'i r:l\

Curs 1

GENETICA _ STIINTA EREDITATII $I VARIABILITATII

1. DEFINITII1.1. EREDITATEAEreditatea este capacitatea unui individ de a transmite descendenlilor sdi

caracterele personale gi ale speciei din care provine. Astfel se realizeazd similitudineabiologicd dintre pdrinli gi copii.

farinlii ng trunr*it "opiilo. caractere,

ci informafiile necesare pentru rcalizarealot,confinute in genele din gamefi. in acest context ereditatea este un proces informa|ionalcare presupune stocarea, expresia qi transmiterea informaliei ereditare pentru formareacaracterelor unui individ.

Substratul molecular al ereditdyii esteindeplineqte trei funclii majore:

acidul dezoxiribonucleic (ADN) care

o ADN-ul deline informalia geneticdunui organism. Unitatea de informalie ereditarddetermind un caracter (,,o geni --+ un caracter").

o ADN-ul exprimd informalia geneticd prin sinteza unor proteine specificecare determind caracterele organismului (,,o gen6 ---+ o proteind --- un caracter")'

o ADN-ul transmite informalia geneticd in succesiunea generafiilor de celuleprin replicare semiconservativd (dublarea materialului genetic) Si diviziune celulard(distribuireaegald a moleculelor de ADN).

Genomul uman reprezintd totalitatea informaliei genetice din celulele umane qieste alcdtuit dintr-un genom nuclear si un genom mitocondrial.

Nucleul este componenta esenlial[ a aparatului genetic al celulei care prezintd ostructurd diferitd in funilie de etapele ciclului celular. in nucleul interfazic ADN-ul 9iproteinele formeazd cromatina, iar in diviziune, cromatina se condenseazd qi formeazd'cromozomii.

Cromozomii reprezintd substratul morfologic al eredit6{ii. ei sunt elementeconstante ale nucleului, dar sunt vizibili numai in timpul diviziunii. Numdrul si forma lorsunt elemente caracteristice fiecdrei specii. La om, in celulele somatice, sunt 46 decromozomi (2n : numdr diploid de cromozomi) - genom diploid, iar in gamefi, numdrulde cromozomi este redus la jumdtate 23 de cromozomi (n : numdr haploid decromozomi)

-

genom haPloid.

1.2. VARIABILITATEAVariabilitatea cuprinde fenomenele care produc diferenlele genetice dintre indivizii

unei populalii precum gi dintre populalii diferite. Principalele surse de variabilitategenetici sunt: iutayiile, recombindrile genetice Si migrafiile. Datotitd acestor procesefiecare individ are o structurd unicd'

pentru rcalizarea caracterelor specifi ceeste gena, un segment de ADN care

2. GENETICA UMANA: DISCIPLINA FUNDAMENTALAOCLNICA $I MEDTCO-SOCIALA

Genetica umana este o gtiin!6 fundamentald qi aplicativd cu rol major in practicamedicali.

Genetica umand este o disciplind fundamentald deoarcce studiazd structurile,mecanismele gi legile de bazb ale stocdrii, transmiterii gi expresiei informafiei ereditarenecesare dezvoltdrii qi funclion[rii organismului uman.

Genetica umand este o disciplind clinicd pentru c[ studiaz[ rela{ia dintre ereditate 9iboald, adicd rolul mutaliilor in producerea sau predispozilia bolilor, care se regdsesc inaproape toate specialitdfile medicale. Genetica medicald este o specialitate clinicddistinit6, care se ocupd de diagnosticul gi tratamentul bolilor genetice, dar qi de sfatulgenetic, diagnosticul prenatal sau presimptomatic gi screeningul neonatal.

Geneticq ,*oid este o disciplind medico-sociald deoarece numeroasele boligenetice au devenit o problemd de sdndtate public[. Datorit[ caracterului lor cronic 9iinvalidant, bolile genetice influenfeazd negativ morbiditatea gi mortalitatea infantili, deunde rezult[ necesitatea unui program de prevenire Si depistare precoce a bolilotgenetice.

3. TNDIVIDUALITATEA GENETICA SI BIOLOGICA3. 1 INDIVIDUALITATEA GENETICAFiecare organism uman se formeazd dintr-o celulI iniliald (zigotul), ca rezultat al

fecunddrii gamelilor haploizi (n). La zigot se reface numdrul diploid (2n) de 46 decromozomi, caracteristic speciei umane gi se stabilegte sexul genetic: XX sau XY. Astfelse formeazd,23 perechi de cromozomi omologi. Acegtia sunt similari cam[rime, formigi confinut genetic, dar sunt diferili ca origine ( unul matern gi celdlalt patern). PrinurTnare fiecare caracter este determinat de o pereche de gene alele, care ocupd aceeaqipozilie (locus) in cromozomii omologi.

Zigotul reunegte in nucleu genele parentale din gamefi intr-o combinafie nou6,unicd giionstantd denumitd individualitate genetici sau genotipl.

Citoplasma zigotului este exclusiv de origine matern[. Deci, ADN-ul mitocondrialal zigotului gi al celulelor somatice din viitorul organism provine din ADN-ulmitocondrial matern. Informafia geneticd din ADN mitocondrial se numegte plasmotip 9ieste responsabil de ereditatea citoplasmaticd.

Cromozomii zigotului conjin informaJia ereditard necesard formdrii caracterelorprecum gi a programului genetic al dezvoltdrii ontogenetice.

3.2 INDIVIDUALITATEA BIOLOGICAFiecare individ este unic atdt prin structura sa genetici cdt gi prin mediul in care s-a

dezvoltat ?n timp. Cele doud ,,for!e" cate participd la formarea caracterelor secondilioneazd reciproc. Ereditatea determind un potenlial pentru formarea unor caractere,care se fnalizeazdvariat, in funcfie de condiliile specifice din mediul socio - economic aicultural in care se dezvolti organismul.

I Prin genotip inlelegem totalitate genelor unui organism

Ansamblul unic de caractere specifice produse prin interacliunea permanent[, dar inproporlii diferite, dintre ereditate gi mediu se numegte individuatitate biologici saufenotip2.

3.3 DETERMINISMUL CARACTERELOR FENOTIPICEin funclie de ponderea celor 2 faclori cauzali ereditate si mediu, se deosebesc 3

categorii de caractere umane:1. caractere fenotipice pur ereditare;2. caractere fenotipice multifactoriale;3 . caractere fenotipice neereditare.

l. caractere fenotipice pur ereditare - sunt determinate exclusiv de structurag"n"tffiuiindivid,decidec6tregenotip.Existd3categorii:

un set fix si cqracteristic de cromozomi cu o anumitl morfologie. Aceastd configurafiesp ecifi cd r ealizeazd o,,b ari er6" repro ductivd intre speci i'Y Caractere ereditare normale- sunt determinate monogenic ai transmise mendelian.

Majoritatea sunt polimorfice, se g[sesc in mai multe variante in populafie, dar unindivid prezintd doar b variantd. De exemplu un individ are numai una din grupelesanguine A, B, AB sau O pentru sistemul grupal ABO'

Studiul caracterelor ereditare normale arc atdt o importanld teoretici in vederealocaliz1rir genelor pe cromozomi, dar mai ales o valoare practicd in identificirile depersoane, Jxpertiza^paternitillii, in transfuzii qi transplant, in diagnosticul diferenlial intre

iemenii monozigoli si cei dizigoli gi in identificarea persoanelor cu predispozi[ie laimbolnaviri.

Y Caractere ereditare anormale - sunt produse de mutafii 9i reprezentate de bolileuomozomiale, bolile monogenice 9i bolile mitocondriale'

2. caractere fenotipice multifactoriale - produse de interacfiunea, in proporliidiferite, dintre ereditate gi mediu. Existd 2 categorii:

Sunt determinate de interacliunea variabild dintre ereditate 9i mediu qi suntrcprezentate de indllime, greutate, tensiune artetialil, inteligenla, etc'

- Ereditatea determind o parte din caracter, denumitd heritabilitate, precum 9ilimita superioard sau potenlialul genetic pdnd la care poate fi dezvoltat aceloaracter,in cele mai favorabile condifii de mediu'Mediul determind cealaltb parte din caracter qi permite sau nu realizarcapotenfialului genetic individual'

De exemplu talia este condilionati genetic, pentru c6 ltecare individ me o ,,limit[ superioard"determinatd genetic de talia pdrinfilor, pe care nu o ioate dep5gi. Dar atingerea acestei limite depinde destilul de viali al individului. (este sportiv sau sedentar)'

2 Prin fenotip inlele gem totalitatea caracterelor unui organism

izolate si de bolile comune ale adultului cu predispozifie geneticd, numite qi bolimultifactoriale.Factorii genetici (reprezentafi, de obicei, prin mai multe gene ) rcalizeazdo predispozifie genetici, dar nu tofi indivizii se imbolndvesc, deoarece este necesard qiintervenfia factorilor de mediu.

3.caractere fenotipice neereditare -

sunt determinate de mediul extern: factori fizici,chimici sau biologici care produc deseori imbolndviri. Efectele agresiunilor externeasupra organismului uman sunt influenlate si de structura geneticd specificd fiecdreipersoane. Genotipul individual determind o eficienld diferitd a mecanismelor de apdtateimund sau de metabolizare a unor substanfe, deci un mod specific de rdspuns la ac{iuneafactorilor externi, influenldnd aparigia si gravitatea imbolndvirilor. Datorit[ acesteiinfluen{e genetice, unii autori consider[ cd nu existd caractere pur ecologice.

4. SCURT ISTORIC AL GENETICil UMANEGenetica igi are inceputurile in secolul XD! cdnd in 1865, Gregor Mendel a descoperit legile

ereditdlii, studiind mazilre4 orealizare care a fost fecuti cu vederea pAna in 1900, cdnd a fostredescoperit.

in tgAZ Walther Flemming avinnlizatprimul cromozomii umani in celulele tumorale giapoi ?q 1888 Waldeyer a introdus termenul de cromozom.

in anii 80, Roux, de Vrie gi Weismann au lansat ipoteza prezen{ei in cromozomi aidetenninantilor eredit6fii gi ontogenezei, iar in 1903, Walter Sutton gi Theodor Boveri au propusteoria cromozomiald a mendelismului.

in acelagi deceniu, conceptul de,,erori inndscute de metabolism" a fost introdus de ArchibaldGarod in 1909, prin propunerea oficiald la conferinfele sale Croonian, unde se discuta desprealkaptonurie, pentosurie, cistinurie gi albinism.

in urmdtoarea jumdtate de secol, Genetica s-a dezvoltat ca o gtiin{6 fundamentalE" in principalprin studii experimentale pe Drosofila, cobai qi porumb, iar studiile umane erau bazate pebiostatisticd gi analize matematice populafionale. Cu toate acestea modelul mendelian ereditar afost descris in numeroase afecfiuni precum albinism, brahidactilia gi simfalangism.

ln aceasta perioadb, conceptul de ,,eugenie" a evolua! rezult6nd dintr-o incercare a societiliide a imbun[dfii fondul genetic gi de a prevenii transmiterea unor gene ,,rele" in urmdtoarelegeneraf;i. Atunci au avut loc anumite practici eugenice in toatd lume4 precum tnterzicmeapersoanelor cu deficienli mentald sau cu malformafii fizice de a se reproduce gi de sterilizare fo{atd.Migcarea eugenicd a culminat cu justificarea holocaustului nazist, dar dupd cel de-al doilea r5z;lrrlimondial eugeni4 ca puls a geneticii umane a dznt in dizgntii.

O abordare $iintificd a geneticii umane a inceput in 1948, odatd cu infiinfarea Societ6liiAmericane de Geneticd Umand (ASHG), dar majoritatea membrilor consiliului de adminisbaliefondator erau fogtii membrii ai SocietElii Americane de Eugenie. Pu{in medici erau interesafi degenetica umand, majoritatea fiind doctoranzi cu preocup[ri legate de genetica popula{iilor sau destudii pe drosofila gi cobai. inra o mare parte dintre acegtia au inceput sA studieze modul defansmitere a bolilor monogenice la om, au descris numeroase sindroame gi malformaliicongenitale, unii devenind clinicieni foarte buni.

F. Clarke Fraser a fost primul care a descris termenul de ,,heterogenitate geneticff', cdnd ademonstat in 1956, cd dou6 cazlur:. similare din punct de vedere clinic sunt genetic diferite.

inceputul citogeneticii umane modeme este marcat de dezvoltarea tehnicilor de culturi

!'[

celulare, de posibilitatea folosirii din sdngele periferic a limfocitelor stimulate s[ intue ?n diviziune,apoi oprirea diviziunilor int-o anumit6 etapd gi diverse tehnici de colorare

in afar[ de descoperirea numdrului corect de 46 de cromozomi din 1956, cele mai multeanomalii cromozomiale erau descrise la copiii cu malformafli din departamentele de pediatrie.Prima descoperire a fost in 1959 a lui l,ejeune, care a constatat prezentp"in plus a unui cromozom21 ?n sindromul Down. Imediat au fost descrise gi anomalii ale cromozomilor sexuali, ca 45, X insindromul Tumer sau 47,)O(Y in sindromul Klinefelter. Nu mult dupd aaffi4- s-au descoperit qi altetrisomii autozomale (fisomia 13 gi 18) sau mozaicurile XYD(O la sexul masculin cupseudohermafroditism gi )O(XO lapacientele cu sindrom Turner gi cu celule X cromatin pozitive.

Dup[ descoperirea metodelor de bandare a cromozomilor din 1969 gi l97l a fost posibilddescrierea mult mai precisd a anomaliilor cromozomiale, in special a celor sfructurale. RoySchmickel a fost cel care a introdus conceptul de sindroame de,delef;e a genelor contigue".

Bandarea G este c,eamuutilizathmetodi de bandare a cromozomilor din s6nge sau fesuturi,?nca din anii 1970. Dn 1977 s-a introdus bandarea cu rezolulie inaltda care a imbundtd{it delimitareamicrodeleliilor din tumorile solide, cum ar fii tumora Wlms, sau retinoblastomul.

La inceputul anilor 1980, apar noi tehnologii de diagnostic molecular cme descriu gi mai binedezechilibrele cromozomiale. TJtilizare.a sondelor fluorescente ftibridizarea in situ cu sondefluorescente) are ca scop identificarea exac6 a cromozomilor sau a unor par{i ale acestor4 precurngi in cartografierea genelor.

O vmiantd a acestei metode este hibridizarea genomicd comparativS, capabild sd identificemici delefii gi duplicafii, cu aplicafii importantein studiul modificdrilordin celulele tumorale.

ln plus au apdrut tehnici de identificare multicolord a cromozomilor, astfel ?ncdt printr-unsingur studiu fluorescent pot fi identificate anomalii multiple, inclusiv cele care implicd tanslocatii,importante penffu descrierea anomaliilor cromozomiale complexe din celulele maligne.

Rezultate gi mai bune sunt obfnute prin hibridizarea ADN sau ARN folosind tehnicamicroarray care a dus la descoperirea expresiei unor gene specifice in celulele maligne.

Una din cele mai importante aplicalii ale tehnicilor de citogeneticd clasicd qi moleculard estein diagnosticul prenatal, cu depistarea timpurie a anomaliilor cromozomiale.

Genetica biochimicd dateazd de la inceputul secolului XX, cend Garod introduce termenul de,,erori inndscute de metabolism", in timp ce descoperea deficienfa de glucozo 6 fosf*aza lnglicogenoza trp 1 Si de fenil alanin hidroxilaza in fenilcetonurie. A urmat descrierea bolilorhzozomalein 1960. Odati cu dentoltareametodelor de electroforezd gi cromatografie a proteinelorgi detectarea enzimelor, s-au elucidat rapid multe dinfe deficientele enzimatice, ale aminoacizilor giacizilor organici, inte anii 1960-1970.

Primele teste serologice au fost efectuate in 1901, cend Landsteiner a descris grupelesanguine ABO iarin 1940 Levine gi Weiner au descris sistemul Rh.

Imunogenetica se dezvolt}, odaIL cu studiile pe culturi de limfocite a rdspunsului limfocitar,care impreund cu inlelegerea geneticii sistemului HLA au dus la progrese semnificative inlansplant. Apoi genotiparea HLA a fost utilizatd ca test de diagnostic in spondilita ankilopoieticd qide predispozilie a afecflunilor autoimune, precum diabetul zalnratttp I.

Anul 2003 a marcat aniversarea a 50 de ani de cdnd Watson gi Crick au descris sfucturaADN. Aceastd jumdtate de secol a fost martoml evolufiei rapide din genetica molecular5" care aculminat tn 2003 cu secvenlierea totald a genomului uman. Cdteva dintre repere din aceastdperioad6 sunt descrierea codului genetic 1966, de c6tre Nirenberg descoperirea enzimelor deresticJie qi utilizarea lor in cartografiere in 1970, inventarea metodei Southem blot ?n 1875, primaclonare a genelor umane in 1977, descrierea polimorfismului lungimii fiagmmtelor de resticlie qi

L7

gtilitatea lor in cartografierea genelor din 1980 gi inventarea reacliei de polimerizare in lan! PCR decefiMullis?n 1986.

Sfatul genetic a fost inifial rcalizatinfamilii cu istoric pozitiv pentru o anumiti boald geneticdqi apoi u-u

"rtinr la nivel populafional printr-o multitudine de programe de screening, care pot

prevenii naqterea unui copil cu tulburdri genetice sau permit un tratament precoce. Odati cu^inventarea

testului de inhib-area bacteriilor de cdtre Guthrie pe sdngele recoltat pe hdrtie de filtru, aap6d gi primul program de screening al PKU la nou niscuti, im dieta terapeutica a fost descoperitide Hans bi.k"l in Germania La scurt timp progamul de screening pentru PKU s-a extins in toatestatele gi s-au add|lgatgi altele, cum ar fi pentru galactozemie, hipotiroidism 9i hemoglobinopatii.

O metod[ importantd de prevenire a bolilor genetice este diagnosticul prenatal, care a fostsugerat prima dat6 be cdte Fuchs in 1956 folosind testul cromatinei sexuale pe amniocite. Apoiatitiocitet" au putu fi cultivate qi folosite pentru teste citogenetice, biochimice gi moleculare. Inultimul deceniu, prelevarea de vilozitili coriale in primul trimestru a cagtigat in popularitate, penfucd deciziile de terminare a smcinii erau luate inainte de migcmile fetale. Apoi au urmat studii pecelule fetale din sdngele matem.

O dezvoltare interesant[ a fost in domeniul de diagnostic preimplantare. Acesta a devenitobignuit odati cu feftilizareain vito. Una sau doud celule sunt scoase dintr-un embrion cu 8 celulep"nto a fi studiate prin detecf,a mutaliilor unor boli moleculare, sau a muta{iilor cromozomialecomune prin FISH. Principalele dezavanlaje zunt incapacitatea de a observa alte anomaliicromozomiale gi intArzierea implanGrii ?n aEeptarea rezultatelor. Prin aplicarea CGH se poateob,Lne un cariotip complet al celulei. Ba mai mult prin combinarea a doui teste, CGH qi micro-arrays, se pot detecta gi cele mai mici delefi.

-

a"ti"t genetica a devenit o specialiate medicalS distincta cu mai multe ramuri qi cu unimportant impact in societate.

Cr

z ol>

Curs 2STRUCTT]RA $I ORGANIZAREA CELULARA A ADN

1. ADN - STIBSTRATTIL MOLECULAR AL EREDTTATII . ,in anul 1865, MENDEL a formulat iporeza genei potrivit cdreia fiecare caracter estedeterminat de "o pereche de factori ereditari, gi a stibilit legile eredit[fii.La inceputul secolului XX, in urma demonstrdrii rolului cromozomilor in ereditate, s-a stabilit cd' gena reyrTinld un segment dintr-un cromozom, care determind un caracterspecific, dar natura ei chimicd pi structura rdmdneau necunoscute.In 1940, s-a stabilit cd in structura cromozomilor existd proteine si acizi nucleici,ADN 9i ARN' Mulli cercetdtori credeau atunci cd genele sunt formate din proteine, cele maicomplexe substanle chimice din celule. ADN-ul era considerat o moleculd prea simpld pentruinmagazinatea informaliei ereditare gi transmiterea ei in succesiunea generafiilor. Existautotugi nnele argumente "indirecte" care pledau pentru rolul genetic al abN-ului: localizarea

aproape exclusivd a ADN-uluiin nucleu si uomozomi, structuri cu rol important in ereditate;cantitatea sa constantd si caracteristicd speciei, propor,tionald

"u n

-a*l cromozomilor qistabilitatea metabolicd amoleculei de ADN.in 1944, Avery et al' au demonstrat experimental cd ADN-ul este substratul molecular alereditafi' Faptul cd' transferut ADN de la un microorganism la altul produce transJbrmdripermanente si ereditare ale primitorului a constituit dovada decisiv6 c6 genele sunt alcdtuitedin ADN.

z.DOVF,ZI EXPERIMENTALE PRIVIND ROLUL ADN iN EREDITATEDemonstrarea rolului genetic al ADNului s-a realizat in decursul timfului prin mai

multe experimenfe:rn 7928, microbiologul englez Griffith a fbcut o observafie remarcabila. El a studiat

morfologia 9i patogenitatea diferitelor tulpini de pneumococus. Unele tulpini aveau o capsul[polizahaidicd qi cultivate pe agar formau colonii "netede", fiind numit. S G ln ,,smooth,) iaraltele erau necapsulate qi formau colonii "rugoase", fiind numite R (de tu,;ioi[n,1. Griffith aobservat cd qoarecii .injectafi cu pneumococi S au murit iar cei inyectali

"i tutpinu R uu:lljlIi"Pit' Patogenitatea pneumococilor S, deteminatd de prezenla capsulei, se transmiteeredttar' In mod surprinzdtor, un amestec de pneumococi R lnepatogeni; vii gi ineumococi S(patogeni) inactivali prin cd.ldurd, a avut un efect letal. De la animalele moarte s-au izolatpneumococi S vll' Explicalia posibild a acestui fenomen era transformarea fulpinilor depneumococi R vii in tulpini S vii, sub influenfa unor componente din structura fneumococilorS omor6li;natura^chimicd a substanfei care aprodus transibrmarea nu a putut fi insd stabilitd.In 1944, Avery et all. au reluat experienlele lui Griffith qi au de;onstrat experimentalcd' ADN-ul este factorul nansformant. Aitorii au ardtat cd transferul ADN-alui extras de la otulpind de pneumococi S capsulafi, patogeni, la pneumo.o"i R necapsulafi, nepatogeni,determind transformarea lor in pneumococi patogeni (R

-) S); iar odatd" produsd"modificarea se transmite la generafiile urmdtoarg ginA deci ereditard. pe aceas td, baz| s-apresupus cd, ADN-ul este materialul genetic.Aqa cum se intdmpld adesea cu marile adevdruri, rolul genetic al ADN demonstrat deAvery et al. a fost insd un timp negat.

(,?

in 1952, Hershey qi Chase (Premiul Nobel, 1969) au demonstr at cd, transferul exclusiv alADN de la bacteriofagi la Escherichia coli transform[ aceastd bacterie in celule producdtoarede particule fagice, cu o structurd completd, inclusiv capsula proteicd. Autorii au marcatp-roteinele capsulare ale bacteriofagilor cu sulf radioactiv ("S) iui ADN cu fosfor radioactivC5P). Cend bacteria E. coli a fost infectatd cu bacteriofagi "marca!i", se observd cd numai 35p(deci ADN-ul) pdtrunde in celuld (32S - proteinele capsulare rdm6n la exterior). Formareaulterioard a unor particule fagice noi, complete, demonstieazd clar cd ADN era unicul purtdtoral informafiei ereditare.

. _

Demonstrarea faptului c6, transferul ADN de la un microorganism la altul producetransformdri permanente gi ereditare ale primitorului a constituit d&ada decisivd ci genelesunt alcdtuite din ADN.

3. STRUCT{'RA ADNDescoperirea rolului genetic al ADN a concentrat atenlia cercetdtorilor asupra structurii

sale, intruc6t descifrarea ei reprezenta singura cale pentru fnyelegerea naturii Sifuicyiei genei.

2.1. STRUCTURA PRIMARA A ADNADN-ul este un macropolimer de "dezoxiribonucleotide'i Lungimea qi greutatea

moleculard foarte mari permit.stocarea unei cantitdli uriage de informafie.-Cantitatea de ADNvanazd' de la specie la speciet, d* este constantdlaindivizii aceleiaqi specii, precum qi intoate celuiele somatice (diploide) de la acelagi individ.

Unitatea structurald a ADN este dezoxiribonucleotidul, alcdtuit din trei elementedistincte: un glucid cu cinci atomi de carbon (o pentozd) , o bazd azotatd qi o grupare

-fosfat -unite prin legdturi covalente,puternice. (figura 1).P e nto z a este reprezentatd de D -2-dezoxiiboza.Baza azotatd poate fi purinicd - adenina (A), guanind (G) - sau pirimidinic[ - timino (T),

citozina (c); se leagd,la c1' al deoxiribozei, alcdtuind impreund un nucleozid.Gruparea fosfat, care provine din acidul ortofosforic se leagd la C5' aI dezoxiibozei,

formdnd cu aceasta qibaza azotatd,un nucleotid, unitatea fundamentald a structurii catenei deADN.itt ADN, exisld patru tipuri de dezoxiribonucleotide - acid dezoxiadenilic,

dezoxiguanilic, dezoxicitidilic, dezoxitimidilic - care se vor deosebi numai pinbaza azotatd;gruparea fosfat gi deoxiribo za srrfi elemente constante.

Polimerizarea nucleotidelor, in molecula de ADN, se realizeazri prin legituri covalente3'- 5' fosfodiester, foryatg intre gruparea OH a C3 al dezoxiibozei unui nircleotid gi restglfosfat fixat la C5 al nucleotidului urmdtor. Se formeazd astfel o catend continud,lineard, carereprezinti' structura primari a ADN. Aceastd catend prezintd o parte "constantd,,,fosfoglucidicd, ce formeaz1, axul catenei, qi o parte "variab ild", rcprezentatd de bazele azotate,,care se frxeazd, perpendicular qi lateral pe "coloana vertebrald" fosfoglucidicd (bazele azotatede pe aceeagi catend nu se leagd intre ele) (figura2).- In catena de ADN pozigia unui nucleotid nu impune cu necesitate in vecindtatea sa

prezenla unui alt nucleotid; poziliile adiacente pot fi ocupate de oricare din cele patru tipuri denucleotide. Acest lucru este esenlial deoarece secvenfa nucleotidelor in lungul catenei de ADNreptezintd, informafia geneticl codificati, pebaza cdreia se stabileqt" ordirro aminoacizilor

c,.,

' lu or g.rn.:3,5 xl0r2 daltoni

tn proteine. Sensul de "citire" al informaliei genetice este determinat de polaritatea 5' -) 3' a

catenei de ADN; poziliile 5'-fosfat a primului nucleotid qi 3'-hidroxil a ultimului nucleotid alcatenei srtnt libere, neangajate intr-o legdturd chimicS. Orice secvenld de nucleotide se"citeqte" in direclia 5'-+ 3' gi se scrie cu capdtul 5'la st6nga, de ex. 5'-ATGCCTAGATCA-3'.Fiecare catend a ADN este deci o secvenld orientatd,definita prin inldnfuirea nucleotidelor.

2.2.STRUCTURA SECTINDARA E APNin elaborarea modelului structurii ADN-ului, WATSON gi CRICK s-aubazatpe studiile

difracliei cu raze X a moleculelor de ADN (M. Wilkins, R. Franklin) precum gi pe analizelechimice ale ADN (Chargraaf).

Prelucrdnd aceste date, Watson qi Crick au propus un model al moleculei de ADNalcdtuit din doui catene polinucleotidice, legate intre ele prin bazele azotate, in modcomplementar (figxa 3) gi infrqurate plectonemic pentru aforma o dubld spirald elicoidald (oelice dubl[) orientatd spre dreapta, cu diametrul de 20 A qi pasul elicei de 34 A (figura 3).Pomind de la faptul cd raportul NT : GIC:1, Watson gi Crick considerd cd in molecula deADN se produce o imperechere "preferenliald" abazelor care unesc cele dou6 catene; bazeleazotate (situate spre interiorul moleculei) se leagd complementar: o bazd,purinicd se unegtecuobazdpirimidinicdsau, mai exact A

-T $i G- C formdnd opereche debaze,prescurtatpb' Leg[turile se realizeazd,prinpunli de hidrogen,legdturi electrostatice slabe. in felul acestasecvenla nucleotidelor unei catene determind cu necesitate secvenfa nucleotidelor celeilaltecatene. Deci, cele doud catene ale ADN nu sunt identice, ci complementare Si strictcodeterminate. Cunoagterea secvenlei nucleotidice a unei catene va permite automatdeterminarea secvenlei nucleotidice a celeilalte catene. De exemplu:

5'-ATGCCAG-3'3'-TACGGTC-5'.

Legea complementaritlfii bazelor stl.labaza mecanismelor prin care se realizeazd,funcliile genetice ale ADN: transcripfia, replicarea, repatarealeziunilor, recombinarea.

Libettatea de aqezare a nucleotidelor in lungul catenelor de ADN ( pe verticald) seasociazd'cu necesitatea dispoziliei lor complementare (in planul orizontal al moleculei).

Legdturile stereochimice / spafiale necesare pentru imperecherea corectd dintre A-T giG-C fac ca orientarea (polaritatea) celor doud catene sd se dirijeze fn sensuri opuse,deci, sd fieantiparalele. Acest lucru are consecinle importante in "citirea" informaliei in procesul sintezeiproteice, precum gi in mecanismul replicdrii (sintezei unor noi molecule de ADN).

Cele dou5" catene ale ADN se infbqoard,plectonemic (unain jurul alteiaqi amdndoudin jurul unui ax central, imaginar al moleculei, formdnd o dubld spirald elicoidald coaxiald(o elice dubld), orientatd. spre dreapta (dextrogir) (figura). Ea poate fi comparata cu o "scardin spirald" in care axele fosfoglucidice formeazd marginile scdrii iar perechile de baze,treptele ei. Aceastl structurd, asociatd funcliilor majore pe care le indeplineqte ADN, a fostplastic numitd "eliceq vielii", fiind un veritabil simbol al lumii vii.

Structura ADN este, in ansamblul ei, perfect regulatd, ordonat5: diametrul moleculei 2nm;-o turd completd are 3600; pasul elicei i,4 *np.nttit. dispunerea a 10 perechi de baze(figura). ln configuralia ei spafialb, molecula de ADN prezintd doud San[uri laterale: unulmai mic $i altul mai mare. Ele sunt importante in recunoasterea stereochimica qi fixarea peADN a histonelor (la nivelul qanfului mici) sau a unor molecule proteice reglatoare (la nivelulganfului mare), singrrrul loc in care bazele sunt accesibile acestor proteine care vor reglafuncfiile ADN-ului.

in condilii fiziologice, molecula de ADN are o mare stabilitate metabolicd. datoritdlegdturilor fizico-chimice dintre elementele unei catene precum qi dintre cele doud catene 2.Ele sunt strdns legate una de alta qi de obicei nu se pot separa. Aceastd stabilitate este ocondilie obligatorie pe care trebuie sd o indeplineascd substratul material al ereditalii. Totugi,sub acliunea unor enzime cele doud catene ale ADN se pot desface par{ial, pe segmentelimitate, pi fi.urclioneazd ca "matri16" pentru sinteza unor molecule noi, complementare(ARNm in procesul de transcriplie, sau o altd catend ADN, in cursul replicdrii).

4. DENATT'RAREA $I HIBRIDIZAREA ADNin condilii experimentale se pot desface legdturile de hidrogen dintre cele doui catene,

prin denaturare termicd (incdlzire la 63-100'C) sau chimicd (tratament cu alcali etc.) (figura2.6). Acest proces de conversie a ADN de la forma bicatenard la starea monocatenard senumeqte denafurare. Prin rdcirea lentd a solufiei, monocatenele de ADN se pot reasocia pebaza complementaritdlii gi refac structura originalS; procesul se numegte renaturare sauhibridizare. Prin rdcire brusci monocatenele ADN rdmdn separate gi pot fi folosite pentrurealizarea unor hibrizi moleculari (pe baza complementaritdlii dintre catene ) de tip ADN-ADN, fie intre doud molecule de ADN de la specii diferite, fie intre fragmente de ADNobfinute artificial ("sonde", ce corespund unei gene) gi regiunea corespunzdtoare,complementard din ADN nativ. Se pot obline de asemeni hibrizi intre o catend ADN qi omoleculd de ARN complementara (de tip ARNm) rezultdnd un heteroduplex. Fenomenele dedenaturare gi hibridare srmt amplu utilizate in biologia moleculard, in tehnicile ADNrecombinant, pentru identificarea sau localizarca unor gene gi, mai recent, in terapia cuoligonucleotide antisens (?n cancere, SIDA) care se fixezdpe secvenle de ADN sau pe ARNmqi blocheazd expresia genelor.

5. POLIMORFISMUL STRUCTURAL AL MOLECULEI DE ADNForma clasicd a structurii ADN, descrisd de Watson gi Crick, corespunde conforma{iei

de tip B, care se rcalizeazd frecvent "in vivo" (in condilii de umiditate crescutd gi concentrafieionicd joasd). S-au descris ins6 gi alte conforma{ii sau isoforme: A Si C, mai frecvente, D qi E,mai rare. Ele au acelasi plan general de structurd: elice dubld orientatd spre dreapta dar sedeosebesc de tipul B printr-o serie de particularitdli frzice (inclinarea bazelor fald de ax,modificarea pasului elicei gi numdrul de baze per turd elice): forma A este mai scurtd Si maigroasd,'iar celelalte mai lungi Si mai subyiri.In organism, in anumite regiuni ale moleculei de ADN (cu o anumitd secven!6 nucleotidici) seproduc frecvent modificdri (tranzilii) conformalionale A

existd "in vivo" gi apare, in anumite condilii fizico-chimice, in regiunile bogate in perechi debaze G-c,prin conversia formei P3; tranzilia B z este reversibild.

ADN-Z intervine foarte probabil in inactivarea unor gene qi, deci, in controlulexpresiei informaliei genetice. Conversia localS B -+ Z (mai ales in situsurile de reglare atranscripfiei) poate fr realizatd, prin fixarea mai intensd a histonelol sau a altor moleCule ceproduc represia genelor sau pnn metilarea citozinei din situsurile GC. Astfel, un "viraj lastdnga" la inceputul unei gene determind stoparea activitdlii ei.

Ttmzitia B Z ar determina ins[ qi eviden{ierea unor situsuri din ADN in care sefrxeazd,mai facil agenli rnutageni sau cancerigeni.

in finalul acestei prezentdri este important de subliniat faptul cd,tratui[iaADN B

7-ntL

Curs 3ORGANIZAREA MATERIALULUI GENETIC iN CELULA1. APARATUL GENETIC AL CELULEIAparatul genetic al celuiei este reprezentat de structurile celulare care conlin ADN, nucleul

gi mitocondriile, la care se adaugd structurile celulare care intervininrealizarea funcliilor ADN-ului: ribozomii qi centrul celular. Ribozomii reprezintd sediul sintezei proteinelor in interiorulcelulei, iar centrozomul intrd in alcdtuirea fusului de diviziune.

Nucleul este elementul principal al aparatului genetic, este centrul de comandd gi controlpentru toataactlitatea celulard; con{ine pana la 99,5 yo din totalul ADN-ului celular. Structurasa este diferitd in funclie de etapa ciclului celular in care se afl6 celula. in interfazii se descrienucleul ,,metabolic" care prezintd, 4 componente: membrana nuclear6, matricea nucleard,cromatina gi nucleolul;

La inceputul diviziunii, membrana nucleard qi nucleoli dispar, iar fibrele de cromatina sespirahzeaz1, se condenseazd gi formeazd cromozomii.

La sfdrgitul diviziunii, cromozomii se despiralize azd Si se gdsesc in interfaza sub formafibrelor de cromatind.

Cromatina rcprezintd, asocierea dintre ADN-ul nuclear qi proteine histonice, are gradediferite de condensare in funclie de etapele ciclului celular qi se prezintd sub 2 tipuri morfo-funclionale diferite: eucromatina gi heterocromatina

-eucromatina conline ADN nerepetitiv in care predomina perechile de baze GC qi conlineproteine nehistonice. Este pulin condensatd qi coloratd cu coloranf ibazic| dar este activd d.p.d.v.genetic, la nivelul sdu are loc transcriplia gi se replicd precoce la inceputul fazei S a interfazii.

-heterocromatina este alcdtuitd din ADN repetitiv in care predomind perechile de baze ATgi din histone; este puternic condensatd qi intens coloratd cu coloranlr bazici. Este inactivdgenetic qi se replicd tardiv, la sfrrqitul fazei S ainteffazei.

Heterocromatina poate fi de doud tipuri: constitutivd gi facultativd-heterocromatina constitutivd se gdseqte constant sub forma condensatb, nu conline gene

funclionale gi este formatd din ADN inalt repetitiv. La nivelul cromozomilor se gdsegti inregiunea centromerului, pe braful lung al cromozomului Y, pe bralele scurte ale cromozomiioracrocentrici qi la nivelul constricfiilor secundare.

-heterocromatina facultativd corespunde unor regiuni de la nivelul cromozomilor sexualisau a gonozomilor qi corespunde cromatinei sexuale X sau y.

Histonele sunt proteine bazice prezente in toate celulele eucariote, cu mare ahnitate pentruADN gi care se fixeazd la nivelul incizurii mici a moleculei de ADN.

Raportul dintre ADN si histone : 1 $i in funclie de numdrul gi tipul de aminoacizi existd 5tipuri de histone la eucariote:HL,H2A, H2B, H3 gi H4

Cu excepfia lui H 1, celelalte tipuri au o structurd stabild gi bine conservatd. Ele intrd inalcdtuirea nucleozomilor, care sunt particule fundamentale din structura fibrelor de cromatind.

Aldturi de rolul structural, histonele prezintd qi un rol funcfional fiind implicate in reglareaexpresiei genelor.

Proteinele nehistonice sunt acide gi neutre, sunt numeroase, heterogene gi prezente cu ofrecvenfd mai micd decdt histonele. Unele proteine nehistonice intrd in alcdtuirea matriceicromozomilor, dar maloritatea au ro1 funclional intervenind in reglarea activitdlii genelor.Proteinele nehistonice se frxeazd,la nivelul moleculei de ADN in marea incizuralaterald..

c4

2. STRUCTURA SUPRAMOLECULARA A CROMATINEIin urma analizei la ME a cromatinei, s-a evidenliat un sistem ierarhtzat de fibre decromatind de dimensiuni diferite , alcdtuite din ADN, histone qi proteine nehistonice. , .

Primul nivel.de organizare supramoleculard a cromatinei este filamentul cu nucleozomi,care are diametrul de 10 nm. Nucleozomul este alcdtuit dintr-un complex de ADN gi histone,adicd un segment de ADN cu lungime de 146 de perechi debaze se indqoard in jurul unui miezhistonic, format din 8 molecule de histone, .et. 2 molecule din ri2A, rtig, nz gi H4.Nucleozomii sunt legali intre ei printr-un segment de ADN liber, format din 60 de p.r..hi d.baze. Astfel se formeazd'frlamentul cu nucleozomi asemdndtor unui qirag de mdrgele. Stubilitut.uacestei structuri este menlinutd de cdtre Hl, iar rata de impachetare a CnN-utnidin dublu helixeste de 10:i.

Al doilea nivel de organizarc supramoleculard a cromatinei este fibra de cromatinl cudiametrul de 30 nm. Ea rezultd, din spiralizarea in solenoid a filamentului cu 6 nucleozomi.Histona I stabilizeazd'fibta de cromatind,ratade compactare este de 5:1. Fibra de cromatind de30 nm este unitatea fundamentalE de organizare a cromatinei in nucleul interfazic.

Al treilea nivel de organizare rezultd. prin plierea fibrei de cromatina de 30 nm in buclelaterale, rezultdnd astfel o fibri pliati in bucle laterale cu diametrul de 300 nm. Buclelelatetale sunt atagate la un schelet sau matrice proteica nonhistonicd. Se considerd cd fiecare bucldsau domeniu, cate conline cdteva gene, este o unitate funclionald de transcriplie qi de replicare aADN-ului.

Fibra pliatd in bucle laterale formeazd.la inceputul diviziunii, printr-o putemicd spiralizare9i condensare cromatida unui cromozom,cate are o grosime de Zbg nm qi reprezintacel mai?nalt grad de compactare a fibrei de cromatina de 30 nm.

Fiecare cromatidd a unui cromozom conline astfel o singurd molecul[ de ADN, organizatdin mai multe structuri succesive, ierarhizate in funclie de gradul de impachetare.

La inceputul diviziunii, cromatina se organizeaz6,in cromozo*i, cur. indeplinesc 2 funcliiimportante:

a' transportul materialului genetic de la parinfi la descendenli, precum qi de la o celul6mamd, la celulele fiice, asigurdnd stabilitatea proceselor ereditare;

b. cromozomii realizeazd' amestecul materialului ereditar intre generafii succesive prinprocesele de recombinare care au loc in meiozd gi care reprezintd principala sursd de variabilitategeneticd.

3. STRUCTURA GENOMULUI UMANTermenul de genom desemna ansamblul genelor unui organism, dar descoperirea ulterioar6

a ADN-ului necodant qi a diferitelor clase de ADN repetitiv, au condus la semnific alia actuald atermenului de genom qi anume: ansamblul secventelor de ADN ale unui individ sau ale uneispecii.

Cantitateatotald de ADN din celulele umane diploide este de aproximativ 7pg.Mdrimea totald"estimatd a genomului uman este de 3,2 Gb.Genomul este alcdtuit dintr-un genom nuclear complex care conline majoritatea ADN-ului

celular qi are o mdrime aproximativd de 3.2 Gb gi dintr-un genom mitocondiial mai mic qi maisimplu organizat cu mdrimea de 16,6 Kb.

vt

3.1. Genomul nuclearEste fragmentat in 24 de tipuri

proteinele formeazd. cromozom ii. 22sexuali X qi Y.

In genomul uman existd maisecven{elor nucleotidice :

- ADN-ul nerepetitiv;- ADN-ul moderat repetitiv;- ADN-ul inalt repetitiv.

distincte de molecule liniare de ADN care prin asociere cude tipuri distincte de autozomi qi 2 tipuri.de cromozomi

multe clase de ADN, diferite intre ele prin repetitia

ADN-ul nerepetitiv reprezintd" 600/o din total de ADN gi este alcdtuit din secvenle unicesau din secvenle carc prezintd un numdr foarte mic de repetilii nucleotidice. Acesta se gdsegtemai frecvent in regiunile cromozomice active transcripfional.

ADN-ul moderat repetitiv reprezintd, 30%o din totalul ADN-ului gi este alcdtuit dinsecvenle scurte de 300-1000 perechi debaze care se repetd de zeci si sute de mii de ori gi suntdispersate in genom, la nivelul genelor ribozomale, genele care codifica ARNt gi la nivelul unorsecvenle particulare de ADN, cu funclie necunoscuta: SINEs ("short interspersed repeatedsequences") qi LINEs ("long interspersed repeated sequences").

ADN-ul inalt repetitiv reprezintl,10Yo din genom gi este alcdtuit din secvenle foarte scufiede perechi debaze repetate in tandem, de milioane de ori. Secvenlele nu sunt transcrise pi intrd inalcdtuirea heterocromatinei. Se cunosc trei tipuri de ADN inalt repetitiv:

- ADN satelit (alphoid) alcdtuit din heterocromatina constitutivS" specificd pentru fiecarecromozom, in anumite regiuni: centromer, telomere, constricfii secundare, benzile G, etc; cu rolstructural.

- minisatelilii hipervariabili sau VNTR de la "variable number of tandem repeats".- microsatelili sau STR formate de regul5 din repetilia unui dinucleotid.

Genomul nuclear este alcdtuit in proporlie de 25%o din ADN-ul genic pi 75 o/o dinADN-ulextragenic.

ADN-ul genic este reprezentat de secvenlele codante qi necodante din structura geneloractive, a fragmentelor de gend sau a genelor inactive sau pseudogene. ADN-ul genic estercptezentat in proporfie de I0%o de ADN-ul codant, care reprezintd exonii din cele 35.000 degene 9i 90% este alcdtuit din ADN-ul necodant, adicf, secvenfele ce alcdtuiesc intronii sau genelenefunc!ionale.

ADN-ul extragenic este alcituit din secvenle inactive transcripfional, care pot fi unice saurepetitive, Secvenfele repetitive au fost grupate in 2 categorii:

1. ADN-ul repetat in tandem qi grupat in blocuri de heterocromatind, Se numegte ,{DN-ulsatelit gi se impartein4 clase: megasatelit, satelit, minisatelit gi microsatelit.

2. ADN-ul repetat qi dispersat in numeroase situsuri in spaliul dintre gene reprezentat desecvenlele SINEs qi LINEs.

3 .2. Genomul mito condrialGenomul mitocondrial este definit printr-un singur tip de ADN circular, bicatenar, format

din 16.569 pb. Secvenfa sa nucleotidicd a fost complet descifratd (Anderson et al, 1981) qi secancteizeazd' printr-o mare densitate de secven{e codante. Cele doud catene ale ADN

\--- .?

mitocondrial au o compozilie bazicd, diferitd: o catend "grea" (H) este mai bogatd in guanind iarcealaltd catend "ugoard" (L) in citozind.Intr-o micd regiune, bucla r, ADN este alcdiuit din treicatene, prin sinteza unei piese scurte adilionale la catena H, cunoscutd ca ADN 75. ' .

Fiecare celuld umand conline cAteva mii de copii ale ADN mitocondrial (ADNmt) gi deaceea cantitatea lui total6, raportat1,la ADN unei celule somatice, poate rcprezenta pdnd ta 0.5%.in cursul diviziunilor celulare mitotice, moleculele de ADN mitocondiial ale celulei inilialesegregd la fntdmplare in celulele fiice.

Genomul mitocondrial aI zigotului provine exclusiv de la ovul, deci de la mamd, fapt cedetermind un tip particular de transmitere maternald a genelor mitocondriale: de la mamd la toticopiii sdi.

Genomul mitocondrial nu este asociat cu proteine histonice sau nehistonice gi nu conlineADN repetitiv. Genomul mitocondrial este extrem de compact: circa 93% dinADN este format dinsecvenle codante (absente doar in bucla D), ce formeazd,3T de gene (28 pe catena H qi 9 pe catenaL): 13 gene codificd polipeptide (constituienfi ai sistemului de fosforilare oxidativd) ,22 gene codificdARNI gi 2 gene ARNr . Restul proteinelor mitocondriale sunt codificate de gene nucleare, sintetizatein citoplasmd gi importate in mitocondrii. Genele mitocondriale sunt aproape totdeauna contigue iuunele chiar suprapuse; ele nu conlin introni.

Transcriplia incepe in promotorii (PH qi PL) aflali in bucla D, este continud (decimultigenicd) qi se desftqoard in direclii diferite pe cele doud catene, generdnd un transcriptmultigenic mare (ce va fi ulterior seclionat in mai multe molecule de ARN). Codul geneticmitocondrial diferd pulin de cel nuclear. El are patru codoni stop (nonsens) din care doi suntcodoni sens in ADN nuclear; codonul stop UGA din ADN nuclear este codon sens in ADNmitocondrial. Replicarea este unidireclionald qi incepe in puncte diferite de origine (O) pentrucele doud catene.

ADN mitocondrial poate suferi mutalii produc6nd o serie de boli degenerative, care sunttransmise fntr-un mod specific, de la mamd la toli descendenyii; bdrbalii bolnavi nu transmit boala.Atunci c6nd se produce o mutalie in ADN mitocondrialrezultd, in mitocondrie un amestec demolecule mutante qi normale, numit heteroplasmie. Cdnd o celuld se divide ADN mitocondrialmutant va fi impdrlit la tntdmplare intre celulele fiice qi astfel, in timp, procentajul de ADNmitocondrial mutant intre diferite linii celulare qi lesuturi va fi diferit, fenomen numit segregqrereplicativd. Studiul familiilor in care existd heteroplasmie cu ADN mitocondrial mutant, relevd cdprocentajul ADNmt mutant creqte gi produclia de energie scade treptat, panA sub un prag minimumnecesar funclion5rii normale a lesutului, moment in care manifestdrile clinice devin evidente. Deaceea bolile mitocondriale au un debut tardiv qi o evolulie progresivd.

S-a demonstrat cd ADN mitocondrial poate suferi mutalii somatice, ?n celuleledupd naqtere, care se acumuleazd, rapid datoritd absentei unor mecarusmewvryurur vuPo uatLvrur vclrs rs