Evolutie Genetica: Dovezi noi în studiul unor structuri interconectate.

Raport tiinific 2014 GENESIS PCCA_1153_2011 (contract 229/2013)

Raport tiinific privind rezultatele obinute n cadrul proiectului PCCA_1153b (contract229/2013)

Evolutie Genetica: Dovezi noi n studiul unor structuri interconectate.O calatorie biomoleculara n jurul Carpatilor din Antichitate pna n Evul Mediu

n perioada ianuarie-decembrie 2014Cuprins:1. Rezumat2. Sinteza rezultatelor obinute n perioada ianuarie decembrie 20143. Anexe I Rezultatele principalelor direcii de cercetare n anul 2014

a. Studiul IUtilitatea spectroscopiei FT-IR n determinarea randamentului extraciei de ADN dinoase arheologice

b. Studiul IIDiagnosticul molecular al tuberculozei la o populaie gotic din Gherseni, Romnia

c. Studiul IIIDiversitatea genetic reflectat de analiza regiunii de control mitocondriale la opopulaie de secol X din Capidava (Constana, Romnia)

d. Studiul IVOptimizarea diagnosticului molecular al sexului la probe arheologice umane

e. Studiul VDiagnosticul interdisciplinar al unui caz de diabet din perioada neolitic

f. Studiul VIMormntul 10 din Biserica Sf. Nicolae Domnesc de la Curtea de Arge

g. Studiul VIICopilul de la Mlieti (MMPP)

4. Anexe II Rapoarte de antropologie fizic pentru loturile procesate n anul 2014 Raport arheozoologic Miercurea Sibiului 2014 Raport antropologic - Capidava 2014 Raport antropologic Cristian 2014 Raport antropologic - Mlieti 2014 Raport antropologic - Miceti 2014 Raport antropologic - Toboliu 2014 Raport antropologic - Turda 2014

5. Lista publicaiilor i participrilor la conferine tiinifice n anul 2014


REZUMAT

n etapa II a proiectului PCCA-1153b contract 229/2013 (perioada 1 ianuarie - 31 decembrie2014) au continuat cercetrile demarate n anul 2013.

Grupurile de antropologie fizic (P1 i P2) continu analiza loturilor recepionate n anul 2013 ia celor recepionate n anul 2014. Analizele antropometrice constituie analize preliminare careevideniaz cazurile speciale ce vor primi prioritate n ceea ce privete analizele moleculare. nAnexele II ale acestui raport tiinific sunt date ca exemplu cele mai relevante necropole studiate dinpunct de vedere al antropologiei fizice n cadrul etapei II a proiectului i pentru care a fost redactatun raport pentru echipa de arheologi.

Cele mai relevante rezultate moleculare obinute n cadrul acestei etape au fost evideniate ncadrul studiilor I-VII ce formeaz Anexa I. Dintre acestea, amintim: 1. optimizarea unei metode deatribuire mai sigur a vrstei la momentul decesului folosind tehnica FTIR (Fourier TransforInfrared Spectroscopy), confirmarea prin analize genetice a unui diagnostic de tuberculoz (studiupentru care la finalul etapei I nu existau dect rezultate preliminare), identificarea primelorhaplogrupuri mitocondriale de Epoca Bronzului i medievale din diverse necropole de pe teritoriulRomniei (Capidava, Mireasa - Constana; M10 din Curtea de Arge; copilul nou-nscut dinMlieti). Majoritatea haplogrupurilor mitocondriale caracterizate pentru populaiile istorice pn nacest moment sunt forme genetice rare, sau relativ rare n populaia modern ceea ce ridic nointrebri despre contribuia acestora la alctuirea structurii genetice a populaiei moderne.

Tot n aceast etap a continuat efortul de datare radiometric i de analizare a izotopilor stabilide C i N, cu rezultate n curs de interpretare.

n cadrul proiectului, ncepnd cu finalul acestei etape au fost demarate patru doctorate (3biologie, 1 arheologie) cu subiecte din aria tematic vizat de proiect.


SINTEZA REZULTATELOR OBINUTE N PERIOADA IANUARIE DECEMBRIE 2014

Obiectivele etapei II sunt:1. Documentare i schimburi tiinifice

(vezi lista de participri la conferine i deplasrile de documentare)2. Investigaii paleo-osteologice

(vezi Anexele II)3. ADN vechi secvenializare i genotipare

(vezi Studiile I-VII)4. Analize izotopi stabili ai carbonului (C) i azotului (N), pentru caracterizarea dietei

(2014 - datri radiometrice i analiza izotopilor stabili de C i N n cadrulstudiilor II, III, VII)

5. Analize complementare (SEM, spectroscopie etc.)(vezi studiile I, II, V)

6. Sapaturi arheologice i procesarea inventarului material(vezi deplasrile pe antiere arheologice)

7. Studii de arhiva(studiul VI)

Obligaiile asumate de partenerii proiectului prin semnarea Actului Aditional nr. 2 din 2014pentru acest etap sunt:

1. Depunerea raportului anual aferent etapei II2. Depunerea raportului tiinific aferent etapei II3. Depunerea raportului financiar aferent etapei II4. Participarea la conferine tiinificen plus fa de indicii asumai au fost publicate 8 articole n reviste indexate n baze de date

internaionale, acceptat spre publicare 1 articol n reviste indexate n baze de date internaionale,publicat 1 articol n revist n curs de indexare n bazele de date (primul numr n anul 2014) ipublicat 1 articol (proceedings) n volumul unei conferine internaionale (Arheovest, decembrie2014, Timioara).

A fost organizat, la Cluj-Napoca, n data de 7-8 noiembrie 2014, Workshopul Abordareabiocultural i tiinele biomedicale care a oferit studenilor arheologi i biologi oportunitatea dea observa procedurile practice aplicate n laboratoare de antropologie fizic i molecular , de ademara un schimb de idei ntre oameni formai n discipline umaniste i reale i a identificaposibiliti de colaborare.

ncepnd cu lunile octombrie 2014, respectiv noiembrie 2014 au demarat 4 doctorate (3biologie, 1 arheologie) cu subiecte din aria acoperit de proiect.

28

Studiul I.Utilitatea spectroscopiei FT-IR n determinarea randamentului extraciei deADN din oase arheologice

Populaia analizat n acest studiu aparine unei necropole de lng satul Mireasa dincomuna Silitea, judeul Constana i aparine Epocii Bronzului, defuncii fiind ngropai npoziie fetal (chircit), pe o parte (Figura 1). Pentru a afla vrsta exact a acestora, unul dintreindivizi a fost testat prin radiometrie.

Datarea cu 14C arat c proba testat aparinea unui individ care a murit ntre anii 2580 i2490 .e.n, perioad ce coincide cu epoca timpurie a bronzului pe teritoriul Romniei.

n acest studiu, notarea indivizilor esteurmtoarea:

M2 AM3 BM4 CM5a DM5b EM6 F

M7 GM11a HM11b JM115A KM160 -L

Fig.1. Fotografiile celor 11 morminte din necropola Mireasa care au fost atribuite EpociiBronzului. Toate scheletele sunt aezate n poziie chircit.

Dup analiza markerilor de sex i vrst (creast nucal, proces mastoid, marginesupraorbital, glabel, i eminen mental, precum i a markerilor de pe oasele coxale, dar ilungimea unor oase lungi) observabili la scheletele indivizilor necropolei Mireasa, EpocaBronzului, a fost fcut o aproximare a vrstei acestora la momentul morii, precum i o atribuirect mai exact a sexului (Tabel 1). Astfel, majoritatea rmielor aparin unor brbai, excepiefcnd (M5a D), de sex feminine. Indivizii studiai au vrste variate, de la nou-nscut, copii,tineri i aduli. n cazul M5b (E), unde e vorba de osemintele unui infans, nu au putut ficaracterizai markerii amintii mai sus din cauza slabei reprezentri i conservri a oaselor (Tabel1).

Tab.1. Valorile aproximative ale vrstei indivizilor din necropola Mireasa, sexul lor, valoareamedie a strii de reprezentare (scorul 3 nsemnnd c peste 75% din os este disponibil, 2 aproximativ 50%, 1 sub 25% i scorul 0 pentru oasele lips ) i procentul de oase disponibilecalculat pe baza strii de reprezentare.

Numrmormnt Cod individ Sex Vrst

Stare dereprezentare

(medie)Procentul de oasesalvate din individ

M2 A M 20-23 ani 1.296875 32%M3 B M 26-70 ani 0.65625 16%M4 C M 15-25 ani 2.265625 57%

M5a D F 11-15 ani 0.953125 24%M5b E ? bebelu ? ?M6 F M 17-19 ani 0.28125 7%M7 G M 33-42 ani 1.15625 29%

M11A H M 21-53 ani 1.65625 41%M11B J M 7-12 ani 0.546875 14%

M115A K M 20+ ani 1.328125 33%M160 L M 26-39 ani 2.4375 61%

Dup cum se observ din tabelul 1, valoarea medie a strii de reprezentare a scheleteloreste n mare parte sub 50%, ceea ce reduce mult acurateea determinrii vrstei i sexului, multedintre poriunile cu rol de marker de diagnostic lipsind. Pentru o confirmare absolut a sexului sepot face analize moleculare, ns vrsta morii este deocamdat o informaie ce nu poate fiverificat i confirmat prin metode de biologie molecular. Analizele spectroscopice, ns,manifest un potenial puternic n creterea acurateii determinrii vrstei.Spectroscopia FTIR i rolul ei n analiza oaselor arheologice

Indicii FTIR folosii pentru evaluarea diagenezei osoaseIRSFIstoric, primul indice FTIR folosit pentru evaluarea cristalinitii hidroxiapatitei a fost

funcia de despicare (splitting function), un raport arie/arie caracteristic despicrii degenerativea peak-ului de la 600 cm-1 propriu ndoirii antisimetrice a fosfatului odat cu sporirea ordiniiatomilor (Termine i Posner, 1966). Uneori numit index de cristalinitate CI, alteori factor dedespicare n infrarou IRSF (Infrared splitting factor), raportul dintre suma absorbanelorvalorilor celor dou peak-uri ale despicturii i valoarea corespunztoare vii dintre ele(A595+A605)/A588 codific informaii referitoare la gradul de diagenez al unui os. Cu ct faza

organic a osului este degradat chimic sau microbiologic, reeaua mineral din jurul ei sufer iea disoluii, mai ales ale cristalitelor mai mici i mai instabile din punct de vedere termodinamic,care se vor recristaliza pe suprafaa cristalelor deja existente, mai mari i mai stabile, conformcondiiilor fizico-chimice discutate mai sus. Nielsen-Marsh i Hedges (2000) afirmau c celedou procese, disoluia i recristalizarea pot participa mpreun la creterea valorii IRSF. Astfel,cristalinitatea crete, i chiar dac la nivel macroscopic nu se observ diferene, reorganizareamicroscopic poate fi urmrit cu ajutorul acestui parametru (Rogers i colab., 2010). O corelaredirect ntre IRSF i mrimea medie a cristalitelor a fost artat de Truman i colab. (2004),mpreun cu o modificare n forma cristalitelor odat cu maturarea, de la o form planar nspreuna acicular: 163 x 28 x 5 nm (Berna i colab., 2004).

Mai multe colective au calculat IRSF pentru os modern n comparaie cu oaselearheologice pe care le studiau la acel moment, artnd o cretere clar a valorii indicelui odat cudegradarea osului: 2.7 peste 3 (Mller i colab., 2011); sub 2.8 ntre 2.7 i 3.4 (Trueman icolab., 2004); 3.4 ntre 3.5 i 3.8 pentru un loc de nmormntare i ntre 3.1 i 4.6 pentru unaltul (Lebon i colab., 2010); 2.6 3 (Nielsen-Marsh i Hedges, 2000) i Berna i colab., (2004)au evideniat o gam i mai larg de valori: ntre 2.6 i 3 pentru oase in vivo, pn la 3.4 pentruoase puin afectate la suprafaa solului, pn la 4.1 pentru oase fosile i un IRSF de 7 a fostdeterminat pentru fosile puternic alterate (Figura 2). Pentru comparaie, IRSF pentruhidroxiapatita sintetic este 5.4. O explicaie pentru care cristalinitatea ntr-un os poate fi maimare dect ntr-o hidroxiapatit standard va fi dat imediat.

Fig.2. Valori ale IRSF i gradul de recristalizare pentru diferite tipuri de apatite. Apatitacarbonatat exogen este mineralul ce se formeaz cel mai des prin reacia ntre fosfatul eliberat din

degradarea materiei organice i carbonatul de calciu prezent n sedimente. (din Berna i colab.,2004)

Cnd structura chimic original a apatitei geologice este alterat, ntregul complex va fimai destins (mai lax), mai solubil i deci mai puin cristalin, asemenea alterri se ntmpl cndCO3 nlocuiete parial PO4 sau OH, sau cnd Ca este substituit de ali atomi, ca Na sau Mg.

Figura 3 arat spectre ale unor tipuri distincte de diagenez, graficul negru corespunznd unui osdepozitat n mediu carbonatat (vezi peak-ul masiv al carbonatului, de la 1415 cm-1): se observslaba despicare a peak-ului la 595 605 cm-1, susinnd explicaia de mai sus. Situaia opuspentru hidroxiapatit este atunci cnd OH este nlocuit de un atom de flor. Floroapatita[Ca10(PO4)6(F)2] este chiar mai strns mpachetat fr gruparea hidroxil, conferind mineraluluiinsolubilitate, cristalinitate i rezisten la pH mic, cu un IRSF de pn la 7. n os, hidroxiapatitacarbonatat leag florul, devenind francolit [Ca10(PO4,CO3)6(F)2], un mineral cu un peakspecific de absorbie n infrarou, la 1096 cm-1, uor de recunoscut pe spectru prin umrul defrancolit de lng peak-ul principal al fosfatului. Graficul rou din Figura 3 este un exemplu despectru al unui os care a absorbit flor, avnd distinctivul umr de francolit i un IRSF mai mare,dup cum despicarea de la 600 cm-1 sugereaz.

Fig.3. Exemple de spectre de absorbie FTIR ale unor oase cu tipuri de diagenez diferite (discuien text) (imagine proprie)

ntr-un sit arheologic s-a observat c oasele indivizilor nmormntai n zona cu sol maiumed a sitului prezentau semne de francolit (King i colab., 2011), ceea ce se explic prinafinitatea mare a florului pentru ap (Greenwood i Earnshaw, 1998). Fosilele foarte vechi, cacele de dinozauri, au IRSF de aproape 7 i un coninut crescut de flor, altfel nu ar fi pututsupravieui n timp (Berna i colab., 2004).

Totui, nici un IRSF mic i nici un timp de depoziie scurt nu se pot corela cu oconservare bun a organicului, cci toi ceilali factori descrii mai sus depesc contribuiavrstei cronologice (Weiner i Bar-Yosef, 1990). Hagelberg i colab. (1991) ofer un exemplu nacest sens: o groap comun din perioada Rzboiului Civil nu a avut randament la obinerea deADN pentru analize genetice, ns un cimitir saxon mai vechi dect precedentul a dus la rezultateADN interpretabile. Nici Salamon i colab. (2005) nu au reuit s gseasc o corelare ntrerandamentul amplificrii ADN i vrsta probei, ns Allentoft i colab. (2012) subliniaz c dactoate celelalte variabile ar fi constante, conservarea ar fi o funcie de timp, aa cum ne ateptm,conform datelor de chimie fizic pur.

C/PConinutul de carbonat, msoar raportul absorbiilor peak-urilor CO3/PO4 de la 1415 i

1035 cm-1 respectiv. Wright i Schwartz (1996) au stabilit o bun corelare ntre raportul C/P iprocentul de mas (wt%) al CO32- msurat prin eliminarea de CO2 la disoluie acid.

C/P este un parametru disputat, mai ales n domeniul etichetrii izotopice, orice carbonatexogen din esutul osos examinat ducnd la rezultate greite legate de vrsta geologic, migraii,diet, clim (King i colab., 2011).

n ceea ce privete diageneza, raportul C/P arat doar raportul cantitativ ntre anioni. Elpoate crete n timp, dac concentraia carbonatului n mediu este mare, astfel nclinnd balanaechilibrului termodinamic mpotriva tendinei naturale a hidroxiapatitei de a elimina carbonatul.Asemenea cazuri vor prezenta pe spectru un peak specific calcitului la 712 cm-1 (Figura 5), daccalcitul reprezint minim 3% din mineralul osului (3% fiind limita de detecie) (Nielsen-Marsh iHedges, 2000; Mller i colab., 2011). O valoare C/P mic indic pierderea CO3 prin disoluiei/sau absorbia de PO4 n structura cristalin; deci o valoare medie, de os modern, a indiceluiC/P ntr-un os antic indic nspre ambele procese: (a) o depunere de calcit (CaCO3) n i pe os iadsorbie pe suprafaa cristalelor de apatit, i (b) o cretere local a perfeciunii cristalitelor prinfixarea PO4 (Nielsen-Marsh i Hedges, 2000).

Lebon i colab. (2010) au argumentat problema valorii fluctuante a raportului C/P pentruprobe arheologice prin existena mai multor procese ce contribuie la valoarea lui final, indicelevariind ntre 0.15 i 0.35, pe cnd probele moderne au o deviaie standard mult mai mic, cu ovaloare medie a C/P de 0.28.

Indicele C/P ridic nite probleme din cauza vibraiilor organice C-H crora li sesuprapune frecvena de absorbie cu cea a gruprii CO3, ducnd la o supraestimare a carbonatuluiodat cu coninutul de matrice organic (Truman i colab., 2004). n Figura 5, spectrul probeicarbonatate are i un peak nalt la Amida I (Amida I este legtura C=O din lanul polipeptidic),sprijinind aceast observaie.

CCConinutul de colagen CC este indicele ce msoar conservarea proteic a matricei

osoase, calculat ca raportul valorilor de absorbie ale amidei I i fosfatului (A1640/A1035). Valoride 0.2 corespund la 15 wt% material organic n os, i un CC de 0.8 la 30 wt% (Truman icolab., 2004). Cu ct semntura proteic este mai puternic, cu att fraciunea organic asupravieuit mai bine trecerii timpului ntr-un anumit os.

Nielsen-Marsh i Hedges (2000) au artat o corelare ntre CC i IRSF explicat prinstrnsa legtur dintre matricea mineral i cea organic, pierderea materialului organic ducndla disoluia mineralului, corelare neobinut i de Lebon i colab. (2010), probabil din cauz clotul investigat de acetia avea i ali factori care au influenat valorile indicilor, ca prezenaflorului.

Deplasarea peak-ului 1PO4Un alt indice, propus de Lebon i colab. (2010), este deplasarea unei benzi de absorbie a

fosfatului de la 960 cm-1 nspre 963 cm-1, deplasare corelat liniar cu pierderea carbonatului icreterea perfeciunii reelei cristaline, odat cu excluderea ionilor strini. Acest indice pare sfie mai sensibil la pierderea carbonatului i modificri ale tensiunii n reeaua mineral dectIRSF, care se refer mai ales la mrimea cristalelor. Unele probe au avut acest peak deplasat ipeste 963 cm-1, dar numai acompaniat de un coninut crescut de flor, care confer floroapatiteimai mult ordine atomic dect are hidroxiapatita.

Apatitele dopate cu ioni ca Ba2+, Mn2+, Sr2+ au acest peak deplasat sub 960 cm-1, artndc acest indice ar putea fi folosit pentru detectarea substituiilor ionice n reeaua mineral de-alungul diagenezei (Thomas i colab., 2007).

ConcluziiProcesul de diagenez afecteaz ambele componente ale esutul osos, fraciunea mineral

trecnd prin disoluii i recristalizri succesive, n timp ce partea organic sufer degradarechimic i digestie microbian. Procesele de diagenez ale celor dou componente osoase suntinterdependente, ele protejndu-se una pe cealalt.

ADN nu poate fi observat a priori n oasele antice, deci estimarea lui se face pe baza altorcomponente, mai accesibile (mineral i proteic).

Din spectrele FTIR se pot obine date privind mrimea cristalitelor din os[(565+605)/588], raportul carbonat/fosfat (1415/1035), coninutul de colagen (1640/1035), dar ialte informaii, ca prezena fluoroapatitei sau a calcitului.

Prin interpretarea informaiilor oferite de spectroscopia FTIR privind diferite oase,molecularistul poate alege osul cel mai potrivit pentru a extrage ADN i a avea un randament ctmai bun n procesele ulterioare (PCR, Q-PCR, secveniere).

Corelarea indicilor FTIR cu concentraia de ADN extrasPentru fiecare prob de extracie de ADN din fiecare individ au fost calculai indicii

IRSF, C/P, CC. Datele indic o corelare clar ntre valoarea concentraiei de ADN extras (cititprin spectrometrie UV) i cei 3 indici. Raportul C/P i coninutul de colagen CC sunt directproporionale cu cantitatea de ADN extras, iar indicele IRSF este n relaie invers (Figura 4.F individul M6-F). Corelarea nu este la fel de evident la toi indivizii, dar proporionalitateainvers a IRSF rmne valabil n mai multe cazuri (Figura 4.B individul M3-B). De precizateste faptul c gradul de corelare ntre date se menine doar cnd se analizeaz cte un individ pernd, astfel c la combinarea datelor ntre indivizii B i F graficul nu mai are aceeai simetrie(Figura 5). IRSF i menine invers proporionalitatea fa de C/P i CC, ns relaia acestora cuconcentraia de ADN extras din probe nu se pstreaz la compararea inter-individual, fapt ce seexplic prin condiiile diferite n care au fost depozitate oasele. Chiar dac toi indivizii studiaiaici provin din aceeai necropol i condiiile climatice de-a lungul secolelor au fost aceleaipentru toate scheletele, este posibil ca proprietile solului i hidrologia local s fie diferite chiari la distane de civa metri.

Fig.4. Corelarea direct proporional a indicilor C/P i CC i invers proporional a IRSF cuconcentraia de ADN extras. F = individul M6, B = individul M3. Pe axa absciselor sunt probe

din oase diferite. Indicii nu sunt reprezentai n valori absolute.

F

F2 F56 F8 F10 F11

CONCIRSFC/PCC

B

B2 B3 B6 B8 B11

CONCIRSFC/PCC

Fig.5. Corelarea indicilor cu concentraia de ADN dispare atunci cnd se compar indivizidiferii. Indicii FTIR i pstreaz relaia de simetrie, dar valorile concentraiei de ADN nu

coincid cu modelul individual. F = individul M6, B = individul M3. Pe axa absciselor sunt probedin oase diferite. Indicii nu sunt reprezentai n valori absolute.

Corelarea indicilor FTIR cu vrstaMetoda pantei graficului CC-ADNIpoteza de la care s-a pornit n studiul de fa este c supravieuirea ADN n oase este

proporional cu cea a colagenului. Deci indicele CC ar trebui s fie decisiv n luarea deciziei dea aprofunda studiul unui anumit os prin extracia de ADN. Figura 6 aduce mpreun toatevalorile indicelui CC i concentraiile de ADN extras. Liniile punctate sunt trendline-uri pentructe un individ i respect codul de culori de la legend. La cele mai multe probe, trendline-ularat o proporionalitate direct ntre valoarea CC i concentraia ADN, dar exist i indivizipentru care dreapta este nclinat invers sau este orizontal. Oricum, i la indivizii cuproporionalitate direct se observ diferite grade de corelare, liniile din grafic fiind nclinate launghiuri foarte variate. Aadar, valoarea CC nu pare s prezic nicicum concentraia de ADN dinprobe.

Fig.6. Slaba corelare dintre valoarea CC i concentraia de ADN obinut pentru toate probelestudiate. Fiecare individ este reprezentat cu un alt simbol, iar axele de trend corespund codului de

culori. Se observ o variaie a unghiului dintre trendline i axa ox.

S-a observat o legtur ntre nclinarea axei dintre CC i concentraiile de ADN extrasper individ i vrsta acestuia. Ecuaiile axelor de trend sunt notate n tabelul 2, ordonate cresctordup panta lor. Astfel, axele cele mai orizontale sunt ale datelor de la indivizii M3-B i M160-L, de 26-70, respectiv 26-39 ani. La individul L, ns, graficul a fost trasat din doar dou puncte,deci e probabil ca unghiul trendline-ului s fie mai mare n realitate. Aadar vrsta lui de maxim39 de ani nu ar mai contrazice teoria propus aici. n ordinea cresctoare a unghiurilor trendline-urilor urmeaz indivizii M7-G i M11a-H care au vrstele cuprinse ntre 33-42 respectiv 21-53ani. Urmtoarele drepte sunt ale indivizilor M115A-K i M2-A, aproximai ca avnd 20+ i 20-23 de ani. Urcnd nspre vertical, urmeaz dreptele indivizilor M4-C i M6-F, de 15-25 respectiv17-19 ani. Dreapta cu cea mai mare pant din aceast serie de drepte este cea a individului M5b-E, infans. Exist i dou axe puternic deviate, unde relaia dintre CC i concentraia de ADN esteinvers, dar acestea aparin tot unor copii i unghiul de nclinaie e n continuare dependent de

F11 F8 F2 F10 B3 B11 F56 B2 B8 B6

CONCIRSFC/PCC

-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160

Concentraie ADN extras

CC

A

B

C

D

E

F

G

H

J

K

L

vrsta lor: M5a-D avnd vrsta de 11-15 ani i M11b-J de 7-12 ani. Aadar, fie individual infans,fie cei doi copii prezint erori de la modelul urmat n acest grafic. Oricum, este important desubliniat aceast legtur n cazul fiecrui individ, ntre unghiul de nclinaie al axei dintrevalorile CC i concentraie, legtur ce poate reda informaii privind vrsta individului.

Tab.2. Ecuaiile dreptelor de trendline ale funciilor dintre valorea CC i concentraia ADN pentrufiecare individ studiat, i vrsta atribuit indivizilor prin metode antropologice i antropometrice.Datele sunt ordonate cresctor dup valoarea pantei dreptei.

Individ Ecuaia dreptei VrstaB y = -0.0075x + 10.43 26-70

L y = 0.0427x + 5.2831 26-39

G y = 0.0819x + 4.5159 33-42

H y = 0.0944x + 9.2929 21-53

K y = 0.1191x + 10.716 20+

A y = 0.3105x - 0.4069 20-23

C y = 0.3502x + 9.7025 15-25

F y = 0.3749x + 3.514 17-19

E y = 0.9444x + 14.056 bebe

D y = -0.9112x + 54.206 11-15

J y = -0.1399x + 21.16 7-12

La indivizii tineri coninutul de colagen este mult mai mare raportat la cantitatea deADN, n comparaie cu cazurile de oseminte adulte, unde valoarea CC crete mai lent cucreterea concentraiei de ADN. Probabil explicaia const n strnsa relaie dintre fraciunilemineral i organic ale osului. Cu ct un individ este mai avansat n vrst, oasele i sunt maimineralizate, iar la momentul morii acest element pare s aib un efect de protejare a ADN. Laindivizii foarte tineri, coninutul de colagen raportat la cel de hidroxiapatit este mai mare, deunde i valori superioare ale indicelui CC, dar cantitatea de ADN ce supravieuiete treceriitimpului este redus, posibil din cauza lipsei proteciei minerale.

Dintr-o reprezentare grafic a intervalelor de vrst determinate prin standardeantropologice i a valorii pantei axelor obinute din graficul CC-concentraie ADN, se obinefigura 11. Cu negru sunt reprezentate intervalele de vrst conform analizei antropologice, cumaximul la 70 de ani, iar cu albastru sunt valorile pantelor axei de trend pentru fiecare individ,ordonate descresctor. ntre indivizii K-B, valorile pantelor scad aproximativ liniar, aa c s-aconsiderat c diferena de vrst ntre ei este una cu variaii mici. La fel este cazul i ntreindivizii F-C-A, ns diferena de vrst dintre individul F (17-19 ani) i infans E este brusc.Pentru a completa acest grafic pn la o liniaritate pe tot intervalul este necesar investigareaunui numr mai mare de indivizi tineri. Exist posibilitatea ca n zona de sub 18 ani relaiavrst-pant s nu mai fie liniar, ci exponenial, ns asta nu se poate clarifica deocamdat.Poate din acest motiv indivizii J i D (7 12, respectiv 11 15 ani) prezint deviaii att deputernice de la grafic. Considernd, aadar, o relaie de liniaritate, s-au trasat (cu albastru) drepteparalele cu dreapta de variaie a pantei, drepte care ndeplinesc condiia de a trece prin toateintervalele de vrst determinate clasic. Pe baza acestui grafic s-au dedus vrstele cele maiprobabile ale indivizilor dintre 17 i 90 de ani. Valorile deduse se regsesc n tabelul din figura 7.

IndividVrsta estimat

prin metodadescris

F 17-19

C 19-21

A 21-23

K 30-35

H 32-36

G 33-37

L 34-39

B 36-40

Fig.7. A. Metoda de deducie a vrstei indivizilor pe baza pantei funciei CC-concentraie ADN. Cunegru sunt reprezentate intervalele de vrst deduse prin metode antropologice. Cu albastru suntvalorile pantelor funciilor corespunztoare fiecrui individ. Prin trasarea unor drepte paralele cuvalorile pantelor astfel nct acestea s se intersecteze la fiecare individ cu intervalul dedus anterior,se pot obine intervale mult mai restrnse ale vrstei indivizilor B.

Excepii ale valorilor indicilor FTIR la oasele de copiin cutarea corelrii dintre indicii FTIR i concentraia de ADN extras din diferite tipuri

de oase, n cazul coastelor i a oaselor craniului s-a observat o anomalie. Figura 8 arat indiciiC/P i CC n relaie cu concentraia de ADN din coastele diferiilor indivizi. Punctul unde apareo cretere a valorilor indicilor corespunde osemintelor unui individ nou nscut.

Fig.8. Indicii C/P i CC n relaie cu concentraia de ADN extras din coastele diferiilor indivizi.Individul E, la care apare o aberaie n grafic, este un nou nscut.

Figura 9 conine valorile indicilor FTIR pentru probe preluate din oasele craniului aleindivizilor investigai. Se poate observa creterea valorilor C/P i CC i scderea lui IRSF fa derestul probelor n dou cazuri. Individul E (M5b) este acelai nou nscut evideniat n graficulanterior, iar individul D (M5a) este un copil de 11-15 ani. Restul indivizilor reprezentai n acestedou grafice au vrste mai mari (Tabel 3).

(coaste)

0

1

2

3

4

5

K9 E45 F56 D56 G67 A8

Concentraii cresctoare de ADN (ng/ul)

C/PCC

Fig.9. Indicii FTIR n relaie cu concentraia de ADN extras din oasele craniilor. Probele aparinndindivizilor D (M5a) i E (M5b) prezint aberaii fa de trendline.

Tab.3. Vrstele indivizilor reprezentai n figurile 12 i 13. Cu rou sunt ncadrate probele careprezint anomalii de la grafic. Cu verde e evideniat proba care n oasele craniului prezintdiferene de la linia general dar n coast nu.

Proba ConcentraiaADN (ng/ul)

Vrstaindividului

K9 4.8 20+E45 11.8 nou nscutF56 38.6 17--19D56 40.3 11--15G67 55.7 33--42A8 71.1 20--23

Proba ConcentraiaADN (ng/ul)

Vrstaindividului

K3 0.4 20+E123 1.6 nou nscutH23 2 21--53F2 2.6 17--19

C1234 3.7 15--25D1234 5.1 11--15

A3 31.2 20--23B3 33 26--70G3 46.7 33--42A2 52.4 20--23G2 53.8 33--42B2 78.2 26--70

Oasele craniului au prezentat o cretere a valorilor C/P i CC la indivizi sub 15 ani, efectobservat la oasele costale doar la indivizi sub 11 ani. Prin diferena de osificare ntre anumiteoase ale corpului i prin compararea cu date de osteologie juvenil se poate determina vrstaunui individ la momentul morii. Rezultatele acumulate aici sunt insuficiente pentru formareaunui etalon complet, dar indic spre o metod alternativ de determinare a vrstei la oaselearheologice, acolo unde rmiele umane sunt incomplete, lipsind markeri eseniali aideterminrii vrstei. Desigur, pentru o analiz comprehensiv, sunt necesare mult mai multeprobe dect am avut noi la dispoziie i indivizi aflai n etape ale vieii mai apropiate ntre ele,pentru a forma o linie continu. Probele ar trebui alese astfel nct s se urmreasc toate oaselecorpului, mai puin prile de articulaii care deja sunt folosite n analiza antropologic ladeterminarea vrstei, unde analiza ar fi redundant.

S-au mai fcut ncercri de corelare a vrstei cu proprieti ale spectrelor FTIR a oaselori s-a artat c odat cu naintarea n vrst are loc o intensificare a mineralizrii n esuturileosoase animale (Alvarez-Lloret i colab., 2006).

Valorile indicilor FTIR i concentraia de ADN, n funcie de tipul de osPentru a diferenia oasele cu cea mai mare ans de izolare a ADN, s-au calculat valorile

medii ale indicilor FTIR i ale concentraiilor de produs extras (Tabel 4). Cea mai mare cantitatede material genetic a fost extras din probele de os spongios din corpurile vertebrale (50-60ng/l), urmat de coaste (~45-50 ng/l) i de osul spongios al oaselor scurte i al epifizelor

(craniu)

K3E1

23 H23 F2

C123

4D1

234 A3 B3 G3 A2 G2 B2

Concentraii cresctoare de ADN (ng/ul)

IRSFC/PCC

testate (~40-46 ng/l). Urmeaz osul compact al diafizelor, cu valori ale concentraiei deaproximativ 30-34 ng/l i osul craniului, cu ~28-33 ng/l. Valoarea mai mic a mediilor s-acalculat folosind toate datele disponibile, iar cea mai mare ( Media ) s-a obinut eliminndvalorile extreme ale unui individ, unde probabil diferena a rezultat dintr-o eroare de manipularen etapa de extracie.

Indicele CC se refer la coninutul de material organic dintr-un os. Valorile minime(~0.11) s-au gsit la oasele nchise (diafize i craniu) acolo unde i cantitile de ADN extras aufost cele mai mici, iar oasele spongioase i coastele au valori mai mari ale CC (0.15-0.18).Explicaia ar fi faptul c n oasele spongioase exist contaminare cu material organic microbian.n ciuda msurilor luate pentru a distruge urmele de ADN exogen, e foarte probabil ca n spaiiledin interiorul esutului spongios curarea s nu fi fost destul de eficient. Probele din oaselecompacte ale diafizelor i din osul craniului au fost preluate din adncime, deoarece grosimeaesutului a permis, astfel reducnd substanial ansa ca acolo s se fi dezvoltat bacterii.

Raportul C/P se distribuie, de asemenea, n aceleai dou direcii: valorile mici (0.17)corespund oaselor cu CC i concentraie de ADN mai mici, iar cele mari (0.21-0.25) celeilaltecategorii. Valoarea mare a carbonatrii oaselor spongioase se poate datora carbonatului din sol,care, dizolvat n ap, a putut ptrunde mai uor n spaiile din esutul spongios dect n oaselecompacte, recristaliznd pe suprafaa apatitei.

Indicele IRSF are valori de 3.3-3.6 pentru oasele compacte i 3.1-3.2 pentru oaselespongioase, ceea ce nseamn c mrimea cristalitelor de hidroxiapatit din oasele compacte estesuperioar celei din oasele spongioase, unde, conform deduciei de mai sus, o mare cantitate decarbonat s-a ncorporat n reeaua mineral. Carbonatul, avnd structura diferit de a fosfatului,reduce cristalinitatea prin dezordonarea structurii, nepermind cristalului s creasc natural, decipstrnd o valoare mai mic a indicelui IRSF.

Valorile medii ale indicilor FTIR se potrivesc cu modelul descris n subcapitolulCorelarea indicilor FTIR cu concentraia de ADN extras, concentraia mai mare de ADNcorespunznd probelor cu CC i C/P mai mari i IRSF mai mic, i invers. Aadar, cele maipotrivite oase pentru extracia de ADN sunt cele compacte, groase i nedeschise, astfel, se reducecontaminarea cu bacterii i cu alte substane chimice inhibitoare din sol. Din aceste considerente,n continuare se vor aprofunda i compara caracteristicile tipurilor de os cranian i a unor diafize.

Tab.4. Valori medii ale concentraiilor de ADN extras i ale indicilor FTIR pe grupe de oase.Conc ADN (ng/ul) CC C/P IRSF

Media Media Media Media Media

Vertebre - S50.707 59.063 0.158 0.214 3.243

Coaste44.812 50.528 0.184 0.231 3.199

Spongios40.4 46.114 0.187 0.254 3.109

Diafize - C29.469 34.363 0.114 0.177 3.37

Cranii28.223 33.171 0.115 0.176 3.623

Oasele craniuluin cadrul osului craniului se disting straturile de os spongios i compact. S-au comparat

valorile indicilor FTIR i concentraia de ADN extras pentru cele dou tipuri de esut cranian laciva indivizi, unde starea de reprezentare a permis acest lucru. La oasele indivizilor foartetineri, osul craniului este prea subire pentru a putea prelua cele dou tipuri de probe ntr-un mod

precis. Concentraia de ADN obinut din probele de os cranian compact i spongios se coreleazpozitiv cu valorile C/P i CC i negativ cu valoarea indicelui IRSF, corespunznd observaiilorfcute mai sus (Figura 10). n grafic, datele sunt reprezentate relativ i nu ca valori absolute,pentru a arta relaia ntre probele aparinnd aceluiai individ. Datele exacte sunt prezentate ntabelul 5. Rndurile gri deschis reprezint oase compacte, iar cele gri nchis sunt oasespongioase. Valorile foarte mici ale concentraiei ADN de la individul K le-am atribuit uneigreeli de manipulare n etapa de extracie, de aceea le-am eliminat de la calcularea valorilormedii (mai sus), dar am considerat c pierderea a fost proporional la toate probele, deci ndiscuia comparrii datelor intra-individual, rezultatele se pot lua n considerare.

Fig.10. Corelarea direct ntre concentraia de ADN extras i indicii CC i C/P i corelarea lorinvers cu IRSF, la indivizii A, B, K. Individul G prezint o neconcordan cu restul rezultatelorobservate. A = individul M2, B = individul M3, K = individul M115A, G = individul M7, C = os

compact, S = os spongios. Indicii nu sunt reprezentai n valori absolute.

Tab.5. Valorile concentraiei ADN extras din poriunea compact (gri deschis), respectivspongioas (gri nchis) a oaselor craniene de la indivizii A, B, G i K, i valorile indicilor FTIRcorespunztori.

Individ Conc (ng/l) IRSF C/P CC

A 52.4 3.803 0.139 0.045

31.2 4.034 0.1 0.038

B78.2 3.63 0.159 0.136

33 3.876 0.138 0.104

G53.8 3.791 0.129 0.048

46.7 3.791 0.136 0.056

K1.6 3.323 0.174 0.145

0.4 3.633 0.156 0.068

Dintre indivizii studiai, unul singur (M7-G) nu se supune modelului: n acest caz, indiciiFTIR au avut valorile IRSF i C/P aproape identice pentru osul spongios versus cel compact, iarCC a fost invers proporional cu concentraia de ADN extras. Probabil c osul compact a suferito fosfatizare concomitent cu o decarbonatare, ceea ce a dus la scderea indicilor CC i C/P i lacreterea IRSF. Mormntul M7 are ntr-adevr o deosebire major fa de celelalte dinnecropol, i anume prezena unor brne de lemn i a ocrului. Este posibil ca materialul organic

(craniu)

A.C A.S B.C B.S K.C K.S G.C G.S

ConcIRSFC/PCC

vegetal suplimentar s fi fost legat preferenial de carbonatul din vecintatea scheletului i astfelexteriorul craniului s fie mai puin carbonatat dect stratul spongios profund.

n figura 11 sunt reprezentate spectre ale diferenei dintre spectrul osului compact i cel alosului spongios pentru fiecare din indivizii testai. Spectrele explic datele prezentate n figura10. Se observ diferena mare ntre valorile indicelui CC la individul K, prin nlimea peak-uluiamidei I n spectru i egalitatea indicilor la individul G, unde spectrul de diferen nu are un vrf. n ceea ce privete indicele C/P, diferena se manifest la nivelul peak-ului fosfatului: pentruindivizii A, B i K valoarea diferenei absorbiei ntre compact i spongios este o valoarenegativ, pe cnd la individul G osul compact are un coninut de fosfat mai mare dect celspongios. i pentru IRSF (cu detaliu n medalion) diferena se poate arta de pe spectru: laindividul A zona de diferen a spectrelor corespunztoare peak-ului despicat arat ca litera W,i n contrast, la individul G spectrul este invers, ca un M.

Fig.11. Diferena dintre spectrele de absorbie ale osului compact i spongios pentru indivizii A, B,K i G. Se observ diferenele de la nivelul amidei I, al carbonatului i fosfatului i din zona de

calcul a indicelui de cristalinitate IRSF, care se vede n detaliu n medalion.

DiafizeS-a comparat randamentul extraciei de ADN din osul compact a unor diafize degradate

diferit, aparinnd aceluiai individ. n cazul individului M7-G, indicii i concentraia de ADNsunt n relaie identic cu a cazurilor prezentate mai sus i n concordan cu atribuirea vizual acaracterului de degradare (Figura 12A). i pentru diafizele individului M3-B, concentraia ADNextras a coincis cu degradarea macroscopica a osului (Figura 12B, Tabel 6), ns valorileindicilor nu au corespuns: IRSF i CC au fost aproape identice pentru cele dou oase, iar C/P fostinversat (Tabel 6). Totui, faptul c aici indicii FTIR nu aduc mult ajutor n alegerea osului maipotrivit pentru extracie, este normal s alegem osul mai puin degradat dac urmrim purificareade ADN.

Fig.12. A. Corelarea dintre concentraia ADN extras din dou diafize ale individului M7-G (probaG9 mai slab conservat dect proba G14) i indicii FTIR pentru oasele respective. B. Fotografie a

probelor din individul M3-B, unde proba B8 este vizibil mai bine conservat dect proba B11.

Tab.6. Valorile concentraiei ADN extras din probele de os compact lung pentru indivizii B i G iale indicilor FTIR n oase cu grade de degradare vizibil diferite. Pe rndurile gri deschis sunt

probele mai slab conservate i pe rndurile gri nchis sunt probele mai bine conservate.

Concentraie(ng/ul) IRSF C/P CC

B11 35 3.554 0.165 0.082

B8 111.8 3.505 0.144 0.084

G9 54.9 3.421 0.152 0.093

G14 77.3 3.189 0.189 0.146

Extracia de ADN vechiADN-ul extras din probe arheologice este puternic degradat. Dup cum se vede n Figura

13, majoritatea materialului extras are lungimi sub 50 pb. Primele dou probe sunt extrase dinoasele craniului, compact i spongios. Toate celelalte probe (din corp vertebral, coast, doudiafize compacte i o epifiz spongioas) prezint urme majore de contaminare cu ADN modern,n partea de sus a gelului. ADN modern nu este la fel de degradat, deci nu migreaz la fel derepede n gelul de agaroz. Contaminarea este cel mai probabil de origine microbian, n probeleextrase din os spongios fiind mult mai evident. Blankul de extracie nu conine ADN.

Fig.13. Gel de agaroz 2% cu ADN vechi extras din probe de os. Banda inferioar amarkerului are 50 pb.

G9 G14

CONCIRSFC/PCC

A

Determinarea inhibitorilor PCR co-extrai cu ADN anticEste un fapt bine cunoscut n literatur c ADN extras din probe antice conine inhibitori

ai PCR, ceea ce constituie o mare problem. Chiar i la adugarea unui l de extras ADN ntr -unPCR cu ADN modern, reacia este inhibat (Kalmar i colab., 2000). S-a ncercat deducereasubstanelor ce rmn n extrasul de ADN i inhib reaciile ulterioare, pentru a putea dezvolta ometod eficient i direcionat de purificare. Prin compararea spectrelor de absorbie FTIR (defapt de Transmisie) ale probelor de ADN extras cu ale substanelor folosite n etapa de extracieADN (sursa: chemicalbook.com), s-au exclus fenolul i cloroformul dintre potenialii inhibitori(Figura 14). n intervalul 3000 1700 cm-1, fenolul are cteva peakuri care n probele noastre nuapar, iar cloroformul are un peak puternic la 800 750 cm-1, peak ce nu se observ n probe.

Fig.14. Evidenierea diferenelor dintre spectrele de absorbie n IR ale fenolului (gri deschis) icloroformului (gri nchis) n comparaie cu spectrul specific al ADN antic extras (jos). Cu rou sunt

marcate peak-urile care infirm prezena acestor substane n produsul extras.

Substanele folosite n soluia de decalcifiere au fost de asemenea verificate princompararea spectrelor individuale (chemicalbook.com) cu spectrul probelor obinutue prinextracie. SDS-ul iese din calcul din cauza peak-ului puternic de la 3000 2700 cm-1 i TRIS-uldatorit peakului ngust de la 1040 cm-1. n schimb, EDTA pare s corespund spectrului deabsorbie al probelor investigate, avnd un peak puternic la 1600 cm-1, i mai multe mici ntre1400 1000 cm-1, la fel ca probele de ADN extras (Figura 15).

Fig.15. Comparaie a spectrelor SDS (gri pal), EDTA (gri) i TRIS (gri nchis) cu al ADN-uluiantic extras (jos). Marcate cu rou sunt peak-urile care dovedesc absena SDS i TRIS n produsul

de extracie. Cu verde e evideniat EDTA, cu un spectru asemntor cu al probei.

Aadar, se pare c substana care rmne n probele de ADN i inhib amplificarea prinPCR ar putea fi EDTA, un cunoscut inhibitor al polimerazei, ce acioneaz prin chelatarea ionilorde magneziu, necesari enzimei pentru funcionare.

Pe lng culoarea maronie a probelor obinute, s-a observat c extractul de ADN arefluorescen albastr n UV (Figura 16). Pe lng aceste dou observaii, Pbo spunea cprobele de ADN antic extras au un miros plcut, dulciu (2014). Aceste indicii conduc nspreexistena n probe a produilor Maillard.

Fig.16. Gel de agaroz n UV, pe care s-a migrat ADN antic. Se observ fluorescena albastr.

Produii Maillard copurificai cu ADN antic pot fi de origine endogen (din condensareacolagenului cu zaharuri) sau pot proveni din sol. Principala component organic a solului suntacizii humici (Figura 17), molecule organice complexe de origine abiogen, ce se formeaz de-alungul timpului, prin reacie Maillard ntre molecule de resturi organice rmase n sol. n plus,acizii humici sunt cunoscui ca fiind inhibitori ai polimerazei n PCR. Figura 18 arat spectre deabsorbie n IR ale unor acizi humici. Primele 2 casete conin imagini preluate din literatur,caseta C conine spectrele IR ale acizilor humici conform chemicalbook.com, iar caseta Dconine spectrul de absorbie al probei G9 de ADN extras din os. Complexitatea i variaiastructurii chimice a acestor molecule duce la diferene n spectru n funcie de proprietilesolului din care provin. n plus, n probele studiate aici, acizii humici sunt n amestec cu ADN,care contribuie i el cu mici diferene la proprietile spectrale, iar posibilitatea ca i EDTA s fifost copurificat nu trebuie omis.













Fig.17. Formula chimic general a acizilor humici.

Fig.18. Spectre de absorbie n IR ale unor acizi humici. A dup Rodriguez i colab., 2009; B dup Fong i colab., 2006; C chemicalbook.com; D proba G9 de ADN extras din os.

nlturarea produilor inhibitori din extractul de ADNS-a ncercat purificarea ADN-ului extras cu kitul SureClean Plus de la Bioline, dar fr

a folosi co-precipitantul roz, care ar fi putut da semnale spectrale care s interfereze cuinterpretarea datelor, i la UV i n IR. Diferena dintre spectrele de absorbie n IR ale probelornainte i dup purificare se poate observa n figura 19, unde spectrul de sus, negru, arattransmitana probei D1 nainte de purificare, spectrul rou dup purificare, iar spectrul albastrueste diferena celor 2 spectre, fiind o vizualizare a cantitilor i tipurilor de contaminaninlturai. Colorarea maronie a probelor a fost redus sau nlturat prin folosirea kitului, iarspectrele confirm nlturarea unei pri din contaminani.

Fig.19. Spectrele de absorbie n IR ale probei D1, nainte i dup purificarea cu kitul SureCleanPlus de la Bioline (spectrul negru, respectiv rou) i diferena dintre acestea (spectrul albastru). Seobserv c peak-ul puternic de la 1600 cm-1 i peak-urile mai mici dintre 1400 1100 cm-1 dispar.

Valorile concentraiei de ADN citite prin spectrometrie UV nainte i dup etapa depurificare ar trebui s fie corelate liniar, aa cum este n cazul probelor aparinnd indivizilor D

i G (Figura 20.1), dar nu ntotdeauna relaia se pstreaz (Figura 20.2). La indivizii A i B nuexist o corelare ntre concentraiile ADN citite la spectrofotometru pentru fiecare prob. Sepoate ca din cauza faptului c nu s-a folosit co-precipitantul roz, ADN s fi fost aruncat dinanumite probe, astfel explicnd necorelarea. Cantitatea de ADN n aceste probe este prea micpentru a se forma un pellet vizibil, crescnd posibilitatea aruncrii materialului genetic. O altexplicaie ar putea fi legat de degradarea ADN, fragmentele sub 100 pb fiind eliminate de kit.Deci, dac o anumit prob coninea un raport mai mare de fragmente sub 100 pb, concentraiade ADN dup purificare trebuie s fi sczut mai mult dect la o prob cu puine fragmente mici.

Fig 20.1. Corelarea liniar a concentraiilor de ADN nainte i dup purificarea cu kitul SureCleanPlus de la Bioline. 2. Probe pentru care corelarea liniar nu s-a pstrat.

Efectele etapei de purificare asupra randamentului PCRNu s-a reuit creterea randamentului PCR prin purificarea cu kitul SureClean Plus de la

Bioline. Urmeaz s se ncerce i alte metode de purificare a ADN, cum ar fi precipitarea cuizopropanol (Hnni i colab., 1955), sau introducerea n procesul de extracie a PTB (N-phenacylthiazolium bromide), substan ce inverseaz reaciile Maillard.

Nici creterea concentraiei de MgCl2 pn la 2.5 mM, i nici reducerea concentraieiamorselor pn la 0.5 pmoli/l nu au avut efect pozitiv asupra reaciei de amplificare. Folosireaadjuvanilor, ca BSA i 2x Polymate AdditiveTM (Bioline) nu au reuit s contracareze efectulinhibitor al compuilor copurificai. S-au ncercat diferite diluii ale ADN, dar rezultatul a fostntotdeauna negativ. Pe toate gelurile s-au vzut dimeri de amorse, la ~50pb.

Totui, faptul c probele au fost curate eficient de compuii Maillard prin metodaadoptat (dup cum demonstreaz rezultatele prezentate n lucrarea de fa) se contrazice cunereuita tuturor ncercrilor de a mbunti randamentul PCR. Se poate ca ntr-adevr ADN sfie att de puternic degradat, nct reacia nu are matri de lungimea potrivit de la care sporneasc, avnd n vedere faptul c populaia studiat aici are 4500 de ani vechime (conformdatrii radiometrice). Prin comparaie, la un individ ce dateaz din secolele IV V d.Cr (Rusu-Bolinde i colab., 2014), deci cu o vechime de aproape o treime din cea a populaiei de laMireasa, s-au putut efectua amplificri ale fragmentelor HVR1 A, B, C, i D, folosind aditiviiBSA sau Polymate, cu 2.5 mM MgCl2 i o diluie a ADN matri de 1:30. Produsul de extraciede la acest individ nu a fost purificat, dar tot a dat rezultate, n ciuda colorrii maronii. Aadar, separe c timpul petrecut de oseminte n sol are o influen asupra randamentului experimentelorulterioare, mai ales cnd diferenele de perioade sunt att de mari. Pentru indivizi datai laintervale de timp apropiate, factorii de mediu sunt decisivi n procesul de diagenez, dar aicidiferena de vrst i spune cuvntul.

0 500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

6000

6500Concentraia ADN nainte de

purificarea

Con

cent

raia

AD

N d

up

purif

icar

ea p

rodu

ilo

r GD

Concentraia ADN nainte depurificarea

Con

cent

raia

AD

N d

up

purif

icar

ea p

rodu

ilo

r AB

CONCLUZII

O comparaie ntre valorile indicilor FTIR la indivizi diferii nu se poate face n modrelevant, fiecare dintre ei suferind un grad de diagenez diferit, n funcie de condiiile dinimediata vecintate. Se pot compara doar oase ale aceluiai individ pentru a alege variantaoptim pentru o extracie ulterioar.

n general, se recomand extragerea de ADN din oase lungi sau ale craniului, din zonegroase de os compact, care nu au fost deschise, deci au anse mult mai mici de contaminare, i nniciun caz din oase spongioase, care dei par s conin mai mult ADN, acesta e n mare parte deorigine exogen, bacterian cel mai probabil.

O legtur impresionant s-a observat ntre valorile indicilor FTIR i vrsta indivizilor lamoarte. Astfel de tehnici pot veni cu mult n ajutorul metodelor clasice de atribuire a vrstei.

S-au identificat compuii colorai din extrasul de ADN, puternici inhibitori ai PCR, cafiind acizi humici, probabil n amestec cu EDTA.

Prin purificri suplimentare ale ADN se poate reduce cantitatea de substane coextrasenedorite care inhib PCR, dar apare i riscul reducerii cantitii de material genetic din probe.

La populaia de la Mireasa, datnd din epoca Bronzului, nu s-a reuit amplificarea niciunui fragment de ADN mitocondrial, motivul cel mai probabil fiind vechimea oaselor.

Studiul II.Diagnosticul molecular al tuberculozei la o populaie gotic din Gherseni,Romnia

Din necropola de la Gherseni, judeul Buzu, au fost deshumai doi indivizi, notai M3 iM4, despre care s-a presupus c au fost afectai de boala lui Pott (tuberculoz osoas). Pentru cau trit n aceeai perioad, o boal infecioas ar putea uor s explice distribuia aceloraisimptome ntr-o comunitate restrns. Dat fiind lipsa dovezilor patognomotice, scopul acesteilucrri experimentale a fost confirmarea sau infirmarea prin metode moleculare a prezeneituberculozei. Lumea tiinific este preocupat de secvenarea ADN-vechi provenit dinorganisme patogene deoarece astfel se poate identifica rata mutaiilor n situsuri implicate npatogenitate. Dat fiind dezvoltarea n ultimele decenii a tulpinilor MDR i XDR de M.tuberculosis, este important identificarea mecanismului de achiziie a rezistenei la antibiotice.Dei experimentul n discuie nu va putea rspunde la aceast ntrebare, el i propune sconfirme existena tuberculozei n acea populaie antic i astfel va pune bazele unui stud iu maiaprofundat.

Analiza antropologicAnaliza antropologic s-a realizat pe baza unor standarde de antropologie fizic pentru

exist grile de atribuire a scorurilor pentru fiecare marker osteologic (Brickley i McKinley,2004). Vrsta este determinat folosind suturile craniene, uzura suprafeei auriculare i a simfizeipubiene. Pentru stabilirea sexului se iau n calcul: markerii cranieni: glabela, protuberana nucali mental, linia supraorbital, procesul mastoid; markerii pelvieni: arcul ventral, concavitateasubpubiana, aspectul ramurii ischiopubiene i al sulcusului. Se pot semnala i unele patologiicare afecteaz osul, dar toate caracterele determinate prin antropologie fizic sunt probabilistice.n afar de vrst, celelalte ipoteze pot fi confirmate prin metode moleculare.

Pstrarea condiiilor de sterilitatePentru a se evita contaminarea probelor cu ADN-modern sunt urmate reguli stricte de

procedur n laboratoare. Etapele de burghiere a osului, extracie de ADN-vechi i amplificareprin PCR i electroforez, sunt separate fizic, realizndu-se n laboratoare diferite. Toatelaboratoarele de ADN-vechi se afl la un etaj al institutului unde nu exist laboratoare n care sse lucreze cu ADN-modern. Cele trei laboratoare de ADN-vechi sunt dotate cu filtre cu UV ilmpi de UV. Filtrele funcioneaz non-stop iar lmpile de UV sunt pornite pe timpul nopii dari n timpul zilei atunci cnd se ncheie munca la un individ i se trece la altul. Se lucreaz nhote cu presiune pozitiv i lmpi cu UV. Personalul este echipat cu combinezoane, mti cufiltru, mnui. Exist un circuit al personalului, astfel c nu se intr n laboratorul de extraciedup ce s-a lucrat n cel de PCR.

Analiza FT-IR (Fourier transform infrared spectroscopy)Probele pentru analiza FT-IR au fost prelevate din vertebre i coaste, zone preponderent

afectate de tuberculoz. n plus, s-au testat probe din oasele lungi (ex. radius) ca i controlnegativ. 0,8 mg pudr de os s-au amestecat cu 150 mg KBr i s-au mojarat folosindu-se mojar ipistil din agat. Proba se comprim cu ajutorul unei prese hidraulice pn la presiunea de 175kg/cm2 pn cnd se formeaz o pastil translucid. n urma spectroscopiei se obine un spectru

ntre numerele de und 400 - 4000 cm-1. Pentru fiecare prob s-a fcut blank-ul cu o probcompus doar din Kbr iar baseline-ul a fost corectat. Dup prelucrarea fiecrei probe s-au cutatsemnalele specifice date de acizii micolici. Oasele pentru extracia ADN au fost selectate peseama spectrului FT-IR. Pentru fiecare prob s-a calculat indicele de cristalinitate (infraredsplitting factor) ca raportul dintre absorbanele (A) la numerele de und (A565+A605)/A588.Aceast valoare este important pentru c se afl n corelaie cu dimensiunea cristalelor dehidroxiapatit. S-a calculat i raportul dintre carbonat/fosfat (A1415/A1035) care ne spune ctanume din carbonat s-a pierdut, probabil n urma dizolvrii n sol. Cantitatea de colagen pstratn oase se poate deduce pe seama raportului A1660-A1645/A1035. Aceast valoare esteproporional cu cantitatea de ADN-endogen pstrat. Toate aceste valori se folosesc atunci cndse alege o prob de os pentru extracia ADN.Protocolul de extracia al ADN-vechi

DecontaminareaProbele alese pentru extracia ADN-vechi au fost tratate pentru a ndeprta contaminarea

cu ADN modern de la suprafata oaselor. Oasele au fost splate cu ap UV/UP, uscate i iradiatepe fiecare parte cu UV pentru 20 min. Suprafaa osului a fost ndeprtat cu o frez dentarsteril i osul a fost iradat pentru nc 10 min.

Decalcifierea i ndeprtarea colagenului de tipul IOsul decontaminat a fost transformat n pulbere cu ajutorul unei freze dentare sterile i a

unui micromotor rulat la vitez mic pentru a se evita degradarea ADN-vechi prin nclzire. 200mg pudr de os au fost incubate peste noapte la 56oC cu 1mL soluie de decalcifiere (0.5 MEDTA pH 8.08.5; 0.5% SDS; 50 mM Tris HCl pH 8.0; 1 mg/ml proteinaza K).

Extracia cu fenol-cloroform1. Probele incubate peste noapte au fost centrifugate 5 min la 6.000 rpm.2. S-a transferat supernatantul ntr-un tub Eppendorf nou i s-a adugat un volum egal de fenol-cloroform-alcool izoamilic (25:24:1) i s-a agitat.3. Probele au fost centrifugate 15 min la 6.000 rpm.4. S-a preluat faza apoas, fr s se ating faza organic, i s-a transferat ntr-un tub nou. S-aadugat un volum egal de fenol-cloroform-alcool izoamilic (25:24:1) i s-a agitat. Probele au fostcentrifugate 15 min la 6.000 rpm.5. S-a transferat faza apoas ntr-un tub nou i s-a adugat un volum egal de cloroform, apoituburile s-au agitat. Tuburile au fost centrifugate 15 min la 6.000 rpm.6. Faza apoas s-a transferat ntr-un tub nou. S-au adugat 1/10 volume de CH3-COONa 3M, pH5.2 i 2,5 volume de etanol absolut.7. Probele au fost inute la -80oC pentru 10 min (o alternativ: 30 min la -3oC).8. Tuburile se centrifugheaz 15 min la 12.400 rpm.9. Supernatantul s-a ndeprtat cu pipeta, iar pellet-ul s-a splat cu 1 mL etanol 80% i a fostcentrifugat 15 min la 12.400 rpm. S-a repetat pn cnd s-a format un pellet stabil*.

*Deoarece ADN-vechi este foarte contaminat cu substane din sol, e posibil s fie necesari mai mult de treipai de splare.

10. Pellet-ul a fost uscat la 37oC pentru a se ndeprta orice urm de etanol.11. ADN a fost resuspendat n 50 L ap PCR Grade sau tampon TE.

Cuantificarea ADN-vechi extrasCantitatea de ADN din fiecare prob a fost cuantificat prin dou metode: electroforez

n gel de agaroz i spectrofotometrie.

Electroforez n gel de agarozDeoarece ADN-vechi este foarte degradat i se gsete aprope n totalitate n fragmente

de 50-200 pb, s-a preparat un gel cu concentraia de 2% agaroz. 100 mL tampon TAE seamestec cu 2 g agaroz ntr-un pahar Erlenmeyer. S-a topit agaroza folosindu-se un cuptor cumicrounde. S-a lsat s se rceasc amestecul i s-au adugat 5 L bromur de etidiu (10mg/mL)pentru a se ajunge la concentraia final de 0,5 g/mL. ADN-vechi s-a ncrcat n godeuri. Semigreaz cu 5-10 V/cm (distana dintre electrozi). ADN s-a vizualizat prin iradierea gelului cuUV ntr-un transiluminator (Barbas et al., 2001).

SpectrofotometrieAcizii nucleici absorb radiaia luminoas cu lungimea de und de 260 nm, proteinele

absorb la 280 nm iar fenolul la 230 nm. Pentru aceast analiz este necesar proba de ADN ce sedorete cuantificat, o prob martor (apa sau tamponul TE n care s-a resuspendat ADN) i unspectrofotometru (NanoDrop Spectrophotometer). Suprafaa optic superioar i inferioar s -asplat cu ap UV/UP. S-a deschis software-ul aparatului i s-a selectat modulul - acizi nucleici.Mai nti se citete o prob de ap. Apoi se citete proba martor prin adugarea a 1 -2 L pesuprafaa optic i selectarea butonului - Blank. Apoi s-au adugat cte 1-2 L din probele deADN i s-a selectat opiunea - Measure. Dup fiecare msurtoare suprafeele optice au fostsplate cu ap UV/UP. Pentru o cuv cu latura de 1 cm, o soluie pur de ADN dublu-catenar cuconcentraia de 50 ng/L are densitatea optic (OD260) egal cu 1. Pe baza acestei corelaii,aparatul afieaz concentraia de ADN existent n probe. Valoarea optim pentru raportul260/280 este cuprins ntre 1.8 - 2. O valoare mai mic este interpretat ca o contaminare cuproteine, iar una mai mare indic prezena ARN sau a ADN mono-catenar (Barbas et al., 2001).PCR (Reacia n lan a polimerazei)

Pentru confirmarea tuberculozei s-a dorit amplificarea unor secvene de ~100 pb dinlocii: pncA, oxyR, IS1081 i D1. Amorsele au fost concepute de Taylor i colab. (2005) cnd auinvestigat cazul de la Tarrant Hinton. Acetia au descris i condiiile de reacie (Tabelul 1).

Tabelul 1. Condiiile de reacie descrise de Taylor i colab. (2005)

Pentru fiecare set de amorse s-a realizat un control pozitiv folosind ADN-genomic de laM. tuberculosis primit de la Institutul Cantacuzino, Romnia. Reaciile pentru ADN modern ivechi s-au realizat n laboratoare diferite (aflate la etaje diferite) ale institutului pentru a se evitacontaminarea i obinerea de rezultate fals-pozitive.

Pentru c randamentul reaciilor pe ADN-vechi este sczut, pentru fiecare set de amorses-au realizat dou reacii succesive, la al doilea PCR folosindu-se 1 L din produsul primului.Am adaptat reaciile crescnd temperatura de aliniere la pncA i IS1018 cu 2oC. Aceasta ne-aajutat c cretem specificitatea reaciilor. Am folosit BSA (albumin seric bovin), PEG(polietilen glicol) i DMSO (dimetil-sulfoxid) ca i aditivi pentru a crete randamentul reaciei.Pentru fiecare PCR s-au realizat 30 de cicluri.

Purificarea ADN din gelul de agarozProduii PCR s-au migrat n gelul de agaroz urmnd metoda descris mai sus. Etapa de

purificare a ampliconilor din gel s-a realizat cu ajutorul kitului Agarose Gel extraction Kit, JenaBioscience.

Clonarea produilor PCRAceast etap s-a realizat folosind kitul CloneJET PCR Cloning Kit, Thermo

Scientific. Am folosit protocolul de clonare cu capete boante (Blunt-End Cloning Protocol).Prima dat s-au digerat capetelor adezive prin realizarea mixului: 2X tampon de reacie - 2 L,H2O - 1.5 L i DNA Blunting Enzyme - 0.5 L. Amestecul s-a vortexat, centrifugat apoi s-aincubat la 70oC pentru 5 min. Probele s-au rcit pe ghea. Reacia de ligare s-a realizat prinadugarea la amestec a 0,5 l pJET1.2/blunt Cloning Vector (50 ng/l) i 0,5 l T4 DNA -ligase.Tuburile s-au vortexat, centrifugat i incubat la temperatura camerei pentru 30-60 min. Pentruclonare s-a realizat urmtorul amestec: KCM 5X - 20 L, H2O - 70 L, Produs de ligare - 10L. Celulele competente s-au scos de la -80oC i s-au dezgheat pe ghea. 100 L suspensie decelule competente s-au adugat la amestecul descris mai sus. Tuburile s-au pstrat pe gheapentru 20 min, apoi la temperatura camerei pentru nc 10 min. S-a adugat peste amestec 1 mLmediu LB lichid. Tuburile s-au inut la 37oC pentru 20 min. 200 L amestec s-a folosit pentruinocularea plcilor cu agar. Acestea s-au incubat la 37oC pentru ~16 ore.

* Prepararea mediului LB (Lysogeny broth) - lichid: 25 g LB - 1000 mL H2O- solid: 15 g agar la 1000mL H2O

- antibiotic - Ampicillin (100mg/mL) se adaug pentru un volum final de 100 g/mL.* Prepararea KCM 5X: 2M KCl - 2.5 mL, 1M MgCl2 - 2.5 mL, 1M CaCl2 - 1.5 mL, H2O- 3.5mL.Pentru preculturi se toarn 5 mL mediu LB lichid cu Ampicilin n tuburi de 15 mL

pentru preculturi. Acestea se inoculeaz cu o colonie de pe placa Petri. Preculturile se incubeazla 37oC, cu agitare 200 rotaii/minut, pentru ~16 ore.

Purificarea de plasmideAceast etap s-a realizat utiliznd kitul Fast-n-Easy Plasmid Mini Prep Kit, Jena

Bioscience. ADN s-a eluat n 50 L tampon de eluie.

Secvenializarea ADNProcedura de secvenializare a plasmidelor s-a realizat de ctre Macrogen Company,

Netherlands. Pentru reaciile de secvenializare s-au folosit amorsele specifice ale plasmiduluipJET 1.2.

Analizele bioinformaticeProduii PCR s-au identificat n interiorul secvenelor vectorilor prin cutarea amorselor

folosite la PCR utiliznd software-ul BioEdit 7.2.5. Fiecare secven s-a identificat princomparare cu cele existente n GenBank (NCBI) folosind instrumentul BLAST (Basic LocalAlignment Search Tool) cu opiunea blastn.

n cazul genei pncA, atunci cnd nu s-a obinut niciun rezultat folosindu -se parametrulHighly similar sequences, am schimbat parametrii algoritmului astfel: Program selection:Somewhat similar sequences; Expect threshold: 15; Word size: 7; Match/Mismatch Scores: 2,-3;Gap Costs: existence 2, extension 2 i s-a deselectat Low complexity regions filter. Secveneleobinute s-au aliniat cu toate secvenele omoloage din genul Mycobacterium din baza de dateGene folosindu-se algoritmul Muscle n Mega 5. Ca i secven outgroup s-a folosit secvenaomoloag a genei pncA de la Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. Alinierea a fostexportat n formatul MEGA, necesar pentru construirea de arbori filogenetici. Am rulat n Mega5 opiunea Models - Find Best DNA/Protein Models (ML) i am stabilit c trebuie folositmodelul evolutiv Tamura 3 cu distribuie discret Gamma.

Istoria evolutiv a secvenelor a fost calculat prin metoda Maximum Likelihood(Tamura, 1992). Arborele final este cel cu cea mai mare valoare log likelihood (-684.5563).Procentul arborilor n care secvenele au fost asociate n acelai cluster este afiat n dreptulramurilor (valoarea Bootstrap). Lungimea ramurilor este proporional cu numrul desubstituii/situs. Toate poziiile cu gap-uri au fost eliminate astfel c n setul final au fost luate nconsiderare 73 de poziii. Au fost analizate n total 45 de secvene nucleotidice (Tamura i colab.,2011).

Analiza antropologicDin necropola de la Gherseni au fost deshumate resturile osteologice a trei indivizi. Pe

baza standardelor de antropologie fizic s-au dedus urmtoarele aspecte: Individul M3 (M - mormnt)

a. Reprezentarea. Din craniu s-a pstrat doar calota cranian. Vertebrele cervicale,toracale i lombare, precum i coastele, s-au pstrat n proporie de 1/3. Sternul nu esteprezent. Dintre oasele lungi se pstrez partea proximal a humerusului de pe parteastng, partea distal a celui de pe dreapta, regiunea medial i proximal a radiusului depe dreapta. Omoplatul drept este mai bine reprezentat dect cel stng. Clavicula de pepartea dreapt este ntreag.b. Conservarea. n general suprafaa oaselor arat bine, iar conservarea a primit scormaxim.c. Sexul. Patru din cei 5 markeri osteologici cranieni lipsesc (glabela, creasta nucal,marginea supraorbital, mentonul). Mastoida a fost notat cu scorul 2 (1-feminin; 5-masculin), valoare corelat cu genul feminin. Niciunul din markerii pelvieni nu estereprezentat.d. Vrsta. Markerii osteologici lipsesc. Aspectul general spune c individul a ajuns lamaturitate.

e. Patologia. Se observ o artroz puternic pe partea proximal a humerusului stng.Artroza a afectat i vertebrele cervicale i toracale, ducnd la distrugerea platouluisuperior i inferior. Dou din vertebrele toracale sunt unite - corpurile vertebrale lipsescdar procesele spinoase se pstreaz (Figura 1). Procesele spinoase sudate, o vertebrcervical i dou coaste (stnga i dreapt) au fost supuse analizelor fizice i moleculare.

Figura 1. A. Epifiza proximal a humerusului stng afectat de artroz; B. Apofizele spinoase a douvertebre toracale sudate ntre ele; C. Platouri vertebrale afectate de artroz; D. Faa anterioar a uneivertebre cervicale afectat de artroz.

Individul M4a. Reprezentarea. Pentru c scheletul este aproape complet vom meniona doar oaselecare lipsesc: oasele minii (dreapta i stnga), vertebrele cervicale C1, C3, C5 i toracaleT1, T12, ischiumul i pubisul, femurul stng, patelele, talusul i calcaneul (dreapta istnga), oasele labei piciorului (dreapta).b. Conservarea. n general conservarea este foarte bun.c. Sexul. Scorurile acordate markerilor osteologici sunt prezentai n Tabelul 2. Sepresupune c individul avea genul feminin dar acest aspect urmeaz a fi clarificat printehnici moleculare.

Tabel 2. Scorurile acordate individului M4 markerilor osteologici asociai genului.CRANIU Scor (1=; 5=) PELVIS Scor (1=; 9=)

Creasta nucal 3 Concavitatea subpubian 4Mastoida 3 Unghiul subpubic -Marginea supraorbital 3 Ramura ischio-pubian 2Glabela 3 Arcul ventral 6Mentonul 4 Arcul compozit 7

Incizura sciatic 7Sulcusul preauricular 9

d. Vrsta. Vrsta individului s-a estimat pe baza markerilor din Tabelul 3 ca fiindcuprins ntre 38-58 ani.

Tabel 3. Estimarea vrstei individului M4 pe baza markerilor osteologici.Marker osteologic Vrsta estimat

Capetele sternale 43-58Simfiza pubian 38Suprafaa auricular 45-47Sinostoza suturilor 45-56Uzura dentar 40-45

e. Patologia. Se observ sudarea urmtoarelor perechi de vertebre: C6 i C7, T7 i T8,T10 i T11. Platoul inferior al vertebrei lombare L5 este complet distrus, la fel i platoulsuperios la S1. n aceste regiuni esutul compact lipsete iar cel spongios este expus(Figura 2). Aceste modificri s-a presupus c ar fi cauzate de boala lui Pott (tuberculozlocalizat n oase).

Figura 2. Probe din care s-a extras ADN pentru confirmarea diagnosticului de tuberculoz. A. VertebraL5 cu platoul inferior distrus n comparaie cu (B) o vertebr sntoas; C. Vertebre toracale sudateversus dou vertebre dispuse anatomic.

Individul M5a. Reprezentarea. Din individul M5 se pstreaz n mic msur calota cranian,vertebrele toracale, lombare i coastele. Manubriul este ntreg dar din corpul sternal s-aconservat doar jumtatea superioar. Omoplatul drept este ntreg, la fel ca i humerusul,radiusul i ulna de pe partea dreapt. Clavicula stng este prezent n ntregime.b. Conservarea. Oasele sunt conservate foarte bine, avnd scor maxim.c. Sexul. Se pstreaz un singur marker osteologic asociat sexului, creasta nucal, creia is-a acordat scorul maxim masculin.d. Vrsta. Estimarea vrstei la 33-42 ani s-a realizat doar pe baza capetelor sternale alecoastelor, fiind singurul marker existent.e. Patologia. Individului M5 nu i s-a asociat nicio patologie.

Analiza FT-IRDatorit deformrilor osoase ale indivizilor M3 i M4 s-a presupus c ambii ar fi putut

suferi de tuberculoz. Acesta este un diagnostic realist deoarece o boal infecioas ar fi o bunexplicaie pentru aceeai simptomatologie existent n aceeai perioad i ntr -o singurnecropol. S-au prelevat probe pentru FT-IR din aceti doi indivizi, att din oase afectate deboal ct din cele care preau neafectate. n spectrul obinut s-au identificat peak-uri asociateacizilor micolici (Figurile 3, 4), precum: absorbana gruprii metilen la 2955 cm-1, a grupriimetil la 2860 cm-1i deformarea lanurilor alifatice cu caten lung la 722 cm-1 (Coates, 2000;Mark i colab., 2009; Rafidinarivo i colab., 2009). Aceste rezultate ns, nu au valoare dediagnostic. Mark i colab. (2009) au testat probele lor pentru confirmarea tuberculozei i prinMALDI-TOF-MS. Minnikin i colab. (2011a, 2011b) i Gernaey i colab. (2001) s-au folosit detehnica HPLC pentru stabilirea patologiei. Datele obinute de noi la FT-IR s-au folosit nselectarea oaselor din care s-a extras ADN, pe baza raionamentului c dac exist acizi micolicin acestea, probabil se gsete i ADN-vechi provenit de la MTBC.

Figura 3. Spectrul FT-IR al unui individ sntos versus M3, presupus a fi infectat cu MTBC.

Figura 4. Spectrul FT-IR al unui individ sntos versus M4, presupus a fi infectat cu MTBC.

Spectrul FT-IR se utilizeaz i pentru stabilirea indicelui de cristalinitate (CI) ahidroxiapatitei. Acesta se calculeaz ca raportul (A595+A605)/A588 dintre suma absorbanelorfosfatului (atunci cnd legturile covalente P-O sunt ndoite antisimetric, iar aceasta rezult ntr-o degenerare a semnalului de la numerele de und 600 cm-1, la 595 cm-1i 605 cm-1), i valoareaminim dintre ele (Termine i Posner, 1966). Aceast valoare se coreleaz cu gradul dediagenez suferit de esutul osos astfel c, cu ct acest raport este mai ma re, cu att este mai maredimensiunea cristalelor. Comparaiile ntre oasele actuale i cele antice au artat c CI n cazulprimelor nu depete valoarea de 2,7 pe cnd cele vechi au n general peste 3. Oasele fosilizatepot avea valori de pn la 4,1 sau chiar 7 n cazul dinozaurilor (Berna i colab., 2004). Totui, ncazul indivizilor afectai de tuberculoz, acest raport este diminuat fa de valoarea ateptat(Nagy i colab., 2008). Valoarea CI a individului M3 este de 3.04 iar a lui M4 de 2.65.

Un alt parametru calculat este raportul carbonat/fosfat (C/P) care indic ce cantitate defosfat s-a pierdut din HA i a fost nlocuit de carbonat. n cazul oaselor infectate cu MTBC s-aobservat o modificare a acestui parametru. Aceast raport are media n jurul valorii de 0,23 laindivizii sntoi, dar n infeciile cu tuberculoz valoarea medie este mult crescut datoritcalcifierii oaselor. Nagy i colab. (2008) au calculat o medie de 0.47 a raportului C/P pentruindivizi afectai de tuberculoz, iar media calculat de noi pentru indivizii de la Gherseni este de0.50 (M3) i respectiv 0.53 (M4).

Coninutul de colagen (C/C) este un alt indice care se poate calcula din spectrul FT-IR.Acesta reprezint cantitatea de colagen pstrat n matricea osoas. Se calculeaz ca raportuldintre absorbanele amidei I i PO4 (A1640/A1035). O valoare de 0,2 corespunde la 15 wt%(procente de mas) iau una de 0,8 la 30 wt% materie organic n os (Lebon i colab., 2010). Noiam presupus c exist o relaie proporional ntre cantitate de colagen din os i cea de ADN-vechi. Indivizii M3 i M4 au avut valoarea C/C de 0,3 respectiv 0,5, acestea sugernd c existposibilitatea izolrii ADN-vechi endogen.

Extracia de ADN-vechiDup extracia cu fenol-cloroform conform protocolului descris, ADN a fost precipitat cu

etanol i s-a observat depunerea unui precipitat brun-negricios. Acesta s-a resuspendat n 50 Lap PCR Grade, iar 8 L au fost migrai n gel de agaroz 1,5% (Figura 5).

Deoarece s-au obinut rezultate similare la extracii succesive din acelai individ, M4, dari din M3, s-a ataat doar Figura 9. Se poate observa n gelul de agaroz un smear de ADNdatorat degradrii n diagenez, astfel c majoritatea fragmentelor au o dimensiune mai mic de50 pb. Mai mult, s-a observat n lumin UV o fluorescen albastr. Numeroase surse au raportatacest aspect i s-a artat c fluorescena este datorat produilor Maillard. Acetia se formeaz ntimpul diagenezei, prin cross-linkarea colagenului de tipul I cu acizii humici infiltrai din sol noase. Acetia migreaz mpreun cu ADN n gelul de agaroz iar n PCR au un efect puternicinhibitor. Kalmr i colab. (2000) i Hnni i colab. (1995) au ncercat ndeprtarea acestorcompui n timpul extraciei prin nlocuirea etanolului cu izopropanol i au observat o diminuarea semnalului fluorescent, dar inhibiia PCR poate fi evitat i prin diluarea ADN de 10 - 100x(Herrmann i Hummel, 1994).

Rezultatele amplificrilor prin PCRHnni i colab. (1995) au testat inhibiia produilor Maillard prin realizarea unui PCR

unde au adugat 1L ADN-vechi la mixul de reacie, iar ca ADN matri au pus ADN-modern.Ei au observat c acel 1 L a fost suficient pentru a inhiba reacia, chiar dac ADN- matri eraintact. Pentru a stabili la ce diluii activitatea polimerazei este restabilit, am diluat ADN-vechiextras din dou vertebre sudate ale individului M3 de 25x, 50x, 75x, 100x. Iniial, la migrareaADN-vechi n gelul de agaroz s-a observat o puternic fluorescen albastr. Rezultatul acestuiPCR se poate observa n Figura 6. Astfel, atunci cnd o prob de ADN-vechi extras avea ofluorescen albastr puternic, s-a stabilit ca la PCR s se folosea o diluie a acestuia de 50x.

Figura 5. Electroforegrama obinut n urma migrrii ADN-vechi extras din individul M4; 1.ADN extras dintr-o coast; 2. ADN extras din vertebre sudate; 3. control negativ de extracie.

Figura 6. Amplificarea fragmentului de 117 pb din gena pncA cu amorsele F2-R2; se observ c diluiade 50x este suficient pentru ca inhibiia datorat produilor Maillard s fie depit; se observ c diluiade 75x i 100x este prea mare, motiv pentru care ADN-matri lipsete.Gena pncA (pirazinamidaza/nicotinamidaza)

Dup mai multe testri s-a constatat c 3 L de ADN-vechi sunt suficieni pentru oamplificare PCR ntr-un volum final de 25 L. S-au realizat dou amplificri succesive cuamorsele F2-R2 (vezi Tabelul 2). n prima reacie s-a adugat BSA la un volum final de 1mg/mL. Acest aditiv nu las ca ADN matri s adere la pereii tubului n care are loc reacia,aspect important mai ales atunci cnd concentraia acestuia este sczut, i scade efectul inhibitoral acizilor humici (Pbo i colab., 1988; Farell i Alexandre, 2012; Simonovi i colab., 2012).Alinierea amorselor s-a fcut la 60oC n prima reacie i la 62oC n cea de-a doua, pentru a secrete specificitatea. n a dou reacie s-a folosit ca i matri 1 L din produsul reacieiprecedente. Electroforegrama pentru amplificarea pncA F2-R2 folosindu-se ADN extras din M4poate fi observat n Figura 7.

Figura 7. Produii PCR amplificai cu amorsele pncA F2-R2 i cu ADN matri extras din individul M4;s-a obinut amplificare specific doar din oase afectate de tuberculoz (coast i vertebr); a fost testat iADN extras din radius, dar nu s-a obinut amplificare; controalele de extracie i de PCR sunt curate,dovedind lipsa contaminrii cu ADN modern; benzile cu dimensiune mai mic de 50 pb s-au constatat a fidimeri de amorse.

Rezultate similare au fost obinute i pentru M4. Produii au fost purificai din gelul deagaroz folosindu-se kitul Agarose Gel extraction Kit - Jena Bioscience, apoi au fost clonai cuajutorul kitului CloneJET PCR Cloning Kit - Thermo Scientific.

Pseudogena oxyRn reacia de amplificare a fragmentului de 110 pb din pseudogena oxyR s-au folosit 2 L

de ADN matri. Concentraia final n mixul de reacie a MgCl2 a fost crescut de la 1,5 mM la2mM deoarece iniial nu s-a obinut nicio amplificare. Ca i n cazul pncA s-a adugat ca i

aditiv BSA (1 mg/mL) n reacia iniial. n a doua reacie s-a folosit 1 L din produsul primuluiPCR. Rezultatele pot fi observate n Figurile 8 i 9.

Figura 8. Electroforegrama produilor de PCR oxyR F3-R1 pentru individul M3; se observ c cea maibun amplificare a rezultat din ADN provenit din vertebra afectat diluat de 50x; exist amplificare i ncontrolul de extracie, dar controlul de PCR este curat, ca urmare se exclude posibilitatea contaminrii cuADN-modern.

Figura 9. Electroforegrama produilor de PCR oxyR F3-R1 pentru individul M4; v - vertebr; s-a obinutamplificare specific pentru probe din coast, vertebre, dar i n controlul de PCR. Deoarece nu existamplificare n controlul de extracie, se consider c nu a existat contaminare cu ADN -modern, darprobabil a intervenit o eroare de manipulare.

Produii PCR au fost purificai din gel cu kitul de la Jena Bioscience. Pn acum au fostclonai i secvenializai doar cei de la individul M3, cei de la individul M4 urmnd a fi clonaiulterior.

Deleia TbD1S-a ncercat amplificarea unui fragment care flancheaz deleia D1, folosindu-se

amorsele F-R2. Deoarece la concentraia de 2 mM MgCl2 nu s-a obinut nicio amplificare, s-acrescut concentraia la 2,5 mM. S-au folosit 2 L ADN matri, iar n cazul ADN extras dinvertebr s-a folosit o diluie de 50x. Ca i n cazurile anterioare, n prima amplificare s-a folositBSA (1 mg/mL) (Figura 10).

Figura 10. Electroforegrama ampliconilor D1f F-R2 pentru individul M3; c - coast, v - vertebr, r -radius; se observ c s-au obinut trei ampliconi de marimi diferite; fiecare band a fost purificat din gel,urmnd a fi clonat; controalele de extracie i de PCR sunt curate, de aceea se elimin posibilitateacontaminrii cu ADN-modern.

Prezena deleiei TbD1 face diferena ntre cele dou tipuri de tulpini M. tuberculosis:ancestrale i moderne. De fapt, ambele tipuri exist astzi, aa cum arat un studiu realizat nIndia, ar responsabil pentru 21% din cazurile globale de tuberculoz. Stavrum i colab. (2009)au testat 65 de izolai de M. tuberculosis i au realizat c 26,2% aveau regiunea TbD1 intact.Pn acum, am reuit obinerea unor produi PCR folosind amorse care flancheaz deleia, dartestm i un set de amorse interne. Pn acum am obinut o amplificare specific n blankul deextracie. Presupunem c n probe nu avem amplificare datorit produilor Maillard. Urmeaz soptimizm reacia prin diluii succesive i utilizarea aditivilor. Dei avem un rezultat pozitiv ncontrolul negativ de extracie nu credem c poate fi vorba de o contaminare cu ADN modern deM. tuberculosis din controlul pozitiv deoarece acesta a fost testat anterior i este TbD1+.

Analiza bioinformaticToate plasmidele secvenializate au fost prelucrate cu software-ul BioEdit 7.2.5.

Ampliconii PCR identificai au fost comparai cu cei din GenBank (NCBI) folosindu -se opiuneablastn. Atunci cnd nu s-a obinut niciun rezultat folosind setrile automate ale blastn, ele au fostmodificate conform descrierii de la materiale i metode. n continuare vor fi descrise analizelebioinformatice pentru fiecare amplicon PCR n parte.

Gena pncAFragmentele pncA obinute de la secvenializare au fost cu 10 nucleotide mai scurte dect

fragmentul ateptat. Parametrii blastn au fost modificai, aa cum s-a descris la Materiale imetode, astfel nct s se conformeze unui ADN-vechi foarte degradat ca urmare a diagenezei.Primele 22 de rezultate blastn pot fi observate n Figura 11.

Figura 11. Rezultatele obinute la blastn prin compararea secvenelor pncA F2-R2 cu secvenele dinGenBank.

Dei primele rezultate nu aparin grupului MTBC ele pot fi excluse deoarece alinierile auacoperire mic. Singurele rezultate cu acoperire de 100% aparin speciei M. tuberculosis, i au oidentitate de 68-70% cu fragmentul omolog modern pncA.

Ulterior, pentru a susine ncadrarea secvenelor de ADN-vechi la grupul MTBC, amdescrcat toate secventele genei pncA ale genului Mycobacterium depuse n baza de date Gene.Am descrcat att secvenele speciilor patogene ct i a celor ambientale. Am aliniat secveneleobinute de noi, din oase, extracii sau indivizi diferii cu cele existente n bazele de date. Pentrualiniere am folosit algoritmul ClustalW n Mega 5 (Figura 12).

Se pot observa din aliniere, trei deleii care se pstreaz n dreptul situsurilor 29-31, 53-57i 95-96. Acele deleii nu puteau aprea n diferite zone din corp i mai ales la indivii diferii caurmare a diagenezei pentru c acesta este un proces randomic. Dar ele ar putea fi explicate deapariia buclelor n moleculele monocatenare de ADN. Aa cum se poate observa n Figura 9,ADN-vechi extras de noi este deja foarte degradat i fragmentat. Forma cea mai stabil a ADNeste aceea de dublu-helix supra-rsucit, dar n momentul fragmentrii orice supra-rsucire estenlturat. Astfel, ADN este mult mai uor de denaturat (Cox i colab., 2010). Mai mult, se tiec extracia cu fenol - cloroform - alcool izoamilic este una agresiv (Ausubel i colab., 1995) iarfenolul oxidat cauzeaz degradarea i ruperea catenelor de ADN. De aceea am presupus c ntimpul extraciei s-ar putea forma monocatene de ADN, care ar putea adopta structuri secundare(Liang i colab., 2006).

Toate PCR s-au realizat cu Taq-polimeraza, iar o serie de articole au analizat activitateaacesteia n momentul n care ntlnete o bucl n molecula de ADN-matri (Viguera i colab.,2001; Canceill i Ehrlich, 1996; Levinson i Gutman, 1987). S-a artat c polimeraza poate ignoranucleotidele implicate n formarea buclei astfel c n molecula rezultat va exista o deleieaproximativ egal cu dimensiunea buclei (Figura 13).

Figura 13. Reprezentarea schematic a modelului prin care Taq-polimeraza induce la locul de formare aunei bucle apariia unei deleii n molecula de ADN (dup Viguera i colab., 2001)

Pentru a observa dac fragmentul de 117 pb formeaz structuri secundare de tipulbuclelor am folosit aplicaia DNA Folding Form a The Mfold Web Server. S-a setat concentraiaMgCl2 folosit n PCR. Rezultatul modelrii 2D poate fi observat n Figura 14. Se poate observac cele trei bucle evideniate (A, B i C) se suprapun peste cele trei deleii n alinierea multipldin Mega 5.

Figura 14. Modelarea 2D a fragmentul de 117 pb al genei pncA de la M. tuberculosis folosind aplicaiaDNA Folding Form a The Mfold Web Server.

Datorit divergenei observate n alinierea multipl ntre secvenele de ADN -vechi i celemoderne, ncadrarea secvenelor de ADN-vechi n MTBC are nevoie de dovezi suplimentare.Astfel s-a formulat ipoteza c dac ntru-un arbore filogenetic secvenele noastre s-ar grupa cucele ale MTBC i nu cu secvenele provenite de la specii ambientale, atunci cel mai probabildivergena este cauzat de degradarea din timpul diagenezei i nu este datorat apartenenei lor lao specie diferit.

Pentru a se afla modelul evolutiv care ar putea explica cel mai bine datele observate, amrulat n Mega 5 opionea Find Best DNA/Protein Models (ML). S-a folosit n construciaarborelui prima opiune raportat: Tamura 92 (Tamura 3 - parameter cu distribuie discretGamma) cu cel mai mic scor BIC (Bayesian Information Criterion).Un scor BIC mic implicexistena unui numr sczut de variabile explicative necesare pentru justificarea datelor obinute(Baxevanis i Ouellette, 2001).

Figu

ra 1

2.A

linie

rea

multi

pl

a se

cven

elor p

ncA

obi

nute d

e noi

i a ce

lor di

n baza

de da

te Gene

ale ge

nului

Mycob

acteri

um.

Arborele a fost realizat prin metoda Maximum Likelihood. Referitor la modul n careurmau s fie tratate cele trei deleii, am ales opiunea Complete deletion - Gap/Missing DataTreatement. Alegerea este justificat prin faptul c am pornit de la ipoteza conform creiadeleiile sunt produsul activitii Taq-polimerazei, i nu al evoluiei sau al diagenezei.

Pentru c modificrile n secvena nucleotidic (exceptnd deleiile) sunt produsuldegradrii post-mortem a ADN, am considerat c n construcia arborelui secvenele nucleotidicear trebui tratate ca secvene non-codificatoare. Dac n schimb, am fi selectat opiunea automat -Protein coding - doar primele dou poziii din codon ar fi fost analizate pentru a se evitainfluena celui de-al treilea nucleotid, care poate varia fr a influena secvena proteic. Aadar,nici n acest caz diferenele nu sunt produsul mutagenezei i al seleciai naturale, ci al diagenezei.

Mai mult, poriunea de 117 pb a genei pncA codific n lanul polipeptidic o regiune de39 de aminoacizi nalt conservat. Lanul polipeptidic formeaz un buzunar care susine un ionde Fe2+ prin intermediul a apte aminoazici: H51, H57, H71, D49, D8, C138, K96. Patru dintreacetia sunt codificai de poriunea amplificat de noi: D49, H51 , H57, H71 (Petrella i colab.,2011). n Figura 15 se observ structura 3D a proteinei prelucrat n Rastop 2.2 astfel nct s fieevideniat buzunarul i aminoacizii implicai n susinerea fierului.

Figura 15. Structura 3D a pirazinamidazei de la Mycobacterium tuberculosis prelucrat n Rastop 2.2; seobserv buzunarul catalitic i cei patru aminoacizi implicai n susinerea Fe2+.

Histidina din poziia 57 este substituit de acidul aspartic la M. bovis ca urmare a uneimutaii punctiforme, aceast specie devenind astfel rezistent la tratamentul cu pirazinamid.Deoarece existena acestor patru poziii este esenial pentru funcia enzimei, este puin probabilca modificrile observate n alinierea multipl s fi survenit n timpul evoluiei.

Pentru ca relaia dintre secvenele obinute de noi i secvenele moderne s fie stabilit cuo mai mare certitudine am construit un arbore filogenetic prin metoda Maximum Likelihood.Aceasta poate reconstitui relaiile filogenetice dintre taxonii analizai i ofer suport statistic

(Bootstrap sau Jack-knife) (Harrison i Langdale, 2006). Arborele rezultat pe baza alinierii dinFigura 12 poate fi observat n Figura 16.

Figura 16. Arborele filogenetic realizat prin Maximul Likelihood: Bootstrap 100, modelul evolutivTamura 3 cu distribuie discret Gamma, poziiile cu gap-uri s-a eliminat din analiz.

Pentru ca arborele realizat s fie relevant s-au ters din alinierea multipl o parte dinsecvenele amorselor, pstrndu-se secvena minim unic de nucleotide de la captul 3', adic 6nucleotide. Pentru a fi siguri c topologia arborelui nu este nfluenat de secvena conservat aamorselor, am pstrat de la captul 3' doar 5 nucleotide. S-a fcut aceast alterare bazandu-ne peraionamentul c acele nucleotide sunt necesare pentru legarea amorselor de catena mat

Date post:	11-Nov-2015
Category:	Documents
Upload:	duke-alexandru
View:	36 times
Download:	7 times

Evolutie Genetica: Dovezi noi în studiul unor structuri interconectate.

Documents