelor de analiză pentru controlul oficial al conținutului de micotoxine din produsele alimentare - Document 32006R0401
https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri=celex%3A32006R0401
Regulamentul (UE) nr. 519/2014 al Comisiei din 16 mai 2014 de modificare a Regulamentului (CE) nr. 401/2006 în ceea ce privește modalitățile de prelevare de probe pentru loturi mari de mirodenii și suplimente alimentare, criteriile de performanță pentru toxinele T-2 și
https://eur-lex.europa.eu/legal-content/SL/TXT/?uri=uriserv:OJ.L_.2014.147.01.0029.01.ENG
41
HT-2 și pentru citrinin și metodele de analiză de screening – Document 32014R0519
Probele depozitate în vederea analizei trebuie să fie păstrate într-o pungă de hârtie sau într-o cutie de carton și în locuri răcoroase și uscate ce nu vor permite dezvoltarea fungilor sau continuarea producerii de micotoxine. În Anexa I a metodei de eșantionare pentru cereale și produse din cereale sunt detaliate și trebuie să fie aplicate pentru controlul oficial al nivelurilor maxime stabilite pentru aflatoxina B1, aflatoxine totale, ochratoxina A și toxinele produse de Fusarium în cereale și produse cerealiere. Greutatea probei increment trebuie să fie de aproximativ 100 de grame, dacă nu este altfel definită în partea B a Anexei I. În cazul loturilor din ambalajul cu amănuntul, greutatea eșantionului elementar depinde de greutatea pachetului de vânzare cu amănuntul. În cazul în care ambalajul cu amănuntul este mai mare de 100 grame, acesta va conduce la obținerea unor probe agregat ce vor cântări mai mult de 10 kg. Dacă greutatea unui ambalaj cu amănuntul depășește cu mult 100 de grame, atunci vor fi prelevate câte 100 de grame din fiecare ambalaj cu amănuntul ca probă increment. Acest lucru poate fi realizat atunci când proba este dusă la laborator. Totuși, în cazurile în care această metodă de eșantionare va conduce la consecințe comerciale inacceptabile ce vor conduce la deteriorarea lotului (datorită formelor de ambalare, mijloacelor de transport, etc.), atunci poate fi aplicată o metodă alternativă de eșantionare. De exemplu, în cazul în care un produs valoros este comercializat în ambalaje cu amănuntul de 500 grame sau 1 kg, proba comună poate fi obținută prin amestecarea unui număr de probe increment ce este mai mic decât numărul indicat in Tabelurile 2 și 3, cu condiția ca greutatea probei agregat să fie egală cu greutatea necesară a probei agregat menționată în Tabelele 3 și 4. Atunci când ambalajul cu amănuntul este mai mic de 100 de grame și diferența nu este prea mare, un ambalaj cu amănuntul este considerat probă increment, obținând astfel o probă agregat de mai puțin de 10 kg. Dacă greutatea ambalajului cu amănuntul este mai mică de 100 grame, o probă increment va fi constituită din două sau mai multe ambalaje cu amănuntul, iar cele 100 de grame vor fi aproximate cat mai aproape posibil. Tabelul 3 – Subdivizarea loturilor în subloturi în funcție de produs ți de greutatea lotului Produs Greutatea
lotului (tone)
Greutatea sau numărul de subloturi
Numărul de probe increment
Greutatea probei agregate(kg)
Cereale și produse din cereale
≥ 1,500 500 tone 100 10 > 300 și < 1,500 3 subloturi 100 10 ≥ 50 și ≤ 300 100 tone 100 10 < 50 — 3-100 (*) 1-10
(*) În funcție de greutatea lotului – vezi Tabelul 3. Metode de eșantionare pentru cereale și produse din cereale pentru loturi ≥ tone
42
Cu condiția ca sublotul să fie separat fizic, fiecare lot va fi subdivizat în subloturi. Având
în vedere că greutatea lotului nu este întotdeauna un multiplu exact al greutății subloturilor, greutatea sublotului poate depăși greutatea menționată cu un maxim de 20%. În cazul în care lotul nu poate fi fizic separat în subloturi, un minim de 100 de probe increment este luată din loturi. Fiecare sublot poate fi eșantionat separat. Numărul de probe increment: 100. Greutatea probei agregat= 10 kg.
Dacă nu este posibil să dezvoltăm metoda de eșantionare stabilită pentru acest punct datorită consecințelor comerciale inacceptabile ce rezultă din afectarea lotului (datorită modalităților de ambalare, a modalităților de transport, etc.) o metodă alternativă de eșantionare poate fi aplicată dar trebuie să fie cât mai reprezentativă și complet descrisă și documentate.
Ca metodă alternativă de eșantionare poate fi aplicată în cazurile în care este practic
imposibil să aplicăm metoda de eșantionare mai sus menționată. Acesta este cazul în care loturi mari de cereale sunt depozitate în depozite sau în care cerealele sunt depozitate în silozuri. [1].
Metode de eșantionare pentru cereale sau produse din cereale pentru loturi < 50 tone
Pentru loturile de cereale și produsele din cereale mai mici de 50 de tone, planul de
eșantionare va fi utilizat cu 10 până la 100 de probe increment, în funcție de greutatea lotului, și rezultâns într-o probă agregat de 1 până la 10 kg. Pentru loturi foarte mici ((≤ 0,5 tone) un număr mai mic de probe increment poate fi prelevat, dar proba agregat ce combină toate probele increment trebuie să aibă în acest caz cel puțin 1 kg.
Tabelul 3 poate fi utilizat pentru a determina numărul de probe increment ce trebuie să fie prelevate. Tabelul 4 Numărul de probe increment ce pot fi prelevate in funcție de greutatea lotului de cereale și a produselor din cereale Greutatea lotului (tone) Numărul de probe
increment
Greutatea probei agregat (kg)
≤ 0,05 3 1 > 0,05-≤ 0,5 5 1 > 0,5-≤1 10 1 > 1-≤3 20 2 > 3-≤ 10 40 4 > 10-≤ 20 60 6 > 20-≤ 50 100 10 (1) Îndrumare privind eșantionarea loturilor va fi oferită într-un document ghid disponibil din 1 iulie 2016 la următoarea adresă: http://europa.eu.int/comm/food/food/chemicalsafety/contaminants/index_en.htm Sunt adoptate criterii diferite în metode de eșantionare pentru alimentele destinate sugarilor și pentru alimentele bazate pe cereale pentru copii. Acestea corespund cu cele din Tabelul 3.
43
Prin Regulamentul (UE) nr. 519/2014 din 16 mai 2014, Regulamentul nr. 401/2006 privind metodele de eșantionare pentru loturi mari, condimente și suplimente alimentare, criterii de performanță pentru toxinele T-2, HT-2, citrinină și metode de screening a fost amendat în particular referitor la subdivizarea loturilor în subloturi în funcție de produs și greutatea lotului, precum și protocoale analitice. Reglementările în țările non UE Conform Recomandărilor Comisiei, pentru evaluarea stării culturilor de porumb și monitorizarea conținutului de micotoxine în porumb a recoltei din 2017, Ministerul Agriculturii, Pădurilor și a Managementului apelor din Republica Serbia, 2017, pentru eșantionarea în timpul recepției cerealelor în depozite și silozuri, eșantionarea este realizată conform procedurii menționată mai sus, în funcție de cantitatea de materiale [30]. Conform legii pentru Siguranță Alimentară [31], Regulamentul privind calitatea hranei pentru animale și a Regulamentului privind cantitățile maxime admise de reziduuri de produse fitosanitare din produsele alimentare și furajele pentru care se determină cantitățile maxime autorizate de reziduuri de produse fitosanitare[33], intrarea corespunzătoare a porumbului sănătos trebuie organizată în depozite. 3.2 METODE PENTRU DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE MICOTOXINE
Metode de detectare fiabile și sensibile sunt necesare pentru monitorizarea contaminării cu micotoxine, și metodele analitice trebuie să aibă limite joase de detecție, în general mg/kg (ppm) sau µg/kg (ppb), în funcție de micotoxinele individuale ce vor fi analizate. Analiza la aceste niveluri trebuie să fie foarte specifice pentru a evita interferențele analitice și poate produce mari incertitudini. O gamă largă de metode analitice, ce oferă metode flexibile si largi de analiză și în unele cazuri detecție, sunt disponibile. Majoritatea dintre ele se desfășoară în laborator și intră în cazul categoriilor generale fie a metodelor cromatografice sau a metodelor imunologice bazate pe utilizarea anticorpilor cu cromatografie analitică lichidă, legată cu spectroscopia în masă ce este foarte populară (Shepard, 2008), iar cercetările se desfășoară rapid in tehnologiile OIT. Toate aceste metode analitice implică mai multe etape: măcinarea probei, extracția cu solvent și purificarea pentru determinarea cromatografică, implică curațarea înainte de determinarea finală. O altă componentă a complexității analizei micotoxinelor este faptul că structurile chimice variate înseamnă că metodele specifice sunt necesare pentru toxinele individuale. Această constrângere este acum depășită prin utilizarea unor metode spectrometrice de masă scumpe și sofisticate. Datorită acestei multitudini de metode și a caracteristicilor lor individuale, atunci când se selectează o metodă de analiză a micotoxinei, trebuie luată în considerare scopul pentru care sunt necesare rezultatele, matricea ce trebuie analizată, limita de detectare necesară și expertiza și infrastructura disponibilă. Pentru supravegherea și controlul nivelurilor de micotoxine și implementarea reglementărilor privind micotoxinele în țările dezvoltare, câteva metode analitice oficiale au fost validate prin studii interlaboratoare colaborative realizate sub auspiciile structurilor internaționale cum sunt AOAC Internațional si Comitetul European pentru Standardizare (CEN).
44
Diferite proceduri cum sunt (a) metodele pentru pre-tratamentul probelor, diferite proceduri cum sunt extracția lichid-lichid (LLE), extracția fluidelor (SFE) și extracția on masă solidă (SPE) sunt disponibile. In mod similar metode de separare cum sunt (TLC), cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC), gaz cromatografie (GC), și electroforeza capilară (CE) pot fi utilizate precum și altele cum este ELISA sau cea bazată pe anticorpi sau aptameri.
Majoritatea metodelor oficiale se bazează pe cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) cu diverși detectori, și cea mai recente din aceste metode utilizând coloanele de imunoafinitate (IAC) curățarea probei înainte de analiza HPLC.
Mai recent, progresele realizate prin cuplarea spectrometriei de masă la HPLC au permis chimiștilor analitici să combine etapele analitice cu un test de confirmare prin măsurarea spectrului de masă al vârfului HPLC. Natura foarte specifică a spectrometriei de masă a fost utilizată pentru a evita purificarea extractului și pentru a dezvolta metode bazate pe multitoxine, ce pot fi aplicate amestecului de micotoxine într-un singur experiemnt.
Gaz cromatografia ECD (GC_ECD), GC-MS, cromatografia lichidă de înaltă performanță HPLC-UV/DAD/FD sau cromatografia lichidă LC/MS sau LC-MS/MS sunt utilizate în mod curent. Aceste metode sunt caracterizate de sensibilitate si reproductibilitate dar necesită un timp lung pentru obținerea rezultatelor și personal instruit pentru utilizarea lor.
Echipamentul este costisitor iar pregătirea probelor înainte de analiza în sine durează mult timp. Toate acestea au un impact consistent asupra costurilor analizei așa că sunt propuse tehnologii mai ieftine pentru screening-ul preliminar.
3.2.1 Cromatografia gazoasă (CG)
Gazul oferă mijloace pentru deplasarea probei prin coloană; posibilitățile de alegere a gazului sunt restricționate și cele mai utilizate sunt nitrogenul și heliul. Este necesară controlarea fluxului de gaz deoarece poate avea impact în performanța de separare.
Procesul cromatografic începe atunci când proba este introdusă în coloană, ideal fără a perturba fluxurile din coloană. De aceea, eliberarea probei în coloană trebuie să fie controlată, reproductibilă și rapidă. GC include un cuptor ce este o componentă importantă în acest proces, deoarece starea de vapori trebuie să fie mentinută prin separare prin gaz cromatografie , de aceea, trebuie menținut un bun control al temperaturii. O altă componentă importantă a gaz cromatografiei este detectorul ce a evoluat de-a lungul anilor. În prezent, spectrometrul de masă (MS) promite a fi cea mai adecvată metodă cuplată cu (CG)
3.2.2 Cromatografia lichidă
Principiul cromatografiei lichide este procesul de separare ce este bazat pe distribuția între două faze. Proba este propagată printr-un lichid ce infiltrează faza solidă staționară. De aceea o varietate de faze staționare poate fi utilizată în sistemele de cromatografie lichidă. Procesul de cromatografie lichidă și separarea probelor poate fi realizată atat in sistemele cu presiune joasă cât și în cele cu presiune înaltă. Selecția corectă a fazei staționare de separare și a fazei mobile poate fi fază normală, fază reversibilă si excluderea pe baza dimensiunii (SEC) sau a schimbului de ioni (IEC).
45
3.2.3 Cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC)
HPLC este acum cea mai comună tehnică cromatografică pentru detectarea unei mari diversități de micotoxine. Curățarea probei de analiză poate fi realizată prin partiționare lichid-lichid, extracție în fază solidă (SPE), cromatografie în coloană, imuniafinitate de curățare (IAC) și coloane multifuncționale de curățare.
Recent, utilitatea IAC a devenit foarte populară datorită selectivității foarte mari. Coloanele IAC pot fi utilizate pentru prepararea probelor înainte de analiza HPLC fie în mod off-line cât și în mod-in-line. În timpul curățării off-line cu ajutorul imunoafoinității, pasul de purificare este realizat separat de către un expert, coloana IAC este cuplată direct la sistemul HPLC in curățarea in-line cu ajutorul imunoafinității. Un proces cromatografic poate fi definit ca o tehnică de separare ce implică transferul de masă între faza staționară și faza mobilă. HPLC utilizează faza lichidă mobilă pentru a separa compomentele dintr-un amestec. Faza staționară poate fi lichidă sau solidă.
Cu toate acestea, în plus față de aceste metode oficiale, metodele de screening rapid au fost dezvoltate (Van Amerongen et al., 2003; Zheng et al., 2005) pentru situații in care sunt necesare decizii rapide, cum sunt hambarele, silozurile și fabricile, și astfel de metode pot fi adaptate pentru transferul în țările în dezvoltare.
Multe dintre aceste metode rapide sunt bazate pe principii imunologice și utilizează anticorpi folosiți împotriva micotoxinelor specifice. Includ teste cantitative ELISA, metode fluorometrice, dispozitive de curgere laterala și o serie de teste ce oferă un rezultat da/nu pentru contaminarea peste o anumită limită sau sub un nivel de control. Există multe comentarii privind metodele pentru analiza micotoxinelor in țările dezvoltate sau în laboratoarele pentru certificarea exporturilor pentru a certifica bunurile pentru export (Krska et al., 2008; Solfrizzo et al., 2009; Maragos and Busman, 2010; Shephard et al., 2012) în timp ce în țările în dezvoltare sunt utilizate mai puține metode sofisticate, cum sunt cromatografia în strat subțire (TLC) sau metodele bazate.
Această gamă largă de metode comerciale imunologice are o largă aplicație în laboratoarele din care lipsesc instrumentele sofisticate sau în care accesul la aceste instrumente este limitat de cererea mare. Dintre acestea, ELISA cantitativă sau semicantitativă, ce nu necesită purificarea probelor, sunt larg utilizate și au avantajul de a permite manipularea mai multor probe într-o singură determinare. Purificarea extractelor probelor prin IAC fost utilizată pentru măsurarea fulorescenței utilizând fluorometre cu calibrare proprie. În ultimii ani, tehnica polarizării fluorescenței (FP) a fost aplicată cu succes pentru determinarea micotoxinelor. În loc să măsoare fluorescența totală, FP măsoară orientarea emisiei de fluorescență, care este legată de viteza de rotație moleculară. Avantajul FP este că se realizează direct în extractul de soluție (Lippolis et al., 2006). Dispozitivele de flux lateral pot oferi rezultate da/nu pentru contaminare peste sau sub un nivel de control, și au fost comercializate cu cititoare optice pentru a oferi rezultate cantitative. Trebuie să se se recunoască faptul că tate metodele bazate pe anticorpi sunt responsabile de reactivități încrucișate și efecte de matrice, dar sunt extrem de utile ca o primă linie de analiză. Acolo unde este posibil, probele problematice pot fi confirmate prin metode HPLC.
Cei mai frecvent utilizați solvenți sunt combinații de metanol:apă, metanol:acetonitril:apă și acetonitril:apă, după aceea extracția ce utilizează coloanele SPE sau coloanele de
46
imunoafinitate (IAC). Coloanele de imunoafinitate (IAC) sunt larg utilizate pentru curățarea și izolarea micotoxinelor extrase din alimente și lichide biologice, în special aflatoxine, ochratoxina A și fumonizine. Coloanele sunt pregătite prin legarea anticorpilor specifici pentru o anumită micotoxină de un suport special activat pentru fază solidă. Micotoxina din extractul sau fluid se leagă de anticorpi, iar impuritățile sunt înlăturate cu apă sau soluții apoase și apoi micotoxinele sunt desorbite cu un solvent miscibil cum este metanolul.
Astfel de metode rapide pentru analiza micotoxinelor sunt descrise pe scurt.
3.2.4 Cromatografia în strat subțire
Cromatografia în strat subțire (TLC) a fost prima metodă stabilită pentru separarea și
cuantificarea micotoxinelor. TLC oferă o alternativă mai puțin costisitoare la alte metode bazate pe cromatografie. În special în țările în dezvoltare are un rol important în scopul supravegherii și controlul valorilor limită reglementate (Gilbert and Anklam, 2002).
Investigații extensive în domeniul TLC au condus la metode foarte sensibile și cu separare bună cu eforturi tehnice si metodologice relativ mici (rezervor, placă acoperită, detector UV). Pe scurt, după preparare, eșantionul este păstrat împreună cu standardele pe o placă de silicagel. Este apoi separat într-un rezervor cu faza mobilă și determinarea poate fi realizată cu lumină UV cu unde lungi sau scurte, autoradiografie, expunere la raze X sau vaporizare de iod (Lin et al., 1998).
Sunt descrise diverse aplicații ale TLC (Turner et al., 2009). Sunt utilizate atât TLC unidimensional cât și bidimensional pentru determinarea cantitativă și semicantitativă a micotoxinelor (Lin et al., 1998). In ciuda simplității sale, metoda necesită un mediu de laborator foarte bine controlat și personal instruit.
3.2.5 Metode bazate pe anticorpi
Multe laboratoare de testare primară utilizează metode bazate pe anticorpi pentru a determina prezența micotoxinelor. Eșantionarea, măcinarea, amestecarea și etapele de extracție sunt similare cu cele pentru TLC, deși sunt mai puțin costisitoare.
O comparație a metodelor TLC și a celor bazate pe anticorpi a arătat că nevoile de instruire sunt similare pentru cele două tipuri de sisteme dar pentru metodele bazate pe anticorpi echipamentul si costurile consumabilelor sunt mai mici, iar problemele asociate cu standardele sunt eliminate.
Câteva companii produc metode de testare foarte bune bazate pe anticorpi cu cititoare ușor de utilizat și relativ ieftine (Schaafsma et al., 2009). Sensibilitatea acestor metode poate fi imbunatatita prin utilizarea nanoparticulelor pentru a sustine anticorpii de captare (Posthuma-Trumpie et al., 2009; Maragos and Busman, 2010).
3.2.6 ELISA – Enzyme linked immunosorbent assay - Test legat de imuno absorbția enzimelor
Testele ELISA (Test legat de imuno absorbția enzimelor) sunt sensibile, simple și metode
relativ rapide pentru confirmarea prezenței micotoxinelor in alimente si furaje. Eistă kit-uri
47
comerciale specifice pentru fiecare tip de micotoxine, ce detecteaza nivelurile din limitele legale pentru fiecare micotoxină, iar pe piață există diverse kit-uri ELISA.
Tehnologia se bazează pe abilitatea anticorpilor specifici pentru a distinge structura tridimensionala a micotoxinelor specifice.
O placă de microtitrare convențională ELISA necesită un echilibru al reacției anticorp-antigen care ar necesita un timp de incubare de aproximativ 1-2 ore. În prezent, majoritatea kit-urilor pentru micotoxine acționează în faza kinetică a legăturii antigen-anticorp, ce reduce timpul de incubare la câteva minute.
După extracția cu solvent a micotoxinelor dintr-o probă măcinată, o porțiune din extractul de probă și un conjugat al unei micotoxine cuplate cu enzime sunt amestecate și apoi adăugate la godeurile de microtitrare acoperite cu anticorpi.
Orice micotoxină în extractul de probă sau în standardele de control poate concura cu micotoxina conjugată cu enzima pentru situsurile de legare a anticorpului. După spălare, se adaugă un substrat de enzimă și se dezvoltă culoarea albastră. Intensitatea culorii este invers proporțională cu concentrația de micotoxină din probă sau standard. O soluție este apoi adăugată pentru a opri reacția enzimei. Intensitatea culorii soluției în godeurile de microtitrare se măsoară optic folosind un cititor ELISA cu un filtru de absorbție de 450 nm. Densitatea optică (DO) a probelor este comparată cu DO standardelor și un rezultat interpretativ este determinat conform nivelului de întrerupere.
În imunoanaliza bazată pe membrană, micotoxina și conjugatul cu enzima micotoxină concurează pentru situsurile limitate de legare a anticorpilor. După etapa de spălare, substratul de enzime este adăugat și reacționează cu micotoxina cuplată cu enzima și se dezvoltă culoarea. Pentru un eșantion negativ, adică un nivel de micotoxină mai mic, va exista un punct de culoare vizibil în centrul membranei. Concentrațiile de micotoxină în probee pozitive pot fi confirmate prin metode cantitative ca HPLC.
Metodele pot fi pe deplin cantitative, iar valoarea lor suplimentară este că trusele sunt ușor de utilizat și pot fi portabile pentru a fi utilizate în câmp pentru detectarea micotoxinelor în alimente și furaje (Trucksess, 2001).
În schimb, din cauza efectului așa-numit de matrice sau a interferenței matricei, poate apărea o subestimare / supraevaluare în concentrațiile de micotoxină în probele de mărfuri care limitează aplicarea ELISA la matricele pentru care au fost validate (Trucksess și Koeltzow, 1995; (Gilbert and Anklam 2002) procesarea probelor, extracția și implementarea testelor utilizate pentru detectarea diveselor micotoxine au fost comparate în diverse studii de-a lungul timpului și performanțele lor au fost îmbunătățite.
3.2.7 Testul fluxului lateral
Tehnologia testului imunocromatografic, denumită și testul de debit lateral, testul cu bandă, joja, a fost deja utilizată în scopuri diferite, dar aplicarea sa în siguranța alimentelor, în special testul cu micotoxine, este destul de recentă (Zheng et al., 2005). Pe scurt, o bandă pre-condiționată este umezită. Apoi proba extrasă trebuie sa fie aplicată.
Un extract de probă este adăugat pe tamponul de probă. Orice micotoxină prezentă se leagă de complexul de particule de aur anticorp anti-micotoxină din placa conjugată și migrează împreună cu complexul de particule de aur anticorp a doua de-a lungul membranei. Membrana
48
conține o zonă de testare și o zonă de control, pe care se usucă un conjugat de micotoxină-proteină și un anticorp secundar.
Conjugatul de proteină micotoxină din zona de testare poate captura orice complex de anticorpi anti-micotoxină anticorp de particule de aur, permițând particulelor de culoare să se concentreze și să formeze o linie vizibilă.
De aceea, o probă pozitivă cu o concentrație de micotoxine mai mare sau egală cu nivelul de întrerupere al analizei nu va avea ca rezultat o linie vizibilă în zona de testare.
În schimb, o probă negativă cu o concentrație de micotoxină mai mică decât nivelul de tăiere va forma o linie vizibilă în zona de testare. Zona de control va fi întotdeauna vizibilă
Zona de control va fi întotdeauna vizibilă, indiferent de prezența sau absența micotoxinei, deoarece al doilea anticorp 2 capturează întotdeauna complexul celui de-al doilea anticorp de particule de aur indicând astfel validitatea testului efectuat.
Testele imunocromatografice sunt ușor de utilizat, foarte rapide, au stabilitate pe termen lung pe o gamă largă de climă și sunt în special potrivite pentru testarea micotoxinelor în câmp. Cu toate acestea, tehnologia poate oferi doar rezultate semi-cantitative; pentru orice probe pozitive, concentrația exactă de micotoxină ar necesita confirmarea printr-o metodă analitică de referință, cum ar fi HPLC.
Progresele în dezvoltare sunt reprezentate de testul cu benzi multimicotinoase pentru detectarea simultană a mai multor toxine diferite într-o singură etapă de analiză (Wolf și Schweigert, 2018).
3.2.8 Testele fluorometrice
Testele fluorometrice, cunoscute ca testul de lumină neagră sau testul fluorescent galben
verzui, sunt o metodă eficientă, cantitativă pentru analiza micotoxinei. Se bazează pe natura fizico –chimică a micotoxinelor de a deveni fluorescente după ce sunt stimulate. Prezența fungilor producătoare de micotoxine în probă este demonstrată de fluorescența observată in lumină UV (365 nm). Testul nu este specific micotoxinei și este limitat la testul de screening fiind dependent de matrice. Mai mult, este necesar sa îndepărtăm interferențele înainte de măsurătoarea fluorometrică deoarece alți compuși din proba de micotoxine pot fi fluorescenți și pot influența citirile. Testele fluorometrice disponibile utilizează două metode de curățare a probelor ce s-au dovedit a fi eficiente pentru a îndepărta eventualele interferențe: 1) curățarea coloanei de imunoafinitate; și (2) curățarea coloanei de extracție în fază solidă. În plus, pentru a spori semnalul de fluorescență, cele mai multe micotoxine sunt derivatizate înainte de măsurarea fluorometrică.
3.2.9 Tehnica minicoloanei
Testul minicoloanei este bazat pe principiile cromatografiei în strat subțire (Holaday,
1981). Coloana de sticlă este umplută cu silica gel între straturi de fibră de sticlă și plasată într-un recipient umplut cu solventul si proba filtrată. După dezvoltare, minicoloana este înlăturată și determinarea se bazează pe vizualizarea sub lampă UV.
49
3.2.10 Fluorescența în soluție În această metodă, este foarte important să se înlăture interferențele înainte de
măsurătorile fluorescenței, pentru a evita rezultatele fals pozitive. După extracție și curățare cu ajutorul coloanelor de imunoafinitate sau coloanele de microextracție în fază solidă, eluatul este plasat într-o cuvă, este tratat cu brom și se măsoară cu un fluorometru.
Diferitele substanțe pentru etichetare sau derivatizare, precum și diferite metode de separare a micotoxinelor, sunt utilizate pentru a obține o sensibilitate mai bună a metodei (Zheng et al., 2006).
3.2.11 Imunoanaliză de polarizare prin fluorescență (FPIA, Zheng et al., 2006)
Imunoanaliza de polarizare prin fluorescență diferă de ELISA prin faptul că este un test omogen realizat în fază solidă. Spre deosebire de testele heterogene, testele omogene nu necesită separarea trasorului liber de cel legat. Aceste este un avantaj semnificativ, în special dacă elimină nevoia de manipulări adiționale, cum sunt pașii de spălare. Atunci când un fluorofor în soluție este expus la lumina polarizată plană la lungimea de undă de excitație, emisia rezultată este depolarizată. Depolarizarea rezultă din mișcarea fluoroforului în timpul proceselor de excitație și emisie. Datorită acestui lucru, cu cât este mai rapidă mișcarea fluoroforului cu atât este depolarizată mai mult emisia. Emisia de fluorescență poate fi separată, folosind polarizatoare, în componente orizontale și verticale. În acest format, polarizarea este invers proporțională cu concentrația de toxină.
Avantajul acestui format, în raport cu un format ELISA, este lipsa unei necesități de separare a acestuia de trasorul legat, îmbunătățind potențial viteza de testare. Dezvoltarea testelor competitive FPIA pentru micotoxine necesită utilizarea unui trasor fluorescent ( în general un conjugat cu fluoresceină al toxinei), un material cu greutate moleculară mare care leagă toxina (în general un anticorp) și un instrument pentru măsurarea polarizării. Instrumentele comerciale de polarizare cu fluorescență sunt disponibile rapid de la mai mulți producători și includ modele pentru laborator, modele portabile și cititoare de plăci. Metoda nu necesită cllătire suplimentară, nici așteptarea pentru dezvoltarea culorii, este foarte simplu de lucrat cu ra și poate fi portabilă. Efectul de matrice poate influența rezultatele.
3.3.Alte metode utilizate în cercetare
3.3.1 Fluorescență indusă de laser - Laser-induced fluorescence (LIF)
Fluorescența indusă de laser (LIF) este bazată pe detectarea analitului în fază lichidă în timp ce trece prin fereastra de detecție a detectorului LIF. Această metodă permite analiza probelor cu concentrații foarte mici. Datorită costurilor mari ale LIF (laser, coloranți speciali pentru etichetare) această metodă nu este larg utilizată ca metodă de screening ci ca metodă de cercetare (Espinosa-Calderón et al., 2011).
3.3.2 Spectroscopia în infraroșu - Near infrared spectroscopy (NIR)
Spectroscopia în infraroșu (NIR) este propusă pentru determinarea aflatoxinelor totuși, această metodă nu este încă reglementată prin lege pentru detectarea aflatoxinelor în alimentele umane (Jagger et al., 2013).
50
3.3.3. Tehnologia microarray
Tehnologia microaarray, în esență tehnica reverse dot blotting, este o tehnologie mai recentă pentru identificarea fragmentelor de ADN cum ar fi produsele PCR și poate fi o tehnică utilă pentru identificarea și diferențierea unui număr mare de microorganisme în paralel (Call et al., 2006). O serie de oligonucleotide de captură specifice de gen, specii sau subsecțiuni, reprezentând microorganismele care trebuie identificate, sunt imobilizate pe un suport solid, cum ar fi un diapozitiv de sticlă.
Acest diapozitiv de sticlă poate fi apoi sonerizat cu ADN marcat din proba de interes. Tehnica microarray are mai multe avantaje, cum ar fi: 1) analiza de mare viteză, 2) volumul mic de probă necesar și 3) gama largă de microorganisme pot fi detectate. Cu toate acestea, are mai multe limitări în cererea de analiză a micotoxinei.
Metoda funcționează bine pentru a detecta speciile fungice care produc micotoxină, mai degrabă decât micotoxinele.
3.3.3 Luminex xMAP_ technology
Tehnologia Luminex xMAP este compusă din tehnologiile existente - citometrie de flux, microsfere, lasere, prelucrarea semnalului digital și chimie tradițională. Gama de aplicații este considerabilă pe tot cuprinsul domeniului descoperire și diagnostic, precum și în cercetarea fundamentală (Vignali, 2000). Microsferele sunt vopsite pentru a crea 100 de culori distincte. Fiecare microsferă are o "adresă spectrală" bazată pe conținut roșu / infraroșu. Microsferele suspendabile sunt acoperite cu reactivi de captare cum ar fi anticorpii sau oligonucleotidele. Proba este apoi adăugată la microsfere și analitul este capturat de microsfere. Se adaugă apoi o etichetă reporter fluorescentă și se citesc rezultatele folosind un analizor compact de microsfere. Avantajele tehnologiei sunt: viteza mare, viteza mare, capacitatea mare de detecție, detecția multianalitilor, versatilitatea si reproductibilitatea, dar până acum nu există un test "comercial" pentru micotoxine.
3.3.5 Tehnica cu biosenzori
În ultima decadă, diferite teste imunichimice inclusiv tehnica cu biosenzori au fost
investigate. Biosenzorii permit detectarea unui analit dintr-o probă datorită interacției dintre analit si un element biologic sensibil, de ex: enzime, țesut, acizi nucleici sau anticorpi. Interacția conduce în obținerea unui semnal ce poate fi detectat printr-un traductor (detecție optică sau fizico – chimică) și este transformată într-o variabilă măsurată utilizabilă.
O metodă ce utilizează biosenzorii pentru determinarea micotoxinelor este rezonanța plasmonului de suprafață (Gaag et al., 2003; Schnerr et al., 2002; Tudos et al., 2003). În acest caz, variabila măsurată este modificarea masei de micotoxine care sunt imobilizate la o suprafață a unui cip senzor. Schimbarea de masă are ca rezultat atașarea unui anticorp specific la micotoxine. Rezultatele s-au dovedit a fi comparabile cu LC-MS, iar cipul senzorului poate fi refolosit fără pierderea activității de până la 500 de ori.
51
3.3.6. Nasul electronic
O nouă abordare analitică bazată pe biosenzori sunt nasurile electronice care deschid un nou câmp pentru analiza rapidă nedistructivă a micotoxinelor (Cheli et al., 2007; Dell’Orto et al., 2007; Olsson et al., 2002; Tognon et al., 2005). Nasul electronic, o serie de biosenzori care detectează substantele volatile emanate, ar putea distinge între prezența și absența micotoxinelor. Dezvoltarea fungică și producția de micotoxine conduc la modificări biochimice care au ca rezultat schimbări în compoziția chimică substanțelor volatile. Diferite molecule volatile acționează în interiorul nasului electronic și generează un semnal electronic detectabil special. Schimbările în compoziția relativă a moleculelor conduc la modificări ale semnalului electronic. Investigația realizată de Cheli și colab.(2009) a arătat că nasul electronic poate face diferența între probele pozitive sau negative pentru micotoxine dar sunt necesare mai multe analize cantitative pentru a evalua potențialul real ca metodă de bază în analiza practică a micotoxinelor (Cheli et al., 2009).
3.3.7. Metode bazate pe biosenzori ADN și cu aptameri
Procesul de detectare se realizează cu ajutorul spectroscopiei de impedanță electrochimică (EIS) și a tehnicilor de voltametrie ciclică (CV). O altă formă de utilizare a ADN-ului în biosenzori este bazată pe aptameri. Aptamerii sunt molecule peptidice sau structuri ADN sau ARN duplex ce poate lega un analit specific. În ceea ce privește instrumentele analitice, cercetările se desfășoară, iar noile metode de analiză ulterioară sunt bazate pe metodele bazate pe IOT, deci probabil în viitorul apropiat va fi posibil ca un telefon inteligent să detecteze micotoxinele, limitând astfel costul per lot și creșterea numărului de probe analizate pentru a selecta.
52
MODULUL II – METODE DE DECONTAMINARE
Capitolul 4. METODE DE DECONTAMINARE A PRODUSELOR CEREALIERE
4.1 Introducere
Micotoxinele sunt produse secundare sintetizate de ciuperci sau mucegaiuri care contaminează în mod frecvent produsele alimentare precum cerealele, fructele, nucile, condimentele, laptele și carnea.
Acestea sunt dezvoltate în condiții microbiologice favorabile și sunt potențial toxice pentru oameni și animale, astfel încât chiar și în procente limitate ele pot afecta negativ funcționarea corectă a organismului. După contaminarea cu micotoxine, boabele de cereale sunt distruse sau folosite ca furaje, dar consecința utilizării lor este dezvoltarea slabă a animalelor sau chiar moartea acestora.
Micotoxinele din furajele pentru animale sunt transferate în lapte și în carne, unde pot fi găsite în forma inițială sau sintetizate ca metaboliți. Cele mai cunoscute micotoxine care apar în cereale sunt: Aflatoxina (AFLA), Ochratoxina A (OTA), Zearalenona (ZEA), Fumonizina (FUMO), Deoxinivalenol (DON).
Prin urmare, un obiectiv de interes major cu implicații asupra sănătății umane și animale se referă la dezvoltarea de tratamente pentru inhibarea și decontaminarea cerealelor cu micotoxine.
FAO a propus următoarele criterii pentru decontaminarea și inhibarea micotoxinei în alimente și furaje:
- inactivarea, distrugerea sau îndepărtarea toxinei; - să nu producă sau să lase reziduuri toxice în produse; - păstrează valoarea nutritivă a produsului; - nu modifică proprietățile tehnologice ale produsului - distruge sporii fungici (Benigni A. 2016)[152]
Aceste metode pot fi grupate în biologice și nonbiologice (fizice și chimice).
Fig.7. Micotoxine în cereale (Alexa, 2008)[149]
53
4.2. METODE FIZICE PENTRU DECONTAMINAREA MICOTOXINELOR
Metodele fizice pentru inhibarea micotoxinelor se referă la următoarele proceduri:
• metodele care se conduc la eliminarea fracțiilor alterate (eliminarea fracțiilor alterate, șlefuirea, polizarea, segregarea prin densitatea cerealelor, aspirarea fracțiilor ușoare, separarea prin flotare și spălare);
• metode care provoacă denaturarea toxinelor (tratamente termice aplicate micotoxinelor, iradiere, plasmă rece).
4.2.1. Metodele care conduc la eliminarea fracțiilor alterate sunt metode foarte eficiente și se bazează pe faptul că toxinele nu sunt distribuite uniform în cereal și sunt de obicei localizate doar într-o fracțiune din cultură.
Micotoxinele cresc în special pe suprafața cerealelor, aplicându-se cu succes sortarea, măcinarea, polizarea sau extragerea fracției ușoare în scopul decontaminării cerealelor de micotoxine.
Eliminarea fracțiilor alterate se bazează pe sortarea sau separarea fizică a boabelor deteriorate (sparte) și alterate fiind o metodă foarte eficientă de reducere a nivelului de micotoxine din produsele pe bază de porumb.Acest proces foarte simplu este de obicei relizat manual, dar poate fi folosit și pentru echipamente automatizate.(De Mello, F. R.; 2009)[162]
Cerealele sparte sau cu defecte conțin de 10 ori mai multe micotoxine comparativ cu cerealele integrale, astfel încât procesele de curățare și de separare a fracțiilor contaminate aplicate pe mei sunt metode eficiente de reducere a contaminării cu micotoxine.
Pearson și colab., arată în studiul său că poate fi folosit un echipament de sortare de mare viteză cu lungime de undă dublă, pentru a obține reduceri ale conținutului de aflatoxine de 81% (inițial 53 µg/kg) și 85% fumonisine (inițial 17 mg/kg) în probele de porumb. Sortarea produselor contaminate este benefică prin reducerea nivelului micotoxinelor la concentrații sigure fără a produce metaboliți de degradare a toxinelor sau afectarea negativă a valorii nutritive a alimentelor(Pearson, T. C.; 2004)[194]
Eficiența sortării și a separării fizice pentru a minimiza conținutul de micotoxine este influențată de faptul că, în general, produsele contaminate nu sunt vizibil diferite de cele necontaminate,s-a observat că distribuția aflatoxinelor în loturile de boabe de cereale a fost semnificativă, eterogenă și miezurile puternic contaminate nu au putut fi detectate vizual. Sortarea tradițională a porumbului, practicată în Kenya, care îndepărtează boabele deteriorate, a arătat că reduce semnificativ contaminarea cu fumonisină, dar nu a reușit să sorteze un material contaminat cu Aflatoxina B1.(Mutiga, S. K.; 2014)[188]
Șlefuirea, polizare şi aspirarea fracțiilor ușoare
O selecție manuală simplă a produselor contaminate cu mucegai duce la o reducere semnificativă a conținutului de toxine. Această selecție poate fi mărită dacă este făcută electronic. O scădere importantă a concentraţiei de DON se realizează prin curățarea și măcinarea probelor de grâu, rezultând o cantitate de făină mai curată cu până la 80% din
54
concentrația inițială a toxinei din cereale (Benigni A. Temba, 2016)[152]. Cernerea porumbului contaminat cu fumonisine este o metodă foarte eficientă de reducere a conținutului de toxine, boabelesparte conțin de 10 ori mai multe micotoxine decât boabele intacte. Procedeele de curățare, polizare și aspirație a cerealelor conduc la eliminarea parțială a deoxinivalenolului, dar încă rămân în făină procente de 60-80% (Karlovsky P, 2016)[180]
Studiile au arătat că măcinarea fină a porumbului permite separarea fracției de diferite toxine. În timpul măcinării umede a porumbului, aflatoxina B1 se găsește în principal în apa de înmuiere (39-42%) şi în fibre (30-38%), cealaltă parte găsindu-se în gluten (13-17%), germeni (6-10%) şi amidon (1%) (Aly, S. E. 2002)[150]. ZEA se găsește în gluten (49-56%) și în substanțe solubile (17-26%), dar lipsește în amidon.Substanțele solubile zdrobite au un conținut de zearalenonă de patru ori mai mare decât boabele întregi sau fracțiunile de gluten, care reprezintă 14-19% din porumb. Nivelul de contaminare al diferitelor fracțiuni de porumb este diferit dacă măcinarea este uscată. Aflatoxina B1 se găsește, de asemenea, în partea periferică a boabelor de grâu dur. În ceea ce privește zearalenona, toate fracțiunile uscate conțin micotoxine, numai 3-10% pot fi îndepărtate prin măcinare uscată. Pentru aflatoxine cel mai înalt nivel se găsește în fracțiuni cu cantități mari de substanţe grase (Benigni A. Temba., 2016)[152]
Separarea prin flotare și spălare
Procesele de flotare a cerealelor contaminate cu fungi pot duce la scăderea conținutului de micotoxine într-o medie de peste 90%, deoarece fracțiunile alterate sunt localizate în boabele plutitoare în apă (Fandohan, Gnonlonfin, Hell, Marasas, &Wingfield, 2005). [166]
Reducerea micotoxinei poate fi de asemenea realizată în timpul procesării alimentelor, în special în procese cum ar fi înmuierea și spălarea, fiind observată o reducere a aflatoxinei în porumb(Mutungi, C.; 2008)[189]
Eficacitatea spălării și îmbibării este maximizată atunci când se realizează în combinație cu îndepărtarea spărturilor, a boabelor deteriorate și a părților de suprafață care sunt mai contaminate (Hell, K.; 2011)[175] Trenholm et al., 1992[205] au raportat că operația de spălare a orzului și a porumbului contaminat cu DON și ZEA cu soluție de carbonat de sodiu a redus considerabil contaminarea. Eficiența decontaminării este mai mare dacăboabele contaminate sunt agitate timp de 4 ore cu soluție de sare, atingând pragul de 100% decontaminare. Fumonisinele se concentrează în apa de înmuiere. Pentru porumbul ușor contaminat (1,0 pg / kg), nu a putut fi detectată nicio fracție dintre fracțiile tratate. Plutirea şi segregarea cerealelor contaminate permite o reducere a micotoxinei cu mai mult de 90%; Aflatoxinele se regăsesc în boabele care plutesc pe apă într-o proporție de 95%. În concluzie, eliminarea fracțiilor alterate trebuie anticipată ori de câte ori este posibil. Eficacitatea sa este legată de natura invaziei fungice (contaminarea la suprafață sau adâncime) și de caracteristicile toxinelor (aflatoxinele se concentrează în fracțiunile bogate în grăsimi, iar fumonisinele solubile în apă se concentrează în apa de înmuiere (KarlovskyPetr, 2016) [181]
55
4.2.2. Metode care provoacă denaturarea toxinelor Tratamente termice aplicate micotoxinelor Una dintre cele mai importante acțiuni, prin care prelucrarea industrială poate afecta conținutul de micotoxine dintr-un produs alimentar, se referă la combinația timp - temperatură. Majoritatea micotoxinelor sunt stabile din punct de vedere termic, temperaturile ridicate utilizate pentru frigere, prăjire, coacere și extrudare pot reduce contaminarea cu micotoxine, în timp ce preparatele alimentare convenționale cu temperaturi de până la 100°C au un efect nesemnificativ asupra majorității micotoxinelor (KarlovskyPetr, 2016).[181] Inactivarea termică a micotoxinelor este, de asemenea, influențată de conținutul de umiditate al produsului alimentar, de concentrația de toxine, de tipul matricei alimentare și de aditivii prezenți. Aflatoxinele pot fi reduse prin extrudare cu 50-80%, în funcție de umiditatea și temperatura cerealelor (Bullerman and Bianchini 2007)[157]. Frigerea poate reduce nivelul de aflatoxine cu 40-80% în porumb, dar aflatoxina B1 (AFB1) este distrusă la temperaturi peste 160°C, inactivarea OTA în grâu prin încălzire și extrudare a fost mai puțin eficientă (Boudra et al. 1995).[154] Eficacitatea unei degradări ale aflatoxinelor prin încălzire depinde, de asemenea, de conținutul de umiditate al produsului alimentar. O degradare a aflatoxinei, prin încălzire, este sporită la un conținut ridicat de umiditate, studiile efectuate evidențiind scăderea nivelurilor de aflatoxină de la 383 la 60 µg / kg prin încălzirea boabelor de porumb (cu umiditate 15%) la 160-180°C timp de 60 minute și numai 50% după încălzirea la 100°C când conținutul de umiditate al mesei a fost de 6,6%.(Hale and Wilson) Unele cercetări au arătat o scădere foarte mare a nivelului de DON în toate condițiile studiate, dar alte studii au constatat efecte moderate sau fără reducerea concentrației de DON. Tratamentul termic au legătură întotdeauna cu reacțiile de transformare. Fumonisina din porumbul extrudat cu glucoză s-a transformat într-un compus mai puțin toxic, fumonisina B1N- (1-deoxi-Dfructos-1-il), încazulstudiilorrealizate la șobolani (Hahn et al. 2015)[171]. Iradierea
Iradierea este considerată o metodă fizică de decontaminare a micotoxinelor, chiar dacă procesul dă energie compușilor care reacționează și deseori facilitează modificările chimice. Iradierea poate fi eficientă fie prin transformarea structurii chimice a micotoxinelor, fie prin inhibarea creșterii și producției de micotoxine prin ciuperci. Utilizarea în agricultură a unor metode avansate de degradare fotochimică pentru transformarea materialelor fotosensibile este o zonă de interes care oferă promisiuni comerciale (Jabusch, T. W.; 2006)[178] Microorganismele patogene pot fi reduse sau eliminate prin radiații neionizante (solare, UV, cu microunde) și ionizante (gamma). Studiile efectuate de Herzallah et al. 2008, a arătat că fotodegradarea aflatoxinelor din cereale reduce nivelurile de toxine cu aproximativ 40% după 3 ore și până la 75% după 30 de ore de lumină directă a soarelui. Aceiași autori au evidențiat faptul că lumina soarelui este mai eficientă decât încălzirea timp de 10 minute la cuptorul cu microunde (reducere de 32%) sau la iradierea gamma cu 25 kGy (reducere de 43%). Într-un alt studiu, orezul și porumbul au fostiradiate cu radiații gamma, la doze mai mari; reducereaaflatoxinei a fostridicată, ajungând la 59-88% la 10 kGy(kilogrey) (Ghanem et al. 2008)[168].
56
Plasma rece Plasma rece poate fi utilizată pentru a steriliza suprafețe fragile sau sensibile la temperatură, cum ar fi alimentele, fiind găsită cu un efect antimicrobian puternic. Schlüter și colab. 2013 au evidențiat potențialul tehnicii de plasmă care poate fi utilizat pentru decontaminarea cu micotoxină, dar necesită o utilizare precaută. Nu există încă studii privind riscul formării compușilor toxici prin tratamentul cu plasmă. Plasma rece la joasă presiune a distrus până la 50% aflatoxină pe suprafețele de cereale (Basaran et al. 2008). A fost recent evaluat, efectul presiunii atmosferice de plasmă rece de argon asupra sporilor și producția de micotoxină de către Aspergillus niger. După 9 minute de tratament, toți sporii fungici au fost uciși și conținutul de OTA și FUMO B2 a scăzut de la 25 la 6 µg / 100 mm, respectiv sub limita de detecție (Ouf et al. 2015). Plasma regenerată de descărcarea barierei dielectrice atmosferice într-un mod direct folosind aer sintetic ca gaz de lucru, a condus la scăderea concentrației de DON și ZEA de la 100 pg / ml la câteva micrograme pe mililitru(Bosch ten Lars et al. 2014)[153]. O altă cercetare efectuată de Bosch et al. 2017 a subliniat eficiența utilizării plasmei reci pentru degradarea fumonisinei B1, DON, toxina T2 și ZEA, rezultatele evidențiind o influență semnificativă a structurii micotoxinelor implicate, în plus față de caracteristicile matricelor studiate.(Bosch ten Lars,2017)[153].
Tabelul5. Compararea eficacității metodelor de decontaminare fizică [Magan, 1993]
Metoda Cereala Micotoxina Eficiența Curățarea și eliminarea
Cernerea Porumb FUMO eliminarea a mai mult de 90%
Curățare și polizare Grâu DON îndepărtarea unor fracții
Măcinarea și separarea Măcinarea umedă Porumb AFLA Eliminare 50-70%
/îndepărtarea unor fracții ZEA Eliminare 50-70%
/îndepărtarea unor fracții Îmbibare Porumb FUMO eliminare 70-90%
Grâu DON eliminare 70-90% Porumb OTA A eliminare 70-90%
Măcinare uscată Porumb AFLA Eliminare 50-70% /îndepărtarea unor fracții
ZEA Eliminare 50-70% /îndepărtarea unor fracții
Tratamente termice Căldură umedă Toatecerealele AFLA Eliminare moderată Porumb FUMO Eliminare moderată Prajire Toatecerealele AFLA Eliminare moderată Căldură uscată Făina OTA A Eliminare a 70-90% Încălzire Toatecerealele Tricotecene Îndepărtarea unor fracții Iradiere Toatecerealele AFLA Îndepărtarea unor fracții
57
4.3.METODE CHIMICE DE DECONTAMINARE A MICOTOXINELOR
Tratamentele chimice utilizate pentru detoxifierea sau decontaminarea micotoxinelor nu sunt autorizate în UE pentru produsele destinate consumului uman; tratamentele specifice de decontaminare ar necesita o aprobare specială de reglementare.Multe cercetări au investigat metodele de procesare chimică a alimentelor, pentru capacitatea lor de a îndepărta sau inactiva micotoxinele. Tratamentele chimice transformă toxinele în alți metaboliți, a căror toxicitate trebuie analizată (Karlovsky et al., 2016)[181].
Principalele metode de denaturare chimică aplicate micotoxinelor sunt:
4.3.1. Tratamentul cu acizi și baze
O fracțiune din materia primă este tratată cu o bază (e.g., KOH, NaOH, Ca(OH)2, Mg(OH)2; iar cealaltă fracțiune este tratată cu un acid (ex:, acid clorhidric, H2SO4, șiacid acetic); și după această etapă, aceste două fracțiuni sunt amestecate pentru a aduce pH-ul la valoarea neutră(Emetco B.V. 1995) [165].
Acizii (dioxidul de sulf și acidul propionic) pot fi, de asemenea, utilizați pentru a reduce contaminarea cu micotoxine, dar pot apărea produse de reacție. Aceste cercetări au evidențiat faptul că, reducerea nivelului de micotoxine poate fi obținută prin controlul fungilor producători de micotoxine (Vidal., et al., 2014) [208].
Studiile au arătat că micotoxinele sunt rezistente la acizii slabi, dar tratamentul cu acizi puternici a distrus activitatea biologică a Aflatoxinei B1 și Aflatoxinei G1 prin transformarea lor în alte forme AFB2a și, respectiv, AFG2a (Karlovsky Petr., 2016) [181].
Tratamentul cu HCl (pH 2) scade concentrația AFB1 cu 19% în decurs de 24 de ore, conform studiilor efectuate de Doyle et al.,1982. Aiko et al. (2016) [148] au efectuat un studiu utilizând acid acetic diluat, acid citric și acid lactic pentru decontaminarea produselor de AFLA, în condiții care simulează coacerea.
Rezultatele au evidențiat faptul că acidul lactic a fost cel mai eficient, transformând AFB1 în AFB2 (urme) și AFB2a (produs major). Pe lângă inhibarea aflatoxinelor, acizii carboxilici inhibă creșterea mucegaiului și, prin urmare, pot fi utilizați ca și conservanți.
4.3.2. Amonificarea
Procedura implică tratarea produselor contaminate sau a furajelor, cu o soluție apoasă, de amoniac, amoniac gazos sau hidroxid de amoniu apos. Soluțiile pe bază de amoniu sunt pulverizate direct pe boabele ambalate în pungi.
Studiile anterioare care investighează decontaminarea cu amoniac a furajelor contaminate cu aflatoxine, au fost foarte reușite și s-a subliniat faptul că tratamentul hranei pentru animale, în special al făinii de porumb cu amoniac, reduce nivelul de aflatoxicoză la animale (Park, D. L. 1993[193]; Frayssinet, C.; 1990[167])
58
Dacă procesul de amonificare este eficient pentru un tip de micotoxine nu înseamnă neapărat că este eficient și pentru o altă categorie de micotoxine. De exemplu, dacă amonificarea a redus nivelul de aflatoxină din porumb, nu a avut un efect semnificativ de decontaminare pentru zearalenonă (Martinez, A. J.;1994)[187].
Potrivit studiilor realizate de Samarajeewa et al., 1990, amoniacul reduce concentrația de aflatoxine (100-4000 µg / kg) cu până la 99% la porumb. Acest proces este ireversibil, tratamentul cu amoniac sub presiune și temperaturi ridicate (80-120 ° C / 35-50psi) aplicat timp de 20-60 de minute duce la inhibarea aflatoxinelor în hrana animalelor.
Eficiența procesului depinde de temperatură, presiune, umiditate, durată și substrat (Weng et al., 1994)[211], Park et al. (1993)[192]au studiat detoxifierea aflatoxinelor prin amonificare iar rezultatele au demonstrat eficacitatea și siguranța amoniacului ca o soluție practică pentru detoxificarea aflatoxinelor din furaje. În ciuda a trei decenii de cercetare, amoniacul alimentar nu a fost aprobat până în prezent în nicio țară.
4.3.3. Nixtamalizarea
Nixtamalizareeste procesul prin care boabele sunt înmuiate și fierte într-o soluție alcalină (apă cu lămâie) și apoi decorticarea boabelor de cereale.
Acest proces are mai multe avantaje: boabele au o germinaţie mai bună în sol, influențează creșterea conținutului de proteine și vitamine, îmbunătățesc gustul și aroma, inhibă incidenţa micotoxinelor. Nixtamalizarea reduce semnificativ (cu 90-94%) micotoxinele produse de Fusarium verticillioides și Fusarium proliferatum, mucegaiuri care, de obicei, infectează porumbul și ale căror toxine sunt potențial carcinogene. Eficacitatea acestui tratament depinde de parametrii de pregătire termică, este necesar un pH ridicat pentru a inhiba aflatoxinele (Torres, P. I 2001)[203].
Studiile făcute de De La Campa, R., et al, în 2004, au arătat că, fierberea porumbului în apă fierbinte cu lămâie, scade conţinutul de zearalenona cu 59-100% și de DON cu 72-82%. Mecanismul de degradare a micotoxinelor prin nixtamalizare nu a fost eficient în profunzime, dar poate fi posibilă hidroliza alcalină. În condiții acide, poate apărea re-formarea aflatoxinei, menținerea eficienței procesului de nixtamalizare reprezentând o provocare, pentru a îmbunătăți expunerea la micotoxine din produsele contaminate. 34% din aflatoxinele originale s-au re-format prin acidifiere, în ciuda scăderii inițiale a aflatoxinei B1 prin nixtamalizarea de 93,2% (Perez-Flores, G. C.,2011)[197].
4.3.4. Decontaminarea chimică utilizând gaz de dioxid de sulf
Unul dintre cei mai vechi aditivi alimentary dioxidul de sulf (SO2) este utilizat pentru controlul micotoxinelor post-recoltare. Este cunoscut ca un dezinfectant prin arderea sulfului elementar și utilizarea fumului rezultat. Dioxidul de sulf SO2 a fost utilizat pentru conservarea alimentelor și a băuturilor (Magan, 1993).
În mod obișnuit, SO2 este utilizat ca tratament inhibitor fungic pentru a preveni creșterea mucegaiurilor, drojdiilor și bacteriilor. Fumigarea cu SO2 a fost testată pentru depozitarea pe
59
termen mediu a cerealelor, dar s-au constatat probleme cu coroziunea conductelor utilizate pentru livrarea SO2 către depozitele de cereale.
Studiile recente au evidențiat faptul că tratamentul cu metabisulfit de sodiu (64 mg / L-1, 48 ore la 25 ° C) pe probe de sorg cu un conținut de umiditate de 13%, a inhibat 95% din fungi, dar germinabilitatea a fost redusă. Tratamentul cu 0,3% SO2 pe porumb cu umititate ridicată (24%) a redus semnificativ colonizarea microbiană și nu a avut efect asupra calității boabelor.
Pentru depozitarea pe termen mediu de 5 luni, este necesară o doză de cel puțin 4,4% SO2 g/kg-1pentru o păstrare eficientă, dar alte studii au subliniat că pot fi necesare concentrații mult mai mari din cauza adsorbției și legarea SO2 la cereale, conducând la scăderea activității antifungice. Rezultatele cercetărilor au arătat că, în funcție de conținutul de umiditate al grâului (20-30%), SO2 gazos a devenit legat de cereale, în timpul tratamentului. (Magan Naresh, 2007)[186].
Efectele diferitelor tratamente chimice ale alimentelor, în funcție de toxinele acumulate, sunt prezentate în tabelul 6.
Tabelul 6. Compararea eficacității metodelor de decontaminare chimică
(Magan, 1993)[185]. Metoda Micotoxina Eficienţă Acizi şi baze
Amonificarea
Aflatoxine Decontaminare și reducerea semnificativă a toxicității.
Fumonisine Decontaminare fără modificarea toxicității.
Nixtamalizarea Aflatoxine Efect benefic, decontaminare fără modificarea toxicității
Fumonisine Decontaminare fără modificarea toxicității
Oxidanți și agenți reducători Apă oxigenată Aflatoxine Effect pozitiv
Bisulfiţi Aflatoxine Effect pozitiv Glucoză, fructoză Fumonisine Effect pozitiv
4.4. ADSORPŢIA TOXINELOR
Adsorbanții sunt utilizați în furajele animalelor ca agenți anticorpi și agenți de peletizare pentru a regal digestia, pentru a controla tulburările gastro intestinale și a oferi oligoelemente animalului. Utilizarea agenților de legare limitează absorbția micotoxinelor în tractul gastrointestinal și absorbția în organism, reducând astfel efectele adverse observate asupra animalelor care consumă hrană contaminată, în special la păsările de curteși porcine (Trckova, M.; 2004)[204].
60
4.4.1. Adsorția toxinelor pe argile
Argilele sunt compuși din silicaţi, mai mult sau mai puțin hidrataţi.
Aflatoxinele sunt puternic adsorbite pe aluminosilicați hidratați de sodiu și calciu, ceea ce micșorează contaminarea plantelor. Termenul de argilă se referă la compuși silicați lamelari, mai mult sau mai puțin hidratați, rezultând din alterarea silicatelor cu structură tridimensională. Atunci când este prezent aluminiu, acești compuși sunt numiți aluminosilicați.
În cazul alimentelor contaminate cu aflatoxine, acești compuși silicați sunt puternic asociați cu diminuarea micotoxinei. Au fost studiate pe larg, efectele benefice ale argilei în contaminarea nutriției animalelor, acești compuși interferând în absorbția oligoelementelor, dar au fost raportate și reacții adverse. Cele mai cunoscute sunt "HSCAS" (hidrataţi de sodiu și aluminosilicați de calciu).(Chulze SN.,2010)[158].
Zeoliţi Zeoliții sunt substanțe cristaline formate din SiO4 și AlO4. Pentru a face parte din familia zeolit, aluminosilicații trebuie să respecte raportul de 0,5 (Si + Al) / O. În zeoliții utilizați ca absorbanți, spațiile libere sunt interconectate, formând un spațiu mare, capabil să absoarbă compușii cu o masă mai mare decât sodiul sau calciul. Pe de altă parte, acești compuși se deshidratează și hidratează foarte ușor, modificând astfel structura lor. Adsorbția AFB în soluție în diferite medii de cultură, a fost de aproximativ 60% in vitro. Această adsorbție, deși inferioară, în prezența compușilor nitrați, va reduce toxicitatea produselor care conțin 2,5 ppm aflatoxine. [Bozollu F.,2009][155].
Bentonitele
Bentonita este argilă formată prin îmbătrânirea cenușii vulcanice. Prin urmare, termenul bentonită se referă la diferite produse de aceeași origine, dar cu compoziție diferită. Bentonitele formate din aluminiu și siliciu fac parte din marea categoria de aluminosilocați. Unele sunt bogate în sodiu în calciu, potasiu sau magneziu, dar toate conțin oligoelemente și urme de metale toxice. Originea bentonitei este importantă deoarece influențează capacitatea de a absorbi toxinele. Bentonita de sodiu este cea mai utilizată în hrana animalelor. Având în vedere suprafața sa interioară mare, betonita absoarbe aproximativ de 6-7 ori greutatea sa în apă. In vitro, 2% bentonita, adsoarbe proporţii de 94-100% soluţii de AFB1în prezenţă de tampon fosfat la pH 4,5. Efectele bentonitei au fost, de asemenea, testate pentru toxicitatea toxinei T-2. La șobolani, acțiunea negativă a acestei micotoxine este diminuată prin administrarea de bentonită în alimentele contaminate cu toxină T-2 de 3 ppb. Proprietățile adsorbante ale Ochratoxinei A sunt dependente de pH(Guerre P.,2000][170].
61
Alţi filosilicați
Caolinitul sau silicatul de aluminiu are proprietăți de adsorbție fiind un filosilicat utilizat pentru tratamentul ulcerelor de stomac.
Acest efect devine insuficient dacă nivelul de contaminare este mult mai mare (20 ppm).
Sepiolitul ((MgO)2(Si02)3, sau silicatul de magneziu este, de asemenea, un filosilicat.
Utilizând 2% sepiolit, este posibil să se adsorbe peste 87% din conținutul de AFB1 (8 ppm) prezent într-o soluție tampon fosfat (pH 6.5). Aceasta explică efectele protectoare ale sepolitului (0,5%) din alimente împotriva toxicității AFB1 (800 ppm) la porcine [Guerre P.,2000][170]. 4.4.2. Adsorbția toxinelor pe carbon activ
Carbonul activ este o matrice insolubilă obținută prin piroliza materialului organic, fiind utilizat cu succes pentru absorbția toxinelor din corpul uman și animal. Capacitatea adsorbantului variază în funcție de porozitatea (suprafața de contact) și mediul său (concentrație apoasă, organică și sare, pH).
Capacitatea adsorbantă a carbonului activ, în ceea ce privește conținutul de aflatoxină, a fost evidențiată prin studii care au arătat că 100 mg de carbon este capabil să adsorbă 1 mg de toxină în prezența a 2% albumină serică bovină și 0,5% ulei de porumb la pH 7.
Complexul format este stabil și protejează toxicitatea AFB1, diminuând semnele hepatotoxice și sporind rata de supraviețuire prin eliminarea micotoxinelor și a metaboliților prin excreție fecală.
Efectele benefice ale carbonului "superactiv" (capacitate mare de adsorbție) au fost evidențiate atunci când a fost administrată toxina T-2. A fost observată o creștere a ratei de supraviețuire când a fost administrată o doză letală șobolanilor. În ceea ce privește ochratoxina A, carbonul activ este un adsorbant eficient in vitro, dar nu reușește să reducă toxicitatea micotoxinei in vivo la puii de găină. Un efect protector a fost observat atunci când s-au administrat doze mari de alimente (5-10%) contaminate cu ochratoxină A (1 ppm), dar, pe de altă parte, s-a constatat o scădere a vitaminei E[Guerre P.,2000][170].
4.4.3. Adsorbția prin rășini
Rășinile sintetice sunt polimeri compuși din macromolecule tridimensionale care au grupuri active sensibile la compuși organici sau minerali fixați prin legături slabe. Există rășini schimbătoare de anioni și rășini schimbătoare de cationi care pot fi utilizate în decontaminarea cerealelor cu micotoxine.
Acești compuși au fost utilizați în decontaminarea produselor vegetale contaminate cu ochratoxină sau zearalenonă. Rășinile sintetice sunt polimeri care prezintă grupări
62
macromoleculare tridimensionale capabile să fixeze compușii minerali sau organici prin legături cu energie redusă.
În prezent, rășinile utilizate sunt rășini schimbătoare de cationi de tipul respectiv R-SO
3; R-PO3 ; R-COO și rășini schimbătoare de anioni de tipul [R-N(CH3)3] . [Bozollu F.,2009][155]. Polimerii sunt lianți anorganici ai micotoxinei. Mai mulți agenți, cum ar fi fibrele dietetice și polivinilpirolidona (polimer amfoteric foarte polar), sunt utilizate pentru decontaminarea de micotoxine, dar cea mai cunoscută este colestiramina. Colestiramina este o rășină cuaternară de amoniu, insolubilă, schimbătoare de anioni, care leagă puternic compușii anionici, fiind utilizată ca tratament pentru absorbția acizilor biliari din tractul gastrointestinal pentru a reduce colesterolul (Underhill et al.,1995). Studiile in vitro, făcute privind acest compus, au subliniat că acesta are proprietăţi de liant, efficient pentru Fumonisina B1, Ochratoxina și Zearalenonă (Avantaggiato et al., 2005;)[151]. Prețurile polimerilor sunt ridicate, limitându-le utilizarea practică în hrana animalelor (Kolosova and Stroka, 2011)[182]. Au fost testate proprietățile adsorbante ale polimerilor divinil - benzen - stiren, o altă rășină capabilă să fixeze anionii. In vivo, adăugarea acestui adsorbant la furajele pentru șobolani (5%), modifică toxicocinetica zearalenonei administrate oral într-o concentrație de 100 mg / kg și diminuează efectele negative ale alimentelor contaminate cu 3 ppm toxină T-2, administrată timp de 2 săptămâni. Rezultatele obținute în acest studiu sunt similare celor obținute în cazul administrării de bentonită, dar superioare celor obținute cu o rășină schimbătoare de cationi [Magan N., 2010, 2007][185].
4.4. DECONTAMINAREA BIOLOGICĂ
Prin "decontaminare biologică" se înțelege transformarea enzimatică a micotoxinei într-un compus mai puțin toxic. S-a incercat degradarea naturală a micotoxinei cu microorganisme sau enzime. Identificarea potențialului de degradare a microorganismelor este primul pas în dezvoltarea acestor procese.Această activitate de decontaminare poate fi transferabilă pe produsele contaminate cu micotoxine. (Chulze., 2010)[158].
Principalele strategii pentru limitarea micotoxinelor în alimente și furaje sunt controlul producerii de micotoxine înainte de recoltare și inactivarea contaminării după recoltare .
Principalele măsuri de prevenire a contaminării cu micotoxine, produse de Fusarium
sp.,în cereale înainte de recoltare, sunt reprezentate de bunele practici agricole care includ rotația culturilor, gestionarea solului, selecția și utilizarea corectă a produselor fungicide, recomandate de Comisia Europeană (CE) .
Metodologiile bazate pe sisteme biologice pentru inactivarea micotoxinei se referă la o serie de activități care încep cu screeningul microorganismelor până la stadiul final al eliminării / inactivării miotoxinelor.
63
Metodele de inactivare a micotoxinelor implică cinci etape: (1) selecția culturilor microbiene din probele naturale (2) izolarea și identificarea coloniilor microbiene individuale implicate în biotransformare (3) investigarea caracteristicilor morfofiziologice ale tulpinilor izolate, (4) identificarea și evaluarea toxicității produselor eliberate după biotransformare și (5) purificarea enzimelor funcționale și aplicarea decontaminării extinse.(Zhu, Y.,2017)[214].
Un program integrat de cercetare privind detoxificarea microbiană a micotoxinelor se desfășoară în următoarele etape:
(1) Obținerea de microorganisme responsabile de biotransformarea micotoxinei sau de consorțiul microbian. Pot fi obținute și identificate din surse naturale sau selectate dintr-un grup care a prezentat capacitate metabolică ridicată.
(2) Studiul eficacității și al factorilor de mediu care influențează procesul de bio-detoxifiere pentru microorganismele selectate. Alegerea mediilor de îmbogățire, a factorilor de creștere etc.
(3) Evaluarea și investigarea siguranței tulpinilor microbiene și a produselor de biotransformare rezultate. După biotransformare este posibil ca produsul să aibă aceeași toxicitate.
(4) Cea mai dificilă etapă este considerată izolarea enzimelor responsabile de biotransformare, după care se face izolarea, identificarea, clonarea și exprimarea genetică.
(5) Fezabilitatea proceselor de inactivare și detoxificare a micotoxinelor din grâu și furaj.(Zhu, Y.,2017)
64
Fig. 8.Etapele de detoxifiere microbiană a micotoxinelor(Zhu, Y.,2017)[214]
4.4.1. Controlul microbiologic al aflatoxinelor (AFB1)
Studiul biodegradabilității micotoxinelor a devenit un domeniu de mare interes, această abordare fiind definită ca o biotransformare care produce produse mai puțin toxice. Utilizarea microorganismelor în domeniul detoxificării micotoxinelor nu este o abordare nouă de cercetare (Schatzmayr et. al. 2006)[201]
Aflatoxinele sunt metaboliți secundari produși de Aspergillus flavus, A. parasiticus și rareori A. Nomius, controlul biologic pare să fie abordarea cea mai promițătoare pentru controlul aflatoxinelor. Din studiile efectuate în laborator, mai multe specii bacteriene (Bacillus, Lactobacilli, Pseudomonas, Ralstonia and Burkholderia spp.,) au evidențiat capacitatea de a inhiba creșterea fungilor și producerea de aflatoxine de către Aspergillus spp. (Reddy K.R.N., 2010)[199].
65
Degradarea biologică a AFB1 de către R. erythopolis şi Mycobacterium
fluoranthenivorans a fost mai mare de 90% în decurs de 4 ore la 300 ° C, iar după 8 ore AFB1 a fost nedetectabilă. Degradarea AFB1 de către aceste bacterii a apărut cel mai probabil printr-o serie de reacții enzimatice cu pierderea, în timp, afluorescenței [Teniola OD, 2005][202].
În alte studii s-au izolat microorganisme cu activitate de inactivare a micotoxinei, Flavobacterium aurantiacum cu capacitate de a detoxifia aflatoxine și, de asemenea, bacteria aerobă Phenylobacterium immobile care a fost utilă în degradarea ochratoxinei A (Wageha Awad, 2010)[210].
L. rhamnosus s-a dovedit a avea capacitatea de a îndepărta aproximativ 80% din Aflatoxina B1 la începutul perioadei de incubație. În continuare, tulpinile au fost testate și s-a constatat că, capacitatea lor de a îndepărta aflatoxina depinde de temperatură, cu îndepărtarea maximă la 37 ° C( El-Nezami H., 2002)[164].
Tulpinile atoxigenice competitive ale A. flavus și A. parasiticus s-au dovedit a avea mari succese în controlul biologic al contaminării cu aflatoxine în diferite culturi. Studiile efectuate de Bown et al. 1991 au evidenţiat reducerea constatată a conținutului de aflatoxină din porumb după aplicarea A. flavus atoxigenic. În cadrul acestei cercetări, când ştiuletele de porumb a fost fie coinoculate cu AF36 și o tulpină toxigenă de A. flavus, fie inoculate cu AF36 cu 24 de ore înainte de inocularea cu tulpina toxigenă, nivelurile ulterioare de aflatoxină au fost semnificativ scăzute, comparativ cu inocularea cu tulpina toxigenă singură.
Drojdia saprofită (Candidakrusei and Pichiaanomala) are potențial de a fi utilizată ca agent de biocontrol pentru decontaminarea aflatoxinelor [Yin Y,2008][212].
Similar cu agenții bacterieni, aceste tulpini de drojdii au fost capabile să inhibe creșterea Aspergillus și toxinele rezultate atunci când au fost testate în condiții de laborator [Hua SST,1999][177].
4.4.2. Controlul microbiologic al deoxinivalenonului (DON)
Dintre microorganismele analizate pentru capacitatea lor de a degrada DON, au fost evidenţiate rezultate privind faptul că, unele au capacitatea de a transforma DON în compuşi mult mai puțin toxici.
DON-ul este o micotoxină produsă pe culturile de cereale, dar nu se acumulează în solurile agricole, implicând posibilitatea mineralizării biologice a DON-ului în natură. Dintre cele 1285 de culturi microbiene obținute din soluri agricole, cereale, insecte și alte surse, o cultură mixtă a reușit să transforme DON în 3-keto- DON (Völkl et al., 2004)[209].
După îmbunătăţirea utilizării porumbului infectat mucegai produs de F. graminearumau fost obţinute şase soluri agricole capabile să transforme DON în produse mai puţin toxice. Aceste soluri îmbunătățite, au transformat DON-ul în procente mai mari de 87% iar două dintre ele au îndepărtat complet DON-ul din mediile de cultură după incubare la 28°C timp de 3 zile (Zhou, 2008)[213].
66
O tulpină bacteriană Barpee a fost izolată din una dintre probele de sol și a evidențiat o activitate puternică de transformare a DON, în condiții aerobe, tulpina bacteriană a transformat DON în doi produși: izomer stereo de DON și 3-keto-DON (Völkl et al., 2004)[209].
El-Nezami et al. 2002[164] au studiat capacitatea tulpinilor Lactobacillus și Propionibacterium de a îndepărta trichothecenele din mediile lichide. Unele tulpini demonstrează eliminarea deoxinivalenolului, diacetoxiscirpenolului și fusarenonului, în procente care variază de la 18 la 93% și o tulpină a îndepărtat numai deoxinivalenolul și diacetoxyscirpenolul, cu un procent de eliminare cuprins între 10 și 64%.
Niderkorn et al. 2006, au studiat bacteriile lactice și acidul propionic pentru capacitatea de inhibare a DON și fumonisine din soluție și rezultatele au arătat că a fost tulpină specifică, bacteriile acidului propionic fiind mai puțin eficiente decât bacteriile lactice cu o concentrație de eliminare de până la 55% DON.
4.4.3. Controlul microbiologic al ochratoxinelor
Ochratoxina A (OTA) produsă de Aspergillus și Penicillium spp. este un contaminant natural în cereale [Reddy., 2010][198]. Au fost efectuate numeroase studii privind decontaminarea cerealelor. Mai multe tulpini bacteriene și fungice aparținând genurilor Streptococcus, Bifidobacterium, Lactobacillus, Butyribrio, Phenylobacterium, Pleurotus, Saccharomyces, Bacillus și Acinetobacter și anumiți fungi care aparțin genurilor Aspergillus (A. fumigatus, A. niger, A. carbonarius, A. japonicus, A. versicolor, A. wentii și A. ochraceus), Alternaria, Botrytis, Cladosporium, Phaffia, Penicillum și Rhizopus (R. stolonifer și R. oryzae), sunt capabili să degradeze OTA in vitro până la mai mult de 95% [Abunrosa L, 2006][146].
Abrunhosa et al. 2002[147] au identificat 51 de izolate fungice cu capacitatea de a inhiba mai mult de 80% din OTA adăugat la un mediu de cultură, dar izolatele cele mai eficiente au aparțin speciilor A. clavatus, A. ochraceus, A. versicolor și A. wentii.
Au fost studiate 37 specii bacteriene, 10 tulpini de drojdii și 12 mucegaiuri pentru a detecta microorganismele capabile să degradeze OTA. Acinobacter calcoaceticus s-a dovedit a fi capabil să degradeze OTA într-un mediu cu săruri minime de etanol la temperaturi între 25 - 30 ° C. S-a subliniat că, produsul final de degradare a OTA de către A. calcoaceticus este un compus mai puțin toxic, ochratoxina α (OTα) [Halasz, 2009][172].
Grunkemeier., 2006 a obținut un amestec de drojdie sterilizată și reziduu de fermentație din bere, care s-a dovedit a fi mai mari de 80% în timpul creșterii în condiții in vitro. Izolatele
Rhizopus sunt, de asemenea, capabile să degradeze parțial OTA în decurs de 10 zile, dar numai tulpina R. stolonifer a prezentat capacități de detoxifiere a OTA în probe de grâu umed [Varga., 2005][207].
Bacteriile detoxifiante aparținând Sphingomonas sp., Stenotrophomonas nitrit reducens, Stenotrophomonas, Ralstoniaeutropha, and Eubacterium sp., și drojdiile detoxifiante care aparțin genurilor Trichosporon sp., Cryptococcus sp., Rhodotorula yarrowii, Trichosporon mucoides, și Trichosporondulcitum s-au dovedit a fi deosebit de eficiente în degradarea OTA, nu numai că au
67
asigurat o degradare completă, ci și pot fi utilizate în siguranță în produse alimentare și hrană pentru animale (Varga., 2010)[207].
4.4.4. Controlul microbiologic al fumonisinelor
Fumonisinele sunt produse de ciuperci aparținând genului Fusarium, dar în special fumonisina B1 (FB1) reprezintă un motiv de îngrijorare privind siguranța alimentară. De exemplu, studiile au evidențiat faptul că, dozele mari de furaj pe bază de porumb infectate cu FB1 au provocat edem pulmonar la porcine, în timp ce doze mai mici pot produce boli hepatice. [Reddy 2010, Haschek WM, 1992][198].
Într-un studiu recent, s-au evaluat efectele a patru agenți bacterieni de biocontrol asupra infecției cu F. verticillioides și contaminarea cu fumonisină în agroecosistemul culturii de porumb. Tratamentul semințelor cu B. amyloliquefaciens și Enterobacter hormaechei a scăzut infecția cu fungi și conținutul de FB1[Pereira P, 2010)[195].
Niderkorn et al., 2006 au studiat bacteriile lactice și acidul propionic pentru capacitatea lor de a elimina deoxinivalenolul și fumonisina din soluție și au descoperit că este tulpină specifică, bacteriile acidului propionic fiind mai puțin eficiente decât bacteriile lactice
Leuconostoc mesenteroides a îndepărtat aproximativ 82% din Fumonisina B1 și L. lactis
a îndepărtat 100% din Fumonisina B2. S-a dovedit că izolatele de B. amyloliquefaciens și de Microbacterium oleovorans reduc în mod eficient sporii de F. verticillioides și conținutul de fumonisine în boabele de porumb la recoltare atunci când sunt aplicate ca înveliș pentru semințe [Pereira P,2006][190].
4.4.5. Controlul microbiologic al Zearalenonei
Gliocladium roseum a redus conținutul de zearalenona prin deschiderea structurii inelului urmând apoi decarboxilarea în randamente cuprinse între 80 și 90%). Se știe că inelul 12,13-epoxid este responsabil pentru activitatea toxică a trichothecenelor și îndepărtarea acestei grupări epoxidice implică o pierdere semnificativă de toxicitate (El-Sharkawy and Abul-Hajj 1988).
Două tulpini de S. cerevisiae au fost capabile să degradeze complet zearalenona; unul a redus concentrația de micotoxine cu până la 25%, iar celălalt până la 75% din cantitatea inițială (Reddy., 2010)[198].
Unii autori au subliniat că acele tulpini specifice de bacterii lactice, cum ar fi Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus planta rumor , Lactobacillus acidophilus poate reduce concentrația de ZEA prezentă în produsele alimentare și în hrana pentru animale [Čvek D., 2012; Dalié DKD, 2010][160].
Neutralizarea zearalenonei de către bacteriile lactice, este eficientă dacă sunt implicate și gruparea carboxil deprotonată (în principal din asparagină și glutamină) a proteinelor bacteriene și a peptidoglicanului. Rezultatele au confirmat că inhibarea zearalenonei de către bacteriile lactice cum ar fi L. lactis și Bifidobacterium sp, este o abordare nouă și promițătoare a neutralizării microbiologice a ZEA (Krol A., 2017)[183].
68
Capitolul 5. PROCESE TEHNOLOGICE DE REDUCERE A CONTAMINĂRII CU MICOTOXINE ÎN LANȚUL ALIMENTAR/FURAJER
Distributia micotoxinelor in cereale nu este uniforma si ca urmare trebuie sa se cunoască repartitia acestora in diferitele fractii obtinute prin procesarea cerealelor pentru a se cunoaste rata de transfer a contaminarii cu micotoxine in produsele alimentare destinate consumului uman sau animalier.
Metodele de procesare care conduc la reducerea contintului de micotoxine se referă la procedee fizice nedistructive ce nu altereaza structura chimică a micotoxinei, respectiv valoarea nutritionala a substratului si procedee fizice sau chimice prin care se modifică structura micotoxinelor respectiv a matricei cerealiere analizate.
5.1. PROCESE TEHNOLOGICE IN INDUSTRIA DE MORĂRIT SI PANIFICATIE
5.1.1. MACINAREA, DECOJIREA CEREALELOR, INMUIEREA SI SEPARAREA FRACTIILOR
Procedeele tehnologice fizice nedistructive aplicate in procesarea cereaelor in moara si care nu presupun tratamente prin care se modifică compozitia matricei cerealiere, iar structura micotixinei nu este alterata, se referă la: macinarea, decojirea cerealelor, inmuierea si separarea fractiilor.
In tehnologia de prelucrare a cerealelor, avînd in vedere faptul că micotoxinele se regasesc in general la suprafata bobului, procedeele tehnologice de indepărtare a taratei de endosperm sunt eficiente in gestionarea incarcaturii micotoxigene a cerealelor.
In general, micotoxinele tind sa se concentreze diferit in fractiile rezultate la macinis, in particular in germene si invelis, astfel incat printr-o gestionare corespunzatoare a procesului de macinis se poate evita contaminarea cu micotoxine a produselor destinate consumului uman.
Prelucrarea fizică a cerealelor, măcinarea şi sortarea prin cernere a produselor de măciniş, conduce la scăderea încărcării fungice, studiile experimentale indicând faptul că făina albă provenită din grâu contaminat prezintă conţinut mai redus de micotoxine comparativ cu făina neagră provenită din acelaşi grâu, ceea ce dovedeşte faptul că prelucrarea grâului scade semnificativ încărcarea fungică, în mod proporţional cu gradul de prelucrare. ⁰24⁰
Posibilitatea de reducere a contaminării produselor cerealiere cu ochratoxină A folosind metode fizico-tehnologice de prelucrare şi anume măcinarea cerealelor şi îndepărtarea învelişului sub formă de tărâţe prin cernere, a fost studiată prin contaminarea artificială a şrotului de grâu cu ochratoxină A, păstrarea în repaus 24 ore şi separarea endospermului de înveliş prin cernere
69
(Sancis, 2000). Rezultatele experimentale au indicat o distribuţie preponderentă (62,5%) a ochratoxinei A în partea periferică a bobului, care se îndepărtează în procesul de măciniş şi se separă prin cernere o dată cu tărâţa, reducându-se astfel şi probabilitatea de contaminare a făinii.
Katta et al., au demonstrat faptul ca, in cazul procesului de macinare uscata a porumbului, cea mai mare parte din fumonisine s-au regasit in malaiul furajer, de granulozitate fina, urmată de tărâțe si germene, aceste fractii fiind utilizate fie in hrana animalelor sau la extractia uleiului. In produsele principale de macinis (crupele si faina), care nu contin in procent ridicat materie grasa, se regaseste doar 6-10% din cantitatea de aflatoxine. In ceea ce priveste zearalenona, toate fractiunile uscate contin micotoxine, doar 3-10% pot fi eliminate prin macinare uscata. O distributie similară a celorlalte micotoxine, incluzand ochratoxina A, deoxynivalenol si zearalenone, in timpul macinarii usacate a graului, orzului sau a altor cereale a fost de asemenea raportată (Park, 2002, Scott, 1984, Aldrich 1996).
Măcinarea umedă prezintă avanataje comparativ cu măcinarea uscată, dovedindu-se faptul că in apa utilizata la inmuirea cerealelor inainte de măcinare se regasesc mare parte din fractiile de micotoxine solubile in apă (fumonizine, aflatoxine and deoxynivalenol). Repartiția micotoxinelor in componentele chimice ale cerealelor este diferita. In general, cea mai mare concentratie de micotoxine se regaseste in apa de spălare, uramtă de fibre, gluten sau gernene, in timp ce amidonul este relativ liber de micotoxine (Park, 2002).
Studii efectuate in cazul crupelor de porumb contaminate cu aflatoxina B1 si prelucratte prin macinarea umeda urmata de separarea fractiilor obtinute, au demonstrat faptul că aflatoxina B1 se regaseste in principal in apa de inmuiere a porumbului (39-42%) si in fibre (30-38%), restul fiind repartizat in gluten (13-17%), germeni (6-10%) si amidon (1%) (Alexa E., 2008).
Cercetari anterioare au raportat ca fumonisinele care au contaminat porumbul au fost solubilizate in apa de spălare, in cea mai mare parte, restul fiind distribuite in gluten, fibre si germene, in timp ce in amidon nu s-au regasit aceste micotoxine. Zearalenona este concentrata in gluten (49-56%) si in substantele solubile (17-26%), dar este absenta in amidon. De asemenea, in cazul deoxinivalenolului, contaminarea se transfera in apa de spalare si doar in urme se transfera in amidon (Ryu, 2008).
A simple manual sorting of mold-contaminated products allows a significant reduction in the toxin content. Flotation and density segregation of contaminated cereals allows a reduction in mycotoxin's average content by more than 90%; 95% of aflatoxins are located in grains floating on water.
Decojirea cerealelor este o operatie indispensabilă in procesul de măcinis, prin care se indepărtează straturile exterioare ale invelisului cerealelor. Prin această operatie se reduce
70
semnificativ si contaminarea cu micotoxine a cerealelor. Invelisurile exterioare ale cerealelor sunt indepărtate prin diferite tehnici de decojire, care reprezintă etape anterioare proceselor de măcinis. Decojirea reprezinta una din cele mai eficiente metode de reducere a continutului de micotoxine din cereale (Vučković et al. 2013). In cazul porumbului, prin această tehnică se reduce continutul de aflatoxine din porumb până la 93 % ceea ce conduce la scaderea riscului de expunere a consumatorilor la alimente contaminate (Siwela et al. 2005).
Decojirea ajută si la cresterea capacitatii de prelucrare a produselor de macinis (faina si gris). (Cheli et al., 2013). Invelisurile obtinute prin decojire sunt reutilizate in hrana animalelor, contribuind la aportul de fibre si vitamine a furajelor. Studiile au aratat ca operatia de decojire realizata timp de 20 min cu ajutorul decojitoarelor conduce la o reducere de 20% a masei cerealiere si o scadere de 60% a continutului de DON (Peng, 2018). Similar, House et al. (2003) a obtinut o reducere importnata (65%) a DON in orz prin operatii succesive de decojire.
5.1.2. PROCEDEE TERMICE
Procedeele termice reprezinta cele mai uzuale si conventionale metode de procesare alimentara incluzand: fierberea, coacerea, conservarea, congelarea si prăjirea. In general majoritatea micotoxinelor sunt rezistente la temperatura ridicata (coacere, fierbere si/sau racire). Din aceasta cauza ele nu se distrug prin procesare si se transfera in paine, cereale pentru mic dejun sau bauturile fermentate din cereale. Prin aplicarea unor metode de procesare adecvate, singure sau in combinatie se poate reduce totusi continutul de micotoxine fara a se elimina total din produsele destinate consumului umar.
Aflatoxinele sunt compusi chimici stabili la temperatura, temperatura de descompunere fiind in domeniul 237-3060C, totusi prin combinarea proceselor termice cu modificarea presiunii se pot obtine rezultate promitatoare. Prin coacerea sau fierberea orezului polizat la presiune atmosferica, reducerea continutului de aflatoxin B1 este de aproximativ 34%, in timp ce prin fierbere la presiune ridicată nivelul de redicere a contaminarii variaza intre 78–88% (Park, 2005 si Park, 2006). In cazul crupelor de porumb contaminate natural cu aflatoxina B1 si utilizate in obtinerea de briose, reducerea continutului de aflatoxina B1 a fost de 13 - 28%, in timp ce prăjirea crupelor fierte conduce la o reducere de 34–53% a continutului de micotoxine.
Fierberea orezului contaminat cu aflatoxina B1 conduce la o reducere de până la 34 %, in timp ce mai mult de 70 % din toxină poate fin distrusă prin coacere sub presiune (Park and Kim 2006).
Ochratoxina A este in general stabila in procesul de coacere cu obtinere de paine in timp ce coacerea biscuitilor a condus la o scadere cu două treimi a continutului de toxina care a fost distrusa sau imobilizata (Scudamore KA,2003). Prin coacere la presiune a boabelor de cereale
71
s-a constat o reducere cu pana la 84% a continutului de ochratoxin A. Rezultate similare au fost raportate prin autoclavarea orzului cu 50% apa, care reduce cu 74% continutul de ochratoxin, in timp ce autoclavarea ovăzului sau a orezului conduce la pierderi mai mari de ocratoxina (87%) (Ryu, 2008).
In scopul studierii reducerii contaminării cu OA prin procesare termică, s-a analizat făină contaminată cu OA prin încălzire la temperaturi cuprinse intre 150-2000C, în prezenţa sau în absenţa aburului (Alexa, 2004). Rezultatele experimentale arată că prin procesare termică uscată la temperatura de 1800C pierderile de OA sunt de 65,5%. Prin ridicarea temperaturii la 2000C conţinutul de ochratoxină A din făină scade, 93,9% din cantitatea introdusă nu se mai regăseşte în făină, in timp ce prin creşterea temperaturii la 2500C ochratoxina nu se mai regaseşte în făină, apărând totodată procese de degradare a făinii. În cazul procesării termice în prezenţa aburului, ochratoxina nu se distruge termic, la 180 0 C, fiind stabilă în condiţii de umiditate ridicată.
Din făină contaminată artificial cu ochratoxina A s-a efectuat şi o probă de pâine obţinută din făină, drojdie, apă, a fost lăsată la fermentat 60 minute apoi apoi supusă operaţiei de coacere la 2000C. În urma coacerii nu s-au mai regăsit reziduuri de ochratoxină A în pâine peste limita minima de detecţie. Scăderea conţinutului de ocratoxină A se datorează hidrolizării de către enzimele proteolitice, ca de exemplu, carboxipeptidaza A, care scindează ocratoxina A în ocratoxina ⁰ şi L- fenilalanină (Alexa, 2008).
Reducerea continutului de fumonisine pana la 90% se poate realiza prin procesare termică la 100–200°C, timp de 60 min in sistem apos-acid, in timp ce coacerea malaiului (polenta) la presiune normala nu a afectat continutul de fumonisine (Brera C,2004). De asemenea, reducerea fumonisinelor cu pana la 48% a fost raportata in cazul coacerii painii de porumb la 232°C for 20 min. Prăjirea masei de porumb la 140–170°C până la 6 minute nu a redus fumonizinele, în timp ce prăjirea chips-urilor de tortilla la 190°C timp de 15 minute a condus la o reducere cu 67% a fumonizinelor (Ryu, 2008). Spre deosebire de alte micotoxine, fumonisinele pot sa dezvolte reactii Maillard cu aminele primare din structura atunci cand sunt supuse incalzirii in prezenta zaharului reducator. Mecanismul indus poate fi explicat prin reactia fumonisinei B1 cu zaharuri reducatoare si formarea de compusi stabili de tipul N-(carboxymethyl)-fumonisin B1. (Polling SM, 2002) .
DON este o micotoxină stabilă din punct de vedere termic cu un punct de descompunere de 151–153◦C, rezultatele anterioare evidentiind o stabilitate relativ ridicata a DON la tratamentul termic. Astfel, prin fierberea spaghetelor obtinute din faina de grâu, nivelul de DON s-a redus cu 47%. In mod similar, o reducere de până la 52% a continutului de DON s-a obtinut
72
prin utilizarea aburului la temperaturi de 185 ◦ C timp de 6 min (Cenkowski S, 2005). Ph-ul mediului influentează capacitatea de degradare a DON, constatându-se că tratamentrul termic la 120 ◦ C pentru 30 min sau 170 ◦ C timp de 15 min asociat cu mediul alcalin de reactie (pH 10) conduce la degradarea completa a DON. Prin coacerea traditionala a painii si a produselor de patiserie, continutul de deoxinivalenol din faina poate fi redus intre 0-35% (Kabak, 2009).
Zearalenona (ZEA) este stabilă din punct de vedere chimic pana la temperaturi de 164–165◦C. Descompunerea completa a ZEA a fost realizată prin incălzirea in solutie apoasă la temperaturi de 225 ◦ C timp de 30 min, indiferent de pH ul solutiei (Ryu, 2003). De asemenea s-a raportat ca potentialul estrogenic al ZEA al produsilor de descompunere poate fi diminuat prin procesare in timpul fabricarii pâinii (Scott, 1984).
Fulgii de porumb, utilizati in meniul obisnuit de mic dejun, prezintă un proces tehnologic de obtinere caracteristic, care presupune utilizarea aburului la presiune de 18 psi timp de 2 ore, urmat de o uscare cu aer (65°C) si toastare la temperaturi mai mari de 300°C, timp de 50 sec. In functie de contiutul de zaharuri, reducerea continutului de aflatoxine variaza intre 64-67% si 78 -85% in timpul fierberii sub presiune, respectiv a toastării (Ryu, 2008). Rezultate similare se obtin si in cazul reducerii continutului de fumonisine in timpul procesului de fierbere si toastare, cand procentul de reducere a micotoxinei variază intre 20–65% si se datoreaza legării toxinei de matrice si mai putin descompunerii chimice.
Studiile experimentale indică şi în cazul ergotoxinelor, posibilitatea de reducere a conţaminării prin prelucrarea termice a cerealelor. Astfel, tratarea sclerozelor din grâu cu clor (1%) şi căldură (150-2000C) a condus la o reducere de 90% a conţinutului de ergoline în 4 ore. Reducerea a afectat toate ergolinele (ergotamina, ergocorina, ergocriptina, ergosina, ergometrina) în moduri identice. Sclerozele autoclavate la 1210C pentru 300 min. au condus la o reducere de 24,6% a conţinutului de ergoline totale. În coacerea pâinii şi a prăjiturilor cu cereale ce conţineau ergotoxine s-a observat o reducere de 59-100% a ergolinelor individuale (ergosina, ergocornina, ergometrina, ergotamina, α-ergocriptina, ergocristina) în pâine din făină integrală, o reducere de 50-86% în pâinea din făină de secară şi o reducere de 25-74% în prăjiturile de triticale (Alexa, 2008).
Extrudarea reprezinta un proces tehnologic alimentar care implica simultan tratament termic (120– 220°C), presiune ridicata (100–2,000 psi) si procese mecanice (torque). Procesul de extrudere implică trecerea materiei prime cerealiere sub presiune prin matrita incălzită, cand, intr-un timp scurt, se obtine produsul final sub diferite forme extrudate. Factorii care influentează procesul de extrudere sunt: caracteristicile materiei prime,. Continutul de umiditate, temperatura si viteza ed rotatie a melcului extruderului (Alexa, 2008b).
Buser and Abbas, 2002 au raportat o reducere de 33% a continutului de aflatoxine in conditiile in care temperatura a crescut de la 160°C. Extruderea porumbului pentru tortillas cu adaos de
73
0.3 respectiv 0.5% lamaie verde a redus continutul de aflatoxin B1 cu 74 respectiv 85% (Elias-Orozco R,2002). Castells, 2006 a observat ca reducerea continutului de aflatoxine in orezul contaminat artificial variaza intre 51 si 95% in functie de tipul de aflatoxina (B1, B2, G1 and G2),de continutul initial de umiditate al probei (24, 27 and 30%) si de temperatura (140, 170 si 200°C). In cazul ochratoxinei A, o reducere cu 40% a fost raportată in cazul extruderii fainii integrale de grau la temperaturi diferite (116–201°C) si continut de umiditate variabil (17–25%) (Scudamore KA, 2004), in timp ce pentru reducerea continutului de zearalenona procedeul de extrudere s-a dovedit a fi mai eficient. Ryu et al. 2008 a examinat influenta caracteristicilor structurale ale extruderului, respectiv extruderea in sistem de amestecare continua sau fara amestecare. Rezultatele au evidentiat o reducere insemnata a continutului de zearalenona in cazul procedeului de extrudere cu amestecare (66–83%), comparativ cu varianta fara amestecare (65–77%), temperatura de extrudere variind intre 120-160°C. Aditia de aditivi influentează reducerea continutului de micotoxine, astfel adaosul de 1% sodium metabisulfit in timpul procesului de extrudere conduce la o scadere cu peste 95% a continutului de deoxynivalenol cand temperatura variaza intre 150-180°C.
Reducerea continutului de aflatoxine variaza intre 50-80% in timpul extrudării fiind diferita in functie de prezenta aditivilor, temperatura/presiunea aplicata. Rezultate similare s-au obtinut si in cazul OTA din produsele de panifcatie (Scudamore et al. 2004).
5.2.PROCEDEE TEHNOLOGICE IN INDUSTRIA BERII
Procesele fermentative care au loc in tehnologia de obtinere a băuturilor fermentate din cereale, inclusiv a berii, influentează capacitatea de degrdare a micotoxinelor. Producerea berii implică 3 procese biochimice esentiale: activitatea enzimatică in boabele de orz in timpul germinării, degradarea amidonului si transformarea in zaharuri fermentescibile datorită echipamentului enzimatic al cerealelor si fermentatia alcoolica realizata de drojdiile de tip Saccharomyces cu formare de etanol si CO2. In ceea ce priveste materia primă sunt implicate in procesul de fabricare a berii orzul, hamei, apă, drojdii si adjuvanti, a căror calitate joacă un rol decisiv in proprietățile organoleptice ulterioare ale berii. Din punct de vedere al etapelor tehnologice, procesul tehnologic include: incălzirea maltului, măcinarea, fermentare, maturare, filtrarea si stabilizarea prin pasteurizare.
Bertuzzi et al. (2011) au studiat incidenta ochratoxinei A, tricotecene, FUMs and AFs in berea produsă in diferite tari europene. In acest studiu nu s-au raportat probe de bere contaminate cu aflatoxine, dar nivele diferite cu priviire la celelalte micotoxine au fost detectate (2.1 µg/L DON, 5.8 µg/L fumonisins B1, 0.6 µg/L fumonisins B2 si 0.019 µg/L ochratoxin A), cu diferente reduse privitor la țara de provenienta.
74
Cele mai multe studii se referă la investigarea continutului de deoxinivalenol in bere, care reprezintă micotoxina cu incidenta cea mai ridicata raportat la riscul sănătătii publice din punct de vedere al consumului de bere. Intr-un studiu efectuat cu privire la modificarile survenite in compozitia a 14 micotoxine (aflatoxine, fumonizine, ochratoxin A, patulină, tricotecene și zearalenone) in timpul procesului de fabricare a berii a demonstrat ca in maltul de cereale contaminat artificial cu micotoxine si supus operatiilor de brasaj (mashing), filtrare, fierbere si fermentare, nivelul de micotoxine a scazut mai mult de 20% din concetratia initială. Micotoxinele au fost adsorbite in special de către cerealele uzate o dată cu mustul nefiltrat. In plus, unii compusi, ca de exemplu zearalenona, se metabolizează in compusi mai putini toxici prin fermentare (Inoue, 2013). Similar in cazul enniatins (Vaclavikova et al., 2013), 64 până la 91% din incarcatura initiala a fost eliminată cu cerealele uzate, iar in cazul zearalenonei rata de indepartare a fost mai mare de 60% (Wolf-Hall, 2007).
Balanta micotoxinelor in timpul procesării orzului si transformarea acestuia in bere, variază in functie de diferitele faze tehnologice. Obtinerea maltului reprezintă etapa initială de germinare controlata a orzului, responsabilă de aroma si gustul berii si care are loc in trei etape: inmuierea orzului, germinarea si măruntirea. Scopul operatiei de inmuiere este de a crea conditii favorabile de umiditate in interiorul cerealelor si de a activa enzimele implicate in procesul germinativ. Inmuierea este un proces care se realizează in conditii controlate de temperatură si umitiate si constă in mai multe cicluri de imersare sau spray-ere a cerealelor cu apă până în momentul in care umiditatea cerealelor ajunge la 42–48%. Acest proces se realizează la temperatura cuprinsă intre 10–15 °C timp de 30–50 ore, in acest timp contaminarea cu fungi fiind favorizată. Având in vedere capacitatea de solubilizare a unor micotoxine in apă (DON si FUMO) este de asteptat ca nivelul micotoxinelor solubile in apă să se reducă pînă la 10% prin descompunere sau metabolizare. Vaclavikova et al. (2013), au raportat o scădere de până la 30% a continutului de DON, după două zile de inmuiere a orzului.
Germinarea implică activarea echipamentului enzimatic al cerealelor in scopul scindării fractiilor proteice si a amidonului. Procesul germinativ incepe la cateva ore dupa penetrarea apei in celula cerealieră in timpul inmuierii si continuă cu transportul acidului giberelic in stratul aleuronic unde are loc productia si activarea enzimelor (Oliveira et al., 2012). In timpul germinării biomasa fungică, respectiv productia de micotoxine, creste ca urmare a infectiei latente existente in orz si care este activată prin cresterea umiditătii in cursul acestui proces. Procesul germinativ este stopat prin uscare urmată de măcinarea maltului.
Măcinarea maltului se realizează in scopul cresterii suprafetei de contact intre malt si lichid. Această fază tehnologică nu influentează nivelul micotoxinelor, dar se poate aprecia o omogenizare si uniformizarea a acestora in masa de malt.
75
O infectie a maltului de bere cu fungii din genul Fusarium (Fusarium Head Blight disease) producătoare de deoxinivalenol, poate să conducă la o digestie ulterioară a proteinelor realizată prin intermediul proteazelor fungice care vor afecta culoarea, aroma, teztura si spuma berii. (Inoue et al., 2013). In această etapă se poate aprecia o posibilă eliberare a conjugatilor de DON
din structurile proteince generată de conditiile biochimice si care să conducă la o crestere totală a concentratiei de DON. Alte studii atribuie cresterea continutului de DON in această fază tehnologică continutului initial de toxine conjugate existente in orz si care nu au fost extrase.
Separarea si fierberea mustului de bere se realizează după separarea particulelor solide, in această etapă adăugându-se hameiul. Mustul poate fi imbogătit si prin adaos de zaharuri sau sirop, precum si plante condimentare ca seminte de coreandru sau coajă de portocale. Mustul de bere este supus fierberii timp de 45–60 min, când are loc inactivarea enzimelor, evaporarea apei si a compusilor volatili, precipitarea proteinelor, sterilizarea, izomerizarea acizilor continuti in hamei, reactii Maillard si modularea aromei. Mustul astfel obtinut este răcit, filtrat si introdus in tancurile de fermentare. Ingredientele introduse In această etapă reprezintă o sursă de micotoxine. Hameiul este susceptibil a fi contaminat cu micotoxine, dar având in vedere că acesta este introdus in cantități reduse in must, impactul poate fi nesemnificativ (Vaclavikova et al., 2013).
Având in vedere că temperatura de fierbere a mustului este de aproximativ 100 °C si că timpul de fierbere este de o oră, este de asteptat o reducere a continutului de micotoxine in această fază tehnologică de obtinere a berii.
Fermentarea mustului reprezintă un proces initiat de drojdiile Saccharomyces, in special Saccharomyces cerevisiae, care transformă zaharurile fermentescibile in alcool etilic si dioxid de carbon, dar si in compusi secundari de fermentare ca esteri, alcooli superiori si compusi volatili. In această fază se realizează o adsorbtie a toxinelor ( in special a zerealenonei) de fractia de betaglucani din celulele de drojdie sau din compozitia orzului. Rata de adsorbtie variază intre 75.1% pentru ZON, 48,1% pentru AF1, 59,4% pentru OTA si de doar 11.6% pentru DON (Campagnollo et al., 2015).
Micotoxinele existente in materia primă influentează compozitia compusilor volatili formati prin fermentatia alcoolică. Unele micotoxine (AFLA si DON) inhibă activitatea alcool dehidrogenazei, ceea ce conduce la scăderea productiei de dioxid de carbon. De asemenea, determină o crestere a concentratiei in acetaldehidă si alti compusi volatili nedoriti sintetizati in timpul fermentatiei alcoolice, dar nu afectează continutul de esteri totali.
Procesul de maturare si conditionare a mustului de bere are ca scop stabilizarea aromei după fermentare prin indepărtarea compusilor volatili nedezirabili si a dioxidului de carbon. Acest proces se realizează timp de 1-3 luni la temperaturi scăzute (0 °C). In timpul procesului de
76
conditionare are loc combinarea proteinelor si taninului si sedimentarea moleculelor mari, rezultand clarificarea berii.
In această fază, utilizarea unor adsorbanti anorganici pentru clarificare, determină indepărtarea micotoxinelor prin adsorbtie pe aceste substraturi. Această adsorbtie este determinată de polaritatea micotoxinelor, solubilitatea in apă sau masa moleculară. In acest sens, silicagelul modificat cu ioni -Cl and –CN este foarte eficient in legarea OTA si FUMO (Belajová, Rauová, and Daško (2007).
Concluzii
Utilizarea procedeelor tehnologice mecanice (şrotarea cerealelor şi îndepărtarea învelişului prin cernere) reprezintă metoda cea mai eficientă de decontaminare a cerealelor şi care păstrează valoarea nutritivă intactă a produsului.
Chiar dacă majoritatea micotoxinelor sunt moderat stabile termic, procesarea termică a produselor cerealiere consituie o posibilitate de reducere a contaminării, în condiţiile în care regimul tehnologic nu afectează valoarea nutritivă a produsului.
Coacerea, prăjirea, extruderea si incalzirea la microunde reprezinta procedee tehnologice eficiente de reducere a continutului de micotoxine in diferite matrici cerealiere. Este important de notat ca randamentul de inhibare este dependent de conditiile tehnologice (temperatura, timp, pH, continut de umiditate), dar si de tipul de micotoxină si concentratia acesteia in matricea alimentară.
Procesele fermentative din tehnologia de fabricare a berii determină un efect inhibitor cu privire la continutul de micotoxine. Cele mai importante faze tehnologice cu impact in inhibarea micotoxinelor sunt: inmuierea, brasajul, fermentarea si stabilizarea. In timpul acestor procese se elimină partial micotoxinele in apa de spălare, cerealele epuizate sau reziduul de fermentare, ca urmare a adsorbtiei pe diferite suprafete sau ca rezultat al tratamentului termic. Germinatia nu
influentează continutul de micotoxine din bere, dar poate sa contribuie la metabolizarea acestora in alti compusi. In timpul brasajului enzimele pot stimula eliberarea compusilor conjugati ai micotoxinelor din structurile proteice, dar tototdata sa contribuie la scaderea toxicitatii.
77
MODULUL 4 – DEZVOLTAREA SISTEMELOR INTEGRATE DE CONTROL (HACCP: ANALIZA RISCURILOR ȘI PUNCTE CRITICE DE CONTROL) ÎN CEREALE ȘI PLANTE MEDICINALE)
Capitolul 6. Dezvoltarea sistemelor integrate de control
Sistemul HACCP, o metoda pentru protectia igienico - sanitara a alimentelor, este unul dintre diferitele procedee propuse pentru a garanta producere igienico- sanitara a alimentelor care a intrunit sufragiile majoritati organismelor internationale in domeniu. Sistemul HACCP face posibila prevenirea contaminarilor si/sau reducerea la un nivel acceptabil a potentialelor riscuri inerente procesului productive sau produsului finit.
Principiile sistemului HACCP sunt esentiale. In 1993, Comisia Codex Alimentarius si apoi OMS (Organizatia Mondiala a Sanatatii) in 1995, au pus bazele teoretice ale controlului prin intermediul sistemului HACCP, enuntand urmatoarele principii:
Identificarea riscurilor asociate cu producerea alimentelor in toate fazele fluxului tehnologic, evaluarea lor comparativa si a nocivitatii fata de consumator, descriind si masurile de control sau de prevenire;
Identificarea pe fluxul tehnologic a punctelor critice de control care, mentinute sub control, sunt in masura sa previna, sa elimine sau sa reduca pana la limite acceptabile riscul;
Stabilirea limitelor critice care nu trebuie depasite pentru a ne asigura ca punctul critic este sub control;
Proiectarea de eventuale actiuni corective, in cazul in care monitorizarea indica faptul ca un anumit punct critic de control nu mai este sub control;
Proiectarea procedurilor pentru a verifica daca intreg sistemul HACCP indeplineste obiectivele fixate;
Documentarea tuturor procedurilor adoptatea pentru realizarea planului HACCP.
Aplicarea sistemului HACCP presupune parcurgerea logica a 12 etape specifice, elaborarea unui plan de lucru caracteristic pentru fiecare proces si/sau produs analizat:
� definirea scopului; � constituirea si organizarea echipei HACCP; � descrierea produsului si identificarea utilizarii intentionate; � elaborarea diagramei de flux tehnologic; � identificarea pericolelor potentiale;
78
� evaluarea riscurilor potentiale; � determinarea punctelor critice de control; � stabilirea limitelor critice; � stabilirea sistemului de monitorizare; � stabilirea actiunilor corective; � stabilirea procedurilor de verificare; � stabilirea documentatiei si a inregistrarilor.
Demersul este bazat pe dezvoltarea unei strategii de prevenire, de control, de bune practice industriale si control al calitatii la toate etapele productiei. Presupune punerea in evidenta a punctelor de risc, ca si a punctelor critice, punerea la punct a solutiilor finale de lupta, ca si dezvoltarea metodelor de verificare.
Ropkins si Beck (2003) au propus un plan HACCP pentru limitarea contaminarii cu compusi organici a produselor alimentare in timpul perioadei de depozitare, transformare si distributie. Procedurile operationale standard sunt definite si trebuie respectate in fiecare etapa. Pentru asigurarea calității sanitare in timpul depozitarii, trebuie ca spatiile de depozitare sa fie dotate cu instalatii conforme si proprii.
Contaminarea externa prin aer si apa, trebuie sa fie supravegheata. Din practicile care trebuie respectare pentru limitarea contaminarii alimentelor amintim: curatarea echipamentelor, o buna igiena personala si purtarea imbracamintei de securitate. Pentru fiecare produs, echipa HACCP trebuie sa studieze daca micotoxinele care constituie un pericol pentru sanatate sunt susceptibile de a fi prezente si daca da, care sunt acelea.
Eliminarea completa a micotoxinelor din alimente contaminate nu se poate realiza la ora actuala, obiectivul fiind acela de a reduce la minim aparitia acestor toxine prin bune practice agricole. Principiile pentru prevenirea si reducerea micotoxinelor difera in functie de cultura, climat si practice agricole locale. Este important ca producatorii sa considere ca bunele practice agricole (BPA) reprezinta primul mod de a lupta impotriva contaminarii cerealelor cu micotoxine, apoi aplicarea bunelor practice de fabricatie (BPF), depozitarea, transformarea si distributia cerealelor destinate alimentatiei umane si animale. Elaborarea codurilor de folosire nationale fondate pe principii generale si reducerea codurilor specifice pentru anumite specii de cereale va ameliora aplicabilitatea acestor principii, in particular pentru culture ca porumbul.
Aceste principii descriu factorii care favorizeaza infectarea, dezvoltarea si productia de toxine in culture cerealiere la nivelul expoatarii ca si metodele de lupta impotriva acestor toxine. Trebuie subliniat ca strategia trebuie aplicata atat in timpul semanarii, cat si in timpul recoltarii si dupa recoltare, dar va depinde de cultura, conditiile climatice si va trebui sa se tina cont de specificitatea locala a culturilor si modul de productie in vigoare in fiecare tara sau regiune. In consecinta, toate interventiile in lantul de aprovizionare vor trebui aplicate, la intervale regulate, evaluarea riscurilor, luarea masurilor pentru prevenirea sau reducerea la minimum a contaminarii cu mucegaiuri fiind de asemenea obligatorie.
Aceste evaluari care tin cont de tipul de cultura considerata (grau, porumb, etc.), se arata a fi foarte utile.
79
Calea de transmitere a infectiei si dinamica formarii toxinelor difera de la o cultura la alta si sunt influentate de factori agricoli. Sistemele de cultura in care este inclus porumbul in rotatie prezinta un risc ridicat. Graul si alte cereale produse in acelasi sistem de cultura in rotatie sau in apropierea acestuia trebuie sa faca de asemenea obiectul unei gestionari si a unei inspectii riguroase.
Contaminarea cerealelor cu mucegaiuri se datoreaza actiunii mai multor factori. Bunele practice nu permit controlarea tuturor factorilor, de exemplu, conditiile climatice.
Parametrii agroclimatici care favorizeaza productia de micotoxine sunt:
� incidenta infectiei cu fungi potential toxigeni a porumbului (procente); � severitatea contaminarii cu aflatoxina Bl (ng/g); � media temperaturii minime din august; � media umiditatii maxime din iulie; � numarul saptamanilor din timpul perioadei de vegetatie in care media temperaturii maxime
saptamanale a depasit 32°C; � media temperaturii maxime din iulie; � media umiditatii minime din iulie; � numarul de saptamani din timpul perioadei de vegetatie in care media saptamanala a
umiditatii maxime a depasit 90%; � variabila compensatorie indicand localitatile cu 0-5 saptamani in care temperatura
saptamanala maxima a depasit 32°C; � variabila compensatorie indicand localitatea cu 11-15 saptamani in care temperatura
saptamanala maxima a depasit 32°C; � numarul de saptamani din timpul perioadei de vegetatie in care media saptamanala a
umiditatii maxime a depasit 90%; � numarul de saptamani din timpul perioadei de vegetatie in care media saptamanala a
temperaturii maxime a depasit 38°C; � numarul de saptamani din timpul perioadei de vegetatie in care media saptamanala a
temperaturii minime a depasit 21°C; � numarul de saptamani din timpul perioadei de vegetatie in care media saptamanala a
umiditatii minime a depasit 55 %.
In plus, nu toti factorii au aceeasi importanta si acesti factori diferiti pot de asemenea antrena o contaminare cu micotoxine. In consecinta, este important sa se adopte o strategie integrata tinand cont de toti factorii de risc. In particular, trebuie sa se evite acumularea diferitilor factori de risc in functie de interactiunile lor posibile.
Este de asemenea primordial sa se tina cont de rezultatele obtinute in anii precedenti in materie de prevenire si formare a mucegaiuri lor si micotoxinelor pentru ai exploata in vederea definirii masurilor care trebuie luate pentru a preveni formarea micotoxinelor in urmatorii ani.
Principiile prezentate mai sus duc la principalii factori de care trebuie sa se tina cont in lupta impotriva contaminarii cu micotoxine in camp; rotirea culturilor, gestionarea solului, alegerea speciile sau hibrizilor si folosirea adecvata a fungicidelor. In ceea ce priveste gestionarea riscurilor, legata de
80
contaminarea cu micotoxine, aplicarea bunelor practici agricole, descrise de un comitet de experti FAO/WHO in 2000, poate permite limitarea pe cat posibil contaminarea cu micotoxine.
Practici recomandate inaintea recoltarii
ROTIREA CULTURILOR
Rotirea culturilor constituie in general un mod eficace de a reduce riscul contaminarii in functie de sursaa fungica si specia cultivata. Este foarte eficienta pentru a reduce contaminarea cerealelor de iarna in particular. Culturile care nu sunt contaminate de specii de Fusarium, care afecteaza in general cerealele trebuie sa fie cultivate prin rotatie pentru a reduce contaminarea campului. Cerealele cu bobul mic, cum ar fi graul, trebuie sa fie semanate numai dupa o evaluare a riscurilor de infectie cu mucegaiuri. Interactiunea semnificativa descoperita intre cultura precedenta si gestionarea solului a pus in evidenta importanta ramasitelor de la cultura gazda in ciclul vietii patogenilor. S-a constat ca, continutul in dezoxinivalenol este mult mai mare in cazul cultivarii graului dupa o cultura contaminata cu ssp de Fusarium, decat porumbul sau alte cereale.
ALEGEREA SPECIILOR SAU A HIBRIZILOR
Se recomanda sa se aleaga hibrizi sau specii mai bine adaptate la natura solului, sau la conditiile climatice si la practicile agricole uzuale. Acest lucru reduce stresul vegetalelor si va proteja mai mult cultura impotriva unei infectii fungice. Se recomanda sa se foloseasca, cand exista, specii de seminte selectionate pentru rezistenta la mucegaiuri sau insecte parazite. Alegerea speciilor pentru rezistenta lor la infestarea cu mucegaiuri se face tinand cont si de riscul infestarii. PLANIFICAREA CULTURILOR
Pe cat este posibil, culturile trebuie sa fie planificate pentru a evita conditiile climatice care prelungesc coacerea in camp inainte de recoltare. Uscarea trebuie de asemenea considerata ca fiind un factor de risc in cazul contaminarii cu mucegaiuri. Trebuie sa se evite plantarea apropiata a plantelor. Din acest motiv se recomanda respectarea spatiilor intre randuri si intre plante. Informatia referitoare la aceste spatii poate fi furnizata de producatorii de seminte.
GESTIONAREA SOLULUI SI A CULTURILOR
La cultivare, trebuie sa se tina cont de riscurile eroziunii si de buna gestionare a solului. Toate practicile agricole distrug sau ascund reziduurile culturilor infectate, aratul permitand dupa toate aparentele reducerea contaminarii culturii urmatoare cu mucegaiuri. Pamantul trebuie semanat astfel incat sa se lase o suprafata de semanat rugoasa, o zona de semanat grosiera, pentru a favoriza infiltrarea apei si reducerea la minimum a riscului de eroziune a solului si nutrientilor sai. Se recomanda pe cat posibil pregatirea suprafetelor destinate semanarii prin arare, inlaturarea speciilor ramase pe camp de la cultura precedenta, precum si inlaturarea tijelor si a altor ramasite vegetale care pot servi ca substrat pentru dezvoltarea mucegaiurilor producatoare de micotoxine. In zonele care sunt expuse eroziunii, practicile de lucru pot fi cuplate cu cele de conservare. O atentie deosebita trebuie acordata gestionarii reziduurilor recoltei susceptibile de a favoriza contaminarea culturii urmatoare cu mucegaiuri; aceste reziduuri trebuie sa fie sfaramate cat de fin posibil si incorporate in sol astfel incat sa se faciliteze descompunerea lor.
81
Trebuie sa se evite pe cat posibil stresul plantelor. Exista numerosi factori de stres: seceta, frigul, carentele in nutrienti si reactiile nedorite intre materialele folosite pentru cultura.
Referitor la masurile luate pentru a evita stresul plantelor, de exemplu irigatiiile, trebuie sa se reduca la minim riscul ulterior de infestare fungica prin evitarea irigarii prin stropire in timpul dezvoltarii organelor florale. Irigarea este o metoda valabila pentru reducerea stresului cauzat plantelor in anumite conditii de crestere. Un aport optim de nutrienti este esential pentru a evita o „slabiciune' a plantei, susceptibila favorizarii unei infestari cu mucegaiuri. Trebuie sa se asigure un aport in nutrienti specifici plantei.
Tratamentele semintelor cu fungicide sunt eficace impotriva numeroaselor tipuri de seminte. Este recomandat sa se aplice masuri de prevenire, pe cat posibil, pentru a reduce la minimum infestarile fungice si pagubele cauzate de insecte si sa se foloseasca, daca e nevoie, insecticide si fungicide agreate si omologate pentru lupta impotriva mucegaiurilor. Daca este inoportuna folosirea pesticidelor, cum este cazul agriculturii biologice, trebuie sa se faca apel la practici adecvate. Trebuie subliniat ca aplicarea fungicidelor in timp util este cruciala pentru lupta impotriva infestarilor fungice. Aceste tratamente trebuie sa se bazeze pe informatii meteorologice si/sau anchete asupra recoltelor. Infestarea se deruleaza de obicei in timpul infloririi, ceea ce inseamna ca micotoxinele pot fi produse. Daca o infestare fungica este descoperita ulterior in cultura, trebuie sa se tina cont de manipularea produselor, de amestecarea si folosirea cerealelor. Specii de mucegaiuri cu potential toxicogen au fost izolate pe un numar mare de ierburi si specii de ierburi cu frunzele late. S-a aratat ca o densitate ridicata de ierburi implica o infestare mare cu mucegaiuri. Ierburile prezente in culturi trebuie sa fie combatute prin mijloace mecanice sau prin ierbicide omologate sau alte practici de inlaturare. S-a stabilit ca „culcarea la pamant' a plantelor are un efect semnificativ asupra cantitatii de micotoxine in cereale. In consecinta, plantele culcate la pamant trebuie evitate in timpul recoltarii, in special daca ele sunt umede si prezinta primele semne ale germinarii. Pentru a evita „culcarea la pamant' a culturilor, se recomanda folosirea judicioasa a ingrasamintelor si aplicarea regulatorilor de crestere. Trebuie sa se evite scurtarea excesiva a tijelor.
6.1 Practici recomandate in timpul recoltarii
Evaluarea calitatii cerealelor inaintea recoltarii, tinand cont de limitele unei esantionari reprezentative si o analiza rapida pe teren. Separarea, daca este posibila, a cerealelor pe baza exigentelor calitatii pietei - de exemplu - pentru productia de paine sau hrana pentru animale - si calitatea culturii vechi - umeda, curata sau uscata. Recoltarea sa se faca pe cat posibil atunci cand continutul de apa al plantei sa fie adecvat. Intarzierea recoltarii cerealelor deja contaminate cu mucegaiuri poate provoca o crestere sensibila a continutului de micotoxine in cultura. Trebuie sa se tina cont de posibilitatea uscarii in cazul in care cultura nu poate fi recoltata in conditii optime de continut de apa. Inainte de recoltare trebuie sa se verifice daca echipamentul care va fi folosit la recoltare si depozitare este in stare buna. O defectiune in aceasta perioada critica poate dauna calitatii cerealelor si favoriza formarea micotoxinelor. Trebuie de asemenea verificat si etalonat echipamentul necesar pentru masurarea continutului de apa. Trebuie sa se evite pe cat posibil sfaramarea mecanica a cerealelor si contactul cu solul in timpul recoltarii. Cerealele cu boabe zbarcite si mici pot prezenta mai multe micotoxine decat cele cu dimensiune normala. Este posibila reducerea continutului de micotoxine prin eliminarea boabelor zbarcite prin reglare corecta a combinei sau printr-o triere post- recoltare pentru a elimina boabele stricate si alte particule straine.
82
6.2 Practici recomandate privind uscarea cerealelor
Trebuie sa se determine continutul de apa al culturii inaintea recoltarii sau imediat dupa recoltare. Esantioanele prelevate in acest scop trebuie sa fie cat mai reprezentative. Se recomanda pe cat posibil uscarea cerealelor pentru a atinge continutul de apa recomandat pentru depozitare. In cazul cerealelor umede care trebuie sa fie uscate, se va reduce la minimum perioada cuprinsa intre recoltare si uscare. In consecinta, va trebui, in anumite cazuri, sa se planifice recoltarea in functie de capacitatea de uscare.
Cerealele trebuie sa fie uscate astfel incat continutul in apa sa fie inferior celui care va permite dezvoltarea mucegaiurilor in timpul depozitarii. O activitate a apei inferioara valorii de 0,65 corespunde in general unui continut in apa mai mic de 15%. Trebuie sa se stabileasca valori precise ale continutului de apa, tinand cont de conditiile locale de depozitare. Este o necesitate pentru prevenirea dezvoltarii unui anumit numar de specii fungice care se pot gasi in cereale inaintea uscarii. Daca cerealele umede trebuie sa fie depozitate fara sa fie uscate, mucegaiurile se vor dezvolta in cateva zile si vor provoca reincalzirea lor. Cerealele trebuie sa fie uscate astfel incat sa se reduca la minimum pagubele cauzate de dezvoltarea mucegaiurilor. Aerarea cerealelor umede poate evita supraincalzirea inaintea uscarii. Evitarea pe cat posibil a amestecarii loturilor de cereale care prezinta riscuri diferite de contaminare. Pentru a reduce variatia continutului de apa in lot, cerealele se pot transfera in alta instalatie sau in alt depozit dupa uscare. 6.3 Practici recomandate la depozitarea cerealelor
Pentru marfurile ambalate trebuie sa se asigure ca sacii sunt curati si uscati si sunt asezati pe paleti sau au intercalat intre ei un strat impermeabil.
Aerarea pe cat posibil a cerealelor, prin trecerea circulara a aerului in zone de depozitare pentru a mentine o temperatura apropiata si uniforma in toate aceste zone. Controlul regulat al continutului de apa si temperatura cerealelor depozitate in timpul depozitarii este necesara. Un miros neplacut poate arata ca boabele sunt incinse, in cazul in care locul depozitarii este inchis, lipsit de ventilatie.
Masurarea temperaturii cerealelor depozitate la intervale determinate in timpul depozitarii. O crestere a temperaturii poate indica o dezvoltare microbiana si/sau o infestare cu insecte. Separarea partilor aparent infestate si prelevarea de esantioane pentru analiza. Scaderea temperaturii cerealelor ramase si aerarea este o metoda eficienta pentru a impiedica dezvoltarea mucegaiurilor. Evitarea folosirii cerealelor contaminate pentru productia de alimente destinate consumului uman si animal.
Folosirea metodelor de intretinere dupa reducerea la minimum a prezentei insectelor si formarea mucegaiurilor in depozite. Folosirea insecticidelor si fungicidelor agreate sau altor metode adaptate. Alegerea produselor chimice care nu influenteaza calitatea cerealelor si folosirea acestora in cantitati prescrise.
Folosirea unui agent de conservare agreat (de exemplu acizi organici - acidul propionic) poate avea efecte benefice pentru cerealele destinate alimentatiei animale. Acidul propionic si sarurile sale sunt fungistatice si sunt uneori folosite pentru conservarea cerealelor recoltate umede, evitand pe cat posibil incingerea sau mucegairea inaintea aplicarii tratamentului. Aceste produse trebuie sa fie aplicate rapid cu ajutorul echipamentelor adecvate astfel incat sa se obtina o repartitie uniforma in tot lotul tratat. Daca cerealele sunt tratate dupa o perioada de depozitare umeda, prezenta agentului de conservare nu constituie o garantie a necontaminarii.
83
6.4 Practici recomandate in timpul transportului produselor
Masinile destinate transportului cerealelor trebuie sa fie uscate si lipsite de mucegaiuri vizibile, insecte si alte materiale contaminate. Daca este necesar, trebuie sa se curete si dezinfecteze inainte si dupa folosire, fiind adaptate destinatiei prevazute. Folosirea fumigatelor si ierbicidelor omologate poate fi util. Se vor proteja cerealele, in timpul transportului, de umezeala. Se vor evita fluctuatiile de temperatura si interventiile care ar putea provoca o condensare a suprafetei cerealelor, ceea ce va conduce la o crestere localizata a nivelului umiditatii care va favoriza dezvoltarea mucegaiurilor si formarea micotoxinelor. 6.5 Evitarea patrunderii insectelor, pasarilor si rozatoarelor in timpul transportului
Totusi, aplicarea practicilor agricole nu este suficienta pentru a impiedica contaminarea. Strategiile de decontaminare sunt dezvoltate pentru a face fata acestei probleme.
II) SIGURANŢA ALIMENTARĂ A CEREALELOR PRIN APLICAREA SISTEMULUI HACCP
Nr. crt.
Fază tehnologică
Riscuri fizice Riscuri chimice
Riscuri biologice
Monitorizare Măsuri preventive şi corective
CCP
1. Recepţie
-Impurităţi minerale (praf, pietriş, nisip) - corpuri vătămătoare (negină, mălură, tăciune, muştar sălbatic)
-corpuri organice inerte (pleavă, frunze, insecte moarte)
-boabe din alte culturi făţă de cultura de bază(secără, orz, porumb)
-boabe depreciate din
- Metale grele
- combustibil
- reziduuri de pesticide
- reziduuri de compusi organici proveniti din fertilizarea cerealelor
-Contaminare fungică,
- Micotoxine,
- boli provocate de ciuperci cerealelor,
- dăunători
- Aspectul general al masei de cereale (continutul de impurităţi, uniformitatea boabelor, gradul de dezvoltare, etc)
-Efectuarea analizelor fizico-chimice de laborator şi întocmirea buletinelor de analiză şi a fişelor de control
Refuzul lotului care nu corespunde condiţiilor de calitate
- Control fizico-chimic preliminar
- Curăţirea şi dezinsecţia locului de recepţie
- Recepţia se face în instalaţii proprii
- Lotul de cereale trebuie protejat de intemperii
CCP1
84
cultura de bază (sparte, strivite, nedezvoltate)
2. Precurăţire
-Impurităţi minerale (praf, pietriş, nisip) - corpuri vătămătoare (neghină, mălură, tăciune, muştar sălbatic)
-corpuri organice inerte(pleavă, frunze, insecte moarte)
-boabe din alte culturi făţă de cultura de bază(secără, orz, porumb)
-boabe depreciate din cultura de bază (sparte, strivite, nedezvoltate)
- Metale grele
- combustibil
- reziduuri de pesticide
- reziduuri de compusi organici proveniti din fertilizarea cerealelor
-Contaminare fungică,
- Micotoxine,
- boli provocate de ciuperci cerealelor,
- dăunători
-Controlul conţinutului de impurităţi
-controlul reziduurilor prin analize chimice de laborator
Separearea impurităţilor pe baza diferenţei de mărime;
Măsă specifică;
Insuşiri magnetice;
Dimensiuni şi solubilitate în apă
- izolarea loturilor necorespunzătoare din punct de vedere chimic si biologic
CCP2
3. Depozitare pe loturi calitative
- Metale grele
- combustibil
- reziduuri de pesticide
- reziduuri de compusi organici proveniti din fertilizarea cerealelor
-Contaminare fungică,
- Micotoxine,
- boli provocate de ciuperci cerealelor,
- dăunători
- Umiditate, - temperatură, - condiţii de
ventilare - controlul
atacului de rozătoare
- repartizarea cerealelor pe loturi diferentiate din punct de vedere calitativ
- igenizarea si deratizarea spaţiilor de depozitare
- depozitarea în spaţii cu
CCP3
85
umiditate şi temperatură controlată
- 4. Pregăti
rea pentru măciniş
Contaminare fungică,
- Micotoxine,
- boli provocate de ciuperci cerealelor,
dăunători
- Umiditate, - temperatură, - condiţii de
ventilare
- aerarea cerealelor
- conditionarea hidrotermică
- prelucrarea invelisului
CCP4
5. Măcinarea
- autoincingerea cerealelor
- temperatura valturilor
- controlul si monitorizarea temperaturii la valturi
CP1
6. Omogenizarea
Modificarea culorii
-umiditatea
-temperatura
- controlul si monitorizarea temperaturii şi umiditătii
CP2
4. Ambalare făinii
Corpuri străine, resturi de ambalaje (hartie, sfoară, materiale textile)
-aspectul general al făinii
- Folosirea unor ambalaje corespunzătoare din punct de vedere igenic
- Indepărtarea fizică a continutului de corpuri straine
CCP5
5. Depozitarea finală
-autoincingerea făinii
-Contaminare fungică, Micotoxine
-temperatura
-conditiile de aerisire
-depozitele să fie curate, uscate şi bine aerisite cu pardoseli din ciment, asfalt sau bitum;
-depozitarea sacilor cu făină se face
CCP6
86
obligatoriu pe grătare de lemn pentru a asigura aerisirea stivelor şi pe partea inferioară şi pentru a nu trage umezeală de la pardoseală;
-între stive de saci şi pereţi sau între două stive trebuie lăsate culoare de vizitare şi aerisire de minimum 0,5 m;
-stivele trebuie astfel organizate încît să existe posibilitatea în orice monent ca făina să poată fi livrată în ordinea producerii ei.
Măsuri de control
După realizarea analizei pericolelor, echipa HACCP trebuie să stabilească măsurile de control, respectiv acele acţiuni sau activităţi care pot asigura prevenirea sau eliminarea pericolelor privind siguranţa alimentelor sau reducerea lor până la un nivel acceptabil.
Măsurile de control pot lua forme variate, de la soluţii tehnice sau tehnologice până la masuri organizatorice şi procedurale.
a. Masuri de control pentru riscurile biologice
• Verificări la furnizori privind calitatea materiilor prime şi auxiliare;
• Analize microbiologice ale materiilor prime şi auxiliare la recepţie;
• Control exigent la recepţie privind infestarea sau atacul rozătoarelor;
87
• Asigurarea condiţiilor de temperatura şi umiditate a aerului specifice pe timpul depozitarii pentru a se asigura menţinerea caracteristicilor calitative;
• Prevenirea contaminărilor pe timpul depozitarii prin combaterea dăunătorilor;
• Utilizarea de materii prime şi ingrediente ambalate prin metode şi cu materiale adecvate prevenirii contaminant sau creşterii încărcăturii microbiene;
• Practici de manipulare corespunzătoare care să protejeze materiile prime, ingredientele, semifabricatele şi chiar produsele finite de contaminări; evitarea transvazărilor dintr-un recipient in altul;
• Cernerea făinii pentru eliminarea infestării;
• Monitorizarea temperaturilor, umidităţii aerului şi a duratei la dospire finală pentru a preveni creşterea încărcăturii microbiene;
• Monitorizarea tratamentelor termice (coacere) din punct de vedere al temperaturilor şi duratelor pentru a se asigura, pe lângă rolul tehnologic de coacere şi pe acela de distrugere sau inactivare a încărcăturii microbiene de contaminare;
• Crearea şi verificarea condiţiilor pentru igiena personalului şi a echipamentului de protecţie şi testarea stării de sănătate a personalului - periodic;
• Efectuarea igienei ustensilelor şi a utilajelor şi verificarea prin probe de sanitare periodice;
» Asigurarea igienei spaţiilor de producţie, prevenirea infiltraţiilor, a igrasiei, a condensului;
• Asigurarea unei bune ventilări a spaţiilor de producţie pentru evitarea apariţiei condensului;
» Instruirea personalului cu practici de operare şi de comportament corecte;
• Controlul microbiologic periodic al apei utilizate în procesul tehnologic;
• Utilizarea de ambalaje igienizate pentru transportul pâinii şi al specialităţilor de panificaţie;
> Controlul igienei mijloacelor de transport.
b. Masuri de control pentru riscurile chimice
« Verificări la furnizori (ex: micotoxine, pesticide);
• Analize fizico-chimice la materii prime, ingrediente pentru acele caracteristici cu potenţial toxic;
• Examen organoleptic exigent la recepţie pentru depistarea contaminării cu substanţe chimice (ex: miros de insecticide, substanţe petroliere etc.);
• Controlul operaţiunilor de clătire a ustensilelor şi utilajelor şi a suprafeţelor care vin în contact direct cu produsul după spălarea cu detergenţi si/sau dezinfectarea cu substanţe specifice ale căror urme pot fi toxice;
88
• Depozitarea substanţelor chimice utilizate la spălare, dezinfectare, dezinsecţie şi deratizare sub control strict, sub cheie şi cu acces limitat şi controlat;
• Controlul chimic al apei utilizate in proces;
• Controlul dozărilor aditivilor care pot deveni substanţe cu potenţial de risc.
c. Masuri de control pentru riscurile fizice
• Verificări la furnizori privind condiţiile de prelucrare şi control pe flux a materiilor prime şi ingrediente lor;
• Verificări exigente la recepţia loturilor de materii prime, ingrediente, ambalaje;
• Depozitare corespunzătoare prevenirii riscurilor de contaminare cu cioburi, tencuială, nisip, praf, pietre, sârme etc.;
• Utilizarea de magneţi şi site corespunzătoare la cernătoare;
• Asigurarea traseelor pentru eliminarea deşeurilor şi respectarea acestora;
• Asigurarea cu echipamente de protecţie fără nasturi sau sisteme de prindere metalice;
• Instruirea personalului privind regulile de comportament în timpul activităţii;
• Controlul personalului pentru a respecta regulile de comportament;
• Interzicerea utilizării obiectelor de sticlă în zonele de fabricate (pahare, borcane, ceşti, cilindri gradaţi, pipete, sticle etc.) şi a obiectelor personale;
• Asigurarea întreţinerii utilajelor pentru prevenirea frecărilor cu formare de pilitura de fier şi aşchii metalice, contaminare cu sârme, şuruburi aşchii de plastic, garnituri;
* Utilizarea de detectoare metalice pentru aluaturi;
• Combaterea dăunătorilor, a pasărilor în spaţiile de producţie sau de depozitare.
Determinarea punctelor critice de control - PCC
Al 2-lea Principiu al sistemului HACCP este acela de determinare a Punctelor Critice de Control, prescurtat în continuare PCC.
PCC trebuie determinate pe parcursul procesului tehnologic, acolo unde parametrii de desfăşurare ai acestuia sau parametrii produsului sunt controlabili.
Parte din riscurile identificate pe fluxul de fabricare al produsului ţintă pot fi ţinute sub control prin măsuri stabilite funcţie de tipul de risc
Prevenirea riscurilor majore se face prin evitarea unor riscuri potenţiale in flux (prin proceduri de selectare a furnizorilor, planuri de întreţinere şi reparaţii, planuri de igienizare, proceduri de combatere a dăunătorilor etc).
89
Aceste puncte trebuiesc identificate de echipa HACCP, lucru ce se poate realiza utilizând Arborele de decizie propus de Codex Alimentarius care conţine un set de întrebări ce vor conduce la stabilirea PCC.
Pentru aplicarea Arborelui de decizie se recomandă utilizarea unui formular în care se vor înscrie răspunsurile la întrebări şi care vor fi analizate şi reanalizate în cadrul echipei pentru ca fundamentarea determinării PCC să fie temeinică.
Pentru identificarea PCC se analizează fiecare etapă a fluxului tehnologic, de la recepţia materiilor prime până la produsul final, chiar şi în etapele de depozitare, livrare şi comercializare.
Pentru fiecare proces vor fi analizate riscurile potenţiale datorate:
• Materiei prime, • Contaminărilor pe flux (utilaje - operator - mediu),
• Creşterii încărcăturii microbiene (temperaturi, timp),
dar şi posibila reducere a riscurilor datorită specificului procesului (cernere, fermentare, coacere).
Determinarea PCC este un proces complex care se aplică pentru toate tipurile de riscuri biologice, fizice şi chimice prin analize şi dezbateri susţinute în cadrul echipei HACCP.
Tehnologiile de fabricaţie variate ale aceluiaşi produs alimentar pot fi diferite în ceea ce priveşte riscul apariţiei pericolelor şi a punctelor/etapelor/operaţiilor care constituie PCC. Acest lucru se poate datora diferenţelor existente în ceea ce priveşte: amplasarea secţiei, utilajele şi echipamentele, selectarea materiilor prime, materialelor şi ingredientelor.
Deci, numărul PCC depinde de condiţiile reale ale fiecărui proces. În general, este bine să nu fie exagerat de mare şi nici extrem de mic şi dacă din analiză rezultă o asemenea situaţie, trebuie reluată analiza pentru a verifica probabilitatea menţinerii sau modificării numărului.
Stabilirea limitelor critice
Etapa răspunde Principiului 3 al sistemului HACCP de a stabili valorile limitelor critice faţă de care un risc poate deveni periculos pentru siguranţa produsului.
Parametrii cei mai des folosiţi pentru domeniul fabricării produselor de panificaţie sunt:
• temperaturi de depozitare, de fermentare, de dospire, de coacere;
• timp de depozitare, de frământare, de fermentare, de dospire, de coacere, de răcire;
• PH-ul aluatului (aciditatea aluatului);
• umiditatea aerului in depozite, în spaţiile de lucru, in dospitoare;
• conţinut de impurităţi metalice la făină;
• grad de încărcare microbiană (mucegaiuri, bacterii patogene etc.);
90
• conţinut de micotoxine;
• grad de infestare.
În general, analizele microbiologice sunt analize costisitoare şi care necesită o durată mare de timp, motiv pentru care ţinerea eficientă sub control a riscurilor biologice se face în general prin metode fizico-chimice, respectiv prin determinarea temperaturilor, a duratelor, a pH-ului, a acidităţii titrabile, prin igiena suprafeţelor etc.
De aceea, la stabilirea limitelor critice pentru aceşti parametri se va ţine cont de condiţiile de inhibare a creşterii microbiene, aceste limite devenind măsuri indirecte de control microbiologic pe parcursul procesului, iar testele microbiologice se vor aplica la intervale mai mari de timp, pentru o verificare a efectului.
Stabilirea sistemului de monitorizare in PCC
Monitorizarea este secvenţa planificată de măsurare sau observare a parametrilor critici ai produsului sau procesului prin care se determină dacă măsurile de control luate în considerare continuă să funcţioneze aşa cum ar trebui pe tot parcursul procesului pentru ca produsul final să nu conţină contaminanţi biologici, chimici şi fizici peste limitele acceptabile şi răspunde celui de al 4-lea Principiu al sistemului.
Monitorizarea necesită:
• definirea parametrilor care trebuie măsuraţi, frecvenţa şi locul;
• selectarea metodei de măsurare;
• stabilirea persoanei / persoanelor responsabile;
• verificarea la intervale de timp regulate dacă procesul se desfăşoară aşa cum a fost planificat.
Echipa HACCP analizează şi stabileşte un sistem de monitorizare care să asigure în PCC detectarea pierderii de sub control a proceselor prin măsurarea caracteristicilor materiilor prime, a semifabricatelor, a proceselor pentru determinarea încadrării în limitele critice şi observarea respectării măsurilor de control / preventive stabilite.
Modalităţile de analiza vor fi selectate în aşa fel încât să se asigure un control operativ şi eficient asupra proceselor şi operării.
Detectarea abaterilor trebuie făcută operativ şi eficient pentru a permite acţiunilor corective să limiteze consecinţele negative asupra siguranţei produsului final.
Monitorizarea asigură:
• determinarea momentului în care are loc o pierdere a controlului într-un punct esenţial pentru siguranţa alimentelor;
• informaţii privind funcţionarea şi menţinerea sistemului conform planului HACCP;
91
• intervenţii operative de corectare a abaterilor pentru diminuarea pierderilor;
• întărirea responsabilizării pentru efectuarea corectă a operaţiunilor;
• elemente de analiza pentru îmbunătăţirea performanţelor.
La proiectarea sistemului de monitorizare trebuie să se aibă în vedere:
• ce anume trebuie monitorizat în PCC şi chiar în ,,punctele de atenţie";
• metoda care va fi utilizată pentru fiecare element ce trebuie ţinut sub control (instrumente, precizie, acurateţe a metodei);
• frecvenţa cu care se va face analiza, observarea, măsurarea;
• responsabilitatea pentru efectuarea acţiunilor de observare sau măsurare poate reveni operatorilor sau unei persoane imparţiale.
De asemenea, echipa HACCP trebuie să stabilească instrucţiuni de operare pentru instrumentele de măsură sau instrucţiuni de lucru pentru efectuarea observaţiilor. Instrumentele utilizate la monitorizare se vor calibra periodic pentru a se asigura acurateţea măsurătorilor.
Sistemul de monitorizare necesită utilizarea unor formulare de înregistrare a datelor, concepute de echipa HACCP în colaborare cu coordonatorii proceselor în forme cât mai simple şi uşor de completat, disponibile la locurile de muncă unde este necesară monitorizarea.
Înregistrările trebuie păstrate pe perioade de timp mai mari decât termenul de valabilitate pentru consum al produselor realizate în sistem HACCP, întrucât poate fi necesară o investigare retrospectivă de către conducerea unităţii de producţie, de către un organism de certificare, de organismul de audit sau chiar de organisme de control oficial.
Timpul şi numărul înregistrărilor diferă de la un proces la altul, funcţie de necesităţile de ţinere sub control, dar de cele mai multe ori se vor face înregistrări la recepţie, pe parcursul procesului, la ambalare, la depozitare, la transport, la efectuarea operaţiunilor de curăţare şi igienizare, a celor de combatere a dăunătorilor, la verificarea şi controlul sănătăţii operatorilor.
4.9. Stabilirea de actiuni corective in cazul abaterilor de la limitele critice
Principiul 5 al sistemului HACCP prevede stabilirea de acţiuni corective care trebuiesc aplicate când limitele critice sunt pe cale să fie depăşite sau chiar au fost depăşite.
În general, acţiunile corective pot fi previzionate sau prestabilite ca mod de aplicare şi de acţiune pentru cele mai defavorabile situaţii şi, implicit, personalul poate fi instruit în acest sens.
Sunt însă şi situaţii în care pot apare abateri neprevăzute şi, in acest caz, este important ca personalul sa fie pregătit (profesional şi psihic) să poată lua deciziile corecte pentru a elimina efectele negative asupra siguranţei produsului.
În toate punctele importante de pe parcursul fluxului vor fi disponibile formulare de înregistrare a acţiunilor corective care au fost executate.
92
Analiza acestor înregistrări asigură, în timp, elaborarea unor masuri preventive care vor constitui o treaptă de îmbunătăţire a conducerii proceselor pentru a se evita apariţia altor abateri.
Tipuri de documente
a. Specificaţii de produs
Specificaţiile de produs sunt documente care se întocmesc pentru produse finite, pentru toate materiile prime utilizate în reţetă, pentru toate ingredientele, pentru ambalaje. Aceste documente cuprind înregistrări ale unor caracteristici şi cerinţe legate de produs, de proces sau pentru nivelul calitativ şi de siguranţa alimentelor ce trebuie îndeplinite de produsul la care se referă.
b. Instrucţiuni
Instrucţiunile sunt documente în care se prezintă modalităţi de operare şi indicaţii referitoare la cel mai eficient mod de acţiune, adaptate la condiţiile de desfăşurare a activităţii, prezentate într-o formă scurtă, concisă, formulate ca nişte comenzi. Instrucţiunile se formulează după consultarea cu persoanele implicate în acţiunea respectivă.
Instrucţiunile pot fi:
• instrucţiuni de lucru - sunt instrucţiuni în care se prezintă acţiunile necesare pentru realizarea unei faze tehnologice, într-o succesiune logică, cu urmărirea respectării regimurilor tehnologice.
• instrucţiuni de operare - sunt instrucţiuni în care se prezintă modalitatea de operare şi de reglare a maşinilor şi instalaţiilor.
• instrucţiuni de control - sunt instrucţiuni pentru efectuarea unei acţiuni de control, a unui test.
c. Proceduri
Procedurile sunt documente ale sistemului care detaliază modul de îndeplinire a unei activităţi care depăşeşte graniţele unui departament şi care se elaborează prin acordul scris dintre departamentele implicate.
• Proceduri de sistem. Sunt proceduri generale, elaborate pentru întreaga organizaţie, respectând cerinţele SR 13462-2, ISO 9001/2000, DS 3027/2002.
• Proceduri operaţionale.
d. Formulare de înregistrare
Formularele de înregistrare sunt documente concepute si distribuite pentru zonele de lucru unde sunt necesare urmăriri ale parametrilor sau ale operaţiunilor conform planului de control al procesului tehnologic.
93
e. Ghidul intern de bune practici
Pentru implementarea unui plan HACCP este necesară stabilirea unui ghid intern (propriu) de bune practici de producţie si igienă, element esenţial care stă la temelia sistemului HACCP,
Ghidul intern de bune practici este un ,,cod de bună purtare" al societăţii care, cu respectarea legislaţiei in vigoare, îşi propune să atingă ţinta: calitatea si siguranţa produselor oferite consumatorilor prin activităţi de maximă eficienţă.
f. Planul HACCP
Planul HACCP este un document descriptiv, care precizează practicile. resursele, succesiunea activităţilor specifice referitoare la siguranţa alimentelor, relevante pentru un anumit produs/produse, proces/procese şi are ca scop asigurarea unui bun management pentru siguranţa alimentelor.
g. Manualul HACCP sau Manualul siguranţei alimentelor
Manualul HACCP este un document care prezintă politica de siguranţă a alimentelor si descrierea sintetică a sistemului HACCP pentru implementarea în unitatea de producţie. Este utilizat în relaţiile cu clienţii, cu furnizorii, precum şi cu reprezentanţii organelor de inspecţie şi control autorizate.
4.11.2. Ţinerea sub control a documentelor
Documentaţia sistemului de management al siguranţei alimentare este necesară pentru:
• realizarea conformităţii, instruire, repetabilitate, trasabilitate, evidenţă obiectivă, evaluarea eficacităţii.
Aceste documente se pot clasifica astfel:
• Documente pregătitoare.
• Documente de execuţie.
• Documente de raportare şi înregistrare.
• Documente de organizare.
Pentru sistemul de management al siguranţei alimentelor este necesară ţinerea sub control a documentelor şi a înregistrărilor. Ansamblul de documente elaborate pentru sistemul de management al siguranţei alimentelor necesită să treacă prin diferite etape de redactare, de aprobare, de verificare, de codificare, de difuzare controlată, de modificare, de revizuire, de înregistrare şi de arhivare.
94
Capitolul 7. LEGISLAȚIA CE PRIVIND CONTAMINAREA CEREALELOR CU FUNGI ȘI MICOTOXINE
Începând cu anul 2001, prin Regulamentul (CE) nr. 466/2001 al Comisiei din 8 martie 2001, UE a stabilit niveluri maxime pentru anumiți contaminanți din produsele alimentare, modificându-le în mod substanțial de multe ori, luând în considerare noile informații și evoluții ale Codex Alimentarius. În scopul protejării sănătății publice, menținerii contaminanților la niveluri acceptabile din punct de vedere toxicologic, pentru a evita disparitățile dintre legislațiile statelor membre și riscul de denaturare a concurenței, Regulamentul (CE) nr. 1881/2006 al Comisiei din 19 decembrie 2006 a fost promulgat .
Se bazează pe mai multe principii descrise pe scurt: i) nivelurile maxime ar trebui stabilite la un nivel strict care să poată fi realizat în mod rezonabil prin respectarea bunelor practici agricole, de pescuit și de producție și ținând seama de riscurile legate de consumul de alimente; (ii) în cazul contaminanților considerați a fi cancerigeni genotoxici sau în cazurile în care expunerea actuală a populației sau a grupurilor vulnerabile din populație este apropiată sau depășește doza admisibilă, valorile maxime ar trebui stabilite la un nivel care să fie scăzut în mod rezonabil (ALARA); (iii) aceste abordări garantează că operatorii din sectorul alimentar aplică, în măsura posibilului, măsuri de prevenire și reducere a contaminării pentru a proteja sănătatea publică; (iv) pentru a asigura o protecție eficientă a sănătății publice, produsele care conțin contaminanți care depășesc nivelurile maxime nu ar trebui introduse pe piață ca atare, după amestecare cu alte produse alimentare sau utilizate ca ingrediente în alte produse alimentare; v) pentru a se asigura că nivelurile maxime sunt puse în aplicare într-un mod uniform, aceleași criterii de eșantionare și aceleași criterii de performanță pentru analiză ar trebui să fie aplicate de autoritățile competente în întreaga Comunitate. De asemenea, este important ca rezultatele analitice să fie raportate și interpretate în mod uniform.
Măsurile privind eșantionarea și analiza specificate în regulament prevăd norme uniforme privind raportarea și interpretarea; (vi) orice nivel maxim adoptat la nivel comunitar poate face obiectul unei revizuiri pentru a ține seama de progresul cunoștințelor științifice și tehnice și de îmbunătățirea bunelor practici agricole, pescărești și de fabricație. Au fost adoptate diferite reglementări. Toate acestea se bazează pe normele generale conform cărora produsele alimentare enumerate în anexă nu se introduc pe piață în cazul în care conțin un contaminant enumerat în anexă la un nivel care depășește nivelul maxim prevăzut în anexă. Nivelurile maxime specificate în anexă se aplică părții comestibile a produselor alimentare în cauză, cu excepția cazului în care se specifică altfel în anexă.
Prezentul regulament este modificat conform celor prezentate mai sus, în conformitate cu noile cunoștințe. 1126/2007 AL COMISIEI din 28 septembrie 2007 de stabilire a conținuturilor maxime pentru anumiți contaminanți din produsele alimentare în ceea ce privește toxinele de fusarium din porumb și de porumb, Regulamentul (UE) nr. 165/2010 al Comisiei din 26 februarie 2010 de stabilire a conținuturilor maxime pentru anumiți contaminanți din produsele alimentare în ceea ce privește aflatoxinele, REGULAMENTUL (UE) 2015/1940 AL COMISIEI din 28 octombrie 2015 privind nivelurile maxime de sclerotia de ergot în anumite cereale neprelucrate și dispozițiile privind monitorizarea și raportarea și RECOMANDAREA
95
COMISIEI din 27 martie 2013 privind prezența toxinelor T-2 și HT-2 în cereale și produse din cereale.
Nivelurile maxime admise efectiv pentru micotoxinele reglementate în cereale sunt reluate în următoarele tabele. Tabelul 7 Valorile maxime admise pentru Deoxynivalenol (DON) (17) în conformitate cu Regulamentul (UE) nr. 1881/2006 al Comisiei din 19 decembrie 2006 și cu Regulamentul (UE) nr. 1126/2007 al Comisiei din 28 septembrie 2007
Alimente Niveluri maxime (ìg/kg o ppb) Cereale neprocesate (18) (19) altele decât grâul dur, ovăz și porumb
1,250
Grâu dur și ovăz neprelucrat (18) (19) 1,750 Porumb neprelucrat (18), cu excepția porumbului neprelucrat destinat prelucrării prin măcinare umedă (*)
1,750 (20)
Cereale destinate consumului uman direct, făină de cereale, tărâțe și germeni ca produs finit comercializat pentru consumul uman direct, cu excepția produselor alimentare enumerate la punctele 2.4.7, 2.4.8 și 2.4.9
750
Paste (uscate) (22) 750 Pâine (inclusiv produse mici de panificație), produse de patiserie, biscuiți, gustări de cereale și cereale pentru micul dejun
500
Paste (uscate) (22) 750 Alimente prelucrate pe bază de cereale și alimente pentru copii pentru sugari și copii mici (3) (7)
200
Fracțiunile de măcinare din porumb cu dimensiunea particulelor> 500 microni care se încadrează la codurile NC 103 13 sau 1103 20 40 și alte produse de măcinare a porumbului cu dimensiunea particulelor> 500 microni care nu sunt utilizate pentru consumul uman direct care se încadrează în cod NC 1904 10 10
750
Fracțiunile de măcinare din porumb cu dimensiunea particulelor ≤ 500 microni care se încadrează la codul NC 1102 20 și alte produse de măcinare a porumbului cu dimensiunea particulelor ≤ 500 microni care nu sunt utilizate pentru consumul uman direct și care intră sub incidența codului NC 1904 10 10
1250
(3) Produsele alimentare enumerate în această categorie, astfel cum sunt definite în Directiva 96/5 / CE a Comisiei din 16 februarie 1996 privind produsele pe bază de cereale pe bază de cereale și alimentele destinate sugarilor și copiilor de vârstă mică (JO L 49, 28.2.1996, p. 17) 2003/13 / CE (JO L 41, 14.2.2003, p. 33). (7) Nivelul maxim se referă la materia uscată. Substanța uscată este determinată în conformitate cu Regulamentul (CE) nr. 401/2006.
96
(17) În scopul aplicării nivelurilor maxime pentru toxinele deoxinivalenol, zearalenonă, T-2 și HT-2 stabilite la punctele 2.4, 2,5 și 2,7 nu sunt incluse în "cereale", iar produsele din orez nu sunt incluse în "produse din cereale". (18) Nivelul maxim se aplică cerealelor neprelucrate introduse pe piață pentru prelucrarea în prima etapă. "Prelucrare în prima etapă" înseamnă orice tratament fizic sau termic, altul decât uscarea, din sau pe boabe. Procedurile de curățare, sortare și uscare nu sunt considerate a fi "procesare în prima etapă", în măsura în care nu se exercită acțiunea fizică asupra sâmburei în sine, iar cerealele integrale rămân intacte după curățare și sortare. În sistemele integrate de producție și prelucrare, nivelul maxim se aplică cerealelor neprelucrate în cazul în care acestea sunt destinate prelucrării în prima etapă. (19) Nivelul maxim se aplică cerealelor recoltate și preluate începând cu anul de comercializare 2005/2006, în conformitate cu Regulamentul (CE) nr. 824/2000 al Comisiei din 19 aprilie 2000 de stabilire a procedurilor de preluare a cerealelor prin intervenție agențiilor și metodelor de analiză pentru determinarea calității cerealelor (JO L 100, 20.4.2000, p. 31), astfel cum a fost modificat ultima dată prin Regulamentul (CE) nr. 1068/2005 (JO L 174, 07.07.2005, p. 65). (20) Nivelul maxim se aplică de la 1 iulie 2007. (21) Pasta (uscată) înseamnă paste făinoase cu un conținut de apă de aproximativ 12%. (*) Scutirea se aplică numai porumbului pentru care este evident, de ex. prin etichetare, destinație, că este destinat utilizării într-un mediu umed (numai producția de amidon). " Tabelul 8 Nivelurile maxime admise de furfomizină (Suma B1 și B2) (17) conform Regulamentului Comisiei (UE) nr. 1881/2006 din 19 Decembrie 2006 și Regulamentul (UE) nr. 1126/2007 al Comisiei din 28 septembrie (notele de subsol sunt raportate ca în documentele originale) Alimente Niveluri maxime (ìg/kg
o ppb)(23) 2.6.1 Porumb neprelucrat (18), cu excepția porumbului neprelucrat destinat prelucrării prin măcinare umedă (*)
4,000
2.6.2 Porumb destinat consumului uman direct, alimente pe bază de porumb destinate consumului uman direct, cu excepția produselor alimentare enumerate la punctele 2.6.3 și 2.6.4
1,000
2.6.3 Cereale pentru micul dejun pe bază de cereale și gustări pe bază de porumb
800
2.6.4 Alimente prelucrate pe bază de porumb și alimente pentru copii pentru sugari și copii mici (3) (7)
200
2.6.5 Fracțiuni de măcinare din porumb cu dimensiunea particulelor> 500 microni care se încadrează la codurile NC 1103 13 sau 1103 20 40 și alte produse de măcinare a porumbului cu dimensiunea particulelor> 500 microni care nu sunt utilizate pentru consumul uman direct și care intră sub incidența codului NC 1904 10 10
1,400
2.6.6 Fracțiunile de măcinare din porumb cu dimensiunea 2,000
97
particulelor ≤ 500 microni care se încadrează la codul NC 1102 20 și alte produse de măcinare a porumbului cu dimensiunea particulelor ≤ 500 microni care nu sunt utilizate pentru consumul uman direct și care intră sub incidența codului NC 1904 10 10 (3) Produsele alimentare enumerate în această categorie, astfel cum sunt definite în Directiva 96/5 / CE a Comisiei din 16 februarie 1996 privind produsele pe bază de cereale pe bază de cereale și alimentele destinate sugarilor și copiilor de vârstă mică (JO L 49, 28.2.1996, p. 17) 2003/13 / CE (JO L 41, 14.2.2003, p. 33). (7) Nivelul maxim se referă la materia uscată. Substanța uscată este determinată în conformitate cu Regulamentul (CE) nr. 401/2006. (18) Nivelul maxim se aplică cerealelor neprelucrate introduse pe piață pentru prelucrarea în prima etapă. "Prelucrare în prima etapă" înseamnă orice tratament fizic sau termic, altul decât uscarea, din sau pe boabe. Procedurile de curățare, sortare și uscare nu sunt considerate a fi "procesare în prima etapă", în măsura în care nu se exercită acțiunea fizică asupra sâmburei în sine, iar cerealele integrale rămân intacte după curățare și sortare. În sistemele integrate de producție și prelucrare, nivelul maxim se aplică cerealelor neprelucrate în cazul în care acestea sunt destinate prelucrării în prima etapă. (23) (*) Exceptarea se aplică numai porumbului pentru care este evident, de ex. prin etichetare, destinație, că este destinat utilizării într-un mediu umed (numai producția de amidon). Tabelul 9 Valorile maxime admise pentru zearalenonă (17) în conformitate cu Regulamentul (UE) nr. 1881/2006 al Comisiei din 19 decembrie 2006 și cu Regulamentul (UE) 1126/2007 al Comisiei din 28 septembrie 2007 (notele de subsol sunt raportate ca în documentele originale)
Alimente Niveluri maxime(ìg/kg o ppb)
2.5.1 Cereale neprocesate (18) (19) altele decât porumbul 100 2.5.2 Porumb neprelucrat (18), cu excepția porumbului neprelucrat destinat prelucrării prin măcinare umedă (*)
350 (20)
2.5.3 Cereale destinate consumului uman direct, făină de cereale, tărâțe și germeni ca produs finit comercializat pentru consumul uman direct, cu excepția produselor alimentare enumerate la punctele 2.5.6, 2.5.7, 2.5.8, 2.5.9 și 2.5.10
75
2.5.4 Ulei rafinat de porumb 400 (20) 400 (20) 2.5.5 Pâine (inclusiv produse mici de panificație), produse de patiserie, biscuiți, gustări de cereale și cereale pentru micul dejun, cu excepția gustărilor de porumb și a cerealelor pentru micul dejun pe bază de porumb
50
2.5.6 Porumb destinat consumului uman direct, gustări pe bază de porumb și cereale pentru micul dejun pe bază de porumb
100 (20)
2.5.7 Alimente prelucrate pe bază de cereale (cu excepția alimentelor pe bază de porumb prelucrate) și alimente pentru copii pentru sugari și copii mici (3) (7)
20
2.5.8 Alimente prelucrate pe bază de porumb pentru sugari și copii mici (3) (7)
20 (20)
2.5.9 Fracțiuni de măcinare din porumb cu dimensiunea particulelor> 500 microni care se încadrează la codurile NC 1103 13 sau 1103 20 40 și
200 (20)
98
(3) Produsele alimentare enumerate în această categorie, astfel cum sunt definite în Directiva 96/5 / CE a Comisiei din 16 februarie 1996 privind produsele pe bază de cereale pe bază de cereale și alimentele destinate sugarilor și copiilor de vârstă mică (JO L 49, 28.2.1996, p. 17) 2003/13 / CE (JO L 41, 14.2.2003, p. 33). (7) Nivelul maxim se referă la materia uscată. Substanța uscată este determinată în conformitate cu Regulamentul (CE) nr. 401/2006. (17) În scopul aplicării nivelurilor maxime pentru toxinele deoxinivalenol, zearalenonă, T-2 și HT-2 stabilite la punctele 2.4, 2,5 și 2,7 nu sunt incluse în "cereale", iar produsele din orez nu sunt incluse în "produse din cereale". (18) Nivelul maxim se aplică cerealelor neprelucrate introduse pe piață pentru prelucrarea în prima etapă. "Prelucrare în prima etapă" înseamnă orice tratament fizic sau termic, altul decât uscarea, din sau pe boabe. Procedurile de curățare, sortare și uscare nu sunt considerate a fi "procesare în prima etapă", în măsura în care nu se exercită acțiunea fizică asupra sâmburei în sine, iar cerealele integrale rămân intacte după curățare și sortare. În sistemele integrate de producție și prelucrare, nivelul maxim se aplică cerealelor neprelucrate în cazul în care acestea sunt destinate prelucrării în prima etapă. (19) Nivelul maxim se aplică cerealelor recoltate și preluate începând cu anul de comercializare 2005/2006, în conformitate cu Regulamentul (CE) nr. 824/2000 al Comisiei din 19 aprilie 2000 de stabilire a procedurilor de preluare a cerealelor prin intervenție agențiilor și metodelor de analiză pentru determinarea calității cerealelor (JO L 100, 20.4.2000, p. 31), astfel cum a fost modificat ultima dată prin Regulamentul (CE) nr. 1068/2005 (JO L 174, 07.07.2005, p. 65). (20) Nivelul maxim se aplică de la 1 iulie 2007. (*) Scutirea se aplică numai porumbului pentru care este evident, de ex. prin etichetare, destinație, că este destinat utilizării într-un mediu umed (numai producția de amidon). Tabelul 10 Nivelurile maxime admise pentru ochratoxina A în cereale în conformitate cu Regulamentul (UE) nr. 1881/2006 al Comisiei din 19 decembrie 2006 (notele de subsol sunt raportate ca în documentele originale) Alimente Niveluri maxime (ìg/kg o
ppb) 2.2.1 Cereale neprocesate 5 2.2.2 Toate produsele derivate din cereale neprelucrate, inclusiv produsele cerealiere prelucrate și cerealele destinate consumului uman direct, cu excepția produselor alimentare enumerate la
3
alte produse de măcinare a porumbului cu dimensiunea particulelor> 500 microni care nu sunt utilizate pentru consumul uman direct și care intră sub incidența codului NC 1904 10 10 2.5.10 Fracțiunile de măcinare din porumb cu dimensiunea particulelor ≤ 500 microni care se încadrează la codul NC 1102 20 și alte produse de măcinare a porumbului cu dimensiunea particulelor ≤ 500 microni care nu sunt utilizate pentru consumul uman direct și care intră sub incidența codului NC 1904 10 10
300 (20)
99
punctele 2.2.9 și 2.2.10 2.2.9 Alimente prelucrate pe bază de cereale și alimente pentru copii pentru sugari și copii mici (3) (7)
0.5
2.2.10 Alimente dietetice destinate unor scopuri medicale speciale (9) (10) destinate în mod special sugarilor
0,5
(3) Produsele alimentare enumerate în această categorie, astfel cum sunt definite în Directiva 96/5 / CE a Comisiei din 16 februarie 1996 privind produsele pe bază de cereale pe bază de cereale și alimentele destinate sugarilor și copiilor de vârstă mică (JO L 49, 28.2.1996, p. 17) 2003/13 / CE (JO L 41, 14.2.2003, p. 33). (7) Nivelul maxim se referă la materia uscată. Substanța uscată este determinată în conformitate cu Regulamentul (CE) nr. 401/2006. (9) Produsele alimentare enumerate în această categorie, astfel cum sunt definite în Directiva 1999/21 / CE a Comisiei din 25 martie 1999 privind alimentele dietetice destinate unor scopuri medicale speciale (JO L 91, 7.4.1999, p. 29). (10) Nivelul maxim se referă, în cazul laptelui și al produselor lactate, la produsele gata de utilizare (comercializate ca atare sau reconstituite conform instrucțiunilor producătorului), iar în cazul produselor, altele decât laptele și produsele lactate, la produsele uscate materie. Substanța uscată este determinată în conformitate cu Regulamentul (CE) nr. 401/2006. Tabelul 11. Nivelul maxim admis pentru aflatoxine în cereale în conformitate cu Regulamentul (UE) nr. 1881/2006 al Comisiei din 19 decembrie 2006 și cu Regulamentul (UE) nr. 165/2010 al Comisiei din 26 februarie 2010 (notele de subsol sunt prezentate în documentele originale). Foodstuffs Niveluri maxime B1
(ìg/kg o ppb) Suma nivelurilor maxime deB1,B2, G1,G2 (ìg/kg o ppb)
2.1.11. Toate cerealele și toate produsele derivate din cereale, inclusiv produsele din cereale prelucrate, cu excepția produselor alimentare enumerate mai jos (2.1.12, 2.1.15 și 2.1.17 din Regulamentul nr. 165/2010
2 4
2.1.12. Porumbul și orezul care urmează a fi supuse sortării sau altui tratament fizic înainte de consumul uman sau de utilizare ca ingredient în produsele alimentare
5 10
2.1.15 Alimente prelucrate pe bază de cereale și alimente pentru copii pentru sugari și copii mici (3) (7)
0.10
2.1.17 Alimente dietetice destinate unor scopuri medicale speciale (9) (10) destinate în mod special sugarilor
0.10 0.025
(3) Produsele alimentare enumerate în această categorie, astfel cum sunt definite în Directiva 96/5 / CE a Comisiei din 16 februarie 1996 privind produsele prelucrate pe bază de cereale și alimentele destinate sugarilor și copiilor de vârstă mică (JO L 49, 28.2.1996, p. 17) Directiva 2003/13 / CE (JO L 41, 14.2.2003, p. 33).
100
(7) Nivelul maxim se referă la materia uscată. Substanța uscată este determinată în conformitate cu Regulamentul (CE) nr. 401/2006. (9) Produse alimentare enumerate în această categorie, astfel cum sunt definite în Directiva 1999/21 / CE a Comisiei din 25 martie 1999 privind alimentele dietetice destinate unor scopuri medicale speciale (JO L 91, 7.4.1999, p. 29). (10) Nivelul maxim se referă, în cazul laptelui și al produselor lactate, la produsele gata de utilizare (comercializate ca atare sau reconstituite conform instrucțiunilor producătorului), iar în cazul produselor, altele decât laptele și produsele lactate, la substanța uscată. Substanța uscată este determinată în conformitate cu Regulamentul (CE) nr. 401/2006. Tabelel 12. Nivelul indicativ pentru produsele din cereale și cereale pentru toxinele T-2 și HT-2 în conformitate cu Regulamentul (UE) nr. 1881/2006 al Comisiei din 19 decembrie 2006 și RECOMANDAREA COMISIEI din 27 martie 2013 privind prezența T2 și HT2 toxină din cereale și produse din cereale Toxinele T-2 si HT-2 (17) Suma toxinelor T-2 și HT-2 toxin
Niveluri maxime (ìg/kg o ppb)
1. Cereale neprocesate (***) 1.1. orz (inclusiv orz de malț) și porumb 200 1.2. ovăz (cu coajă) 1,000 1.3. grâu, secară și alte cereale 100 2. Cereale pentru consumul uman direct (****) 2.1. Ovăz 200 2.2. Porumb 100 2.3. Alte cereale 50 3. Produse din cereale pentru consumul uman 3.1. tărâțe de ovăz și fulgi de ovăz 200 3.2. tărâțe de cereale, cu excepția tărâțelor de ovăz, produse de măcinare a ovăzului, altele decât tărâțele de ovăz și ovăzul sub formă de fulgi și produsele de măcinare a porumbului
100
3.3. alte produse de măcinare a cerealelor 50 3.4. cereale pentru micul dejun, inclusiv fulgi de cereale formate
75
3.5. pâine (inclusiv mărfuri mici de panificație), produse de patiserie, biscuiți, gustări de cereale, paste făinoase
25
3.6. cereale pe bază de alimente pentru sugari și copii mici 15 (*)Nivelurile menționate în prezenta anexă sunt niveluri indicative peste care, cu siguranță în cazul constatărilor repetitive, ar trebui să se efectueze investigații asupra factorilor care conduc la prezența toxinelor T-2 și HT-2 sau asupra efectelor procesării hranei pentru animale și a alimentelor . Nivelurile orientative se bazează pe datele privind situațiile disponibile în baza de date a EFSA, astfel cum sunt prezentate în avizul EFSA. Nivelurile indicative nu reprezintă
101
nivelurile de siguranță pentru hrana pentru animale și produsele alimentare. (**) În sensul prezentei recomandări, orezul nu este inclus în cereale și produsele din orez nu sunt incluse în produsele din cereale. (***) Cerealele neprelucrate sunt cerealele care nu au suferit nici un tratament fizic sau termic decât uscarea, curățarea și sortarea. (****) Boabele de cereale destinate consumului uman direct sunt boabe de cereale care au suferit procese de uscare, curățare, dezosare și sortare și pe care nu se vor efectua alte procese de curățare și sortare înainte de prelucrarea ulterioară în lanțul alimentar. (*****) Nivelele orientative pentru cereale și produsele cerealiere destinate furajelor și furajelor combinate sunt relativ la un furaj cu un conținut de umiditate de 12%.
Tabelel 13. Nivelurile maxime admise pentru scleroti de ergot și pentru alcaloizii de ergot în anumite cereale neprelucrate în conformitate cu Regulamentul (UE) nr. 1881/2006 al Comisiei din 19 decembrie 2006 și 2015/1940 din 28 octombrie 2015 Alimente Niveluri maxime (ìg/kg o ppb) 2.9.2. Scleroti de ergot 2.9.1.1. Cereale neprocesate (18), cu excepția porumbului și a orezului
0.5 g/kg(*)
2.9.2. Alcaloizi din ergot (**) 2.9.2.1. Cereale neprocesate (18), cu excepția porumbului și a orezului
-(***)
2.9.2.2. Produse de măcinare a cerealelor, cu excepția produselor de măcinare a porumbului și a orezului
-(***)
2.9.2.3. Pâine (inclusiv produse mici de panificație), produse de patiserie, biscuiți, gustări de cereale, cereale pentru micul dejun și paste făinoase
—(***)
2.9.2.4. Cereale pe bază de alimente pentru sugari și copii mici - (***) (*) Eșantionarea se efectuează în conformitate cu punctul B din anexa I la Regulamentul (CE) nr. 401/2006 al Comisiei (JO L 70, 9.3.2006, p. 12). Analiza se efectuează prin examinare microscopică. (**)Suma de 12 alcaloizi de ergot: ergocristină / ergocristinină; ergotamină / ergotaminine; ergocriptina / ergocryptinine; ergometrine / ergometrinine; ergosine / ergosinine; ergocornină / ergocorninină. (***)Nivelurile maxime adecvate și realizabile, care asigură un nivel ridicat de protecție a sănătății umane, sunt luate în considerare pentru aceste categorii de produse alimentare relevante înainte de 1 iulie 2017. " (18) Nivelul maxim se aplică cerealelor neprelucrate introduse pe piață pentru prelucrarea în prima etapă. "Prelucrare în prima etapă" înseamnă orice tratament fizic sau termic, altul decât uscarea, din sau pe boabe. Curățarea, inclusiv procedurile de spălare, sortare și uscare, nu sunt considerate a fi "procesare în prima etapă", în măsura în care cerealele integrale rămân intacte după curățare și sortare. Curățarea cerealelor prin spălarea și / sau curățarea viguroasă a acestora. În cazul în care spălarea este aplicată în prezența sclerotiei de ergot, cerealele trebuie să fie supuse unei prime etape de curățare înainte de spălare. Curățarea, efectuată în combinație cu un aspirator de praf, este urmată de o sortare a culorii înainte de frezare. Sisteme integrate de producție și prelucrare înseamnă sisteme prin care toate loturile de cereale primite sunt curățate,
102
sortate și prelucrate în aceeași unitate. În astfel de sisteme de producție și prelucrare integrate, nivelul maxim se aplică cerealelor neprelucrate după curățare și sortare, dar înainte de prima prelucrare. Operatorii din sectorul alimentar asigură respectarea procedurii HACCP prin care se stabilește și se pune în aplicare o procedură eficientă de monitorizare la acest punct critic de control. " În concluzie, astfel de informații privind legislația europeană privind micotoxinele pe cereale sunt prezentate pe scurt și în tabelul 8 sunt enumerate regulile și link-urile site-ului pentru a ajuta utilizatorii, dar este obligatoriu să ne amintim că informațiile prezentate aici sunt exhaustive pentru toate aspectele și în funcție de viața regulamentele documentelor oficiale trebuie consultate. Table 14 Lista regulamentelor și link-urile catre site-urilor Regulamentul privind nivelurile
maxime de micotoxine pe cereale
Link
Regulamentul (CE) nr. 1881/2006 al Comisiei din 19 decembrie 2006 de stabilire a nivelurilor maxime pentru anumiți contaminanți din produsele alimentare - Document 32006R1881
https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=celex%3A32006R1881
Regulamentul (UE) nr. 1126/2007 al Comisiei din 28 septembrie 2007 de modificare a Regulamentului (CE) nr. 1881/2006 de stabilire a conținuturilor maxime pentru anumiți contaminanți din produsele alimentare în ceea ce privește toxinele de fusarium din porumb și din porumb -Document 32007R1126
https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/HTML/?uri=CELEX:32007R1126&from=IT
Regulamentul (UE) nr. 165/2010 al Comisiei din 26 februarie 2010 de modificare a Regulamentului (CE) nr. 1881/2006 de stabilire a conținuturilor maxime pentru anumiți contaminanți din produsele alimentare în ceea ce privește aflatoxinele - Document 32010R0165
https://eur-lex.europa.eu/legal-content/IT/ALL/?uri=CELEX%3A32010R0165
Regulamentul (UE) 2015/1940 al Comisiei din 28 octombrie 2015
https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?toc=OJ:L:2015:283:TOC&uri=
103
de modificare a Regulamentului (CE) nr. 1881/2006 în ceea ce privește nivelurile maxime de sclerotia de ergot în anumite cereale neprelucrate și dispozițiile privind monitorizarea și raportarea - Document 32015R1940
uriserv:OJ.L_.2015.283.01.0003.01.ENG
REFERINȚE
1. Ismaiel, A. and Papenbrock, J. (2015). Mycotoxins: producing fungi and mechanisms of phytotoxicity. Agriculture. 5: 492-537.
2. Cook, F. K. and Johnson, B. L. (2009). Microbiological spoilage of cereal products. In: Food microbiology and food safety: Compendium of the microbiological spoilage of foods and beverages. (Sperber, W. H. and Doyle, M. P, eds). Springer. 223-245.
3. Krska, R., de Nijs, M., McNerney, O., Pichler, M., Gilbert, J., Edwards, S., Suman, M., Magan, N., Rossi, V., van der Fels-Klerx, H. J., Bagi, F., Poschmaier, B., Sulyok, M., Berthiller, F. and van Egmond, H. P. (2016). Safe food and feed through an integrated toolbox for mycotoxin management: the MyToolBox approach. World Mycotoxin Journal, 2016; 9 (4): 487-495.
4. Moss, M. O. (2000). Toxigenic fungi and mycotoxins. In: The microbiological safety and quality of food (Lund, B. M., Baird-Parker, T. C., Gould, G. W., eds). Aspen Publishers, Inc. 1490-1510.
5. Alshannaq, A. and Yu, J-H. (2017). Occurrence, toxicity, and analysis of major mycotoxins in food. International Journal of Environmental Research and Public Health. 14 (6): 632.
6. Perrone, G., Susca, A., Cozzi, G., Ehrlich, K., Varga, J., Frisvad, J.C., Meijer, M. P. Noonim, P., Mahakarnchanakul, W. and Samson R. A. (2007). Biodiversity of Aspergillus species in some important agricultural products. Studies in Mycology. 59: 53 – 66.
7. Frisvad, J. C., Thrane, U., Samson, R. A., Pitt, J. I. Important mycotoxins and the fungi which produce them. In: Advances in Food Mycology. Advances in Experimental Medicine and Biology book series (Hocking A. D, Pitt J. I, Samson R. A, Thrane U, eds). Springer. 571: 3 – 31.
8. Frisvad, J. C. and Samson, R. A. (2004). Polyphasic taxonomy of Penicillium subgenus Penicillium. A guide to identification of food and air-borne terverticillate Penicillia and their mycotoxins. Studies in
Mycology. 49: 1-174. 9. Magnoli, C. E., Astoreca, A. L., Chiacchiera, S. M., Dalcero, A. M. (2007). Occurrence of ochratoxin A
and ochratoxigenic mycoflora in corn and corn based foods and feeds in some South American countries. Mycopathologia. 163: 249–260.
10. Ostry, V., Malir, F., Toman, J., Grosse, Y. (2017). Mycotoxins as human carcinogens - the IARC Monographs classification. Mycotoxin Research. 33 (1): 65–73.
11. Pitt, J. I., Wild, C. P., Baan, R. A., Gelderblom, W. C. A., Miller, J. D., Riley, R. T. and Wu, F. (2012). IARC Scientific Publication No. 158: Improving public health through mycotoxin control. International
Agency for Research on Cancer. 1-30. 12. Sweeney, M. J., Dobson, A. D. W. (1998). Mycotoxin production by Aspergillus, Fusarium and
Penicillium species. International Journal of Food Microbiology. 43: 141–158. 13. Cabañes, F. J., Bragulat, M. R. and Castellá, G. (2010). Ochratoxin A producing species in the genus
Penicillium. Toxins (Basel). 2 (5): 1111–1120. 14. Xu, B. J., Jia, X. Q., Gu, L. J., Sung, C. K. (2006) Review on the qualitative and quantitative analysis of
the mycotoxin citrinin. Food Control. 17: 271 – 285. 15. Khosravi, A. R., Sheikhkarami, M., Shokri, H., Sabokbar, A. (2012) Genetic variability of citrinin
producing Penicillium citrinum strains as occupational health hazards in Northern Iran. Archives of
Industrial Hygiene and Toxicology. 63: 489 – 496. 16. Placinta, C. M., D'Mello, J. P. F., Macdonald, A. M. C. (1999). A review of worldwide contamination of
cereal grains and animal feed with Fusarium mycotoxins. Animal Feed Science and Technology. 78, 1 – 2: 21 – 38.
104
17. Proctor, R. H., Desjardins A. E. and Moretti, A. (2010). Biological and chemical complexity of Fusarium
proliferatum. In: The role of plant pathology in food safety and food security, Plant pathology in the 21st century 3, (Strange, R. N. and Gullino, M. L. eds.). Springer Science+Business Media B. V. 97-111.
18. Richard J. L. (2007). Some major mycotoxins and their mycotoxicoses – An overview. International
Journal of Food Microbiology. 119: 3–10. 19. Samson, R. A., Visagie, C. M., Houbraken, J., Hong, S. B., Hubka, V., Klaassen, C. H., Perrone, G.,
Seifert, K. A., Susca, A., Tanney, J. B., Varga, J., Kocsube, S., Szigeti, G., Yaguchi, T. and Frisvad, J. C. (2014). Phylogeny, identification and nomenclature of the genus Aspergillus. Studies in Mycology. 78: 141 – 173.
20. Pitt, J. I., Hocking, A. D. (2009). Fungi and food spoilage. Springer.
21. Houbraken, J., J.C. Frisvad J. C., and Samson, R. A. (2011). Taxonomy of Penicillium section Citrina. Studies in Mycology. 70: 53–138.
22. Moretti, A. (2009). Proc. Nat. Sci, Matica Srpska Novi Sad. 117:7-13. 23. Geiser, D. M., Klich, M. A., Frisvad, J. C., Peterson, S. W., Varga, J. and Samson, R. A. (2007). The
current status of species recognition and identification in Aspergillus. Studies in Mycology. 59: 1-10. 24. Semple, R. L., Frio, A. S., Hicks, P.A., and Lozare, J.V. (1991). Mycotoxin prevention and control in
foodgrains. A collaborative publication of the UNDP/FAO Regional Network Inter-Country Cooperation on Preharvest Technology and Quality Control of Foodgrains (REGNET) and the ASEAN Grain Postharvest Programme.
25. Schoch, C. L., Seifert, K. A., Huhndorf, S., et al. (2012). Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America. 109: 6241–6246 26. Peterson, S. W., Varga, J., Frisvad, J. C., et al. (2008). Phylogeny and subgeneric taxonomy of Aspergillus.
In: Aspergillus in the genomic era (Varga, J., Samson R. A., eds). Wageningen Academic Publishers,
Wageningen. 33–56. 27. Visagie, C. M., Varga, J., Houbraken, J., et al. (2014b). Ochratoxin production and taxonomy of the yellow
aspergilli (Aspergillus section Circumdati). Studies in Mycology. 78: 1–61. 28. Visagie, C. M., Houbraken, J., Frisvad, J. C., Hong, S. B., Klaassen C. H. W., Perrone, G., Seifert, K. A.,
Varga, J., Yaguchi, T. and Samson, R. A. (2014). Identification and nomenclature of the genus Penicillium. Studies in Mycology. 78: 343–371.
29. Frisvad, J. C., Andersen, B., Thrane, U. (2008). The use of secondary metabolite profiling in chemotaxonomy of filamentous fungi. Mycological Research. 112 (Pt 2): 231-40.
30. Leslie, J. F. and Summerell, B. A. (2006). The Fusarium laboratory manual. Blackwell Publishing. 31. Geiser, D.M., Jimenez-Gasco, M., Kang, S., Makalowska, I., Veeraraghavan, N., 2,3, Ward, T. Zhang, N.,
Kuldau, G. A., O'Donnell, K. (2004). FUSARIUM-ID v. 1.0: A DNA sequence database for identifying Fusarium. European Journal of Plant Pathology. 110: 473–479.
32. Pitt, J. I. (2009). Toxigenic fungi: which are important? Medical Mycology. 38, Supplement 1: 17-22. 33. Bennet, J. W. and Klich, M. (2003). Mycotoxins. Clinical microbiology reviews. 497–516. 34. Wilson, D. M., Mubatanhema, W. and Jurjevic Z. (2002). Biology and ecology of Mycotoxigenic
Aspergillus species as related to economic and health concerns. Advances in Experimental Medicine and
Biology. 3-18. 35. IARC International Agency for Research on Cancer. (2012). Chemical agents and related occupations: A
review of human carcinogens. Lyon (France): IARC Scientific Publications; Vol. 100F. p. 225–248. 36. Luo, Y., Liu, X., Li, J. (2018). Updating techniques on controlling mycotoxins - A review. Food Control.
89: 123-132. 37. Doughary, J. H. (2015). The occurrence, properties and significance of citrinin mycotoxin. Journal of Plant
Pathology & Microbiology. 6:11. 38. European Commission Regulation (EC) No 1884/2006 of 19. December 2006. Setting maximum levels for
certain contaminants in foodstuffs. Text with EEA relevance. OJ L 364, 20.12.2006, p: 5). 39. Atanda, S. A., Pessu, P. O., Agoda S., Isong I. U., Adekalu O. A., Echendu M. A. and Falade T. C. (2011).
Fungi and mycotoxins in stored foods. African Journal of Microbiology Research. 5 (25): 4373-4382. 40. Magan, N., Olsen, M. (2004). (eds) Mycotoxins in Food: Detection and control. Woodhead Publishing.
174-196.
105
41. Milani, J. M. (2013). Ecological conditions affecting mycotoxin production in cereals: a review. Veterinarni Medicina. 58 (8): 405–411.
42. Cotty, P. J. and Jaime-Garcia, R. (2007). Influences of climate on aflatoxin producing fungi and aflatoxin contamination. International Journal of Food Microbiology. 119: 109–115.
43. Ji, Y., Zhu, K., Qian, H. and Zhou, H. (2007). Effect of water activity and temperature on growth of Penicillium citreoviride and Penicillium citrinum on MiGao (rice cake). Canadian Journal of
Microbiology. 53(2): 231-236.
44. Popovski, C. and Celar, F. A. (2012). The impact of environmental factors on the infection of cereals with Fusarium species and mycotoxin production – a review. Acta agriculturae Slovenica. 101 (1): 105 – 116.
45. Nazari, L., Pattori, E., Terzi, V., Morcia, C., Rossi, V. (2014). Influence of temperature on infection, growth, and mycotoxin production by Fusarium langsethiae and F. sporotrichioides in durum wheat. Food
Microbiology. 39: 19-26.
46. Yumangulova, G. M., Semenov, E. I., Potekhina, R. M., Mukminov, M. N., Shuralev, E. A. (2017). Effect of abiotic stressors on T-2-producing environmental isolates of Fusarium sporotrichioides. Journal of
Pharmacy Research. 11 (10). 47. Thompson, D. P., Metevia, L. and Vessel, T. (1993). Influence of pH alone and in combination with
phenolic antioxidants on growth and germination of mycotoxigenic Species of Fusarium and Penicillium. Journal of Food Protection. 56 (2): 134-138.
48. Abbas, H. K., Zablotowicz, R. M., Weaver, M. A., Shier, W. T., Bruns, H. A., Bellaloui, Abel, C. A. (2013). Implications of Bt traits on mycotoxin contamination in maize: overview and recent experimental results in Southern United States. Journal of agricultural and food chemistry, 61(48), 11759-11770.
49. Alkadri, D., Nipoti, P., Döll, K., Karlovsky, P., Prodi, A., & Pisi, A. (2013). Study of fungal colonization of wheat kernels in Syria with a focus on Fusarium species. International Journal of Molecular
Sciences, 14(3), 5938-5951. 50. Almeida, Á. M. R., Saraiva, O. F., Farias, J. R. B., Gaudêncio, C. A., & Torres, E. (2001). Survival of
pathogens on soybean debris under no-tillage and conventional tillage systems. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, 36(10), 1231-1238. 51. Amini, M., Safaie, N., Salmani, M. J., & Shams-Bakhsh, M. (2012). Antifungal activity of three medicinal
plant essential oils against some phytopathogenic fungi. Trakia J Sci, 10(1), 1-8. 52. Bajpai, V. K. (2012). In Vitro and In Vivo Inhibition of Plant Pathogenic Fungi by Essential Oil and
Extracts of Magnolia liliflora Desr. Journal of agricultural science and technology, 14(4), 845-856. 53. Bakkali, F., Averbeck, S., Averbeck, D., & Idaomar, M. (2008). Biological effects of essential oils–a
review. Food and chemical toxicology, 46(2), 446-475. 54. Baliukonienė, V., Bakutis, B., Januškevičienė, G., & Mišeikienė, R. (2011). Fungal contamination and
Fusarium mycotoxins in cereals grown in differenttillage systems. Journal of Animal and Feed
Sciences, 663, 127. 55. Beti, J. A., Phillips, T. W., & Smalley, E. B. (1995). Effects of maize weevils (Coleoptera: Curculionidae)
on production of aflatoxin B1 by Aspergillus flavus in stored corn. Journal of Economic
Entomology, 88(6), 1776-1782. 56. Bodroža Solarov, M. (2002). Grain Storages in Serbia, Žitozajednica doo Beograd. I Conference
“Technology of Grain Storages”, Kopaonik, Serbia. 57. Brooker, D. B., Bakker-Arkema, F. W., & Hall, C. W. (1992). Drying and storage of grains and oilseeds.
Springer Science & Business Media. 58. Channaiah L. (2011). Mycotoxin. World-Grain.com. http://www.world-grain.com. 59. Channaiah, L. H., & Maiyer, D. E. (2014). Best stored maize management practices for the prevention of
mycotoxin contamination. Mycotoxin Reduction in Grain Chains, 78. 60. Chongo, G., Gossen, B. D., Kutcher, H. R., Gilbert, J., Turkington, T. K., Fernandez, M. R., & McLaren,
D. (2001). Reaction of seedling roots of 14 crop species to Fusarium graminearum from wheat heads. Canadian Journal of Plant Pathology, 23(2), 132-137.
61. Christensen, C. M., & Kaufmann, H. H. (1969). Grain storage: The role of fungi in quality loss. U of Minnesota Press.
106
62. Christensen, C. M., & Kaufmann, H. H. (1974). Microflora. CHRISTENSEN, CM Storage of cereal grain
and their products. St. Paul: American Association of Cereal Chemists, 158-192. 63. Ĉizmić, I. (2003). Bolesti koje se prenose sjemenom pšenice. Glasilo biljne zaštite, 5, 307-315. 64. Collins, D.A. (2012) A review on the factors affecting mite growth in stored grain commodities.
Experimental and Applied Acarology, 56, 191-208. 65. Ćosi, J. (2002). Taxonomy of Fusarium species isolated from cultivated plants, weeds and their
pathogenicity for wheat. Poljoprivreda (Osijek). 66. Cosic, J., Jurkovic, D., Vrandecic, K., & Šimicр, B. (2006). Occurence of Fusarium species isolated from
winter wheat and barley grains in Croatia. In Proceedings of the 9th International Working Conference on
Stored Product Protection (pp. 123-127).
67. Ćosić, J., Vrandečić, K., Poštić, J., Jurković, D., & Ravlić, M. (2010). In vitro antifungal activity of essential oils on growth of phytopathogenic fungi. Poljoprivreda (Osijek), 16(2), 25-28.
68. Cotten, T. K., & Munkvold, G. P. (1998). Survival of Fusarium moniliforme, F. proliferatum, and F. subglutinans in maize stalk residue. Phytopathology, 88(6), 550-555.
69. Crane, J. M., Gibson, D. M., Vaughan, R. H., & Bergstrom, G. C. (2013). Iturin levels on wheat spikes linked to biological control of Fusarium head blight by Bacillus amyloliquefaciens. Phytopathology, 103(2), 146-155.
70. Dill-Macky, R., & Jones, R. K. (2000). The effect of previous crop residues and tillage on Fusarium head blight of wheat. Plant disease, 84(1), 71-76.
71. Doohan, F. M., Brennan, J., & Cooke, B. M. (2003). Influence of climatic factors on Fusarium species pathogenic to cereals. In Epidemiology of mycotoxin producing fungi (pp. 755-768). Springer, Dordrecht.
72. Dunkel, F. V. (1988). The relationship of insects to the deterioration of stored grain by fungi. International
Journal of Food Microbiology, 7(3), 227-244. 73. Duvnjak, T., Sudarić, A., Kočar, M. M., Ćosić, J., & Vrandečić, K. (2016). First report of soybean
Fusarium wilt caused by Fusarium graminearum in Croatia. Plant Disease, 100(3), 648. 74. Egorov,G.A., Melnikov, E.M., Maksimčuk,B.M. (1984).Tehnologija muki krupi i kombi kormov, Kolos,
Moskva. 75. Eugenio, C., De Las Casas, E., Harein, P. K., & Mirocha, C. J. (1970). Detection of the mycotoxin F-2 in
the confused flour beetle and the lesser mealworm. Journal of Economic Entomology, 63(2), 412-415. 76. Fernandez, M. R., Selles, F., Gehl, D., DePauw, R. M., & Zentner, R. P. (2005). Crop production factors
associated with Fusarium head blight in spring wheat in eastern Saskatchewan. Crop Science, 45(5), 1908-1916.
77. Ferrigo, D., Raiola, A., & Causin, R. (2016). Fusarium toxins in cereals: occurrence, legislation, factors promoting the appearance and their management. Molecules, 21(5), 627.
78. Fleurat-Lessard, F. (2017). Integrated management of the risks of stored grain spoilage by seedborne fungi and contamination by storage mould mycotoxins–An update. Journal of Stored Products Research, 71, 22-40.
79. Fleurat-Lessard, F., Fourar-Belaifa, R., & Bouznad, Z. (2010). Multivariate analysis of the temporal changes of fungal communities in unsafe storage conditions of some common wheat varieties in relation to relative humidity level and rice weevil infestation. Julius-Kühn-Archiv, (425), 518.
80. Gourdain, E., Piraux, F., & Barrier-Guillot, B. (2011). A model combining agronomic and weather factors to predict occurrence of deoxynivalenol in durum wheat kernels. World Mycotoxin Journal, 4(2), 129-139.
81. Hall, C. W. (1980). Drying and storage of agricultural crops. AVI Publishing Company Inc. 82. Harris, R. (2002). Progress with superficial mycoses using essential oils. International Journal of
Aromatherapy, 12(2), 83-91. 83. Hashem, M., Moharam, A. M., Zaied, A. A., & Saleh, F. E. M. (2010). Efficacy of essential oils in the
control of cumin root rot disease caused by Fusarium spp. Crop protection, 29(10), 1111-1117. 84. Heier, T., Jain, S. K., Kogel, K. H., & Pons‐Kühnemann, J. (2005). Influence of N‐fertilization and
fungicide strategies on Fusarium head blight severity and mycotoxin content in winter wheat. Journal of
Phytopathology, 153(9), 551-557. 85. Hooker, D. C., Schaafsma, A. W., & Tamburic-Ilincic, L. (2002). Using weather variables pre-and post-
heading to predict deoxynivalenol content in winter wheat. Plant Disease, 86(6), 611-619.
107
86. Huang, H. C., Kodama, F., Akashi, K., & Konno, K. (2002). Impact of Crop Rotation on Soilborne
Diseases and Yield of Kidney Bean: A case study in northern Japan. Plant Pathology Bulletin, 11(2), 87-96.
87. Hue, A. G., Voldeng, H. D., Savard, M. E., Fedak, G., Tian, X., & Hsiang, T. (2009). Biological control of fusarium head blight of wheat with Clonostachys rosea strain ACM941. Canadian Journal of Plant
Pathology, 31(2), 169-179. 88. Hyldgaard, M., Mygind, T., & Meyer, R. L. (2012). Essential oils in food preservation: mode of action,
synergies, and interactions with food matrix components. Frontiers in microbiology, 3, 12. 89. Inch, S. A., & Gilbert, J. (2003). Survival of Gibberella zeae in Fusarium-damaged wheat kernels. Plant
Disease, 87(3), 282-287. 90. Jochum, C. C., Osborne, L. E., & Yuen, G. Y. (2006). Fusarium head blight biological control with
Lysobacter enzymogenes strain C3. Biological Control, 39(3), 336-344.
91. Jordan, V. W., & Hutcheon, J. A. (2003). Influence of cultivation practices on arable crop diseases. Soil
Tillage in Agroecosystems, 187-206. 92. Jug, I., Jug, D., Sabo, M., Stipesevic, B., & Stosic, M. (2011). Winter wheat yield and yield components as
affected by soil tillage systems. Turkish journal of agriculture and forestry, 35(1), 1-7.
93. Kaaya, A. N., Warren, H. L., Kyamanywa, S., & Kyamuhangire, W. (2005). The effect of delayed harvest on moisture content, insect damage, moulds and aflatoxin contamination of maize in Mayuge district of Uganda. Journal of the Science of Food and Agriculture, 85(15), 2595-2599.
94. Khan, M. R., & Doohan, F. M. (2009). Bacterium-mediated control of Fusarium head blight disease of wheat and barley and associated mycotoxin contamination of grain. Biological control, 48(1), 42-47.
95. Klem, K., Vanova, M., Hajslova, J., Lancová, K., & Sehnalová, M. (2007). A neural network model for prediction of deoxynivalenol content in wheat grain based on weather data and preceding crop. Plant Soil
and Environment, 53(10), 421. 96. Kriss, A. B., Paul, P. A., Xu, X., Nicholson, P., Doohan, F. M., Hornok, L., ... & Madden, L. V. (2012).
Quantification of the relationship between the environment and Fusarium head blight, Fusarium pathogen density, and mycotoxins in winter wheat in Europe. European journal of plant pathology, 133(4), 975-993.
97. Krnjaja, V., Mandić, V., Lević, J., Stanković, S., Petrović, T., Vasić, T., & Obradović, A. (2015). Influence of N-fertilization on Fusarium head blight and mycotoxin levels in winter wheat. Crop protection, 67, 251-256.
98. Landschoot, S., Waegeman, W., Audenaert, K., Vandepitte, J., Baetens, J. M., De Baets, B., & Haesaert, G. (2012). An empirical analysis of explanatory variables affecting Fusarium head blight infection and deoxynivalenol content in wheat. Journal of Plant Pathology, 94(1), 135-147.
99. Lemmens, M., Haim, K., Lew, H., & Ruckenbauer, P. (2004). The effect of nitrogen fertilization on Fusarium head blight development and deoxynivalenol contamination in wheat. Journal of
Phytopathology, 152(1), 1-8. 100. Leonard, K. J., & Bushnell, W. R. (2003). Fusarium head blight of wheat and barley. American
Phytopathological Society (APS Press). 101. Lindblad, M., Börjesson, T., Hietaniemi, V., & Elen, O. (2012). Statistical analysis of agronomical factors
and weather conditions influencing deoxynivalenol levels in oats in Scandinavia. Food additives &
contaminants: Part A, 29(10), 1566-1571. 102. Lori,G. A., Sisterna, M. N., Sarandon, S. J., Rizzo I., Chidichimo, H. (2009). Fusarium head blight in
wheat: impact of tillage and other agronomic practices under natural infection. Crop Protection 28: 495–502.
103. Marburger, D. A., Venkateshwaran, M., Conley, S. P., Esker, P. D., Lauer, J. G., & Ané, J. M. (2015). Crop rotation and management effect on Fusarium spp. populations. Crop Science, 55(1), 365-376.
104. Medina, A., Schmidt-Heydt, M., Cárdenas-Chávez, D. L., Parra, R., Geisen, R., & Magan, N. (2013). Integrating toxin gene expression, growth and fumonisin B1 and B2 production by a strain of Fusarium verticillioides under different environmental factors. Journal of the Royal Society Interface, 10(85), 20130320.
105. Miller, J. D. (1995). Fungi and mycotoxins in grain: implications for stored product research. Journal of
Stored Products Research, 31(1), 1-16.
108
106. Miller, J. D. (2001). Factors that affect the occurrence of fumonisin. Environmental Health
Perspectives, 109 (Suppl 2), 321. 107. Mills, J. T. (1989). Spoilage and heating of stored agricultural products. Prevention, detection and control.
Minister of Supply and Services. 108. Moschini, R. C., & Fortugno, C. (1996). Predicting wheat head blight incidence using models based on
meteorological factors in Pergamino, Argentina. European Journal of Plant Pathology, 102(3), 211-218. 109. Munkvold, G. P. (2003). Cultural and genetic approaches to managing mycotoxins in maize. Annual review
of phytopathology, 41(1), 99-116. 110. Munkvold, G. P. (2014). Crop management practices to minimize the risk of mycotoxins contamination in
temperate-zone maize. Mycotoxin Reduction in Grain Chains, 59-75. 111. Neme, K., & Mohammed, A. (2017). Mycotoxin occurrence in grains and the role of postharvest
management as a mitigation strategies. A review. Food Control, 78, 412-425. 112. Nguefack, J., Leth, V., Zollo, P. A., & Mathur, S. B. (2004). Evaluation of five essential oils from aromatic
plants of Cameroon for controlling food spoilage and mycotoxin producing fungi. International Journal of
Food Microbiology, 94(3), 329-334. 113. Novak, A. (2012). karakterizacija patotipova gljivice Passalora fulva (Cooke) U. Braun&Crous uzročnika
baršunaste plijesni lista rajčice u hrvatskoj. Poljoprivreda, 18(2), 65-66.
114. Olsen, M., Jonsson, N., Magen, N., Banks, J., Fanelli, C., Rizzo, A., ... & Olkku, J. (2004). Prevention of ochratoxin A in cereals (OTAPREV). Final report of Project No. QLK1-CT-1999-00433 Quality of Life
and Management of Living Resources. 115. Palazzini, J. M., Alberione, E., Torres, A., Donat, C., Köhl, J., & Chulze, S. (2016). Biological control of
Fusarium graminearum sensu stricto, causal agent of Fusarium head blight of wheat, using formulated antagonists under field conditions in Argentina. Biological control, 94, 56-61.
116. Palazzini, J. M., Yerkovich, N., Alberione, E., Chiotta, M., & Chulze, S. N. (2017). An integrated dual strategy to control Fusarium graminearum sensu stricto by the biocontrol agent Streptomyces sp. RC 87B under field conditions. Plant Gene, 9, 13-18.
117. Pande N., Mehrotra B.S. (1988): Rice weevil (Sitophilus oryzae Linn.): vector for toxigenic fungi. National Academy Science Letters. 11(1): 3-4
118. Pelhate, J. (1988). Ecology of the microflora of grains and seeds. Multon, J.L. (Ed.), Preservation and storage of grain seeds and their by-products. Lavoisier publishing Inc., New York, pp. 244-262.
119. Perez-Brandán, C., Arzeno, J. L., Huidobro, J., Grümberg, B., Conforto, C., Hilton, S., ... & Vargas-Gil, S. (2012). Long-term effect of tillage systems on soil microbiological, chemical and physical parameters and the incidence of charcoal rot by Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid in soybean. Crop protection, 40, 73-82.
120. Petcu, G., & Ionia, S. (1998). Influence of crop rotation on weed infestion and Fusarium spp. attack, yield and quality of winter wheat. Rom Agric Res, 9(10), 83-91.
121. Postic, J., Cosic, J., Vrandecic, K., Jurkovic, D., Saleh, A. A., & Leslie, J. F. (2012). Diversity of Fusarium species isolated from weeds and plant debris in Croatia. Journal of phytopathology, 160(2), 76-81.
122. Prandini, A., Sigolo, S., Filippi, L. A. U. R. A., Battilani, P., & Piva, G. I. A. N. F. R. A. N. C. O. (2009). Review of predictive models for Fusarium head blight and related mycotoxin contamination in wheat. Food
and Chemical Toxicology, 47(5), 927-931. 123. Roberts, D. W., & Yendol, W. G. (1971). Use of fungi for microbial control of insects. Burges, HD
Microbial control of insects & mites. New York, NY, pp. 125-149. 124. Ruckenbauer, P., Buerstmayr, H., Lemmens, M. (2000): Present strategies in resistance breeding against
scab (Fusarium spp.). Abstracts, 29, 6th International Wheat Conference, Budapest, Hungary. 125. Scala, V., Aureli, G., Cesarano, G., Incerti, G., Fanelli, C., Scala, F., ... & Bonanomi, G. (2016). Climate,
Soil management, and cultivar affect Fusarium head blight incidence and deoxynivalenol accumulation in durum wheat of Southern Italy. Frontiers in
microbiology, 7, 1014. 126. Schaafsma, A. W., Ilinic, L. T., Miller, J. D., & Hooker, D. C. (2001). Agronomic considerations for
reducing deoxynivalenol in wheat grain. Canadian Journal of Plant Pathology, 23(3), 279-285. 127. Schmidt-Heydt, M., Parra, R., Geisen, R., Magan, N. (2011): Modelling the relationship between
environmental factors, transcriptional genes and deoxynivalenol mycotoxin production by strains of two Fusarium species. J. R. Soc. Interface, 8:117–126.
109
128. Seherm, H., & Coakley, S. M. (2003). Plant pathogens in a changing world. Australasian Plant
Pathology, 32(2), 157-165. 129. Sinha, R. N. (1984). Effects of weevil (Coleoptera: Curculionidae) infestation on abiotic and biotic quality
of stored wheat. Journal of economic entomology, 77(6), 1483-1488. 130. Sinha, R.N. (1979) Ecology of microflora in stored grain. Annales of Technical Agriculture, 28: 191-209. 131. Smrž, J., Čatská, V. (1989) The effect of the consumption of some soil fungi on the internal microanatomy
of the mite Tyrophagus putrescentiae (Schrank) (Acari, Acaridida). Acta Universitatis. Carolinae, Biology, 33, 81-93.
132. Stejskal, V., Aulicky, R., Kucerova, Z. (2014) Pest Control Strategies and Damage Potential of Seed-Infesting Pests in the Czech Stores – a Review. Plant Protection Science, 50(4), 165-173.
133. Sumalan, R. M., Alexa, E., & Poiana, M. A. (2013). Assessment of inhibitory potential of essential oils on natural mycoflora and Fusarium mycotoxins production in wheat. Chemistry Central Journal, 7(1), 32.
134. Sweeney, M. J., & Dobson, A. D. (1998). Mycotoxin production by Aspergillus, Fusarium and Penicillium species. International journal of food microbiology, 43(3), 141-158.
135. Tillmann, M., von Tiedemann, A., & Winter, M. (2017). Crop rotation effects on incidence and diversity of Fusarium species colonizing stem bases and grains of winter wheat. Journal of Plant Diseases and
Protection, 124(2), 121-130. 136. Van der Burgt, G.J.H.M., Timmermans, B.G.H., Scholberg, J.M.S. and Osman A.M. (2011). Fusarium
head blight and deoxynivalenol contamination in wheat as affected by nitrogen fertilization NJAS – Wageningen. Journal of Life Sciences. 58 (3–4) :123–129.
137. Van Wyk, J. H., Hodson, A. C., & Christensen, C. M. (1959). Microflora associated with the confused flour beetle, Tribolium confusum. Annals of the Entomological Society of America, 52(4), 452-463.
138. Vanova, M., Klem, K., Misa, P., Matusinsky, P., Hajslova, J., & Lancova, K. (2008). The content of Fusarium mycotoxins, grain yield and quality of winter wheat
cultivars under organic and conventional cropping systems. Plant Soil Environ, 54(9), 395-402. 139. Vrandečić, K., Jug, D., Ćosić, J., Stošić, M., Ilić, J. (2013.): The impact of tillage and fertilization on wheat
grain infection. Book of proceedings. 2nd International Scientific Conference. Soil and crop management: adaptation and mitigation of climate change. 296-301.Osijek, Croatia.
140. Wicklow, D. T. (1995). The mycology of stored grain: an ecological perspective. Stored grain ecosystems, 197-249.
141. World Health Organization. (2012). Prevention and reduction of food and feed contamination. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO).
142. Wright, V. F. (1980). interactions of stored product insects with storage fungi of the genus penicillium, with emphasis on secondary metabolites.
143. Xu, X. M., Nicholson, P., Thomsett, M. A., Simpson, D., Cooke, B. M., Doohan, F. M., ... & Hornok, L. (2008). Relationship between the fungal complex causing Fusarium head blight of wheat and environmental conditions. Phytopathology, 98(1), 69-78.
144. Žeželj, M. (1989). Tehnologija skladištenja žita, Beograd. 145. Žeželj, M. (1995). Tehnologija žita i brašna, Tehnološki fakultet Novi Sad.
146. Abrunhosa L, Santos L, Venancio A. Degradation of ochratoxin-A by proteases and crude enzyme extract of Aspergillus niger. Food Biotechnol. 2006:20:231-236
147. Abrunhosa L., Serra R., Venancio A. Biodegradation of ochratoxin A by fungi isolated from grapes. J. Agric. Food Chem. 2002; 50:7493–7496.
148. Aiko V, Edamana P, Mehta A (2016) Decomposition and detoxification of aflatoxin B1 by lactic acid. J Sci Food Agric 96:1959–1966.
149. Alexa Ersilia, 2008, Contaminanţi în produse horticole și cerealiere, Editura Solness, Timişoara, ISBN 978-973-729-152-3, 326 pp.
150. Aly, S. E. (2002), Distribution of aflatoxins in product and by‐products during glucose production from contaminated corn. Nahrung, 46: 341-344.
151. Avantaggiato G., Solfrizzo M., Visconti A. (2005). Recent advances on the use of adsorbent materials for detoxifi cation of Fusarium mycotoxins. Food Additives and Contaminants Part A 22, 379-388.
110
152. Benigni A. Temba, YasminaSultanbawa, Darren J. Kriticos, Glen P. Fox, Jagger J. W. Harvey, and Mary T.
Fletcher, Tools for Defusing a Major Global Food and Feed Safety Risk: Nonbiological Postharvest Procedures To Decontaminate Mycotoxins in Foods and Feeds, Journal of Agricultural and Food
Chemistry 2016 64 (47), 8959-8972, DOI: 10.1021/acs.jafc.6b03777 153. Bosch ten Lars, Katharina Pfohl, Georg Avramidis ,Stephan Wieneke,Wolfgang Viöl and Petr Karlovsky.,
Plasma-Based Degradation of Mycotoxins Produced by Fusarium, Aspergillus and Alternaria Species, Toxins 2017, 9, 97, 168-179.
154. Boudra H, Bars PL, Bars JL (1995) Thermostability of Ochratoxina in wheat under two moisture conditions. Appl Environ Microbiol 61: 1156–1158
155. Bozollu F., Different mycotoxin inactivation applications and their inactivation mechanisms. Proc Nat Sci, Matica Srpska Novi Sad, 117:27-35, 2009.
156. Brown RL, Cotty PJ, Cleveland TE. Reduction in aflatoxin content of maize by atoxigenic strains of Aspergillus flavus. J Food Prot. 1991:54:623-626.
157. Bullerman, L. B.; Bianchini, A. Stability of mycotoxins during food processing. Int. J. Food Microbiol. 2007, 119, 140−146.
158. Chulze SN., Strategies to reduce mycotoxin levels in maize during storage: a review. Food Add Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess, 27(5):651-657, 2010.
159. Čvek D, Markov K, Frece J, Friganović M, Duraković L, Delaš F. Adhesion of zearalenone to the surface of lactic acid bacteria cells. Hrvat čas za prehrambenu tehnol biotehnol nutr. 2012;7:49–52.
160. Dalié DKD, Deschamps AM, Richard-Forget F. Lactic acid bacteria—potential for control of mould
growth and mycotoxins: a review. Food Control. 2010;21:370–380. 161. De La Campa, R.; Miller, J. D.; Hendricks, K. Fumonisin in tortillas produced in small-scale facilities and
effect of traditional masa production methods on this mycotoxin. J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 4432−4437.
162. De Mello, F. R.; Scussel, V. M. Development of physical and optical methods for in-shell Brazil nuts sorting and aflatoxin reduction. J. Agric. Sci. 2009, 3,3
163. Doyle MP, Applebaum RS, Brackett RE, Marth EH (1982) Physical, chemical and biological degradation of mycotoxins in foods and agricultural commodities. J Food Prot 45:964–971
164. El-Nezami H, Polychronaki N, Salminen S, Mykkänen H. Binding rather than metabolism may explain the interaction of two food-grade Lactobacillus strains with zearalenone and its derivative α-zearalenol. Appl Environ Microbiol. 2002:68:3545-3549.
165. Emetco B.V. Method for de-activating mycotoxin. EP0450721B1 (1995). 166. Fandohan, P., Gnonlonfin, B., Hell, K., Marasas, W. F. O., &Wingfield, M. J. (2005).Natural occurrence of
Fusarium and subsequent fumonisin contamination in preharvest and stored maize in Benin, West Africa. International Journal of Food Microbiology, 99, 173–183.
167. Frayssinet, C.; Lafarge-Frayssinet, C. Effect of ammoniation on the carcinogenicity of aflatoxin-contaminated groundnut oil cakes:long-term feeding study in the rat. Food Addit. Contam. 1990, 7, 63−68.
168. Ghanem I, Orfi M, Shamma M (2008) Effect of gamma radiation on the inactivation of aflatoxin B1 in food and feed crops. Braz J Microbiol 39:787–791
169. Grunkemeier A. UntersuchungenzurBeeinflussung der Ruckstandsbildung von Ochratoxin A beimSchweindurch den diatetischenEinsatz von Adsorbentien. PhD thesis, University of Munich, Germany. 1990.
170. Guerre P., Interet des traitements des matieres premieres et de l`usage d`adsorbants lors d`une contamination des aliments du betail par des mycotoxins. Revue Med Vet 151(12):1095-1106, 2000.
171. Hahn I, Nagl V, Schwartz-Zimmermann HE, Varga E, Schwarz C, Slavik V, Reisinger N, Malachová A, Cirlini M, Generotti S, Dall’Asta C, Mycotoxin Res (2016) 32:179–205
172. Halasz A, Lasztity R, Abony T, Bata A. Decontamination of mycotoxin-contaminating food and feed by biodegradation. Food Rev Int. 2009:25:284-298.
173. Hale, O. M.; Wilson, D. M. Performance of pigs on diet containing heated or unheated corn with or without aflatoxin. J. Anim. Sci. 1979, 48, 1394−1400.
174. Haschek WM, Motelin G, Ness DK, Harlin KS, Hall WF, Vesonder RF, Peterson RE, Beasley VR. Characterization of fumonisin toxicity in orally and intravenously dosed swine. Mycopathologia. 1992:117:83-96.
111
175. Hell, K.; Mutegi, C. Aflatoxin control and prevention strategies in key crops of Sub-Saharan Africa. Afr. J.
Microbiol. Res. 2011, 5, 459− 466. 176. Herzallah S, Al Shawabkeh K, Al Fataftah A (2008) Aflatoxin decontamination of artificially contaminated
feeds by sunlight, g-radiation, and microwave heating. J ApplPoult Res 17:515–521 177. Hua SST, Baker JL, Flores-Espiritu M. Interactions of saprophytic yeasts with a non-mutant of
Aspergillusflavus. Appl Environ Microbiol. 1999:65:2738-2740. 178. Jabusch, T. W.; Tjeerdema, R. S. Photodegradation of Penoxsulam.J. Agric. Food Chem. 2006, 54,
5958−5961. 179. Jard, G.; Liboz, T.; Mathieu, F.; Guyonvarc’h, A.; Lebrihi, A. Review of mycotoxin reduction in food and
feed: from prevention in the field to detoxification by adsorption or transformation. Food Addit.Contam., Part A 2011, 28, 1590−1609.
180. Karlovsky P, Suman M, Berthiller F, et al. Impact of food processing and detoxification treatments on mycotoxin contamination. Mycotoxin Res. 2016; 32(4):179-205.
181. Karlovsky Petr, Suman Michele, Berthiller Franz, De Meester Johan, Eisenbrand Gerhard, Perrin Irène, Oswald Isabelle P., Speijers Gerrit, Chiodini Alessandro, Recker Tobias, Dussort Pierre, Impact of food processing and detoxification treatments on mycotoxin contamination, Mycotoxin Res (2016) 32:179–205.
182. Kolosova A., Stroka J. (2011). Substances for reduction of the contamination of feed by mycotoxins: a review. World Mycotoxin Journal 4, 225-256.
183. Król, A., Pomastowski, P., Rafińska, K., Railean-Plugaru, V., Walczak, J., & Buszewski, B. (2017). Microbiology neutralization of zearalenone using Lactococcus lactis and Bifidobacterium sp. Analytical
and bioanalytical chemistry, 410(3), 943-952. 184. Magan N, Aldred D, Mylona K, Lambert RJ., Limiting mycotoxins in stored wheat - a review. Food Addit
Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess 27(5):644-650, 2010. 185. Magan N, Aldred D., Post-harvest control strategies: Minimizing mycotoxins in the food chain. Int J Food
Microbiol 119:131-139, 2007. 186. MaganNaresh, Aldred David., Post-harvest control strategies: minimizing mycotoxins in thefood chain.
Mycotoxins from the Field to the Table, International Journal of Food Microbiology, Volume 119, Issues 1-2, 2007, Pages 131-139.
187. Martinez, A. J.; Weng, C. Y.; Park, D. L. Distribution ofammonia/aflatoxin reaction products in corn following exposure toammonia decontamination procedure. Food Addit. Contam. 1994, 11, 659−667.
188. Mutiga, S. K.; Were, V.; Hoffmann, V.; Harvey, J. W.; Milgroom, M. G.; Nelson, R. J. Extent and drivers of mycotoxin contamination: inferences from a survey of Kenyan maize mills. Phytopathology 2014, 104, 1221−1231.
189. Mutungi, C.; Lamuka, P.; Arimi, S.; Gathumbi, J.; Onyango, C.The fate of aflatoxins during processing of maize into muthokoi − a traditional Kenyan food.Food Control 2008, 19, 714−721.
190. Niderkorn V, Boudra H, Morgavi DP. Binding of Fusariummycotoxins by fermentative bacteria in vitro. J ApplMicrobiol. 2006:101:849-856.
191. Niderkorn V, Boudra H, Morgavi DP. Binding of Fusariummycotoxins by fermentative bacteria in vitro. J ApplMicrobiol. 2006:101:849-856.
192. Park, D. L. Perspectives on mycotoxin decontamination procedures. Food Addit. Contam. 1993, 10, 49−60. 193. Park, D. L. Perspectives on mycotoxin decontaminationprocedures. Food Addit. Contam. 1993, 10, 49−60. 194. Pearson, T. C.; Wicklow, D. T.; Pasikatan, M. C. Reduction of aflatoxin and fumonisin contamination in
yellow corn by high-speed dual-wavelength sorting.Cereal Chem. 2004, 81, 490−498. 195. Pereira P, Nesci A, Castillo C, Etcheverry M. Impact of bacterial biological control agents on fumonisin B1
content and Fusariumverticillioides infection of field-grown maize. Biological Control. 2010: (in press, doi:10.1016/j.biocontrol.2010.02.001).
196. Pereira P, Nesci A, Etcheverry M. Effects of biocontrol agents on Fusarium verticillioides count and fumonisin content in the maize agroecosystem: Impact on rhizospheric bacterial and fungal groups. Biological Control. 2007:42:281-287.
197. Perez-Flores, G. C.; Moreno-Martınez, E.; Mendez-Albores, A. Effect of microwave heating during alkaline-cooking of aflatoxin contaminated maize. J. Food Sci. 2011, 76, 48−52.
198. Reddy K.R.N., Farhana N.I., Salleh B. and Oliveira C.A.F., ( 2010) Current Research, Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology, A. Méndez-Vilas (Ed.), pp.1078-1085.
112
199. Reddy KRN, Salleh B, Saad B, Abbas HK, Abel CA, Sheir WT. An overview of mycotoxin contamination
in foods and its implications for human health. Toxin Rev. 2010:29:3-26. 200. Rustom, I. Y. S. Aflatoxin in food and feed: occurrence, legislation and inactivation by physical methods.
Food Chem. 1997, 59, 57−67 201. Schatzmayr G, Täubel M, Vekiru E, Moll M, Schatzmayr D, Binder EM, Krska, R, Loibner AP. 2006.
Detoxification of mycotoxins by biotransformation. In: The mycotoxin factbook. Edited by: Wageningen Academic Publisher, p. 363- 375.
202. Teniola OD, Addo PA, Brost IM, Farber P, Jany KD, Alberts JF, Vanzyl WH, Steyn PS, Holzapfel WH. Degradation of AFB1 by cell free extracts of Rhodococcus erythropolis and Mycobacterium fluoranthenivorans sp. Int J Food Microbiol. 2005:105:111-117.
203. Torres, P. I.; Guzman-Ortiz, M.; Ramirez-Wong, B. Revising the role of pH and thermal treatments in aflatoxin content reduction during the tortilla and deep frying process. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 2825−2829.
204. Trckova, M.; Matlova, L.; Dvorska, L.; Pavlik, I. Kaolin, Bentonite, and zeolites as feed supplements for animals: health advantages and risks. Vet. Med. (Praha) 2004, 49, 389−399.
205. Trenholm, H. L.; Charmley, L. L.; Prelusky, D. B.; Warner, R. M. Washing procedures using water or sodium carbonate solutions for the decontamination of three
cereals contaminated with deoxynivalenol and zearalenone. J. Agric. Food Chem. 1992, 40, 2147−2151. 206. Varga J., Péteri Z., Tábori K., Téren J., Vágvölgyi C. Degradation of ochratoxin A and other mycotoxins
by Rhizopus isolates. Int. J. Food Microbiol. 2005;99:321–328 207. Varga, J., Kocsubé, S., Péteri, Z., Vágvölgyi, C., & Tóth, B. (2010). Chemical, physical and biological
approaches to prevent ochratoxin induced toxicoses in humans and animals. Toxins, 2(7), 1718-50.
208. Vidal, A.; Morales, H.; Sanchis, V.; Ramos, A. J.; Marín, S., Stability of DON and OTA during the breadmaking process and determination of process and performance criteria. Food Control 2014, 40, 234−242.
209. Völkl A, Vogler B, Schollenberger M, Karlovsky P. 2004. Microbial detoxification of mycotoxindeoxynivalenol. J. Basic Microbiol. 44:147–156.
210. Wageha Awad. Decontamination and detoxification strategies for the Fusarium mycotoxin deoxynivalenol in animal feed and the effectiveness of microbial biodegradation. Food Additives and Contaminants, 2010, 27 (04), pp.510-520.
211. Weng CY, Martinez AJ, Park DL (1994) Efficacy and permanency of ammonia treatment in reducing aflatoxin levels in corn. Food AdditContam 11:649–658.
212. Yin Y, Yan L, Jiang J, Ma Z. Biological control of aflatoxin contamination of crops. J Zhejiang Univ Sci B. 2008:9:789-792.
213. Zhou T, He J, Gong J. 2008. Microbial transformation of trichothecenemycotoxins. World Mycotoxin J. 1:23-30.
214. Zhu, Y., Hassan, Y. I., Lepp, D., Shao, S., & Zhou, T. (2017). Strategies and Methodologies for Developing Microbial Detoxification Systems to Mitigate Mycotoxins. Toxins, 9(4), 130. doi:10.3390/toxins9040130.
215. Sancis V., Control de mycotoxinas emergentes, Rev. Iberoam Micot., 17, 69-75, 2000; 216. Alexa Ersilia, Daniela Mucete, I. Gergen, Nicoleta Hadaruga Mariana Poiana, Comparative study of TLC and
HPLC determination of ochratoxin A in wheat and food products of wheat, Procedings of the 12 th International Symposium on Instrumental Planar Chromatography - Budapesta, Ungaria, 236-241, 2004;
217. Alexa Ersilia, Contaminanti in produse cerealiere si horitcole, Ed. Eurobit, Timisoara, 2008 218. Alexa Ersilia, Tehnologii alimentare vegetale, Ed. Eurobit, Timisoara, 2008 219. Kabak Bulent, The fate of mycotoxins during thermal food processing, J Sci Food Agric 2009; 89: 549–554 220. Cenkowski S, Pronyk C, Zmidzinska D and Muir WE, Decontamination of food products with superheated
steam. J Food Eng 83:68–75 (2007). 221. Ryu D, Hanna MA, Eskridge KM and Bullerman LB, Heat stability of zearalenone in an aqueous buffered
model system. J Agric Food Chem 51:1746–1748 (2003). 222. Scott PM, Effects of food processing on mycotoxins. J Food Protect 47:489–499 (1984).
223. Inoue T1, Nagatomi Y, Uyama A, Mochizuki N., Fate of mycotoxins during beer brewing and
fermentation.Biosci Biotechnol Biochem. 2013;77(7):1410-5. Epub 2013 Jul 7.
113
224. XeniaPascariAntonio J.RamosSoniaMarínVicenteSanchísMycotoxins and beer. Impact of beer production
process on mycotoxin contamination. A review, Food Research International, Volume 103, January 2018,
Pages 121-129 225. M. Vaclavikova, A. Malachova, Z. Veprikova, Z. Dzuman, M. Zachariasova, J.Hajslova"Emerging"
mycotoxins in cereals processing chains: Changes of enniatins during beer and bread making, Food Chemistry, 136 (2) (2013), pp. 750-757
226. F.B. Campagnollo, L.T. Franco, G.E. Rottinghaus, E. Kobashigawa, D.R.Ledoux, A. Daković, C.A.F. OliveiraIn vitro evaluation of the ability of beer fermentation residue containing Saccharomyces cerevisiae to bind mycotoxins, Food Research International, 77 (2015), pp. 643-648
227. E. Belajová, D. Rauová, L. DaškoRetention of ochratoxin A and fumonisin B1 and B2 from beer on solid surfaces: Comparison of efficiency of adsorbents with different origin, European Food Research and Technology, 224 (3) (2007), pp. 301-308
228. P. Oliveira, B. Brosnan, F. Jacob, A. Furey, A. Coffey, E. Zannini, E.K. ArendtLactic acid bacteria bioprotection applied to the malting process. Part II: Substrate impact and mycotoxin reduction, Food Control, 51 (2015), pp. 444-452
229. Ryu Dojin, Bianchini Andreia, Bullerman Lloyd B, Effects of processing on mycotoxins, Stewart
Postharvest Review 2008, 6:5
230. Katta SK, Cagampang AE, Jackson LS and Bullerman LB. Distribution of Fusarium molds and fumonisins
in dry-milled corn fractions. Cereal Chemistry 1997: 74(6):858–863.
231. Park DL. Effect of processing on aflatoxin. Advances in Experimental Medicine and Biology 2002:
504:173–179.
232. Scott PM, Kanhere SR, Dexter JE, Brennan PW and Trenholm HL. Distribution of DON during the milling
of naturally contaminated hard red spring wheat and its fate in baked products. Food Additives and
Contaminants 1984: 1(4):313–323.
233. Alldrick AJ. The effects of processing on the occurrence of ochratoxin A in cereals. Food Additives and
Contaminants 1996: 13(Suppl. 27):27–28.
234. Park JW, Lee C and Kim YB. Fate of aflatoxin B1 during the cooking of Korean polished rice. Journal of
Food Protection 2005: 68(7):1431–1434.
235. Park JW and Kim YB. Effect of pressure cooking on aflatoxin B1 in rice. Journal of Agricultural and Food
Chemistry 2006: 54(6):2431–2435.
236. Scudamore KA, Banks J and MacDonald SJ. Fate of ochratoxin A in the processing of whole wheat grains
during milling and bread production. Food Additives and Contaminants 2003: 20(12):1153–1163.
237. Brera C, Debegnach F, Grossi S and Miraglia M. Effect of industrial processing on the distribution of
fumonisin B1 in dry milling corn fractions. Journal of Food Protection 2004: 67(6):1261–1266.
238. Polling SM, Plattner RD and Weisleder D. N-(1-Deoxy-D-fructos-1-yl) fumonisin B1, the initial reaction
product of fumonisin B1 and D-glucose. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2002: 50(5):1318–
1324.
239. Elias-Orozco R, Castellanos-Nava A, Gaytan-Martinez M, FigueroaCardenas JD and Loarca-Pina G.
Comparison of nixtamalization and extrusion processes for a reduction in aflatoxin content. Food additives
and contaminants 2002: 19(9):878–885.
240. Castells M, Marin S, Sanchis V and Ramos AJ. Reduction of aflatoxins by extrusion-cooking of rice meal.
Journal of Food Science 2006: 71 (7):c369–c377.
241. Scudamore KA, Banks JN and Guy RCE. Fate of ochratoxin A in the processing of whole wheat grain
during extrusion. Food Additives and Contaminants 2004: 21(5):488–497. 242. Bertuzzi, 2011, Food Control
114
243. Peng, J.L.M. Marchal, A.F.B. van der Poel, Strategies to prevent and reduce mycotoxins for compound feed manufacturing W.-X., Animal Feed Science and Technology, Volume 237, March 2018, Pages 129-153, 2018
244. . Commission of the European Communities, Brussels, White Paper on Food Safety , 2000 245. Froman B., Quality Manual, 1998 246. Mitonneau H., Initiation in Wuality Audit, 2000 247. Mortimore S., Wallace C., HACCP – a practical approach, 1994 248. Nediţa G., Guide for HACCP system implementation, 2003 249. Noye D., Practical Guide for Quality Control, 2000 250. Poll N., Fundamental hygiene notions, 2002 251. Rotaru G., Moraru C., HACCP – Risk Analysis.Critical Control Points, 1997 252. Sonneveld C., HACCP Guide, 1996 253. General food hygiene principles, Codex Alimentarius, 2003 254. Standard DS 3027/2002 - E
