8/14/2019 lucrarea-2-descrierea-fenomenelor-de-difuzie-ci-osmozc2a6a.docx http://slidepdf.com/reader/full/lucrarea-2-descrierea-fenomenelor-de-difuzie-ci-osmozc2a6adocx 1/20 llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllLucr are de laborator:DIFUZIUNEA ŞI OSMOZAA. Studiul influenţei unor factori fizici asupra ratei difuziunii A.1 Definirea şi explicarea fenomenelor de agitaţia termică, difuziune şi osmozăA.2 Legile osmozei. Soluţii false şi soluţii adevărateA.3 Osmolalitate şi osmolaritate. Calculul presiunii osmoticeA.4 Aplicaţii medicaleB. Noţiuni generale despre microscopia optică B1. Metode de măsurare a dimensiunilor celulareC. Evaluarea cantitativă a fenomenului de osmoză C1. Osmoza la celulele vegetale C2. Osmoza la nivelul hematiei La nivelul membranelor naturale se petrec schimburi de substanţă fără de care celulele vii nu ar putea supravieţui. Acestea implică fenomene de transport al e solventului sau/şi ale solvenţilor intra şi extracelulari. Lucrarea prezentată vă permite să puneţi în evidenţă fenomenul de transport membranar al solventului, osmoza, în cazul celulelor vegetale şi animale . Microscopul optic este utilizat pentru a observa şi măsura variaţiile dimensiunil or celulare
A. Studiul influenţei unor factori fizici asupra ratei difuziunii
A.1 Definirea şi explicarea fenomenelor de agitaţia termică, difuziune şi osmoză
Difuzie:
Datorită energiei lor cinetice, moleculele unui fluid se găsesc intr -o continuă mişcare,numită agitaţie termică; aceasta încetează doar la temperatura de zero absolut .
Difuzia este fenomenul de pătrundere a moleculelor unei substanţe(lichide sau gazoase) printre moleculele alteisubstanţe (lichide, gazoase sau solide).Difuzia se produce ca urmare a tendinţei
fluidelor de a ocupa întreg volumul aflat ladispoziţie, datorită agitaţiei termice. Acest proces conduce la egalizarea diferenţelor deconcentraţie, presiune sau temperatură, fiindo expresie a tendinţei naturale a sistemelorde a tinde spre starea de echilibru.Fenomenul de difuzie este caracterizat dedouă legi, cunoscute sub numele de legileFick. În cazul difuziunii, prezenţa uneimembrane prin porii căreia să se realizezefenomenul este facultativă.
Unde fluxul moleculelor transportate pasiv (moli/s) în sensul gradientului de concentraţie
dc/dx, printr-o suprafaţă S a membranei. Constanta de proporţionalitate, D, poartă numele decoeficient de difuziune. Semnul minus sugerează că difuziunea are loc întotdeauna de la zonelede concentraţie mare spre zonele de concentraţie mai mică.
Coeficientul de difuzie depinde de natura substanţei, de temperatură şi de forma şi dimensiunea particulelor ce difuzează. Pentru particule sferice de mici dimensiuni, coeficientul de difuzie sescrie sub forma:
r
kT D
6
unde T este temperatura absolută, k este constanta lui Boltzmann, η este vâscozitatea şi r esteraza particulelor.
Fenomenul de difuzie stă la baza a numeroase schimburi de substanţă care au loc în natură întreorganisme sau în interiorul unui organism. În toate aceste cazuri însă, substanţele care difuzeazănu sunt în contact direct, ci sunt despărţite printr -o membrană. Această membrană poate fi permeabilă în mod diferit pentru substanţe diferite, caz în care se numeşte selectiv permeabilă.Un caz important este acela al membranelor care sunt permeabile pentru solventul unei soluţii,dar nu sunt permeabile pentru solvit, numite membrane semipermeabile.
Osmoză:
Fenomenul de difuzie selectivă care are loc în cazul a două soluţii de concentraţii diferite,despărţite printr -o membrană semipermeabilă, poartă numele de osmoză. Efectul osmozei esteegalizarea concentraţiilor celor două soluţii, atâta timp cât osmoza nu este împiedicată de altecauze externe.
În cazul unei membrane strict semipermeabile, osmoza este singurul fenomen de
Fig. 2 Membrana celulară [ www.philadelphia.edu.jo/courses/biology/ di f fus ion .pp t ] Pentru o membrană permeabilă sau selectiv permeabilă fenomenele de osmoză şi de
dializă au loc concomitent, în sensuri opuse.
Difuziunea solventului (apa în sistemele vii) are loc din compartimentul în care soluţia
este mai diluată (număr de molecule ale solventului mare, molecule de solvit puţine) însprecompartimentul în care soluţia este mai concentrată, are un număr mai mic de molecule alesolventului şi un număr mai mare de molecule de solvit, diluând-o. Datorită procesului deegalizare a concentraţiei prin difuzia solventului, osmoza redă tendinţa generală pe care o aresistemul de a-şi mări entropia.
Fig 3.1 Osmoza în cazul unei membrane strict
permeabile. Soluţii hipotonice şi hipertonice
Mecanismele osmozei
Explicarea molecular-cinetică afenomenului este următoarea: trebuie săvedeţi soluţia ca fiind un amestec de douăsubstanţe, apă (solvent) şi solvit (sausolviţi), ambele formate din molecule, darde dimensiuni diferite; moleculelesolventului vor fi întotdeauna mai micidecât cele ale solvitului. În acest fel va fi
mai evident pentru dumneavoastră faptulcă ambele specii moleculare se supunaceloraşi legi, nici una nefiind privilegiată.
De exemplu, într-o soluţie de sare (NaCl) în apă, solventul este reprezentat de moleculele de apă,
iar solvitul este reprezentat de particule de şi de .
Să considerăm două compartimente separate de o membrană strict semipermeabilă şi săne reprezentăm situaţia printr-o schemă simplă (fig.1). Molecula de solvent, fiind sufucient demică, poate trece prin membrană, pe când molecula de solvit nu. Numărul moleculelor de apă ceajung în unitatea de timp la membrana semipermeabilă este mai mic în compartimentul II decât
în compartimentul I, ca urmare a concentraţiei scăzute a apei în II. În intervalul de timp în caredin I trec în II trei molecule de apă, din II în I trece doar o moleculă de apă.
I= compartiment cu solvent purII= compartiment cu soluţieF= flux net de solvent
Acest fenomen apare numai în condiţiile existenţei mem branei. Solventul difuzează prin membrană în cele două sensuri, dar viteza de trecere a solventului pur spre soluţie este mai maredecât trecerea în sens contrar. Această diferenţă de flux este singura responsabilă de fenomenul
de osmoză. Fluxul net rezultant face ca nivelul lichidului din II să crească, dezvoltându -se în acest
compartiment o presiune; în momentul în care această presiune; va fi echilibrată de presiunea
hidrostatică ascensiunea în II se opreşte.
Dacă s-ar exercita o presiune statică asupra soluţiei din compartimentul II, numărulmoleculelor de solvent care ar ajunge în unitatea de timp la faţa membranei dinspre acest vas arcreşte. Când numărul acestora egalează numărul moleculelor de solvent ce ajung în unitatea detimp la membrană în vasul I, se stabileşte un echilibru dinamic între cele două compartimente.Această presiune ar reprezenta presiunea osmotică a soluţiei din I.
Presiunea osmotică (), este presiunea ce ar trebui exercitată asupra soluţiei pentru a
aduce în echilibru cu solvent pur, separat de ea printr-o membrană semipermeabilă, adică pentrua împiedica orice flux de solvent între cele două compartimente. În exemplul menţionat anterior:
Valoarea numerică a presiunii osmotice a unei soluţii poate fi măsurată experimental prindiverse tehnici. De asemenea, ea poate fi calculată teoretic în cazul soluţiilor pentru care poate fiaplicat un model asemănător celui al gazelor ideale.
A.2 Legile osmozei. Soluţii false şi soluţii adevărate
Botanistul Pfeffer, cu ajutorul osmometrului care îi poartă numele a stabilit următoarealege cantitativă a osmozei, pentru soluţii diluate:
unde,
k= constantă C= concentraţia ponderală a soluţiei (g/l)M= masa molară a solvitului T= temperatura absolută
Dacă notăm cu n numărul de moli dizolvaţi în volumul de soluţie V, vom avea:
m reprezintă concentraţia molară (număr de moli/ unitate de volum) Dacă înlocuim în relaţia iniţială, obţinem:
Unde:
= presiunea osmotică a soluţiei
V= volumul soluţiein= numărul de moli de substanţă dizolvată R= constanta universală a gazelor T= temperatura absolută Ea este, pentru soluţiile foarte diluate, identică cu legea gazelor perfecte.Se numeşte presiune osmotică presiunea care se exercită asupra unei soluţii pentru a o menţine
în echilibru cu solventul, separat de ea printr-o membrană semipermeabilă.
Legile osmozei
Legea concentraţiilor: la temperatură constantă, presiunea osmotică este proporţională
Legea temperaturii: pentru o soluţie dată, presiunea osmotică creşte propor ţional cu
coeficientul (1+), valoarea lui fiind aceeaşi ca la gaze, iar t fiind temepratura (lege
valabilă până în ): ~ (1+)
Legea lui Van’t Hoff: este independentă de natura solventului şi de substanţa
dizolvantă, ea nu depinde decât de numărul particule prezente în volumul ocupat desoluţie: * V=n * R* T
Legea amestecurilor: a unei soluţii în care faza dispersată este alcătuită din substanţe
diferite este egală cu suma presiunilor osmotice determinată de fiecare substanţă în parte.
Soluţii izo-, hipo-, hipertone:
Se impun câteva definiţii: două soluţii A şi B care au aceeaşi presiune osmotică, deciîntre ele nu ar exista flux de solvent în prezen ţa unei membrane semipermeabile, se numesc
izoosmotice (izo=egal). Dacă A are mai mare decât B spunem că A este hiper osmotică faţă de
B iar B este hipoosmotică faţă de A. În mod asemănător, expresia membrană semipermeabilă sereferă la un anumit solvent; dacă acesta nu este precizat, se subînţelege că este vorba despre apă.
Termenii hipoton şi hiperton sunt folosiţi prin raportare la plasma sanguină, latemperatura organismului (izoton =izoosmetic cu plasma, hipoton= hipoosmetic faţă de plasmă,hiperton= hiperosmotic faţă de plasmă).
Soluţii false şi soluţii adevărate: Legile osmozei nu se aplică riguros la toate categoriile de soluţii. Pentru soluţiile
concentrate presiunea osmotică mai mare decât cea calculată conform legilor osmozei. Aceastase datorează faptului că volumul moleculelor încetează de a mai fi neglijabil în raport cu volumul
soluţiei şi distanţa intermoleculară. Ca urmare a fenomenului de disociaţie electrolitică sărurile, acizii, bazele au în soluţii
apoase o presiune osmotică superioară celei care ar corespunde numărului de molecule prezente
în volumul de soluţie dat. De exemplu o soluţie de va avea o presiune dublă, o soluţie de
va avea o presiune triplă.
În cazul soluţiilor coloidale, formate din agregate moleculare, presiunea osmotică estemai mică decât cea calculată teoretic, doarece fiecare agregat se comportă ca o singură particulă.
Având în vedere consideraţiile de mai sus, soluţiile se pot clasifica în adevărate şi false,după cum se supun sau nu legilor osmozei. Soluţiile adevărate sunt cele cristaloide neelectrolite
diluate, la care numărul de particule corespunde exact cu numărul de molecule dizolvate.Soluţiile false sunt cele cristaloide şi cele coloidale.
A.3 Osmolalitate şi osmolaritate. Calculul presiunii osmotice
moli de solviţi de masă molară V= volumul soluţiei
= volumul molar (al solventului)
= volumul molar al solvitului
Pentru o soluţie electrolitică sau neelectrolitică, se pot defini: a) Concentraţia molară (c) (molaritatea sau osmolaritatea). Reprezintă numărul de
soluţie/litru:
∑
Concentraţiile molare sunt aditive; ele sunt aplicabile atât pentru solvent, cât şi pentru solvit.Osmolaritatea se exprimă în miliosmoli/ litru de soluţie.
b) Molalitatea (m) sau osmolalitate. Reprezintă numărul de moli de solvit considerat perunitate de masă (în general pe kg) de solvent.
unde,
reprezintă masa solventului, în grame.
Molalităţile sunt aditive; ele sunt aplicabile decât solvenţilor.
În cazul soluţiilor apoase foarte diluate, volumul particulelor din soluţie este neglijabil în raportcu volumul solventului, iar molaritatea şi molalitatea pot fi confundate. În acest caz un litru deapă cântăreşte aproape 1 kg. Această aproximaţie nu este corectă în cazul plasmei sanguine,
deoarece volumul proteinelor nu este neglijabil.Osmolalităţile se exprimă în miliosmoli/kg de solvent.
c) Concentraţia ponderală (p). Reprezintă masa de solvit per volul de soluţie:
Concentraţiile ponderale nu sunt aditive. Relaţia între concentraţia molară (moli/litru) şiconcentraţia ponderală (grame/litru) va fi:
⁄
Osmol- explicaţie şi definiţie
Deoarece osmoza depinde doar de numărul total de particule de solvit din soluţie,indiferent de natura acestora, în scop de uniformizare a termenilor cu referire atât la soluţiile care
conţin ioni cât şi la cele care conţin molecule s-a introdus noţiunea de osmol, aceastareprezentând o particulă oarecare din soluţie (Osm)- particulă gram cinetică, adică o particulă acărei mişcare liberă şi dezordonată este asimilabilă unei molecule de gaz. Pentru neelectroliţi sauelectroliţi nedisociaţi, osmolul corespune molului; pentru soluţiile de electroliţi, osmolulcorespunde ionului-gram; pentru ionii monovalenţi, osmolul corespunde şi echivalentului gram.
Osmolaritatea totală a unei soluţii este, deci, suma numărului de moli nedisociaţ i şi anumărului de ioni-gram per litru de soluţie.
Osmolul fiind o unitate prea mare pentru soluţiile biologice, se utilizează un submultiplu
al acestuia- moliosmolul (mOsm): 1 mOsm= Osm.
Pentru soluţiile complexe, osmolalitatea se calculează prin sumarea tuturor concentraţiilormolare ale constituenţilor, ţinând cont de gradul lor de dizociere. De exemplu, pentru lichidul
extracelular, se consideră constituenţi principali: , glucoză, uree; există formule de
calcul pentru fiecare lichid în parte.
Osmolalitatea plastică se exprimă în număr de miliOsmoli/ litru de plasmă; se determină prinmăsurarea punctului crioscopic al unei soluţii.
A.4 Aplicaţii medicale
În organism, sectoarele celulare, interstiţiale şi intravasculare sunt tot atâteacompartimente separate prin membrane biologice, cu permeabilitate selectivă, prin care
transportul apei se face prin mecanisme total diferite decât în cazul membranelor biologice potexista proteine cu rol de canale pentru molecule de apă. Fiecare celulă sau compartimentsubcelular delimitat (nucleu, vacuolă, lizozomi etc.) reprezintă compar timente microscopice încare intervin fenomenele osmotice. Se poate vorbi, deci, de presiunea osmotică a oricăruicompartiment lichidian delimitat de o membrană. Osmoza intervine şi în realizarea funcţieinormale a glomerulului renal.
Cea mai mare parte a lichidelor din organism sunt solu ţii complexe. Pentru aceastăosmolaritate se calculează prin sumarea tuturor concentraţiilor molare ale constituenţilor, aşacum s-a menţionat deja.
Atât variaţiile în plus cât şi cele în minus ale osmolarităţii diferitelor sectoare lichidieneale organismului pot ameninţa însăşi existenţa individului. Exemplu: o deshidratare celulară produsă ca urmare a unei evaporări masive a apei prin transpiraţie abundentă. Pierderea uneicantităţi mari de apă va fi urmată de creşterea presiunii osmotice a lichidelor extracelulare. Înaceste condiţii apa intracelulară se va deplasa extracelular -osmoză la nivelul membranei celulare,selectiv permeabile. Diminuarea volumului lichidian intracelular va altera metabolismul celular.
Intensitatea şi durata unei astfel de deshidratări condiţionează reversibilitatea sau ireversibilitateaalterărilor proceselor celulare.
Este sugestiv de menţionat că la un deficit de peste 15 % apă din greutatea corporală, pentru un interval de timp de 6-7 zile, survine încetarea funcţiilor vitale ale organismului-
moartea.
Stările hipo- şi hiperosmolare, în perioada de reversibilitate, pot fi corectate prin aportsau eliminări lichidiene controlate, dar aceasta necesită în prealabil avaluarea osmolarităţiidiferitelor comportimente lichidiene.
Stările hipo- şi hiperosmolare:
Osmolalitatea lichidului intra- şi extracelular sunt menţinute în echilibru deşi compoziţia
electrolitică este diferită. Variaţii mai mari de 2% ale osmalităţii plasmatice sunt cunoscute subnumele de stări de hiperosmolare, respectiv hiperoosmolare, în cazul variaţiilor sub aceastăvaloare.
Stările hiperosmolare pot fi produse de creşterea cantităţii unor substanţe solvite în sânge
: , glucoză sau ureea şi alcoolul care nu au acest efect; în aceste cazuri osmolaritatea
determinată este mai mare decât osmolaritatea totală calculată pentru , glucoză, uree. Stările
hiperosmolare se pot datora: creşterii cantităţii de solvit; scăderii cantităţii de solvent; unui aportexogen de solvent şi solvit. Tratamentul implică rehidratare prin indigestie sau prin perfuzie cusoluţii fiziologice hipotone.
Stările hipoosmolare sunt definite de scăderea osmolalităţii sub 235-300mOsm/kg apă şi
de scăderea , concomitent. Tratamentul implică perfuzii cu soluţii hipertone, până la
revenirea, la osmolaritatea plasmatică normală.
Izoosmolaritatea lichidelor biologice:
În condiţiile normale, lichidele biologice sunt izoosmolare. Menţinearea acestei izoosmolarităţieste asigurată prin schimburi de solvent dar mai ales de solvit. Expresia analitică a osmolarităţiiunui lichid bilogic, stabilită cu ajutorul dozărilor chimice, consideră electroliţii ca fiind total
disociaţi, acestea explicând lipsa unei corespondenţe riguroase între rezultatele obţinute princrioscopie (300 mOsm) şi prin calcul.
Contribuţia diver şilor constituenţi plasmatici la osmolaritatea totală a plasmei este prezentată întabelul 1.
Difuziunea poate fi influenţată de greutatea moleculară şi de concentraţia moleculelor:
a) Efectul greutăţii moleculare
Mod de lucru:1. Luaţi trei eprubete conţinând deja o coloană de agar (10 ml gel polizaharidic, în stare
semifluidă) 2. Adăugaţi 3ml din soluţiile de aceeaşi concentraţie a unor compuşi coloraţi, cu masa
moleculară diferită. 3. Notaţi nivelul la care se găseşte limita de separaţie a celor două medii, pentru fiecare
eprubetă 4. La sfâr şitul orelor de lucrări practice: notaţi nivelul la care a ajuns soluţia colorată şi
măsuraţi distanţa pe care a difuzat.Datele se notează în tabelul de rezultate
Substanţa Distanţa (timp: 2 ore)Metil orangeBicromat de potasiuSulfat de cupru
Materiale necesare:
3 eprubete cu agar Soluţii de 5 mM de:
o Metil orangeo Bicromat de potasiuo Sulfat de cupru
b) Efectul gradientului de concentraţie1. Luaţi alte eprubete cu agar.
2. Adăugaţi în fiecare eprubetă 3 ml din soluţia aceluiaşi compus (metil orange) dar deconcentraţii diferite.3. Realizaţi aceleaşi măsurători ca şi la puctul a) şi notaţi rezultatele în tabelul de
3 eprubete cu agar Soluţii de metil orange de concentraţii: 1 mmol, 5 mmol, 10 mmol.
B. Noţiuni generale despre microscopia optică
B1. Metode de măsurare a dimensiunilor celulare
Participarea fenomenului de osmoză la schimbul de substanţă dintre celulă şi mediulînconjurător poate fi observată prin experienţe simple, utilizând microscopul optic.
Descrierea microscopului optic
Microscopul optic obişnuit este un sistem de lentile convergente astfel realizat încât să poatăfi folosit pentru observarea unor structuri cu dimensiuni în general de ordinul micrometrilorformat din:
Partea optică, care se compune dintr -un sistem centrat de iluminare şi două sisteme delentile convergente: obiectivul cu distanţă focală de câţiva milimetri şi ocularul, cudistanţă focală de ordinul centimetrilor.
Sistemul obiectiv este alcătuit dintr -un sistem centrat de lentile aşezate într-o anumită
ordine într-un tub metalic montat direct sau prin intermediul sistemului revolver la parteainferioară a tubului microscopului. Obiectivele au notată puterea măritoare care variazăîntre x10 şi x90.
Sistemul ocular este alcătuit dintr -un sistem de lentile situate la partea superioară atubului microscopului. Puterea măritoare a ocularelor care variază între x5 şi x15. Existămicroscoape monoculare şi binoculare.
Sistemul de iluminare serveşte pentru a aduce la obiectul examinat lumina de la o sursănaturală sau artificială. Este situat sub platina microscopului şi se compune din sursă de lumină,oglindă, diafragmă şi condensor. Unele microscoape au un sistem de iluminare cu bec situat în
piciorul microscopului şi oglinda detaşabilă. Partea mecanică serveşte la susţinerea părţii optice şi a obiectului examinat. Ea se compune
din picior, coloană, platină şi un dispozitiv de punere la punct format din şurubul macrometric şicel micrometric.
Puterea măritoare a microscopuluieste dată de produsul dintre putereamăritoare a obiectivului şi cea a
ocularului. Microscoapele opticeactuale ating o putere măritoare dex2000.
Fig. 4 Microscop optic
[Media/Science/Microscopy
/Optical Microscope Diagram
freeinfosociety.com]
Principalele mărimi caracteristice unui microscop optic
Puterea de rezoluţie reprezintă calitatea cea mai importantă a unui microscop. Eareprezintă capacitateaunui sistem optic de a separa două puncte să fie percepute distinct la nivelul imaginii finale. Printermenul general de rezoluţie se înţelege abilitatea unui sistem optic de a detecta detaliile unui
obiect. Puterea de rezoluţie este invers propor ţioanală cu sitanţa minimă (ε) între două puncteluminoase ale obiectului, percepute separat. Prin urmare, dacă se notează puterea de rezoluţie cu
P (
). Cu cât ε este mai mic cu atât puterea de rezoluţie P este mai mare. Distanţa minimă ε,
denumită şi distanţa minimă rezolutivă sau minimum separabil este dată de formula lui Abbe:
unde:
= lungimea de undă a luminii utilizate la microscop
n= indicele de refracţie al mediului prin care trece luminau= jumătatea unghiului de deschidere a conului luminos ce cade pe obiectivSe observă că ε este cu atât mai mic cu cât n şi u sunt mai mari. Mărimea (n x sinu) se numeşteapertură numerică şi poate fi mărită în două moduri:
1. Mărind indicele de refracţie al mediului existent între obiectiv şi lama ce conţine preparatul: astfel, obiectivele sunt de două feluri: uscate şi umede, după cum între ele şilamelă există aer sau un mediu cu indicele de refracţie mai mare decât 1.
2. Mărind unghiul u, prin construcţiePuterea separatoare a unui microscop optic este, deci, limitată de lungimea de undă a radiaţ iei
utilizate, de indicele de refracţie al mediului şi de construcţia obiectivului, care impune o valoaremaximă a unghiului u. Puterea de mărire este mărimea numeric egală cu raportul dintre unghiul u’ sub care se
vede imaginea la microscop şi mărimea obiectului AB.
Puterea de mărire se exprimă în dioptrii şi este invers propor ţională cu distanţele focaleale obiectivului şi ocularului.
Puterea de pătrundere este o calitate ce aparţine obiectivelor cu putere de mărire mică.
Datorită acestei calităţi se poate vedea în profunzime obiectul examinat. Ea variază înraport invers cu mărimea unghiului de deschidere a obiectivului.
PARTEA PRACTICĂ
Principiul metodei
Se suprapune imaginea microscopică a obiectului de măsurat peste imaginea unei scărigradate etalonată în prealabil.
Se utilizează două tipuri de micrometre: ocular şi obiectiv. Micrometrul obiectiv este olamă de sticlă pe care sunt marcate diviziuni echidistante cu valoare cunoscută de 10μm. Elserveşte la etalonarea micrometrului ocular acesta este un disc de sticlă introdus în sistemulocular şi la rândul lui are marcate diviziuni echidistante. Imaginea lui este dată numai de lent ilaocular, îm timp ce micrometrul obiectiv este mărit de întreaga putere măritoare a microscopului.
A etalona micrometrul ocular inseamnă a stabili o corespondenţă între o diviziune alemicrometrului obiectiv. În acest fel, diviziunile micrometrului ocular pot fi exprimate în unităţide lungime.
Mod de lucru:
1. Se aşează pe platina microscopului lama micrometru obiectiv. Aceasta se fixeazăcu ajutorul celor doi cavaleri.
2. Realizaţi acum imaginea la microscop: se aduce în axul microscopului obiectivulx10 prin rotirea sistemului revolver. Privind din lateral, se roteşte vizamacrometrică spre înainte şi se coboară tubul microscopic până ce obiectivul seapropie de preparat. Viza macrometrică se mişcă foarte încet. Apoi, privind prinocular, cu ajutorul aceluiaşi şurub macrometric, rotit în sens invers, se ridică încet
tubul până ce apare imaginea în câmpul microscopului. În continuare se procedează la completarea punerii la punct a imaginii cu ajutorul şurubuluimicrometric care va fi mişcat în ambele sensuri.
3. Se introduce micrometrul ocular intr-unul dintre ocularele microscopului prinscoaterea acestuia din tub şi deşurubarea lentilei superioare a ocularului. Sistemul
ocular se introduce apoi în tub. Se observă suprapunerea celor două imagini alescalelor micrometrice. Notaţi câte diviziuni ale micrometrului obiectiv corespundlaturii unui pătrat al micrometrului ocular.
4. Cunoscând valoarea unei diviziuni ale micrometrului obiectiv puteţi uşor afla câţimm reprezintă latura unui pătrat din reţeaua micrometrului ocular. Acum,înlocuind lama micrometru obiectiv cu o lamă având un preparat, puteţi măsuradimensiunile obiectivelor de pe acestea.
5. Dacă se utilizează un obiect liniar de lungime d cunoscută (etalon), aşezat într -un plan bine determinat, perpendicular pe axa optică a microscopului şi se măsoară
lungimea imaginii reale i=n diviziuni a obiectului cu ajutorul micrometruluiocular pentru un obiectiv dat se poate determina un factor de transformare Mrdefinit prin relaţia:
r
n M
d
6. Factorul de transformare Mr este o mărime caracteristică microscopului şi poate fiutilizat pentru etalonare astfel încât el să poată fi folosit pentru determinarealungimii unor obiecte microscopice. Dacă în locul obiectului etalon se aşează preparatul ce con’ine celule de dimensiuni necunoscute d’ şi se măsoară lungimeacorespunzătoare imaginii n’, în conformitate cu relaţia anterioară se obţine:
'
'r
n M
d
Evaluarea cantitativă a fenomenului de osmoză
1. La nivelul celulelor vegetale
Celulele vegetale prezintă o membrană citoplasmatică(care include plasmalema şitonoplastul); la exteriorul membranei citoplasmatice există o altă membrană sau peretecelulozic rigid, inextensibil, aflat la o oarecare distanţă de membrana citoplasmatică.
Tonoplastul este considerat o membrană semipermeabilă, sediul principal al fenomenului deosmoză.
După păstrarea în mediu izoosmotic celule îşi conservă volumul, deoarece nu are loc niciun flux rezultant de solvent, spre interiorul sau exteriorul celulei.În mediul hipoosmotic apa intră în celulă, traversând peretele celulozic şi membranacitoplasmatică; celula se măreşte de volum, dar această mărire este limitată prin existenţa
peretului celulozic, rigid. Fenomenul poartă numele de turgescenţă. Turgescenţa este stareafiziologică normală, de hidratare optimă a celulei vegetale.
În mediul hiperosmotic, apa celulară este extravazată prin membrană, în scopulrestabilirii izotoniei între mediul intra- şi extracelular. Celula îşî micşorează volumul,fenomenul f iind denumit plasmoliză. Membrana citoplasmatică urmăreşte plasma care se
restrânge în volumul celular mic, îndepărtându-se de peretele celulozic. Plasmoliza are loc întrei faze:
1. Plasmoliza incipientă, care constă în deprinderea citoplasmei de peretele ce lulozicnumai la colţurile acesteia;
2. Plasmoliza concavă, care constă în desprinderea parţială a citoplasmei de perete; 3. Plasmoliza convexă, care constă în desprinderea totală a citoplasmei de perete.
Plasmoliza poate fi un fenomen reversibil şi apare doar celula viabilă,semipermeabilitatea protoplasmei fiind un fenomen caracteristic doar protoplasmei vii; prin moarte celulară protoplasma devine permeabilă.
Presiunea osmotică a celulei vegetale este numită şi potenţial osmotic şi este dată deconcentraţia sucului vacuular în glucide şi săruri minerale.
2. La nivelul celulelor animale
La celulele animale, lipsa unui perete rigid,care să limiteze mărirea de volum a celulei înmediul hipoton, duce la ruperea membranei celulare. În cazul particular al hematieifenomenul se numeşte hemoliză. În mediul hiperosmotic apa iese prin exosmoză din celule,membrana citoplasmaticăse retrage împreună cu conţinutul celular spre nucleu, celulamicşorându-şi volumul; fenomenul este denumit ratatinare. Modificările de volum a lehematiei depind, deci,de modificările de presiune osmotică, astfel încât eritrocitul poate fi
considerat un veritabil osmometru natural. Presiunea osmotică totală în interiorul hematieidepinde, la rândul său, de concentraţia ionică şi de concentraţia glucozei, precum şi deconţinutul său în hemoglobină.
Membrana eritrocitară este permeabilă la apă şi molecule mici, dar este totalimpermeabilă la hemoglobină, astfel încât determinantul principal al comportamentului deosmometru al hematiei rămâne hemoglo bina.
Eritrocitul reprezinta însa mecanisme de control ce tind să readucă rapid celula la starea
de echilibru iniţial. Astfel trecerea masivă de s pre exterior poate compensa parţial
cr eşterea volumului. Dacă însa gradientul transmembranar de presiune osmotică este prea
mare, aceste mecanisme devin insuficiente. În plus hemoglobina care nu poate părăsi celulamenţine o presiune care atrage în continuare volumul iar dacă presiunea osmotică a mediuluiextracelular scade în continuare, la un moment dat, fiind depăşită rezistenţa mecanică amembranei, hemoglobina va fi extravazată prin intermediul unor false orificii, fără a se produce o veritabilă rupere. Membrana eritrocitară, de aspect modificat, va include unconţinut electrolitic, lipsit de hemoglobină, această nouă structură poartă numele de fantomaeritrocitară.
În mecanismul hemolizei şi în refacerea integrităţii membranare după eliminareahemoglobinei un rol important revine şi citoscheletului eritrocitar.
Dacă introducem hematii normale în soluţie de NaCl, hemoliza apare la concentraţii de NaCl de 5g/l şi este totală la o concentraţie de 3 g/l.
În unele stări patologice hemoliza poate apare chiar şi în vivo; de exemplu într-o maladie
ereditară, în care hematiile sunt mult mai sensibile la variaţii de presiune osmotică.
PARTE PRACTICA
http://www.linkpublishing.com/video-transport.htm
a. Osmoza la alga ….. Utilizând microscopul optic, veţi observa modificările unor celule vegetale puse în medii
izoosmotice, hipoosmotice şi hiperosmotice.Cele mai evidente modificări apar în privinţa volumului şi formei celulare. Pentru a leobserva aveţi nevoie de a măsura dimensiunile unei celule prin metoda descrisă anterior,micrometria.Mod de lucru
1. Se pun în cele 3 vase Petri respectiv cca 20 ml mediu hipoton, mediu izoton şi mediuhiperton şi în fiecare câteva frunzuliţe de plantă.
2. Se lasă astfel 20 minute după care se examinează la microscop câte o frunză din fiecaremediu. Pentru a fi examinată la microscop, frunza, aşezată pe lama de sticlă, sesecţionează în grosime. Se aşează fragmentul de frunză pe lama de sticlă, apoi se aşează pe platina microscopului în aşa fel încât frunza să se afle în dreptul orificiului central al platinei. Se foloseşte obiectivul x10.
3. Se roteşte dispozitivul revolver şi se formează imaginea cu obiectivul x20, care a fostfolosit şi pentru etalonarea micrometrului ocular.
4. Se măsoară diametrul longitudinal şi transversal pentru un numar de 10 celule; datele setrec în tabel, în care:
I= mediu izo-osmotic;II= mediu hipoosmotic;III=mediu hiperosmotic;L=diametru longitudinal;T=diametru transversal;
m=media aritmetică.
I
L T
II
L T
III
L T123456
78910
b. Osmoza la hematiiPentru a pune în evidenţă fenomenul de osmoză la nivelul biomembranelor, se poate realizaun experiment asemănător, dar de data asta utilizând eritrocitele; acestea reprezinta un modelde studiu deosebit de accesibil în raport cu alte celule animale.
Protocolul de izolare celulara (pentru obţinerea eritrocitelor )consta in centrifugarea sangeluiintegral urmata de indepartarea plasmei si a stratului superior ( in care se gasesc trombocitele si leucocitele) . Dupa centrifugarea sangelui , eritrocitele se resuspenda in solu ţie demani tol 0,3M si se spală. Spalarea consta dint r -o serie de centrifugăr i si resuspendări inmanitol .Stocarea eritrocitelor s-a facut prin tinerea lor la frigider. ( temperatura fiind cuprinsa intre 4-80 C) , in HBSS (Hanks’Balanced Salt Solution) continand saruri , glucoza, bicarbonat de sodium si fosfati .
Mod de lucruVeţi observa dimensiunea transversală celulelor. Se va lucra cu 5 recipiente: în A aveţi osuspensie de eritrocite în mediu izoosmotic lor (NaCl 9g/l); în B şi B1 aveţi soluţiihipoosmotice de concentraţii diferite (NaCl 3g/l); în C aveţi soluţie izoosmotică (NaCl 9g/l);
în D aveţi soluţie hiperosmotică (NaCl 40g/l).1. Puneţi cu o pipetă Pasteur câte 1 ml suspensie din recipientul A în fiecare dintre
recipienetele B, C,D.2. În continuarea la anumite intervale de timp, veţi lua câte o picătură din conţ inutul
recipientelor B, C si D şi o veţi examina la microscop.Veţi remarca că celulele puse în C nu-şi modifică dimensiunile. Celulele puse în D seratatinează. Celulele puse în B1 şi scoase după primul interval de timp sunt turgescente iarcele puse în B sunt parţial sau total distruse.
