| Date post: | 14-Apr-2018 |
| Category: |
Documents |
| Upload: | larisa-mocanu |
| View: | 218 times |
| Download: | 0 times |
of 42
7/30/2019 pintea
1/42
INTRODUCERE
Infeciile oportuniste de etiologie micotic fac parte din grupul bolilor infecioase
emergente i au pondere din ce n ce mai mare n cadrul bolilor infec ioase, mai ales n
contextul abuzului de antibiotice de sintez (Odds i colab., 1979). Gravitatea infeciilor
produse de Candida este determinat de echilibrul dintre patogenitatea
microorganismului i capacitatea de aprare a gazdei i implic afectarea sistemul imun
(Fromtling i colab, 2003).
Candida albicans este prezent la aproximativ 50% din populaie fr a provoca
semne sau simptome de boali este localizat la diferite niveluri: cavitate bucal, vagin,
tract gastrointestinal. Aceste zone pot constitui, sub aciunea unor factori, adevrate
"rezervoare" de Candida albicans, grbind astfel apariia manifestrilor (Colosi i col.,
2009). Aceti factori pot fi: consumul prelungit de antibiotice, modificri aprute in
timpul sarcinii, menstruaiei, menopauzei sau n urma tratamentului cu medicamente
hormonale, inclusiv cele anticoncepionale, ali factori de infecie sau boli asociate,
deficiena sistemului imunitar, dari diabetul zaharat.
Medicaia antifungic alopat include diferite substane cum sunt hexoralul,
fungizon, ampfocin, fluconazol, miconazol, etc. n ultimii ani, pe baza unor cercetri
detaliate privind aciunea competitiv a lactobacililor cu fungi din specia Candida
albicans, au aprut formule naturale cu iaurt sau probiotice (Lactobaciluls acidophilus)
care au dovedit a fi eficiente (Osset i colab, 2001). Usturoiul este de asemenea
recomandat, n acelai context.Prezenta tez de doctorat ii propune ca obiective studiul comparativ al unor
plante aromatice care pot s aib potenial anti-candida. Astfel, innd seama de
multitudinea compuilor bioactivi din plantele aromatice i medicinale, ndeosebi a
uleiurilor volatile i a compuilor fenolici (mono-, di- sau polifenoli) care sunt cunoscui
ca avnd potenial antimicrobian, ne-am propus caracterizarea chimic a compoziiei
unor plante autohtone (16 tipuri de plante) i relaia acestor parametri cu aciunea
1
7/30/2019 pintea
2/42
antifungic, testat in vitro pe tulpini de Candida prelevate de la purttori, urmat de
tratamente in vivo i re-evaluri in vitro marcndu-se efectele nregistrate.
Acest studiu este menit s evidenieze care dintre plantele studiate pot fi utilizate
n diferite formule antimicotice.SCOP I OBIECTIVE
Scopul lucrrii: caracterizarea chimic a unor extracte de plante bogate n
compui fenolici cu potenial antifungic i testarea comparativ a aciunii acestor extracte
de plante aromatice i medicinale cu potenial anti-candida.
Obiectivele cercetrilor noastre se refer la dou aspecte:
1. Realizarea i caracterizarea unor extracte din diferite plante
medicinale i aromatice din flora spontan sau cultivate n Romnia care au
potenial antifungic, studiind compoziia acestora n compui fenolici n relaie cu
aciunea antioxidant.
2. Testarea comparativin vitro i in vivo a aciunii extractelor asupra
unor tulpini diferite de Candida albicans (faringian, nazal, vaginal) prin evaluarea
calitativi cantitativ a aciunii acestora, pe pacieni purttori (aparent sntoi,
cu boli cronice sau dup tratamente ndelungate cu antibiotice).Concluziile studiilor efectuate au ca finalitate selectarea celor mai eficiente
extracte de plante care pot oferi aciune antifungic pe termen lung, fr remisii.
Structura tezei
Teza include 4 capitole, primele dou capitole sunt dedicate studiilor de
literatur, iar dou capitole prezint rezultatele experimentale, conform celor dou
obiective menionate mai sus.
Capitolul 1, denumit Compui bioactivi cu potenial antimicotic din plantemedicinale i aromatice, include date detaliate privind ncadrarea botanic, istoric i
compoziia chimic a fiecrei plante care a fost studiat
Capitolul 2, denumit Genul Candida - caracterizare general, tehnici de
prelevare, cultivare i examinare
Capitolele de Cercetri proprii sunt urmtoarele:
2
7/30/2019 pintea
3/42
Capitolul 3 - Caracterizarea unor extracte vegetale cu potenial antimicotic
include 3 studii experimentale paralele efectuate pe plante aromatice i medicinale, dup
cum urmeaz:
Studiul experimental 1: Realizarea unor extracte n alcool etilic i oet de mere,utiliznd 8 plante medicinale i aromatice
Studiul experimental 2: Realizarea unor extracte hidroalcoolice i hidroglicerice
din 6 tipuri de plante medicinale i aromatice
Studiul experimental 3: realizarea i studiul unor extracte hidrofilice de vsc de
diferite proveniene (vsc de mr sau de salcm), distribuia compuilor fenolici n frunze
i stem, variaia compoziiei n funcie de sezon i determinarea capacitii antioxidante
utiliznd metode specifice de evaluare a inhibiiei radicalilor liberi (DPPH, TEAC) sau a
proceselor antioxidante mediate ioni (FRAP, ORAC).
Capitolul 4 -Testarea in vitro i in vivo a aciunii antimicotice a extractelor
vegetale investigate pe diferii purttori de Candida albicans include
Studii in vitro (4.1) i Studii in vivo (4.2.).
Subcapitolul 4.1. intitulat Studiile in vitro include rezultate privind evalurile
cantitative de inhibare a proliferrii in vitro a tulpinilor de Candida albicans prin
spectrometrie UV-Vis (4.1.2.1.). Aceste studii au fost efectuate prin 6 module
experimentale, n care s-au utilizat diferite extracte de plante, individuale sau asociate, la
diferite concentraii, urmrindu-se dinamica de inhibare la 24, 48 i 72 de ore co-cultivare
a extractelor cu tulpinile Candida albicans (faringiene sau vaginale sau nazale) prelevate
de la 11 purttori diferii (aparent sntoi, dar cu diferite boli cronice sau dup
tratamente cu antibiotice). n paralel s-au fcut evaluri calitative (4.1.2.2.) pe mediu
solid, prin acordare de scoruri. n seciunea 4.1.2.3. s-au corelat datele obinute prindeterminrile cantitative i calitative.
Subcapitolul 4.2. intitulat Studiile in vivo au fost derulate pe durata a 21 de zile de
tratament al purttorilor, urmate de investigaii privind viabilitatea, respectiv rezistena
fungilorCandida albicans fa de tratament.
3
7/30/2019 pintea
4/42
CARACTERIZAREA UNOR EXTRACTE VEGETALE CU POTENIAL
ANTIMICOTIC
Folosirea extractelor din plante este o form alternativ tratamentului micozelor ngeneral i a candidozelor, n special, bucurndu-se de o popularitate din ce n ce mai mare
ncepnd cu anii 1990 (Cowans, 1999).
Datele de literatur au demonstrat c exist relaii direct proporionale ntre tipul i
concentraia compuilor fenolici (de tip acid fenolic, procianidine, flavonoide sau
taninuri) din plantele medicinale i aciunea antimicrobian a acestor plante (Sher, 2009).
Aceti compui sunt sintetizai de plante n scop de aprare fa de duntori
microscopici (mucegaiuri sau virusuri) sau macroscopici (insecte). Mecanismul de
aciune implic biosinteza unor elicitori (molecule de aprare imuni toxine sintetizate,
cu efect letal asupra duntorilor. n acest context, pentru a selecta plante i tipuri de
extracte cu efect antifungic, am investigat un numr de 16 plante, medicinale i
aromatice.
Studiu experimental 1
Materiale i metodeS-au utilizat 8 specii de plante aromatice i medicinale i anume: Angelica
archangelica (Angelica)(A); Silybum marianum (Armurariu) (B); Ocimum basilicum
(Busuioc) (C);Ribes nigrum (Coacze negre) (D); Coriandrum sativum (Coriandru) (E);
Majorana hortensis (Maghiran) (F); Rosmarinus officinalis (Rozmarin) (G); Salvia
officinalis (Salvie) (H);
Plantele au provenit din culturi controlate (Staiunea didactic experimental aUSAMV Cluj-Napoca) sau procurate de la PLAFAR Cluj-Napoca.
Protocolul de extracie i evaluarea concentraiei fiecrui extract prin spectrometrie
UV-Vis
Extracia probei mcinat (5 g) a fost fcut mai nti n etanol 35% (50 ml) apoi
s-a folosit ca solvent de extracie oetul de mere de aciditate 5% (50 ml). Probele s-au
sonicat la ntuneric, 24 ore. Absorbana extractelor obinute (nediluate sau diluate 1:10,1:100, 1:1000 ), bogate in compui fitochimici, a fost nregistrat pe domeniul 200-700
4
7/30/2019 pintea
5/42
nm (UV-Vis) cu ajutorul unui spectrofotometru JASCO/2005, pentru a stabili care este
concentraia total de compui fenolici. Pentru acizi fenolici s-a urmrit semnalul
caracteristic la 280 nm, pentru flavonoide la 340 nm, iar pentru antociani la 525 nm.
Cuantificarea acizilor fenolici prin Cromatografie de Lichide de nalt Performan
(HPLC)
Extractele obinute a fost supuse analizei, utiliznd un cromatograf HPLC
Shimadzu, echipat cu o pomp solvent binar, un degazor, cuptor pentru coloani un
detector cu fotodiod DAD (diode array detector). Coloana cromatografic, de tip
SUPELCOSIL TM LC-18, 5m, 25 cm x 4.6 mm, a fost utilizat la 300C. Faza mobil a
constat din doi solveni: solventul A format din metanol : acid acetic: ap bidistilat nraport de 10:1:88 (v/v/v) i solventul B format din metanol: acid acetic: ap bidistilat n
raport de 90:3:7 (v/v/v).
Determinarea concentraiei de polifenoli totali prin metoda Folin-Cioclteu
Coninutul de polifenoli totali din toate probele (extracte alcoolice sau n oet) s-a
determinat prin metoda spectrofotometric Folin-Cioclteu (Huang si colab., 2005).
Determinarea activitii antioxidante prin metoda DPPH
Metoda DPPH (1,1,-difenil-2-picrilhidrazil) este o metod spectrofotometric, larg
utilizat pentru a testa abilitatea compuilor de a ndeparta radicalii liberi sau capacitatea
lor de a dona hidrogen. Este utilizat pentru cuantificarea antioxidanilor n sisteme
bilogice complexe (Miliauskas i colab., 2004). Protocolul de lucru folosit a fost conform
metodei descrise de Brand-Williams i colab., (1995).
Rezultate i discuii
Separarea i cuantificarea prin HPLC a acizilor fenolici din plante medicinale
Separarea unui amestec de standarde pure de acizi fenolici s-a realizat prin HPLC,
n 30 minute. Ordinea eluiei, n funcie de timpii de retenie, a fost: acid galic (4.3), acid
protocatecuic (6,.7), acid clorogenic (13.15), acid cafeic (14.18), acid p-cumaric (19.9),
acid ferulic (21.75), acid sinapic (22.65), acid o-cumaric (25.4). n figura I.1 se regsete
5
7/30/2019 pintea
6/42
imaginea comparativ a amprentei cromatografice a extractului alcoolic comparativ cu
cel acid (oet) Ocimum basilicum.
Ocimum basilicum(Oet)
Ocimumbasilicum (alcool)
mAU
Timp (min)/ Time (min
Fig. I.1. Imaginea comparativ a amprentei cromatografice a extractului alcoolic
comparativ cu cel acid (oet) Ocimum basilicum (B)
Fig. I.1. Comparing image of chromatographic fingerprint of alcoholic extract comparing
to acidic (vinegar) forOcimum basilicum (B)
Analiza spectrometric UV-Vis a extractelor n alcool i n oetS-au identificat maxime specifice pe domeniul 280-340 nm, specifice acizilor
fenolici i a flavonoidelor, care permit recunoaterea unor compui fitochimici
caracteristici (markeri spectrali).
Determinareac activitii antioxidante prin metoda DPPH
Se constat c aciunea antioxidant maxim o are extactul de coacze negre att
n alcool ct i n oet, dei concentraia de acizi fenolici este apropiat de a altor plante
6
7/30/2019 pintea
7/42
ca: busuioc, mgheran, salvie. Acest fapt se explic prin potenialul crescut antioxidant al
antocianilor, superior fa de acizii fenolici i flavonoide ndeosebi n mediul acid. Dintre
plantele medicinale salvia are cea mai mare aciune antioxidant n alcool i de
aproximativ 4 ori mai mic n oet (tabel I.1.)Tabel I 1.
Valorile concentraiilor de fenoli totali i activitatea antioxidant (prin metoda DPPH) a
extractelor din cele 8 plante medicinale, n alcoole etilic i oet de mere
Tabel I.1
Concentrations value of total poliphenols and antioxidant activity (throught DPPH assay) of
extracts obtained from 8 medicinal plants in alcohol and vinegar
Nr. Planta Fenoli totali
mg/ml extract
alcoolic
Activitatea
antioxidant
mM Trolox/ml extract
alcoolic
Activitatea antioxidant
mM Trolox/ml extact n
oet
No. Plant Total phenolics
mg/ml alcoholic
extractt
Antioxidant activity
mM Trolox/ml
alcoholic extract
Antioxidant activity
mM Trolox/ml vinegar
extract
A Angelica archang. 0.64 6.07 0.38
B Silybummarianum 0.70 4.22 0.83
C Ocimum basili. 1.21 6.59 4.46
D Ribes nigrum 1.22 40.08 47.85
E Coriandrum sativ. 0.20 4.78 3.25
F Majorana hortensi 1.17 7.39 1.63
G Rosmarinus off. 1.09 6.92 3.30
H Salvia officinalis 1.16 37.50 8.04
Glucozidele flavonoidice i compui procianidinici au tR mai mare de 30
minute i apar n cantiti semnificative n extractele studiate. Cantitatea de acizi fenolici
este mai mic pentru extractele de angelica, armurariu i rozmarin. Extractul alcoolic de
mgheran este cel mai bogat n compui fenolici. n general s-au identificat att n oet
ct i n alcool regiuni specifice de recunoatere a plantei marcate prin dreptunghiuri n
7
7/30/2019 pintea
8/42
Fig.I.1. Alcoolul are o capacitate mai bun de a asigura o extracie eficient a
flavonoidelor comparativ cu oetul.
Coninutul n polifenoli totali determinat prin metoda Folin-Cioclteu
n tabelul III.3. se regsesc valorile obinute n urma determinrii cantitative a
polifenolilor totali din extractele alcoolice, prin metoda spectofotometric.
S-a observat c cea mai mare cantitate de polifenoli totali se gsete n extractul
vegetal de coacze negre (1.22 mg/ml) i busuioc (1.21 mg/ml) n comparaie cu extractul
de coriandru care conine doar 0.20 mg/ml. Coninut asemntor n polifenoli totali
(mg/ml extract) au mgheranul i salvia.
Concluzii Cea mai mare cantitate de polifenoli totali s-a gsit n extractul vegetal de Ribes
nigrumi Ocimum basilicum;
Cea mai mare activitate antioxidant corelat coninutul de polifenoli a fost
obinut pentru extactul deRibes nigrum att n alcool ct i n oet;
Dintre plantele medicinale cea mai mare aciune antioxidant n alcool s-a
nregistrat pentru extractul de Salvia officinalis; n urma acestui experiment s-a constatat c alcoolul asigur o extracie mai bun a
flavonoidelor fa de oet;
Oetul asigur o extacie mai bun a acizilor fenolici ;
Studiu experimental 2
Materialei metode
n cadrul acestui studiu s-au utilizat plante medicinale din speciile : Melissa
officinalis (Roini) din Timioara (I), Melissa citronella (Cluj) (J);Echinaceea purpurea
(Echinacea) (K) ; Cynara scolymus (Anghinarea) (L);Hypericum perforatum (Suntoare)
(M); Calendula oficinallis (Glbenelele) (N).
8
7/30/2019 pintea
9/42
Protocolul de extracie i evaluarea concentraiei fiecrui extract prin spectrometrie
UV-Vis
n acest studiu, pentru obinerea extractelor s-au utilizat 10g plant medicinal
uscat la 100 ml solvent de extracie, fie amestec alcool etilic : apa n raport de 45:65(%), fie amestec glicerina : ap n raport de 50:50 (%). Extracia s-a efectuat pe durata a 7
zile, la ntuneric i la temperatura de 25 C. Analiza spectrometric s-a fcut conform
celei prezentate n sucapitolul III.1.2 din tez.
Analiza HPLC
Separarea HPLC a standardelor de acizi fenolici i flavonoide s-a realizat confrom
protocolul menionat n subcapitolul. III.1.1.3 din tez.
Rezultate si discuii
Analiza HPLC
n figura I.2. sunt prezentate cromatogramele HPLC extractelor de Calendula
officinalis.
2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 0 2 2 2 4 2 6 2 8 3 0 3 2 3 4 3 6 3 8 4 0
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
2 5 0 0
3 0 0 0
3 5 0 0
4 0 0 0
mAu
T i m p ( m i n )
C a l e n d u l a
1
1 - a c i d g a l ic
2 - a c i d p r o t o c a t e c u ic
4 - a c i d c a f e i c
5 - a c i d p - c u m a r ic
7 - a c i d s i n a p i c
8 - a c i d o - c u m a r ic
1 0 - a c i d r o z m a r in i c
2 4
5n .in . i .
7
8
1 0
Fig. I.2. Cromatogramele HPLC ale extractelor de Calendula oficinallis
Fig. I.2. HPLC cromatograms of extracts Calendula oficinallis
n Tabelul I.2. sunt prezentate cantitile de acizi fenolici i flavonoide mg/g prob
uscat. Acid galic (27.77 mg/g) conin doar glbenelele. Acestea conin cantitatea ceamai mare de acid cafeic (14.83 mg/g), acid sinapic (72.45 mg/g), acid o-cumaric (170
9
7/30/2019 pintea
10/42
10
mg/g) i acid rozmarinic (60.23 mg/g). Cel mai bogat extract vegetal n acid p-cumaric
(8.44 mg/g), este cel de Echinaceea purpurea. Acid ferulic (15.38 mg/g) cantitatea cea
mai mare se afl n extractul deMelissa officinalis. Acid clorogenic (62.07 mg/g) i acid
protocatecuic (129.18 mg/g) n cantitatea cea mai mare se afl n extractul deHypericumperforatum. Flavonoidele se gsesc n cantitatea cea mai mare n extractul de suntoare i
anume quercetina (176,22 mg/g) i kaempherol (127,27 mg/g). Extractul de anghinare
conine n principal, miricetina (14,16 mg/g). Extractul de glbenele conine cea mai
mare cantitate de acizi fenolici i flavonoide. Extractele de Melissa officinalis i
citronella conin acid rozmarinic i acid cafeic n concentraii diferite.
Comparnd coninutul de acizi fenolici i flavonoide (din extractele de plante
medicinale studiate) s-a constatat c extractul de glbenele este cel mai bogat n acizi
fenolici (250 mg/g), iar extractul de suntoare este cel mai bogat n flavonoide
(quercetina i kaempherol cu un total de 300 mg/g).
Studiu experimental 3
Materiale i metodeVscul (Viscum album) a fost prelevat n diferite luni (decembrie, mai, iunie, iulie)
pe parcursul anului 2009 din diferite locatiti din Nord-Vestul Transilvaniei. Probele au
fost denumite n conformitate cu arborele gazd pe care l semi-paraziteaz, astfel: VAM
vscul care paraziteaz mrul (Mallus domestica) i VAS vscul care paraziteaz
salcmul (Robinia pseudoacacia). S-au utilizat frunze (VAM L i VAS L) i stem (VAM
S i VAS S) de la aceste probe.
Protocolul de extracie i analiza spectrometric
Frunzele, respectiv stemul probelor de vsc au fost cntrite i rapid uscate (pentru
a preveni aciunea enzimelor) ntr-o etuv la 900 C, timp de 48 de ore. S-a determinat apoi
substana uscat a probelor. Pentru extracia compuilor bioactivi s-a folosit metoda
descris de Sakakibara i col., 2003, cu unele modificri.
Activitatea antioxidant a compuilor fitochimici se poate determina prin diferite
metode. Compusii hidrofilici (compusii fenolici) au mecanisme ionice prin care
actioneaza ca reducatori (donori de electroni) , metodele optime de determinare a aciunii
antioxidante fiind FRAP i TEAC.
7/30/2019 pintea
11/42
Concentraiile de compui fenolici individuali i totali obinute prin analiza H
Concentrations of each phenolic compounds and total phenolics determined t
plants investigated
Concentraia compus fenolic mg/g probPhenolic compound concentration mg /g sample
Denumireprob
Sample nameAcidgalic
Acidprotoca
tecuic
Acidcloroge
nic
Acidcafeic
Acidp-
cumaric
Acidferulic
Acidsinapic
Acido-
cumaric
Rutina Miricetina
Melissa
officinalis0 54.05 0 4,09 0 15.38 0 0 0 0
Melissa
citronella0 0 0 3,63 0 0 0 7.15 0 0
Echinaceea
purpurea0 31,09 0 0 8.44 0 0 0 0 0
Cynara
scolymus0 0 31.70 0 0 13.71 0 0 0 14.51
Hypericum
perforatum0 129.18 62.07 0 0 0 0 8.07 0 0
Calendula
oficinallis27.77 26.5 0 14.83 5.72 0 52.45 40 0 0
7/30/2019 pintea
12/42
12
Cuantificarea acizilor fenolici prin Cromatografie de Lichide de nalt
Performan
Probele au fost extrase conform protocolului de la subcapitolul III.1.1.1.
Extractul a fost supus analizei HPLC conform protocolului descris n subcapitolul
III.1.1.2. Cromatogramele obinute au fost monitorizate la 280 nm. Pentru
cuantificarea rezultatelor s-au determinat curbele de etalonare a 9 standarde (acid
galic, acid protocatecuic, acid cafeic, acid siringic, acid ferulic, acid sinapic,
naringina, quercetina, kaempherol).
Evaluarea activitii antioxidante
Metoda DPPH, s-a realizat conform protocolului descris n subcapitolul
III.1.1.4.
Metoda ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) este o metod folosit
pentru msurarea capacitaii antioxidante a diferitelor probe. S-a urmarit principiul
metodei stabilit de Huang si colab., 2002, ce const n msurarea degradarii unei
molecule fluorescente n prezena unui generator de radicali liberi de tip peroxil
(Huang i colab., 2002, Cao i colab., 1998).Metoda FRAP (ferric reducing antioxidant power) este o metoda simpl
spectrofotometric care testeaz puterea antioxidant a probelor luate n studiu, i
se bazeaz pe reducerea complexului tripiridiltriazina feric (Fe(III)-TPTZ) la
complexul tripiridiltriazina feroas (Fe(III)-TPTZ) de ctre un reductant la pH acid
(Benzie, 1996).
Metoda TEAC (Trolox Equivalents Antioxidant Capacity) se bazeaz pe
abilitatea antioxidanilor de a diminua viaa radicalului cation (ABTS+), un
cromofor albastru verde care absoarbe la 734 nm, comparativ cu Trolox (Arnao i
colab., 2001).
Rezultate i discuii
Cuantificarea acizilor fenolici din vsc prin metoda HPLC
Fig.I.3.conine cromatogramele extractelor VAM ( L si S), i VAS ( L si S).
Tabelul I.3. include valorile obinute pentru determinarea compuilor fenolici din
7/30/2019 pintea
13/42
vsc de pe mri salcm, calculate pe baza curbei de calibrare HPLC cu standarde,
prezentat mai sus.
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
VAML_H_AcEt1-Galic -
2-Protocatecuic7,597
3-Cafeic 13,154
4-Siringic 13,353
5-Ferulic 20,273
6-Sinapic 20,583
7 -N arin gin a 2 7,5 85
8-Quercet ina 30,014
9-Kaempherol -
mAU
Timp (min)
2
34
56
8
7
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000VAMs_H_AcEt
1-Galic 4,570
2-Protocatecuic7,627
3-Cafeic 13,089
4-Siringic 13,827
5-Ferulic 20,668
6-Sinapic 21,091
7-N aringina 27,530
8 -Q uer ce ti na -
9-Kaempherol -
mAU
Timp (min)
1
2
3
45 6
7
Fig. I.3. Cromatograma HPLC a extractelor din frunze i stem de vsc VAM
care paraziteaz mrul A). VAM L B). VAM S
Fig. I.3. HPLC chromatogram of leaves and stem extracts of mistletoe that
parasites apple tree (VAM) A). VAM L B). VAM S
13
7/30/2019 pintea
14/42
Tabelul I.3.
Compui polifenolici totali (acizi fenolici i flavonoide) n diferite extracte de vsc
de pe mri salcm
Table I.3.Total polyphenolic compounds (phenolic acids and flavonoids) from different
mistletoe extracts that parasites apple and acacia trees
Proba Compui polifenolici (acizi fenolici i flavonoide)* - (g/g prob uscat)
Sample Phenolic compunds (phenolic acids and flavonoids)* - (g/g dry sample)
VAM S 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
VAM L nd. 4.10 6.39 nd. 7.81 2.11 nd. 0.36 nd.
VAS L 39.93 0.37 nd. nd. 9.93 19.32 nd. 7.90 7.58
VAM S nd. nd. 6.81 nd. 6.88 1.13 nd. nd. nd.
VAS S nd. 2.01 nd. nd. nd. nd. nd. nd.
* - numerotarea i denumirea compiilor polifenolici este redat n Tabelul III.9.
6.38
nd.** - nedetectabil
Se constat c VAM L i S sunt mai bogate n acid ferulic, avnd
concentraii de 7.81 i respectiv 6. 88 g/g iar VAS L este bogat n acid galic, n
timp ce VAS S n kaemferol, cu concentraii de 39.93 i respectiv 6.38 g/g.
n extractele de vsc nu s-au pus n eviden prezena acidului siringic (4) i
a acidului galic (1), cu excepia probei VAS L n care s-a detectat o cantitate
remarcabil comparativ cu ceilali acizi fenolici, de 39.93 g/g prob uscat. De
asemenea, frunzele de vsc sunt mai bogate dect stemul, probei VAM. n figurile
I.3 i I. 4 sunt prezentate cromatogramele HPLC a extractelor de vsc recoltate de
pe mri salcm. Extractul de frunze de vsc care crete pe salcm este cel mai
bogat n compui bioactivi.
Evaluarea activitii antioxidante prin metodele DPPH, ORAC, TEAC, FRAP
n ultimii ani au fost studiate intens efectele antioxidante a extractului de
vsc aparinand speciei Viscum coloratum, activitate datorat n special
flavonoidelor (Leu i colab., 2006, Yao i colab., 2006, Shi i col., 2006; Vicai
colab., 2008; 2009). Majoritatea extractelor de plante prezint proprietai
antioxidante, n special datorit compuilor bioactivi aparinnd clasei polifenolilor
(Aqil i colab., 2006).
14
7/30/2019 pintea
15/42
15
Determinarea activitii antioxidante prin metoda DPPH
n Tabelul I.4. sunt prezentate gradul de inhibiie a radicalului DPPH
exercitat de extractele apoase de vsc VAM i VAS (frunze i stem).
Tabel I.4.Capacitatea de inhibare a radicalului DPPH de ctre compuii cu potenial antioxidant
din extractul de vsc
Tabel I.4.
Inhibition capacity of
DPPH radical by coumpounds from mistletoe extract with antioxidant potential
Inbibare a DPPH (%)Probe
Decembrie Mai IulieInhibition of DPPH (%)Samples
December May July
VAM L 5,20,00 12,090,01 2,220,01
VAS L 6,050,01 23,230,01 11,490,04
VAM S - 7,40,00 -
VAS S 9,450,01 21,370,01 2,560,02
Valorile nregistrate prin metoda DPPH, arat c activitatea antioxidanteste semnificativ mai mare n luna mai, explicabil prin stimularea activitii
enzimatice specifice sezonului de primvar.
Determinarea activitii antioxidante prin metoda ORAC
Valorile obinute prin metoda ORAC arat c acestea sunt influenate de
perioada de recoltare a produsului vegetal. Valorile ORAC sunt mai mari pentru
probele recoltate n decembrie.
Determinarea activitii antioxidante prin metoda TEAC
Valorile TEAC obinute n urma investigrii diferitelor extracte de vsc, au
artat c activitatea antioxidant cea mai mare s-a nregistrat n luna mai ndeosebi
n stem .
Determinarea activitii antioxidante prin metoda FRAP
Din punct de vedere al valorilor FRAP am obtinut diferene ntre extractele
recoltate n diferite perioade de timp. Dintre extractele investigate, cea mai mare
activitate antioxidant a prezentat-o extractul VAS S (4,230,87 mg/L echivalent
vitamina C/g stem) recoltat n luna mai.
7/30/2019 pintea
16/42
16
Concluzii Concentraia total de compui fenolici n vscul de salcm (VAS L) ajunge
la valori de aprox. 84 mg/kg plant uscat, n timp ce la mr (VAM L) de 4
ori mai puin. In acelai timp, n stem, la VAM concentraia de compuifenolici este de aprox 14 mg/kg, mai mare de 2 ori dect la VAS S.
Comparativ cu plantele medicinale de mai sus, concentraia n compui
fenolici este semnificativ mai mic.
Activitatea antioxidant hidrofil la vsc a fost evaluat prin metodele
FRAP i TEAC, respectiv DPPH i ORAC. Activitatea antioxidant este
mai mare la probele recoltate n luna mai, cnd procesele biosintetice sunt
mai intense. Metodele TEAC si FRAP dau valori mici i similare la celedou tipuri de extracte. n concluzie, considerm c cele dou metode
DPPH i ORAC dau informaii complementare i evideniaz specific
potenialul diferit al extractelor VAM i VAS.
Corelnd compoziia n compui fenolici cu aciunea antioxidant s-a
constatat c vscul recoltat de pe salcm VAS are valori maxime de
compui fenolici i concomitent, o activitate antioxidant intens.
TESTAREA IN VITRO I IN VIVO A ACIUNII ANTIMICOTICE A
EXTRACTELOR VEGETALE INVESTIGATE PE DIFERII
PURTTORI DE CANDIDA ALBICANS
Plantele medicinale sunt utilizate ca tratamente alternative n diferite stri
de boal. Tot mai multe recomandri susin tratamentele alternative bazate pe
extracte de plante deoarece oferi protecie organismului n lupta cu patogenii i
stimuleaz sistemul imun (Bilia i colab., 2002; Cichewicz i colab.,1996; Dauria
i colab., 2005.).
Candida albicans este un patogen ce poate cauza infecii locale sau
sistemice, putnd afecta pacienii ce au o imunitate sczuti pe cei supui unor
tratamente ndelungate cu antibiotice (Istrati-Ghinescu.,1979; Zhang i colab.,2003; Polak i colab., 1985). Potenialul patogen se manifest numai n anumite
7/30/2019 pintea
17/42
17
condiii, dar existi factori favorizani care duc la manifestarea acestuia (Cutler,
1991).
n urma tratamentului cu extracte vegetale la om i animale, pn acum, nu
s-au obinut rezultate spectaculoase mpotriva acestui patogen, dei se cunosccteva specii de plante care au efect anti-candidozic. Aceste date preliminare i
unele contradictorii justificderularea unor cercetri care s identifice extracte
de plante cu aciune anti-candida (Petran i colab., 2006; Lemar i colab., 2002;
Shams i colab., 2006; Mir-Rashed i colab., 2010).
Obiectivele prezentului capitol sunt:
Evaluarea (calitativi cantitativ) a aciunii diferitelor extracte de plante
aromatice i medicinale (caracterizate conform datelor din capitolul III.) in
vitro, pe diferite tulpini de Candida albicans (faringian, vaginal sau nazal)
recoltate de la purttori aparent santoi. Au fost elaborate 6 module
experimentale, fiecare cu protocol specific.
Utilizarea pentru tratamente locale (21 de zile) in vivo a extractelor care au
dovedit aciune inhibitoare in vitro. n funcie de prezena sau absena
patogenului, dup 21 de zile s-a trecut sau nu, la nsmnarea pe mediul
lichid. La probele care au fost pozitive s-au nsmnat tulpinile pe mediul
solid i lichid i dup 24, 48, 72 h s-a identificat microscopic prezena
patogenului i s-a determinat cantitativ rata sa de proliferare n prezena
aceluiai tip de extract vegetal, care s-a dovedit eficient n modulele
experimentale in vitro.
Re-evaluarea sensibilitii in vitro a tulpinilor de Candida (recoltate de la
purttorii tratai in vivo) fa de aceleai tipuri de extracte.
Studii in vitro
IV.1.1. Materiale i metode
Efectul in vitro al aciunii antifungice al extractelor de plante medicinale
a impus utilizarea de tulpini patogene de Candida prelevate de la diferii purttori
P1P11. S-au prelevat tulpini de Candida albicans fie de la purttori aparentsntoi, fie de la purttori cu diferite afeciuni. Tulpinile recoltate au fost
inoculate pe medii de cultur standardizate.
7/30/2019 pintea
18/42
18
Material vegetal: Extractele vegetale utilizate au fost de Ocimum
basilicum (busuioc), Coriandrum sativum (coriandru), Rosmarinus officinalis
(rozmarin), Salvia officinalis (salvie), Angelica archangelica (angelica), Silybum
marianum (armurariu), Ribes nigrum (coacze negre), Majorana hortensi(mghiran),Echinaceea purpurea (echinacea),Hypericum perforatum (suntoare),
Calendula officinalis (glbenele), Melissa officinalis (Roini) din Timioara,
Melissa citronella, Cynara scolymus (anghinare), Vscum album (vsc).
Descrierea etapelor experimentale
Pentru a obine tulpina de patogen dorit, s-a procedat astfel: s-au izolat n
condiii de laborator fungi din prelevatele patologice (secreie faringian, secreienazal, secreie vaginal) prin nsmnare prin etalare n puncte fixe i mai trziu
prin alte tehnici, pe mediu solid i lichid.
Dup o incubare de 24, 48, 72 h, placa Petri s-a examinat macroscopic i
microscopic.
Culturile de Candida albicans de la purttori au fost incubate la 37 C,
urmnd a fi folosite fragmente pentru testrile ulterioare. Fiecreia i s-a atribuit un
numr de identificare i s-au notat caracterele culturale.
Determinri cantitative (pe mediul lichid)
Evaluarea cantitativ a activitii antimicotice ,,in vitros-a realizat n urma
punerii n contact a tulpinii agentului fungic n cauz cu antimicoticul pe care l-am
considerat control pozitiv (hexoral) i cu extractele vegetale menionate mai sus. n
concentraii de la 0,2% pn la 8%.
Dup obinerea culturii pure de C. albicans s-au luat fragmente din colonie
i s-au transplantat n mediu Sabouraud lichid.
O importan deosebit am acordat-o anamnezei purttorilor (P1-
P11), care pe lng simptomele subiective caracteristice candidozei a relevat
prezena unei simptomatologii de baz, date de o boal de ordin general sau
loco-regional, cu ecouri asupra economiei ntregului organism, predispozante
la micoz. Evaluarea aciunii antifungice s-a fcut n ase module experimentale,prezentate n tabelul I.5.
7/30/2019 pintea
19/42
19
Tabel I.5.
Module experimentale i extracte utilizate pentru testarea aciunii anti-Candida in
vitro. Tulpini recoltate de la diferii pacieni ( P1-P11)
Table I.5.Experimental modules and extracts used for testing the action of anti-Candida in
vitro. Strains collected from different patients (P1-P11)
Modulexperimental
Abrevierepurtator
Sursa derecoltare
Extracte utilizate
Experimentalmodule
Abreviationbearer
Prelevationsource
Extract studied
1. P1P2
P3
Faringian Busuioc, Coriandru,Rozmarin, SalvieAngelica, Armurariu, Coacze negre,
MgheranEchinaceea, Suntoare, Glbenele
2. P4P5P6
Faringian Amestec extracteA1busuioc+coriandru (1:1)A2rozmarin+salvie (1:1)
3. P7
Vaginal MelissaAnghinareHA si HG
4. P8 Nazal VAM S si VAS LVAS S i VAS L
5. P9P10
Faringian VAM SMelissaEchinaceeaCalendula
6. P11
Vaginal Amestec extracteA3busuioc+coriandru (1:3)A4salvie+rozmarin (1:3)
Module experimentale
Patogenul Candida albicans prelevat de la purttori a fost co-cultivat cu
diferite concentraii de extract vegetal (0,2 %; 0.5 %; 1 %; 2 % ; 3 %; 4 %; 5 %; 6
%; 7 % , 8 %) n mediul de cultur lichid.
Pentru fiecare prob experimental (abreviat PE), mediul de cultur lichid
a fost inoculat cu aceeai tulpin de Candida albicans (106 celuleml ) prelevat de
la purttorii P1-P11). Toate analizele s-au realizat in triplicat.
La fiecare 24 ore s-a msurat absorbia specific a fiecrei probe la = 560
nm, utiliznd un spectrofotometru de tip ABLE-JASCO 530. Rata de proliferarecelular a fost determinat prin msurarea densitii optice la 24, 48, 72 h de la co-
cultivare cu extractele vegetale i/sau Hexoral.
7/30/2019 pintea
20/42
7/30/2019 pintea
21/42
Perioada 24-48 ore pare s fie optim pentru a identifica activitatea antifungic.
Dup 48 ore aceasta se menine aproape constant.
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
Graddeinhibiie(%)
Inhibitiondegree(%)
24h 48h 72h 24h 48h 72h
0,2% 8%
PURTTOR P1/ BEARER P1
Ocimum basilicum
Coriandrum sativum
Rosmarinus officinalis
Salvia officinalis
Control +
Fig. I.4. Gradul de inhibiie (%) al diferitelor extracte vegetale co-cultivate cu C. albicans
recoltat de la purttorul P1
Fig. I.4. The degree of inhibition (%) of different vegetal extracts co-cultured with C.
albicans collected from P1 bearer
La purttorul P2, extractul de Ribes nigrum (coacze negre), ndeosebi laconcentraia de 8%, are aciune inhibitoare, maxim la 48 de ore, urmat de
extractul de Angelica archangelica (angelica). Extractul de Silybum marianum
(armurariu) are un efect de inhibare a creterii patogenului Candida numai n
primele ore, dar devine stimulator la 72 de ore.
Ordinea descresctoare efectului antifungic la acest purttor a fost:
Hexoral> coacaze>maghiran > angelica>armurariu
La purttorul P3 toate cele 3 extracte (echinaceea, suntoare, calendula) au
efect inhibitor la toate concentraiile, dupa 48 de ore, i maxim dup 72 de ore.
Asemenea celorlalte variante, valorile inhibiiei de la 48 de ore nu cresc
semnificativ la 72 de ore.
Ordinea descresctoare efectului antifungic la acest purttor a fost:
Hexoral = echinaceea= sunatoare >calendula
Dupa 72 ore, la o concentraie de 8%, efectul a fost similar pentru toateextractele i similar cu cel al hexoralului.
21
7/30/2019 pintea
22/42
Concluzii
Datele obinute n modulul experimental 1 au demonstrat aciunea inhibitoare
semnificativ a extractelor de plante, ndeosebi pentru coriandru, coacze, echinaceea,
suntoare i calendula. Aciunea a fost dependent de concentraie i de durata co-cultivrii.
Modul experimental 2
Figura I.5.reprezint gradul de inhibiie al diferitelor extracte vegetale comparativ
cu controlul negativ, exprimat n procente, dup 24, 48 i 72 ore de co-cultivare cu C.
albicans prelevat de la purttorul P4.
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
Graddeinhibiie(%)
Inhibitiondegree(%)
24 h 48h 72h 24 h 48h 72h
0,2% 8%
PURTTOR P4/ BEARER P4
A1
A2
Control +
Fig I.5.Gradul de inhibiie (%) al diferitelor extracte vegetale co-cultivate cu C. albicans
recoltat de la purttorul P4
Fig I.5. The degree of inhibition (%) of different vegetal extracts co-cultured with C.
albicans collected from P4 bearer
Amestecul A1 (busuioc+coriandru, 1:1) a fost, n mod semnificativ mai activ dect
A2 (rozmarin + salvie, 1:1), att la 0,2% ct i la 8%, dar nu s-au remarcat diferene
semnificative ntre % de inhibiie la aceste concentraii, att la 48 de ore ct i la 72 de
ore. Am remarcat efect sinergic ntre aciunea inhibitoare a extractului de coriandru i
busuioc (observat la P1) n timp ce asocierea rozmarinului cu salvia (care nu au avut
efecte semnificative independent) nu au mbuntit efectul antifungic prin asociere.
La purttorul P4 amestecul de extracte A1 (busuioc+coriandru, 1:1 ) a fost, n mod
semnificativ mai activ dect A2 (rozmarin + salvie, 1:1), att la 0,2% ct i la 8%, dar nu
s-au remarcat diferene semnificative ntre % de inhibiie la aceste concentraii, att la 48
de ore ct i la 72 de ore. S-a remarcat un efect sinergic ntre aciunea inhibitoare a
22
7/30/2019 pintea
23/42
extractului de coriandru i busuioc (observat la P1) n timp ce asocierea rozmarinului cu
salvia (care nu au avut efecte semnifcative independent) nu au mbuntit efectul
antifungic prin asociere.
La purttorul P5 acelai amestec de extracte a determinat rezultate similare
demonstrnd c efectul antifungic al amestecului A1 este reproductibil. Efectul antifungic
al extractului A2 ( rozmarin + salvie, 1:1) a fost i n acest caz mai redus, reprezentnd
aprox. 60% din efectul extractului A1.
La purttorul P6 aceleai amestecuri de extracte A1i A2 au determinat rezultate
similare cu purttorul P5, demonstrnd c efectul lor antifungiceste reproductibil. Efectul
antifungic al extractului A2 ( rozmarin + salvie, 1:1) a fost i n acest caz mai redus,
repezentnd aprox. 60% din efectul extractului A1.
Concluzii
Tulpinile de Candida faringiene de la cei trei purttori P4-P6 au rspuns similar
fa de extractele adminstrate. Extractul cu activitate fungic evident este amestecul
busuioc+coriandru, 1:1, ndeosebi la o concentraie de 8%.
Modul experimental 3
Figura I.6. reprezint gradul de inhibiie (%) indus de extracte hidroalcoolice de
Melissa officinalis (Roini) din Timioara, Melissa citronella, Cynara scolymus
(anghinare) comparativ cu controlul negativ, exprimat n procente, asupra patogenului C.
albicans dup 24, 48 i 72 ore..
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
Gradde
inhibiie(%)
Inhibitiondebree(%)
24 h 48h 72h 24 h 48h 72h
0,2% 8%
PURTTOR P7/ BEARER P7 (HA)
Melissa officinalis
Melissa Timi
oaraMelissa citronella
Cynara scolymus
Control +
Fig I.6.Gradul de inhibiie al diferitelor extracte vegetale hidroalcoolice (HA) co-cultivate
cu C. albicans vaginalrecoltat de la purttorul P7
Fig I.6. The degree of inhibition (%) of different hidroalcoholic vegetal extracts co-
cultured with C. albicans collected from P7 bearer
23
7/30/2019 pintea
24/42
Toate extractele hidroalcoolice (HA) au avut aciune mai slab dect hexoralul,
darCynara scolymus (anghinare) a dovedit a avea efect inhibitor la concentraie de 8%,
indiferent de durata incubrii (constant la 24, 48 si 72 ore).
n general, extractele de Melissa officinalis (Roini) din Timioara, Melissa
citronella au indus efecte similare, apropiate de anghinare dup 72 ore de co-cultivare la
8% superioare.
Concluzii
n prezena extractelor vegetale hidroalcoolice i hidroglicerice patogenicitatea i
virulena celulelor de Candida albicans este redus, efectul inhibitor al extracului de
anghinare, la 8%, dup 72 de ore fiind superior Hexoralului. Extractele hidroglicerice
(HG) au avut efect inhibitor mai intens dect cele hidroalcoolice, dar nu semnificativ
statistic
n general aciunea inhibitoare este maxim la 72 ore de co-cultivare dar este
eficient i la 24 ore. Extractele de Melissa au avut aciune inhibitoare similar, constant
pe interval 48-72 de ore.
Modul experimental 4
Gradul de inhibiie (%) indus de extracte de Viscum album (vsc) este reprezentat
n figura I.7. comparativ cu controlul negativ, asupra patogenului C.
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
Graddeinhibiie(%)
Inhibitiondegree(%)
24 h 48h 72h 24 h 48h 72h
0,2% 8%
PURTTOR P8/BEARR 8
VAM S
VAM L
VAS S
VAS L
CONTROL+
albicans dup 24, 48 i 72 ore.
Fig. I.7.Gradul de inhibiie al diferitelor extracte de vsc co-cultivate cu C. albicans
nazal recoltat de la purttorul P8
Fig I.7. The degree of inhibition (%) of different mistletoe extracts co-cultured with C.
albicans collected from bearer P8
24
7/30/2019 pintea
25/42
25
Concluzii
Extractul de vsc ce paraziteaz mrul (VAM) a demonstrat efect similar
inhibitor cu controlul pozitiv, chiar mai intens n cazul extractului de stem (S)
dect cel de frunze (L), mai intens la mr dect la VAS (S sau L). Extractul deVAM S a inhibat creterea culturii de C. albicans chiar de la 24 de ore, fiind mai
eficient dect Hexoralul la concentraia de 8%. Efectul inhibitor a fost semnificativ
mai mare la concentratia de 8% i nu a crescut semnificativ de la 48 la 72 de ore.
n general aciunea inhibitoare a vscului a fost mai redus dect la plantele
medicinale investigate n modulele experimentale 1-3.
Modul experimental 5
Pornind de la rezultatele obinute n modulele anterioare, au fost selectate
extractele cu efect inhibitor mai intens pentru a fi co-cultivate, n aceleai condiii
cu Candida albicans faringian. Pentru tulpina Candida recoltat de la purtatorul
P9, comparativ cu vscul, toate celelalte extracte Melissa officinalis (Roini) din
Timioara,Echinaceea purpurea (echinacea), Calendula oficinallis (glbenele) au
avut efect inhibitor mai intens dect extractul de vsc controlul pozitiv (Hexoral).
ndeosebi extractele de Calendula officinalis (glbenele) i Echinaceea purpurea
(echinacea) au indus inhibiie de peste 70%. Nu au fost remarcate deosebiri
semnificative ntre gradul de inhibiie la 0,5% i 7% la cele trei extracte active din
plante medicinale. S-a confirmat faptul c extractul de vsc e mai puin activ
(Tabel I.6.)
7/30/2019 pintea
26/42
Tabelul I 6.
Valorile absorbanelor la =560nm, comparativ pentru diferite concentraii de extract de
plante co-cultivate cu C. albicans faringian prelevat de la purttorul P9
Table I.6
Absorbance values at =560nm, comparative for different plant extract concentrations co-
cultured with faringian C. albicans collected from bearer P9
Denumire extract Durata(h)
Valorile absorbanelor
Absorbance valuesExtract name Period (h)
0,5 3 7
VAM S 1,60,141 1,620,04 1,380,084
MELISSATIM 1,040,04 0,9150,021 0,8250,035
ECHINACEEA 0,580,028 0,520,049 0,4250,04
CALENDULA 0,500,007 0,45 0 0,350,063
CONTROL + 1,560,035 1,400,028 0,930,014
CONTROL-
24
20,028
VAM S 1,590,007 1,49 0,035 1,30,042
MELISSATIM 1,010,021 0,930,014 0,830014
ECHINACEEA 0,6650,03 0,560,028 0,470,042
CALENDULA 0,680,014 0,580,042 0,350,049
CONTROL + 1,660,014 1,450,021 1,340,035
CONTROL-
48
2,20,021
VAM S 1,5650,049 1,480,056 1,2150,077
MELISSATIM 1,1550,02 0,9850,021 0,740,028
ECHINACEEA 0,360,014 0,340,007 0,250,00
CALENDULA 0,690,028 0,640,035 0,530,049
CONTROL + 1,480 1,270,007 1,200,021
CONTROL-
72
2,40
26
7/30/2019 pintea
27/42
Concluzii
Aciunea inhibitoare a extractului de Echinaceea purpurea (echinacea) i
Calendula oficinallis (glbenele) sunt similare, la toate intervalele de co-cultivare i nu
depend de doz. Intensitatea inhibiiei este apropiat de a hexoralului. Semnificativ mairedus este efectul antifungic al extractului de Melissa officinalis (Roini) din Timioara
n acest caz, i minim pentru extractul de Viscum album (vsc). Comparativ cu controlul
pozitiv, la 24 i 48 de ore sunt mai inhibitoare, dar la 72 de ore devin aproximativ egale.
Modul experimental 6
Tinnd seama de rezultatele obinute n modulul experimental 1 i 2, n acest
modul s-au utilizat extracte de busuioc + coriandru (1:3) (extract A3), comparativ cu
extracte de salvie+rozmarin (1:3) (extract A4).
Tabelul IV.14 include valorile absorbanei obinute la =560nm, comparativ
pentru hexoral, amestecuri vegetale A3, A4 co-cultivat cu tulpina de Candida albicans
vaginal prelevat de la purttorul P11, comparativ cu controlul pozitiv i negativ.
Gradul de inhibiie al amestecuri de extracte vegetale A3 si A4 comparativ cu
controlul negativ, exprimat n procente, dup 24, 48 i 72 ore de co-cultivare cu C.
albicans vaginal este reprezentat n figura I.8.
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
Graddeinhibiie(%)
Inhitiondegree(%)
24 h 48h 72h 8 24 h 48h 72h
0,2% 8%
PURTTOR P11/BEARER 11
A3
A4
CONTROL+
Figura I.8.Gradul de inhibiie al celor dou amestecuri de extracte vegetale co-cultivate
cu C. albicans recoltat de la purttorul P11
Fig. I.8. The degree of inhibition (%) of two vegetal extracts co-cultured with C. albicans
collected from P11 bearer
27
7/30/2019 pintea
28/42
28
Determinrile cantitative efectuate n modulule experimentale 1-6 au permis
evidenierea aciunii antifungice a extractelor de plante medicinale, unele din ele
similare cu ale preparatului hexoral, la concentraii similare.
De remarcat:1. Extractele pe baza de coriandru i busuioc au avut aciune intens
antifungic fa de tulpinile de Candida faringian i vaginal
2. Extractele de Echinaceea, calendula i suntoare au avut efect intens
inhibitor asupra tulpinilor de Candida faringian
3. Extracia n hidroglicerin are efecte similare cu extractul hidroalcoolic i
este recomandabil, innd cont de lipsa toxicitii glicerinei fa de alcool
4. Extractele de vsc au efect inhibitor semnificativ mai slab dect al plantelor
medicinale. Totui extractul recoltat de pe stem de vsc de mr a avut
aciune inhibitoare mai mare dect extractele similare de vsc din frunze
sau alte plante (salcm).
5. S-au remarcat efecte reproductibile ale acelorai extracte testate pe tulpini
recoltate din zona faringian sau vaginal.
6. Efectele au avut o dependen de doza aplicat n unele cazuri (excepie
fcnd extractele intens antifungice unde i dozele mici au indus efect
semnificativ) i au demonstrat aciunea antifungic optim pe intervalul de
tratament de 48-72 de ore.
7. Efectul amestecurilor A3 i A4 este similar cu efectul Hexoralului, si este
similar dup 72 de ore, nu depinde de concentraie (0, 2% sau 8%). n acest
caz, spre deosebire de modulul experimental 2, extractul de salvie cu
rozmarin a fost mai eficient, ca inhibitor al tulpinii. Se poate aprecia caceste amestecuri de extracte vegetale pot fi folosite ca ageni antifungici n
tratamentul candidozelor, mai ales n cazul candidozelor rezistente la
tratamentul antifungic clasic.
7/30/2019 pintea
29/42
Evaluare calitativ (pe mediu solid)
Aspectul morfologic al tulpinilor de C. albicans recoltate de la purttorii investigai(P1 P11)
Figura I.9. a i b reprezint aspectul morfologic macroscopic al tulpinilor de
C. albicans cultivate pe mediu de cultur solid (a) i recoltate de la purttori (b)
a.
Fig. I.9. a. Aspectul morfologic macroscopic al tulpinilor de C. albicans cultivate pe
mediu de cultur solid
Fig. I.9. a. Morphologic aspect ofC. albicans strains cultivated on solid culture media
Coloniile de Candida albicans au avut o cretere rapid pe mediul solid.
Aspectul macroscopic al culturilor: colonii rotunde, mici, de culoare crem sau
crem-galbuie, reliefate, convexe, umede lucioase, de consisten cremoas, cauntul, neaderente de mediu ce trimit filamente fine n profunzimea mediului.
Identificarea fungilor patogeni a fost efectuat prin examenul microscopic
direct al probelor patologice prelevate de la purttori i prin colorarea frotiurilor.
Produsul patologic recoltat n condiii sterile s-a examinat la microscop, cu
obiectivul cu imersie. Celulele levurice gen Candida apar ca formaiuni rotunde,
ovalare. n cmpul microscopic apar strlucitoare, unele avnd muguri, fapt care le
difereniaz de orice alt element. Dimensiunile celulelor variaz: diametrul lorfiind de 2-3 microni la celulele tinere, ceva mai mare la celulele mature.
Pentru examinarea la microscop s-au folosit fie suspensii din cultur, fie
mici eantioane. Figura I.10 a-d reprezint aspectul microscopic al tulpinilor de C.
albicans identificate la purttori.
29
7/30/2019 pintea
30/42
a. b.
Fig. I. 10. Aspect microscopic al celulelor fungice a .Gram pozitiv b. nativ
Fig. I. 10. Microscopic aspect of fungic cells a.Gram positive coloration b nativ
Aspectul microscopic al culturilor era de ,,pietre n pavaj: Celule levurice
(blastospori) de 2-4 microni diametru, rotunde sau ovalare, multe n curs de
nmugurire; filamente (filamentarea este caracteristic pentru Candida);clamidiospori (numai la Candida albicans)-celule sferice de 20-22 microni
diametru, refringente, cu dublu contur, ce se gsesc la extemitatea unor ramuri
pseudomiceliene. Se produc atunci cnd cultura de Candida a fost trecut pe
mediul P.C.B. Dup examinare s-a ridicat obiectivul, s-a ters uleiul de cedru de pe
obiectivul cu imersie i s-a scos lama de pe platina microscopului.
Evaluarea efectului antifungic
Pentru a stabili un sistem rapid, screening de evaluare a efectului antifungic
al diferitelor extracte, am selectat extractele care au dovedit aciune inhibitoare in
vitro, prin determinri cantitative i le-am utilizat, la concentraii de 7-8 % pentru a
identifica, pe mediu solid gradul de inhibiie. Au fost acordate scoruri de la + la
+++, n funcie de numrul coloniilor de Candida care s-au dezvoltat dup
nsmnare cu tulpina Candida i/ sau dup tratamentul cu extracte vegetale.
Tabelul IV.15. reprezint dinamica de inhibiie celular (+ = inhibiie minim, +++= inhibiie maxim), a tulpinii C. albicans n funcie de concentraia fiecrui
extract ce s-a folosit ca tratament.
Se observ c cea mai eficient concentraie a extractului vegetal este cea
mai mare (8%), cu excepia extractului de Calendula oficinallis (glbenele),
Echinaceea purpurea (echinacea) i Ocimum basilicum (busuioc) care au fost
eficiente i la 7%. O relaie proporional cu durata incubrii a fost observat
pentruEchinaceea purpurea (echinacea), coriandru, coacze negre i busuioc, dar
nu i pentru Calendula oficinallis (glbenele), a crei actiune nu a depins de durata
incubrii.
30
7/30/2019 pintea
31/42
Pe baza scorurilor se pot ierarhiza efectele acestora, n ordine
descresctoare, astfel:
Coriandru 8% > Echinaceea 7%> Sunatoare 8%> Calendula 7% >
Busuioc 8% > Coacaze negre 8% > Melissa Timisiara 8% > Melissa Cluj =Melissa citronella 8%=anghinare8%= salvie 8% = vsc 8% = rozmarin 8%>
maghiran 8%. Extractele de angelica i armurariu au prezentat efecte minime.
Corelaii ntre rezultatele obinute n determinrile calitative i cantitative la
concentraiile cele mai eficiente
Tabelul I.7 reprezint rezultatele examinrii macroscopice i microscopice a
probelor prelevate la purttorii investigai (P1- P11).Conform datelor obinute se constat corelaii pozitive si semnificative ntre
evalurile calitative (scoruri +, ++, +++) i evalurile cantitative ( %- procente de
inhibiie). Datele prezentate indic faptul c la purttorii de tulpini de Candida
albicans faringian , efecte antifungice semnificative se obin cu extracele de
coriandru 8 %, dup 72 de ore ( inhibiie 90%), cu extracte de Calendula ( pe tot
intervalul 24-72 ore) sau cu amestec de coriandru i busuioc (A1) 8 % dup 48 de
ore. n mod surprinztor, pe tulpini de Candida albicans vaginal, anghinarea 8% i
amestecul de salvie i rozmarin (A4) au avut efect inhibitor maxim, dup 72 de
ore, i respectiv 48 de ore, confirmat calitativ i cantitativ.
Aceste date sunt extrem de utile pentru a demonstra c extractele de plante
pot avea, n mod performant, similar cu hexoralul- antifungic de sinteza, la
concentraii similare, efect inhibitor la fel de intens.
31
7/30/2019 pintea
32/42
Tabelul I.7
Rezultatele examinrii macroscopice i microscopice a probelor prelevate de la purttoriiinvestigai i corelaiile ntre scorurile obinute pe mediul solid i procentul inhibiiei ncomparaie cu controlul, pe mediul lichid
Table. I.7Results obtained after macroscopic and microscopic examination os samples collected frombearer investigated and correlations between scores on solid media and percent of inhibitioncomparing to control
Nr.purttor Agent patogenIdentificat
Extract utilizatla co-cultivare( %)
Timp Scorevaluarecalitativ
Grad deinhibiie
(%)No. Bearer Patogen
identificatedExtract utilized forco-cultivation (%)
Time Scorecalitativeevaluation
Inhibitiondegree
(%)24 ++ -68
48 +++ -73
P1 Candida albicans
faringian
Coriandru 8 %
+++ -907224 + -3248 +++ -82P2
Candida albicans
faringianCoacze negre 8%
72 ++ -6124 ++ -4248 ++ -45
P3 Candida albicansfaringian
Echinaceea 8%
+++ -887224 + -4948 +++ -84
P4 Candida albicansfaringian
Coriandru + busuiocA1 8%
72 ++ -7724 + -3748 +++ -82
P5 Candida albicans
faringianCoriandru + busuiocA1 8%
+++ -887224 ++ -4848 +++ -86
P6 Candida albicansfaringian
Coriandru + busuiocA1 8%
+++ -817224 ++ -8048 ++ -77
P7 Candida albicansvaginal
Anghinarea8%
+++ -927224 + -3948 ++ -57
P8 Candida albicansnazal
VAM S 8%
72 ++ -57+++ -8224
48 +++ -86P9 Candida albicans
faringianCalendula7%
+++ -757224 ++ -7548 ++ -77
P10 Candida albicansfaringian
Echinaceea 7%
++ -827224 + -2448 ++ -83
P11 Candida albicansvaginal
Salvia + rozmarinA4 8%
++ -9072
32
7/30/2019 pintea
33/42
IV.1.3. Concluzii ( studii in vitro)Cercetrile efectuate, prin determinri cantitative i calitative pe mediu lichid i
respectiv solid, au demonstrat posibilitatea utilizrii preparatelor de origine vegetal
pentru combaterea tulpinilor de Candida albicans. Aceste date pot fi utile n elaborarea
de noi formule antifungice i n stabilirea perspectivei de utilizare clinic a lor. n urma
co-cultivrii unor extracte vegetale cu Candida albicans se observ urmtoarele:
La purttorii de tulpini de Candida albicans faringian, se obin efecte antifungice
semnificative cu extractele de Coriandrum sativum (coriandru) 8 %, dup 72 de ore sau
cu extracte de Calendula oficinallis (glbenele) 7-8% (pe tot intervalul 24-72 ore) sau
cu Rosmarinus officinalis (rozmarin) i Salvia officinali (salvie) (A4), Ocimum
basilicum (busuioc) i Coriandrum sativum (coriandru) (A1) 8 % dup 48 de ore.Pe tulpini de Candida albicans vaginal, Cynara scolymus (anghinare) 8% i
amestecul Salvia officinali (salvie) i Rosmarinus officinalis (rozmarin) (A4) au avut
efect inhibitor maxim, dup 72 de ore, i respectiv 48 de ore, confirmat calitativ i
cantitativ.
Punctul critic pentru inhibarea creterii celulare a fost stabilit n intervalul 24-48h
(pe ambele medii:lichid i solid). Eficiena extractelor a fost n general observat
ncepnd cu intervalul 24-48 ore, cnd rata de proliferare in vitro a C. albicans este
maxim.
n general extractele de plante la concentraii de peste 1%, devin mai eficiente,
ajungnd la o inhibare a creterii celulare la concentraii de 7-8%.
Aproape toate extractele vegetale au demonstrat inhibarea proliferrii celulei
fungice, dar efectul inhibitor a fost dependent de extractul vegetal, de doz i timp de
interaciune in vitro. Relaiile doz-efect nu au fost intotdeauna direct proporionale, eleau depins de natura plantei i a solventului utilizat (hidroalcoolic sau hidrogliceric).
Extractele hidroglicerice au aciune antifungic mai buni sunt mai puin toxice la nivel
celular dect cele hidroalcoolice.
Trebuie inut cont de faptul c purttorii de tulpini Candida P1-P11 au avut
sensibilitate diferit datorit cantitilor de antibiotice pe care le-au luat, candidozele
aprnd mai frecvent la doze mari si dup o administrare mai ndelungat a
antibioticelor.
33
7/30/2019 pintea
34/42
Studii in vivo
Materiale i metodeExtractele care au demonstrat aciune antifungic in vitro au fost aplicate la
aceeasi purttori, pe durata a 21 de zile, prin badijonaj local. Metodele microbiologice ispectrometrice utilizate au fost prezentate la cap. IV.1.1.
Dup 21 zile de tratament, s-au prelevat probe de la acela purtator i s-au
nsmnat n acela tip de mediu solid, evalund rezultatele macroscopic i microscopic.
n funcie de prezena sau absena patogenului pe mediul solid s-a trecut sau nu, la
nsmnarea pe mediul lichid. La probele care au fost pozitive s-au nsmnat tulpinile
pe mediul lichid i dup 24, 48, 72 ore s-a identificat microscopic prezena patogenului i
s-a determinat cantitativ rata sa de proliferare n prezenta aceluiai tip de extract vegetal,
care s-a dovedit eficient n modulele experimentale in vitro.
Rezultate i discuii
Tabelul I.8. prezint comparativ efectul de inhibiie, msurat calitativ i cantitativ
(in vitro, pe mediu lichid, pe durata a 72 de ore), ca o indicaie a dinamicii de dezvoltare
individual a celulelor de Candida albicans prelevate de la aceeai purttori, dup
administrarea in vivo, a extractului vegetal care se presupune c a inhibat patogenul.
Observaii:
Se constat c purttorii P1, P4, P5, P6 si P9 au rspuns bine tratamentului aplicat cu
extractele de plante i n urma prelevrii de probe de la acela purttor (faringian) nu s-au
mai evideniat tulpinile de Candida albicans.
La purttorii P2, P10i P3 , tratai cu extracte de Echinaceea (P2, P10)i respectiv,
coacze negre 8% (P3) s-au identificat acelai tip de tulpini de Candida faringian i dup
tratament in vivo, dar care au fost inhibate cu 77%, 81%, respectiv 89%, dup re-
incubare cu aceleai extracte.
La purttorii P7 i P11 de Candida vaginal, tratai cu anghinare 8%, respectiv
extract A4 8%, dupa tratamentul in vivo s-au mai evideniat aceleai tip de tulpini, dar
care au rmas sensibile fat de aceste extracte, fiind inhibate cu 82%, respectiv 90% dup
72 de ore.
34
7/30/2019 pintea
35/42
Tabelul I.8.Efectul de inhibiie, msurat calitativ sau cantitativ (in vitro, pe mediu lichid, pe durata a 72 de ore) , ca o indicaie a dinamicii de dezvoltare
individual a celulelor de Candida albicans prelevate de la aceeai purttori, dup administrarea in vivo, a extractului vegetal care se presupunec a inhibat patogenul
Tabelul I.8.Inhibition effect, calitativ or cantitative measured (in vitro, on liquid media, for 72 h), like an indication of dinamics of individual developing of
Candida albicans cells colected from the same bearers, after administration in vivo of vegetal extract, which is supposed that inhibited thepatogen
Numr purttor Agent patogenidentificatin vitro
Concentratiatratamentului(%)
Timp Scormediu
solid
Efect cantitativ( % inhibitie)
Bearer number Patogen identificated Treatmentconcentration(%)
Time Scoresolidmedia
Cantitativeffect (% ofinhibition=
24 - -
48 - -
P1 (diabetic)P1(diabetic)
- Coriandru8 %
72 - -24 ++ - 43
48 ++ - 67
P2 (tratamentantibiotic)P2(tratamentantibiotic)
Candida albicansfaringian
Coacaze negre8%
72 ++ - 77
24 +- 35
48 + - 41
P3 (aparent sntos)P4(apparently healthy)
Candida albicansfaringian
Echinaceea8%
72 +++ -89
24 - -
48 - -
P4(aparent sntos)P3(apparently healthy)
- A1 8%
72 - -
24 - -
48 - -
P5(aparent sntos)P5(apparently healthy)
- A1 8%
72 - -
24 - -
48 - -
P6(aparent sntos)P6(apparently healthy)
- A18%
72 - -
24 ++ -65
48 ++-56
P7 (tratament antibiotic)P7(tratamentantibiotic)
Candidaalbicansvaginal
Anghinare8%
72 +++-82
24 ++-45
48 ++-51
P8 (imunitate sczut)P8(low immunity)
Candidaalbicansnazal
VAM S8%
72 ++ -6224 -
-48 -
-
P9 (diabetic)P9(diabetic)
- Calendula7 %
72 --
24 +++-67
48 +++-76
P10 (diabetic)P10(diabetic)
Candida albicansfaringian
Echinaceea (7%)
72 +++-81
24 + -24
48 ++ -83
P11 (aparent sntos)P11(apparently healthy)
Candida albicansvaginal
A48%
72 ++ -90
+++ grad de inhibiie pronunat; ++ grad de inhibiie moderat; + grad de inhibiie slab - nu s-au dezvoltat germeni
35
7/30/2019 pintea
36/42
Concluzii (studii in vivo)
1. Extractele vegetale selecionate a avut succes pentru aprox. 50% dintre
purttorii luai n studiu: 5/11 purttori nu au mai avut contaminare fungic
dup tatament,
2. La restul purttorilor, dac s-au identificat tulpini la aceeasi locaie, acestea
au rmas sensibile prin incubarea in vitro efectuat pe durata a 72 de ore.
La acetia se poate recomanda continuarea tratamentului in vivo cu aceleai
tipuri de extracte, care s-au dovedit potrivite i eficiente, dar nu sufieciente.
3. n cazurile n care patogenul exist, s-a observat c are o sensibilitate mai
mare fa de aciunea antifungic a extractului vegetal selectat i utilizat.
CONCLUZII GENERALE
Obiectivele cercetrilor care fac obiectul prezentei teze de doctorat au fost:
1. Realizarea i caracterizarea unor extracte din 16 tipuri diferite de plante aromatice
i medicinale din flora spontan sau cultivate n Romnia, studiind compoziiaacestora n compui fenolici n relaie cu aciunea lor antioxidant.
2. Testarea comparativ in vitro i in vivo a aciunii extractelor din aceste plante
asupra unor diferite tulpini de Candida albicans (faringian, nazal, vaginal)
prelevate de la 11 purttori diferii, prin evaluarea calitativi cantitativ a aciunii
acestora.
1. Rezultatele aferente obiectivului 1 au fost obinute prin metodologii specifice de
analiz chimic. Astfel:
a. Analizele spectroscopice UV-Vis au fost utile n screeningul de
evideniere a compuilor fitochimici specifici plantelor incvestigate. Cu
ajutorul maximelor specifice de absorbie i valorilor absorbanei s-au putut
recunoate i identifica grupe de compui fitochimici caracteristici
b. Determinarea calitativ i cantitativ a compuilor bioactivi din
plantele medicinale luate n studiu s-a realizat prin cromatografia delichide de nalt perfoman (HPLC) cuplat cu detecie cu fotodiod. S-au
36
7/30/2019 pintea
37/42
stabilit amprentele caracteristice fiecrui tip de extract i s-au dozat
concentraiile de compui fenolici, pe baza unor curbe de calibrare
specifice.
c. Capacitatea antioxidant a extractelor a fost evaluat comparativ prinpatru metode i a fot corelat cu compoziia n compui fenolici.
n raport cu rezultatele obinute pot fi evideniate urmtoarele concluzii, obinute din trei
studii experimentale:
La extractele de plante investigate n studiul experimental 1 s-a constatat c:
Extractele hidroalcoolice de coacze negre, busuioc, salvie au fost cele mai
bogate n compui fenolici (corespunznd la 2000-12200 mg/ kg plant), iar
coninutul acestora s-a corelat pozitiv cu capacitatea lor antioxidant
(determintat prin metoda DPPH), att n oet ct i n alcool, semnificativ
statistic pentru coacze i busuioc. Acestea au fost selectate pentru a fi
investigat efectul lor antifungic.
La extractele de plante investigate n studiul experimental 2 s-a constatat c:
Cea mai mare concentraie de polifenoli se ntlnete n suntoare i glbenele.
Extractul de suntoare este cel mai bogat n compui fenolici (peste 500 mg/ kg
suntoare), fa de 220 mg/kg glbenele. Extractul de glbenele este cel mai
bogat n acizi fenolici, iar extractul de suntoare este cel mai bogat n
flavonoide (quercetina i kaempherol cu un total de 300 mg/g).
Extractele de Melissa- Timioara au fost mai bogate n compui fenolici dect
Melissa citronella, fapt explicabil dpdv genetic, Melissa citronella fiind
orientat spre biosinteza de uleiuri volatile n detrimentul acizilor fenolici.La extractele de vsc investigate n studiul experimental 3 s-a constatat c:
Concentraia total de compui fenolici n vscul de salcm (VAS L) ajunge la
valori de aprox. 84 mg/kg plant uscat, n timp ce la mr (VAM L) de 4 ori mai
puin. n acelai timp, n stem, la VAM concentraia de compui fenolici este de
aprox 14 mg/kg, mai mare de 2 ori dect la VAS S. Comparativ cu plantele
medicinale de mai sus, concentraia n compui fenolici este semnificativ mai
mic.
37
7/30/2019 pintea
38/42
Activitatea antioxidant hidrofil la vsc a fost evaluat prin metodele FRAP i
TEAC, respectiv DPPH i ORAC. Activitatea antioxidant este mai mare la
probele recoltate n luna mai, cnd procesele biosintetice sunt mai intense.
Metodele TEAC i FRAP dau valori mici i similare la cele dou tipuri deextracte. n concluzie, considerm c cele dou metode DPPH i ORAC dau
informaii complementare i evideniaz specific potenialul diferit al extractelor
VAM i VAS.
Corelnd compoziia n compui fenolici cu aciunea antioxidant s-a constatat ca
vscul recoltat de pe salcm VAS are valori maxime de compui fenolici i
concomitent, o activitate antioxidant intens.
Pe baza acestor rezultate s-au selectat 14 extracte de plante care au fost supuse
testrilor in vitro privind activitatea lor anti-candida. Acestea au fost: fie extracte
individuale de busuioc, coriandru, rozmarin, salvie, angelica, armurariu, roini,
anghinare, coacze negre, maghiran, echinaceea, suntoare, calendula, vsc (VAM,
VAS), fie amestecuri de extracte de busuioc cu coriandru, rozmarin cu salvie.
2.Rezultatele aferente obiectivului 2 (studii in vitro si in vivo) au fost obinute prin
metodologii specifice de microbiologie cuplate cu analiza spectrometric.
S-au utilizat extracte vegetale (soluii hidroalcoolice sau hidroglicerice) individuale de:
coriandru, busuioc, salvie, rozmarin, coacze negre, armurariu, angelica, anghinare,
Echinaceea, glbenele, vsc, sau n amestec (coriandru + busuioc, salvie + rozmarin) n
diferite rapoarte.
Evaluareaefectelor inhibitoare ale extractelor de plante (la diferite concentraii) a
fost fcut calitativ (prin microscopie i pe mediu solid, cu determinarea unor scoruri deinhibiie) sau cantitativ, pe mediu lichid, prin analiz spectrometric, pe durata a 24-72
de ore, prin co-incubare a tulpinilor recoltate de la 11 purttori cu concentraii diferite de
extracte de plante, comparativ cu un control pozitiv (hexoral- produs antifungic de
sintez) i un control negativ.
S-au constatat corelaii pozitive i semnificative ntre evalurile calitative
(exprimate n scoruri +, ++, +++) i evalurile cantitative ( %- procente de inhibiie).
38
7/30/2019 pintea
39/42
2a. Pe baza datelor obinute la studiile in vitro (6 module experimentale) se pot
evidenia urmtoarele concluzii:
1. Pe baza scorurilor obinute n evalurile calitative, se pot ierarhiza efectele extractelor, n
ordine descresctoare, astfel: Coriandru 8% > Echinaceea 7%> Sunatoare 8%>
Calendula 7% > Busuioc 8% > Coacaze negre 8% > Melissa Timisiara 8% >
Melissa Cluj = Melissa citronella 8%=anghinare8%= salvie 8% = vsc 8% = rozmarin
8%> maghiran 8%. Extractele de angelica i armurariu au prezentat efecte minime.
De remarcat:
Extractele pe baz de coriandru i busuioc au avut aciune intens antifungic fa
de tulpinile de Candida faringian i vaginal.
Extractele de Echinaceea, glbenele i suntoare au avut efect intens inhibitor
asupra tulpinilor de Candida faringian
Extractele de vsc au efect inhibitor semnificativ mai slab dect al plantelor
medicinale.
La purttorii de tulpini de Candida albicans faringian, s-au obinut efecte
antifungice semnificative cu extractele de coriandru 8 %, dupa 72 de ore sau cu
extracte de Calendula 7-8% (pe tot intervalul 24-72 ore) sau cu salvie si
rozmarin (A4), coriandru si busuioc (A1) 8 % dup 48 de ore.
Pe tulpini de Candida albicans vaginal, anghinarea 8% i amestecul salvie i
rozmarin (A4) au avut efect inhibitor maxim, dup 72 de ore, i respectiv 48 de
ore, confirmat calitativ i cantitativ.
2. Aproape toate extractele vegetale au demonstrat inhibarea proliferrii celulei fungice, dar
efectul inhibitor a fost dependent de extractul vegetal, de doz i timp de
interaciune in vitro. n general extractele de plante la concentraii de peste 1%, devin
mai eficiente, ajungnd la o inhibare a creterii celulare la concentraii de 7-8%.
3. In vitro, aciunea antifungic a fost optim pe intervalul de tratament de 48-72 deore, perioad critic pentru inhibarea creterii celulare (pe ambele medii, lichid i solid).
Eficiena extractelor a fost n general observat ncepnd cu intervalul 24-48 ore, cnd
rata de proliferare in vitro a C. albicans este maxim.
4. Extractele hidroglicerice au aciune antifungic mai buni sunt mai puin toxice la nivel
celular dect cele hidroalcoolice.
2b. Studiind eficiena in vivo a extractelor vegetale care au dovedit aciune anti-
candida in vitro, la aceeai purttori investigai, s-a constatat c dup 21 zile de
39
7/30/2019 pintea
40/42
tratament local, tulpinile de Candida prelevate, dac au fost prezente, au fost mai mult sau mai
puin sensibile fat de acelai tip de extract. Astfel:
Extractele vegetale selecionate a avut succes pentru aprox. 50% dintre purttorii luai n
studiu: 5/11 purttori nu au mai avut contaminare fungic dup tratamentul in vivo
La restul purttorilor, dac s-au identificat tulpini la aceeasi locaie, acestea au rmas
sensibile prin incubarea in vitro efectuat pe durata a 72 de ore cu acelai tip de extract.
La acetia se poate recomanda continuarea tratamentului in vivo cu aceleai tipuri de
extracte, care s-au dovedit potrivite i eficiente, dar nu suficiente.
n concluzie, putem aprecia c cercetrile efectuate deschid perspectiva utilizrii extractelor de
plante aromatice i medicinale, bogate n compui fenolici, pentru combaterea tulpinilor de
Candida albicans. Aceste date pot fi utile n elaborarea de noi formule antifungice i n stabilirea
protocolului de utilizare clinic a acestora.
BIBLIOGRAFIE
1. ARNAO M. B., CANOA A., ALCOLEA J. F., ACOSTA M., 2001. Estimation of freeradical quenching activity of leaf pigment extracts. Phytochem Anal. ,12: 138-143.
2. AQIL F., AHMAD I., MEHMOOD Z., 2006. Antioxidant and free radical scavengingproperties of twelve traditionally used Indian medicinal plants. Turk J. Biol., 30: 177-
183.
3. BILIA A., BERGONZI M., GALLORI S., MAZZI G., VINCIERI F., 2002. Stability ofthe constituents of Calendula, milk-thistle and passionflower tinctures by LC-DAD and
LC-MS, J. Pharm. Biomed. Anal., 30: 613-24.
4. BENZIE I. F., STRAIN J. J., 1996. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as ameasure of ''antioxidant power'': The FRAP assay. Anal. Biochem., 239: 70-76.
5. BRAND-WILLIAMS W., CUVELIER M. E, BERSET C., 1995. Use of a free radicalmethod to evaluate antioxidant activity. Lebensmittel-Wissenschaft und -
Technologie/Food Science and Technology, 28: 25-30.
6. CAO G., PRIOR R. L 1998. Comparison of different analytical methods for assessingtotal antioxidant capacity of human serum. Clin. Chem., 44: 1309-1315
7. CICHEWICZ R. H., THORPE P. A., 1996. The antimicrobial properties of chile peppers(Capsicum species) and their uses in Mayan medicine. J. Ethnopharmacol., 52: 6170.
8. CUTLER J.E., 1991. Putative virulence factors of Candida albicans. Ann RevMicrobiol., 45: 187-218.
40
7/30/2019 pintea
41/42
9. COLOSI I., C. COSTACHE, M. JUNIE, 2009.Patogenia infeciilor cu Candida: factoriide patogenitate i factorii de risc ai infeciilor cu fungi din genul Candida, Clujul
MedicalVol. LXXXII - nr. 1, 30-34
10.COWANS M. M., (1999) Plant Products Agents, Clinical Microbiology Reviews, 564-582.
11.DAURIA F., TECCA M., STRIPPOLI V. , SALVATORE G. , BATTINELLI L.,MAZZANTI G., 2005Antifungal activity of Lavandula angustifolia essential oil against
Candida albicans yeast and mycelial form, Med. Mycol., 43 (5): 391-396.
12.FROMTLING RA, RHODES JC, DIXON DM., 2003, Taxonomy, classification andmorphology of the fungi, in: MURRAY PR (ed.) Manual of Clinical Microbiology. Vol.
1. 8th ed. Washington D.C (USA): ASM PRESS, 1653-9
13.HUANG D., OU R., HAMPSCH-WOODILL M., FLANAGAN J. A., PRIOR R. L., 2002.. High-throughput assay of oxygen radical absorbance capacity (ORAC) using a
multichannel liquid handling system coupled with a microplate fluorescence reader in
96-well format, J. Agric Food Chem., 50 (16): 4437-44.
14.ISTRATI-GHITESCU I., 1979. Candidozele dup antibioterapie, Produsefarmaceutice,12.
15.LEMAR K.M., TURNER M. P., LLOYD D., 2002. Garlic (Allium sativum) as an anti-Candida agent: a comparison of the efficacy of fresh garlic and freeze-dried
extracts.Journal of Applied Microbiology, 93: 398405.
16.LEU Y-L., HWANG T-L., CHUNG Y-M., HONG P-Y., 2006. The inhibition ofsuperoxide anion generation in human neutrophils by Viscum coloratum, Chem. Pharm.
Bull., 54: 1063-1066.
17.MILIAUSKAS G., VENSKUTONIS P. R., VANBEEK T. A. ,2004. Screening of radicalscavenging activity of some medicinal and aromatic plant extracts. Food Chem., 85: 231-
237.18.MIR-RASHED N., CRUZ I., JESSULAT M., DUMONTIER M., CHESNAIS C., NG J,
AMIGUET V.T., GOLSHANI A., ARNASON J. T., SMITH M. L., 2010. Disruption of
fungal cell wall by antifungal Echinacea extracts.Med Mycol.
19.ODDS FC.1979. Candida and Candidosis. Leicester University Press; 92-11320.OSSET J, GARCA E, BARTOLOM RM, ANDREU A., 2001, Role of Lactobacillus
as protector against vaginal candidiasis, Med Clin (Barc). 117 (8):285-288
41
7/30/2019 pintea
42/42
21.PETRAN MARIANA, SOCACIU C., 2006.Evaluation of antimicotic effect of calendulaofficinalis in vitro, Buletin USAMV-CN, 63: ISSN 1454:2382.
22.PETRAN MARIANA, ATANASIU S., MIU C., 2006. Preliminary study regardingefficacity of hexoral drug and dill, marygold, melissa plant extracts against pathogen
Candida albicans.The Romanian Review of Laboratory Medicine, 4: 79:80.
23.POLAK A., ODDS F. C., LDIN E., SCHOLER H. J., 1985. Correlation ofsusceptibility test results in vitro with response in vivo: ketoconazole therapy in a
systemic candidiasis model.Chemotherapy, 31 (5): 395:404.
24.SAKAKIBARA H., HONDA Y., NAKAGAWA S., ASHIDA H., KANAZAWA K.,2003. Simultaneous determination of all polyphenols in vegetables, fruits, and tea, J.
Agric. Food Chem., 51: 571-581. SCALBERT A., 1991. Antimicrobial properties of
tannins. Phytochemistry, 30: 3875-3883.
25. SHAMS-GHAHFAROKHI M., SHOKOOHAMIRI M., AMIRRAJAB N.,MOGHADASI B., GHAJARI A., ZEINI F., SADEGHI G., RAZZAGHI-ABYANEH
M., 2006.In vitro antifungal activities of Allium cepa, Allium sativum and ketoconazole
against some pathogenic yeasts and dermatophytes Fitoterapia, 77 (4): 321-3.
26. SHI Z-M., FENG P., JIANG D-Q., WANG X-J., 2006. Mistletoe alkali inhibitsperoxidation in rat liver and kidney, World J. Castroenterol, 12: 4052-4055.
27. SHER A., 2009. Antimicrobial Activity of Natural Products from MedicinalPlants.Gomal Journal of Medical Sciences, 7: 72-78
28.VICA S., RUGINA D., SOCACIU C., 2008. Antioxidant activities of Viscum albumsleaves from various host trees, Bulletin UASVM, Agriculture, Cluj-Napoca, 65 (1): 327-
332.
29. VICAS S., RUGINA D., PANTEA S., SOCACIU C., 2009. The MorphologicalFeatures and UV-VIS Analysis of Some Taxonomic Markers of Genus Viscum, Bulletin
UASVM, Agriculture, 66 (1): 193-200.30.ZHANG N., HARREX A. L., HOLLAND B. R., FENTON L. E., CANNON R. D, 2003.
Sixty alleles of the ALS7 open reading frame in Candida albicans: ALS7 is a
hypermutable contingency locus. Genome Res 13: 20052017.
31.YAO H., LIAO Z-X., WU Q., LEI G-Q., LIU Z-J., CHEN D-F., CHEN J-K., ZHOU T-S., 2006. Antioxidative flavanone glycosides from the branches and leaves of Viscum
coloratum, Chem. Pharm. Bull, 54: 133-135.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3902391http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3902391http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3902391http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3902391http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3902391http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3902391http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3902391
