+ All Categories
Home > Documents > RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de...

RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de...

Date post: 20-Sep-2019
Category:
Upload: others
View: 8 times
Download: 1 times
Share this document with a friend
104
1 RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE Axa prioritară 2: Competitivitate prin Cercetare, Dezvoltare Tehnologică şi Inovare Operaţiunea: O.2.1.2 „Proiecte CD de înalt nivel ştiinţific la care vor participa specialişti din străinătate” Numărul de înregistrare din SMIS - CSNR: 692-12650 Contract de finanţare nr.: 211/20.07.2010 Acronimul Proiectului: GPN2 Numele proiectului: PROFILUL GENIC AL CANCERELOR BRONHO-PULMONARE PRIMITIVE CU CELULE NON—MICI SI INVAZIA GANGLIONILOR MEDIASTINALI Raport final Perioada: 20 iulie 2010 – 19 mai 2014 Numele si titlul reprezentantului stiintific al proiectului: Profesor Doctor Jean-François REGNARD, Director de Proiect
Transcript
Page 1: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

1

RAPORT STIINTIFIC FINAL

POS CCE

Axa prioritară 2: Competitivitate prin Cercetare, Dezvoltare Tehnologică şi Inovare

Operaţiunea: O.2.1.2 „Proiecte CD de înalt nivel ştiinţific la care vor participa specialişti din

străinătate”

Numărul de înregistrare din SMIS - CSNR: 692-12650

Contract de finanţare nr.: 211/20.07.2010

Acronimul Proiectului: GPN2

Numele proiectului: PROFILUL GENIC AL CANCERELOR BRONHO-PULMONARE PRIMITIVE

CU CELULE NON—MICI SI INVAZIA GANGLIONILOR MEDIASTINALI

Raport final

Perioada: 20 iulie 2010 – 19 mai 2014

Numele si titlul reprezentantului stiintific al proiectului:

Profesor Doctor Jean-François REGNARD, Director de Proiect

Page 2: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

2

RAPORT STIINTIFIC

aferent Raport Final Proiect

CUPRINS Pagina

Introducere

A1. Generarea materialului biologic preterapeutic pentru investigatia genomica si activitati specifice bancii de tesuturi si organe

A2. Definirea loturilor de prognostic

A3. Prepararea esantioanelor pentru analiza genomica

A4. Analiza genica

A5. Analiza bioinformatică

A6. Validarea rezultatelor de microarray

A7. Secventierea pentru genele candidate

A8. Validarea tehnicilor de Tissue-Array pe limfoganglion in aprecierea prognosticului. Validarea tehnicilor de Tissue-Array in comparatie cu tehnicile de micro-array

Discutii

Concluzii

Bibliografie

Anexa 1 Aprobare Comisii de Etica si Protectie a Persoanelor din Franta si Austria. Autorizatie AFSSAPS – Agentia Franceza de Securitate Sanitara a Produselor de Sanatate. Asigrari Cecetare Biomedicala.

Anexa 2 Protocoale de lucru adaptate fiecarui centru

3

21

26

28

32

44

55

58

77

82

87

89

106

Page 3: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

3

INTRODUCERE

Chimioterapia citotoxica standard este eficienta pentru anumite tipuri de cancer, dar pentru

multe alte tipuri, tratamente disponibile oferă doar un beneficiu de supravietuire limitat.

Cancerul pulmonar este un astfel de cancer. Dezvoltarea de terapii specifice este cea mai mare

promisiune pentru tratarea cu succes a aceastei boali, dar o abordare orientată depinde de

înțelegerea genomului celulelor tumorale. Secventierea exonunului unui număr mare de probe

tumorale de cancer pulmonar a oferit o primă imagine a profilului mutațiilor somatice a acestor

tumori. Astfel de studii de secventiere au confirmat frecventa mare de mutatii TP53 și KRAS în

cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori

cunoscute si neasociate anterior cu cancerul pulmonar, și au identificat mutatii oncogene ale

EGFR pe care s-a bazat prima terapie tintita pentru adenocarcinomul pulmonar. Si alte oncogene

candidate așteaptă validarea funcționala. Este de asteptat ca secventierea viitoare a întregului

exom și a intregului genom al cancerului pulmonar sa dezvăluie un peisaj mai detaliat al

mutațiilor somatice care pot fi exploatate în scopuri terapeutice.

Cancerul pulmonar este principala cauza de deces prin cancer în lume reprezentand aproximativ

1,2 milioane de decese in fiecare an [1]. La momentul diagnosticului, 30% dintre pacienti sunt

diagnosticati intr-un stadiu local avansat, pentru care strategia de tratament este încă

controversată și depinde starea patologica a ganglionilor limfatici. Rata de supravietuire globala la

5 ani a cancerului pulmonar este de numai 16%, în mare măsură determinată de frecvența mare a

diagnosticului tardiv, cu tumori nonrezecabile [1]. Cancerul pulmonar poate fi clasificat din punct

de vedere histologic, în 4 mari categorii: adenocarcinom pulmonar, carcinom cu celule

scuamoase, si carcinom cu celule mari, care formeaza cancerul pulmonar cu celule non-mici

(CPCNM), și carcinomul pulmonar cu celule mici [2].

Rata de supravietuire foarte redusa a cancerului pulmonar reflectă insuficiența chimioterapiei

citotoxice traditionale; tratamentele specifice orientate catre anumite puncte slabe ale celulelor

tumorale sunt cea mai importanta promisiune pentru viitor. Mutațiile somatice care activează

oncogene duc frecvent la dependența celulelor tumorale de produsele oncogenice modificate

[3,4] o proprietate exploatata de terapia tintita. Prin urmare, identificarea leziunilor oncogenice

Page 4: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

4

recurente de care depinde supravietuirea celulei tumorale ar putea duce la noi terapii ale

cancerului pulmonar.

Un experiment pe scară largă de secventiere directa a exomului tumoral, Proiectul de Secventiere

Tumorala (TSP), a fost realizat cu scopul de a determina mutațiile somatice recurente în

adenocarcinomul pulmonar. În acest experiment, toți exonii codanti a 623 de gene cu rol in

oncogeneza, au fost secventiate în 188 de perechi de ADN tumori / tesut normal, ceea ce a dus la

identificarea de 1.013 mutații somatice nonsinonime [5]. Analiza statistică a indicat 26 de gene cu

mutatii semnificative.

Aceste 26 de gene cu mutatii semnificative au inclus mai multe oncogene și genele supresoare

deja cunoscute a fi implicate in cancerul pulmonary: KRAS, TP53, STK11, EGFR, și CDKN2A. In plus

au mai fost identificate cateva gene cu mutatii semnificative, neidentificate pana atunci in

adenocarcinomul pulmonar, inclusive cateva gene supresoare cunoscute si cateva gene ale tirozin

kinazei care sunt in curs de validare functionala.

Descriem aici cunostintele actuale in legatura cu genomul cancerului pulmonar, subliniind

implicatiile terapeutice.

Cunostintele viitoare rezultate din secventierea intregului exom si a intregului genom, facilitate

de tehnologii de secventiere de ultimă generație, va revoluționa probabil inca o data intelegerea

genomului acestei boli.

MUTATII GENICE CUNOSCUTE IN CANCERUL PULMONAR

Mutatii exclusive

Modificări somatice ale 7 oncogene in cancerul pulmonar [6]: KRAS, EGFR, ALK, ERBB2, BRAF

HER2 și ROS1 se exclud reciproc. Cinci dintre aceste gene (KRAS, EGFR, ALK, ERBB2, BRAF) sunt

regasite în mai mult de 50% din adenocarcinoamele pulmonare. De fapt, pacientii cu mutatii in

aceste cinci gene pot reprezenta până la 90% dintre pacientii asiatici care nu au fumat niciodata

[7]. Prin urmare, posibilitatea de a inhiba terapeutic functiile acestor gene modificate ar

reprezenta un progres semnificativ in lupta impotriva cancerului pulmonar.

Page 5: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

5

KRAS

La om, au fost identificate trei gene RAS diferite: KRAS (omoloagă cu oncogena virusului lui

Kirsten al sarcomului șobolanului), HRAS (omoloagă cu oncogena virusului lui Harvey al

sarcomului șobolanului) și NRAS (inițial izolată de la un neuroblastom uman). Diferitele gene RAS

sunt foarte asemanatoare structural, dar distincte funcțional. Proteine RAS sunt GTPaze mici, care

trec de la forme inactive legate de guanozin difosfat (GDP) în forme active legate de trifosfat

guanozina (GTP). Proteine RAS sunt mediatori cheie în aval de receptorii factorilor de creștere și

sunt esentiale pentru proliferarea, supraviețuirea și diferențierea celulelor. RAS are capacitatea

de a activa caile de semnalizare in aval din celulă. Aceste cai includ calea PI3K - AKT - mTOR, care

este implicată în supraviețuirea celulară, si calea RAS - RAF - MEK - ERK, care este implicată în

proliferarea celulară.

RAS a fost implicat în patogeneza mai multor tipuri de cancer. Mutațiile activatoare ale genei RAS

au ca si consecinta activarea constitutiva aRAS GTPazei, chiar și în absența semnalizării de catre

factorii de creștere. Rezultatul este un semnal continuu de proliferare celulară. Gene specifice

RAS sunt frecvent mutate in diferite forme de cancer. Mutatiile KRAS sunt deosebit de frecvente

in cancerul de colon, cancerul pulmonar, si cancer pancreatic [8].

Mutatii KRAS în cancerul pulmonar cu celule non mici (CPCNM)

Aproximativ 15-25 % dintre pacientii cu adenocarcinom pulmonar au mutatii KRAS. Mutatiile

KRAS sunt rare în carcinoamele cu celule scuamoase [9]. In cele mai multe cazuri, aceste mutatii

sunt mutații non-sens rezultate prin înlocuirea unui aminoacid la poziția 12 (cel mai frecvent), 13

sau 61. Acest lucru duce la activarea constitutiva a căilor de semnalizare ale KRAS. Mutatii KRAS

sunt găsite în tumori atat la fumatori cat si la fosti fumatori si nefumatori. Ele sunt mult mai rare

la nefumatori, precum și la pacientii asiatici, comparativ cu cei nord-americani sau europeeni [7,

10, 11]. KRAS nu pare a avea o valoare prognostica in CPCNM netratat [12]. Foarte putine studii

prospective randomizate au fost efectuate folosind KRAS ca un biomarker pentru stratificarea

optiunilor terapeutice in tratamentul cancerului metastatic. Spre deosebire de cancerul de colon,

mutațiile KRAS in CPCNM nu sunt un predictor negativ al rezultatului tratamentului prin anticorpi

anti - EGFR. In schimb, mutatiile KRAS sunt un factor predictiv negativ al răspunsului radiologic la

Page 6: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

6

inhibitori ai tirozin kinazei EGFR, gefitinib si erlotinib [10, 13]. Intr-un studiu care a inclus 17 de

pacienți cu mutații KRAS, ganetespibul, un inhibitor de HSP90, a demonstrat o activitate redusa

[14]. La om, în asociere cu docetaxel, selumetinib, un inhibitor de MEK1/MEK2, a demonstrat o

activitate la pacientii aflati in tratament de linia a doua pentru CPCNM metastatic avand un KRAS

mutant. In acest studiu randomizat, perioada fara récidiva (PFR) a fost de 5,3 luni în grupul

selumetinib / docetaxel față de 2,1 luni in grupul placebo / docetaxel (HR 0,58 p = 0,014) [15].

In prezent, nu există nici un medicament cu efect direct anti KRAS.

EGFR

Receptorul factorului de crestere epidermica (EGFR) aparține unei familii de receptori de tirozin

kinaza (RTK), care includ EGFR/ERBB1, HER2/ERBB2/NEU, HER3/ERBB3 și HER4/ERBB4. Legarea

liganzilor, cum ar fi factorul de creștere epidermal (EGF) induce o modificare conformațională

care permite homo-sau hetero-dimerizarea receptorului, iar rezultatul este începutul activității

EGFR kinazei. Astfel activat, EGFR isi fosforileaza substraturi sale, ducând la activarea mai multor

căi de semnalizare in aval, din celula: PI3K-AKT-mTOR, care este implicată în supraviețuirea

celulară, și RAS-RAF-MEK- ERK, care este implicată în proliferarea celulară.

Mutatii EGFR in cancerul pulmonar cu celule non-mici (CPCNM)

Aproximativ 10% dintre pacientii cu CPCNM în SUA și 35% în Asia de Est au mutatii EGFR in tumori

[16-18]. Aceste mutații se produc în exonii 18 și 21 ai genei EGFR, care codifică o porțiune din

domeniul kinazei a receptorului. Aproximativ 90% dintre aceste mutatii sunt deletii în exonul 19

sau mutații punctuale L858R în exonul 21 [19]. Aceste mutații determine cresterea activitatea

kinazei EGFR, care duce la hiperactivarea căilor de semnalizare in aval [20] și o sensibilitate la

tratamentul cu inhibitori ai tirozin kinazei [19]. Cu toate acestea, anumite mutații (inserții in

exonul 20, mutatia T790M) semneaza prezenta unei rezistențe initiale sau, mai frecvent,

dobandita la inhibitorii de tirozin kinaza [21).

Indiferent de apartenenta etnica, mutatiile EGFR sunt mult mai frecvent în tumorile de tip

adenocarcinom la pacientii nefumători (definiti ca mai putin de 100 de tigari in viata pacientului),

Page 7: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

7

de sex feminin [16-18]. Cu toate acestea, mutatii EGFR pot fi de asemenea găsite si în alte

subgrupuri de CPCNM: fumatori actuali si fosti fumatori, alte tipuri histologice.

ALK

Fuziuni ale genei ALK sunt prezente la aproximativ 3-7% din tumorile pulmonare. Prezența lor a

demonstrat eficacitatea primului inhibitor de ALK, crizotinib.

ALK este un receptor de tirozin kinază, care poate fi anormal în multe tipuri de cancer. De

exemplu, mutații activatoare ale ALK sunt găsite în unele neuroblastoame [22-25]. Fuziuni ALK au

fost descrise în limfomul anaplazic cu celule mari (NPM-ALK) [26], la tumori myofibroblastice

inflamatorii (IMT) [27] și in cancerul pulmonar cu celule non-mici (CPCNM) [28-32]. Toate

fuziunile ALK conțin intregul domeni tirozin kinaza al receptorului. Până în prezent, toate fuziunile

ALK evaluate biologic au demonstrat o activitate oncogenica in vitro și in vivo [26, 28, 31, 32].

Diferitii partenerii de fuziune N-terminală favorizeaza dimerizarea și prin urmare activitatea

kinazei [33]. Semnalizare in aval a acestor fuziuni se traduce prin activarea cailor implicate în

creșterea și proliferarea celulară.

Fuziuni ALK în cancerul pulmonar cu celule non mici (CPCNM)

Fuziuni ale genei ALK sunt prezente la aproximativ 3-7% din tumorile pulmonare [29, 31, 34-37].

Aceste fuziuni ALK sunt mai des intalnite in randul fumatorilor de mici cantitati (<10 PA) și / sau

ne-fumatori [29, 31, 34, 37, 38]. Fuziuni ALK sunt de asemenea mai frecvente în tumorile la tineri

[34, 37, 38] in adenocarcinoamele cu componenta acinara [37, 38], sau prezenta de celule în inel

cu pecete [34].

Terapeutic, prezența fuziuni EML4-ALK este asociata cu rezistenta la inhibitori de EGFR (EGFR TKI)

[39].

Mai multe tipuri de rearanjari de ALK au fost descrise în CPCNM. Majoritatea acestor variante de

fuziune cuprind o parte a genei EML4 asociată cu gena ALK. Au fost identificate cel puțin nouă

variante de fuziune EML4-ALK în CPCNM [28, 29, 31, 32, 36, 37, 40]. In plus, au fost identificate

variante de fuziune non-EML4, de exemplu KIF5B-ALK [32] și TFG-ALK [30]. În practică, prezenta

unei rearanjari a ALK este detectata prin fluorescenta in hibridizarea in situ (FISH). FISH nu poate

Page 8: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

8

determina subtipul specific de fuziune ALK prezenta într-o probă de tesut. Dezvoltarea detectarii

anomaliilor ALK prin RT-PCR [41] ar trebui să permita identificarea subtipurilor de anomalii. In

plus, rezultatele RT-PCR par să fie bine corelate cu cele ale FISH. S-a dovedit ca rearanjarea ALK ar

putea fi, de asemenea, detectata pe celule tumorale circulante printr-o tehnica FISH modificata.

Această tehnică permite realizarea testului atunci cand nu este disponibil tesut tumoral și

urmărirea evoluției în timp a numărului acestor celule [42]. În fine, au început să se dezvolte

tehnici de imunohistochimie pentru a detecta anomalii ale ALK [43].

În cele mai multe cazuri, prezenta unei rearanjari ALK exclude prezenta altor mutatii oncogene în

CPCNM (mutatii EGFR, mutații KRAS, etc). [34, 35, 37, 38, 44]. Cu toate acestea, a fost descrisă

coexistența cu alte anomalii moleculare (mutatii EGFR și mai ales MET) [45].

Crizotinibul (Xalkori), un inhibitor de ALK și al receptorului c-Met, a fost recent aprobat de către

autoritățile americane și europene în tratamentul CPCNM la pacientii care prezinta o fuziune ALK

[46].

Într-un studiu de faza I care implica 149 de pacienti cu fuziune ALK, rata de raspuns radiologic a

fost de 61% la tratamentul cu crizotinib, un inhibitor (TKI) de ALK / MET [47]. Mediana de

supravietuire fara progresiune a fost de 9,7 luni, iar 75% dintre pacienti au fost in viata la un an.

Un studiu international de faza III, randomizat, in cancerul pulmonar avansat ce prezinta fuziuni

ALK, a comparat crizotinibul cu chimioterapia standard, ca tratament dupa progresia bolii dupa

tratamentul standard in prima linie. Rezultatele arata un beneficiu pentru crizotinib în termeni de

supraviețuire fără progresia bolii 7.7 luni vs 3.0 luni pentru chimioterapia standard [48]. Noi

Inhibitori de ALK sunt în dezvoltare, cum ar fi CH5424802, care a dat o rată de răspuns de 93,5%

într-un studiu de faza 2 la pacienti netratati anterior cu inhibitor de ALK [49].

Sensibilitate la pemetrexed la pacientii cu cancer pulmonar ce prezinta o rearanjare ALK a fost

obiectul unor studii rétrospective care nu au permis se se faca o concluzie. Un studiu a aratat ca

pacientii cu cancer pulmonar și o rearanjare ALK au avut o rata de raspuns si o supravietuire fara

progresie mai buna daca au fost tratati cu pemetrexed în monoterapie sau în combinație [50].

Trebuie remarcat faptul că nici unul dintre pacienți ALK inclusi în acest studiu nu au fost tratați

anterior cu crizotinib. În schimb, un alt studiu retrospectiv a aratat o supravietuire fara progresie

similara cu ceea a pacientilor fara acest tip de anomalie [51].

Page 9: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

9

Într-un studiu ne-randomizat de fază II a IPI-504, un inhibitor de HSP-90, la pacienții cu cancer

pulmonar avansat, aflati in progresie sub tratament cu EGFR TKI, tumorile a trei dintre pacienti s-

au dovedit a avea o rearanjare ALK. Doi dintre acesti pacienti au avut un raspuns partial, iar cel

de-al treilea au avut o stabilizare prelungita a bolii (7.2 luni, scadere de 24% a dimensiunii

tumorii) [52]. Într-un studiu de fază 2 a unui alt inhibitor de HSP-90, ganetespib, 7 din 8 pacienți

cu cancer pulmonar și o rearanjare ALK, netratati cu crizotinib, au avut un beneficiu clinic sub

formă de răspuns parțial (4 pacienti) sau boala stabila (3 pacienți) [14].

Până în prezent au fost găsite mai multe mutații punctiforme în domeniul tirozin kinazei ALK la

pacienții cu rezistență dobândită la crizotinib, inhibitor TKI ALK.

Prin rezistența dobândita se intelege progresia maladiei, după un răspuns inițial obținut cu

tratamentul aplicat. In prezent nu sunt bine cunoscute mecanismele de dobândirea rezistenței la

crizotinib, inhibitorul de ALK / MET. Caeva studii pe cohorte mici de pacienti au aratat ca mutatii

in domeniul kinazei a ALK pot duce la rezistență dobândită la crizotinib. Mutațiile descrise pot

conferi diferite grade de sensibilitate sau rezistenta la ALK TKI de a doua generație.

Noi strategii terapeutice sunt in curs de evaluare la pacienții cu CPCNM ALK +, cu scopul de a trata

sau preveni rezistența asociată cu aceste mutații [53].

ERBB2

Mutații somatice ale ERBB2 au fost descrise in adenocarcinomul pulmonar pentru prima dată în

același an ca și mutatiile EGFR, deși la o frecvență mai mică, de aproximativ 2-4% [54,55]. Aceste

mutații sunt de obicei mici insertii in domeniului kinazei al exonului 20, analog mutatiilor de

rezistenta primara ale EGFR în exonul paralog 20. ERBB2 este un receptor tirozin kinaza care nu

leagă nici un ligand cunoscut, dar homodimerizeaza sau heterodimerizeaza cu EGFR și alte

membri ai familiei ERBB, ERBB3 si ERBB4, pentru a activa semnalul cailor in aval [56]. Aceste

mutatii sunt activatoare si stau la baza testelor de transformare a oncogenelor celulare și răspund

în vitro la inhibitorii ireversibili ai EGFR, care de asemenea leaga si inhiba ERBB2 [57, 58-60].

Ramane de demonstrat in ce masura acesti inhibitori sunt eficienti clinic impotriva mutatiilor in

domeniul kinazei ale ERBB2 găsite în adenocarcinomul pulmonar. Anticorpul Trastuzumab ce activ

Page 10: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

10

in cancerul de san nedeterminat pentru ERBB2 amplificat, nu este promițător în modelele

preclinice cu ERBB2 mutant [60-62].

Mutații oncogene sensibile la medicamente ale domeniului extracelular al EGFR au fost descrise

în glioblastom [63,64] ceea ce sugereaza posibilitatea ca mutații ale domeniului extracelular al

ERBB2 sa fie găsite de asemenea, la pacienții cu cancer. De fapt, în adenocarcinomul pulmonar a

fost raportat existenta mutației S310F, mutatie codanta ERBB2. Aceasta mutatie, deși nu

frecventă în adenocarcinomul pulmonar, a fost gasita si in alte tipuri de cancer, și este oncogenica

și sensibila la inhibitori ireversibili de EGFR / ERBB2 in vitro, subliniind necesitatea de a cauta

dincolo de domeniul kinazei al ERBB2 pentru a gasi mutații somatice activatoare relevante clinic.

BRAF

BRAF este o kinază care joacă un rol cheie în calea de semnalizare a kinazelor MAP. In cancerul

pulmonar, aceste mutatii sunt rare și sunt în mare parte regăsite la adenocarcinomul fumatorilor.

BRAF aparține unei familii de serin-treonin kinaze care include ARAF, BRAF, și CRAF (RAF1).

Kinazele RAF sunt mediatori cheie in calea de semnalizare a MAP kinazei. Ele își exercită efectul in

mod principal prin fosforilarea și activarea MEK care are loc prin dimerizare (homo sau hetero-) a

moleculelor RAF. Ca parte din calea MAP kinazei, RAF joaca un rol esential in multe procese

celulare, cum ar fi proliferarea, diferențierea și reglementarea transcrierii.

Mutatii ale BRAF au fost implicate în patogenia mai multor tipuri de cancer, incluzand melanomul,

cancerul pulmonar cu celule non-mici, cancerul colorectal, cancerul papilar tiroidian, și cancerul

ovarian [65].

Mutatii BRAF în cancerul pulmonar cu celule non mici (CPCNM)

Mutatiile somatice ale BRAF au fost gasite in aproximativ 3-5% din CPCNM [9, 65-68], în principal

în adenocarcinoame. Mutatiile BRAF se gasesc in principal la fumători sau foști fumători [66, 67,

69].

Spre deosebire de melanom unde majoritatea mutatiilor BRAF apar pe valina 600 (mutația V600)

în exonul 15 al domeniului kinazei, mutatiile BRAF in cancerul pulmonar apar și la alte niveluri ale

domeniului kinazei. Într-un studiu pe 739 de pacienti cu adenocarcinom pulmonar, 36 de pacienți

Page 11: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

11

prezentau mutatii BRAF (4,9%). La acești 36 de pacienți, mutatiile BRAF identificate au fost de

tipul V600E la 57% din aceste cazuri si non V600E la 43% din cazuri [68]. Intr-o alta serie a fost

gasita o proporție de 50% V600E și 50% non V600E [70].

HER2

Mutatiile HER2 sunt rare în cancerul pulmonar. Rezultatele preliminare sugerează eficacitatea

unor terapii anti HER2.

HER2 aparține unei familii de receptori de tirozin kinaza (RTKs), care includ EGFR/ERBB1,

HER2/ERBB2/NEU, HER3/ERBB3 și HER4/ERBB4. Gena HER2 este localizată pe cromozomul 17 ;

acesta este amplificat cu mai multe copii ale genei în diferite tipuri de cancer [71].

Nu se cunosc in ziua de azi liganzi HER2. Cu toate acestea, HER2 pare a fi partenerul de dimerizare

preferat pentru toți receptorii familiei ERBB [72]. Legarea ligantilor, urmată de hetero dimerizarea

receptorului détermina activarea activității de kinază a HER2. HER2 activat iși fosforileaza

substraturile sale, ducând la activarea mai multor căi de semnalizare în aval în celulă. Aceste cai

includ PI3K - AKT - mTOR, care este implicată în supraviețuirea celulară, si calea RAS - RAF - MEK -

ERK, care este implicată în proliferarea celulara.

Mutatii HER2 în cancerul pulmonar cu celule non mici (CPCNM)

Mutatiile HER2 se gasesc in aproximativ 2-4 % din CPCNM [54, 55, 73]. Cea mai frecventa mutatie

este o inserție în exonul 20 [74]. Mutatiile HER2 sunt mai frecvente la nefumatori (definit ca mai

putin de 100 de tigari fumate pe durata viații), si in adenocarcinom [54, 55, 73, 74]. Cu toate

acestea, mutațiile HER2 pot fi găsite în alte subtipuri de CPCNM, inclusiv la fumători sau foști

fumători, sau in prezenta alte tipuri histologice [54, 55, 73]. Insertiile de la nivelul exonului 20

antreneaza o hiperactivitate a HER2 kinazei, urmata de activarea caii de semnalizare în aval,

avand ca rezultat : creșterea supravietuirii celulare, invazia și dezvoltarea tumorii [60].

Amplificare HER2 nu pare legate de mutatii HER2 [55, 73]. Și spre deosebire de ceea ce se observă

în cancerul de sân, amplificarea HER2 nu este un factor de prognostic in CPCNM.

ROS1

Page 12: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

12

Fuziunile genei ROS1 sunt prezente în aproximativ 2 % din tumorile pulmonare. Rezultate

preliminare indica eficacitatea crizotinib, un inhibitor de ALK / MET cu actiune asupra ROS1.

ROS1 este un receptor de tirozin kinază (RTK) aparținând familiei de receptori de insulină.

Rearanjamente cromozomiale care implică gena ROS1, la nivelul cromozomului 6q22, au fost

descrise inițial în glioblastoame (de exemplu, FIG - ROS1) [75-77]. Mai recent fuziuni ale ROS1 au

fost identificate ca anomalii cauzale în cancerul pulmonar cu celule non mici [30].

Fuziunile ROS1 încorporează un domeniu tirozin kinază intact. Biologic, fuziunile care au fost

studiate au activitate oncogenica [30, 77]. In aval de fuziunile ROS1, semnalizarea activeaza caile

celulare cunoscute ca fiind implicate in cresterea si proliferarea celulelor. In vitro, fuziunile ROS1

sunt asociate cu o sensibilitate la inhibitori ai tirozin kinazei activi pe ROS1 [78].

Fuziuni ROS1 în cancerul pulmonar cu celule non mici (CPCNM)

S-au găsit fuziuni ROS1 în aproximativ 2 % din cazurile de cancer pulmonar [79]. La fel ca si pentru

fuziunile ALK, fuziunile ROS1 sunt mai des intalnite in randul fumatorilor mici (< 10 pachete ani) și

/ sau nefumatorilor. Fuziunile ROS1 sunt mai des asociate cu vârstele tinere și histologie de

adenocarcinom [79]. Două serii asiatice recente au raportat 31 de cazuri de fuziuni ROS1 ; toate

cazurile au fost adenocarcinom [80, 81]. La modelele preclinice, fuziunile ROS1 arată o

sensibilitate la inhibitorii de tirozin kinaza care prezintă o activitate colaterala pe ROS1, cum ar fi

crizotinibul [79]. Doi pacienti cu CPCNM metastatic și fuziune ROS1 a avut un raspuns partial la

crizotinib [79, 82].

Au fost gasite mai multe rearanjamente ROS1 în CPCNM. Acestea includ SLC34A2 - ROS1 și CD74 -

ROS1 [78]. În practică, prezența unei rearanjari ROS1 este detectata prin hibridizare in situ in

fluorescenta (FISH) folosind o sondă ROS1 "break apart". FISH nu determina subtipul specific de

fuziune ROS1 prezent in proba de tesut.

Mutatii non-exclusive

Page 13: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

13

DDR2

DDR2 (Discoidin Death Receptor 2) este un membru al familiei de receptori de tirozin kinaza DDR

care sunt stimulate de colagen și nu de factori de creștere peptidici. Semnalizarea in aval in

celulele canceroase nu este bine cunoscuta, dar ar putea fi facuta prin caile de semnalizare SRC si

STAT. Ca și la receptorii integrină, DDR2 poate juca un rol prin modularea interacțiunilor celulare

cu matricea extracelulară.

Mutații DDR2 au fost găsite (nu foarte frecvent) in cateva tipuri de cancer, inclusiv carcinom cu

celule renale, glioblastomul multiform, cancer endometrial, cancer colorectal (Catalogue of

Somatic Mutations in Cancer - COSMIC). Cel mai frecvent se intalneste in carcinomul pulmonar cu

celule scuamoase [83].

Mutații DDR2 au fost găsite în 3,8% din carcinoamele cu celule scuamoase ale plămânului, dar la

mai puțin de 1% din tumorile cu celule non-scuamoase ale plămânului [COSMIC; 83]. Nici o locație

specifică nu a fost identificata, mutațiile fiind in domeniul kinazei si al discoidinei (acesta din urmă

fiind parte a regiunii extracelulare care se leaga de colagen; 84). Nu au fost raportate nici

supraexprimari ale DDR2 nici modificări ale numărului de copii ale locusului DDR2 (1q23).

Caracteristicile clinice ale pacientilor cu mutatii DDR2 sunt puțin cunoscute, și nici o asociere

semnificativă cu sexul, vârsta, sau fumatul nu a fost găsita.

FGFR1

Amplificările FGFR1 genei sunt frecvente, găsite în aproximativ 20% din cancerul pulmonar cu

celule scuamoase și legate de fumat. Inhibitori de FGFR sunt în curs de dezvoltare.

Gena receptorului factorului de creștere a fibroblastelor de tip 1 (FGFR1) codifică unul dintre

subtipurile familiei receptorilor FGFR ai tirozin kinazei (TK). In total sunt patru astfel de familii:

FGFR1, 2, 3, și 4. FGFR TK au un rol-cheie în dezvoltare și sunt de multe ori deregulate în cancer,

prin fenomene de amplificare, mutații punctuale, sau translocatii [85]. Fenomene de amplificare

sau de aleactivare a FGFR1 au fost descrise în numeroase tipuri de cancer, inclusiv cancer cu

celule scuamoase ale gurii [86], cancerul de sân [85], carcinom cu celule scuamoase de esofag

[87] cancerul ovarian [88], cancer de vezica urinara [89], cancerul de prostata [90], și cancer

pulmonar, in special cu celule scuamoase [91- 93].

Page 14: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

14

Mutatii FGFR1 în CPCNM

Amplificări ale FGFR1 se găsesc în principal în pulmonar cu celule scuamoase, la pacienti fumatori

sau fosti fumatori. La pacienții asiatici, amplificarea FGFR1 este legată de importanța

tabagismului ; este de asemenea un factor independent de prognostic prost [94]. Regiunea

cromozomiala 8p12 pe care se afla locusul genei FGFR1 este amplificat în ~ 20% din tumorile

pacienților cu cancer pulmonar cu celule scuamoase. Modificări în numărul de copii ale genei au

fost identificate cu diferite tehnici, printre care hibridizare in situ in fluorescenta (FISH) [91, 93,

95]; semnificația clinică a pragurilor de pozitivitate a testelor nu este determinata pana in

prezent. La pacienții care suferă de alte tipuri histologice de cancer pulmonar cum ar fi

adenocarcinoamul, amplificarea FGFR1 este rara (mai puțin de 2%) [94]. Regiunea cromozomiala

8p12 pe care se afla locusul genei FGFR1 este amplificat în ~ 20% din tumorile pacienților cu

cancer pulmonar cu celule scuamoase. Modificări în numărul de copii ale genei au fost

identificate cu diferite tehnici, printre care hibridizare in situ in fluorescenta (FISH) [91, 93, 95].

Date preclinice sugerează că celulele canceroase care prezintă o amplificare a FGFR1 sunt

dependente de calea de semnalizare FGFR.

MET

Anomaliile MET întâlnite în cancerul pulmonar constau în principal dintr- o amplificare genica, în

special prezenta la pacienții cu mutații EGFR, și rezistenti la inhibitori de tirozin kinaza.

Gena MET (gena de transformare MNNG - HOS [96]), localizată pe cromozomul 7, codifică pentru

un receptor de tirozin kinază (RTK) aparținând familiei MET / RON. Legarea ligandului, factorul de

creștere a hepatocitelor (HGF, de asemenea, cunoscut ca scuatter factor (SF)), produce o

modificare conformațională a receptorului MET care induce fosforilarea și activarea receptorului.

MET astfel activât, iși fosforileaza substraturile sale, ducând la activarea mai multor căi de

semnalizare în aval în celulă. Aceste cai includ PI3K - AKT - mTOR, care este implicată în

supraviețuirea celulară, si calea RAS - RAF - MEK - ERK, care este implicată în proliferarea celulară.

În cancer, semnalizarea anormala la nivelul receptorului MET induce reacții ce procesul de

metastazare [97, 98].

Page 15: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

15

S-a arătat că receptorul MET și ligantul său HGF au fost anormal activate in multe cancere la om

(vezi http://www.vai.org/met/). Mutatii germinale in domeniul tirozin kinazei a MET se găsesc în

100 % din cazurile de cancer renal papilar ereditar , și mutații somatice ale MET sunt prezente în

10-15 % din carcinoamele papilare renale sporadice [99]. Cu o frecvență mai mică, au fost gasite

mutatii ale MET in cazurile de cancer cu celule scuamoase al capului si gatului [100], în carcinomul

hepatocelular al copilului [101], în CPCNM [102, 103] și în cancerul pulmonar cu cellule mici [103].

Amplificări MET au fost descrise în cancerul gastric [104], în cancerul de esofag [105], în cancerul

colorectal [106], în glioame [107] în cancerul ovarian cu celule clare [108] si CPCNM [109-115].

MET în cancerul pulmonar cu celule mici non (CPCNM)

Au fost descrise mai multe mecanisme de activare a MET în CPCNM, inclusiv amplificarea genica

[109-115] si a mutatiilor [102, 103].

Nu este cunoscută activitatea inhibitorilor de MET în CPCNM și în cancerul pulmonar cu cellule

mici, pentru tumorile cu mutatii in afara domeniului kinazei. În schimb, au fost raportate

răspunsuri la foretanib (XL880 sau GSK136308), un inhibitor al MET și a altor tirozin kinaze,

inclusiv VEGFR2, activ pe cale orala, la pacientii cu carcinom papilar renal [116].

O supraexprimare a proteinei în țesutul tumoral comparativ cu țesutul normal adiacent, este

prezenta in 25-75 % din CPCNM și este un factor de prognostic prost [117-124]. Într-un studiu

recent de faza II, pacientii cu CPCNM au fost randomizati intre MetMAb (anticorpi anti - MET), in

asociere cu erlotinib fata de erlotinib singur. Supraexprimarea proteinei MET a fost asociata cu o

crestere a supravietuirii fara progresie a bolii si supravietuirii globale la pacientii tratati cu

MetMAb plus erlotinib [125]. În acest studiu, supraexprimarea proteinei MET a fost definit, atunci

când mai mult 50 % din tumora prezenta o expresie moderată sau înaltă a MET la

imunohistochimie, folosind un anticorp specific anti - MET (Ventana CONFIRM anti-CMET clona

SP44).

NRAS

Mutatii NRAS sunt rare în cancerul pulmonar. Inhibitori MEK ar putea avea o activitate clinica.

Page 16: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

16

La om, au fost identificate trei gene RAS diferite: KRAS (omoloagă cu oncogena virusului

sarcomului Kirsten la șobolan), HRAS (omoloagă cu oncogena virusului sarcomului Harvey la

șobolan) și NRAS (inițial izolată intr-un neuroblastom uman). Diferitele gene RAS sunt foarte

omologe, dar distincte funcțional. Proteinele RAS sunt GTPaze mici, care trec de la forme inactive

legate de guanozin difosfat (GDB) la forme active legate de trifosfat guanozina (GTP). Proteine

RAS sunt mediatori cheie în aval de receptorii factorului de creștere și sunt critice pentru

proliferarea, supraviețuirea și diferențierea celulelor. RAS are capacitatea de a activa în celulă cai

de semnalizare in aval. Aceste cai includ PI3K-AKT-mTOR, care este implicată în supraviețuirea

celulară, si calea RAS-RAF-MEK-ERK, care este implicată în proliferarea celulară.

RAS a fost implicata în patogeneza multor tipuri de cancer. Mutații activatoare ale genei RAS au

dus la activarea constitutiva a RAS GTPazei, chiar și în absența semnalizării de catre factorii de

creștere. Rezultatul este un semnal continuu de proliferare celulară. Genele RAS specifice sunt

deseori mutate in multe forme de cancer. Mutatiile NRAS sunt deosebit de frecvente in cancerul

de colon, melanom, carcinom hepatocelular, leucemie mieloidă, și cancer tiroidian [126].

Mutatii NRAS în cancerul pulmonar cu celule non mici (CPCNM)

Aproximativ 1% din pacientii cu cancer pulmonar cu celule non mici au mutatii NRAS. Mutatiile

NRAS sunt rare în carcinoame cu celule scuamoase și la nefumatori [9, 5, 127]. In cele mai multe

cazuri, aceste mutatii sunt mutații non-sens prin înlocuirea unui aminoacidul din poziția 12 și 61.

Acest lucru duce la activarea constitutiva a cailor de semnalizare NRAS.

Nu exista încă tratamente tintite anti-NRAS, dar studiile pre-clinice sugereaza ca inhibitori ai MEK

(selumetinib, trametinib) ar putea fi activi [127].

În cele mai multe cazuri, mutațiile NRAS sunt exclusive altor mutatii oncogene găsite în CPCNM

(de exemplu mutatii EGFR, rearanjare de ALK, etc).

PIK3CA

Page 17: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

17

Mutatiile PIK3CA sunt rare ; ele par a fi mai frecvente în cazurile de cancer cu celule scuamoase.

Inhibitori ai PIK3 si ai PIK3/mTOR sunt in curs de dezvoltare clinica.

Fosfatidil 3-kinazele (PI3K) sunt o familie de kinaze lipidice implicate în numeroase procese

celulare cum ar fi creșterea, proliferarea, diferențierea, mobilitatea și supraviețuirea. PI3K este un

heterodimer compus din două subunități - o subunitate de reglare a 85 kDa (p85) și o subunitate

catalitică a 110 kDa. Gena PIK3CA codifică p110α, una dintre subunități catalitice.

PI3K convertește PI (4,5) P2 [fosfatidilinozitol 4,5-bifosfat] in PI (3, 4, 5) P3 [fosfatidilinozitol (3, 4,

5)-trifosfat] în interioarul foitei interne a membranei celulare. PI (3, 4, 5) P3 activeaza la nivelul

membranei importante proteine de semnalizare, cum ar fi AKT, ducând la creșterea activității

acestor proteine.

PIK3CA mutanta este implicată în patogeneza multor tipuri de cancer, printre care glioamele,

cancerele de colon, de stomac, de sân, de endometru, și de plămân [COSMIC; 128].

Mutatii PIK3CA în cancerul pulmonar cu celule non mici (CPCNM)

Mutații somatice în PIK3CA au fost găsite în 1-3% din toate CPCNM [COSMIC; 128, 129]. Aceste

schimbari au loc, de obicei, la două puncte critice ale exonului 9 (domeniul elicoidal) și exonul 20

(domeniul kinazei). Mutatiile PIK3CA par a fi mai frecvente în carcinoame cu celule scuamoase,

comparativ cu adenocarcinomul [129, 130] si s-au găsit atât în rândul fumătorilor cat si la

nefumători. Mutatii PIK3CA pot coexista cu mutații EGFR [7, 129]. Mai mult decât atât, au fost

detectate mutații PIK3CA într-un procent mic (~ 5%) din cazurile de cancer pulmonar cu mutații

EGFR prezentand o rezistență dobândită la inhibitorii de tirozin kinaza a EGFR [131].

RET

Fuziuni RET sunt descrise în aproximativ 1 la 2% din cazurile de cancer de plămân cu celule non

mici, de obicei adenocarcinoame. Mai multe studii explorareza activitatea inhibitorilor de tirozin

kinaza a RET.

Gena RET ("rearranged during transfection") [132], este localizată pe cromozomul 10 ; acesta

codifică un receptor de tirozin kinază (RTK) aparținând familiei RET. Legarea cu liganzii săi

aparținând familiei "glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF)" induce fosforilarea și

Page 18: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

18

activarea receptorului ; acești liganzi sunt molecule de semnalizare extracelulară [133]. Odata

activat, RET fosforilează substraturile sale, determinand activarea cailor de semnalizare in aval

[134].

Anomalii RET se găsesc mai ales în cazurile de cancer tiroidian. Mutații somatice punctuale și

germinale sunt găsite în cancerul tiroidian medular [135, 136]. Fuziuni RET sunt, de asemenea,

găsite în unele adenocarcinoame pulmonare [137].

RET in cancerul pulmonar

Aproximativ 1,3% din tumorile pulmonare prezintă modificări cromozomiale de tipul genelor de

fuziune RET [41, 138-141]. Aceste rearanjamente de gene par să existe aproape exclusiv în tumori

de tip adenocarcinom. Când s-au căutat alte anomalii, fuziuni RET apar mutatii oncogene

exclusive în CPCNM (exclud existenta mutatiilor EGFR, KRAS, ALK). Cele mai frecvente gene de

fuziune sunt CCDC6-RET și KIF5B-RET și, mai recent, NCOA4-RET [41].

Într-o serie importanta de pacienti chinezi [41], pacientii ce prezinta o fuziune RET sunt mai

degraba tineri, nefumatori și cu tumori slab diferențiate, comparativ cu pacienții fără această

anomalie.

Consecințele funcționale ale proteinelor de fuziune RET în adenocarcinomul pulmonar nu sunt pe

deplin înțelese, dar se stie ca ele sunt oncogenice in vitro și in vivo. La modelele in vitro, produsii

de fuziune RET pot fi sensibili la inhibitorii de kinazei multi-țintă precum vandetanib, sorafenib,

sunitinib și cabozantinib [139, 141, 142]. In clinica, sunt încă puține datele prospective permit sa

se faca legatura intre prezența de fuziuni RET cu răspunsul la anumite tratamente [143].

Fuziuni RET au fost inițial identificate prin RT-PCR, imunohistochimie, și secvențiere de a doua

generatie. Nu există nici un test standard pentru identificarea fuziunilor RET in probele de

tumorale, dar hibridizare in situ in fluorescenta (FISH) sau captura țintită / secventiere de a doua

generatie sunt metode utile potențial.

În ciuda progreselor semnificative in dezvoltarea de noi terapii tintite, rata ridicata a mortalitatii

in cancerul pulmonar subliniază cu fermitate necesitatea unei preventii și a unei depistari mai

Page 19: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

19

eficiente a cancerului pulmonar, precum și o mai bună clasificare a pacientilor care vor putea

astfel beneficia de un anumit tip de terapie.

Microarrays au fost folosite pentru mai mult de două decenii în cercetare preclinice cu scopul de

a determina profilele de expresie genica associate cu diferite subgrupuri tumorale histopatologice

sau diferitele evolutii clinice, și pentru a evalua funcțiile biologice și celulare determinate de

aceste seturi de gene.

Pacientii cu cancer pulmonar cu cellule non-mici (CPCNM) in stadiul IIIA (invazia ganglionilor

mediastinali – N2+) reprezintă un grup heterogen de pacienti: Ruckdeschel [144], imparte acesti

pacienti in în trei grupe: ganglioni N2 cu invazie minimă sau microscopică, descoperiti întâmplător

în timpul sau după intervenția chirurgicală; pacienți cu N2+ diagnosticat pre-operator, imagistic

sau chirurgical; si pacientii cu N2+ masiv, din mai multe statii ganglionare. In ultimii 20 de ani, au

fost propuse mai multe strategii de tratament diferite pentru a trata pacientii cu CPCNM in stadiul

IIIA [145]. Diferitele opțiuni terapeutice includ: un tratament neoadjuvant prin chimioterapie sau

chimio-radioterapie urmat de chirurgie; chirurgie primară urmata de chimioterapie adjuvanta, cu

sau fără radioterapie secvențială; chimio-radioterapie definitiva, fara interventie chirurgicala

[146-148].

Mai multe studii clinice de faza II si III au demonstrat fezabilitatea clinica si îmbunătățirea

supravietuirii prin administrarea chimioterapiei neoadjuvante [146, 148, 149-155]. In cele mai

multe dintre aceste studii, sterilizarea ganglionilor mediastinali (downstaging) si rezectia

chirurgicala completa sunt predictori ai supravietuirii pe termen lung [149, 150].

In cazul unui cancer bronho-pulmonar cu celule non-mici cu invadarea ganglionilor mediastinali

(N2+), atitudinea terapeutica acceptata in prezent este cea a unui abord multimodal ce consta din

chimioterapie neoadjuvanta pe baza de saruri de platina, urmata de rezectie chirurgicala

completa pentru pacientii care au raspuns sau au fost stabilizati de chimioterapie. Dupa

chimioterapia neoadjuvanta, aproximativ 5% din pacienti vor avea un raspuns complet.

Majoritatea pacientilor va avea un raspuns partial (mai mult de 50% reductie tumorala), dar

numarul pacientilor care vor fi doar stabilizati sau vor avea un raspuns minor, ramane foarte

important (aproximativ 40%). Supravietuirea globala la 5 ani a pacientilor cu cancer bronho-

Page 20: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

20

pulmonar cu celule non-mici cu invadarea ganglionilor mediastinali (N2) este de 20-25%, insa

analiza de subgrup arata ca supravietuirea la 5 ani a celor care au raspuns la chimioterapie este

de 42%, versus 10% la cei care nu au raspuns la chimioterapie (156).

Este prin urmare evident ca pentru aproximativ 40% dintre pacientii in stadiul IIIA tratamentul

prin chimioterapie neoadjuvanta nu aduce niciun beneficiu, in schimb expune pacientul riscului

efectelor adverse si al diferitelor complicatii dintre care unele majore. In plus, aceste tratamente

sunt in general foarte costisitoare.

Studiul de fata are ca obiectiv determinarea unei semnaturi genice cu valoare de prognostic, care

sa permita definirea acestui grup de pacienti inainte de orice tratament.

Astfel, am realizat experimente microarray pe esantioane de tesut tumoral provenit din ganglionii

tumorali mediastinali recoltati chirurgical inainte de tratamentul prin chimioterapie

neoadjuvanta, de la 27 de pacienti cu CPCNM in stadiul IIIA. In functie de raspunsul la

tratamentului neoadjuvant in conformitate cu criteriile OMS [157], s-au determinat doua grupuri

de pacienti: Lotul A – pacientii care au avut un raspuns partial, au fost stabilizati sau nu au

raspuns la chimioterapie; Lotul B - pacientii care au avut un raspuns major sau complet la

tratamentul de inductie. In fine, s-au realizat expresiile genice pentru cele doua grupuri de

pacienti prin analiza microarray utilizand tehnologia Agilent One-Color Microarray. Datele

microarray au fost apoi analizate şi pentru identificarea principalelor căi de semnalizare implicate

în diferentierea celor doua grupuri de pacienti.

Ulterior s-a realizat secventierea exomului (Whole Exome Sequencing) tesutului tumoral din

ganglionii tumorali mediastinali recoltati chirurgical inainte de tratamentul prin chimioterapie

neoadjuvanta si s-au comparat cele doua grupuri de pacienti. Am determinat astfel 5 gene

modificate specific fiecarui grup de pacienti, in raport cu raspunsul la chimioterapia

neoadjuvanta.

Page 21: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

21

A1. Generarea materialului biologic preterapeutic pentru investigatia genomica si activitati

specifice bancii de tesuturi si organe

- Baza de date anonima cu materiale biologice, date clinice si patologic.

- Aprobare Comisii de Etica si Protectie a Persoanelor din Franta si Austria pentru includerea

pacientilor (Anexa 1)

- Protocoale de lucru adaptate fiecarui centru (Anexa 2)

- Materiale biologice

- Esantioane tisulare si serice de la toti pacientii care intrunesc criteriile de includere

Baza de date anonima cu materiale biologice, date clinice si patologic rezultata din includerea

pacientilor poate fi consultata la adresa: https://gpn2.icfundeni.ro,

Parola: ANCS

Password: ancsgpn2.

Toate probele de tesut și datele clinice relevante au fost obținute prospectiv de la

departamentele de chirurgie toracica de la Spitalul Hotel Dieu din Paris afiliat la Facultatea de

Medicina Paris 5 Rene Descartes si de la Spitalul Allegemeines Krakenhaus Universitatskliniken din

Viena în perioada ianuarie 2011 - decembrie 2012. Probele includ 27 de ganglioni mediastinali

tumorali recoltati de la pacienti cu CPCNM si invazia ganglionilor mediastinali (stadiul IIIA), tratati

prin chimioterapie neoadjuvanta, urmată de rezecția chirurgicală la pacientii care au raspuns sau

au fost stabilizati prin tratamentul de inductie.

Consimțământul informat a fost obținut de la toți pacienții și protocoalele pentru acest studiu au

fost aprobate de către Comitetul de Protecție al Persoanelor ile de France V si Ethik-Kommission

al Universitatii de Medicina din Viena.

Page 22: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

22

Criteriile de includere și evaluarea preoperatorie a pacientilor

Criteriile de includere au fost pacienții cu CPCNM diagnosticat histologic, care nu au primit nici un

tratament pentru cancer pulmonar înainte de tratamentul neoadjuvant și care au fost apti pentru

tratamentul prin chimioterapie urmata de intervenție chirurgicală. Toti pacientii au fost

stadializati conform clasificării TNM a American Joint Committee on Cancer, editia a 7-a, prin

bronhoscopie, computer tomografie sau tomografie cu emisie de pozitroni (PET). Invazia

ganglionilor mediastinali a fost confirmata patologic prin biopsie chirurgicala prelevata prin

mediastinoscopie sau toracoscopie. Datele clinice inregistrate au fost: ziua de nastere, sex,

histologie a tumorii, răspunsul clinic la tratament neoadjuvant, numărul de cicluri administrate,

tipul de droguri utilizate, efectele adverse, stadializarea TNM a pieselor rezecate la pacientii

operati. Numărul de cicluri de regim de chimioterapie a fost determinat de catre clinicieni si a

variat intre 2 si 3, in functie de răspunsul clinic și radiologic. Răspunsul clinic a fost definit prin

utilizarea criteriilor OMS de evaluare a raspunsului la tratament in tumorile solide. După

chimioterapia neoadjuvanta pacientii au fost reevaluati prin computer tomografie și / sau PET, și

rezecția tumorii a fost realizata pentru cei care nu au avut nici o dovada de progresie a bolii.

Pacientii care au progresat sub chimioterapie nu au fost operati. Boala stabila (SD), nu a fost

considerat o contraindicație pentru chirurgie si, prin urmare, o restadializare patologica a

statutului ganglionilor mediastinali nu a fost considerată necesară. Pacientii care au fost operati

au beneficiat de o rezectie pulmonara anatomica și o limfadenectomie sistematică a ganglionilor

limfatici mediastinali.

Un total de 73 de pacienti diagnosticati sau suspecti de CPCNM in stadiul IIIA clinic au fost inclusi

initial in studiu. Toti pacientii au beneficiat de o procedura chirurgicala (mediastinoscopie sau

toracoscopie) pentru confirmarea histologica a invaziei ganglionilor mediastinali. Un total de 44

de pacienti au fost exclusi din studiu in urma analizei histologice a tesuturilor ganglionare

mediastinale prelevate. Cauzele de excludere se regasesc in Tabelul 9.

Page 23: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

23

Cauza de excludere Numar pacienti

Lipsa tesutului tumoral in ganglionii mediastinali 28

recoltati prin biopsie chirurgicala (pN0)

Leziuni benigne in ganglionii mediastinali 1

Carcinom pulmonar cu cellule mici 6

Invazie avansata a ganglionilor mediastinali (bulky N2) 2

Limfom in ganglionii mediastinali 1

Utilizarea tesutului ganglionar tumoral congelat in scop diagnostic 1

Absenta tesutului tumoral in tesutul ganglionar congelat 2

Descoperirea fortuita a invaziei ganglionare de tip N3 3

TOTAL 44

Tabelul 9. Cauzele de excludere

Toti pacientii au fost in stadiul IIIA (invazia ganglionilor mediastinali – N2+) clinic dovedit

histopatologic. Caracteristicile de bază ale 29 de pacienți ramasi in studiu sunt detaliate în Tabelul

10. Pacientii de sex masculin au fost predominanti (n = 18; 62%), vârsta medie fiind de 61 ani.

Adenocarcinomul (n = 22; 75,8%) a fost cel mai frecvent tip histologic.

Page 24: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

24

Caracteristici Numar (%)

Total pacienti 29

Sex

masculin 18 (62)

feminin 11 (38)

Varsta medie (ani) 61 [40-75]

Histologie

Adenocarcinom 22 (75,8)

Carcinom scuamos 3 (10)

Carcinom neuroendocrin cu cellule mari 3 (10)

Carcinom cu cellule mari 1 (3,2)

cT (stadiul clinic al tumorii)

T1a 3 (10)

T1b 8 (27,5)

T2a 10 (34,5)

T2b 2 (7)

T3 6 (20)

Tabelul 10. Caracteristicile generale ale populatiei studiate

Page 25: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

25

Chimioterapia neoadjuvanta

Numarul mediu de cicluri de chimioterapie administrate a fost de 3 (interval 2-4): 1 (3,2%) pacient

a primit 2 cicluri, 21 (72,6%) au primit 3 cicluri și 6 (21%) au primit 4 cicluri si 1 pacient (3,2%) a

primit 5 cicluri. Toti pacienții au fost tratați cu o combinație de două medicamente primul

chimioterapic fiind invariabil Cisplatina (n=23, 79%) sau Carboplatina (n=5, 21%), combinatia de

cisplatina/pemetrexed fiind administata în majoritatea cazurilor (n = 15; 52%). Al doilea

chimioterapic a fost Etoposidul (n=7, 24%), urmată de Gemcitabina (n=3, 10%) si Vinorelbina

(n=3, 10%). Toxicitatea la chimioterapia neoadjuvanta a fost în majoritatea cazurilor ușoară sau

moderată (gradul 1-2) evenimente adverse (efectele toxice hematologice leucopenie: în 29,4%,

anemie la 25,8%, trombocitopenie la 7%, toxice non-hematologice: gastrointestinale, inclusiv în

principal greață, vărsături sau diaree în 37,6%, oboseala la 25,8%, alopecie la 14,1% și altele în

8%). Trei (10%) pacienti au avut de grad 3/4 de toxicitate, care a inclus 2 leucopenii si o tromboză

venoasă profundă complicat cu embolie pulmonara si deces dupa primul ciclu de chimioterapie.

Răspunsul clinic a fost evaluat la cei 28 pacienti care au terminat tratamentul de inductie prin

chimioterapie. Evaluarea raspunsului la tratament s-a realizat prin scanare CT și / sau PET si a

arătat 13 pacienti (46,4%) au evoluat sub chimioterapie, 7 pacienti (25%) au fost stabilizati si 8

pacienti (28,6%) au avut răspunsuri parțiale. Nici un pacient nu a avut un răspuns clinic complet.

Rata globala de raspuns clinic la chimioterapia neoadjuvanta a fost de 15 pacienti (51,7%). Acesti

pacienti au beneficiat ulterior de interventie chirurgicala.

Chirurgie

Un pacient a avut carcinoza pleurala descoperita la toracotomie si nu a beneficiat de rezectie

chirurgicala. Restul de 14 (50%) pacienti au beneficiat de rezectie chirurgicala: 11 lobectomii

(78,5%), o bilobectomie (7%) și 2 pneumonectomii (14,5%). Limfadenectomia sistematică a

ganglionilor limfatici mediastinali a fost efectuata la fiecare pacient. Toti pacienții au beneficiat de

o rezectie completa R0.

Page 26: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

26

A2. Definirea loturilor de prognostic

- Definire componenta Lot A: al pacientilor care au avut un raspuns obiectiv la

chimioterapie neoadjuvanta

- Definire componenta Lotul B: al pacientilor care au avut raspunsuri minore sau au fost

doar stabilizati prin chimioterapie neoadjuvanta.

- Esantioane tisulare si serice de la 100 de pacienti selectati in urma acestei etape.

O rezectie a fost considerată completă (R0), atunci când nu a existat nici o tumoare reziduala

detectata la marginile de sectiune bronșica sau vasculara și nici boala reziduala in regiunea

mediastinala. Downstagingul mediastinal a fost definit ca lipsa de celule tumorale în ganglionii

mediastinali rezecati. Răspuns patologic complet a fost definit ca absența celulelor tumorale

viabile în piesa sau in ganglionii limfatici rezecati. Pacientii care progresat sub chimioterapie si

care nu au avut un downstaging pe piesa operatorie, au fost considerati ca insensibili la

tratamentul chimioterapic si inclusi in Lotul A. Pacientii care au avut un downstaging sau au un

raspuns patologic complet pe piesa operatorie, au fost considerati ca sensibili la tratamentul

chimioterapic si inclusi in lotul B.

Răspuns histopatologic

Un raspuns patologic complet a fost observat la 2 (7%) pacienți. Boala reziduala N2 a fost prezent

în 6 (21,5%) pacienți, în timp ce 7 (25%) au avut downstaging mediastinal: N1 (n = 1; 3,5%) sau N0

(n = 6; 21,5%).

În total, 7 (25%) pacienti au avut un downstaging al bolii initiale și au fost inclusi in Lotul B al

pacientilor sensibili la chimioterapie. Restul de 21 de pacienti (cei care au evoluat sub

chimioterapie – 13 pacienti, si cei care nu au avut un dowstaging prin chimioterapie – 8 pacienti)

au fost inclusi in Lotul A ai pacientilor care nu au raspuns la chimioterapie :

- Lotul A - 21 de pacienti care nu au raspuns la chimioterapie sau au avut raspunsuri minore

ori au fost doar stabilizati prin chimioterapie neoadjuvanta (criterii OMS).

Page 27: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

27

- Lotul B – 7 pacienti care au avut un raspuns obiectiv la chimioterapie neoadjuvanta

(criterii OMS).

Stadiul patologic a fost: nici o boală reziduală în 2 cazuri, stadiul IA în 3, IIA în 3 și IIIA în 6 cazuri.

Nu s-a determinat nici o asociere semnificativa între răspunsul clinic și patologic sau downstaging

mediastinal și de sex, vârstă, histologie, numărul de cicluri tipurile de tratament chimioterapic sau

raspunsul clinic la chimioterapie.

Page 28: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

28

A3. Prepararea esantioanelor pentru analiza genomica

- ARN total, ADN genomic si proteinele denaturate folosind protocolul Sigma TRIREAGEN pe

loturi de 25 de probe biologice, 4 loturi

- ADN complementare pe loturi de 25 de probe biologice, 4 loturi

- Aliquoturile de ARN SI ADN purificate pe loturi de 25 de probe, 4 loturi

Extractiile ARN

Esantioanele tisulare recoltate de la pacienti eligibili pentru studiu au fost prelucrate in vederea

extactiei de ARN total.

Pe scrurt, ARN-ul total a fost obtinut prin extractie in doua etape: prima etapa reprezentata de

extractia cu Trizol (Invitrogen) si cea de-a doua reprezentata de purificarea ARN (clean-up)

folosindu-se kitul Absolutely RNA Microprep (Agilent Technologies).

In prima etapa a protocolul de extractie s-a omogenizarea tesutului cu 1 ml trizol, s-a adugat

cloroform care a permis izolarea ARN in faza apoasa. Aceasta faza a fost tratata cu izopropanol,

iar peletul (ARN precipitat) a fost spalat cu etanol 75%. Ulterior ARN precipitat a fost dizolvat in

apa Rnase Dnase free.

Cea de-a doua etapa in procesul de izolare, clean-up-ul a presupus amestecarea solutiei ARN cu

tampon de liza si beta-mercaptoetanol; ulterior a fost adugat etanol 70% care a facilitat legarea

selectiva a ARN de membrana coloanelor din kit. Urmatoul pas a presupus splarare cu 1xHigh Salt

Wash Buffer si respectiv 1xLow Salt Wash Buffer urmat de eluarea ARN cu tamponul de eluare din

kit.

Pentru probele de ARN astfel obtinute au fost realizate controalele cantitative si respectiv

calitative prin citirea spectrofotometrica a concentratiilor ARN si a raportului A260/A280 si

respectiv prin electroforeza capilara in polimer de acrilamida cu ajutorul Agilent 2100 Bioanalyser

si a chipurilor din kitului RNA 6000 Nano kit (rapoarte Bioanalyser prezentate in Figura 1). Agilent

2100 Bioanalyzer cuantifica calitatea ARN prin atribuirea unui RNA Integrity Number (RIN) fiecarei

Page 29: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

29

probe citite. Aceste RIN poate lua valori de la 1 la 10; un RIN de valoare 1 fiind atribuit unui ARN

degradat, iar un RIN de valoare 10 fiind atribuit unui esantion ARN integru.

Figura 1 : Raport ARN total Bioanlizor 2100

Extractii ADN

Protocolul de extractie ADN (conform protocolului DNA Extraction kit (Startagene) si QIAamp Dna

Mini Kit (Qiagen)), presupune urmatoarele etape (Figura 2):

1. mojararea in azot lichid a ~30 mg tesut

2. amestecarea cu tampon de liza

3. adaugare proteinaza K

4. incubare peste noapte in termobloc la temperatura de 56˚C

5. tratament cu Rnaza. Concentratia initiala a enzimei este de 10mg/ml, concentratia finala

de Rnaza este de 20 ug/ml. Amestecul de reactie se incubeaza pe termobloc timp de 10

minute la 70˚C

6. adaugare etanol 100%

Page 30: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

30

7. incarcare amestec de reactie pe coloane

8. centrifugare la 8000 rpm timp de 1 minut la temperatura camerei

9. aruncare eluat

10. splare cu 500 ul tampone de spalare

11. eluare finala cu 50 ul apa libera de Rnase si Dnase

12. tratament cu Rnaza.

13. citire concentratie si raport 260/280 la Nanodrop 1000

14. citirea concentratiilor fluorimetric cu ajutorul echipamentului Quibit

Puritatea probelor a fost determinata prin calcularea raportului dintre absorbanta la 260 nm si

280 nm. ADNul izolat a avut un raport intre 1.7 si 2.2.

Pentru asigurarea acuratetii concentratiei, aceasta a fost estimata si cu ajutorului Qubit 2.0

Fluorometer (test: dsDNA BR).

Echipamentul utilizeaza fluorocromi de tip sonde moleculare pentru cuantificarea gDNA. Acesti

marcatori emit semnal fluorescent numai cand sunt legati de moleculele de inters, in cazul nostru

gDNA.

Figura 2: Pasii de lucru pentru estimarea concentratiei gDNA cu ajutorul Qubit

(http://www.lifetechnologies.com/ro/en/home/brands/product-brand/qubit/qubit-

fluorometer.html#how)

ADNul astfel izolat a fost stocat la -28ºC pentru utilizare in rectiile de secventiere.

Page 31: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

31

Ulterior, in vederea testarii calitatii, probele de ADN au fost migrate si electroforetic in gel de

agaroza 1%, 1X TAE, 100V, timp de 60 minute. Imaginile au fost preluate cu ajutorul

echipamentului GelDoc, BioRad (Figura 3).

Figura 3: Migrare electroforetica in gel de agaroza 1%, Ladder 100-3000 bp

Protocolul de secvetiere de urmatoare generatie presupune initial utilizarea tehnologiei de

capturare (SureSelect Target Enrichment) Agilent. Tehnologia SureSelect Target Enrichment

permite tintirea regiunilor de interes (precum exomul). Initial va fi necesara o etapa de

fragmentare pentru obtinerea unor fragmente de dimensiuni mici pronind de la gADN urmata de

o etapa de reparare a capetelor acestor fragmente cu ajutorul enzimei Klenow, iar ulterior vor fi

adugate in reactie sonde oligonucleotidice biotinilate care tintesc zonele de interes din genom.

Probele vor fi purificate iar in final selectia regiunilor tintite de va realiza cu bile metalice cu

streptavidina. Ulterior etapele de lucru vor presupune generarea clusterelor, secventierea,

alinierea citirilor si determinarea variatiilor.

Page 32: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

32

A4. Analiza genica

- Expresie genica pentru fiecare proba pentru perechile de ganglion mediastinali tumorali si

normali, 100 expresii genice

- Studiu de expresie genica comparativa prin tehnica One-Color Microarray-Based Gene

Expression Analysis – AGILENT inainte si dupa chimioterapia neoadjuvanta

- Expresii genice modificate in limfoganglionii mediastinali

- Expresii genice modificate in limfoganglionii mediastinali de catre chimioterapia

neoadjuvanta, in cancerul bronho-pulmonar cu cellule non-mici si invazia ganglionilor

mediastinali si in functie de tipul histopatologic

- Consideratii privind importanta fenomenelor de epigenetica prin compararea expresiilor

genice dintre limfoganglionii mediastinali tumorali si tumora primitive dupa chimioterapie

Experimentele microarray

Pentru analiza microarray s-a utilizat tehnologia Agilent One-Color Microarray- Based Gene

Expression Analysis, versiunea 5.5 / februarie 2007. Au fost folosite lamele microarray slides

Whole Human Genome Oligo Microarray with SurePrint Technology 4 x 44 K.

Page 33: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

33

In Figura 4 este schematizat Planul de realizare al experimentelor microarray a fost urmatoarul:

MI

Figura 4 : Planul de realizare al experimentului microarray

Tesut

normal

Tesut

tumoral

Extractii ARN total/

Purificare ARN

ARN total + spike-in

Sinteza cDNA

Sinteza ARN si amplificare

Purificare cARN

Prgatirea probelor si hibridizare

Hibridizare 17h/ 65˚C

Feature extraction/ Gene Spring

Determinare concentratie/

Verificarea calitatii

O

N

E

-

C

O

L

O

R

M

I

C

R

O

A

R

R

A

RECOLTARE TESUTURI

E

X

T

R

A

C

T

I

I

Extractii ADN

Spalare/ Scanare

Page 34: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

34

Pornind de la 100 ng in 1.5µl, s-au realizat urmatoarele etape:

1. Reactia de marcare, folosind kitul Low Imput Quick Amp Labeling, one-color, marcajul

realizandu-se cu Cy 3. Din ARN total s-a obtinut cDNA printr-o reactie de revers

transcriere, urmata de sinteza cARN cu nucleotide marcate cu Cy3.

2. Reactia de purificare a cARN pe coloane conform protocolului Absolutely RNA Microprep

kit

3. Cuantificare cARN, prin determinarea concentratiei/ stocului (μg) si a activitatii specifice in

pmol Cy3/ μg cARN. Activitatea specifica trebuie sa fie mai mare de 8 pmol Cy3/ μg cARN

pentru continuarea experimentului.

4. Hibridizarea. Se realizeaza pornind de la 1.65 μg cARN marcat si cuantificat anterior,

folosindu-se kitul Gene Expression Hybridisation, varianta 4 x 44 k . Amestecul de reactie

este incorporat in sandwichul format de gasket slide si slidul oligo microarray, plasat in

camera de hibridizare SureHyb. Pe un gasket slide vor fi pipetate 4 probe. Camera de

hibridizare a fost incubata in cuptorul de hibridizare pentru 17 ore la 65 °C, 10 rpm.

5. Spalarea. Lamele au fost trecute prin bai succesive folosindu-se Gene Expression Wash

Buffer 1 si Gene Expression Wash Buffer 2.

6. Plasarea lamelor in slide holder. Lamele oligo microarray au fost asezate in cate un slide

holder versiunea B astfel incat codul numeric sa fie vizibil odata pus in carousel, ceea ce

permite citirea prin sticla.

7. Scanarea lamelor. Pentru scanarea lamelor a fost folosit programul Scan Control versiunea

7, compatibil cu softul de extractie a datelor Feature Extraction 9.1. Pentru lamele Agilent

4 x 44K (61 x 21.6 mm) este necesara scanarea cu o rezolutie de 5 μm. Lamele au fost

scanate folosindu-se urmatorii parametrii: RPMT 10%, GPMT 100% si XDR 0.10%. Fisierul

.tiff creat a avut o rezolutie de 16 bit (Figura 5)

Page 35: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

35

Figura 5: Semnalele inregistrate pentru un array dupa extractia datelor din fisirele .tif cu

Feature Extraction

Page 36: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

36

In Figura 6 este redat un rapport de calitate al unui experiment microarray.

QC Report - Agilent Technologies : 1 Color Gene Expression

Date Thursday, October 18, 2012 - 10:30 Grid 026652_D_F_20110325

Image US45102959_252665216355_S01_H

[1_2] BG Method No Background

Protocol GE1-v5_91_0806 (Read Only) Background Detrend On(FeatNCRange, LoPass)

User Name Administrator Multiplicative Detrend True

FE Version 9.1.3.1 Additive Error 4(Green)

Saturation Value 630001 (g)

Spot Finding of the Four Corners of the Array

Net Signal Statistics

Agilent SpikeIns:

Green

# Saturated Features 0

Page 37: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

37

Grid Normal

Feature Local Background

Green Green

Non Uniform 13 103

Population 64 523

Spatial Distribution of All Outliers on the Array

532 rows x 85 columns

99% of Sig. Distrib. 294433

50% of Sig. Distrib. 683

1% of Sig. Distrib. 28

Non-Control probes:

Green

# Saturated Features 0

99% of Sig. Distrib. 35665

50% of Sig. Distrib. 144

1% of Sig. Distrib. 26

Histogram of Signals Plot

Page 38: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

38

# FeatureNonUnif (Green) = 13(0.03%)

# GeneNonUnif (Green) = 10 (0.028 %)

# Features (NonCtrl) with BGSubSignal < 0: 3937 (Green)

Spatial Distribution of Median Signals for each Row

Page 39: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

39

• BG NonUniform • BG Population

• Green FeaturePopulation • Green Feature NonUniform

Negative Control Stats

Green

Average Net Signals 28.31

StdDev Net Signals 2.92

Average BG Sub Signal -4.38

StdDev BG Sub Signal 2.60

Local Bkg (inliers)

Green

Spatial Distribution of Median Signals for each Column

Page 40: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

40

Number 43887

Avg 41.04

SD 2.32

Foreground Surface Fit

Green

RMS_Fit 1.44

RMS_Resid 3.71

Avg_Fit 57.25

Multiplicative Surface Fit

Green

RMS_Fit 0.12

Agilent SpikeIns: Log(Signal) vs. Log(Relative concentration) Plot

Page 41: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

41

Reproducibility: %CV for Replicated Probes

Median %CV Signal (inliers)

Non-Control

probes Agilent SpikeIns

Green Green

BGSubSignal 14.53 12.71

ProcessedSignal 4.47 3.80

Agilent SpikeIns Signal Statistics

Probe Name Log(Relative

Conc.)

Median(Log

Proc. Sig.) % CV StdDev

(+)E1A_r60_3 0.30 0.62 231.72 0.28

(+)E1A_r60_a104 1.30 0.60 63.77 0.17

Agilent Spike-In Concentration-Response Statistics

Linear Range Statistics:

Low Signal 0.70

High Signal 5.67

Page 42: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

42

(+)E1A_r60_a107 2.30 1.38 24.76 0.09

(+)E1A_r60_a135 3.30 2.35 5.09 0.02

(+)E1A_r60_a20 3.83 2.73 3.69 0.02

(+)E1A_r60_a22 4.30 3.23 3.01 0.01

(+)E1A_r60_a97 4.82 3.86 3.60 0.02

(+)E1A_r60_n11 5.30 4.52 3.95 0.02

(+)E1A_r60_n9 5.82 4.85 3.80 0.02

(+)E1A_r60_1 6.30 5.44 5.91 0.03

Agilent SpikeIns: %CV of Avg. Processed Signal Plot

Low Relative

Concentration 1.72

High Relative

Concentration 6.57

Slope 1.03

R^2 Value 1.00

Signal Detection Limit Statistics

Saturation Point 5.80

Low Threshold 0.41

Low Threshold Error 0.35

Spike-In Detection Limit 1.36

Page 43: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

43

Median %CV:3.80

Figura 6: Raportul de calitate al experimetului microarray (este prezentat raportul pentru un array (o proba))

Page 44: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

44

A5. Analiza bioinformatică

- Gene şi căi de semnalizare cheie implicate în cancerul bronho-pulmonar cu cellule non-mici

si invazia ganglionilor mediastinali

- Analiza bioinformatica a rezultatelor globale in urma determinarilor de genom si selectarea

genelor candidat pentru validare

Datele sunt compuse din două grupuri de pacienti: cei care nu au raspuns la tratamentul prin

chimioterapie neoadjuvanta (non-responders) si cei care au raspuns la tratamentul prin

chimioterapie neoadjuvanta (responders). De notat ca printre responders există doar o singură

femeie (nepereche). Unele esantioane sunt imperecheate la esantioane de ganglioni non-tumorali

de la acelasi pacient, altele nu. Acest tip de date este menționat în literatura de specialitate ca

"Parțial imperecheat", și pot fi abordate prin modele liniare cu efecte mixte [158, 159]. Pentru

simplificare, am luat în considerare mai intai datele care sunt imperecheate, si apoi am considerat

datele ca un întreg, indepedent de împerechere.

Tesut ganglionar normal versus tumoral: În urma experimentului microarray realizat s-au putut

identifica un număr de 1127 gene cu expresie modificată în ţesutul tumoral comparativ cu ţesutul

normal cu p-value ≤ 0.05 şi 44 de gene cu p-value ≤ 0.01.

Dintre genele identificate cele cu cele mai mari diferenţe de expresie genică identificată între

ţesutul tumoral faţă de cel normal sunt COL1A1, INHBA sau TXNIP.

Tesut ganglionar tumoral responders versus non-responders: Seturile de gene au fost pregătite

pentru analiza GO (ontologia genelor) îmbogățita (bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt) [160, 161] cu

ajutorul combinațiilor de gene de varianță mare sau mica la responders si la non-responders. A fost

definit un total de 12 grupuri diferite și 50 de gene mai reprezentative (cea mai mare sau cea mai

mica varianță) au fost selectate ca in-put pentru fiecare grup. Tabelele 12 și 13 arata termenii GO

care au fost semnificativi pentru responders si non-responders, respectiv, folosind genele cu

varianță mare.

Page 45: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

45

De notat că pentru seturile de gene cu varianță mica au existat doar rezultate de Proces Molecular,

și ca în toate cazurile, "activitatea receptorului de semnalizare transmembranara", și grupurile

asociate (de exemplu " receptorul de activitate "), au fost semnificative.

Multe categorii GO au fost semnificative pentru unele dintre grupuri, si prin urmare am filtrat

pentru a da rezumatele prezentate în Tabelele 12 și 13. Am păstrat termenii GO cu valori p <0,01,

cel puțin 5 gene in termen de Proces Biologic, cel puțin 4 gene în termen de Funcții Moleculare, și

cel puțin 3 gene în termen de Componente Celulare. A fost selectat un numărul diferit de gene

minime pentru fiecare categorie, deoarece a existat o preponderență a rezultatelor in termen de

Proces Biologic, fata de Funcțiile Moleculare and Componentele Celulare, respectiv. Din motive de

redundanta, în care există mai multe rezultate similare este redata doar o singura categorie. De

exemplu, doar termenul de"regiune extracelulară" (Componenta Celulara) in loc de "spațiul

extracelular", "o parte a regiunii extracelulare", și "regiune extracelulară".

Analiza GO îmbogățita a aratat ca genele de semnalizare transmembranara nu variază de la un

pacient la altul, independent de răspunsul la chimioterapia neoadjuvanta.

Genele cu mare variabilitate ale pacientilor care au raspuns la chimioterapia neoadjuvanta implica

keratina și cornificarea. Invelisul cornificat al celulelor epidermice ale pielii este format din keratina,

și este înconjurat de lipide. Acesta este asociat cu disfuncții de barieră și are ca rezultat un semnal

de apoptoză [162].

Genele cu mare variabilitate ale pacientilor care au nu raspuns la chimioterapia neoadjuvanta

implica activitatea enzimatică și sensibilitatea hormonala.

Page 46: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

46

Procese Biologice - Diferentierea keratocitelor

- Dezvoltarea epiteliala

- Diferentierea celulelor epidermice

- Raspunsul la lipide

Functii Moleculare Constituenti structurali ai citoscheletului

Componente

Celulare

- invelisul keratinizat

- matricea proteica extracelulara

- regiunea extracelulara

Tabelul 12: termeni GO semnificativi pentru seturile de gene de varianță mare la responders.

Procese Biologice - Raspuns la stimulul hormonal

- Reglarea negativa a activitatii hidrolazei

- Reglarea negativa a activitatii endopeptidazei

- Raspunsul la lipide

Functii Moleculare Inhibitor al activitatii endopeptidazei

Componente

Celulare

Regiunea extracelulara

Tabelul 13: termeni GO semnificative pentru seturi de gene de varianță mare la non-responders.

Analiza Cailor de semnalizare

Am inclus ganglioni limfatici tumorali și non-tumorali și am încercat determinarea unor căi

moleculare care sa defineasca diferența răspunsului la chimioterapie. Dacă există un semnal genetic

pentru răspunsul la chimioterapie, aceasta este probabil o caracteristică a pacientului, și este

prezent în atât ganglionii tumorali cat și non-tumorali.

Page 47: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

47

Datele au fost împărțite în subgrupuri (Tabelul 14). Rezultatele, sugerează faptul că numai

eșantioanele de dimensiuni mai mari permit obtinerea unor rezultate semnificative. In Tabelul 14

sunt prezentate căile semnificative doar pentru grupurile cu cel puțin 10 esantioane pe categorie. S-

au determinat 7 cai moleculare care au fost semnificative (FDR <0,05) în cel puțin unul din

subgrupuri. Toate aceste căi sunt in raport cu sistemul imunitar, una este o cale de semnalizare, iar

restul sunt legate de răspunsul imun sau autoimun la tesut strain. Calea de semnalizare a citokinelor

este de asemenea legata de bolile autoimune [163]; citokinele sunt implicate în procesul de

recrutare al limfocitelor.

Nu este clar dacă semnalul de raspuns la chimioterapie este prezent atat în ganglionii limfatici

invadati cat și cei neinvadati. Cu toate acestea, luând în considerare coloanele D și E, vedem că

valorile p sunt bine corelate între ele, cu excepția căii de semnalizare a citokinelor, care este mai

implicata în ganglionii limfatici invadati.

A B C D E

Caile KEGG MF M MF M M

Toti toti tumorali tumorali non-

tumorali

24/11 9/10 18/7 7/6 2/4

Boala grefon-versus-receptor

Poliartrita reumatoida

Rejetul alogrefelor

Tiroidita autoimuna

Lupus eritematos systemic

Diabet de tip I

Calea de semnalizare a citokinelor

0.04 0.08 0.07 0.09 0.06

0.04 0.05 0.07 0.07 0.06

0.04 0.07 0.07 0.09 0.09

0.04 0.05 0.07 0.09 0.06

0.04 0.26 0.13 0.32 0.24

0.05 0.08 0.07 0.10 0.06

0.97 0.05 0.93 0.24 0.96

Page 48: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

48

Tabelul 14: Valoarea p pentru caile KEGG care sunt semnificative cu un p <0.05, pentru cel puțin unul din cele 5 seturi de date de in-put, definite de la A la E. Valorile aflate sub cutoff sunt subliniate. Prima linie a antetului arata sexul pacientilor (M=masculin, F=feminin) din subgrup. A doua linie arata tipul ganglionilor limfatici. Ultima linie a antetului arata numărul de non-responders si de responders (non-responders/responders) luati in calcul. De notat că există doar o singura femeie in grupul de responders, si prin urmare nu a fost luat în considerare un subgrup numai de femei.

Căile din Tabelul 14 amintesc de ceea ce s-ar putea aștepta de la compararea transcriptomului unei

persoane de sex masculin cu transcriptomul unei persoane de sex feminin, deoarece diferența

majoră dintre transcriptomele legate de sexe sunt procesele sistemului imunitar [164, 165]. Cu

toate acestea, semnificația căilor grupului pacientilor numai de sex masculine ai subgrupului B

(ganglioni limfatici invadati si neinvadati) sugerează, de asemenea, o functie imunitara similara cu

comportamentul autoimun.

Ca si control negativ, Ghidul Pathway a fost utilizat în compararea femeilor cu bărbații. Căile

semnificative specifice sexului sunt prezentate în Tabelul 15. Multe dintre acestea sunt căi pentru

bolile autoimune, care sunt cunoscute a fi mai frecvente la femei decât bărbați [164].

Ran

g

Nume pPERTFdr

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Receptor de interactiune citochina-citochina

*Lupus eritematos systemic

*Diabet de tip I

**Poliartrita reumatoida

*Reactie grefon-versus-receptor

Calea de semnalizare MAPK

Calea de semnalizare NF-kappa B

Interactiunea neuroactiva ligant-receptor

** Tiroidita autoimuna

Procesarea si prezentarea antigenelor

0.025

0.025

0.025

0.025

0.025

0.025

0.025

0.025

0.025

0.027

Page 49: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

49

11

12

13

14

15

16

17

18

19

*Rejetul alogrefelor

** Calea de semnalizare a citokinelor

Cai in cancer

Calea de semnalizare a receptorului Toll-like

Proteoglicanii in cancer

Cancerul pulmonary cu cellule mici

Miocardita virala

Aderarea punctiforma

Hepatita B

0.027

0.031

0.034

0.037

0.039

0.043

0.043

0.047

0.047

(*) cai care sunt de asemenea semnificative si la responders/non-responders (Tabelul 5). (**) cai care sunt de asemenea semnificative si numai la barbatii responders/non-responders. Tabelul 15: Cele 19 cai semnificative, bazate pe diferențele de sex.

Tabelul 15 arată că există 19 cai semnificative atribuite diferențelor de sex. Șapte dintre acestea

sunt, de asemenea, semnificative atunci când se compară pacientii care au raspuns la chimioterapia

neoadjuvanta cu cei care nu au raspuns. deși unele sunt, probabil, semnificative doar pentru ca in

categoria pacientilor care au raspuns la chimioterapia neoadjuvanta exista doar o singura persoana

de sex feminin. Cu toate acestea, luând în considerare numai pacientii de sex masculin, există trei

căi importante pentru răspunsul la chimioterapie, și acestea sunt, de asemenea, printre cele mai

importante cai atribuite diferențelor de sex: poliartrita reumatoida, boli tiroidiene autoimune, și

semnalizarea citokinelor. Este interesant de a vizualiza aceste 3 cai, comparând rezultatul feminin /

masculin cu rezultatele responder / non-responder.

Pathway Guide permite vizualizarea modificarilor, perturbarea totala [166], și totalul perturbarilor

acumulate [167] in caile KEGG. În cazurile care au răspuns la chimioterapie, nu au existat gene

exprimate diferențiat. De aceea vom analiza doar rezultatele cu privire la acumularea de

perturbare. Totalul perturbarilor acumulate rezumă efectul genelor din amonte, asupra fiecarei

gene, și deduce modificarile acesteia, în timp ce perturbare totală analizeaza schimbarea fiecărei

gene.

Page 50: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

50

In Figura 11 este prezentata acumularea totala de perturbare in calea poliartritei reumatoide pentru

pacientii de sex masculin responders / non-responders (partea de sus) și femei / bărbați (partea de

jos). Efectul asupra caii este aceeași pentru ambele categorii. Non-responders si sexul feminin are

un efect de down-regulare a semnalului pentru celulele T (CTLA4 și CD28), și up-reguleaza

angiogeneza (FLT1), in comparatie cu responders si sexul masculin, respectiv. CD28 este improtant

pentru producerea de citokine, precum și activarea și supraviețuirea celulelor T. CTLA4 are un rol în

multe boli autoimune; transmite semnale de in-hibare pentru celulele T. FLT1 este implicat in

angiogeneza și funcția macrofagelor.

Page 51: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

51

Figura 11: Acumularea totala de perturbare in calea poliartritei reumatoide la pacientii de sex masculin non-responders/responders (A) și femei/bărbați (B). În albastru sunt CTLA4 și CD28. În portocaliu este FLT1. Aceasta cale poate fi analizata interactiv și mai în detaliu la www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?hsa05323 .

In Figura 12 este prezentata acumularea totala de perturbare in calea tiroiditei autoimune pentru

pacientii de sex masculin non-responders/responders (partea de sus) și femei / bărbați (partea de

jos). Efectul asupra caii are unele asemănări dar și deosebiri. Ca si pentru calea poliartritei

reumatoide, non-responders și sexul feminin down-reguleaza de semnalizare CD28 catre celulele T.

Cu toate acestea, semnalizarea receptorilor celulelor B, fiind mediata de CD40, este down-regulata

la non-responders în comparație cu responders, dar up-regulata la femei față de bărbați. CD40 joacă

un rol în răspunsurile imune și inflamatorii. Activitatea receptorului de suprafață FAS a morții

celulare este down-regulata la non-responders fata de responders, dar up-regulata la femei

comparativ cu bărbații. Această observație este în concordanță cu faptul că la non-responders nu se

produce suficienta de apoptoza, dar femeile (care au cele mai multe boli autoimune) produc in mod

manifest prea multă apoptoza in tesuturile tinta.

Page 52: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

52

Figura 12: Acumularea totala de perturbare în calea tiroiditei autoimune la pacientii de sex masculin non-responders/responders (A) și femei/bărbați (B). În albastru este CD28. CD40 și FAS sunt activate la femei comparativ cu bărbații (portocaliu), dar down-regulate (albastru) la non-responders fata de responders. Aceasta cale poate fi analizata interactiv și mai în detaliu la www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?hsa05320 .

In Figura 13 este prezentata acumularea totala de perturbare in calea de semnalizare a Citokinelor

pentru bărbați non-responders / responders (partea de sus) și femei / bărbați (partea de jos). Marea

majoritate a efectelor asupra acestei căi sunt opuse. In comparatie cu responders, non-responderi

Page 53: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

53

au o represiune generală a întregii cai, iar femeile au o stimulare generală a întregii cai, comparativ

cu bărbații. Unele citokine inflamatorii initiaza raspunsul imun. Represiunea semnalizarii citokinelor

la non-responders si de activarea ei la femei, confirmă, de asemenea, ipoteza că la non-responders

nu se produce suficient raspuns imunitar, în timp ce femelele produc prea mult.

Figura 13: Acumularea totala de perturbare în calea de semnalizare a citokinelor pentru pacientii de sex masculin non-responders/responders (A) și femei/bărbați (B). Cascadele coerente de perturbare

Page 54: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

54

sunt trasate prin linii de culoare roșie. Marea majoritate a efectelor asupra acestei căi sunt opuse. Față de responders, non-responders au o down-regulare generală a întregii cai iar pacientii de sex feminin au o activare generală a întregii cai comparativ cu bărbații. Aceasta cale poate fi analizata interactiv și mai în detaliu la www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?hsa04062.

A6. Validarea rezultatelor de microarray

- Validarea functionala in vitro a genelor candidat

- Validarea expresiei diferentiale observate in analiza genica

Profilele genice au fost identificate prin compararea nivelului de expresie in tesutul tumoral cu

tesutul normal. Graficul de tip heat map al expresiilor genice sunt prezentate in Figura 7.

Figura 7: Graficul de tip heat map al expresiilor genice pentru primele 100 cele mai variabile gene

Page 55: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

55

Analiza expresiei genice ale datelor de tip one-color microarray au condus la identificarea unei liste

de 1127 gene cu expresie modificata in tesutul tumoral comparativ cu cel normal, cu o valoare p p ≤

0.05 si a unei liste de 44 gene cu un p ≤ 0.01.

Controlul calitatii a fost realizat utilizand pachetul Agi4x4Preprocess R.

In Tabelul 11 sunt prezentate cele 44 de gene cu p ≤ 0.01. Aceste gene au avut un fold change (in

valoare logaritmica) care a variat de la -1,7 la 4,23.

entrezgene logFC AveExpr t P.Value adj.P.Val

22821 -1,173258731 11,13694967 -12,98345105 3.49343401072318e-07 0,005546005

27286 2,545876689 8,890347552 11,34529854 1.11807759868413e-06 0,005546005

26508 1,876663537 9,192918963 11,12359435 1.3236134164741e-06 0,005546005

2191 4,022255682 9,437812624 10,9762565 1.48312639869672e-06 0,005546005

1277 4,231281424 12,9965347 10,91369957 1.55716660199109e-06 0,005546005

7434 -0,941052066 6,72058215 -10,11983818 2.95368413038161e-06 0,007499442

55379 1,004302185 10,25022671 10,11029066 2.97728365006124e-06 0,007499442

7076 2,87756409 12,53348489 9,925538564 3.47738114167333e-06 0,007499442

1741 1,123055978 8,596499646 9,824297712 3.79014937023107e-06 0,007499442

284217 1,367868135 6,674277885 9,687002883 4.26484889326777e-06 0,007567146

6659 1,667996873 8,069546502 9,496667902 5.03462255723364e-06 0,007567146

54972 2,665611377 9,862355762 9,469463092 5.15662314647218e-06 0,007567146

11215 -0,814402188 9,105882189 -9,343864536 5.76365018459461e-06 0,007567146

7083 2,676443411 12,22765411 9,308393659 5.94901376789674e-06 0,007567146

204 0,679810381 9,795624417 9,100511695 7.17620021096144e-06 0,007913304

10848 1,8321068 9,130893651 9,088531883 7.25495658932353e-06 0,007913304

1278 2,798927601 13,01906921 9,030717462 7.64862884342508e-06 0,007913304

4192 2,398358908 11,75701295 8,960337335 8.15986496238367e-06 0,007913304

57406 -1,265393014 8,965186115 -8,918510887 8.48140297045091e-06 0,007913304

101060503 -1,705156498 14,16353261 -8,815791117 9.33172609749257e-06 0,007913304

10628 -1,705156498 14,16353261 -8,815791117 9.33172609749257e-06 0,007913304

Page 56: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

56

10631 3,540699178 10,40582188 8,731025388 1.01041507170582e-05 0,008178851

113452 2,418904943 10,67408826 8,63173113 1.10994924125068e-05 0,008337932

376267 1,829969417 10,11817436 8,591294234 1.15352807335472e-05 0,008337932

55055 0,905758763 7,666081227 8,553643689 1.19579734350864e-05 0,008337932

56262 0,912017157 11,54976301 8,535001776 1.21735309054371e-05 0,008337932

157 -1,611194101 10,07410734 -8,449010001 1.32246275601811e-05 0,008722377

2050 1,14890615 8,334851704 8,365496263 1.43414725365402e-05 0,00877029

5295 -1,339082297 9,270794271 -8,365315465 1.43439999060357e-05 0,00877029

5754 1,038829341 6,997112489 8,311579568 1.51172866405036e-05 0,00877029

541471 1,185444982 10,38471918 8,284766599 1.55201491136218e-05 0,00877029

51203 1,898659759 8,262710933 8,247583966 1.60984336317396e-05 0,00877029

51330 2,401023087 10,33485488 8,237941996 1.62522215575208e-05 0,00877029

79682 1,540038351 8,384637854 8,173828757 1.73167264134797e-05 0,00906989

22861 -0,9628272 7,900876874 -8,078060453 1.90519599582042e-05 0,009419884

80325 -0,984246414 10,58843737 -8,054256347 1.95122724610364e-05 0,009419884

332 2,601838185 9,936349792 8,051219934 1.95718606648487e-05 0,009419884

6790 1,721496802 8,056554846 8,017040016 2.02565631882032e-05 0,009492865

3624 3,429633239 9,585551188 7,952341954 2.16256362755282e-05 0,009696314

128408 -1,443797363 11,4465483 -7,945344621 2.17796802694478e-05 0,009696314

57648 2,382017595 9,588140988 7,861805962 2.37146276552714e-05 0,009727647

2150 1,812910141 7,515960736 7,86150297 2.37219796738778e-05 0,009727647

84627 1,575775347 9,129878734 7,854522972 2.38920405755272e-05 0,009727647

79686 -1,409964199 10,19374091 -7,848694623 2.40350661087991e-05 0,009727647

Tabel 11. Lista celor 44 de gene cu un p ≤ 0.01

Page 57: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

57

A7. Secventierea pentru genele candidate

- Secventierea genelor candidate - Studii secundare pentru gasirea unor biomarkeri plasmatici echivalenti - Studiu comparativ privind piata serviciilor de analiza genomica pt dezvoltarea de noi

biomarkeri - Contract de consultanta in scopul valorificarii rezultatelor cercetarii

Secveţierea de tip whole exome sequencing

Pentru secvenţiere s-a utilizat platforma HiSeq2000 Illumina, cu la 50X coverage mediu pentru

zonele de interes.

Tehnologia Illumina de secventiere paralel in masa se bazează pe secventierea prin sinteza [158].

După preparare tesuturilor, secvențierea începe cu adăugarea ADN-polimerazei si a unui amestec

de patru nucleotide, fiecare etichetata cu un terminator reversibil și o eticheta fluorescenta

specifica bazelor. Fragmentele sunt alungite treptat cu cate o nucleotida, și după încorporarea

nucleotidelor, activarea prin laser și achiziția de imagini permite identificarea nucleotidelor recent

încorporate. Eticheta fluorescenta și terminatorul sunt apoi eliminate, si incepe următorul ciclu de

secventiere [159]. Experimentul de secvenţiere a permis identificarea genelor responsabile pentru

răspunsul la tratament prin determinarea unei semnaturi genetice a pacientilor cu CPCNM.

Intr-o prima etapa secventele adaptor din datele brute precum si datele de calitate inferioara (cu

multe N) sunt indepartate. Acest pas a permis dobandirea datelor nealterate/ curate. Apoi este

realizata alinierea BWA (Burrow-Wheeler Aligner). Acest tip de aliniere genereaza date in fisiere cu

format .bam. Aceste fiesiere sunt necesare pentru procesari, precum stabilirea informatiei pereche

a alinierii, adaugarea informatiei despre grupul de citire, realizarea citirilor duplicat cauzate de PCR.

Dupa aceste procesari, fisierele BAM au fost utilizate pentru citirea variantelor. SNP (Single

Nucleotide Polymorphism) sunt determinate cu SOAPsnp, insertiile/deletiile (InDels) mici sunt

determinate cu Samtools/GATK, SNVs (Single Nucleotid Variants) sunt detectate cu Varscan.

Insertiile/deletiile (In/Del) somatice sunt detectate cu GATK, CNVs (Copy Number Variation) sunt

Page 58: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

58

detectate cu Exome CNV/Varscan. Procedura experimentala include si estimarea puritatii. Ulterior o

serie de filtre au fost aplicate pentru obtinerea unor rezultate mult mai sigure. Apoi s-a utilizat

ANNOVAR pentru adnotarea variantelor rezultate. Variantele finale pot fi utilizate in procedura

avansata ulterioara, in aval.

Procedura experimentala standard este prezentata in figura de mai jos (Figura 8):

Figura 8 : Rezultatele analizei bioinformatice: Procedura experimentala standard de whole exome

sequencing

Page 59: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

59

Controlul calitatii datelor de secventiere

Definim citirile brute ca citiri care contin secventa adaptorului, un continut mare de baze

necunoscute si citiri de calitate inferioara. Acestea trebuie sa fie inalturate inaintea analizei de date.

Pasii de filtrare sunt urmatorii:

1. Eliminarea citirilor adaptorului: Citirile adaptorului sunt definite ca o citiri care include bazele

adaptorului; aceste cititi ale adaptorului vor fi eliminate din datele brute ale FASTQ;

2. Eliminarea citirilor de calitate inferioara: daca mai mult de jumatate din bazele dintr-o citire

sunt baze de calitate inferioara care a fost definite ca si calitate a bazelor mai mica sau egala

cu 5, consideram citirea ca fiind inferioara calitativ si aceasta va fi eliminate din datele brute

ale FASTQ;

3. Eliminarea citirilor in care bazele necunoscute au un procent mai mare de 10%

Dupa filtrare, citirile ramase sunt denumite “citiri curate” sunt utilizate pentru analiza

bioinformatica ulterioara. In final s-a realizat o statistica pentru a avea productia de date pentru

datele brute FASTQ si datele curate. In acelasi timp, calitatea datelor curate poate fi prezentata

intr-o imagine.

Controlul de calitate al alinierii

Citirile secventierii au fost aliniate cu secventa genomului de referinta folosind BWA. Pentru

cartografiere s-a folosit genomul uman ca genom de referinta. BWA a fost selectat dupa evaluarea

performantei sale. BWA este un program eficient, care analizeaza secventele de nucleotide relativ

scurte in vederea producerii unor rezultate precise si rapide , cu rate de eroare scazute. BWA

furnizeaza schema flexibila a parametrilor si productia alinierii este prezentata in format SAM

(Sequence Alignment/Map).

S-a folosit picard pentru a marca citirile in duplicat (informatii in exces produse prin PCR). Dupa care

s-au combinat rezultatele de aliniere la un format de fisier BAM care este forma compresata a

fisierelor SAM.

Page 60: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

60

S-a considerat genomul uman build 37 (hg19) ca genom de referinta pentru acest proiect.

Dimensiunea intregului genom hg19 este de 3,137,161,264, in timp ce dimensiunea efectiva este de

2,861,327,131 (excluzand bazele N, regiunile randomice, regiunile hap, cromosomul Un,

cromosomul M in referinta).

Analiza SNP

Am utilizat SOAPsnp pentru detectia SNPs. Genotipul cu cea mai mare probabilitate la un locus dat

este identificat pentru fiecare proba secventiata a unui individ si secventa consens a probei este

asambalata si salvata in format CNS. Utilizand secventa consens, locusul polimorfic intre genotipul

identificat si cel de referinta poate fi filtrat si evidentiat; acesta va constitui setul de date SNP cel

mai sigur. Setul de date este salvat intr-o fila separate in format text.

Analiza In/Del si Distrbutia lungimilor

Am utilizat citirea capetelor imperecheate pentru alinierea decalajelor pentru a detecta InDel-urile

(small Insertion/Deletion) utilizand programul mpileup in SAMtools.

Distrbutia lungimilor InDelurilor in intreaga regiune tinta si regiunea CDS au fost de asemenea

reprezentate. Distributia lungimii InDel-urilor in regiunea CDS arata faptul ca peak-urile sunt

prezente in lungimile 3,6,9. InDel-urile cu aceasta periodicitate nu sunt InDel-uri de tip frameshift,

ele afecteaza relativ putin genomul in comparative cu InDel-urile de tip frameshift.

Analiza In-Dels

Parametru Java-jar GenomeAnalysisTK.jar – T UnifiedGenotyper – stand_call_conf50

stand_emit_conf10.0 – A DepthOfCoverage – A RMSMappingQuality-baq

CALCULATE_AS_NECESSARY –glm INDEL

Analiza statistică

În analiza statistica, variabile dihotomice au fost exprimate ca numere absolute și procente și

variabilele cantitative au fost rezumate ca valori medii cu primul și al treilea cuartil.

Page 61: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

61

Asocierea dintre variabilele calitative a fost verificată prin intermediul testului χ2 sau testul Fisher.

Semnificația statistică a diferenței dintre valorile medii a fost testată prin Mann-Whitney U-test

pentru probele nepereche.

Analiza statistica si a distributiei rezultatelor secventierii

In Tabelul 1 este redat un exemplu de rezultate statistice calculate in urma secventietii unui

esantion tisular.

Tabel 1: Statistica datelor pentru o proba

Nota:

1. Regiunea din vecinatatea tintei se refera la regiunile adiacente nu mai departe de 200 pb

fata de regiunea tinta.

2. Citirile efective inseamna cartarea citirilor dupa procesul de indepartare al duplicatilor.

Bazele efective inseamna bazele din citirile efective.

3. Regiunile tinta utilizate aici se refera la regiuni genomice pe care array-ul exomomic de fapt

l-a acoperit.

Page 62: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

62

4. Citirile cartate unic : citirile alinierii a calitatii cartografierii >= 1.

Distributia profunzimii secventierii per baza si distributia cumulativa a profunzimii in regiunile tinta

au fost de asemenea reprezentate grafic mai jos (Tabelul 2 si Figura 13).

Page 63: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

63

Tabel 2 si Figura 13: Statistica de distributie pentru o proba

Distributia profunzimii secventierii per baza a urmat aproximativ o distributie Poisson, care arata ca

regiunea tinta de capturare a exomului a fost uniform esantionata. Axa x indica profunzimea

secventierii, in timp ce axa y indica procentul regiunii tinta totala sub o anumita profunzime a

secventieri.

Intre timp in graficul distributiei cumulative a profunzimii din regiunile tinta, axa x indica adancimea

secventierii si axa y indica fractia de baze care atinge sau depaseste o anumita profunzime a

secventierii.

Statistica SNPs

Dupa ce SNPs sunt identificate, s-a utilizat ANNOVAR pentru a face adnotarile si clasificarea (Tabelul

3).

Nota: Valoarea din prima coloana se ghideaza dupa urmatoarele prioritati:

exonic=splicing>ncRNA>>UTR5/UTR3>intron>upstream/downstream>intergenic.

1. Hom-homozigot; Het-heterozigot;

Page 64: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

64

2. Exonic se refera numai la portiunea codanta, dar nu si la portiunea UTR, dupa cum exista 2

cuvinte UTR5 si UTR3 care sunt special rezervate pentru adnotarile UTR.

3. Stopgain inseamna ca un SNV nonsinonim care a condus la imediata creare a codonului stop

la situsul variant, iar stoploss inseamna ca a condus la o eliminare imediata a codonului stop

la situsul variant.

4. Splicing-ul in ANNOVAR este definit ca varianta care este la 2 bp departare de o limita

exon/intron

5. Daca o varianta este localizata atat in regiunea exonic cat si la joctiunea de splicing, atunci

au fost calculate atat exonii cat si splicingul (“exonic and splicing”).

6. Termenii upstream si downstream sunt definiti ca fiind la 1kb departare de situsul de start al

transcrierii sau situsul de terminare a acesteia.

7. SIFT (Sortarea tolerantului de intolerant) prezice daca o substitutie a unui aminoacid

afecteaza functia proteica.

8. Ti se refera la tranzitie, TV se refera la transversie.

Tabel 3: Statistica SNP-urilor pentru o proba

Page 65: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

65

Statistica in Analiza In/Del

Dupa ce InDel-urile sunt identificate utilizam ANNOVAR pentru a face adnotarile si clasificarea

(Tabelul 4 si Figura 14).

Nota: Valoarea din prima coloana se ghideaza dupa urmatoarele prioritati:

exonic=splicing>ncRNA>>UTR5/UTR3>intron>upstream/downstream>intergenic.

1. Mutatiile de tip frameshift inseamna o insertie sau o deletie a uneia sau a mai multor

nucleotide care cauzeaza schimbari de tip frameshift in secventa proteica codanta.

2. Mutatiile de tip nonframeshift inseamna o insertie sau o deletie a 3 sau multiplu de 3

nucleotide care nu cauzeaza schimbari de tip frameshift in secventa proteica codanta.

3. Substitutia in bloc de tip frameshift sau nonframeshift inseamna ca o susbtitutie in bloc a

uneia sau a mai multor nucleotide care (nu) cauzeaza schimbari de tip frameshift in secventa

proteica codanta.

4. Exonic se refera doar la portiunea exonica codanta, dar nu si la portiunea UTR, dupa cum

exista 2 cuvinte UTR5 si UTR3 care sunt special rezervate pentru adnotarile UTR.

5. Stopgain se refera la o insertie sau o deletie de tip frameshift, o insertie sau o deletie de tip

nonframeshift sau o substitutie in bloc care conduce la o creare imediata de codon stop la

situsul variant. Pentru mutatii de tip frameshift, crearea unui codon stop downstream de

variant nu va fi considerat ca “stopgain”. In timp ce stoploss se refera la faptul ca se produce

o eliminare imediata a codonului stop la situsul variant.

6. Splicing-ul in ANNOVAR este definit ca varianta si care este la 2 bp departare de o legatura

exon/intron

7. Daca o varianta este localizata atat in regiunea exonic cat si la joctiunea de splicing atunci va

fi calculate atat ca exon cat si ca splicing (“exonic and splicing”).

8. Termenii upstream si downstream sunt definiti ca fiind la 1kb departare de situsul de start al

transcrierii sau situsul de terminare a acesteia.

Page 66: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

66

Tabel 8 si Figura 10: Statistica InDel pentru o proba

Secventierea exomului (Whole exome sequencing)

Dupa analiza calitativa a esantioanelor recoltate, doar 15 pacienti au indeplinit aceste criterii.

Pacientii ai caror ganglioni mediastinali tumorali pre-chimioterapie sunt analizabili se impart in:

- Lotul A - 9 pacienti care nu au raspuns la chemioterapie, au avut raspunsuri minore sau au

fost doar stabilizati prin chimioterapie neoadjuvanta.

- Lotul B – 6 pacienti care au avut un raspuns obiectiv la chimioterapie neoadjuvanta.

Mediile numarului de secventieri a tintei per fiecare proba analizata, exprimate procentual, sunt

prezentate in tabelul de mai jos (Tabelul 16):

Page 67: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

67

Proba Procent (%)

LOT A_11B00790 50.72

LOT A_11B02611 65.75

LOT A_11B02967 57.72

LOT A_11B04855 57.23

LOT A_11B04906 61.05

LOT A_12B05696 58.44

LOT A_LUN85_1 66.85

LOT A_LYN77_1 60.65

LOT A_LYN84 65.56

LOT B_11B01622 65.85

LOT B_12B03834 65.8

LOT B_LUN49_1 65.96

LOT B_LYN 101_1 65.66

LOT B_LYN43_1 63.28

LOT B_LYN48_1 58.82

Tabel 16 : Mediile numarului de secventieri a tintei per proba

In Tabelul 17 sunt prezentate numarul total de SNP obtinute prin secventiere in fiecare proba

analizata:

Proba Numar total SNP

LOT A_11B00790 79698

LOT A_11B02611 88013

LOT A_11B02967 78338

LOT A_11B04855 87236

Page 68: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

68

LOT A_11B04906 84855

LOT A_12B05696 80321

LOT A_LUN85_1 82614

LOT A_LYN77_1 81344

LOT A_LYN84 84592

LOT B_11B01622 78490

LOT B_12B03834 84547

LOT B_LUN49_1 85919

LOT B_LYN 101_1 86017

LOT B_LYN43_1 76863

LOT B_LYN48_1 81829

Tabel 17 : Numarul total de SNP per proba

In tabelul de mai jos (Tabelul 18) sunt prezentate numarul total de In/Del obtinute prin secventiere

in fiecare proba analizata:

Proba Numar total In/Del

LOT A_11B00790 8557

LOT A_11B02611 10285

LOT A_11B02967 8804

LOT A_11B04855 9983

LOT A_11B04906 9826

LOT A_12B05696 9046

LOT A_LUN85_1 9672

LOT A_LYN77_1 9707

Page 69: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

69

LOT A_LYN84 10254

LOT B_11B01622 9050

LOT B_12B03834 9547

LOT B_LUN49_1 9911

LOT B_LYN 101_1 10050

LOT B_LYN43_1 8898

LOT B_LYN48_1 9000

Tabel 18 : Numarul total de In/Del per proba

S-a identificat un numar de 216 gene cu mutaţii cu un p-value ≤ 0.05 care sunt associate cu

fenotipul cancerului bronho-pulmonar cu cellule non-mici (Figura 14).

Figura 14: Genele identificate, cu p value semnificativ statistic, prin whole genome sequencing

intre loturile de pacienti analizati

TOTAL = 216 gene

P-value< 0.05 – 211 gene

P-value<0.01 – 5 gene

Page 70: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

70

Selecţia genelor cu p-value ≤ 0.01 (Tabel 19), a condus la identificarea SNP-urilor pentru genele

SENP5 (rs63736860 si rs1602), RGP1 (rs1570248), NCBP2 (rs553783), SLFN12L (rs2304968 si

rs9905892) si GBA2 (rs3833700) care permit identificarea pacienţilor cu raspuns la tratament

chimioterapeutic neoadjuvant versus pacienţii cu răspuns minor la tratament chimioterapeutic

neoadjuvant (Tabel 20).

Mutaţiile SENP5 (rs63736860 si rs1602) si NCBP2 (rs553783) sunt identificare cu o frecvenţă mult

mai crescută la pacienţii cu raspuns minor la tratament, în timp de mutaţiile RGP1 (rs1570248),

SLFN12L (rs2304968 si rs9905892) şi GBA2 (rs3833700) sunt identificate cu o frecvenţă mult mai

mare la pacienţii cu răspuns obiectiv la tratamentul de inductie.

Astfel prezenţa SNP-urilor menţionate pentru genele SENP5 şi NCBP2 pot indica un non-raspuns la

tratament, în timp ce prezenţa SNP-urilor meţionate pentru genelor RGP1, SLFN12L si GBA2 pot

indica un răspuns pozitiv la tratamentul chimioterapeutic neoadjuvant.

Numarul cromozomului

ID REF ALT LOTA* (Alt_freq)

LOTB** (Alt_freq)

Valoare P***

Simbolul genei

Numele complet al genei

chr3

rs63736860 CT C 1 0.5 0.0015 SENP5 SUMO1/sentrin specific peptidase 5

chr3

rs1602 G A 0,95 0,5 0.008 SENP5

chr9

rs1570248 C T 0,5 1 0.0040 RGP1 Retrograde Golgi Transport Homolog (S. Cerevisiae)

chr3

rs553783 A G 0,95 0.5 0.0057 NCBP2 Nuclear Cap Binding Protein Subunit 2

Page 71: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

71

chr17

rs2304968 T C 0,54 1 0.0058 SLFN12L Schlafen Family Member 12-Like chr17

rs9905892 T A 0,54 1 0.0058 SLFN12L

chr9 rs3833700 G GC 0,55 1 0.009 GBA2 Glucosidase, Beta (Bile Acid) 2

*LOT A- include pacientii cu raspuns minor la tratament **LOT B- include pacientii cu raspuns la tratament ***Valoarea P a fost calculatea conform testului Fischer

Tabelul 19. Gene cu mutaţii cu un p-value ≤ 0.01

ID dbSNP

rs63736860 GTGCCACTGAAGTGTTTCTGGGACC[-/T]TTTTTTTTGCAGTACTGCAAGTGCC

rs1602 ATAACCTCCAGTGAGACATGGATGA[C/T]ACCCACACTTCACTCTTGATCCCTG

rs1570248 AAACCCTAACCTCTACTCTCATCTC[C/T]GTTCCCTCTCAGCATTACCTCTCCA

rs553783 GGGTAGAGCTGAGAGTGGTAGCTCA[C/T]AAGCGTCCCTGCACTCGTCCCTACG

rs2304968 ACATCATCACCTGTCTCCCAGAGTT[A/G]TCCTCTTCGTGAATATATTAACTTC

rs9905892 GAGCCGTTAGAATAGGAGTTAAGCC[A/T]GAGAGACAGCAAATTCTGCATTATG

rs3833700 CTGAGAGTGGCCAGAGCTGGGGGAG[-/C]AGACACAGAAGGGAGGCAGGGAATG

Tabel 20. Secventa SNPs (Single Nucleotid Polymorphism)

Page 72: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

72

Mutatiile SENP5 (rs63736860 si rs1602) si NCBP2 (rs553783) sunt identificare cu o frecventa mult

mai crescuta la pacientii fara raspuns la tratament, in timp de mutatiile RGP1 (rs1570248), SLFN12L

(rs2304968 si rs9905892) si GBA2 (rs3833700) sunt identificate cu o frecventa mult mai mare la

pacientii cu raspuns la tratament.

Astfel prezenta SNP-urilor mai sus mentionate pentru genele SENP5 si NCBP2 pot indica un non-

raspuns la tratament, iar prezenta SNP-urilor mai sus mentionate a genelor SLFN12L si GBA2 pot

indica un raspuns pozitiv la tratamentul chimioterapeutic neoadjuvant.

Mutatii la nivelul acestor gene nu au fost depistate pana in present in asociatie cu cancerul

pulmonar cu cellule non-mici.

SENP5 (Sentrin-specific protease 5), EC=3.4.22.68 (Figura 15), face parte din familia de protease cu

SUMO-specificitate (SENP). SENP participa in reglarea SUMOilarii prin generarea unor small

ubiquitin-related modifiers (SUMO) pentru conjugarea proteinelor (clivareaa endopeptidazelor) si

deconjugarea tintelor (clivarea izopeptidazelor). Boli asociate modificarilor la nivelul SENP5 sunt

carcinomul oral cu celule squamoase si carcinomul cu celule squamoase.

Figura 15. Reteaua generata de programul String 9.05 pentru SENP5

Page 73: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

73

NCBP2 (Nuclear Cap Binding Protein Subunit 2), component a complexului de legare a proteinei cap,

care se leaga la capatul 5`al pre-miRNA si este implicate in procese variate precum splicingul pre-

miRNA, reglarea translatiei, degradarea mARN, silentiere geneica mediata de microARN si exportul

mARN (Figura 16).

Figura 16. Reteaua generata de programul String 9.05 pentru NCBP2

RGP1 (RGP1 retrograde golgi transport homolog), poate fi necesar pentru fuziunea eficenta a

veziculelor derivate din endozomilor cu aparatul Golgi (Figura 17).

Boli associate cu modificari la nivelul RGP1 include boala periodontala si periodontita.

Page 74: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

74

Figura 17. Reteaua generata de programul String 9.05 pentru RGP1

GBA2 (Beta Glucosidase) se gaseste in reticulul endoplasmatic si membrane aparatului Glogi fiinf

implicate in metabolismul sfingolipidelor (Figura 18). Mutatii la nivelul acestei gene sunt ascociate

cu boala Gaucher.

Functia enzimei GBA2 este de a hidroliza, la nivelul ficatului, acid 3-O-glucozidaza din bila, ca si

compus endogen, dar si de a hidroliza glucozilceramidele.

De exemplu, soarecii deficienti GBA2 prezinta acumularea de GlnCer in diferite tesuturi.

Figura 18. Reteaua generata de programul String 9.05 pentru GBA2

Page 75: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

75

SLFN12L (schlafen family member 12-like) este implicate in legarea dependent de ATP si

preferential exprimata in tesuturile limfoide (Figura 19).

Modificari la nivelul SLFN12L sunt associate cu diabetul de tip 1.

Figura 19. Reteaua generata de programul String 9.05 pentru SLFN12L

Page 76: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

76

A8. Validarea tehnicilor de Tissue-Array pe limfoganglion in aprecierea

prognosticului

- Validarea tehnicilor de Tissue-Array in comparatie cu tehnicile de micro-array

Experimentele de tissuearray

Tehnica Tissue Array (Figura 9) folosita in cadrul proiectului de cercetare a permis analiza pe aceeasi

lama histologica a unor probe tisulare apartinand unor pacienti diferiti.

Prin aceasta tehnica s-a urmarit identificarea nivelului de expresie a celor cinci proteine cofidicate

de genele la nivelul carora s-au identificat mutatii in experimentul de secventiere intre cele doua

loturi de paciente analizati.

Avantajele tehnicii Tissue Array.

1. Se pot preleva 80 de esantioane pe o lama histologica uzuala. In acelasi timp, se pastreza

dimensiunea de baza de la 1,5 mm in diametru pentru a ca tesutul prelevat pentru tehnica tissue-

array sa fie reprezentativ.

2. O lama de tissue-array poate conţine 200 de probe, reprezentând 200 de cazuri cu diametru de

1,0 mm.

3. Economisirea markerilor imunohistochimici.

4. Folosirea „bancilor de blocuri de parafina” in departamentele de patologie pentru o evalare

retrospectiva a noilor markeri tumorali pentru fiecare pacient . Detaliind, cu cat noile metode vor fi

aplicate mai repede in practica zilnica cu atat factorii de prognostic si tatament vor fi mai relevanti.

5. Majoritatea ramurilor de cercetare in cancer sunt focalizate pe tehnicile de Tissue Array.

Raspandirea folosirii Tissue Array va deveni o parte integranta in practica zilnica a cercetarii si in o

practica de rutina in laboratoarele clinice. Pe fundalul cazurilor de tumori arhivate, anatomo-

patologii vor putea folosi potentialul tehnologic al tissue array pentru a putea prezenta atat cazurile

arhivate cat si recente, comunitatii stiintifice.

Page 77: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

77

6. Reducerea numarului de lame examinate

7.

Analiza probelor poate fi automatizata

8. Uniformitate experimentala

Materiale si metoda.

Din partea spitalului Hotel Dieu, Paris, Franta au fost aduse in Institutul Clinic Fundeni Bucuresti,

Romania 6 blocuri de parafina, respectiv lamele histologice corespunzatoare apartinand unui lot de

6 pacienti cu neoplazii maligne pulmonare.

Compararea rezultatelor I. Initial au fost analizate lamele histologice in vederea selectarii campului cel mai bine reprezentat

din punct de vedere tumoral. Ulterior s-au comparat blocurile de parafina cu lamele histologice

corespunzatoare in vederea corelarii imaginii microscopice cu cea macroscopica; acest pas a fost

extrem de important deoarece o buna orientare a materialului tisular conduce la o corecta recoltare

si deci la rezultate corecte.

II. In urmatoarea etapa s-a realizat un proiect pentru tissue array care sa cuprinda cele 6 blocuri

donoare de parafina si 2 blocuri receptor (cele 2 blocuri receptor formate sunt blocuri de parafina

identice). In total s-au realizat 16 punctii in blocurile de parafina, din care 4 au fost folosite pentru

orientare si cate 6 pentru fiecare bloc receptor.

Page 78: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

78

Figura 9 : Aspecte preluate din software-ul echipamentului Tissue array

III. Ulterior s-a programat locul din blocul receptor in care ulterior au fost pozitionate fragmenele

recoltate din blocurile donor (Figura 10). Pentru orientare, s-a stabilit ca primele 2 pozitii din blocul

receptor sunt pozitii de control. In etapa actuala, s-au stabilit distantele fata de marginile blocurilor

de parafina la care s-au preformta locusurile in care s-au depuns automatizat, fragmentele de tesut

tumoral prelevat din blocurile de parafina donoare.

Page 79: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

79

Figura 10 : Aspecte preluate din software-ul echipamentului Tissue array

IV. In aceasta etapa de lucru s-au pozitionat cele 6 blocuri de parafina donor, si cele 2 blocuri

receptor in caruselul MiniCore in locurile prestabilite (Figura 11). In pozitiile 1-6 ale caruselului s-au

fixat blocurile donor, iar in pozitiile 7-8 s-au fixat blocurile receptor (blocurile donor sunt marcate cu

albastru in programul informatic, iar cele receptor cu rosu).

Figura 11 : Aspecte preluate din software-ul echipamentului Tissue array

Page 80: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

80

V. Este etapa efectiva in care dintr-o arie tumorala prestabilita s-au recoltat tesut tumoral conform

proiectului de Tissue microarray anteprezentat. Imaginile urmatoare prezinta in detaliu aria din care

s-a facut recoltarea (Figura 12).

Figura 12 : Blocul receptor realizat si aspecte microscopice (coloratie hematoxilina-eozina) ale

probelor analizate

Page 81: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

81

DISCUTII

Cancerul pulmonar reprezinta una din principalele cauze de deces la nivel mondial de cancer [170],

de multe ori pentru că doar un număr redus de pacienți au la diagnosticul initial o tumoare în stadiu

incipient, care poate beneficia de rezectie chirurgicala. Aproximativ 30% din cazuri sunt intr-un

stadiu local avansat (stadiul III) la diagnosticul initial. Tratamentul optim pentru acești pacienți nu a

fost încă bine definit și depinde de mai multi factori [171]. Prognosticul pacientilor cu NSCLC in

Stadiul III tratati printr-o singur optiune terapeutica, cum ar fi chimioterapie, radioterapie sau

chirurgie, este în general prost. Rata de supravietuire la 5 ani pentru pacientii cu N2 clinic sau

dovedit histologic care au fost tratati numai prin rezectie chirurgicala este redusa, variind de 9-16%,

iar cei mai multi pacienti decedeaza prin recidive locale și sistemice după rezecția primară [172,

173]. Din aceste motive, tratamentul pacientilor cu N2 pozitiv ramane controversat; deși cei mai

multe chirurgi cred că există un rol important pentru chirurgie în tratamentul acestei boli, există o

lipsă de consens în ceea ce privește extinderea rezecției, rolul downstagingului și regimurile optime

de chimioterapie si / sau iradiere care trebuie asociate.

Istorie și rolul terapiei de inductie

Primele utilizări ale chimioterapiei neoadjuvante dateaza de la sfârșitul anilor 1980, când a fost

limitată la cazuri de CPCNM local avansat (stadiul IIIA-N2-III B) și introduse in scopul de a imbunatati

rata de supravietuire redusa vazut observata în acest grup. O serie de studii prospectiv randomizate

și evaluări retrospective au arătat rate de supravietuire mai bune pentru pacientii care au primit

chimioterapie neoadjuvanta comparativ cu interventii chirurgicale ca monoterapie [147, 146-155].

Pe baza acestor date, în septembrie 2001, Societatea Europeana de Oncologie Medicala (ESMO) a

stabilit liniile directoare de tratament recunoscand chimioterapia neoadjuvanta ca tratament

standard pentru stadiul III rezecabil in CPCNM [174]. O meta-analiza recenta a 13 studii

randomizate controlate, incluzand 3224 pacienti, a confirmat oportunitatea acestor linii directoare,

demonstrand un beneficiu de supravietuire cu un HR de 0,84 (95% CI 0.77 - 0.92, p <0,0001) la

pacienții tratați cu chimioterapie neoadjuvanta comparativ cu interventia chirurgicale ca

monoterapie [175].

Page 82: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

82

După diagnosticarea cancerului pulmonar, parametrii clinicopatologici cum sunt profilul histologic al

tumorii, stadializarea si localizarea metastazelor determina prognosticul bolii și alegerea

tratamentului [176,177]. Ghidurile de practică clinică actuale diferențiaza cancerul pulmonar cu

celule mici (CPCM) și cancerul pulmonar cu celule non-mici (CPCNM), precum și cele mai importante

subtipuri de CPCNM: carcinom cu celule scuamoase și non-scuamoase, rezultate din analizele de

histopatologie standard.

Analiza microarray a materialului tumoral rezecat permite realizarea unui profil molecular. Astfel,

bazat pe profilele de transcriptie, adenocarcinoamele (AC) pulmonare au putut fi stratificate în

subgrupuri moleculare care propun diverse caracteristici celulare si de prognostic [178-183]. In

raport cu unele similitudini de transcriptie ale unor carcinoame definite histologic (carcinom

bronchioalveolar, carcinom cu celule scuamoase, si carcinom cu celule mari), diferite paternuri de

expresia genica au fost asociate cu diferite subtipuri de adenocarcinom (respectiv bronchioid,

squamoid, magnoid) [181]. Recent, o clasificare arhitecturala a adenocarcinoamelor pulmonare

invazive a descris cinci modele predominante ce au fost dovedite ca fiind prognostice pentru

supraviețuire independent de stadiu [184,185]. Prezenta de mai multe patenuri histologice diferite

intr-o singura tumora împiedică evaluarea arhitecturii predominante. Mai mult, diferitele patenuri

histopatologice ale adenocarcinomului nu corespund neaparat cu un subtip molecular.

Analizele de subtip similare au fost efectuate pentru carcinoamele pulmonare cu celule scuamoase

(CCS) pentru estimarea prognosticului [186-188]. Clasificarea CCS in patru subtipuri de expresie

genica diferite (primitiv, clasic, secretoriu și bazal) generate de analizele microarray au fost

reproductibile prin analize microarray independente și prin secvențierea de ARN a aproximativ 600

de CCS [188,189]. Subtipul primitiv a fost asociat cu prognosticul cel mai prost. Mai mult decât atât,

diferitele paternuri de expresie genica ale diferitelor subtipuri moleculare au fost correlate cu

starea de activare a proceselor biologice și celulare, și căile oncogene.

Mai multe studii pe baza de qPCR-și de microarray au identificat paternuri de miRNA specifice

subtipurilor de cancer pulmonar. De exemplu, clasificarea histologica a AC și CCS a fost realizata cu

un panel 34-miRNA pe blocuri de parafina la 205 fumatori de sex masculin [190].

In studiul de fata a fost investigata expresia genica si caile de semnalizare a pacientilor cu cancer

pulmonar cu cellule non-mici si invazia ganglionilor mesiastinali (stadiul IIIA, N2) in functie de

raspunsul histologic la tratamentul prin chimioterapie neoadjuvanta.

Page 83: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

83

Nu s-au determinat gene corelate statistic semnificativ cu răspunsul la tratament. Nu s-a putut

determina un semnal de raspuns la chimioterapie nici prin clusterizarea, nici prin analiza

componentelor principale sau a expresiei genice.

In schimb, s-au determinat multe gene corelate cu statusul histologic al ganglionilor limfatici

mediastinali precum si in raport cu sexul pacientilor. Genele cele mai variabile ale pacientilor

responders sunt in legatura cu keratinizarea, iar cele ale pacientilor non-responders, in legatura cu

stimularea hormonala si activitatea peptidazei. Patenul de expresie genica a pacientilor de sex

masculin se confundă cu răspunsul la chimioterapie în acest studiu.

Analiza cailor moleculare folosind analiza de impact și studiind modificări ale tuturor genelor a dus

la unele rezultate convingătoare in legatura cu mecanismele de răspuns la chimioterapie.

Această analiză sugerează că diferența dintre responders si non-responders se gaseste în reglarea

mecanismelor imunitare. Toate caile care au fost semnificative pentru răspunsul la chimioterapie s-

au suprapus peste cele care sunt, de asemenea, semnificative pentru diferenta între bărbați și

femei. Pe de alta parte, luând în considerare numai pacientii de sex masculin, au rămas

semnificative trei cai de reglare a mecanismelor imunitare: poliartrita reumatoida, tiroidita

autoimuna, și calea de semnalizare a Citokinelor.

Acumularea totala de perturbare in calea poliartritei reumatoide a fost, în esență, aceeași pentru

responders si non-responders, si pentru pacientii de sex feminin comparativ cu cei de sex masculin.

Acumularea totală perturbare in calea tiroiditei autoimune a fost similară în ceea ce privește

activitatea celulelor T, dar diferita intre responders si non-responders în ceea ce privește răspunsul

imun și inflamator, și apoptoza. Acumularea totala de perturbare pe calea de semnalizare a

Citokinelor a fost inhibata în întregime la non-responders fata de responders, dar a fost în întregime

activata la femei comparativ cu bărbații.

Observațiile rezultate din analiză cailor moleculare sugereaza ca hormonii sexuali si raspunsul la

chimioterapie ar putea fi interconectate. Semnificativitatea termenilor GO a stimulusului hormonal

printre genele cu varianta mare la non-responders susține această ipoteză. Având în vedere că

acumularea totală de perturbare in poliartrita reumatoida este similară cu cea a răspunsului la

chimioterapie, este interesant de observat că estrogenul și citokina CCL13 sunt implicate in

severitatea poliartritei rheumatiode datorata deregularii apoptozei [191]. Nilsson [192] arata

importanța estrogenilor (atât ERα și ERβ) în controlul evoluției inflamației, în special prin

Page 84: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

84

modificarea comportamentului leucocitelor, și prin down-regularea citokinelor și a adeziunii

moleculare. Hohla si colab. [33] a constatat că sexul feminin este asociat cu un răspuns favorabil la

chimioterapie in cancerul pancreatic. Rodriguez-Lara și colab. [194] a aratat că adenocarcinoamele

pulmonare exprima in exces ERβ, precum și citokinele CXCL12 și CXCL4 față de tesutul pulmonar

normal, și că aceasta supra-expresie este mai pronunțata la femeile aflate in premenopauza, care

au un risc crescut, decât la femeile în postmenopauză sau la bărbați. Cercetarile lui Szymanowska-

Narloch si colab. [195] arata utilitatea potențială a terapiei hormonale in CPCNM la pacienti

selectati.

Factori de prognostic

Mai multi factori au dovedit imbunatatirea supravietuirii fara boala si supravietuirii globala la

pacientii tratati cu chimioterapie neoadjuvanta, cum sunt: răspunsul clinic și histologic la

chimioterapie, rezecția completa a tumorii și downstagingul mediastinal [173-175,196]. Ca urmare,

în anii ‘90 au fost efectuate studii de faza II incluzand pacienti cu CPCNM in stadiul IIIA-N2/IIIB

utilizand diferite regimuri de radiochimioterapie, cu scopul de a creste rata de downstaging

mediastinal și astfel, creșterea procentului de rezectie chirurgicala completa [149, 151, 152]. În

ciuda unui procent mai mare de downstaging obținut în aceste studii, cu o rată de rezectie

chirurgicala completa ce se apropie de 93%, si o rata de raspuns complet la chimioterapie între 15 și

24%, a existat o ușoară creștere în morbiditatea și / sau mortalității perioperatorie, fără nici o

creștere semnificativă a ratei de supravietuire, comparativ cu studiile anterioare. Într-un studiu de

faza III al Intergrupului 0139, 396 de pacienti cu CPCNM in stadiul IIIA-N2 au fost randomizati, fie

pentru tratament prin radiochimioterapie neoadjuvanta urmata de rezectie chirurgicala si

chimioterapie adjuvanta de consolidare, fie pentru a radiochimioterapie concomitenta definitiva.

Rata mediana de supravietuire globala in grupul neoadjuvant versus grupul radiochimioterapie

singura nu diferă semnificativ (supravietuire la 5 ani de 27 vs 20%, risc relativ 0,63; 95% CI 0.36-

1.10). Cu toate acestea, o analiză de subgrup a relevat un avantaj statistic semnificativ al ratei de

supravietuire la 5 ani pentru pacientii care au fost tratati prin radiochimioterapie neoadjuvanta si

lobectomie, comparativ cu cei care au fost tratati doar prin radiochimioterapie (36 și 18%, respectiv,

p = 0,002), si a determinat un rol prognostic negativ in caz de pneumectomie [146]. Astfel, o re-

Page 85: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

85

evaluare corecta a pacienților după terapie neoadjuvanta, in mod special a statutului ganglionilor

mediastinali, este de o importanță capitală. În experiența noastră, toți pacienții au avut o

confirmare histologica a statusului ganglionilor limfatici înainte de începerea tratamentului de

inducție, prin abordare chirurgicala (mediastinoscopie sau toracoscopie) și, prin urmare,

reevaluarea nu a fost chirurgicala, ci prin examene radiologice (scanare CT toracic și / sau PET-CT).

Îmbunătățirea metodelor bronhoscopice neinvazive pentru examinarea ganglionilor limfatici ar

putea ajuta în viitor, pentru o mai bună evaluare a răspunsului patologic după tratamentul

neoadjuvant, prin combinarea tehnicilor neinvazive înainte de tratament și biopsii chirurgicale

invazive dupa tratament, evitându-se astfel re-mediastinoscopia . Spre deosebire de Liao și colab.

[197], in studiul nostru am găsit nici o diferență intre raspunsul la chimioterapia de inductie la

pacientii cu carcinom de celule scuamoase fata de pacienți cu adenocarcinom.

Screeningul si validarea biomarkerilor moleculari capabili de a prezice raspunsul la diferiti agenti-

chimioterapeutici constituie un pas important spre un tratament personalizat pentru bolnavii de

cancer. În domeniul de biomarkerilor de prognostic, progresele in tehnicile de secventiere și analiza

microarray a genomului tumoral au permis identificarea de semnaturi moleculare si genice care pot

determina o clasificare mai precisă și pronosticare a cancerului pulmonar [198-200]. A fost

raportata o semnătură de cinci gene strâns asociata cu perioada libera de recidiva și cu

supraviețuirea globala la pacientii cu CPCNM, precum si o semnătura de 54 de gene ce ar putea

prezice riscul de recidiva in CPCNM [199]. Cu toate acestea, până în prezent, în domeniul de

biomarkerilor de predictie a chemosensibilitatii, nu există încă nici o semnatura genica c ear putea fi

utilizata pentru personalizarea chimioterapiei in cancerul pulmonar.

În studiul de față, am realizat prin secventierea intregului exom tumoral al pacientilor cu CPCNM in

stadiul IIIA, si am izolat un grup de cinci gene asociate semnificativ pacientilor care au un răspuns

pozitiv la tratamentul chimioterapeutic neoadjuvant (RGP1, SLFN12L si GBA2) si pacientilor care nu

au răspuns la tratamentul chimioterapeutic neoadjuvant (SENP5 şi NCBP2).

Page 86: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

86

Directii de viitor

Progrese continue în tehnologii experimentale și bioinformatica sunt în dezvoltare pentru

explorarea genomului. Platformele de astăzi, care sunt, în esență, limitate la replicarea de secvențe

de nucleotide ADN-ului, ar putea fi înlocuite cu sisteme capabile să capteze ADN-ul cu modificari

epigenetice [201]. Sunt necesare instrumente analitice mai bune pentru a facilita detectarea

sensibilă a mutațiilor cheie și a realiza cataloage complete de date de genom, ceea ce va putea

facilita diseminarea acestor cunoștințe către comunitățile științifice si medicale [202]. Alte progrese

tehnologice, cum ar fi secventierea unei singure celule, sunt susceptibile de a ne ajuta sa intelegem

complexitatea și heterogenitatea genomului tumoral [203].

Mai mult decât atât, o deplina înțelegere a relațiilor complexe dintre caile intracelulare de activare

și mutațiile existente, împreună cu procesele de mutageneză care stau la baza, va putea ghida

dezvoltarea de terapii cu tintita moleculara. Pe masura ce secventierea genomului devine

disponibila pe scară largă și interpretabila cu mare precizie, la un cost redus, aceste informații vor fi

din ce în ce util pentru clinicieni, și mai important, pentru pacientii lor.

CONCLUZII

În concluzie, analiza cailor moleculare sugerează că diferența dintre responders si non-responders se

gaseste în reglarea mecanismelor imunitare. Trei cai de reglare a mecanismelor imunitare au reiesit

semnificative: poliartrita reumatoida, tiroidita autoimuna, și calea de semnalizare a Citokinelor.

Căile de semnalizare identificate cu FDR (false discovery rate) < 0.005 includ: căile de semnalizare a

citokinelor, adeziune focală sau interacţia ECM-receptor.

Pe de alta parte, observațiile rezultate din analiză cailor moleculare sugereaza ca hormonii sexuali si

raspunsul la chimioterapie ar putea fi deasemeni interconectati.

O mai bună înțelegere a relației dintre diversitatea histopatologică a tumorilor pulmonare,

caracteristicile moleculare si evolutia bolii, va contribui la dezvoltarea patologiei moleculara si a

biomarkerilor.

Page 87: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

87

Cercetarile pentru determinarea unor semnături specifice de expresie a genelor, mutații genice și

alte modificări genomice, sunt promitatoare si vor permite identificarea de biomarkeri și de tinte

terapeutice adresate diferitelor tipuri de arhitecturi tumorale.

Mutaţiile RGP1 (rs1570248), SLFN12L (rs2304968 si rs9905892) şi GBA2 (rs3833700) sunt

identificate cu o frecvenţă mult mai mare la pacienţii cu răspuns obiectiv la tratamentul de inductie.

Instituirea acestei semnatura genice compuse din trei gene ca un nou model de estimarea a

sensibilitatii la tratamentul prin chimioterapie neoadjuvanta, asociata semnificativ pacientilor care

au un răspuns pozitiv la tratamentul chimioterapeutic neoadjuvant pe baza de saruri de platina,

constituie un nou pas către realizarea unui tratament individualizat la pacientii cu CPCNM.

Rezultatele noastre sugereaza ca un pacient cu CPCNM stadiu IIIA, care are un nivel ridicat al

indicelui de semnatura a celor trei gene, ar fi un candidat ideal pentru a primi un tratament de

inductie prin chimioterapie dubla, asociind cel putin o sare de platina. Aceste constatări sunt pre-

liminare și doar sugestive în acest moment, și această aceasta semnătură de trei gene trebuie să fie

validate înainte de a fi utilizate în practica clinică de rutina. Este necesara realizarea unui studiu

clinic în scopul de a valida rolul unui tratament personalizat pe baza acestei semnături de trei gene.

Secventierea exonului cancerului pulmonar a permis intelegerea multor mecanisme ale

oncogenezei.

Mai multi factori influenteaza aceste experimente, inclusiv pierderea de putere in a detecta

mutațiile somatice specific tumorale în prezența contaminarii stromale și o capacitate limitata de a

detecta mutații la un subset de secvențe de codificare. Scaderea costul legate de secventiere a

permis lansarea recenta a proiectelor de secventiere a întregului exome și a întregului genom al

cancerului pulomnar, care permite o analiză a mutatiilor intr-o maniera complet imparțiala. Mai

mult decât atât, colectarea datelor rezultate prin metodele de secventiere next-generation, este

"digitala", realizata pentru fiecare molecula, astfel încât capacitatea de a detecta alelele de slaba

abundenta, fie din cauza contaminarii stromale sau datorita heterogenitatii tumorii, depinde doar

de capacitatea de acoperire. Generarea datelor de secventiere a întregului exome și a întregului

genom de la un număr tot mai mare de probe, se va putea realiza o imagine mai globală a mutațiilor

somatice in cancerul pulmonar, oferind o imagine de ansamblu a genomului cancerului pulmonar și

o orientare adecvata a obiectivelor terapeutice.

Page 88: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

88

BIBLIOGRAFIE 1. Jemal A, Siegel R, Xu J, Ward E. Cancer statis- tics, 2010. CA Cancer J Clin. 2010;60:277-300.

2. Travis WD, Travis LB, Devesa SS. Lung cancer. Cancer. 1995;75:191-202. A multicenter phase II study of ganetespib monotherapy in patients with genotypically defined advanced non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2013 Jun 1;19(11):3068-77.

3. Sharma SV, Settleman J. Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and “oncogenic shock.” Biochem Pharmacol. 2010;80:666-73.

4. Weinstein IB. Cancer. Addiction to onco-genes: the Achilles heal of cancer. Science. 2002;297:63-4. 5. Ding L, Getz G, Wheeler DA, et al. Somatic mutations affect key pathways in lung adeno- carcinoma. Nature. 2008; 455:1069-75. 6. Gandhi J, Zhang J, Xie Y, et al. Alterations in genes of the EGFR signaling pathway and their relationship to EGFR tyrosine kinase inhibitor sensitivity in lung cancer cell lines. PLoS ONE. 2009;4:e4576. 7. Sun Y, Ren Y, Fang Z, et al. Lung adenocarci- noma from East Asian never-smokers is a disease largely defined by targetable oncogenic mutant kinases. J Clin Oncol. 2010;28:4616-20. 8. Schubbert S, Shannon K, Bollag G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nat Rev Cancer. 2007 Apr;7(4):295-308. Review. Erratum in: Nat Rev Cancer. 2007 Jul;7(7):563. 9. Brose MS, Volpe P, Feldman M, et al. BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma. Cancer Res. 2002 Dec 1;62(23):6997-7000. 10. Riely GJ, Kris MG, Rosenbaum D, et al. Frequency and distinctive spectrum of KRAS mutations in never smokers with lung adenocarcinoma. Clin Cancer Res. 2008 Sep 15;14(18):5731-4. 11. Dogan S, Shen R, Ang DC, et al. Molecular epidemiology of EGFR and KRAS mutations in 3,026 lung adenocarcinomas: higher susceptibility of women to smoking-related KRAS-mutant cancers. Clin Cancer Res. 2012 Nov 15;18(22):6169-77. 12. Shepherd FA, Domerg C, Hainaut P, et al. Pooled analysis of the prognostic and predictive effects of KRAS mutation status and KRAS mutation subtype in early-stage resected non-small-cell lung cancer in four trials of adjuvant chemotherapy. J Clin Oncol. 2013 Jun 10;31(17):2173-81. 13. Riely GJ, Marks J, Pao W. KRAS mutations in non-small cell lung cancer. Proc Am Thorac Soc. 2009 Apr 15;6(2):201-5. 14. Socinski MA, Goldman J, El-Hariry I, et al. A multicenter phase II study of ganetespib monotherapy in patients with genotypically defined advanced non-small cell lung cancer. Clin

Page 89: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

89

Cancer Res. 2013 Jun 1;19(11):3068-77. 15. Jänne PA, Shaw AT, Pereira JR, et al. Selumetinib plus docetaxel for KRAS-mutant advanced non-small-cell lung cancer: a randomised, multicentre, placebo-controlled, phase 2 study. Lancet Oncol. 2013 Jan; 14(1):38-47. 16. Lynch TJ, Bell DW, Sordella R, et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med. 2004 May 20;350(21):2129-39. Epub 2004 Apr 29. 17. Paez JG, Jänne PA, Lee JC, et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 2004 Jun 4;304(5676):1497-500. Epub 2004 Apr 29. 18. Pao W, Miller V, Zakowski M, et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Sep 7;101(36):13306-11. Epub 2004 Aug 25. 19. Ladanyi M, Pao W. Lung adenocarcinoma: guiding EGFR-targeted therapy and beyond. Mod Pathol. 2008 May;21 Suppl 2:S16-22. 20. Sordella R, Bell DW, Haber DA, Settleman J. Gefitinib-sensitizing EGFR mutations in lung cancer activate anti-apoptotic pathways. Science. 2004 Aug 20;305(5687):1163-7. Epub 2004 Jul 29. 21. Cadranel J, Ruppert AM, Beau-Faller M, Wislez M. Therapeutic strategy for advanced EGFR mutant non-small-cell lung carcinoma. Crit Rev Oncol Hematol. 2013 Dec;88(3):477-93. 22. Chen Y, Takita J, Choi YL, et al. Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma. Nature. 2008 Oct 16;455(7215):971-4. 23. George RE, Sanda T, Hanna M, et al. Look AT Activating mutations in ALK provide a therapeutic target in neuroblastoma. Nature. 2008 Oct 16; 455(7215):975-8.. 24. Janoueix-Lerosey I, Lequin D, Brugières L, et al. Somatic and germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma. Nature. 2008 Oct 16; 455(7215):967-70. 25. Mossé YP, Laudenslager M, Longo L, et al. Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene. Nature. 2008 Oct 16;455(7215):930-5. 26. Morris SW, Kirstein MN, Valentine MB, et al. Fusion of a kinase gene, ALK, to a nucleolar protein gene, NPM, in non-Hodgkin's lymphoma. Science. 1994 Mar 4;263(5151):1281-4. 27. Lawrence B, Perez-Atayde A, Hibbard MK, et al. TPM3-ALK and TPM4-ALK oncogenes in inflammatory myofibroblastic tumors. Am J Pathol. 2000 Aug;157(2):377-84.

Page 90: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

90

28. Choi YL, Takeuchi K, Soda M, et al. Identification of novel isoforms of the EML4-ALK transforming gene in non-small cell lung cancer. Cancer Res. 2008 Jul 1;68(13):4971-6. 29. Koivunen JP, Mermel C, Zejnullahu K, et al. EML4-ALK fusion gene and efficacy of an ALK kinase inhibitor in lung cancer. Clin Cancer Res. 2008 Jul 1; 14(13): 4275-83. 30. Rikova K, Guo A, Zeng Q, et al. Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer. Cell. 2007 Dec 14;131(6):1190-203. 31. Soda M, Choi YL, Enomoto M, et al. Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer. Nature. 2007 Aug 2;448(7153):561-6. 32. Takeuchi K, Choi YL, Togashi Y, et al. KIF5B-ALK, a novel fusion oncokinase identified by an immunohistochemistry-based diagnostic system for ALK-positive lung cancer. Clin Cancer Res. 2009 May 1;15(9):3143-9. 33. Mossé YP, Wood A, Maris JM. Inhibition of ALK signaling for cancer therapy. Clin Cancer Res. 2009 Sep 15;15(18):5609-14. 34. Kwak EL, Bang YJ, Camidge DR, et al. Anaplastic lymphoma kinase inhibition in non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 2010 Oct 28; 363(18):1693-703. 35. Shinmura K, Kageyama S, Tao H, et al. EML4-ALK fusion transcripts, but no NPM-, TPM3-, CLTC-, ATIC-, or TFG-ALK fusion transcripts, in non-small cell lung carcinomas. Lung Cancer. 2008 Aug;61(2):163-9. 36. Takeuchi K, Choi YL, Soda M, et al. Multiplex reverse transcription-PCR screening for EML4-ALK fusion transcripts. Clin Cancer Res. 2008 Oct 15;14(20):6618-24.. 37. Wong DW, Leung EL, So KK, et al. University of Hong Kong Lung Cancer Study Group. The EML4-ALK fusion gene is involved in various histologic types of lung cancers from nonsmokers with wild-type EGFR and KRAS. Cancer.2009 Apr 15;115(8):1723-33. 38. Inamura K, Takeuchi K, Togashi Y, et al. EML4-ALK lung cancers are characterized by rare other mutations, a TTF-1 cell lineage, an acinar histology, and young onset. Mod Pathol. 2009 Apr;22(4):508-15. 39. Shaw AT, Yeap BY, Mino-Kenudson M, et al. Clinical features and outcome of patients with non-small-cell lung cancer who harbor EML4-ALK. J Clin Oncol. 2009 Sep 10;27(26):4247-53. 40. Horn L, Pao W. EML4-ALK: honing in on a new target in non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2009 Sep 10; 27(26): 4232-5. 41. Wang R, Pan Y, Li C, et al. The use of quantitative real-time reverse transcriptase PCR for 5' and

Page 91: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

91

3' portions of ALK transcripts to detect ALK rearrangements in lung cancers. Clin Cancer Res. 2012 Sep 1;18(17):4725-32. 42. Pailler E, Adam J, Barthélémy A, et al. Detection of circulating tumor cells harboring a unique ALK rearrangement in ALK-positive non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2013 Jun 20;31(18):2273-81. 43. To KF, Tong JH, Yeung KS, et al. Detection of ALK rearrangement by immunohistochemistry in lung adenocarcinoma and the identification of a novel EML4-ALK variant. J Thorac Oncol. 2013 Jul;8(7):883-91. 44. Gainor JF, Varghese AM, Ou SH, et al. ALK rearrangements are mutually exclusive with mutations in EGFR or KRAS: an analysis of 1,683 patients with non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2013 Aug 1;19(15):4273-81. 45. Boland JM, Jang JS, Li J, et al. MET and EGFR mutations identified in ALK-rearranged pulmonary adenocarcinoma: molecular analysis of 25 ALK-positive cases. J Thorac Oncol. 2013 May;8(5):574-81. 46. Bang YJ. Treatment of ALK-positive non-small cell lung cancer. Arch Pathol Lab Med. 2012 Oct;136(10):1201-4. 47. Camidge DR, Bang YJ, Kwak EL, et al. Activity and safety of crizotinib in patients with ALK-positive non-small-cell lung cancer: updated results from a phase 1 study. Lancet Oncol. 2012 Oct;13(10):1011-9. 48. Shaw AT, Dong-Wan Kim, M.D., Ph.D., et al. Crizotinib versus Chemotherapy in Advanced ALK-Positive Lung Cancer. N Engl J Med 2013; 368:2385-2394June 20, 2013. 49. Seto T, Kiura K, Nishio M, et al. CH5424802 (RO5424802) for patients with ALK-rearranged advanced non-small-cell lung cancer (AF-001JP study): a single-arm, open-label, phase 1-2 study. Lancet Oncol. 2013 Jun;14(7):590-8. 50. Camidge DR, Kono SA, Lu X, et al. Anaplastic lymphoma kinase gene rearrangements in non-small cell lung cancer are associated with prolonged progression-free survival on pemetrexed. J Thorac Oncol. 2011 Apr;6(4):774-80. 51. Shaw AT, Varghese AM, Solomon BJ, et al. Pemetrexed-based chemotherapy in patients with advanced, ALK-positive non-small cell lung cancer. Ann Oncol. 2013 Jan;24(1):59-66. 52. Sequist LV, Gettinger S, Senzer NN, et al. Activity of IPI-504, a novel heat-shock protein 90 inhibitor, in patients with molecularly defined non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2010 Nov 20;28(33):4953-60. 53. Solomon B, Wilner KD, Shaw AT. Current status of targeted therapy for anaplastic lymphoma

Page 92: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

92

kinase-rearranged non-small cell lung cancer. Clin Pharmacol Ther. 2014 Jan;95(1):15-23. 54. Shigematsu H, Takahashi T, Nomura M, et al. Somatic mutations of the HER2 kinase domain in lung adenocarcinomas. Cancer Res. 2005 Mar 1;65(5):1642-6. 55. Stephens P, Hunter C, Bignell G, et al. Lung cancer: intragenic ERBB2 kinase mutations in tumours. Nature. 2004 Sep 30;431(7008):525-6. 56. Hynes NE, Lane HA. ERBB receptors and cancer: the complexity of targeted inhibitors. Nat Rev Cancer. 2005;5:341-54. 57. Li D, Ambrogio L, Shimamura T, et al. BIBW2992, an irreversible EGFR/HER2 inhib- itor highly effective in preclinical lung cancer models. Oncogene. 2008;27:4702-11. 58. Minami Y, Shimamura T, Shah K, et al. The major lung cancer-derived mutants of ERBB2 are oncogenic and are associated with sensitiv- ity to the irreversible EGFR/ERBB2 inhibitor HKI-272. Oncogene. 2007;26:5023-7. 59. Shimamura T, Ji H, Minami Y, et al. Non-small- cell lung cancer and Ba/F3 transformed cells harboring the ERBB2 G776insV_G/C muta- tion are sensitive to the dual-specific epidermal growth factor receptor and ERBB2 inhibitor HKI-272. Cancer Res. 2006;66:6487-91. 60. Wang SE, Narasanna A, Perez-Torres M, et al. HER2 kinase domain mutation results in consti- tutive phosphorylation and activation of HER2 and EGFR and resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors. Cancer Cell. 2006;10:25-38. 61. Baselga J, Swain SM. Novel anticancer targets: revisiting ERBB2 and discovering ERBB3. Nat Rev Cancer. 2009;9:463-75. 62. Perera SA, Li D, Shimamura T, et al. HER2YVMA drives rapid development of adenosquamous lung tumors in mice that are sensitive to BIBW2992 and rapamycin combination therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:474-9. 63. Lee JC, Vivanco I, Beroukhim R, et al. Epidermal growth factor receptor activation in glioblastoma through novel missense mutations in the extracellular domain. PLoS Med. 2006;3:e485. 64. Network CGAR. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 2008;455:1061-8. 65. Davies H, Bignell GR, Cox C, et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 2002 Jun 27;417(6892):949-54. 66. Pratilas CA, Hanrahan AJ, Halilovic E, et al. Genetic predictors of MEK dependence in non-small cell lung cancer. Cancer Res. 2008 Nov 15;68(22):9375-83.

Page 93: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

93

67. Paik PK, Arcila ME, Fara M, et al. Clinical characteristics of patients with lung adenocarcinomas harboring BRAF mutations. J Clin Oncol. 2011 May 20;29(15):2046-51. 68. Marchetti A, Felicioni L, Malatesta S, et al. Clinical features and outcome of patients with non-small-cell lung cancer harboring BRAF mutations. J Clin Oncol. 2011 Sep 10;29(26):3574-9. 69. Sasaki H, Shitara M, Yokota K, et al. BRAF and ERBB2 mutations correlate with smoking status in lung cancer patients. Exp Ther Med. 2012 May;3(5):771-775. Epub 2012 Mar 1. 70. Cardarella S, Ogino A, Nishino M, et al. Clinical, pathologic, and biologic features associated with BRAF mutations in non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2013 Aug 15;19(16):4532-40. 71. Jørgensen JT. Targeted HER2 treatment in advanced gastric cancer. Oncology. 2010; 78(1): 26-33. 72. Graus-Porta D, Beerli RR, Daly JM, Hynes NE. ERBB-2, the preferred heterodimerization partner of all ERBB receptors is a mediator of lateral signaling. EMBO J. 1997 Apr 1; 16(7): 1647-55. 73. Buttitta F, Barassi F, Fresu G, et al. Mutational analysis of the HER2 gene in lung tumors from Caucasian patients: mutations are mainly present in adenocarcinomas with bronchioloalveolar features. Int J Cancer. 2006 Dec 1;119(11):2586-91. 74. Arcila ME, Chaft JE, Nafa K, et al. Prevalence, clinicopathologic associations, and molecular spectrum of ERBB2 (HER2) tyrosine kinase mutations in lung adenocarcinomas. Clin Cancer Res. 2012 Sep 15;18(18):4910-8. 75. Birchmeier C, Sharma S, Wigler M. Expression and rearrangement of the ROS1 gene in human glioblastoma cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 Dec;84(24):9270-4. 76. Birchmeier C, O'Neill K, Riggs M, Wigler M. Characterization of ROS1 cDNA from a human glioblastoma cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Jun;87(12):4799-803. 77. Charest A, Lane K, McMahon K, et al. Fusion of FIG to the receptor tyrosine kinase ROS in a glioblastoma with an interstitial del (6)(q21q21). Genes Chromosomes Cancer. 2003 May;37(1):58-71. 78. McDermott U, Iafrate AJ, Gray NS, et al. Genomic alterations of anaplastic lymphoma kinase may sensitize tumors to anaplastic lymphoma kinase inhibitors. Cancer Res. 2008 May 1;68(9):3389-95. 79. Bergethon K, Shaw AT, Ou SH, et al. ROS1 rearrangements define a unique molecular class of lung cancers. J Clin Oncol. 2012 Mar 10;30(8):863-70.

Page 94: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

94

80. Yoshida A, Kohno T, Tsuta K, et al. ROS1-rearranged lung cancer: a clinicopathologic and molecular study of 15 surgical cases. Am J Surg Pathol. 2013 Apr;37(4):554-62. 81. Go H, Kim DW, Kim D, et al. Clinicopathologic analysis of ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer and proposal of a diagnostic algorithm. J Thorac Oncol. 2013 Nov;8(11): 1445-50. 82. Davies KD, Le AT, Theodoro MF, et al. Identifying and targeting ROS1 gene fusions in non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res. 2012 Sep 1;18(17):4570-9. 83. Hammerman PS, Sos ML, Ramos AH, et al. Mutations in the DDR2 Kinase Gene Identify a Novel Therapeutic Target in Squamous Cell. Lung Cancer Cancer Discovery June 2011 1; 78 84. Ichikawa O, Osawa M, Nishida N, et al. I Structural basis of the collagen-binding mode of discoidin domain receptor 2. EMBO J. 2007 Sep 19; 26(18): 4168-76. Epub 2007 Aug 16. 85. Turner N, Grose R. Fibroblast growth factor signalling: from development to cancer. Nat Rev Cancer. 2010 Feb;10(2):116-29. 86. Freier K, Schwaenen C, Sticht C, et al. Recurrent FGFR1 amplification and high FGFR1 protein expression in oral squamous cell carcinoma (OSCC). Oral Oncol. 2007 Jan;43(1):60-6. Epub 2006 Jun 27. 87. Ishizuka T, Tanabe C, Sakamoto H, et al. Gene amplification profiling of esophageal squamous cell carcinomas by DNA array CGH. Biochem Biophys Res Commun. 2002 Aug 9; 296(1):152-5. 88. Gorringe KL, Jacobs S, Thompson ER, et al. High-resolution single nucleotide polymorphism array analysis of epithelial ovarian cancer reveals numerous microdeletions and amplifications. Clin Cancer Res. 2007 Aug 15; 13(16):4731-9. 89. Simon R, Richter J, Wagner U, et al. High-throughput tissue microarray analysis of 3p25 (RAF1) and 8p12 (FGFR1) copy number alterations in urinary bladder cancer. Cancer Res. 2001 Jun 1;61(11):4514-9. 90. Edwards J, Krishna NS, Witton CJ, Bartlett JM. Gene amplifications associated with the development of hormone-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 2003 Nov 1;9(14):5271-81. 91. Dutt A, Ramos AH, Hammerman PS, et al. Inhibitor-sensitive FGFR1 amplification in human non-small cell lung cancer. PLoS One. 2011;6(6):e20351. 92. Weir BA, Woo MS, Getz G, et al. Characterizing the cancer genome in lung adenocarcinoma. Nature. 2007 Dec 6;450(7171):893-8. Epub 2007 Nov 4. 93. Weiss J, Sos ML, Seidel D, et al. Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer. Sci Transl Med. 2010 Dec

Page 95: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

95

15;2(62):62ra93. 94. Kim HR, Kim DJ, Kang DR, et al. Fibroblast growth factor receptor 1 gene amplification is associated with poor survival and cigarette smoking dosage in patients with resected squamous cell lung cancer. J Clin Oncol. 2013 Feb 20; 31(6):731-7. 95. Turner NC, Seckl MJ. A therapeutic target for smoking-associated lung cancer. Sci Transl Med. 2010 Dec 15;2(62):62ps56. 96. Cooper CS, Park M, Blair DG, et al. Molecular cloning of a new transforming gene from a chemically transformed human cell line. Nature. 1984 Sep 6-11;311(5981):29-33. 97. Birchmeier C, Birchmeier W, Gherardi E, Vande Woude GF. Met, metastasis, motility and more. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003 Dec;4(12):915-25. 98. Peruzzi B, Bottaro DP. Targeting the c-Met signaling pathway in cancer. Clin Cancer Res. 2006 Jun 15;12(12):3657-60. 99. Schmidt L, Duh FM, Chen F, et al. Germline and somatic mutations in the tyrosine kinase domain of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Nat Genet. 1997 May;16(1):68-73. 100. Di Renzo MF, Olivero M, Martone T, et al. Somatic mutations of the MET oncogene are selected during metastatic spread of human HNSC carcinomas. Oncogene. 2000 Mar 16;19(12):1547-55. 101. Park WS, Dong SM, Kim SY, et al. Somatic mutations in the kinase domain of the Met/hepatocyte growth factor receptor gene in childhood hepatocellular carcinomas. Cancer Res. 1999 Jan 15;59(2):307-10. 102. Kong-Beltran M, Seshagiri S, Zha J, Zhu W, Bhawe K, Mendoza N, Holcomb T, Pujara K, Stinson J, Fu L, Severin C, Rangell L, Schwall R, Amler L, Wickramasinghe D, Yauch R. Somatic mutations lead to an oncogenic deletion of met in lung cancer. Cancer Res. 2006 Jan 1; 66(1):283-9. 103. Ma PC, Kijima T, Maulik G, et al. c-MET mutational analysis in small cell lung cancer: novel juxtamembrane domain mutations regulating cytoskeletal functions. Cancer Res. 2003 Oct 1;63(19):6272-81. 104. Nakajima M, Sawada H, Yamada Y, et al. The prognostic significance of amplification and overexpression of c-met and c-erb B-2 in human gastric carcinomas. Cancer. 1999 May 1;85(9):1894-902. 105. Miller CT, Lin L, Casper AM, et al. Genomic amplification of MET with boundaries within fragile site FRA7G and upregulation of MET pathways in esophageal adenocarcinoma. Oncogene. 2006 Jan 19;25(3):409-18.

Page 96: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

96

106. Umeki K, Shiota G, Kawasaki H. Clinical significance of c-met oncogene alterations in human colorectal cancer. Oncology. 1999;56(4):314-21. 107. Beroukhim R, Getz G, Nghiemphu L, et al. Assessing the significance of chromosomal aberrations in cancer: methodology and application to glioma. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Dec 11;104(50):20007-12. Epub 2007 Dec 6. 108. Yamamoto S, Tsuda H, Miyai K, et al. Gene amplification and protein overexpression of MET are common events in ovarian clear-cell adenocarcinoma: their roles in tumor progression and prognostication of the patient. Mod Pathol. 2011 Aug;24(8):1146-55. 109. Bean J, Brennan C, Shih JY, et al. MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Dec 26;104(52):20932-7. Epub 2007 Dec 18. 110. Cappuzzo F, Jänne PA, Skokan M, et al. MET increased gene copy number and primary resistance to gefitinib therapy in non-small-cell lung cancer patients. Ann Oncol. 2009 Feb;20(2):298-304. 111. Onozato R, Kosaka T, Kuwano H, et al. Activation of MET by gene amplification or by splice mutations deleting the juxtamembrane domain in primary resected lung cancers. J Thorac Oncol. 2009 Jan;4(1):5-11. 112. Engelman JA, Zejnullahu K, Mitsudomi T, et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 2007 May 18;316(5827):1039-43. Epub 2007 Apr 26. 113. Kubo T, Yamamoto H, Lockwood WW, et al. MET gene amplification or EGFR mutation activate MET in lung cancers untreated with EGFR tyrosine kinase inhibitors. Int J Cancer. 2009 Apr 15;124(8):1778-84. 114. Okuda K, Sasaki H, Yukiue H, et al. Met gene copy number predicts the prognosis for completely resected non-small cell lung cancer. Cancer Sci. 2008 Nov;99(11):2280-5. 115. Onozato R, Kosaka T, Kuwano H, et al. Activation of MET by gene amplification or by splice mutations deleting the juxtamembrane domain in primary resected lung cancers. J Thorac Oncol. 2009 Jan;4(1):5-11. 116. Eder JP, Shapiro GI, Appleman LJ, et al. A phase I study of foretinib, a multi-targeted inhibitor of c-Met and vascular endothelial growth factor receptor 2. Clin Cancer Res. 2010 Jul 1;16(13):3507-16. 117. Benedettini E, Sholl LM, Peyton M, et al. Met activation in non-small cell lung cancer is associated with de novo resistance to EGFR inhibitors and the development of brain metastasis. Am

Page 97: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

97

J Pathol. 2010 Jul;177(1):415-23. 118. Ichimura E, Maeshima A, Nakajima T, Nakamura T. Expression of c-met/HGF receptor in human non-small cell lung carcinomas in vitro and in vivo and its prognostic significance. Jpn J Cancer Res. 1996 Oct;87(10):1063-9. 119. Liu C, Tsao MS. In vitro and in vivo expressions of transforming growth factor-alpha and tyrosine kinase receptors in human non-small-cell lung carcinomas. Am J Pathol. 1993 Apr;142(4):1155-62. 120. Ma PC, Jagadeeswaran R, Jagadeesh S, et al. Functional expression and mutations of c-Met and its therapeutic inhibition with SU11274 and small interfering RNA in non-small cell lung cancer. Cancer Res. 2005 Feb 15;65(4):1479-88. 121. Nakamura Y, Niki T, Goto A, et al. c-Met activation in lung adenocarcinoma tissues: an immunohistochemical analysis. Cancer Sci. 2007 Jul;98(7):1006-13. Epub 2007 Apr 24. 122. Olivero M, Rizzo M, Madeddu R, et al. Overexpression and activation of hepatocyte growth factor/scatter factor in human non-small-cell lung carcinomas. Br J Cancer. 1996 Dec;74(12):1862-8. 123. Siegfried JM, Weissfeld LA, Luketich JD, et al. The clinical significance of hepatocyte growth factor for non-small cell lung cancer. Ann Thorac Surg. 1998 Dec;66(6):1915-8. 124. Xu L, Nilsson MB, Saintigny P, et al. Epidermal growth factor receptor regulates MET levels and invasiveness through hypoxia-inducible factor-1alpha in non-small cell lung cancer cells. Oncogene. 2010 May 6;29(18):2616-27. 125. Spigel DR, Burris HA 3rd, Greco FA, et al. Randomized, double-blind, placebo-controlled, phase II trial of sorafenib and erlotinib or erlotinib alone in previously treated advanced non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 2011 Jun 20;29(18):2582-9. 126. Schubbert S, Shannon K, Bollag G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nat Rev Cancer. 2007 Apr;7(4):295-308. 127. Ohashi K, Sequist LV, Arcila ME, et al. Characteristics of lung cancers harboring NRAS mutations. Clin Cancer Res. 2013 May 1;19(9):2584-91. 128. Samuels Y, Wang Z, Bardelli A, et al. High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers. Science. 2004 Apr 23;304(5670):554. Epub 2004 Mar 11. 129. Kawano O1, Sasaki H, Endo K, Suzuki E, Haneda H, Yukiue H, Kobayashi Y, Yano M, Fujii Y. PIK3CA mutation status in Japanese lung cancer patients. Lung Cancer. 2006 Nov;54(2):209-15. Epub 2006 Aug 22.

Page 98: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

98

130. Spoerke JM, O'Brien C, Huw L, et al. Phosphoinositide 3-kinase (PI3K) pathway alterations are associated with histologic subtypes and are predictive of sensitivity to PI3K inhibitors in lung cancer preclinical models. Clin Cancer Res. 2012 Dec 15;18(24):6771-83. 131. Sequist LV, Waltman BA, Dias-Santagata D, et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Sci Transl Med. 2011 Mar 23;3(75):75ra26. 132. Takahashi M, Ritz J, Cooper GM. Activation of a novel human transforming gene, ret, by DNA rearrangement. Cell. 1985 Sep;42(2):581-8. 133. Airaksinen MS, Titievsky A, Saarma M. GDNF family neurotrophic factor signaling: four masters, one servant? Mol Cell Neurosci. 1999 May;13(5):313-25. 134. Phay JE, Shah MH. Targeting RET receptor tyrosine kinase activation in cancer. Clin Cancer Res. 2010 Dec 15;16(24):5936-41. 135. Ciampi R, Nikiforov YE. RET/PTC rearrangements and BRAF mutations in thyroid tumorigenesis. Endocrinology. 2007 Mar;148(3):936-41. Epub 2006 Aug 31. 136. Salvatore D, Barone MV, Salvatore G, et al. Tyrosines 1015 and 1062 are in vivo autophosphorylation sites in ret and ret-derived oncoproteins. J Clin Endocrinol Metab. 2000 Oct;85(10):3898-907. 137. Pao W, Hutchinson KE.Chipping away at the lung cancer genome. Nat Med. 2012 Mar 6;18(3):349-51. 138. Ju YS, Lee WC, Shin JY, et al. A transforming KIF5B and RET gene fusion in lung adenocarcinoma revealed from whole-genome and transcriptome sequencing. Genome Res. 2012 Mar;22(3):436-45. 139. Kohno T, Ichikawa H, Totoki Y, et al. KIF5B-RET fusions in lung adenocarcinoma. Nat Med. 2012 Feb 12;18(3):375-7. 140. Takeuchi K, Soda M, Togashi Y, et al. RET, ROS1 and ALK fusions in lung cancer. Nat Med. 2012 Feb 12;18(3):378-81. 141. Lipson D, Capelletti M, Yelensky R, et al. Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies. Nat Med. 2012 Feb 12;18(3):382-4. 142. Verbeek HH, Alves MM, de Groot JW, et al. The effects of four different tyrosine kinase inhibitors on medullary and papillary thyroid cancer cells. J Clin Endocrinol Metab. 2011 Jun;96(6):E991-5. 143. Drilon A, Wang L, Hasanovic A, et al. Response to Cabozantinib in patients with RET fusion-positive lung adenocarcinomas. Cancer Discov. 2013 Jun;3(6):630-5.

Page 99: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

99

144. Ruckdeschel JC. Combined modality therapy of non-small cell lung cancer. Semin Oncol

1997;24:429–39.

145. Stinchcombe TE, Fried D, Morris DE, Socinski MA. Combined modality therapy for stage III non-

small cell lung cancer. Oncologist 2006;11:809–23.

146. Albain KS, Swann RS, Rusch VW, Turrisi AT III, Shepherd FA, Smith C et al. Radiotherapy plus

chemotherapy with or without surgical resection for stage III non-small-cell lung cancer: a phase III

randomised controlled trial. Lancet 2009;374:379–86.

147. Sause W, Kolesar P, Taylor S IV, Johnson D, Livingston R, Komaki R et al. Final results of phase III

trial in regionally advanced unresectable non- small cell lung cancer: Radiation Therapy Oncology

Group, Eastern Cooperative Oncology Group, and Southwest Oncology Group. Chest 2000;117:358–

64.

148. RothJA,FossellaF,KomakiR,RyanMB,PutnamJBJr,LeeJSetal.Arando- mized trial comparing

perioperative chemotherapy and surgery with surgery alone in resectable stage IIIA non-small-cell

lung cancer. J Natl Cancer Inst 1994;86:673–80.

149. Albain KS, Rusch VW, Crowley JJ, Rice TW, Turrisi AT III, Weick JK et al. Concurrent

cisplatin/etoposide plus chest radiotherapy followed by surgery for stages IIIA (N2) and IIIB non

small cell lung cancer: mature results of Southwest Oncology Group Phase II Study 8805. J Clin

Oncol 1995;13:1880–92.

150. Rosell R, Gómez-Codina J, Camps C, Maestre J, Padille J, Cantó A et al. A randomized trial

comparing preoperative chemotherapy plus surgery versus surgery alone in patients with non-

small-cell lung cancer. N Engl J Med 1994;330:153–8.

151. StraussGM,LangerMP,EliasAD,SkarinAT,SugarbakerDJ.Multimodality treatment of stage IIIA

non-small-cell lung carcinoma: a critical review of the literature and strategies for future research. J

Clin Oncol 1992;10: 829–38.

152. Albain KS. Induction chemotherapy with/without radiation followed by surgery in stage III non-

Page 100: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

100

small-cell lung cancer. Oncology 1997;11:51–7.

153. Rosell R, Gómez-Codina J, Camps C, Javier Sánchez J, Maestre J, Padilla J et al. Preresectional

chemotherapy in stage IIIA non-small-cell lung cancer: a 7-year assessment of a randomized

controlled trial. Lung Cancer 1999;26:7–14.

154. Martini N, Kris MG, Flehinger BJ, Gralla RJ, Bains MS, Burt ME et al. Preoperative

chemotherapy for stage IIIa (N2) lung cancer: the Sloan-Kettering experience with 136 patients. Ann

Thorac Surg 1993;55: 1365–73.

155. Goldberg M, Burkes RL. Induction chemotherapy for stage IIIA unresect- able non-small cell

lung cancer: the Toronto experience and an overview. Semin Surg Oncol 1993;9:108–13.

156. Stefani A, Alifano M, Bobbio A, Grigoroiu M, Jouni R, Magdeleinat P, Regnard JF. Which

patients should be operated on after induction chemotherapy for N2 non-small cell lung cancer?

Analysis of a 7-year experience in 175 patients. J Thorac Cardiovasc Surg. 2010 Aug;140(2):356-63.

157. Miller AB, Hoogstraten B, Staquet M, Winkler A. Reporting results of cancer treatment. Cancer

1981; 47: 207–14.

158. Johan L, Jayoun K, Sangcheol K, Donghyeon Y, Kyunga K, Byung Soo K. Detection of

differentially expressed gene sets in a partially paired microarray data set. Statistical Applications in

Genetics and Molecular Biology, 11(3), 2012.

159. Yi S, Park T. Integrated analysis of the heterogeneous microarray data. BMC bioinformatics,

12(Suppl 5):S3, 2011.

160. Jing W, Dexter D, Zhiao S, Bing Z. Web-based gene set analysis toolkit (webgestalt): update

2013. Nucleic acids research, 41(W1):W77–W83, 2013.

161. Zhang B, Kirov S, Snoddy J. Webgestalt: an integrated system for exploring gene sets in various

biological contexts. Nucleic acids research, 33(suppl 2):W741–W748, 2005.

162. Candi E, Schmidt R, Melino G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature

reviews Molecular cell biology, 6(4):328–340, 2005.

163. Godessart N, Kunkel SL. Chemokines in autoimmune disease. Current opinion in im- munology,

13(6):670–675, 2001.

Page 101: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

101

164. Oertelt-Prigione S. The influence of sex and gender on the immune response. Autoimmunity

reviews, 11(6):A479–A485, 2012.

165. Jansen R, Batista S, Brooks AI, si colab. Sex differences in the human peripheral blood

transcriptome. BMC genomics, 15(1):33, 2014.

166. Draghici S, Khatri P, Tarca AL, si colab. A systems biology approach for pathway level analysis.

Genome Research, 17(10):1537–1545, 2007.

167. Tarca AL, Draghici S, Khatri P, si colab. A novel signaling pathway impact analysis.

Bioinformatics, 25(1):75–82, 2009.

168. Systems/Genome Analyzer IIx/Specifications: Illumina Inc.; 2013 Available online:

http://www.illumina.com/systems/genome_analyzer_iix/performance_specifications.ilmn

169. Sequencing Video: The Genome Analyzer: Illumina, 2009.

170. Ginsberg RJ, Vokes EE, Raben A. Non-small cell lung cancer. In: De Vita VT Jr, Hellman S,

Rosemberg SA (eds). Cancer: Principles and Practice. Philadelphia, PA: Lippincott-Raven 1997, 858–

911.

171. West H, Albain KS. Current standards and ongoing controversies in the management of locally

advanced non-small cell lung cancer. Semin Oncol 2005;32:284–92.

172. Feld R, Rubinstein LV, Weisenberger TH. Sites of recurrence in resected stage I non-small-cell

lung cancer: a guide for future studies. J Clin Oncol 1984;2:1352–8.

173. Immerman SC, Vanecko RM, Fry WA, Head LR, Shields TW. Site of recur- rence in patients with

stages I and II carcinoma of the lung resected for cure. Ann Thorac Surg 1981;32:23–7.

174. Felip E, Pavlidis N, Stahel RA. ESMO Guidelines Task Force. ESMO Minimum Clinical

Recommendations for diagnosis, treatment and follow- up of non-small cell lung cancer (NSCLC).

Ann Oncol 2005;16:28–31.

175. Song WA, Zhou NK, Wang W, Chu XY, Liang CY, Tian XD et al. Survival benefit of neoadjuvant

chemotherapy in non-small cell lung cancer: an updated meta-analysis of 13 randomized control

trials. J Thorac Oncol 2010;5:510–6.

Page 102: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

102

176. Ettinger DS, Akerley W, Borghaei H, si colab. Non-small cell lung cancer. J. Natl. Compr. Cancer

Netw. 2012, 10, 1236-1271.

177. Kalemkerian GP, Akerley W, Bogner P, si colab. Small cell lung cancer. J. Natl. Compr. Cancer

Netw. 2013, 11, 78-98.

178. Bhattacharjee A, Richards WG, Staunton J, si colab. Classification of human lung carcinomas

by mRNA expression profiling reveals distinct adenocarcinoma subclasses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA

2001, 98, 13790-13795.

179. Beer DG, Kardia SL, Huang CC, si colab. Gene-expression profiles predict survival of patients

with lung adenocarcinoma. Nat. Med. 2002, 8, 816-824.

180. Garber ME, Troyanskaya OG, Schluens K, si colab. Diversity of gene expression in

adenocarcinoma of the lung. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 13784-13789.

181. Hayes DN, Monti S, Parmigiani G, si colab. Gene expression profiling reveals reproducible

human lung adenocarcinoma subtypes in multiple independent patient cohorts. J. Clin. Oncol. 2006,

24, 5079-5090.

182. Park YY, Park ES, Kim SB, si colab. Development and validation of a prognostic gene-expression

signature for lung adenocarcinoma. PLoS One 2012, 7,

183. Takeuchi T, Tomida S, Yatabe Y, si colab. Expression profile-defined classification of lung

adenocarcinoma shows close relationship with underlying major genetic changes and

clinicopathologic behaviors. J. Clin. Oncol. 2006, 24, 1679-1688.

184. Warth A, Muley T, Meister M, si colab. The novel histologic International Association for the

Study of Lung Cancer/American Thoracic Society/European Respiratory Society classification system

of lung adenocarcinoma is a stage-independent predictor of survival. J. Clin. Oncol. 2012, 30, 1438-

1446.

185 Travis WD, Brambilla E, Riely GJ. New pathologic classification of lung cancer: Relevance for

clinical practice and clinical trials. J. Clin. Oncol. 2013, 31, 992-1001.

186. Inamura K, Fujiwara T, Hoshida Y, si colab. Two subclasses of lung squamous cell carcinoma

with different gene expression profiles and prognosis identified by hierarchical clustering and non-

negative matrix factorization. Oncogene 2005, 24, 7105-7113.

187. Raponi M, Zhang Y, Yu J, si colab. Gene expression signatures for predicting prognosis of

squamous cell and adenocarcinomas of the lung. Cancer Res. 2006, 66, 7466-7472.

Page 103: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

103

188. Wilkerson MD, Yin X, Hoadley KA, si colab. Lung squamous cell carcinoma mRNA expression

subtypes are reproducible, clinically important, and correspond to normal cell types. Clin. Cancer

Res. 2010, 16, 4864-4875.

189. The Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of

squamous cell lung cancers. Nature 2012, 489, 519-525.

190. Landi MT, Zhao Y, Rotunno M, si colab. MicroRNA expression differentiates histology and

predicts survival of lung cancer. Clin. Cancer Res. 2010, 16, 430-441.

191. Yamaguchi A, Nozawa K, Fujishiro M, si colab. Estrogen inhibits apoptosis and promotes cc

motif chemokine ligand 13 expression on synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis.

Immunopharmacology and immunotoxicology, 34(5):852–857, 2012.

192. Nilsson BO. Modulation of the inflammatory response by estrogens with focus on the

endothelium and its interactions with leukocytes. Inflammation Research, 56(7):269–273, 2007.

193. Hohla F, Hopfinger G, Romeder F, si colab. Female gender may predict response to folfirinox in

patients with unresectable pancreatic cancer: A single institution retrospective review. International

journal of oncology, 44(1):319–326, 2014.

194. Rodriguez-Lara V, Pe a-Mirabal E, Baez-Saldana R, si colab. Estrogen receptor beta and

cxcr4/cxcl12 expression: Differences by sex and hormonal status in lung adenocarci- noma. Archives

of Medical Research, 2014.

195. Szymanowska-Narloch A, Jassem E, Skrzypski M, si colab. Molecular profiles of non-small cell lung cancers in cigarette smoking and never-smoking patients. Advances in medical sciences, pages 1–11, 2014.

196. Betticher DC, Hsu Schmitz SF, Tötsch M, Hansen E, Joss C, von Briel C et al. Prognostic factors affecting long term outcomes in patients with resected stage IIIA pN2 non-small-cell lung cancer: 5-year follow-up of a phase II study. Br J Cancer 2006;94:1099–106.

197. Liao WY, Chen JH, Wu M, Shih JY, Chen KY, Ho CC et al. Neoadjuvant chemotherapy with docetaxel-cisplatin in patients with stage III N2 non-small-cell lung cancer. Clin Lung Cancer 2013;14:418–24.

198. Chen HY, Yu SL, Chen CH, Chang GC, Chen CY, Yuan A, Cheng CL, Wang CH, Terng HJ, Kao SF, et al: A five-gene signature and clinical outcome in non-small-cell lung cancer. N Engl J Med 2007, 356:11–20.

199. Larsen JE, Pavey SJ, Passmore LH, Bowman RV, Hayward NK, Fong KM: Gene expression signature predicts recurrence in lung adenocarcinoma. Clin Cancer Res 2007, 13:2946–2954.

200. Dowsett M, Cuzick J, Wale C, Forbes J, Mallon EA, Salter J, Quinn E, Dunbier A, Baum M, Buzdar A, et al: Prediction of risk of distant recurrence using the 21-gene recurrence score in node-

Page 104: RAPORT STIINTIFIC FINAL POS CCE - icfundeni.ro · cancerul pulmonar, au descoperit mutatii de inactivare in unele gene supresoare de tumori cunoscute si neasociate anterior cu cancerul

104

negative and node-positive postmenopausal patients with breast cancer treated with anastrozole or tamoxifen: a TransATAC study. J Clin Oncol 2010, 28:1829–1834.

201. Marx V. Next-generation sequencing: The genome jigsaw. Nature 2013;501:263-8.

202. Green ED, Guyer MS, National Human Genome Research Institute. Charting a course for genomic medicine from base pairs to bedside. Nature 2011;470:204-13.

203. Leary RJ, Sausen M, Diaz LA Jr, et al. Cancer detection using whole- genome sequencing of cell free DNA. Oncotarget 2013;4:1119-20.

Director de proiect,

Prof. Dr. Jean-François REGNARD

Data: 29.06.2014


Recommended