SEMINAR Sem 1. 1 Introducere şi prezentarea obiectului Micropropagării. Baze de date. Organisme şi organizaţii profesioniste 2. Înfiinţarea unității de Micropropagare 3. Sterilizarea. Metode de dezinfecție și asepsizare 4. Prepararea unui mediu de cultură 5. Metode de laborator: analiza optică a tipurilor de țesuturi utilizate în Micropropagare. 6. Cultura de protoplasti/ Resurse de informare. Cum citim un articol stiintific 7. Colocviu 2: Înfiinţarea unei unităţi de micropropagare Un laborator-unitate de culturi de ţesuturi vegetale, destinat doar scopurilor de multiplicare, nu trebuie să fie scump. Unitatea de micropropagare trebuie să deţină însă obligatoriu un număr de încăperi separate, cu destinaţie precisă, elemente esenţiale pentru reuşita operaţiunilor. Amenajarea corectă, într-o ordine logică şi eficientă, asigură nu numai menţinerea asepsiei dar şi un nivel de standard ridicat al muncii. Amplasarea unei unităţi de producţie trebuie să ţină cond de găsirea unei locaţii potrivite, de aproximativ 150 mp. Această locaţie trebuie să fie amplasată într-o zonă, luminoasă, izolată de trafic, să împiedice transmiterea contaminărilor de la o încăpere la alta, să deţină un sistem de control al temperaturii, să fie legată la o sursă de apă permanentă şi de calitate, precum şi la o structură de alimentare cu curent electric (minimum 100 amp). Instalaţiile electrice trebuie realizate de electricieni de profesie, (majoritatea firelor cerute fiind de 110 volţi). De asemenea, pentru asigurarea securităţii este indicată instalarea unor sisteme de detectare a incendiilor şi a controlului temperaturii, conectate la o linie telefonică pentru intervenţie urgentă. Pentru situaţii incidentale se recomandă şi instalarea unui generator de curent independent. Este recomandat ca unitatea de micropropagare să fie construită ca spaţiu independent. Chiar dacă aceasta implică cheltuieli suplimentare, izolarea este o garanţie a menţinerii condiţiilor de curăţenie şi asepsie. În prezent există posibilitatea utilizării prefabricatelor, disponibile în mărimile dorite, materiale care pot reduce costurile de înfiinţare ale unităţii. La instalarea unuei unităţi de producţie trebuie luat în vedere obţinerea autorizaţiei, amplasarea separată şi la distanţă faţă de zonele care reprezintă surse de contaminare (zona de transfer postaclimatizare, zona de pregătire a amestecurilor de pămînt, zona de depozitare a
Transcript
SEMINAR Sem 1.
1 Introducere şi prezentarea obiectului Micropropagării. Baze de date. Organisme şi organizaţii profesioniste
2. Înfiin ţarea unității de Micropropagare 3. Sterilizarea. Metode de dezinfecție și asepsizare 4. Prepararea unui mediu de cultură 5. Metode de laborator: analiza optică a tipurilor de țesuturi utilizate în Micropropagare. 6. Cultura de protoplasti/ Resurse de informare. Cum citim un articol stiintific 7. Colocviu
2: Înfiin ţarea unei unităţi de micropropagare
Un laborator-unitate de culturi de ţesuturi vegetale, destinat doar scopurilor de
multiplicare, nu trebuie să fie scump. Unitatea de micropropagare trebuie să deţină însă
obligatoriu un număr de încăperi separate, cu destinaţie precisă, elemente esenţiale pentru
reuşita operaţiunilor. Amenajarea corectă, într-o ordine logică şi eficientă, asigură nu numai
menţinerea asepsiei dar şi un nivel de standard ridicat al muncii.
Amplasarea unei unităţi de producţie trebuie să ţină cond de găsirea unei locaţii potrivite,
de aproximativ 150 mp. Această locaţie trebuie să fie amplasată într-o zonă, luminoasă,
izolată de trafic, să împiedice transmiterea contaminărilor de la o încăpere la alta, să deţină
un sistem de control al temperaturii, să fie legată la o sursă de apă permanentă şi de calitate,
precum şi la o structură de alimentare cu curent electric (minimum 100 amp). Instalaţiile
electrice trebuie realizate de electricieni de profesie, (majoritatea firelor cerute fiind de 110
volţi). De asemenea, pentru asigurarea securităţii este indicată instalarea unor sisteme de
detectare a incendiilor şi a controlului temperaturii, conectate la o linie telefonică pentru
intervenţie urgentă. Pentru situaţii incidentale se recomandă şi instalarea unui generator de
curent independent.
Este recomandat ca unitatea de micropropagare să fie construită ca spaţiu independent.
Chiar dacă aceasta implică cheltuieli suplimentare, izolarea este o garanţie a menţinerii
condiţiilor de curăţenie şi asepsie. În prezent există posibilitatea utilizării prefabricatelor,
disponibile în mărimile dorite, materiale care pot reduce costurile de înfiinţare ale unităţii. La
instalarea unuei unităţi de producţie trebuie luat în vedere obţinerea autorizaţiei, amplasarea
separată şi la distanţă faţă de zonele care reprezintă surse de contaminare (zona de transfer
postaclimatizare, zona de pregătire a amestecurilor de pămînt, zona de depozitare a
pesticidelor, îngrăşămintelor sau a altor substanţe chimice). În interior este obligatoriu
utilizarea gresiei şi a faianţei pentru realizarea unor suprafeţe uşor de curăţat. Asigurarea
curăţeniei permanente este un principiu de bază. Contaminarea datorată murdăriei poate duce
la pierderi de la 1% pînă la 50%. Având în vedere valoarea plantelor multiplicate in vitro nu
pot fi acceptabile pierderi datorate murdăriei mai mari de 1%. Sistemul de încălzire trebuie să
permită realizarea unor temperaturi constante mai ales pe timpul iernii (min. 25°C), iar pe
timpul verii este necesar utilizarea unui sistem de ventilaţie pentru controlul temperaturilor
prea ridicate.
Suprafaţa totală a unităţii de micropropagare este compartimentată într-o cameră
destinată spălării vaselor, o încăpere pentru pregătirea şi păstrarea mediilor de cultură şi a
soluţiilor stoc prevăzută cu o incintă, separată exclusiv pentru autoclav, o cameră sterilă
pentru inoculări, camere de vegetaţie şi unităţi pentru aclimatizare. Camera pentru pregătirea
şi păstrarea mediilor de cultură şi a soluţiilor stoc, precum şi zona de spălare a sticlăriei
trebuie amplasate separat de camera de inoculare şi de cea de vegetaţie. Zonele cele mai
curate trebuie să fie camera de vegetaţie şi camera de inoculat. Aceste două sectoare trebuie
să fie amplasate astfel încât intrarea să nu se facă direct din afara cădirii. Mai mult, ele
trebuiesc separate şi între ele prin instalarea unor uşi, cu rolul de reducere a traficului.
Camera destinată spălării vaselor
Camera pentru spălarea sticlăriei trebuie să fie dotată cu sursă permanentă de apă rece
şi caldă, de calitate, cel puţin un bazin-chiuvetă mare cu ţevi din materiale rezistente la soluţii
acide şi alcaline, rafturi şi dulapuri pentru uscarea şi păstrarea sticlăriei, aparatele pentru
producerea apei distilate şi deionizate.
Camera pentru pregătirea şi păstrarea mediilor de cultură şi a soluţiilor stoc
Camera pentru preparat mediile de cultură şi a altor soluţii trebuie să fie lângă camera
de spălat, având astfel acces direct la sursa de apă distilată şi la vase. Această încăpere este
prevăzută cu console sau mese de lucru foarte stabile. Suprafaţa lor trebuie să fie din
materiale rezistente şi uşor de curăţat. Camera trebuie să fie încăpătoare deoarece în această
zonă se găseşte majoritatea echipamentelor cerute în unitatea de micropropagare.
Necesarul de echipamente se stabileşte în funcţie de mărimea unităţii de producţie şi
se completează adecvat dacă în această unitate se realizează şi activităţi de cercetare.
Din tot necesarul de înfiinţare, cele mai costisitoare sunt aparatele, pentru un
laborator de culturi fiind necesară achiziţionarea a minimum următoarelor echipamente:
Cantitate Descriere produs Utilizare produs sticlărie
100 buc. Vase de cultură din sticlă, autoclavabile, cu posibilitate de inchidere ermetică
Veselă pentru menţinerea materialului vegetal prin subculturi
100 buc. Capace pentru vasele de cultură, autoclavabile, cel mai indicat din polipropilenă
Închiderea ermetică a vaselor de cultură
15 buc Cutii Petri sau plăci de faianţă autoclavabile
Suprafaţă sterilă pentru fasonarea explantelor în timpul transferului pe mediu proaspăt
10 buc. Sticle cu capac pentru apă, autoclavabile (500 mL)
Apă sterilă pentru clătire
1 buc. Vas Erlenmeyer, 1000 mL Pregătirea mediului/soluţii
1 buc. Vas Erlenmeyer, 2000 mL Pregătirea mediului/soluţii
1 buc. Vas Erlenmeyer, 4000 mL Pregătirea mediului/soluţii
1 buc. Vas Erlenmeyer, 6000 mL Pregătirea mediului/soluţii
1 cutie Sistem de filtrare cu pompă de vacuum, pentru lichide, din polistiren; 200 mL; 47 mm în diametru/ membrane filtrante de nailon cu pori de 0,22 µm
Sterilizarea soluţiilor stoc fierbinţi
1 buc. Cilindru de sticlă/plastic gradat; 10 mL
Preparare soluţii stoc
1 buc. Cilindru de sticlă/plastic gradat; 100 mL
Preparare soluţii stoc
1 buc. Cilindru de sticlă/plastic gradat; 1000 mL
Preparare soluţii stoc
100 buc. Pipete gradate, 1 mL, sterile sau autoclavabile
Măsurare soluţii stoc
100 buc. Pipete gradate, 5 mL, sterile sau autoclavabile
Măsurare soluţii stoc
100 buc. Pipete gradate, 10 mL, sterile sau autoclavabile
1 buc. Oală sub presiune cu operare între 116-126 ºC; 10-20 psi
Sterilizarea volumelor mici de mediu, soluţii, obiecte mici
1 buc. Etuvă 120V (S636) sau 240V (S637)
Presterilizare, sterilizare uscată
1 buc. Cronometru electronic, cu alarmă
Alarmă şi cronometrare
1 buc. Stereo-lupă prevăzută cu sursă de luminare
Observare material biologic
1 buc. Aparat fotografiat Observare material biologic
chimicale 1 L Detergent Spălarea vaselor de
sticlă 1 L Dezinfectant (hipoclorit) Sterilizarea suprafeţei
explantului 4 L Alcool 70 % Pentru sterilizarea
suprafeţelor de lucru şi a instrumentarului
solutii standard de calibrare pentru valorile 4,0 si 7,0
Calibrarea pH-metrului
Vată, tifon Uz general
instrumentar 3 buc. Foarfece din inox,
autoclavabilă Fasonat explante
2 buc. Bisturiu din inox, autoclavabil,
Fasonare explante
100 buc. Lame bisturiu Nr. 11 Fasonare explante 2 buc. Spatulă mare Măsurare volume mari de
substanţe chimice 2 buc. Spatulă mijlocie, 30
cm lungime Măsurare volume mari de substanţe chimice
1 buc. Micropipetă şi vărfuri 0-20 µl
Măsurare volume mici
1 buc. Micropipetă şi vărfuri 20-1000 µl
Măsurare volume mici
2-3 buc. Marker colorat, 2-3 culori
Etichetarea culturilor
1 rolă Parafilm(4``x250 ft) Sigilare vase de cultură 1 pereche Mănuşi de protecţie
pentru autoclav Pentru manevrarea în siguranţă a autoclavului şi a vaselor fierbinţi
1 rolă Folie aluminiu Pentru împachetarea instrumentarului în vederea autoclavării
2-3 buc. Magneţi de agitare ( pentru volume de 250 mL, 1000 mL, 2000 mL)
Amestecarea soluţiilor pe agitator magnetic
2-3 buc. Perie de sticlă Spălare eprubete şi vase de sticlă
25 buc. Suport eprubete Suport eprubete în camera de vegetaţie
1000 buc. şerveţele Pot fi sterilizate , sau pentru uz general în laborator
100 coli Hârtie Pentru împachetat, la sterilizare
1 rolă Bandă adezivă pentru autoclav, se diferenţiază după 15 min. de expunere la 121 ºC
Marcare autoclavare, etichetare
1 buc. Termometru -20 /+150 ºC
Măsurare temperatura lichidelor sau în camera de vegetaţie
25 buc. Tăviţe pentru cântărire, volume diferite
Cântărirea substanţelor chimice
În categoria echipamentelor opţionale, în funcţie de bugetul alocat dotării, se pot
achiziţiona şi altele, cum este cazul unui cuptor cu microunde- necesar pentru dezgheţarea
rapidă sau pentru topirea rapidă a mediilor de cultură ce trebuie suplimentate postautoclavare
cu diferite componente termosensibile; laboratorul poate fi dotat şi cu o maşină de spălat
vasele de cultură, un sistem automat de dispersie a mediului de cultură, etc.
Camera sterilă pentru inoculări
Alături de camera de preparat mediul de cultură, există camera sterilă, destinată
inoculărilor, care trebuie să fie cea mai curată şi izolată încăpere. Izolarea eficientă a acestei
încăperi asigură condiţii de transfer aseptic şi împiedică circulaţia sporilor
microorganismelor. În această incintă este obligatorie purtarea unui echipament de laborator
corespunzător (halat, pantofi, bonetă, etc.). În această cameră sunt montate hotele de suflat
aer steril astfel încît toate operaţiunile să se execute obligatoriu în condiţii de asepsie. Pentru
menţinerea gradului de steril camera este prevăzută cu un sistem de ultraviolete, lumina UV
fiind însă utilizată, înainte sau între perioadele de inoculare şi doar când personalul şi
materialul biologic nu se află în încăpere. Pentru o protecţie sporită a personalului, este
indicat să fie avertizată prezenţa şi funcţionarea UV-ului iar închiderea/deschiderea lămpilor
UV să fie practicabile din exteriorul camerei, Suprafaţa interioară a hotelor trebuie să fie din
materiale perfect netede (sticlă) pentru a reduce depunerile de praf şi eventualele surse de
depozitare a microrganismelor, uşor de curăţat şi rezistente. Camera trebuie să fie dotată cu
surse de curent electric pentru hote, lupe, microscop şi aparatele bacto-incineratoare
(aparatele de sterilizat instrumentarul).
Camera de vegetaţie
Camera de vegetaţie este locul unde se păstreză materialul vegetal (plante, calus,
suspensii, protoplaşti) în vasele de cultură în intervalul dintre două subculturi. Elementele
caracteristice pentru această încăpere sunt definite de temperatură, umiditatea relativă,
sistemul de iluminare şi tipul de rafturi pentru culturi. Toate aceste elemente se stabilesc în
funcţie de mărimea camerei, locaţie şi tipul de cultură pentru care este destinată.
Elementul esenţial în camera de vegetaţie îl reprezintă temperatura. În funcţie de
aceasta se stabilesc şi alţi parametrii cum sunt lumina, umiditatea relativă şi tipurile de rafturi
(simple, cu oglindă sau cu system de răcire) pentru vasele de cultură.Valoarea medie a
temperaturii în camera de vegetaţie este cuprinsă între 22 şi 25 ºC. Încălzirea camerelor de
vegetaţie nu prezintă o problemă în sine; mult mai dificil este însă răcirea şi menţinerea unei
temperature constante – aceasta se realizează prin instalarea sistemelor de aer condiţionat sau
a unor ventilatoare. Nu este indicat apelarea la geamuri pentru camerele de vegetaţie
deoarece aceasta ar spori riscul contaminării culturilor în timpul verii şi ar crea variaţii de
umiditate în timpul iernii.
Unele camere de vegetaţie pot fi menţinute în întuneric dar majoritatea culturilor au
nevoie de lumină. Camerele de vegetaţie sunt prevăzute cu sisteme de iluminat
neincandescent, asigurându-se o intensitate medie de 1- 5 klux, această valoare fiind stabilită
în funcţie de specia cultivată şi de sistemul de cultură practicat. Calitatea luminii este şi ea o
componentă esenţială în procesele de culturi de celule şi ţesuturi vegetale : majoritatea
culturilor se practică sub lumină florescentă albă. Stadiul de dezvoltare a culturii poate
necesita însă utilizarea unui spectru variat de lumină. Culturile pot manifesta cerinţe specifice
şi faţă de fotoperioadă astfel încât orice cameră de vegetaţie va fi dotată cu un sistem automat
pentru programarea fotoperioadei. Utilizarea unor surse de lumină de tipul reflectoarelor este
limitată deoarece căldura generată de acestea poate determina condensarea sau concentrarea
mediilor de cultură. Dacă prezenţa reflectoarelor direct pe vasele de cultură este absolut
necesară atunci trebuie să se asigure o circulaţie corespunzătoare a aerului cu ajutorul
ventilatoarelor.
Umiditatea relativă este foarte greu de controlat în interiorul vaselor de cultură.
Valoarea umidităţii relative în camera de vegetaţie nu trebuie să scadă sub 50 % ; dacă
valoarea creşte peste limitele acceptabile se vor folosi metode de uscare iar pentru situaţia
inversă vor fi folosite cantităţi mai reduse de agar la prepararea mediului.
Unitatea pentru aclimatizare
Aclimatizarea plantelor înrădăcinate in vitro se realizează în boxe speciale în care toţi
factorii de stress post transferului ex vitro să poată fi controlaţi şi adaptaţi în funcţie de
necesarul şi starea plantulelor
Aspecte economice şi comerciale
ale unităţii de micromultiplicare
Etichetare si păstrarea evidenţei
Laboratorul de culturi de celule şi ţesuturi vegetale, organizat pe principii comerciale
necesită utilizarea unui sistem eficient de înregistrare a informaţiilor care trebuie să asigure
toate informaţiile simplu şi exact prezentate din toate etapele procesului operaţional.Aceasta
se realizează îin scopul eficientizării planificării producţiei şi pentru reducerea la minimum,
mentinându-se costuri scăzute de producţie. Multe dintre informaţii pot fi păstrate în registru,
dar ideal este utilizarea unei baze de date pe calculator.Utilizarea calculatorului permite
organizarea, accesarea, sortarea şi clasificarea pe categorii.
Exemple de înregistrări:
• Metode de cultură
1.Protocoale, proceduri, formule de medii 2.Reţete de medii şi soluţii stoc
• Activitatea experimentală
1. Specii recalcitrante, problematica de rezolvat 2. Evoluţia experimentelor (detalii pe faze)
• Comenzi
1. Lista de furnizori (persoana contact, adrese,etc.) 2. Formulare tipizate 3. Informaţii legislative pentru produse cu regim special
• Contabilitatea
1. Conturi 2. Facturi 3. Alte documente
• Control periodic
1. Data verificării hotelor 2. Filtre schimbate 3. Control biohazard 4. Control instalaţie electrică 5. Verificare aparate în regim special (autoclav, distilator, pH-metru) 6. Control protecţia muncii 7. Control dotări prim-ajutor (acid acetic 2%, acid boric 4%, spirt medicinal,
apă oxigenată 3%, bicarbonat de sodiu 2%, comprese sterile, leucoplast, pahar special pentru spălat ochii, tinctură de iod, vată hidrofilă, faşă de tifon)
3: Sterilizarea; asepsizarea – metode de sterilizare
Cuvinte cheie:
Sterilizare vs asepsizare, metodă şi agenţi diferenţiaţi
Necesar consumabile:
Hipoclorit Alcool 70 % Apă apă sterilă
Necesar echipamente:
Filtru Millipore® Autoclav Etuva
Noţiuni teoretice
Prin “steril” în culturile in vitro se înţelege lipsa totală a microorganismelor, atât de
pe suprafaţa cât şi din interiorul materialului biologic cu care se lucrează. Aceasta se asigură
prin operaţiunea de sterilizare sau dezinfecţie. Sterilizarea se aplică următoarelor categorii de
materiale:
• materialul biologic
• instrumentar şi vase de laborator
• incintei şi suprafeţei de lucru.
Termenul de aspsizare este utilizat în cazul sterilizării materialului vegetal deoarece
rezerva de agenţi patogeni endogeni nu poate fi eliminată prin tratamentele de spălare cu
agenţi de sterilizare.
Sterilizarea/dezinfecţia se face cu ajutorul agenţilor sterilizanţi care pot fi fizici sau
chimici.
Agenţii fizici :
1. Căldura – uscată
• Flambarea – operaţiunea de îndepărtare a agenţilor patogeni prin inversare în
alcool şi trecere prin foc timp de câteva secunde. Metoda se aplică instrumentarului
şi cutiilor Petri folosite în cabinetul steril. Se poate aplica, cu risc, şi ţesutului
vegetal – flambare uscată – fără imersie în alcool, dar numai în cazuri extreme.
• Încălzirea la roşu – sterilizarea prin supraîncălzire. Se aplică obiectelor metalice
– instrumentar.
• Aer cald – etuvarea la 160º-180ºC, timp de 1-3 ore. Se aplică vaselor de cultură
(lipsite de mediu) instrumentarului. Uneori are rol de presterilizare şi uscare a
vaselor spălate.
i. Etuva este un aparat prevăzut cu o incintă interioară – stratificată sau nu –
separată de exterior prin doi pereţi metalici izolaţi cu plăci de azbest, care
au rolul menţinerii temperaturii constante, fără pierderi de căldură, pe tot
parcursul desfăşurării procesului de presterilizare. Este prevăzută, de
asemenea, cu termometru, buton de reglare a temperaturii dorite,
temporizator, precum şi cu un dulap pentru depozitarea materialelor
sterilizate pentru o perioadă determinată.
2. Căldura umedă
Foloseşte aburii ca agenţi de sterilizare. Are o putere de penetrare mai mare şi asigură
distrugerea microorganismelor hidratate.
• Fierbere: Se aplică instrumentarului sau obiectelor mici – dopuri, garnituri,
capace etc.
a. vapori de apă sub presiune – autoclavarea. Orice agent patogen – bacterie,
ciupercă sau virus, ţinut timp de 1 oră la o temperatură de 120ºC la o presiune de
1 atm. este distrus în totalitate. Autoclavarea este o etapă obligatorie – pentru
sterilizarea vaselor, a mediilor de cultură şi a apei de clătire folosită la limpezirea
explantelor vegetale. Durata autoclavării depinde de materialul care se
sterilizează, fiind în medie de 20-25 min. pentru mediile de cultură, respectiv 1
oră pentru vase, calculat din momentul cînd se obţine temperatura, respectiv
presiunea, dorită.
· pentru solide se recomandă în medie 15 minute.
· pentru lichide timpul este în corelaţie cu volumul care se sterilizează:
ml 25 50 100 250 500 1000 2000
Min. 20 25 28 31 35 40 48
Nu se recomandă depăşirea timpului de autoclavare deoarece aceasta ar duce la degradarea
componentelor din mediu.·
După autoclavare, eliberarea presiunii din autoclav trebuie să se facă treptat în cazul
lichidelor şi rapid, urmată de ciclul de uscare, în cazul solidelor
Manipularea autoclavului se face numai de personal autorizat, sub control strict
deoarece există în permanenţă pericolul de explozie. Principiul autoclavării constă în circuitul
vaporilor fierbinţi (121ºC) sub presiune (obişnuit 1 atm. dar se pot folosi şi presiuni mai mari
2-2,5 atm. până la 7 atm.) într-o incintă (camera de sterilizare) închisă. Încălzirea vaporilor se
realizează printr-un sistem de termoplonjare, iar circulaţia vaporilor se face prin sistem de
supape admisie – evacuare. Există mai multe tipuri de autoclave, clasificate după:
� tipul de funcţionare: cu gaz, electric, automatizat, neautomatizat.
� capacitate.
� în funcţie de poziţia incintei (verticală sau orizontală)
Verificarea funcţionării se face periodic, de persoane autorizate sau la diferite
intervale prin probe biologice. Pentru aceasta se folosesc culturi bacteriene cu rezistenţa
cunoscută (de ex. Bacillus anthracis este distrus la 115ºC sau B. stearothermophillus distrus
la 121ºC în 5 minute). (Este identificat numărul de bacterii înainte şi după autoclavare).
b. Pasteurizarea – metodă imaginată de L. Pasteur aplicabilă materialelor care nu
rezistă la temperaturi foarte ridicate. Principiul metodei constă în distrugerea
agenţilor patogeni prin şoc termic: ridicarea la temperatură mare urmată de
scăderea bruscă la temperaturi foarte scăzute.
Sunt descrise trei tipuri de pasteurizare, în funcţie de valoarea medie a temperaturii realizată:
� joasă: 60-65ºC – 30 min., urmată de răcirea bruscă la 3ºC şi păstrare la 4ºC
� medie: 70-75ºC – 10-20 min. – răcire bruscă 30ºC
� înaltă: 85-90º câteva secunde – răcire la 3ºC.
c. Tindalizarea – principiul metodei constă într-o sterilizare fracţionată. Se
realizează printr-o încălzire discontinuă 30-60ºC repetată timp de 3 zile
consecutiv la interval de 24 ore. Scopul este distrugerea agenţilor patogeni
în forma lor vegetativă, iar prin răcirea lentă asigurarea condiţiilor
favorabile (36ºC) pentru germinarea sporilor care vor evolua şi astfel vor fi
distruşi la încălzirea din ziua următoare.
3. Razele ultraviolete
Este o metodă de distrugere a celulelor vegetative şi mai puţin eficientă pentru sporii
agenţilor patogeni. Se realizează cu ajutorul lămpilor UV – fixe sau mobile. Se aplică
incintelor şi suprafeţelor de lucru. Nu este recomandată materialului biologic, deoarece poate
induce mutaţii.
4. Ultrasunetele
Principiul metodei constă în folosirea vibraţiilor acustice cu frecvenţe mai mari de 20.000
Hz care asigură dezintegrarea rapidă a celulei bacteriene. Se aplică cu succes instrumentarul,
folosind aparate speciale care sunt prevăzute din construcţie cu un cristal de cuarţ asupra
căruia se acţionează cu impulsuri electrice pentru realizarea vibraţiilor. Avantajul metodei
constă în absenţa riscurilor şi a timpului deosebit de scurt (câteva secunde).
5. Filtrarea
Metodă de sterilizare bazată pe trecerea lichidelor prin substraturi poroase care au rolul
de a reţine elementele nedorite. Principiul se bazează pe exploatarea fenomenului de
adsorbţie a particulelor la pereţii capilarelor ce formează porii filtrului astfel că filtrarea nu
presupune doar un fenomen mecanic.
Există diferite tipuri de filtre: de sticlă, de ceramică, de hârtie sau alte membrane filtrante.
Regulile ce trebuiesc avute în vedere la filtrare sunt:
a. verificarea stării intacte a filtrului
b. verificarea gradului de vâscozitate a lichidului de filtrare şi să nu conţină
particule mari în suspensie, ceea ce ar determina o colmatare prematură a
filtrului. În caz de vâscozitate prea mare se recomandă o diluare.
c. executarea filtrării la o presiune corectă (de obicei <30-40 mm Hg) şi în timp
adecvat (la un timp prea scurt şi la presiune mare, filtrele se pot sparge, iar la un
timp prea lung se pot colmata).
d. evitarea variaţiilor bruşte de presiune sau depresiune.
Agenţii chimici
Pentru agenţii chimici se preferă termenul de agenţi dezinfectanţi celui de agenţi
sterilizanţi (pentru a nu se confunda sau suprapune cu metodele de inducere a sterilităţii în
organismele biologice care folosesc diferite substanţe chimice în acest scop). În funcţie de
materialul care urmează să fie sterilizat se folosesc diferite substanţe chimice:
a. soluţie de sublimat coroziv 0,1% HgCl2 – pentru mese, mobilier
b. detergenţi
c. bicromat de potasiu 5% - pentru pipete
d. alcool etilic 70º
e. formol 40%
f. fenol 5%
g. apă oxigenată 3%
h. permanganat de potasiu 0,1%
i. tincturi.
j. EtOH 70% pentru suprafeţe sau 80% pentru instrumentele flambate
k. Hipoclorit de sodiu (NaOCl)
O metodă de sporire a eficacităţii agenţilor sterilizanţi constă în adăugarea de
surfactanţi pentru reducerea tensiunii superficiale create la interfaţa dintre lichidul de
dezinfectat şi suprafaţa (uneori nu chiar netedă) materialului biologic (de ex.Tween 20; 40;
60; 80; Pluronic-F68, Pluronic- F127etc.)
Metode generale de evitare a contaminării culturilor
a. Evitaţi circulaţia excesivă în camera de inoculat şi între camera de inoculat şi camera de
vegetaţie sau camera de pregătit mediile de cultură.
b. Nu lăsaţi niciodată în camera de inoculat sau în hotă vasele contaminate, murdare sau
resturi de culturi infectate. Acestea trebuiesc autoclavate şi apoi spălate cu atenţie.
c. Porniţi hota cu cel puţin 20 minute înainte să se înceapă operaţiunile de inoculare.
d. Sterilizaţi zona cu lampa de UV timp de 30 minute.
e. Spălaţi suprafaţa hotei cu etanol 70 %.
f. Purtarea inelelor, brăţărilor , a altor bijuterii sau a unghiilor lungi nu sunt indicate.
g. Mâinile se spală cu apă caldă şi săpun.
h. Măriţi accesul circulaţiei aerului steril prin îndepărtarea tuturor obiectelor în surplus sau
nefolositoare din interiorul hotei laminare.
i. Pulverizaţi cu etanol 70 % toate obiectele ce urmează a fi introduse în hotă.
j. Menţineţi zona sterilă deasupra şi în jurul vaselor de cultură deschise.
k. Treceţi rapid prin flacără gura tuturor vaselor de cultură înainte de deschidere.
l. Lucraţi în partea interioară a hotei cât mai aproape de filtrele de sterilizare a aerului.
m. Evitaţi strănutul, tuşitul sau vorbitul în zona sterilă a hotei şi folosiţi o mască dacă este
necesar.
n. Păstraţi o poziţie verticală a corpului în timpul lucrului.
o. Când se toarnă lichide sterile păstraţi mâinile cât de departe de deschiderile flacoanelor.
p. În hotă plasaţi capacele de flacon, capacele cutiilor Petri în aşa fel încât zona de steril să
nu atingă masa sau altă suprafaţă.
q. După fiecare utilizare resterilizaţi pentru aproximativ 5 secunde toate instrumentele.
Protecţie şi hazard într-un laborator de culturi de celule şi ţesuturi vegetale
a. Nu se pipetează cu gura. Pentru pipetare se folosesc Pipetteboy automate sau manuale
b. Soluţiile de dezinfectare (hipoclorit, Domestos, etc.) nu se expun la radiaţii UV deoarece
pot produce gaz toxic
c. După flambare nu reintroduceţi instrumentul în vasul cu alcool, pericol de aprindere
Nu folosiţi HgCl2 ca dezinfectant deoarece este foarte toxică
Exerciţii practice
Exerciţiul 1. Microfiltrarea
Folosiţi un microfiltru Millipore® de 0,4 µm pentru a steriliza o soluţie termosensibilă:
a. activitatea se execută în hota sterilă.
b. încărcaţi într-o siringă soluţia nesterilă.
c. deschideţi cu atenţie, fără să atingeţi, filtrul Millipore .
d. fixaţi siringa încărcată pe filtru.
e. filtraţi cu atenţie (viteză şi presiune medie) într-un vas colector sterilizat în
prealabil.
f. dacă soluţia filtrată trebuie adăugată unui mediu lichid aceasta se va face la
temperatura camerei iar în cazul mediului solid când acesta, după topire, s-a răcit
la 50-55°C.
Exerciţiul 2. Sterilizarea mediilor de cultură
Mediile de cultură se sterilizează prin autoclavare la temperatura de 121 °C, sub o
presiune de 1-1,2 atm Durata pentru autoclavare depinde de compoziţia mediului şi de
volumul supus sterilizării. Pentru reuşita autoclavării este recomandat dispersarea mediului în
volume mici pentru evitarea alterării chimice a componentelor în cazul unei expuneri
îndelungate de timp. Practica a demonstrat că o expunere prelungită a mediului pentru
sterilizare împiedică solidificarea mediului după răcire, având şi efecte negative asupra
creşterii ţesuturilor vegetale.
Volumul mediului/vas (mL)
Timp minim de sterilizare (min)
25 50 100
20 25 28
250 500 1000 2000 4000
31 35 40 48 63
Timpul mininm de autoclavare reprezintă timpul minim cerut pentru atingerea
temperaturii de autoclavare (121 °C), plus încă 15 minute din momentul ajungerii la
temperatura de 121 °C (Burger, 1988).
Unele componente ale mediului sunt considerate ca fiind termosensibile şi astfel nu
pot fi autoclavate. Aceste substanţe se adaugă mediului de cultură sub formă de soluţii stoc
care se sterilizează prin filtrare prin filtru Millipore de 0,22 µm, într-un vas steril, închis..
Soluţiile filtrate se adaugă aseptic, mediului de cultură după autoclavarea acestuia şi răcirea
Nu se recomandă scimbarea cantitaţilor din reţetele de soluţii anorganice, întrucât se
produc modificari în ceea ce priveşte proporţia diferiţilor compuşi, alterând echilibrul ionic
fixat ca optim din punct de vedere fiziologic, a stabilităţii în timp a pH-ului.
Exerciţiul 3: Prepararea unor soluţii stoc de fitoregulatori de creştere
La prepararea soluţiilor stoc reţinem câteva reguli generale:
g. dizolvarea substanţelor se face numai în apă bidistilată
h. fiecare compus se dizolvă într-o anumită cantitate de apă proporţional cu
i. numărul ingredientelor ce urmează a fi amestecate şi cu volumul final al
j. soluţiei stoc, după care soluţiile obţinute se amesteca succesiv, în ordinea
k. indicată în reţetar
l. la substantele greu hidrosolubile, amestecul se încălzeşte uşor pe baia de
m. apă (dacă reţeta prevede această indicaţie), agitând
n. regulatorii de creştere - hormonii - vor fi solubilizaţi fiecare în parte, potrivit
o. indicaţiilor din literatura de specialitate
p. deoarece autorii exprimă concentraţia în maniera diferită (g, mg%, g/l sau
q. ppm) se are în vedere calcularea cantităţii de substanţă ce trebuie cântărită
r. pentru a asigura echivalenţa
s. se are în vedere asigurarea echivalenţei unui compus introdus în mediu
t. când aceasta este o sare cu un anumit conţinut în apă sau în cazul unor
u. săruri cristalizate
v. în prepararea mediului de bază fiecare compus în parte se adaugă eşalonat,
w. într-o anumită cantitate de apă bidistilată apreciată arbitrar, proporţional cu
x. volumul final al soluţiei
y. pH-ul mediului se va regla înainte de adăugarea agarului
z. agarul se va adăuga mediului de cultură după introducerea celorlalte
aa. ingrediente, mediul agarizat, cu agarul lichefiat se repartizează în recipiente
bb. de cultură. La pH prea acid sau la autoclavare incorectă agarul rămâne în
cc. stare lichidă şi mediul de cultură nu se mai poate folosi.
Fişa mediului constă în înregistrarea formulelor utilizate într-o bază de date proprii.
Fişele vor conţine obligatoriu codurile înscrise pe flacoane. MS , B5, WPM, etc.)
5. Metode de laborator: analiza optică a tipurilor de țesuturi utilizate în Micropropagare.
Cele mai multe caracteristici structurale şi metabolice sunt comune tuturor
organismelor eucariotice, diferenţele care există fiind mai mult de detaliu, la nivel de
mecanism molecular. Cu toate acestea există trei mari caracteristici care deosebesc
fundamental celulele vegetale de alte celule eucariotice şi anume:
1. prezenţa unui perete celular rigid
2. capacitatea de fixare în cloroplaste a CO2
3. prezenţa unei vacuole mari, izolată printr-o membrană, care ocupă aproximativ
95% din volulmul citoplasmatic al celulei mature.
Plantele vasculare sunt alcătuite din organe diferite- rădăcină, tulpină, frunze,
flori- şi fiecare este alcătuit dintr-un număr variat de ţesuturi, respectiv de celule. Toate
structurile vegetale diferenţiate sunt iniţiate din celule apte pentru diviziune, celule
identice ca număr de cromozomi, specific speciei, ceea ce înseamnă că în determinarea şi
controlul dezvoltării şi diferenţierii celulare rolul determinant efectiv îl joacă activarea
selectivă a anumitor gene în asociaţie cu diferenţele la nivel citoplasmatic. La nivel
molecular aceasta înseamnă că celulele vegetale individuale exprimă doar o parte din
informaţia lor genetică totală (respectiv, din genom). Expresia unei secvenţe particulare
din genotip are ca rezultat diferenţierea celulară, creşterea unui organ distinct şi
determină calea specifică a dezvoltării vegetale. O astfel de expesie diferenţială poartă
denumirea de determinare şi este necesară pentru menţinerea şi funcţionarea unui anumit
tip de ţesut.
Diferenţa majoră între tehnicile clasice şi cele moderne de înmulţire vegetală
constă în faptul că sistemul tradiţional se bazează pe organismul vegetal ca întreg, în timp
ce tehnologiile moderne utilizează ca bază pentru multiplicare, celulele. Tehnicile
culturilor in vitro permit accesul la celulele vegetale individuale, ceea ce face posibilă o
gamă largă de manipulări, urmate de selecţie şi inducerea regenerării plantei întregi prin
controlul parametrilor de cultură relevanţi. Înţelegerea naturii, a limitelor şi a posibilităţii
de control a acestei variabilităţi funcţionale a celulelor permit realizarea regenerării
organismelor vegetale dorite. O plantă vasculară regenerată, la maturitate, va conţine
câteva tipuri diferite de celule, care se vor grupa în ţesuturi; unele dintre aceste ţesuturi
vor conţine numai un anumit tip de celule, altele vor conţine mai multe tipuri de celule.
Celule de tip meristematic
Aceste celule sunt mici (cca. 20 µm), izodiametrice, caracterizate prin perete
celular subţire, nucleu mare, citoplasmă densă, vacuolă centrală, activitate metabolică
redusă, dar capacitate susţinută de diviziune. Datorită spaţiilor inter-celulare aproape
inexistente, a lipsei totale a structurilor vasculare -ceea ce asigură absenţa totală a
agenţilor patogeni- precum şi a potenţialului divizionar foarte ridicat (funcţia principală a
meristemului fiind mitoza) explantele de acest tip sunt cel mai mult folosite pentru
iniţierea culturilor in vitro
În corpul plantei, ţesuturile meristematice sunt localizate în zone specifice:
• zona meristemelor apicale, fiind punctele de creştere a rădăcinilor şi a tulpinilor • zona meristemelor secundare (mugurii laterali), situate la nivelul nodurilor, fiind
locul de iniţiere a ramificaţiilor • în cazul unor specii, zona circulară de ţesut, denumit cambiu, care se regăseşte în
tulpina matură
Cu timpul, celulele produse în meristem devin diferenţiate în unul sau altul din
următoarele tipuri de celule:
Celule de apărare
Celulele/ţesuturile de apărare acoperă suprafaţa frunzelor, tulpinilor şi a
rădăcinilor. Sunt alcătuite din celule plate, de obicei aşezate pe câte un singur rând,
numite epiderme. Acest tip de celule secretă la suprafaţa exterioară a ţesutului ceară,
dând naştere unui strat impermeabil, numit cuticulă. Datorită spaţiului închis şi a
umidităţii ridicate (90-98 %) din vasele de cultură, la ţesuturile crescute in vitro stratul de
cuticulă este practic inexistent. Acest aspect necesită obligatoriu o aclimatizare treptată,
la umidităţi controlate, care să favorizeze formarea stratului protector.
Fig. Tipuri de meristeme: apical, lateral, intercalar, florifer (Cutter, 1978)
Izolate, celulele epidermale sunt folosite ca model experimental în studiile de
“programare” a morfogenezei directe, fără o fază intermediară de calus. Cultivarea unui
fragment subţire de celule de mărime redusă (1mm x 5 sau 10 mm), constând din stratul
epidermal şi 3-6 straturi corticale de celule diferenţiate, permite într-o manieră unică,
monitorizarea proceselor morfogenice, prin intermediul unor markeri ai diferenţierii,
adică: (1) prin urmărirea la nivel celular din primele stadii de dezvoltare; (2) prin
Fig. Aspecte ale frunzei crescute in vitro: stânga sus (a)- suprafaţa foliară nu secretă ceară; dreapta sus (b)- secreţia tipică de ceară în condiţii de cultură in vivo;
imaginea de jos- structurile tipice unei frunze crescute in vitro: astrosclereidele sunt prezente numai în mezofilul marginal (Cutter, 1978)
controlul moleculelor specifice; (3) prin reprimarea inhibitorilor specifici anumitor căi
metabolice şi (4) prin regenerarea după adăugarea unor astfel de compuşi (Tran Thanh
Van şi Gendy, 1996).
Parenchimul
Celulele parenchimului sunt mari, prezentâd mai multe faţete ca rezultat al
acţiunii presiunii şi tensiunilor dintre celulele învecinate, devenind izodiametrice când
Fig. Programarea morfogenezei in vitro: stânga –regenerare muguri vegetativi primordii la 14 zile şi muguri complet formaţi după 5 săptămâni (Cătană, 1996) dreapta- muguri florali: regenerare directă pornind de la ţesut epitelial – primordii la 14 zile şi floare completă după 4 săptămâni (Tran Thanh van şi Gendy, 1996)
sunt izolate; prezintă pereţi subţiri şi vacuolă centrală mare, puţin specializate. De obicei
sunt separate între ele şi sunt pline cu plastide alături de care conţin cristale, taninuri,
uleiuri, amidon, grăunciori de aleuronă. În zonele care nu sunt expuse luminii (de
exemplu tulpinile subterane, tuberculi) în aceste celule predomină plastidele necolorate,
acumularea de substanţe de rezervă definind funcţia principală. Zonele expuse luminii (de
exemplu frunzele) conţin cloroplaste, funcţia principală fiind fotosinteza.
Ţesut relativ nespecializat, parenchimul prezintă un interes deosebit pentru
multiplicare deoarece, datorită versabilităţii, celulele sale îşi coservă foarte bine
potenţialul de redobândire a activităţilor de tip meristematic. Chiar şi în multiplicarea
clasică, în fasonarea butaşilor, se utilizează zone cu ţesut parenchimatic, capabile să
dezvolte primordii radiculare şi caulinare. Cel mai bun exemplu al capacităţii
regenerative a ţesutului parenchimatic, izolat de condiţiile normale, îl reprezintă obţinerea
unei plante de morcov complet formată şi funcţională, pornindu-se din celule
parenchimatice din floemul secundar radicular, cultivate pe mediu lichid suplimentat cu
extract de nucă de cocos (Steward,1970) .
Colenchimul
Celulele colenchimului (lungi de maximum 2 mm) sunt înconjurate de un perete
celulozic subţire, mai ales la colţuri, ceea ce le conferă un anumit grad de plasticitate şi
capacitate de extinţie. Datorită conţinutului mare de pectină (45% la Petasites sp., Cutter,
1978), hemiceluloză (35%, la Petasites sp., Cutter, 1978) şi celuloză (20% la Petasites
sp., Cutter, 1978), aceste celule asigură suportul mecanic al plantei, găsindu-se mai ales
în zonele organelor aflate în creştere (de exemplu, peţiolul frunzelor este întărit de
prezenţa celulelor de tip colenchimatic). Pot conţine plastide şi pot chiar manifesta
activitate fotosintetică.
Sclerenchimul
Sunt celule cu funcţie de suport mecanic, prezente în seminţe, tulpini şi în
alcătuirea ţesutului vascular din frunze. Peretele celular este foarte gros fiind puternic
lignificat şi dispus într-un strat uniform pe toată marginea celulei. Aceste ţesuturi nu pot
genera protoplaşti viabili, deoarece conţinutul viu al celulei moare imediat după
încheierea sintezei peretelui.
Xilemul
Xilemul conduce apa şi mineralele dizolvate (ioni anorganici), de la nivelul
rădăcinilor în tot restul corpului plantei. Xilemul se formează din celule individuale
aşezate cap la cap sub forma unor tuburi cu diametrul mediu de 0,7 mm, având un aspect
tipic de panglică sau spirală. La maturitate, peretele celular din capetele acestor celule se
dizolvă, peretele secundar se îngroaşă prin depunerea suplimentară de celuloză şi
impreganare cu lignină în timp ce conţinutul citoplasmatic moare, rezultând astfel un
sistem conducător continuu. Acest tip de celule trebuie evitat la iniţierea culturilor in
vitro deoarece reprezintă o posibilă sursă de rezervă de agenţi patogeni endogeni care
supracontaminează explantul.
Floem
Componentele de bază ale floemului sunt:
• elementele sită şi • celulele gardă .
Elementele sită se numesc aşa datorită pereţilor perforaţi care permit legături
citoplasmatice pe plan vertical, între celule. Rezultatul acestor structuri îl reprezintă tubul
perforat care conduce produşii fotosintezei – zaharuri şi amino acizi- din locul de sinteză
(de la sursă) de exemplu din frunză, spre locul de consum sau depozitare cum sunt de
exemplu rădăcinile, vârfurile de creştere a tulpinilor sau a frunzelor, flori, fruct, tuberculi,
etc.
Aceste celule nu mai conţin nucleu ci doar câteva organite celulare, fiind astfel,
pentru multe funcţii, dependente de celulele gardă.
Cu toate că sunt active metabolic, datorită pierderii citoplasmei şi a nucleului,
aceste două tipuri de celule nu sunt folosite ca materiale de iniţiere a unei culturi de
celule. Prezenţa lor într-o cultură de calus sau în agregatele celulare este importantă
deoarece este semnul iniţierii rediferenţierii (organogenezei).
Tipuri de creştere utilizate în culturile in vitro
Tehnicile şi metodele de cultură in vitro permit obţinerea a două tipuri de creştere:
creşterea materialului vegetal în formă organizată (celule, ţesuturi specializate şi organe)
şi respectiv, creşterea materialului vegetal în formă neorganizată (calus, suspensii
celulare).
Pentru scopurile de multiplicare in vitro sunt folosite atât creşterea organizată cât
şi cea neorganizată.
Fig. Diferenţierea xilemului în calus-primul indiciu al reorganizării ţesutului in vitro (Cătană, 1996) xilem tipic (Cutter, 1978)
![5 LP Neuroviroze 2013 GRUP[1]](https://static.documente.net/doc/80x56/55cf9cdb550346d033ab4bcc/5-lp-neuroviroze-2013-grup1.jpg)
