1 PLATELIA™ Toxo IgG 1 placă – 96 72840 DETERMINAREA CANTITATIVĂ A ANTICORPILOR lgG CONTRA TOXOPLASMA GONDII DIN SERUL SAU PLASMA UMAN(Ă) CU AJUTORUL ANALIZEI IMUNOENZIMATICE 881127 – 2013/11 1. DESTINAŢIA Platelia™ Toxo IgG este o analiză imunologică ELISA indirectă, creată pentru determinarea cantitativă a anticorpilor IgG contra Toxoplasma gondii din serul sau plasma uman(ă). 2. VALOAREA CLINICĂ T. gondii este un protozoar care cauzează infecţii la numeroase specii de mamifere şi păsări. Toxoplasmozele, frecvente la oameni şi animale, sunt de obicei asimptomatice. Prevalenţa acestei infecţii în populaţie este stabilită cu ajutorul testelor serologice şi poate să difere în funcţie de ţara de origine şi vârstă. În timpul sarcinii, toxoplasmoza a fost implicată în anomalii congenitale serioase (în particular, afectarea funcţiilor creierului) şi uneori decesul fătului. Demonstrarea prezenţei anticorpilor Toxo lgG la femei înainte de concepţie asigură protecţia fetală contra infecţiilor posibile cu toxoplasmoză în timpul sarcinii. Predispoziţia la infecţie severă cu toxoplasmoză este comună la persoanele care au contactat sindromul imuno-deficienţei dobândite (SIDA) sau care au imunitatea compromisă în alt mod. Aceste infecţii se datorează în principal reactivării chisturilor T. gondii prezente înainte de infecţia HIV. Diagnosticarea specifică infecţiei cu T. gondii poate fi complicată şi izolarea parazitului este rară. Confirmarea serologică a anticorpilor T. gondii este un indiciu al expunerii la parazit şi este larg acceptată ca modalitate de stabilire a stării imunitare şi susceptibilităţii la infecţie. Identificarea mai multor izotopi permite fie datarea T. gondii şi implementarea terapiei potrivite în cazul infecţiei recente, fie propunerea unor recomandări profilactice: indicaţii de igienă alimentară la femeile însărcinate, chemoprofilaxia la populaţia cu imunitate compromisă. 3. PRINCIPIUL Platelia™ Toxo IgG este un test de detectare şi titrare a anticorpilor lgG corespunzători Toxoplasma gondii din serul sau plasma uman(ă) folosind o metodă ELISA imuno-enzimatică şi indirectă. Antigenul T. gondii este folosit pentru acoperirea microplanşetului. Un anticorp monoclonal etichetat cu peroxidază, specific lanţurilor gama umane (anti-lgG), este folosit pe post de conjugat. Etapele testului sunt următoarele: Pasul 1 Probele şi calibratorii de la pacienţi sunt diluate 1/21 şi apoi distribuite în alveolele microplanşetului. În timpul acestei incubaţii de o oră la temperatura de 37°C, anticorpii IgG la T. gondii din probă se fixează la antigenul T. gondii întins pe alveolele microplanşetului. După incubare, anticorpii nespecifici desprinşi şi alte proteine din ser sunt eliminaţi prin spălare. Pasul 2 Conjugatul (anticorpul monoclonal etichetat cu peroxidază, specific lanţurilor gama umane) este adăugat la alveolele microplanşetului. În timpul acestei incubaţii de o oră la temperatura de 37°C, anticorpul etichetat se fixează la lgG seric, captat de antigenul T. gondii. Conjugatul nefixat este eliminat prin operaţii de spălare la sfârşitul incubaţiei.
Transcript
1
PLATELIA™ Toxo IgG 1 placă – 96 72840
DETERMINAREA CANTITATIVĂ A ANTICORPILOR lgG CONTRA TOXOPLASMA GONDII DIN SERUL SAU PLASMA UMAN(Ă) CU AJUTORUL ANALIZEI IMUNOENZIMATICE
881127 – 2013/11 1. DESTINAŢIA Platelia™ Toxo IgG este o analiză imunologică ELISA indirectă, creată pentru determinarea cantitativă a anticorpilor IgG contra Toxoplasma gondii din serul sau plasma uman(ă). 2. VALOAREA CLINICĂ T. gondii este un protozoar care cauzează infecţii la numeroase specii de mamifere şi păsări. Toxoplasmozele, frecvente la oameni şi animale, sunt de obicei asimptomatice. Prevalenţa acestei infecţii în populaţie este stabilită cu ajutorul testelor serologice şi poate să difere în funcţie de ţara de origine şi vârstă. În timpul sarcinii, toxoplasmoza a fost implicată în anomalii congenitale serioase (în particular, afectarea funcţiilor creierului) şi uneori decesul fătului. Demonstrarea prezenţei anticorpilor Toxo lgG la femei înainte de concepţie asigură protecţia fetală contra infecţiilor posibile cu toxoplasmoză în timpul sarcinii. Predispoziţia la infecţie severă cu toxoplasmoză este comună la persoanele care au contactat sindromul imuno-deficienţei dobândite (SIDA) sau care au imunitatea compromisă în alt mod. Aceste infecţii se datorează în principal reactivării chisturilor T. gondii prezente înainte de infecţia HIV. Diagnosticarea specifică infecţiei cu T. gondii poate fi complicată şi izolarea parazitului este rară. Confirmarea serologică a anticorpilor T. gondii este un indiciu al expunerii la parazit şi este larg acceptată ca modalitate de stabilire a stării imunitare şi susceptibilităţii la infecţie. Identificarea mai multor izotopi permite fie datarea T. gondii şi implementarea terapiei potrivite în cazul infecţiei recente, fie propunerea unor recomandări profilactice: indicaţii de igienă alimentară la femeile însărcinate, chemoprofilaxia la populaţia cu imunitate compromisă. 3. PRINCIPIUL Platelia™ Toxo IgG este un test de detectare şi titrare a anticorpilor lgG corespunzători Toxoplasma gondii din serul sau plasma uman(ă) folosind o metodă ELISA imuno-enzimatică şi indirectă. Antigenul T. gondii este folosit pentru acoperirea microplanşetului. Un anticorp monoclonal etichetat cu peroxidază, specific lanţurilor gama umane (anti-lgG), este folosit pe post de conjugat. Etapele testului sunt următoarele: Pasul 1 Probele şi calibratorii de la pacienţi sunt diluate 1/21 şi apoi distribuite în alveolele microplanşetului. În timpul acestei incubaţii de o oră la temperatura de 37°C, anticorpii IgG la T. gondii din probă se fixează la antigenul T. gondii întins pe alveolele microplanşetului. După incubare, anticorpii nespecifici desprinşi şi alte proteine din ser sunt eliminaţi prin spălare. Pasul 2 Conjugatul (anticorpul monoclonal etichetat cu peroxidază, specific lanţurilor gama umane) este adăugat la alveolele microplanşetului. În timpul acestei incubaţii de o oră la temperatura de 37°C, anticorpul etichetat se fixează la lgG seric, captat de antigenul T. gondii. Conjugatul nefixat este eliminat prin operaţii de spălare la sfârşitul incubaţiei.
2
Pasul 3 Prezenţa complexurilor imunitare (antigen T. gondii, anticorpi IgG anti-T. gondii, conjugat anti-IgG) este demonstrată introducând în fiecare alveolă o soluţie enzimatică de dezvoltare. Pasul 4 După incubaţie la temperatura camerei (+18-30°C), reacţia enzimatică este oprită prin adăugarea unei soluţii de acid sulfuric 1N. Datele de densitate optică obţinute cu un spectrofotometru setat la 450/620 nm sunt proporţionale cu cantitatea de anticorpi lgG anti-T. gondii din probă şi sunt convertite în unităţi UI/ml cu ajutorul unei curbe standard, calibrate conform Standardului internaţional al OMS, TOX-M. 4. INFORMAŢII DESPRE PRODUS Cantităţile de reactivi furnizate au fost calculate pentru 96 de teste. Toţi reactivii sunt destinaţi exclusiv diagnosticării in vitro.
Eticheta Natura reactivilor PrezentareR1 Microplanşet Microplanşet: (gata de utilizare):
12 benzi cu 8 alveole fragile, acoperite cu antigen T. gondii neutralizat
R3 Calibrator 0 Calibrator 0: Ser uman negativ pentru anticorpii lgG anti- T. gondii şi negativ pentru antigen HB, anti-HIV1, anti-HIV2 şi anti-HCV Anticoagulant: 0,098% ProClin™ 300
1 x 0,75 ml
R4a Calibrator 6 Calibrator 6 UI/ml: Reactiv de ser uman pentru anticorpii lgG anti- T. gondii şi negativ pentru antigen HB, anti-HIV1, anti-HIV2 şi anti-HCV Anticoagulant: 0,098% ProClin™ 300
1 x 0,75 ml
R4b Calibrator 60 Calibrator 60 UI/ml: Reactiv de ser uman pentru anticorpii lgG anti- T. gondii şi negativ pentru antigen HB, anti-HIV1, anti-HIV2 şi anti-HCV Anticoagulant: 0,098% ProClin™ 300
1 x 0,75 ml
R4c Calibrator 240 Calibrator 240 UI/ml: Reactiv de ser uman pentru anticorpii lgG anti- T. gondii şi negativ pentru antigen HB, anti-HIV1, anti-HIV2 şi anti-HCV Anticoagulant: 0,098% ProClin™ 300
1 x 0,75 ml
R6 Conjugat (51X)
Conjugat (51X): Anticorp monoclonal de rozătoare pentru lanţuri gama umane, cuplat cu peroxidază de hrean Anticoagulant: 0,159% ProClin™ 300
1 x 0,7 ml
R7 Diluant Diluant pentru probe şi conjugat (gata de utilizare): Soluţie tampon Tris-NaCl (pH 7,7), glicerol, 0,1% Tween® 20, fenol roşu Anticoagulant: 0,148% ProClin™ 300
R10 Soluţie de oprire Soluţie de oprire (gata de utilizare):
Soluţie de acid sulfuric 1N 1 x 28 ml
Pentru condiţii de depozitare şi data expirării, citiţi indicaţiile de pe cutie. 5. AVERTIZĂRI ŞI MĂSURI DE PRECAUŢIE Credibilitatea rezultatelor depinde de implementarea corectă a următoarelor bune practici de laborator: Nu folosiţi reactivi expiraţi. Nu amestecaţi sau asociaţi într-o serie dată, reactivi din loturi diferite. OBSERVAŢIE: Pentru soluţia de spălare (R2, identificare etichetă: 20x colorat în verde), cromogen (R9, identificare etichetă: TMB colorat turcoaz) şi soluţie de oprire (R10, identificare etichetă: 1N colorat roşu), puteţi folosi alte loturi decât cele din kit, cu condiţia ca aceşti reactivi să fie strict echivalenţi şi acelaşi lot să fie folosit într-o serie de teste dată. OBSERVAŢIE: Nu este permisă utilizarea diluantului (R7) din loturi diferite de cele furnizate în kit. Nu este permisă nici utilizarea diluantului (R7) furnizat cu kiturile Platelia ™ Toxo IgM (Ref. 72841). OBSERVAŢIE: În plus, soluţia de spălare (R2, identificare etichetă: 20x colorat în verde) poate fi amestecată cu celelalte 2 soluţii de spălare incluse în diverse kit-uri de reactivi Bio-Rad (R2, identificări de etichetă: 10x colorat albastru sau 10x colorat portocaliu) la reconstituire corespunzătoare, cu condiţia să folosiţi un singur amestec într-o serie de teste dată. Înainte de utilizare, aşteptaţi 30 de minute pentru a permite reactivilor să ajungă la temperatura
camerei (+18-30°C). Reconstituiţi sau diluaţi cu atenţie reactivii, evitând orice contaminare. Nu efectuaţi testul în prezenţa vaporilor reactivi (vapori de acizi, alcalini, de aldehidă) sau a
prafului care ar putea altera activitatea enzimatică a conjugatului. Folosiţi recipiente din sticlă bine spălate şi clătite cu apă deionizată sau, de preferat, din materiale
de unică folosinţă. Spălarea microplanşetului este un pas critic al procedurii: respectaţi numărul recomandat de
cicluri de spălare şi asiguraţi-vă că toate alveolele sunt complet umplute şi apoi complet golite. Spălările incorecte pot produce rezultate inexacte.
Nu lăsaţi microplanşetul să se usuce între sfârşitul operaţiei de spălare şi distribuţia reactivului. Nu folosiţi niciodată acelaşi recipient pentru a distribui conjugatul şi soluţia de dezvoltare. Reacţia enzimatică este foarte sensibilă la metale sau ioni de metal. În consecinţă, nu lăsaţi niciun
element de metal să intre în contact cu diverse soluţii care conţin conjugat sau cromogen. Soluţia de cromogen (R9) trebuie să fie incoloră. Apariţia unei nuanţe de albastru arată că
reactivul nu poate fi folosit şi trebuie înlocuit. Folosiţi un nou vârf de pipetă pentru fiecare probă. Verificaţi pipetele şi celelalte echipamente pentru precizie şi operaţii corecte.
Instrucţiuni pentru sănătate şi siguranţă
Materialul de origine umană folosit la prepararea reactivilor a fost testat şi găsit nereactiv pentru antigenul de suprafaţă al hepatitei B (HBs Ag), anticorpii virusului hepatitei C (anti-HCV) şi pentru virusul imunodeficienţei umane (anti-HIV1 şi anti-HIV2). Deoarece nicio metodă nu poate garanta în mod absolut absenţa agenţilor infecţioşi, manevraţi reactivii de origine umană şi probele pacienţilor ca elemente cu potenţial de transmitere a bolilor contagioase: Orice material, inclusiv soluţiile de spălare, care intră în contact direct cu probe şi reactivi ce
conţin materiale de origine umană trebuie considerat capabil de transmitere a bolilor contagioase. Purtaţi mănuşi de unică folosinţă când manevraţi probe şi reactivi. Nu aplicaţi pipeta cu gura. Evitaţi vărsarea probelor sau a soluţiilor care conţin probe. Lichidele vărsate trebuie spălate cu
înălbitor diluat la 10%. În cazul vărsării unui acid, acesta trebuie mai întâi neutralizat cu bicarbonat de sodiu, apoi trebuie curăţat cu înălbitor diluat la 10% şi uscat cu hârtie adsorbantă. Materialul folosit pentru curăţare trebuie eliminat într-un recipient de resturi contaminate.
4
Probele pacienţilor, reactivii care conţin material de origine umană, precum şi materialul şi produsele contaminate trebuie eliminate după decontaminare numai prin: - scufundare în înălbitor cu concentraţie finală de 5% hipoclorură de sodiu, timp de 30 de
minute - sau prin autoclavizare la 121°C timp de cel puţin 2 ore.
ATENŢIE: Nu introduceţi în autoclavă soluţii care conţin hipoclorură de sodiu Evitaţi orice contact dintre reactivi, inclusiv cei consideraţi nepericuloşi, cu pielea şi mucoasa. Resturile chimice şi biologice trebuie manevrate şi eliminate în conformitate cu bunele practici de
laborator. Pentru recomandări privind pericolele şi măsurile de precauţie asociate unor componente chimice
din acest kit de test, vă rugăm să consultaţi pictograma (pictogramele) menţionată(e) pe etichete şi informaţiile furnizate la sfârşitul instrucţiunilor de utilizare. Fişa tehnică de siguranţă este disponibilă la www.bio-rad.com.
6. PROBELE 1. Serul şi plasma (EDTA, heparină sau citrat) sunt tipurile de probe recomandate. 2. Respectaţi recomandările următoare pentru manipularea, procesarea şi stocarea probelor de
sânge: Colectaţi toate probele de sânge, respectând precauţiile de rutină pentru venopunctură. Pentru ser, lăsaţi probele să se coaguleze complet înainte de centrifugare. Păstraţi permanent eprubetele cu dopuri. După centrifugare, separaţi serul sau plasma de coagul sau celule roşii, păstrându-le într-o
eprubetă cu dop bine fixat. Specimenele pot fi depozitate la +2-8°C dacă testul este efectuat în 7 zile. Dacă testul nu este completat în 7 zile sau pentru expediere, congelaţi probele la -20°C sau
mai rece. Nu folosiţi probe care au fost dezgheţate mai mult de 5 ori. Specimenele congelate anterior
trebuie amestecate bine (Vortex) după dezgheţare şi înainte de testare. 3. Probele care conţin 90 g/l de albumină sau 100 mg/l de bilirubină neconjugată, probele lipemice
care conţin echivalentul a 36 g/l de trioleină (trigliceridă) şi probele de hemoliză care conţin până la 10 g/l de hemoglobină nu afectează rezultatele.
4. Nu încălziţi probele. 7. PROCEDURA DE ANALIZARE 7.1 Materiale necesare, dar care nu sunt furnizate
Mixer de tip vârtej. Cititor de microplanşet echipat cu filtre de 450 nm şi 620 nm (*). Incubator de microplanşet, setat termostatic la 37±1°C (*). Spălător de microplanşet automat, semiautomat sau manual (*). Apă sterilă, distilată sau deionizată. Mănuşi de unică folosinţă. Ochelari de protecţie sau de siguranţă. Hârtie adsorbantă. Pipete sau multipipete automate sau semi-automate, reglabile sau presetate, pentru a măsura
şi doza 10 µl la 1000 µl, 1 ml, 2 ml şi 10 ml. Cilindri gradaţi cu capacitate de 25 ml, 50 ml, 100 ml şi 1000 ml. Hipoclorură de sodiu (înălbitor) şi bicarbonat de sodiu. Container pentru reziduuri ce reprezintă pericol biologic. Eprubete de unică folosinţă.
(*) Luaţi legătura cu departamentul nostru tehnic pentru informaţii detaliate despre echipamentul recomandat.
5
7.2 Reconstituirea reactivilor R1: Lăsaţi 30 de minute la temperatura camerei (+18-30°C) înainte de a deschide punga.
Scoateţi tava de transport, returnaţi imediat benzile nefolosite în pungă şi verificaţi prezenţa absorbantului de umiditate. Resigilaţi cu atenţie punga şi depozitaţi la +2-8°C.
R2: Diluaţi 1/20 soluţia de spălare R2 în apă distilată: de exemplu 50 ml de R2 şi 950 ml de apă distilată pentru a obţine soluţia de spălare gata-de-folosire. Preparaţi 350 ml de soluţie de spălare diluată pentru o plăcuţă de 12 benzi dacă spălaţi manual.
R3, R4a, R4b, R4c: Diluaţi 1/21 în diluant (R7) (exemplu: 300 µl de R7 + 15 µl de calibrator). R6+R7: Conjugatul (R6) este concentrat 51x şi trebuie omogenizat înainte de folosire. Diluaţi
1/51 în diluant (R7). Pentru o placă, diluaţi 0,5 ml de conjugat (R6) în 25 ml de diluant (R7). Împărţiţi aceste volume cu 10 pentru a obţine volumul necesar pentru o bandă.
7.3 Depozitarea şi valabilitatea reactivilor deschişi şi / sau reconstituiţi Kit-ul trebuie depozitat la +2-8°C. Când kit-ul este depozitat la +2-8°C înainte de deschidere, fiecare componentă poate fi folosită până la data de expirare indicată pe eticheta exterioară a kit-ului.
R1: După deschidere, benzile rămân stabile timp de 8 săptămâni dacă sunt stocate la +2-8°C în aceeaşi pungă bine închisă (verificaţi dacă există absorbantul de umiditate).
R2: După diluare, soluţia de spălare poate fi păstrată timp de 2 săptămâni la +2-30°C. După deschidere, soluţia concentrată de spălare, depozitată la +2-30°C şi în absenţa contaminării, este stabilă până la data de expirare indicată pe etichetă.
R3, R4a, R4b, R4c, R6, R7: După deschidere şi dacă nu se produce nicio contaminare, reactivii depozitaţi la +2-8°C sunt stabili până la 8 săptămâni.
R6+R7: După diluare, soluţia de lucru pentru conjugat este stabilă timp de 8 ore la temperatura camerei (+18-30°C) sau 2 săptămâni la +2-8°C.
R9: După deschidere şi dacă nu se produce nicio contaminare, reactivul depozitat la +2-8°C este stabil până la 8 săptămâni.
R10: După deschidere şi dacă nu se produce nicio contaminare, reactivul depozitat la +2-8°C este stabil până la data expirării indicată pe etichetă.
7.4 Procedura Respectaţi cu stricteţe procedura de analizare a probelor şi bunele practici de laborator. Înainte de utilizare, lăsaţi reactivii să ajungă la temperatura camerei (+18-30°C). Utilizarea alveolelor fragile necesită atenţie specială în timpul manevrării. Folosiţi toţi calibratorii la fiecare serie pentru a valida rezultatele analizei. 1. Stabiliţi cu grijă planul de distribuţie şi identificare pentru calibratori şi probele pacienţilor. 2. Preparaţi soluţia de spălare diluată (R2) [Consultaţi Secţiunea 7.2]. 3. Scoateţi tava de transport şi benzile (R1) din punga de protecţie [Consultaţi Secţiunea 7.2]. 4. În eprubete identificate individual, diluaţi calibratorii R3, R4a, R4b şi R4c şi probele pacienţilor (S1,
S2…) în diluant (R7) pentru a obţine o diluţie de 1/21: 300 µl de diluant (R7) şi 15 µl din probă [Consultaţi Secţiunea 7.2]. Probe diluate în vârtej.
5. Respectând cu stricteţe secvenţa indicată mai jos, distribuiţi în fiecare alveolă 200 µl de calibratori diluaţi şi probe ale pacienţilor:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A R3 S5 S13 B R4a S6 C R4b S7 D R4c S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12
6. Acoperiţi microplanşetul cu o placă adezivă de etanşare, apoi apăsaţi cu fermitate pe placă pentru
a asigura o etanşare bună. Incubaţi imediat microplanşetul într-o baie de apă controlată cu termostat sau într-un incubator uscat timp de 1 oră 5 minute la 37°C 1°C.
6
7. Înainte de terminarea primei perioade de incubaţie, preparaţi soluţia de lucru a conjugatului (R6+R7) [Consultaţi Secţiunea 7.2].
8. La sfârşitul primei perioade de incubaţie, îndepărtaţi placa adezivă de etanşare. Aspiraţi conţinutul tuturor alveolelor într-un recipient pentru reziduuri cu pericol biologic (care conţine hipoclorură de sodiu). Spălaţi microplanşetul de 4 ori cu 350 µl de soluţie de spălare (R2). Inversaţi microplanşetul şi apăsaţi uşor cu hârtia adsorbantă pentru a îndepărta lichidul rămas.
9. Distribuiţi imediat 200 µl de soluţie de lucru conjugată (R6+R7) în toate alveolele. Soluţia trebuie agitată uşor înainte de utilizare.
10. Acoperiţi microplanşetul cu o placă adezivă de etanşare, apoi apăsaţi cu fermitate pe placă pentru a asigura o etanşare bună. Incubaţi imediat microplanşetul într-o baie de apă controlată cu termostat sau într-un incubator uscat timp de 1 oră 5 minute la 37°C 1°C.
11. La sfârşitul celei de-a doua perioade de incubaţie, îndepărtaţi placa adezivă de etanşare. Aspiraţi conţinutul tuturor alveolelor într-un recipient pentru reziduuri cu pericol biologic (care conţine hipoclorură de sodiu). Spălaţi microplanşetul de 4 ori cu 350 µl de soluţie de spălare (R2). Inversaţi microplanşetul şi apăsaţi uşor cu hârtia adsorbantă pentru a îndepărta lichidul rămas.
12. Distribuiţi rapid în fiecare alveolă şi ferit de lumină 200 µl de soluţie de cromogen (R9). Lăsaţi reacţia să se desfăşoare în întuneric timp de 30 ± 5 minute, la temperatura camerei (+18-30°C). Nu folosiţi placa adezivă de etanşare în timpul acestei incubaţii.
13. Opriţi reacţia enzimatică, adăugând 100 µl soluţie de oprire (R10) în fiecare alveolă. Folosiţi aceeaşi secvenţă şi rată de distribuţie ca în cazul soluţiei de dezvoltare.
14. Ştergeţi cu grijă partea inferioară a plăcii. Citiţi densitatea optică la 450/620 nm cu ajutorul unui cititor de placă şi în 30 de minute de la oprirea reacţiei. Înainte de citire, benzile trebuie păstrate întotdeauna la distanţă de lumină.
15. Înainte de raportarea rezultatelor, verificaţi dacă există concordanţă între citire şi planul de distribuţie al plăcii şi probelor.
8 INTERPRETAREA REZULTATELOR 8.1 Stabilirea curbei standard Prezenţa şi cantitatea anticorpilor IgG anti-T. gondii în proba de testare este determinată prin compararea densităţii optice (OD) a probei de testare cu un domeniu standard. Analiza Platelia™ Toxo IgG este standardizată conform Standardului internaţional al OMS, TOX-M. Cu toate acestea, pot fi observate anumite discrepanţe ale titrurilor la aceeaşi probă de ser atunci când aceasta este testată folosind tehnici serologice diferite. Discrepanţa se datorează faptului că virusul T. gondii folosit în aceste tehnici conţine proporţii variabile din antigenul de membrană solubil. Desenaţi curba standard [OD = funcţie (UI/ml)] prin trasarea citirilor OD ale calibratorilor R3, R4a, R4b pe axa verticală (Y), apoi prin trasarea concentraţiei acestora în UI/ml pe axa orizontală (X). Pentru fiecare probă testată, calculaţi titrul anticorpilor lgG anti-T. gondii determinând din curba standard desenată concentraţia corespunzătoare OD-ului măsurat. NB: Dacă citirea OD a unei probe de testare diluate la 1/21 este > OD R4c, atunci această probă trebuie diluată la 1/210 în diluant R7 şi reintrodusă în analiză. Valorile UI/ml asociate trebuie multiplicate apoi cu un factor de 10. 8.2 Controlul calităţii Include toţi calibratorii pentru fiecare microplanşet şi serie şi analiza rezultatelor obţinute. Pentru validarea analizei, următoarele criterii trebuie îndeplinite:
Valorile densităţii optice: OD R4a ≥ 0,200 OD R4b ≥ 0,400
7
Rapoartele densităţii optice:
OD R4a / OD R3 ≥ 5,00 OD R4b / OD R4a ≥ 2,20 OD R4c / OD R4b ≥ 1,15
Dacă aceste criterii de control al calităţii nu sunt îndeplinite, atunci seria de testare trebuie repetată. 8.3 Interpretarea rezultatelor
Titru < 6 UI/ml Negativ Un rezultat negativ sau echivoc este un indiciu al absenţei imunităţii obţinute, dar nu poate exclude o infecţie recentă. Dacă se suspectează o infecţie recentă a pacientului, trebuie efectuată a doua prelevare de probe aproximativ două săptămâni mai târziu.
6 UI/ml ≤ Titru < 9 UI/ml Echivoc
Titru ≥ 9 UI/ml Pozitiv
Un rezultat pozitiv indică de obicei o infecţie în trecut. Cu toate acestea, o infecţie recentă nu poate fi exclusă, mai ales dacă sunt prezenţi anticorpi lgM anti-T gondii.
O variaţie mai mare a titrului poate fi observată la concentraţii de peste 200 UI/ml. 8.4 Ghidul depistării problemelor Reacţiile nevalidate sau nerepetabile sunt cauzate adeseori de: Spălările inadecvate ale microplanşetului. Contaminarea probelor negative cu ser sau plasmă având titru de anticorpi mai mare. Contaminarea soluţiei de dezvoltare cu agenţi de oxidare chimică (înălbitor, ioni metalici...). Contaminarea soluţiei de oprire. 9 PERFORMANŢE Performanţele Platelia™ Toxo IgG au fost evaluate în 2 locaţii folosind un total de 1310 probe prelevate de la femei însărcinate şi donatori de sânge. Într-o locaţie a fost efectuat un studiu comparativ folosind Platelia™ Toxo IgG TMB (72741) într-o analiză manuală. În a doua locaţie, performanţa Platelia™ Toxo IgG a fost evaluată în raport cu Platelia™ Toxo IgG TMB (72741) folosită la un dispozitiv de analizare automată a microplanşetului EIA. În plus, performanţele trusei Platelia™ Toxo IgG au fost evaluate pe 47 de probe de sânge de cordon ombilical. 9.1 Prevalenţa Prevalenţa anticorpilor anti-Toxoplasma gondii IgG folosind Platelia™ Toxo IgG a fost estimată pe un eşantion de 538 probe provenind în principal de la femeile gravide monitorizate în timpul sarcinii şi din zona Paris (Franţa). 128 probe au fost pozitive pentru anticorpii lgG anti-toxoplasma. Prevalenţa măsurată prin analiza cu Platelia™ Toxo IgG este stabilită la 23,8% (128/538). 9.2 Studiul comparativ (Locaţia 1) Performanţa Platelia™ Toxo IgG a fost evaluată pe un eşantion de 745 probe grupate astfel: 606 probe de ser de la donatori de sânge 139 probe de ser de la femei însărcinate Rezultatele au fost comparate cu cele obţinute folosind Platelia™ Toxo IgG TMB (72741), considerată ca referinţă.
8
Platelia™ Toxo IgG TMB (72741)
Negativ Indecis* Pozitiv Total
Platelia™ Toxo IgG (72840)
Negativ 365 0 0 365
Indecis* 0 2 0 2
Pozitiv 0 0 378 378
Total 365 2 378 745 Acord global: 743/743 100,0% [IC 95% = 99,5% - 100,0%] Specificitatea relativă: 365/365 100,0% [IC 95% = 99,0% - 100,0%] Sensibilitatea relativă: 378/378 100,0% [IC 95% = 99,0% - 100,0%] * Probele indecise nu au fost incluse în calculele de sensibilitate, specificitate şi acord. [IC95%] = 95% interval de încredere 9.3 Performanţe (Locaţia 2) A fost efectuat un studiu prospectiv pe 538 probe provenind în principal de la femei gravide monitorizate în timpul sarcinii şi testate cu rutina de laborator. Aceste probe au fost testate în paralel cu analizele Platelia™ Toxo IgG şi Platelia™ Toxo IgG TMB (72741). În plus, toate probele provenind de la pacienţii necunoscuţi din baza de date a laboratorului şi având un titru sub 100 UI/ml au fost controlate cu a doua metodă: Aglutinarea la sensibilitate (antigen de laborator: T. gondii, tulpină RH) pentru probe de ser cu titru
> 10 UI/ml. Imuno-fluorescenţa indirectă (antigen de laborator: T. gondii, tulpină RH) pentru probe de ser cu
titrul între 3 şi 10 UI/ml. Rezultatele au fost comparate cu cele obţinute folosind Platelia™ Toxo IgG TMB (72741), considerată ca referinţă.
Platelia™ Toxo IgG TMB (72741)
Negativ Indecis* Pozitiv Total
Platelia™ Toxo IgG (72840)
Negativ 406 1 0 407
Indecis* 3 0 0 3
Pozitiv 7 10 111 128
Total 416 11 111 538 Acord global: 517/524 98,7% [IC 95% = 97,3% - 99,5%] Specificitatea relativă: 406/413 98,3% [IC 95% = 96,5% - 99,3%] Sensibilitatea relativă: 111/111 100,0% [IC 95% = 96,8% - 100,0%] * Probele indecise nu au fost incluse în calculele de sensibilitate, specificitate şi acord. [IC95%] = 95% interval de încredere Cele 7 probe pozitive discrepante la analiza Platelia™ Toxo IgG au primit în totalitate confirmare pozitivă cu ajutorul metodelor complementare folosite în laborator (aglutinare la sensibilitate, imuno-fluorescenţă indirectă). În plus, 9 eşantioane de seroconversie incluzând 3 probe fiecare au fost de asemenea testate cu analizele Platelia™ Toxo IgG (72840) şi Platelia™ Toxo IgG TMB (72741). Pentru fiecare eşantion, prima probă a fost negativă pentru anticorpii anti-Toxoplasma gondii IgG şi IgM. În 8 din 9 eşantioane de seroconversie, ambele analize au produs rezultate similare. Într-un eşantion, a doua probă de seroconversie a serului a fost găsită pozitivă cu analiza Platelia™ Toxo IgG, dar indecisă cu analiza Platelia™ Toxo IgG TMB.
9
9.4 Performanţele pe probele de sânge de cordon ombilical 47 de probe de sâmge prelevate din cordon ombilical au fost testate prin protocolul prezentat în paragraful 7.4 (diluţia probelor a fost de 1/21) :
22 probe provenite de la cazuri confirmate cu toxoplasmoză congenitală 18 probe provenite de la cazuri cu infecţii în antecedente la mamă 7 probe provenite de la cazuri indemne.
Toate probele de infecţii congenitale sau în antecedentele mamelor au fost testate pozitive cu trusa Platelia Toxo IgG (72840) şi, dintre acestea, toate probele de infecţii în antecedente erau negative cu trusa Platelia Toxo IgM (72841). Cele 7 probe indemne (fără infecţie) au fost confirmate negative.
9.5 Precizia Precizia în cadrul seriei (repetabilitatea): Pentru a evalua repetabilitatea intra-analiză, au fost testate o probă negativă şi trei pozitive de 32 de ori în cadrul aceleiaşi serii. Concentraţia (UI/ml) a fost determinată pentru fiecare probă. Media concentraţiilor (UI/ml), deviaţia standard (SD) şi coeficientul de variaţie (%CV) pentru fiecare probă sunt listate în tabelul de mai jos: Precizia în cadrul seriei (repetabilitatea):
N=32 Probă negativă Probă pozitivă
scăzutăProbă pozitivă Probă pozitivă
înaltă Concentraţie (UI/ml)
Medie 0,15 16,0 39,8 167,5 Deviaţie standard 0,01 2,3 2,7 23,1
Coeficient de variaţie 7,2% 14,4% 6,9% 13,8% Precizia între serii (reproductibilitatea): Pentru a evalua reproductibilitatea între analize, cele patru probe (una negativă şi trei pozitive) au fost testate în duplicat, în două serii pe zi, pe o perioadă de 20 de zile. Concentraţia (UI/ml) a fost determinată pentru fiecare probă. Media concentraţiilor (UI/ml), deviaţia standard (SD) şi coeficientul de variaţie (%CV) pentru fiecare probă sunt listate în tabelul de mai jos: Precizia între serii (reproductibilitatea)
N=80 Probă negativă Probă pozitivă scăzută
Probă pozitivă Probă pozitivă înaltă
Concentraţie (UI/ml)Medie 0,15 15,2 41,7 166,5
Deviaţie standard 0,05 2,4 4,2 21,0 Coeficient de variaţie 32,6% 15,5% 10,1% 12,6%
10
9.6 Precizia şi liniaritatea Pentru evaluarea preciziei calibrării, au fost testate câteva diluţii ale standardului internaţional OMS, TOX-M. Rezultatele obţinute au demonstrat că analiza Platelia™ TOXO IgG este calibrată precis conform standardului internaţional OMS, TOX-M, pentru valori de până la 30 UI/ml. Peste 30 UI/ml, rezultatele obţinute sunt subestimate cu aproximativ 25 - 50%. Folosind diluţii seriale la 5 probe pozitive, domeniul analizei Platelia™ Toxo IgG a fost stabilit între 7 şi 200 UI/ml. 10 LIMITĂRILE PROCEDURII Diagnosticarea infecţiei T. gondii poate fi stabilită numai pe baza unei combinaţii de date clinice şi biologice. Rezultatul unui singur test de titrare a anticorpilor lgG anti-T.Gondii nu constituie o dovadă suficientă pentru diagnosticarea unei infecţii recente cu Toxoplasma gondii. Diagnosticarea unei infecţii recente poate fi realizată numai cu informaţii complete despre pacient,
inclusiv datele clinice şi biologice (creşterea semnificativă a anticorpilor lgG anti-T. gondii din 2 probe de ser prelevate de la pacient la interval de 3 săptămâni şi testate în aceeaşi serie, prezenţa anticorpilor lgM anti- T. gondii la un nivel semnificativ, demonstraţia avidităţii IgG anti-T.Gondii scăzute).
Prezenţa anticorpilor lgM anti-T. gondii nu reprezintă o dovadă suficientă pentru confirmarea unei infecţii recente deoarece IgM poate să persiste câteva luni sau chiar ani după infectare. Când este detectat IgM, trebuie efectuată atât o determinare cantitativă a anticorpilor lgG anti-T. gondii, cât şi o analiză de urmărire a evoluţiei anticorpilor anti- T. gondii cel puţin la a doua probă de ser prelevată trei săptămâni mai târziu.
Dacă o probă este testată prea devreme în timpul unei infecţii principale recente, este posibil ca anticorpii lgM anti-T. gondii să nu fie încă prezenţi. Dacă există o suspiciune, a doua probă trebuie prelevată aproximativ 3 săptămâni mai târziu, putând să efectuaţi din nou pe aceasta testarea IgM.
11 CONTROLUL CALITĂŢII LA FABRICANT Toţi reactivii sunt preparaţi conform sistemului nostru de calitate, pornind de la recepţionarea materiei prime până la comercializarea produsului final. Fiecare lot este supus evaluărilor de control al calităţii şi este eliberat pe piaţă numai după stabilirea conformităţii cu criteriile de acceptare predefinite. Înregistrările referitoare la producţia şi comenzile fiecărui lot sunt păstrate în cadrul Bio-Rad. 12 REFERINŢE 1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. : The diagnosis of toxoplasmosis. Southern Med. J.
1975; 68, 1433-1443. 2. DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L’AULNOIS D., VITTU G.,
NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A. : Anti-P30 IgA antibodies as prenatal markers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, 310-315.
3. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii infection in 35 940 pregnant women in Norway and pregnancy outcome forinfected women. J. Clin.Microbiol. 1998; 36, 2900-2906.
4. JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. : Development of specific immunoglobulins G, M, and A following Toxo-plasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, 2907-2913.
5. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G. : Improved Diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of anti-Toxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin. Microbiol. 1997 ; 35, 1972-1977.
6. LECOLIER B. and PUCHEU : Usefulness of IgG avidity analysis for the diagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, 2 155-158.
11
7. REMINGTON J.S. and DESMONTS G. : Toxoplasmosis in infectious disease of the fetus and
newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB Saunders Co., Philadelphia 1976; 191-332. 8. SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P., SLIZEWICZ B. and
DEROUIN F. : Serodiagnosis of toxoplasmosis in patients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the specific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, 63-69.
9. WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE D. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group : Evaluation of six commercial kits for detection of human immunoglobulin M. Antibodies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, 3112-3115.
10. WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7, 299-316.
![hhhhçççffçfvvfvÛÛvÛÖÖÛÖ]]Ö] ðð] ð^^ð^ßß ... Ifnaul... · ... {hh++h+IIII)))) ... (L(11(1)))1) XXXX 37¤S((((333 ... @@**@*ÃÃé»»»»1~~~~ZZZZwwwÅÅÅÅÏÏÏÏ™™™¹¹¹¹'''',,,cccc***´´´´MMMM](https://static.documente.net/doc/80x56/5bb1d08509d3f249438b59c5/hhhhcccffcfvvfvuuvuoeoeuoeoe-dd-ddssss-ifnaul-.jpg)
