1
Raport stiintific sintetic
privind implementarea proiectului cod: PN-II-RU-PD-2012-3 - 0282
Particule magnetice funcţionalizate cu potenţiale aplicaţii ca mijloc teranostic
pe toata perioada de executie pana in prezent (mai 2013-octombrie 2015)
( format .pdf)
1. Prezentarea succintă a proiectului
1.1. Stadiul actual al cercetărilor în domeniul particulelor magnetice funcționalizate cu potențiale
aplicații ca mijloc teranostic
Cancerul reprezintă o cauză majoră a mortalităţii *1+. Dintre toate tipurile de cancer, cancerul de sân
este cel mai frecvent diagnosticat și cel mai raspândit în rândul femeilor, reprezentând 23 % din totalul
cazurilor de cancer şi 14 % din numărul deceselor cauzate de cancer *2+. Tendinţele actuale cu privire la
studiul cancerului sunt îndreptate în continuare spre o cale de diagnosticare, dar, de asemenea, sunt
orientate şi asupra metodelor de tratament, motiv pentru care, o nouă clasă de nanoparticule magnetice
sunt îndelung studiate în acest domeniu, datorită potenţialului acestora de a fi folosite ca mijloc
"teranostic" *3+. Termenul "teranostic" se referă la o modalitate de a îmbina tehnici de diagnosticare, cu
metode terapeutice şi cu tehnici de imagistică medicală în vederea optimizării eficacităţii si a siguranţei
sistemelor terapeutice [4].
Datorită proprietăţilor fizice remarcabile combinate cu abilitatea de a fi ghidate în câmp magnetic şi de
a funcţiona la nivel celular şi molecular, nanoparticulele magnetice au o gamă largă de aplicaţii: sisteme de
eliberare controlată de medicamente, [5] hipertermie [6+ sau imagistica prin rezonanță magnetică (IRM)
[7]. Mai mult, datorită capacităţii lor de a fi funcţionalizate simultan cu diferiţi liganzi şi ghidate către zona
biologică de interes, nanoparticulele magnetice reprezintă un instrument adecvat ca mijloc teranostic [8].
Într-adevăr, funcţionalitatea magnetică poate fi dublu exploatată: atât pentru diagnostic cât şi pentru
tratament, nanoparticulele magnetice fiind utilizate în tehnici imagistice datorită faptului că măresc
contrastul imaginilor prin reducerea intensităţii semnalului [9].
Pentru a exploata pe deplin potenţialul particulelor magnetice ca mijloc teranostic, acestea ar trebui să
îndeplinească mai multe cerinţe: bio-şi hemo / compatibilitate, capacitate de circulaţie prelungită în fluxul
de sânge şi stabilitate [10+; dimensiune adecvată pentru administrare intravasculară (1000-2000 nm);
proprietăţi magnetice bune şi comportament superparamagnetic, eficienţă mare de încapsulare a
principiilor active şi capacitate de eliberare controlată a acestora precum şi abilităţi de functionalizare a
suprafaţei. Aceste particule "inteligente" au o structură complexă, fiind alcatuite din: 1) un miez magnetic
2
(care are rolul de a direcţiona particulele către zona biologică de interes precum şi a oferi oportunităţi de
vizualizare - imagistică moleculară); 2) un material de acoperire biocompatibil (care oferă stabilitate în
mediu fiziologic şi multi-funcţionalitate); 3) un agent terapeutic (adsorbit / găzduit în cavităţile interne ale
particulelor); şi 4) o componentă de recunoaştere a celulelor tumorale (reprezentată de un receptor
adecvat ataşat) *11].
Materialul magnetic cel mai des folosit în aplicaţiile biomedicale este reprezentat de oxidul de fier
(Fe3O4), cunoscut şi sub numele de magnetită, sau varianta sa oxidată, γ-Fe2O3 (maghemită) atât datorită
proprietăţilor magnetice excelente (magnetizare de saturație ridicată și comportament
superparamagnetic) care îi permit manipularea în câmp magnetic precum şi a biocompatibilităţii sale deja
demonstrate. Comportamentul superparamagnetic al particulelor se referă la faptul că acestea sunt uşor
magnetizabile când sunt supuse acţiunii unui câmp magnetic dar nu păstrează magnetizarea remanentă
după îndepărtarea acestuia. Această proprietate este foarte importantă, deoarece dacă particulele ar
prezenta magnetism remanent, acesta ar determina formarea inevitabilă de aglomerări ce pot duce în final
la ocluzia capilarelor.
Modificarea suprafeţei particulelor magnetice cu materiale polimerice naturale (chitosan, dextran,
gelatină) asigură stabilitate chimică şi proprietaţi biologice excelente, dar, de asemenea, oferă posibilități
de funcţionalizare cu molecule precum: proteine [8], peptide [12], sau moleculele mici [13]. Din categoria
liganzi-receptori, biotina (vitamina B7 sau H) este utilizată pe scară largă ca o abordare de direcţionare
pentru diverse medicamente antitumorale, în scopul de a intensifica concentraţia locală a acestora în zona
de interes [14, 15+. Această vitamină este un promotor al creşterii celulare în multe tipuri de celule şi
numărul receptorilor acesteia este foarte mare în mai multe celule tumorale, în special în celulele tumorale
mamare [16, 17]. Studii recente au demonstrat că nanoparticulele polimerice funcţionalizate cu biotină si
încărcate cu agent chimioterapeutic pot fi folosite ca sisteme de eliberare controlată a medicamentelor
[18-20].
Chitosanul este un heteropolimer compus din N-acetil-2-amino-2-deoxi-d-glucopiranoză şi 2-
amino-2-deoxi-d-glucopiranoză legate prin legături 1-4 glucozidice, extras din chitină, componentul major
al artropodelor şi crustaceelor, prin procesul de N-deacetilare termochimică în mediu bazic [21]. Acest
polimer se poate înscrie ca un candidat adecvat pentru acoperirea materialelor magnetice atât datorită
proprietăţilor sale biologice excelente (biodegradabilitate, biocompatibilitate, bioactivitate) cît şi celor
chimice (polication, prezenţa grupărilor reactive aminice [22].
Mai multe lucrări reprezentative au propus că particulele magnetice pe bază de chitosan, pot fi
utilizate ca sisteme de eliberare controlată a medicamentelor *23, 24]. Dezavantajele acestor tipuri de
particule magnetice sunt date de faptul că nu sunt caracterizate de o distribuţie uniformă şi au o capacitate
limitată de încărcare a principiilor active. O serie de derivaţi de chitosan modificaţi cu compuşi de tip alchil
3
cu catenă lungă (ex. palmitoil) au fost propuşi ca materiale de acoperire a nanoparticulelor magnetice, cu
rezultate promițătoare în ceea ce privește inhibarea creșterii tumorale *25]. Cu toate acestea,
îmbunătățirea mai multor proprietăți ale acestor particule cum ar fi (i) eficiența de încărcare, (ii)
direcționarea către locul de acțiune, (iii) stabilitatea in vivo a particulelor și controlul eliberării
medicamentului, (iv) îmbunătățirea biocompatibilităţii acestor nanovectori și eliminarea acestuia din
organism după tratament ar trebui să fie reconsiderate.
În acest context, proiectul cu titlul "Particule magnetice funcţionalizate cu potenţiale aplicaţii ca mijloc
teranostic" propune sinteza unor noi tipuri de particule magnetice biofuncţionalizate cu o eficiență
crescută de încorporare a agenţilor chimioterapeutici pentru aplicaţii ca mijloc teranostic. În formularea
acestor particule încărcate cu agenţi terapeutici şi material magnetic se va utiliza un polimer biocompatibil
(derivat amfifil de chitosan), datorită proprietăţilor sale biologice. Rezultatele preliminare publicate de Chiu
et al. [25] au arătat că un grad redus de substituţie a grupărilor de palmitoil (5%) a fost suficient pentru a
permite formarea de nanoparticule, restul grupărilor aminice nesubstituite ale chitosanului vor putea fi
ulterior conjugate cu receptori specifici. Proprietăţile fizico-chimice ale particulelor magnetice
(dimensiune, distribuţie dimensională, sarcină de suprafaţă) vor influenţa compartamentul acestora in
vivo, motiv pentru care optimizarea acestor purtători magnetice va include teste de evaluare a stabilitaţii
coloidale, de determinare a dimensiunii, a polidispersităţii şi a capacităţii de încorporare şi eliberare a
medicamentelor.
1.2. Obiectivele proiectului
Obiectivul principal al acestui proiect este de a furniza cunoştinţe teoretice şi practice în vederea
obţinerii unor noi tipuri de particule magnetice biofuncţionalizate cu potenţiale aplicaţii ca mijloc
teranostic. Obiectivele derivate din acest proiect sunt reprezentate de:
O1. Studii privind dezvoltarea bazei tehnice şi ştiinţifice necesară îndeplinirii obiectivelor şi etapelor
proiectului;
O2. Sinteza unor particule magnetice cu funcţionalitate dublă (diagnostic şi tratament);
O3. Cercetări applicative orientate către obţinerea şi caracterizarea acestor particule magnetice
biofuncţionalizate cât şi evaluarea in vitro şi in vivo a performanţelor lor biologice în vederea aplicaţiilor
ulterioare în domeniul biomedical;
O4. Studii privind abilitatea acestor tipuri de particule magnetice de a combina mijloace de
diagnostic cu metode de tratament;
O5. Dezvoltarea unei noi strategii de tratament al cancerului bazată pe soluţii care combină
nanotehnologia cu ştiinţa materialelor şi procese biologice;
O6. Diseminarea rezultatelor obtinute (participări la conferinţe naţionale şi internaţionale, publicaţii
în reviste de prestigiu naţionale şi internaţionale).
4
2. Raport sintetic al rezultatelor preliminare obţinute în etapa 2013
Obiectivele propuse pentru etapa 2013 și activităţile desfășurate pentru îndeplinirea acestor
obiective au fost:
Obiectivul 1. Sinteza unor derivaţi de chitosan cu caracter amfifil în vederea utilizării acestora ca
materiale de acoperire a particulelor magnetice;
Activitatea 1.1: Modificarea chitosanului cu grupări de tip alchil cu catenă lungă (palmitoil);
Activitatea 1.2: Caracterizarea fizico-chimică a derivaţilor obţinuţi prin tehnici de spectroscopie (IR,
RMN) şi analiză termică.
Obiectivul 2. Formularea particulelor magnetice pe bază de chitosan modificat cu potenţiale
aplicaţii ca sisteme de eliberare controlată a medicamentelor antitumorale;
Activitatea 2.1: Formularea particulelor magnetice pe bază de chitosan modificat;
Activitatea 2.2: Caracterizarea fizico-chimică a particulelor magnetice: Determinarea dimensiunii şi
a sarcinii de suprafaţă; Caracterizarea fizico-chimică a particulelor magnetice prin tehnici de spectroscopie
(IR) şi analiză termică; Evaluarea morfologiei prin tehnici imagistice (SEM/TEM); Analiza proprietăţilor
magnetice;
Activitatea 2.3: Evaluarea particulelor magnetice ca sisteme cu eliberare controlată a
medicamentelor;
Activitatea 2.4: Studii de optimizare a caracteristicilor particulelor magnetice.
2.1. Rezultate preliminarii obţinute în etapa 2013
În prima etapă a proiectului (etapa 2013) s-au sintetizat derivaţi de chitosan cu caracter amfifil (N-
palmitoil chitosan) în vederea utilizării acestora ca materiale de acoperire a particulelor magnetice. N-
palmitoil chitosanul a fost sintetizat prin reacția de a acilare a chitosanului cu clorura de palmitoil (Fig. 1).
Structura N-palmitoil chitosanului a fost confirmată prin tehnici de spectroscopie: 1H-NMR și FT-IR [26] .
Ulterior, s-au preparat nanoparticule magnetice pe bază de chitosan modificat prin două metode: gelifiere
ionică simplă și gelifiere ionică în emulsie. Particulele magnetice pe bază de palmitoil-chitosan obţinute au
fost analizate din punct de vedere al dimensiunilor şi al potenţialului Zeta. S-au preparat şi particule
magnetice pe bază de chitosan ca probă martor. Din analiza rezultatelor obţinute (prezentate în Tabelul 1)
se poate constata că particulele obţinute prin gelifiere ionică (CsPCM) au dimensiuni nanometrice (147.9
nm) şi valori mai mici decât a particulelor pe bază de chitosan (249 nm) [ 26]. Explicaţia poate fi dată de
faptul că partea hidrofobă dată de radicalul palmitoil în timpul reticulării ionice cu TPP se organizează către
interiorul particulelor şi compactează structura. Rezultatele preliminare privind dimensiunea particulelor
obţinute prin gelifiere ionică în emulsie în prezenţa doxorubicinei (CsPCM-DOX) indică că aceste particule
au dimensiuni nanometrice, dar puţin mai mari (327 nm), probabil datorită încorporării medicamentului.
5
Fig. 1. Metoda de obţinere a N-palmitoil chitosanului
Tabelul 1. Caracteristicile particulelor magnetice pe bază de CsPC (CsPCM, CsPCM-DOX)
Codificare probă Diametru mediu (nm)
±SD1
Indice de polidispersitate
(IP)
Potenţial Zeta (mV)
±SD
CsPCM 147.9± 11.31 0.39 16.78±0.42
CsPCM-DOX 327±0.64 0.43 18.2±0.35
CsM² 249±33.74 0.32 20.5±0.70
¹Rezultatele reprezintă media a trei determinări ± SD (deviaţia standard)
²S-au preparat şi particule magnetice pe bază de chitosan (codificate CsM) ca probă martor
În privinţa potenţialului Zeta se observă că acesta are valori pozitive pentru toate tipurile de
particule datorită grupărilor amino în stare protonată din structura polimerilor; cu menţiunea că pentru
CsPCM şi CsPCM-DOX valoarea potenţialului Zeta este mai mică (16.78 mV, respectiv 18.2 mV) ceea ce
confirmă faptul că o parte din grupările amino din structura chitosanului au fost implicate în legarea
radicalului palmitoil.
Particulele magnetice pe bază de palmitoil-chitosan obţinute au fost caracterizate prin tehnici de
spectroscopie (IR). Spectrul FT-IR al particulelor CsPCM, prezentat în Fig. 2 conţine atât benzi caracteristice
pentru CsPC, şi anume 2919 cm-1, 1633 cm-1, 1537 cm-1, 1066 cm-1 cât şi banda caracteristică magnetitei de
la 570 cm-1, confirmând formarea cu succes a particulelor magnetice. Spectrul FT-IR al particulelor CsPCM-
DOX (Fig. 2) prezintă benzi noi la 3404 cm-1 şi respectiv 1413 cm-1 care pot fi atribuite vibraţiilor N–H şi
respectiv C-C din structura doxorubicinei, ceea ce indică faptul că doxorubicina este incorporată în
structura particulelor.
6
Fig. 2. Spectrele FT-IR ale Cs, CsPC, CsPCM şi CsPCM-DOX
Morfologia particulelor magnetice obţinute prin gelifiere ionică în emulsie a fost evaluată prin
intermediul microscopiei SEM (Fig. 3) care a pus în evidenţă formarea unor particule cu formă sferică şi cu
dimensiuni medii de ≈ 200 nm. Această diferenţă de dimensiune faţă de cea determinată prin tehnica DLS
este datorată faptului că, dispersia particulelor magnetice în apă favorizează asocierea mai multor
particule cu formarea de agregate care duc la creşterea semnificativă a dimensiunii.
Fig. 3. Morfologie SEM a particulelor CsPCM-DOX
7
Într-o primă etapă în evaluarea particulelor magnetice ca sisteme cu eliberare controlată a
medicamentelor s-au realizat teste in vitro de încărcare cu doxorubicină a particulelor CsPCM. S-a calculat
gradul de încărcare şi eficienţa de încărcare folosind următoarele formule:
Gradul de încărcare (% ) = W încărcat/W particule * 100% (1)
Eficienţa de încărcare (% ) = W încărcat/W iniţial * 100% (2)
S-a constatat că particulele CsPCM sunt caracterizate de o eficienţă de încărcare de 47 % şi prezintă
un grad de încărcare a medicamentului de 9%.
2.2. Diseminarea rezultatelor obținute în etapa 2013 a proiectului
Rezultatele ştiintifice preliminarii obţinute în cadrul etapei 2013 a proiectului, au fost valorificate
prin participarea cu 2 lucrări la 2 conferinţe internaţionale, prezentate sub formă de poster, prin publicarea
unui articol indexat ISI și prin trimiterea spre publicare a unui articol într-o revistă cu factor ISI.
ARTICOLE –ETAPA 2013:
Balan V, Butnaru M, Verestiuc L. Synthesis and Characterization of Magnetic Nanoparticles Based on N-
Palmitoyl-Chitosan with Potential Applications in Cancer Theranostics. Proceedings of the 4th ed. of E-
Health and Bioengineering Conference-EHB 2013, Iasi, Romania, 21-23 Nov 2013, ISBN (Print): 978-1-4799-
2372-4, www.dx.doi.org/10.1109/EHB.2013.6707322.
V.Balan, L.Verestiuc. Strategies to improve chitosan hemocompatibility: A review, trimis spre publicare la
European Polymer Journal, 2013 (under review –Dec. 2013)
LUCRĂRI PREZENTATE LA CONFERINȚE INTERNAȚIONALE- ETAPA 2013:
Vera Balan, Maria Butnaru, Liliana Verestiuc. Magnetic nanoparticles based on N-hydrophobically modified
chitosan with potential applications in cancer theranostics, prezentată la 25th European Conference on
Biomaterials – September 8th – 12th, Madrid 2013.
Vera Balan, Maria Butnaru, Liliana Verestiuc. Synthesis and Characterization of Magnetic Nanoparticles
Based on N-Palmitoyl-Chitosan with Potential Applications in Cancer Theranostics, prezentată la 4th IEEE
International Conference on E-Health And Bioengineering - EHB 2013, Iaşi, Romania, Nov. 21st-23rd, 2013.
3. Raport sintetic al rezultatelor preliminare obţinute în etapa 2014
Obiectivele propuse pentru etapa 2014 și activităţile desfășurate pentru îndeplinirea acestor
obiective, conform planului de realizare al proiectului au fost:
Obiectivul 1. Formularea particulelor magnetice pe bază de chitosan modificat cu potenţiale
aplicaţii ca sisteme de eliberare controlată a medicamentelor antitumorale (continuare din 2013)
Activitatea 1.1. Studii de optimizare a caracteristicilor particulelor magnetice (dimensiune, conţinut
magnetită, capacitate de încorporare principiu activ) (continuare din 2013)
Activitatea 1.2. Analiza critică a rezultatelor în scopul stabilirii influenţei diverşilor parametri asupra
caracteristicilor particulelor; Selecţia loturilor de particule pentru studii ulterioare de eliberare ţintită
Obiectivul 2. Formularea particulelor magnetice biofuncţionalizate cu biotină
Activitatea 2.1. Prepararea particulelor magnetice biotinilate; Corelaţii dintre structură şi proprietăţi
8
Activitatea 2.2. Analiza fizico-chimică şi structurală a particulelor magnetice biotinilate: FTIR,
analiză termică, determinarea potenţialului Zeta, a dimensiunilor şi a proprietăţilor magnetice
Activitatea 2.3. Evaluarea abilităţilor de redispersie a particulelor biotinilate în medii fiziologice
(soluţii tampon, ser fiziologic, glucoză)
Activitatea 2.4. Interpretarea rezultatelor experimentale; Analiza critică a rezultatelor. Selectarea
loturilor pentru studii ulterioare; Diseminarea rezultatelor; Manegement proiect; Raportare proiect-etapa
2014.
3.1. Raport sintetic al rezultatelor preliminare obţinute în etapa 2014
Caracteristicile particulelor magnetice (dimensiune, conţinut de magnetită, capacitate de
încorporare a principiului activ) sunt dictate în primul rând de proprietățile fizico-chimice ale polimerului cu
rol de matrice. Astfel, cu scopul de a modula aceste caracteristici în formularea acestora s-au utilizat trei
derivați de chitosan (N-palmitoil-chitosan) cu grade de substituție diferite. Structura derivaților acilați a
fost investigată și confirmată prin spectroscopie de rezonanţă magnetică de protoni (1H–NMR) și prin
spectroscopie FT-IR (Fig. 4) [27]. În spectrele FT-IR ale derivaților acilați (Fig. 4A) apar noi semnale la 2916
cm-1 și 2852 cm_1 care pot fi atribuite vibrațiilor de deformare simetrice și respectiv asimetrice ale
grupărilor metilen nou introduse din lanțul palmitoilului [28]. Se observă o intensificare a acestor benzi
odată cu creșterea conținutului de palmitoil. Același trend se poate observa și pentru benzile caracteristice
grupării amidice (de la 1650 cm-1 și 1554 cm-1) [29], în timp ce banda de la 3360 cm_1 descrește în
intensitate odată cu creșterea gradului de substituție, indicând o diminuare a legăturilor de hidrogen în
compușii acilați [28]. În spectrele 1H–NMR (Fig. 4B) ale derivaților acilați apar semnale noi la 1,2 ppm şi
respectiv 1,7 ppm datorate grupărilor metil (–CH3) şi respectiv metilen (-CH2) nou introduse din structura
palmitoilui. Se poate observa că intensitățile acestor semnale cresc direct proporțional cu gradul de
substituție. Gradul de acilare al derivaților sintetizați a fost determinat prin metoda TNBS (Tabelul 2).
Rezultatele obținute, confirmă faptul că gradul de substituție variază direct proporțional cu raportul molar
utilizat în reacție. În același timp se poate observa că valorile potențialului Zeta scad odată cu creșterea
gradului de substituție, datorită faptului că o parte din grupările aminice au fost substituite. Ulterior am
determinat masele moleculare medii, numerice (Mn) și respectiv gravimetrice (Mw) ale derivaților acilați și
s-a constat o creștere a maselor moleculare medii numerice pentru derivații acilați (Tabelul 2) și a maselor
moleculare gravimetrice de la 240 KDa pentru chitosan la 269.3 KDa pentru PCs0.5, la 322.5 KDa pentru
PCs1 și respectiv la 395.7 KDa pentru PCs2, datorită introducerii unor noi lanțuri de palmitoil în structură.
Valorile indicelui de polidispersitate sunt similare pentru toți compușii analizați, indicând o distribuție
medie a maselor moleculare, probabil datorită faptului că probele au fost filtrate înainte de analiză. Este
important de menționat faptul că în timpul sintezei nu au apărut fenomene de degradare ale produșilor.
9
Fig.4. Spectrele FT-IR (a) și 1H–NMR (b) ale chitosanului (Cs) și ale derivaților N-acilați
cu grade diferite de substituție (PCs0.5, PCs1 și PCs2)
Tabelul 2. Caracteristicile derivaților acilați cu grade diferite de substituție
Probă Grad de
substituție (%) ±DS1*
Potențial Zeta (mV)
±DS2*
Mn, kDa Mw , kDa Indice de
polidispersitate
Cs - 56.1±6.80 183.3 240.9 1.31
PCs0.5 7.69 ±0.42 54.4±2.75 192.5 269.3 1.39
PCs1 12.35 ±1.60 51.3±4.66 235.2 322.5 1.37
PCs2 25.57 ±2.33 43.3±2.96 264.3 395.7 1.49
1 – determinat prin metoda TNBS
2 – valori pentru chitosan și derivații acilați (0.2% în apă acidă, pH=3.5)
* - datele sunt prezentate ca media a trei determinări ± deviația standard
S-au sintetizat trei loturi de nanocapsule magnetice, prin metoda dublei emulsii (schematizată în
Fig. 5) [27] în formularea cărora s-au utilizat cei trei derivați de chitosan cu grade diferite de substituție. În
urma analizei critice a rezultatelor s-a ales lotul codificat MN2, denumit în continuare MN-DOX pentru
studii ulterioare de eliberare ţintită, deoarece prezintă cele mai mici dimensiuni, caracteristică esențială în
vederea aplicațiilor ulterioare biomedicale. Tehnica de spectroscopie FT-IR a confirmat structura
nanocapsulelor magnetice (MN-DOX): magnetită, N-palmitoil chitosan și doxorubicină (Fig. 6). Spectrul FT-
IR al nanocapsulelor magnetice preparate în absența medicamentului (MN-fără DOX) conţine atât benzi
caracteristice pentru polimer la 3360, 2916, 2852, 1631 și 1068 cm-1 cât și banda caracteristică magnetitei
de la 567 cm-1. Spectrul doxorubicinei, descris anterior în literatură, prezintă benzi la 3330 (H–O), 2932 (C–
10
H), 1730 (C=O), 1618 and 1577 (N–H), 1414 (C–C), 1280 (C–O–C) și respectiv 1071 (C–O) cm_1 [30, 31].
Aceste benzi sunt prezente și în spectrul nanocapsulelor MN-DOX, ușor deplasate la 2916 (C–H), 1732
(C=O), 1631 și 1537 (N–H), 1406 (C–C), 1251 (C–O–C) și respectiv 1068 (C–O) cm_1 [27].
Fig. 5. Reprezentare schematică a metodei de preparare a nanocapsulelor magnetice cu dublă
încapsulare (medicament și material magnetic) [27]
Fig.6. Spectrele FT-IR ale magnetitei, ale nanocapsulelor magnetice preparate în absența
medicamentului (MN-fără DOX) și ale lotului MN-DOX cu dublă încapsulare (magnetită, medicament)
Analiza termogravimetrică a lotului MN-DOX poate furniza date relevante referitoare la structura
nanocapsulei și la conținutul în material magnetic. Curbele TG/DTG ale magnetitei au evidențiat o singură
etapă de degradare termică (Fig. 6 ) în timp ce degradarea termică a polimerului a avut loc în două etape:
prima este datorată evaporării apei iar a doua degradării unităților polizaharidice și a lanțurilor alifatice ale
palmitoilului [32,33]. Curbele TG/DTG ale doxorubicinei prezintă trei etape de degradare, cu maxime
11
situate la 239 oC, la 345 oC și respectiv la 540 oC. Degradarea termică a lotului MN-DOX a avut loc în patru
etape: prima etapă este datorată cel mai probabil evaporării apei adsorbită în structură; al doilea
eveniment termic, cu un maxim la 245 oC poate fi corelat atăt cu degradarea polimerului cât și cu
degradarea doxorubicinei; a treia etapă de degradare termică, cu un maxim la 543 oC poate fi atribuită
degradării medicamentului în timp ce ultima etapă, cu un maxim la 620 oC se datorează degradării TPP-
ului. Reziduul obținut în urma degradării termice a lotului MN-DOX poate fi corelat cu conținutul în
material magnetic al acestuia. Astfel, lotul MN-DOX conține aproximativ 28 % magnetită în structură.
Analiza XRD a fost utilizată pentru a studia dacă încapsularea magnetitei hidrofobe a influențat
cristalinitatea acesteia (Fig. 8). Difractograma XRD a magnetitei prezintă unghiurile de difracţie 2θ
caracteristice, şi anume: 30,3 °; 35,6 °; 43,4 °; 53,5 ° şi 57,4 ° unghiuri care pot fi indexate planurilor (220),
(311), (400), (422), şi (511), aparţinând unei celule cubice. Polimerul (PCs2) prezintă o reflexie intensă la
aproximativ 21° C și o reflecție slabă la 10°, indicând faptul că introducerea lanțurilor hidrofobe au
determinat modificări în structura cristalină a chitosanului. Difractograma XRD a lotului MN-DOX
evidențiază atât picurile caracteristice pentru polimer (la 10 ° și, respectiv, 21 °) cât și ale magnetitei (la
30,3 °, 35,6 °, 43,4 °, 53,5 °, și 57,4°), confirmând faptul că nanocapsulele magnetice pe baza N-palmitoil
chitosan prezervă cristalinitatea magnetitei.
Fig. 7. Curbele TG și DTG ale lotului MN-DOX, magnetitei, polimerului (PCs2) și
ale medicamentului (DOX)
12
Fig. 8. Difractogramele XRD ale lotului MN-DOX comparativ cu
ale magnetitei și polimerului (PCs2)
Morfologia lotului MN-DOX a fost investigată prin tehnica de microscopie electronică de baleiaj
(SEM) și respectiv microscopie electronică de transmisie (TEM). Imaginile SEM și TEM (Fig. 9) au evidenţiat
formarea unor nanocapsule magnetice, cu formă aproximativ sferică și cu dimensiuni medii cuprinse în
intervalul 100-150 nm. Mai mult, micrografiile TEM au confirmat încorporarea materialului magnetic
(zonele mai inchise la culoare) în structura nanocapsulelor (Fig. 9 B,C). Această diferenţă de dimensiune
faţă de cea determinată prin tehnica DLS (215 ± 23.33 nm) este datorată faptului că, în medii apoase
stratul de polimer se umflă și determină o creştere a dimensiunii.
Fig. 9. Imagini SEM (A) și TEM (B, C) ale lotului MN-DOX
Eficienţa de încapsulare a lotului MN-DOX calculată conform ecuației (2) a fost de 73%, rezultat care
indică o eficiență ridicată de încapsulare a medicamentului precum și faptul că doxorubicina a fost
încapsulată cu succes în nanocapsulele magnetice. Profilele de eliberare in vitro ale medicamentului în
medii cu diferite valori ale pH-ului, respectiv 7.4 (pH-ul mediului sangvin) și 5.5 (pH-ul mediului tumoral) s-
13
au obținut prin reprezentarea cantității de medicament eliberat în raport cu cantitatea de doxorubicină
încărcate în nanocapsulele magnetice (Fig. 10). În ambele medii studiate, nanocapsulele magnetice
prezintă un model bifazic de eliberare a medicamentului: în primele șase ore se observă un „burst effect”,
urmat de o a doua fază care corespunde unei eliberării constante timp de șase zile. „Burst effect”-ul ar
putea fi datorat difuziei medicamentului adsorbit pe suprafața nanocapsulelor magnetice [34]. Eliberarea
cumulată de doxorubicinei (%) în mediu acid a fost mai mare comparativ cu eliberarea acestuia în mediu
neutru, probabil datorită solubilității mai bune a medicamentului în mediu acid [35+. În același timp,
eliberarea doxorubicinei din nanocapsulele magnetice ar putea fi influențată de capacitatea
medicamentului de a traversa straturile nanocapsulei, din miezul interior către învelișul exterior polimeric
precum și de biodegradabilitatea polimerui [36], motiv pentru care se impune realizarea unor studii
suplimentare privind factorii cheie care pot modula eliberarea in vitro medicamentului.
În cadrul acestui proiect, biofuncţionalizarea particulelor magnetice a vizat imobilizarea biotinei pe
suprafaţă, procedeul adoptat valorificând posibilitatea formării unor legături amidice între gruparea
carboxil a biotinei și gruparea amino a chitosanului (Fig. 11), reacţie mediată de carbodiimide solubile în
apă: 1-etil-3-(3-dimetil aminopropil) carbodiimidă hidroclorurată, (EDAC) și N-hidroxisuccinimidă.
Particulele magnetice biotinilate au fost caracterizate din punct de vedere compoziţional, structural şi
morfologic, al dimensiunilor și a distribuţiei dimensionale, a potenţialului Zeta și al proprietăţilor magnetice
prin tehnici moderne de analiză.
Fig.10. Profilele de eliberare in vitro ale doxorubicinei din lotul MN-DOX
în soluții tampon fosfat
14
Fig. 11. Reprezentare schematică a metodei de funcționalizare a nanocapsulelor
magnetice cu biotină [37]
Spectrul FT-IR al particulelor biotinilate ( codificate BMN) a fost analizat comparativ cu cel al lotului
MN-DOX (înainte de biotinilare) și cu cel al biotinei, descris anterior în literatură *38]. Spectrul biotinei
prezintă banda de la 3306 cm-1 caracteristică pentru heterociclul imidazolului; picurile de la 2931 cm-1 şi
2850 cm-1 corespund vibraţiilor de deformare şi întindere ale grupării metilenice; banda de la 1639 cm-1
este caracteristică vibraţiei de deformare a grupării C-O; banda de la 1481 cm-1 este specifică vibraţiei de
întindere a grupării COO- iar benzile de la 1316 cm-1 şi 1269 cm-1 sunt caracteristice pentru vibraţiile de
deformare a legăturii C–C din structura moleculei de biotină *38]. În spectrul particulelor biotinilate (Fig.
10) banda de absorţie caracteristică pentru heterociclul imidazolic de la 3300 cm-1 se suprapune cu benzile
caracteristice grupărilor hidroxil din structura chitosanului situate în aceeași zonă și se observă o
intensificare a acesteia. Același trend se observă și pentru cele două benzi specifice legăturii amidice de la
1631 cm-1 şi 1537 cm-1. Aceste benzi sunt caracteristice vibraţiilor de întindere a grupării (C-O) şi respectiv
(–NH) şi deşi sunt prezente şi în spectrul nanocapsulelor magnetice (MN-DOX), o intensificare a acestora în
spectrul particulelor biotinilate indică formarea unor noi legături amidice, între gruparea carboxil a biotinei
şi gruparea amino a chitosanului. Spectroscopia FT-IR confirmă astfel obţinerea particulelor magnetice
biotinilate [37].
15
Fig. 12. Spectrele FT-IR ale particulelor biotinilate (BMN) comparativ cu ale lotului MN-DOX
O caracteristică esenţială a particulelor magnetice cu aplicaţii biomedicale este dată de
dimensiunea acestora, motiv pentru care s-au determinat dimensiunile particulelor magnetice biotinilate,
precum şi caracteristicile lor de suprafaţă deoarece acestea influenţează atât timpul de circulaţie sangvină
cât şi biodisponibilitatea particulei. Din analiza rezultatelor obţinute se constată că procesul de biotinilare
nu a determinat o modificare semnificativă a dimensiunii medii a particulelor, datorită faptului că biotina
este o moleculă mică. Particulele magnetice biotinilate prezintă o dimensiune medie de 255 ± 26.9 nm şi
valori negative ale potenţialului Zeta (-15.7 ±0.83 mV), caracteristici ce confirmă legarea biotinei pe
suprafața nanocapsulelor magnetice.
Deoarece aplicaţia acestor particule magnetice în mediul sangvin va fi sub formă de suspensii
injectabile se impune realizarea de teste de redispersii a acestor particule în medii adecvate aplicaţiei.
Astfel, testele de redispersie ale particulelor biotinilate s-au realizat în două medii comune care se folosesc
în domeniul medical ca soluţii injectabile și anume: serul fiziologic 0, 9 % NaCl şi soluţia de glucoză 10 %. S-
au determinat dimensiunea şi potenţialul Zeta al particulelor biotinilate redispersate, caracteristici care pot
furniza informaţii privind comportamentul acestor particule în mediul sangvin. Din analiza rezultatelor
obținute se poate concluziona că glucoza reprezintă un mediu mult mai adecvat de redispesie comparativ
cu serul fiziologic, în condițiile în care dimensiunea medie a particulelor biotinilate redispersate în glucoză
este cuprinsă în intervalul 100-300 nm în timp ce dimensiunea medie a particulelor biotinilate redispersate
în ser fiziologic este de ordinul a 1 μm. Dimensiunile de ordin micrometric pot indica faptul că prezenţa
diferiţilor tipuri de ioni, în special săruri, determină aglomerarea particulelor magnetice biotinilate; un alt
aspect care trebuie luat în seamă este faptul că inainte de redispersie particulele biotinilate au fost
liofizilate, proces care conduce la aglomerarea particulelor magnetice. Valorile înregistrate pentru
16
potenţialul Zeta se incadrează într-un interval negativ de valori, și anume: -16.7 mV pentru glucoză și
respectiv -9.53 mV, indicând faptul că tăria ionica a diverselor medii influenţează atât dimensiunea cât şi
sarcina de suprafață a particulelor biotinilate.
3.2. Diseminarea rezultatelor ştiintifice obținute în etapa 2014
Rezultatele ştiintifice obţinute în cadrul etapei 2014 a proiectului, cod PN-II-RU-PD-2012-3 – 0282
au fost valorificate prin participarea cu 3 lucrări la 3 conferinţe internaţionale (una dintre ele a fost
acceptată în 2014 și a fost prezentată în 2015) și prin trimiterea spre publicare a unui articol într-o revistă
internațională de specialitate cu factor ISI. Articolul trimis spre evaluare în etapa 2013, a fost publicat în
cursul anului 2014.
ARTICOLE-ETAPA 2014
V.Balan, L.Verestiuc. Strategies to improve chitosan hemocompatibility: A review. European Polymer
Journal, 53, 171–188, 2014.
V. Balan, G. Dodi, N. Tudorachi, O. Ponta, V. Simon, L. Verestiuc. Doxorubicin-loaded magnetic
nanocapsules based on N-palmityl chitosan and magnetite: synthesis and characterization, trimis spre
publicare, Carbohydrate Polymers, 2014.
LUCRĂRI-ETAPA 2014
Vera Balan, Valentina Redinciuc, Liliana Verestiuc. Magnetic Nanocapsules based on Hydrophobically-
Modified Chitosan and Magnetite for Biomedical Applications, prezentată la 6th International Conference
“Biomaterials, Tissue Engineering and Medical Devices” - BiomMedD’2014, 17-20 Sep. 2014, Constanța,
Romania.
Vera Balan, Liliana Verestiuc. Preparation and characterization of magnetic composites based on N-palmityl
chitosan for biomedical applications, prezentată la 6th International Conference on Nanomaterials-
Research & Application, 5-7 Nov. 2014, Brno, Cehia.
V. Balan, Maria Butnaru, Oana Ponta, Adriana Vulpoi, Viorica Simon, L. Verestiuc. Biofunctionalized magnetic nanocapsules based on N-palmityl chitosan with dual entrapment for cancer theranostic applications, acceptată pentru prezentare la 4th International Conference on Multifunctional, Hybrid and Nanomaterials- HYMA 2015, Sitges, Spania, 9-13 Martie 2015.
4. Raport sintetic al rezultatelor preliminare obţinute în etapa 2015
Obiectivele propuse pentru etapa 2015 și activităţile desfășurate pentru îndeplinirea acestor
obiective, conform planului de realizare al proiectului au fost:
Obiectivul 1. Evaluarea performanţelor biologice ale particulelor magnetice biofuncţionalizate ca
sisteme teranostic
17
Activitatea 1.1. Evaluarea in vitro a biodegradabilităţii particulelor magnetice biofuncţionalizate în
medii fiziologice (în prezența lizozimului) şi a eliberării medicamentului
Activitatea 1.2. Evaluarea in vitro a hemocompatibilității şi a biocompatibilității particulelor
magnetice biofuncţionalizate; Studii privind influența gradului de funcționalizare asupra eficienţei de
internalizare celulară
Activitatea 1.3. Evaluarea in vitro a particulelor magnetice biofuncţionalizate ca agenti de contrast
în IRM
Activitatea 1.4. Evaluarea in vivo a hemocompatibilităţii şi a biocompatibilităţii particulelor
magnetice biofuncţionalizate (teste pe animale mici)
Activitatea 1.5. Evaluarea bidistribuţiei particulelor magnetice biofuncţionalizate şi a abilităţii de a fi
ghidate în câmp magnetic prin teste histologice
Activitatea 1.6. Interpretarea rezultatelor experimentale; Analiza critică a rezultatelor testelor in
vitro şi in vivo; Diseminarea rezultatelor; Manegement proiect; Raportare proiect finala
Metoda de testare a biodegradabilității
Evaluarea in vitro a biodegradabilităţii nanoparticulelor s-a realizat în două medii biologice simulate
(soluții tampon fosfat pH=7.4 și respectiv 5.5), în prezenţa lizozimului, timp de 6 zile, iar concentraţia în
produşii de degradare a fost determinată prin metoda fericianurii de potasiu. O cantitate de nanoparticule
a fost redispersată în cele două soluții tampon într-o membrană de dializă (Mw=12 400 Da) care a fost
plasată în soluții tampon fosfat (volum final 25ml), într-un incubator, la 37◦C. La intervale de timp, s-a
prelevat 1 ml de soluție pentru analiză spectrofotometrică (la 420 nm) și s-a înlocuit cu 1 ml de soluție
tampon. Peste proba prelevată s-au adăugat 4 ml soluţie de fericianură de potasiu, s-a pus la fiert timp de
15 minute, după care s-a răcit şi s-au adăugat 5 ml soluţie tampon fosfat şi s-a citit absorbanţa la
spectrofotometru. După 3 zile, mediul a fost complet îndepărtat și înlocuit cu mediu proaspăt. O curbă de
calibrare realizată cu N -acetil-D- glucozamină a fost utilizată pentru a evalua cantitatea capetelor
reducătoare rezultate în urma degradării.
Interpretarea rezultatelor obținute și discuții
Biodegradabilitatea este o cerință esențială pentru utilizarea cu succes a unui material sau
dispozitiv medical în aplicații biologice. Chitosanul și derivaţii săi, sunt expuşi, în corpul uman degradării
chimice și enzimatice, ultima dintre ele realizându-se în special de către lizozim și enzimele bacteriene
[39]. Biodegradarea este un proces de descompunere a substanțelor organice de
către enzimele produse de organisme vii, în special bacterii și ciuperci microscopice, prin care se asigură
ciclul elementelor în natură *40]. Kofuji şi colab. au studiat biodegrabilitatea mai multor tipuri de
chitosan în prezenţa lizozimului prin observarea modificărilor care apar în vâscozitatea soluţiilor şi au
raportat că chitosanul cu un grad de deacetilare scăzut are tendinţa de a se degrada mai rapid [41],
18
viteza de degradare enzimatică depinzând de distribuţia grupărilor acetil şi acetamidă în molecula
chitosanului, de lungimea catenei macromoleculare şi implicit de valoarea masei moleculare. În cele mai
multe dintre studiile raportate, chitosanul a fost degradat suficient astfel încât să fie şi uşor excretat din
organism. În literatura de specialitate sunt raportate doar câteva studii referitoare la degradarea in vivo
a chitosanului după administrarea acestui polimer pe cale intravenoasă. Mecanismul de biodegradare
nu este clarificat pe deplin, dar unele etape au ca rezultat diverși produși de degradare (Fig. 13) [42].
Atât biodistrubuţia chitosanului în organism cât şi biodegradarea şi eliminarea acestuia sunt dependente
de masa moleculară a polimerului [39].
Fig. 13. Etape ale biodegradării chitosanului [42].
Evaluarea in vitro a biodegradabilităţii nanoparticulelor s-a realizat în două medii biologice simulate,
în prezenţa lizozimului, timp de 6 zile, iar concentraţia în produşii de degradare a fost determinată prin
metoda fericianurii de potasiu [43]. Rezultatele au confirmat capacitatea nanoparticulelor de a fi
degradate în organismul uman, deoarece lizozimul este prezent în diferite fluide biologice și țesuturi,
inclusiv în celulele canceroase mamare [44].
Metoda de testare in vitro a viabilității celulare
Un test MTT standard de viabilitate celulară a fost utilizat pentru a determina efectele citotoxice ale
particulelor magnetice biotinilate asupra celulelor mamare canceroase (linia MCF-7) comparativ cu
19
doxorubicina liberă (DOX). Celulele au fost crescute în mediu DMEM suplimentat cu ser fetal bovin 10% și
antibiotice. Pentru studiul in vitro, 5000 celule / godeu au fost cultivate în 96-godeuri pentru culturi de
țesuturi, la o temperatura de 37 ◦C într-o atmosferă umedă conținând 5% bioxid de carbon, timp de 48h.
Particulele magnetice au fost suspendate în mediu de cultură DMEM suplimentat cu 2% FBS și 1%
antibiotice la concentrații diferite și au fost adăugate într-un volum unic (200 µl). Ca și probă control (test
negativ) mediu a fost folosit doar mediu de creștere. La 24 de ore, soluția MTT a fost înlocuită cu
izopropanol, pentru a solubiliza cristale de formazan insolubile formate în celule. Absorbanța formazanului
a fost citită, la 570 nm (Tecan Sunrise Reader). Studiile privind influența gradului de funcționalizare asupra
eficienţei de internalizare celulară au fost realizate prin microscopie cu fluorescență.
Interpretarea rezultatelor obținute și discuții
Efectele citotoxice ale particulelor magnetice biotinilate asupra celulelor mamare canceroase (linia
MCF-7) comparativ cu doxorubicina liberă (DOX) au fost evaluate folosind un test standard de viabilitate
celulară (MTT). Rezultatele testului MTT, la 24 h de cultură (Fig. 14) au indicat faptul că particulele
magnetice biotinilate (BMN) prezintă efecte antiproliferative pe celulele, mai pronunțate decât
doxorubicina liberă, în special la concentrații mai mari.
Fig. 14. Evaluarea in vitro a viabilității celulare
Studii recente au evidențiat faptul că doxorubicina liberă poate fi extrudată în afara celulei
tumorale de către glicoproteina P, care este acționează ca o pompă în celulele rezistente la medicamente
[45]. Încapsularea medicamentului în nanoparticule magnetice polimerice ar putea preveni acest
mecanism ceea ce ar duce la intensificarea efectului citotoxic asupra celulelor tumorale.
Studiile privind influența gradului de funcționalizare asupra eficienţei de internalizare celulară au
fost realizate prin microscopie cu fluorescență, doxorubicina fiind un produs chimic fluorescent, cu o
culoare rosu aprins atunci când este vizualizat cu filtru roșu. Au fost analizate placile de cultură în urma
contactului cu particulele magnetice biotinilate (BMN) și respectiv particule magnetice nefuncționalizate
20
(MN-DOX). Această tehnică a permis evidențierea faptului că particulele magnetice biotinilate au fost
internalizate în celulele MCF-7 (Fig 15 B) cu mai mult succes decat particule magnetice nefuncționalizate
(Fig 15 A), confirmând rolul determinant al procesului de funcționalizare/biotinilare asupra internalizării.
Fig. 15. Imagini de microscopie cu fluorescență ale placilor de cultură în urma contactului
cu particule magnetice nefuncționalizate (A) și particule magnetice biotinilate (B)
Evaluarea hemocompatibilității
Gorbet sugerează că hemocompatibilitatea se referă în primul rând la răspunsul trombogen indus
de un material sau un dispozitiv când acesta este pus în contact cu sângele, răspuns care include o serie de
reacţii imediate ale sângelui reprezentate de formarea de trombi sau cheaguri care conduc, în final la
activarea mecanismului de coagulare al sângelui [46]. În esenţă, fenomenul de coagulare a sângelui constă
în transformarea fibrinogenului plasmatic în fibrină care ulterior polimerizează pe două direcţii:
- longitudinală- cu formarea fibrelor sau fibrilelor primare;
- transversală- cu producerea fibrelor secundare de fibrină, datorită punţilor de hidrogen ce se
stabilesc între aminoacidul tirozină şi aminoacidul histidină dintre două fibre primare.
Particularităţile specifice procesului de coagulare sunt reprezentate de: numărul mare de compuşi
cu rol de activatori sau inhibitori ai procesului care intervin; existenţa în sânge, sub formă de precursori, a
majorităţii factorilor coagulării; preponderent, factorii coagulării sunt proteaze care rezultă în urma
proteolizei limitate a formele lor inactive; transformarea factorilor coagulării din forme inactive în forme
active se face prin procesul de autocataliză, determinată de propriile lor produse; unii dintre factori, (ex.
Ca2+) au acţiune multiplă, intervenind aproape în toate etapele coagulării; acest proces complex se
desfăşoară în cascadă; faza de latenţă a coagulării este reprezentată de o serie de transformari cu viteze
mari ale factorilor coagulării din formele lor inactive în forme active.
Coagularea sângelui se desfăşoară pe două căi: calea extrinsecă şi calea intrinsecă. Cele două se
deosebesc prin originea tisulară sau sangvină a factorului de declanşare a procesului în cascadă şi sunt
prezentate în Fig. 20. Calea extrinsecă, scurtă, cu durată de ordinul secundelor, are două etape
importante: generarea protrombinazei şi producerea trombinei. Trombina acţionează asupra
A B
21
fibrinogenului transformându-l în fibrină. Fibrina formata în această fază este instabilă. Calea intrinsecă are
o durată mai lungă, de ordinul minutelor şi prezintă patru etape: generarea protrombinazei; producerea
trombinei; transformarea fibrinogenului în fibrină şi stabilizarea acesteia; sinereza şi retracţia cheagului. În
calea intrinsecă sunt implicaţi numai factori sangvini. Procesul este declanşat prin activarea factorului XII
(cunoscut şi sub numele de factorul Hageman), ca urmare a fenomenului de suprafaţă de hemosorbţie, pe
care-l suferă acest factor la nivelul leziunilor vasculare sau prin contact cu o suprafaţă straină. Urmează
apoi o serie de paşi care conduc la formarea polimerului de fibrină, instabil care este stabilizat sub acţiunea
factorului XIII. Sinereza cheagului prin expulzarea apei din ochiurile gelului, cu micşorarea spaţiilor dintre
fibrile şi retracţia cheagului sunt etapele finale ale coagulării sângelui. Retracţia cheagului se produce
numai în prezenţa trombocitelor funcţionale normale, care acţionează prin intermediul factorului I
plachetar. În punctele nodale ale reţelei de fibrină plachetele sangvine au rol de centri mecanici.
Pentru a studia efectele particulelor biotinilate în contact cu sângele, s-au realizat teste
convenţionale de coagulare care au constat în măsurarea timpului de protrombină şi a indicelui normalizat
internaţional. Timpul de protrombină evaluează calea extrinsecă a coagularii şi furnizează informaţii privind
prezenţa şi activitatea a cinci factori ai coagulării (factorii I, II, V, VII, şi X). Timpul de protrombină (TP)
reprezintă timpul de declanşare a procesului de coagulare, exprimat prin formarea trombului în urma
contactului sângelui cu particulele magnetice biotinilate. Referitor la valorile normale ale INI, acestea sunt
cuprinse între 1-2. Rezultatele obţinute indică faptul că nu s-au observat modificări importante ale nici unui
parametru analizat şi confirmă că particulele biotinilate nu afectează activitatea protrombinei.
4.2. Diseminarea rezultatelor ştiintifice obținute în etapa 2015
Rezultatele ştiintifice obţinute în cadrul etapei 2015 a proiectului, cod PN-II-RU-PD-2012-3 – 0282
au fost valorificate prin participarea cu 5 lucrări prezentate la 3 conferinţe internaţionale (HYMA 2015,
NN15, EHB 2015), 1 conferință națională și 1 workshop; prin publicarea a 2 articole: 1 articol indexat ISI și 1
articol într-o revistă cu ISSN; trimiterea spre publicare a unui articol într-o revistă internațională de
specialitate cu factor ISI si participarea directorului de proiect la un training. Articolul trimis spre evaluare
în etapa 2014, a fost publicat în cursul anului 2015.
ARTICOLE-ETAPA 2015
1. V. Balan, G. Dodi, N. Tudorachi, O. Ponta, V. Simon, L. Verestiuc. Doxorubicin-loaded magnetic
nanocapsules based on N-palmitoyl chitosan and magnetite: synthesis and characterization, Chemical
Engineering Journal, 279, 188–197, 2015.
2. Balan V, Butnaru M, Bredetean O, Knieling L, Munteanu A, Verestiuc L. Design and
Characterization of Biotinylated Magnetic Nanocapsules for Breast Cancer Applications. Proceedings of the
22
5th IEEE International Conference on E-Health and Bioengineering Conference-EHB 2015, Iasi, Romania, 19-
21 Nov 2015, acceptat spre publicare, în curs de indexare ISI.
3. Redinciuc Valentina, Bălan Vera, Vereștiuc Liliana. Nanoparticule pe bază de chitosan modificat
cu potenţiale aplicaţii ca sisteme de eliberare a principiilor active. Volumul de lucrări științifice al
Conferinței Naționale de Bioinginerie pentru studenți și tineri cercetători, ed. a XVIII-a, Ed. Gr. T. Popa UMF
Iași, 2015, ISSN 2285-1348, pg. 185-190.
4. Balan V, Redinciuc V, Tudorachi N, Verestiuc L. Biotinylated N-palmitoyl chitosan for design of
drug loaded self-assembled nanocarriers, trimis spre publicare, Biomacromolecules, 2015.
LUCRĂRI-ETAPA 2015
1. Vera Balan, Maria Butnaru, Oana Ponta, Adriana Vulpoi, Viorica Simon, Liliana Verestiuc.
Biofunctionalized magnetic nanocapsules based on N-palmityl chitosan with dual entrapment for cancer
theranostic applications, prezentată sub formă de poster la Fourth International Conference on
Multifunctional, Hybrid and Nanomaterials -HYMA 2015, 9-13 martie 2015, Sitges, Spania.
2. V. Balan, M. Butnaru, L. Verestiuc. Biotinylated magnetic nanostructures with potential
applications for breast cancer chemotherapy, prezentată sub formă de poster la 12th International
Conference on Nanosciences & Nanotechnologies (NN15), 7-10 Julie 2015, Thessaloniki, Grecia.
3. Redinciuc Valentina, Bălan Vera, Vereștiuc Liliana. Nanoparticule pe bază de chitosan modificat
cu potenţiale aplicaţii ca sisteme de eliberare a principiilor active, prezentată sub formă de comunicare
orală la Conferința Națională de Bioinginerie pentru studenți și tineri cercetători, ed. a XVIII-a, 14-17 mai
2015, Iași, România.
4. V. Balan, V. Redinciuc, L.Vereștiuc. Self-assembled nanoparticles based on N-hydrophobically
modified chitosan, prezentată sub formă de comunicare orală la The 3rd CEEPN Workshop on Polymer
Science, 23-26 Septembrie 2015, Iași, România.
5. Balan V, Butnaru M, Bredetean O, Knieling L, Munteanu A, Verestiuc L. Design and
Characterization of Biotinylated Magnetic Nanocapsules for Breast Cancer Applications, va fi prezentată
sub formă de comunicare orală, la 5th IEEE International Conference on E-Health and Bioengineering
Conference-EHB 2015, Iasi, Romania, 19-21 Nov 2015.
Training
Participarea directorului de proiect (Dr. bioing. Vera Balan) la trainingul: 9th International Summer
School “N&N: Organic Electronics and Nanomedicine” (ISSON 15), organizat in perioada 4-11 iulie 2015, in
cadrul conferintei 12th International Conference on Nanosciences & Nanotechnologies (NN15).
23
Concluzii generale
1. S-au obţinut particule magnetice biofuncționalizate cu biotină, în 2 etape. Într-o primă etapă
s-au preparat nanocapsule magnetice pe bază de N-palmitoil chitosan prin metoda dublei emulsii iar
ulterior acestea au fost biofuncționalizate cu biotină, procedeul adoptat valorificând posibilitatea formării
unor legături amidice între gruparea carboxil a biotinei și gruparea amino a chitosanului, reacţie mediată
de carbodiimide solubile în apă.
2. Spectroscopia FT-IR a fost folosită pentru a confirma structura nanocapsulelor magnetice
(MN-DOX): magnetită, N-palmitoil chitosan și doxorubicină. Aceste rezultate au fost în corelație și cu datele
obținute prin analiza EDX și respectiv datele de analiza termogravimetrică. Imaginile de microscopie (SEM și
TEM) au evidenţiat formarea unor nanocapsule magnetice, cu formă aproximativ sferică și cu dimensiuni
medii cuprinse în intervalul 100-150 nm. Această diferenţă de dimensiune faţă de cea determinată prin
tehnica DLS (ca. 215 nm) este datorată faptului că, în medii apoase stratul de polimer se umflă și determină
o creştere a dimensiunii.
3. S-au studiat profilele de eliberare in vitro ale medicamentului în medii cu diferite valori ale
pH-ului, respectiv 7.4 (pH-ul mediului sangvin) și 5.5 (pH-ul mediului tumoral). În ambele medii studiate,
nanocapsulele magnetice prezintă un model bifazic de eliberare a medicamentului: în primele șase ore se
observă un „burst effect”, urmat de o a doua fază care corespunde unei eliberării constante timp de șase
zile.
4. Particulele magnetice biotinilate au fost caracterizate din punct de vedere compoziţional,
structural şi morfologic, al dimensiunilor și a distribuţiei dimensionale, a potenţialului Zeta și al
proprietăţilor magnetice prin tehnici moderne de analiză.
5. Spectroscopia FT-IR a confirmat imobilizarea biotinei pe suprafața nanocapsulelor
magnetice. Procesul de biotinilare nu a determinat o modificare semnificativă a dimensiunii medii a
particulelor, aceste particule prezentând dimensiuni de ordinul a 255 nm, dar a determinat o modificare a
potenţialului Zeta către valori negative, ceea ce indică că o parte din grupările amino au fost implicate în
legarea biotinei.
6. Particulele magnetice biotinilate prezintă proprietăţi magnetice adecavate (magnetizare de
saturaţie adecvată şi comportament superparamagnetic) și pot fi formulate ca suspensii injectabile,
caracteristici care confirmă potenţialul acestora de a fi folosite ca sisteme de tip teranostic.
7. Evaluarea in vitro a biodegradabilităţii nanoparticulelor magnetice s-a realizat în două medii
biologice simulate, în prezenţa lizozimului iar concentraţia în produşii de degradare a fost determinată prin
metoda fericianurii de potasiu. Rezultatele au confirmat capacitatea nanoparticulelor de a fi degradate în
organismul uman, deoarece lizozimul este prezent în diferite fluide biologice și țesuturi, inclusiv în celulele
canceroase mamare.
8. Particulele magnetice biotinilate au prezentat efecte antiproliferative in vitro pe celulele
MCF-7. Pe baza imaginilor de microscopie cu fluorescență s-a evidențiat faptului că particulele magnetice
biotinilate au fost internalizate în celulele MCF-7, cu mai mult succes decat particule magnetice
24
nefuncționalizate, confirmând rolul determinant al procesului de funcționalizare/biotinilare asupra
internalizării.
9. Pentru a studia efectele particulelor biotinilate în contact cu sângele, s-au realizat teste
convenţionale de coagulare care au constat în măsurarea timpului de protrombină şi a indicelui normalizat
internaţional. Rezultatele obtinute indica faptul că nu s-au observat modificări importante ale nici unui
parametru analizat şi confirmă că particulele biotinilate nu afectează activitatea protrombinei.
Bibliografie
(1) Misra R, Acharya S, Sahoo SK, Cancer nanotechnology: application of nanotechnology in cancer therapy. Drug Discov Today 15, 842–850, 2010.
(2) Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E, Forman D, Global Cancer Statistics, CA Cancer J Clin, 61, 69-90, 2011.
(3) Cole AJ, Yang VC, David AE, Cancer theranostics: the rise of targeted magnetic particles. Trends Biotechnol 29, 323-332, 2011.
(4) Rai P, Mallidi S, Zheng X, Rahmanzadeh R, Mir Y, Elrington S, et al, Development and applications of photo-triggered theranostic agents. Adv Drug Deliv Rev 62 1094–1124, 2010.
(5) Namdeo M, Saxena S, Tankhiwale R, Bajpai M, Mohan YM, Bajpai SK. Magnetic nanoparticles for drug delivery applications. J Nanosci Nanotechnol 8, 3247-3271, 2008.
(6) Wilhelm C, Fortin JP, Gazeau F. Tumour cell toxicity of intracellular hyperthermia mediated by magnetic nanoparticles. J Nanosci Nanotechnol 7, 2933-2937, 2007.
(7) Quang HV, Muthiah M, Kim YK, Cho CS, Namgung R, Kim WJ et al. Carboxylic mannancoated iron oxide nanoparticles targeted to immune cells for lymph node specific MRI in vivo, Carbohyd Polym, 88, 780-788, 2012.
(8) Shubayev VI, Pisanic TR, Jin S, Magnetic nanoparticles for theragnostics. Adv Drug Deliv Rev 61, 467–477, 2009.
(9) Dilnawaz F, Singh A, Sahoo SK, Transferrin-conjugated curcumin-loaded superparamagnetic iron oxide nanoparticles induce augmented cellular uptake and apoptosis in K562 cells. Acta Biomater, 8, 704–719, 2012.
(10) Sahu SK, Maiti S, Pramanik A, Ghosh SK, Pramanik P. Controlling the thickness of polymeric shell on magnetic nanoparticles loaded with doxorubicin for targeted delivery and MRI contrast agent. Carbohyd Polym 87, 2593– 2604, 2012.
(11) Chomoucka J, Drbohlavova J, Huska D, Adam V, Kizek R, Hubalek J, Magnetic nanoparticles and targeted drug delivering. Pharmacol Res 62 144–149, 2010.
(12) Ravanpay MR, Kusuma SY, Hansen SJ, Kwok D, Munoz NN, Sze RW et al. Tumor paint: a chlorotoxin: Cy5.5 bioconjugate for intraoperative visualization of cancer foci, Cancer Res 67 6882–6888, 2007.
(13) Weissleder R, Kelly K, Sun EY, Shtatland T, Josephson L, Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules, Nat Biotechnol 23, 1418–1423, 2005.
(14) Ouchi T, Yamabe E, Hara K, Hirai M, Ohya Y. Design of attachment type of drug delivery system by complex formation of avidin with biotinyl drug model and biotinyl saccharide. J Control Release 281–291, 2004.
(15) Nobs L, Buchegger F, Gurny R, Allemann E. Biodegradable nanoparticles for direct or two-step tumor immunotargeting. Bioconjugate Chem ,17,139–145, 2006.
(16) Lee ES, Na K, Bae YH, Super pH-sensitive multifunctional polymeric micelle, Nano Lett 5, 325–329, 2009.
(17) Yang W, Cheng Y, Xu T, Wang X, Wen LP, Targeting cancer cells with biotin–dendrimer conjugates. Eur J Med Chem, 44, 862–868, 2009.
(18) Kim JH, Li, Y, Kim MS, Kang SW, Jeong JH, Lee Ds, Synthesis and evaluation of biotinconjugated pH-responsive polymeric micelles as drug carriers. Pharmaceut Nanotech. Int J Pharm, 2012.
(19) Patil YB, Sadhukh T, Ma L, Panyam J, Nanoparticle-mediated simultaneous and targeted delivery of paclitaxel and tariquidar overcomes tumor drug resistance J Control Rel 136, 21–29, 2009.
25
(20) Patil YB, Swaminathan SK, Sadhukh T, Ma L, Panyam J. The use of nanoparticle-mediated targeted gene silencing and drug delivery to overcome tumor drug resistance. Biomaterials 31, 358–365, 2010.
(21) Roberts G.A.F. Structure of chitin and chitosan. In: Roberts GAF, editor. Chitin chemistry. Houndmills: Macmillan. 1992, 1–53.
(22) Gui-yin, H.K., Jiang Y., Ding P., Yang D., Biochem. Engineering J., 2008, 40, 408-414. (23) Chen JP, Yang PC, Ma YH, Wu T, Characterization of chitosan magnetic nanoparticles for in situ
delivery of tissue plasminogen activator. Carbohyd Polym 84, 364–372, 2011. (24) Wilson B, Samanta MK, Santhi K, Perumal K, Kumar S, Ramasamy M, Suresh B. Significant delivery of
tacrine into the brain using magnetic chitosan microparticles for treating Alzheimer’s disease. J Neurosci Meth 177, 427–433, 2009.
(25) Chiu YL, Ho YC, Chen YM, Peng SF, Ke CJ, Chen KJ, et al, The characteristics, cellular uptake and intracellular trafficking of nanoparticles made J Control Rel 146, 152–159, 2010.
(26) Balan V, Butnaru M, Verestiuc L. Synthesis and Characterization of Magnetic Nanoparticles Based on N-Palmitoyl-Chitosan with Potential Applications in Cancer Theranostics. Proceedings of the 4th ed. of E-Health and Bioengineering Conference-EHB 2013, Iasi, Romania, 21-23 Nov 2013, ISBN (Print): 978-1-4799-2372-4, www.dx.doi.org/10.1109/EHB.2013.6707322.
(27) Balan V, Dodi G, Tudorachi N, Ponta O, Simon V, Butnaru M, Verestiuc L. Doxorubicin-loaded magnetic nanocapsules based on N-palmitoyl chitosan and magnetite: synthesis and characterization; Chem Eng J 279, 188–197, 2015.
(28) Ma, G., Yang, D., Kennedy, J.F., & Nie, J. (2009). Synthesize and characterization of organic-soluble acylated chitosan. Carbohydrate Polymers, 75, 390–394.
(29) Cho, Y., Kim, J.T., & Park, H.J. (2012). Preparation, characterization and protein loading properties of N-acyl chitosan nanoparticles. Journal of Applied Polymer Science, 124, 1366–1371.
(30) Kayal, S. & Ramanujan, R.V. (2010). Doxorubicin loaded PVA coated iron oxide nanoparticles for targeted drug delivery. Materials Science and Engineering C, 30, 484–490.
(31) Unsoy, G., Khodadust, R., Yalcin, S., Mutlu P. & Gunduz, U. (2014). Synthesis of Doxorubicin loaded magnetic chitosan nanoparticles for pH responsive targeted drug delivery. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 62, 243–250.
(32) Bhattarai, S.R., Remant Bahadur Kc, Aryal, S., Khil, M.S., & Kim, H.Y. (2007). N-Acylated chitosan stabilized iron oxide nanoparticles as a novel nanomatrix and ceramic modification. Carbohydrate Polymers, 69, 467-477.
(33) Choi, Ch.Y., Kim, S.B., Pak, P.K., Yoo, D.I., & Chung, Y.S. (2007). Effect of N-acylation on structure and properties of chitosan fibers. Carbohydrate Polymers, 68, 122–127.
(34) Zhang, J., Chen, X.G., Li, Y.Y., & Liu, C.S. (2007). Self-assembled nanoparticles based on hydrophobically modified chitosan as carriers for doxorubicin. Nanomedicine 3, 258–265.
(35) Guo H., Zhang D., Li C., et al. Self-assembled nanoparticles based on galactosylated O-carboxymethyl chitosan-graft-stearic acid conjugates for delivery of doxorubicin International Journal of Pharmaceutics 458 (2013), 31– 38.
(36) Doina Hritcu, Marcel I.Popa, Niculina Popa, Vasile Badescu, Vera Balan, Preparation and characterization of magnetic chitosan nanospheres, Turk.J.Chem. 33(2009), 785-796.
(37) Balan V, Butnaru M, Bredetean O, Knieling L, Munteanu A, Verestiuc L. Design and Characterization of Biotinylated Magnetic Nanocapsules for Breast Cancer Applications. Proceedings of the 5th ed. of E-Health and Bioengineering Conference-EHB 2015, Iasi, Romania, 19-21 Nov 2053, acceptat spre publicare.
(38) Balan, V., Petrache, I.A., Popa, M.I., Butnaru, M., Barbu, E., Tsibouklis, J., & Verestiuc, L. (2012).
Biotinylated chitosan-based SPIONs with potential in blood-contacting applications. Journal of Nanoparticle
Research, 14, 1-14.
(39) T. Kean, M. Thanou. Biodegradation, biodistribution and toxicity of chitosan, Adv. Drug Deliver. Rev.
62 (2010) 3–11.
(40) Popa D. M., Stănciulescu A., Matei G.F., Tudor A., Zgăvărdici C., Chiriacescu R., Dicționar enciclopedic,
Editura Enciclopedică, 1993-2009.
(41) Kofuji K., Qian C.J., Nishimura M., Sugiyama I., Murata Y., Kawashima S., Relationship between
physicochemical characteristics and functional properties of chitosan, European Polymer Journal, Vol.41,
2784–2791, 2005.
26
(42) Balan V., Verestiuc L., Strategies to improve chitosan hemocompatibility: A review, European
Polymer Journal Vol.53, 171–188, 2014.
(43) F. Qian, F.Y. Cui, C.H. Yin, Preparation, characterization and enzyme inhibition of
methylmethacrylate copolymer nanoparticles with different hydrophilic polymeric chains, Eur. Polym. J. 42
(2006) 1653.
(44) F. Vizoso, E. Plaza, J. Vázquez, C. Serra, M.L. Lamelas, L.O. González, A.M. Merino, J. Méndez.
Lysozyme expression by breast carcinomas, correlation with clinicopathologic parameters, and prognostic
significance. Ann. Surg. Oncol. 8 (2001) 667–674.
(45) C. Riganti, C. Voena, J. Kopecka, P.A. Corsetto, G. Montorfano, E. Enrico, C. Costamagna, A.M. Rizzo,
D. Ghigo, A. Bosia, “Liposome-encapsulated doxorubicin reverses drug resistance by inhibiting P-glycoprotein
in human cancer cells”, Mol. Pharm. 8(3), 2011, 683–700.
(46) Gorbet M.B., Sefton M.V. Biomaterial-associated thrombosis: roles of coagulation factors,
complement, platelets and leukocytes. Biomaterials. 2004, 25, 5681–5703.
(47) T. Wang, W. C. Hartner, PhDa, J. W. Gillespie, K. P. Praveen, S. Yang, L. A. Mei, V. A. Petrenko, V. P.
Torchilin. Enhanced tumor delivery and antitumor activity in vivo of liposomal doxorubicin modified with
MCF-7-specific phage fusion protein. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 10 (2014) 421–
430.
Director proiect,
Dr. bioing. Vera Balan