1
Universitatea de Ştiinţe Agricole si Medicina Veterinara Cluj-Napoca
FACULTATEA DE MEDICINA VETERINARA
Disciplina de Imunologie
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
Profilul molecular al răspunsului imun în tumori maligne: validarea pe culturi celulare
şi modele animale
Conducător ştiinţific Doctorand
Prof. dr. Gheorghe Răpuntean ing. Almăşan Claudia
căs. Gherman
Cluj-Napoca
2012
2
Cuprins CONTEXTUL STUDIULUI .....................................................................................3
1. EVALUAREA PROFILULUI MOLECULAR ÎN CANCERUL COLORECTAL ............................................................................................................ 5
1.1. Evaluarea mecanismelor moleculare de acţiune a Oxaliplatinei, studiu in vitro pe linia celulară tumorală colorectală. ...................................................... 5
1.1.1. Evaluarea viabilităţii pe linia celulară Colo320 prin testul MTT .............5
1.1.2. Evaluarea nivelelor de expresie ale genelor implicate în apoptoza indusă de Oxaliplatin cu reactia RT-PCR.............................................................................7
1.2. Evaluarea profilului apoptotic in cazul tratamentului combinat cu oxaliplatin si 5-fluorouracil ...................................................................................... 9
1.2.1. Evaluarea efectului antiproliferativ indus de Oxaliplatin, 5-FU si tratamentul combinat al celor doi agenti terapeutici. ................................................9
1.2.2. Evaluarea nivelului de expresie pentru genele implicate in mecanismul de apoptoza ............................................................................................................. 10
1.2.3. Evaluarea profilului imunologic in cazul tratamentului combinat cu oxaliplatin si 5-fluorouracil ..................................................................................... 12
2. EVALUAREA IN VITRO ŞI IN VIVO EFECTULUI ANTITUMORAL ŞI IMUNOMODULATOR AL EGCG. ......................................................................... 13
2.1. Evaluarea in vitro pe cultura de celule de ascita Ehrlich a efectului antitumoral şi imunomodulator al EGCG. ........................................................... 13
2.1.1. Evaluarea in vitro pe cultura de celule de ascita Ehrlich a efectului antitumoral a EGCG-ului. ....................................................................................... 13
2.1.2. Evaluarea in vitro pe cultura de celule de ascita Ehrlich a efectului inumomodulator a EGCG-ului. ............................................................................... 14
2.2. Evaluarea in vivo efectului antitumoral şi imunomodulator al EGCG . 15
2.2.1. Evaluarea in vivo efectului imunomodulator al EGCG.......................... 15
2.2.2. Evaluarea apoptozei prin marcare cu Anexina V/Cy5/Calceina ............. 18
3. NANOTUBURILE DE CARBON: TRANSPORTORI BIOLOGICI MULTIFUNC ŢIONALI CU APLICA ŢII ÎN MEDICIN Ă, TESTAREA EFECTULUI BIOLOGIC PE SISTEMELE IN VITRO , RESPECTIV IN VIVO 20
3.1. Experimentarea capacitatii de internalizare a NTC pe Hep2G .............. 20
3.2. Aplicaţii ale NTC în transportul ţintit al TNF- α siRNA .......................... 22
3.2.1. Caracterizarea chimică a nanotuburilor de carbon carboxilate ............... 22
3.2.2. Internalizarea siRNA în celulele hepatice HepG2 ................................... 23
3.2.3. Evaluarea supravieţuirii celulare (MTT) ................................................. 24
4. CONCLUZII GENERALE ................................................................................. 27
BIBLIOGRAFIE .................................................................................................. 28
3
Contextul studiului
Progresele ultimelor decenii din domeniul imunologiei tumorale au dus la
identificarea de noi mecanisme moleculare cu impact major în raspunsul imun la
terapia antitumorala. O nouă viziune în cadrul acestui domeniu o reprezintă
interacţiunea gazdă-tumoră, acesta fiind un proces extrem de complex şi dinamic,
contribuind la eliminarea celulelor tumorale sau la creerea unui echilibru între rata de
elinimare şi proliferare tumorală, ca în cele din urmă aceste evenimente să contribuie
la creşterea tumorilor cât şi la procesul de migrare al celulelor maligne. Pe parcursul
acestui proces are loc selecţia celulelor tumorale în funcţie de capacitatea acestora de a
induce un răspuns imun, astfel sunt selectate doar celulele tumorale cu imunogenicitate
scăzută care sunt rezistente la apoptoză şi prezintă capacitatea de a supravieţui în
condiţii nefavorabile. Celulele tumorale au capacitatea de a modula specific sistemul
imun crescandu-şi toleranţa în organismul gazdă, care în cele din urmă să inducă
imunosupresie în stadiile finale tumorale. De asemenea anumite fenotipuri maligne,
cum este cazul cancerului colorectal, sunt validate în cazul unor factori inflamatori.
De aceea răspunsul imun la nivel molecular, prin intermediul factorilor caracteristici
implicaţi în modularea transcrierii moleculelor de ARN mesager cât şi în procesele de
sinteză proteică reprezintă un proces important în patologia tumorală.
Scopul acestei teze este de a identifica şi caracteriza rolul unor gene în căile de
supraveghere imuno tumorale, care modulează atât mecanismele implicate în
dezvoltarea fenotipului malign cât şi răspunsul la terapiile antitumorale.
Lucrarea de faţă abordează un subiect de actualitate care se încadrează în
tendinţa internaţională de utilizare a sistemelor şi metodelor de cultivare celulară in
vitro ca alternativǎ la studiile in vivo pe animale de experienţǎ, doar etapa de validare a
datelor experimentale obţinute pe sistemele in vitro realizându-se pe sistemele in vivo.
Tematica proiectului prezintă noutăţi atât în dezvoltarea de noi strategii
antitumorale prin modularea sistemului imun folosind copuşi chimici naturali
sau sintetici, nanomateriale sau terapie genică. În lucrare sunt incluse sistemele
actuale de evaluare in vitro şi in vivo, în ceea ce priveşte studiile de toxicitate sau cele
de genomică funcţională conform normelor europene.
4
Studiile de genomică funcţională permit evaluarea relaţiei dintre genom şi
fenotip, în stare normală sau de boală. Acest lucru se poate realiza prin cuantificarea
expresiei genice, respectiv asupra nivelului cuantificabil de transcripţie genică,
folosind tehnicile de tip array (microarray, PCR array) sau PCR-cantitativ (RT-PCR).
Tehnica PCRarray sau microarray prin analiza simultană a unui număr mare de gene
permite obţinerea unei imagini globale asupra alterării profilului transcripomic la un
moment dat, şi să ofere informaţii legate de răspunsul la tratament.
Studiile de cercerare din această teză s-au realizat ţinânt cont de nevoile clinice
pentru studirea unor patologii complexe cum este cancerul, utilizând intrumente de
ultimă generaţie.
Efectul antiproliferativ la nivel celular sau molecular este exprimat prin termeni
diferiţi, citotoxicitate, imunotoxicitate, genotoxicitate sau mutagenitate, în funcţie de
ţinta moleculară afectată.
Acţiunea antiproliferativă şi imunomodulatoare este determinată de obicei de
compuşi străini organismului (numiţi şi xenobiotice), care pot aparţine claselor de
compuşi sintetici (medicamente), compuşilor naturali şi presupune alterarea
functionalităţii celulare (a căilor metabolice), cu sau fără afectarea structurii sale
morfologice. Compuşii antitumorali pot interacţiona cu proteine şi enzime specifice,
cu anticorpi (imunotoxicitate), afectând viabilitatea şi metabolismul celular. În acest
context, lucrarea de faţǎ şi-a propus ca scop evaluarea efectului in vitro şi in vivo a
acţiunii unor agenţi citostatici sintetici (oxaliplatin) sau naturali (catechine).
În cursul derulării experimentelor, s-au iniţiat şi utilizat diferite sisteme celulare
(culturi de ascita Erlich primare, linii celulare tumorale), s-au selectat compuşi
antitumorali reprezentativi, şi anume din clasa de compuşi sintetici oxaliplatin şi
epigalocatechin galatul (EGCG) ca şi agent citostatic natural care are capacitatea de a
modula multiple căi metabolice, inclusiv ca şi imunomodulator.
5
1. Evaluarea profilului molecular în cancerul colorectal
1.1. Evaluarea mecanismelor moleculare de acţiune a Oxaliplatinei, studiu in
vitro pe linia celulară tumorală colorectală.
Unul dintre citostaticele cele mai active în cancerul colorectal este oxaliplatina.
Acesta este un agent alchilant, face parte din clasa compuşilor de platină care inhibă
sinteza ADN-ului prin formare de punţi inter şi intracatenare de tipul platină-ADN
care vor duce la oprirea ciclului celular, inhibarea replicării şi inducerea celulei în
apoptoză (Temmink şi colab., 2007).
1.1.1. Evaluarea viabilităţii celulare pe linia celulară Colo320 prin testul
MTT
Efectele oxaliplatinei pe linia celulară tumorală colorectală Colo320 implică
modificări în bioactivitatea celulară. Viabilitatea celulelor a fost evaluată prin testul
MTT, cu ajutorul spectrofotometrului. Se observă că viabilitatea celulelor este
dependentă de timp şi de concentraţia de oxaliplatină administrată. Viabilitatea
celulară este exprimată în procent faţă de control care este considerat de 100% , figura
1. La o concentraţie scăzută de citostatice, celulele prezintă citotoxicitate minimă la
24, 48 şi 72 de ore. Reducerea viabilităţii celulare este asociată cu creşterea
concentraţiei de oxaliplatină la diferiţi timpi.
Figura 1. Rezultatele proliferării celulare folosind testul MTT (% de control) la linia
celulelară Colo320 tratate cu doze multiple de oxaliplatin la 24, 48, 72 ore.
-2 -1 0 1 2 30
20
40
60
80
100
120
24h
48h
72h
MTT test
log(conc, µµµµg/ml)
% o
f co
ntro
l
6
Pe baza datelor prezentate în figura 1, am stabilit, de asemenea, IC50
(concentraţie inhibitorie la 50%) pentru activitatea oxaliplatinei pe linia celulară
tumorală colorectală la 24, 48 şi 72 de ore. Evaluarea se bazează pe parametrii
statistici obţinuţi cu GraphPadPrism5. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 2.
Tabelul 2.
Valorile IC50 determinate pentru evaluarea citotoxicităţii după tratamentul cu
oxaliplatin la 24, 48 şi 72 de ore de incubare
Linia celulară Timp (ore) IC 50 (µg/ml) Panta R2
Colo320
24 14.45 3.101 0.9511
48 7.858 0.6428 0.9698
72 8.356 2.624 0.9328
Evaluarea efectului antiproliferativ de administrare de doze multiple la 24, 48
şi 72 ore este prezentat în figura 2. După administrarea unei doze duble de 5µg/ml la
T = 0 şi după 8 ore, nu se observă nici o schimbare semnificativă în efectul
antiproliferativ, în comparaţie cu administrarea unei doze unice de 5µ/ml la T = 0. În
figură am reprezentat o doză dublă de 5 µg/ml la T = 0 şi la 24 de ore, urmată de
evaluarea viabilităţii celulelor la 48 de ore. Administrarea unei doze triple de 3,33 µg
/ ml oxaliplatină la T = ore 0, 24 şi 48, urmate de evaluare a viabilităţii celulelor la 72
de ore a evidenţiat o reducere a efectului antiproliferativ într-un mod mai eficient,
comparativ cu administrarea unei doze unice de 10 µg / ml oxaliplatină.
7
Figura 2. Rezultatele proliferării celulare folosind testul MTT (% de control) la
celulele Colo320 tratate cu doze multiple de oxaliplatin la 24, 48, 72 ore.
1.1.2. Evaluarea nivelelor de expresie ale genelor implicate în apoptoza
indusă de Oxaliplatin cu reactia RT-PCR
Evaluarea expresiei relative a genelor PDGF, NFB, p53 pe linia celulară
tumorală colorectală Colo320, tratată cu 10 µg/ml oxaliplatină după 24 de ore sunt
prezentate în tabelul 2. Ca genă de referinţă am folosit β-Actina. Aşa cum se vede în
figura 3, rezultatele studiului nostru au arătat că tratamentul cu oxaliplatină duce la
subexprimarea genei PDGF care este implicată în angiogeneza tumorală cât şi la
supraexprimarea genelor p53 şi a NfκB cu rol în inducerea morţii celulare şi a inhibării
proliferării celulare (Nemoto şi colab., 2009).
Nivelele de exprimare ale genelor (PDGF, NFκB, p53) în celulele tratate cu
oxaliplatina comparativ cu controlul folosind metoda ∆∆ ct sunt redate în tabelul 3.
MTT test
10 (2
4 h)
2X5
(24h
)
10 (4
8 h)
2X 5
(48h
)
10 (7
2h)
3X3.3
(72h
)0
20
40
60
80
100
120
140
Concentratia oxaliplatinei (µµµµg/ml)
% d
e co
ntro
l
8
Tabel 3
Nivelele de exprimare ale genelor PDGF, NFκB, p53
Gene Oxaliplatina (10 µg/ml)
Fold change Eroare (+), (-)
β−Actine 1.000 0.433 0.302
PDGF 0.368 0.217 0.136
NFκB 1.662 0.552 0.414
p53 1.840 0.658 0.485
Figura 3. Dinamica exprimării genice după tratamentul cu oxaliplatină pe linia
celulară Colo320
În studiul de faţă, am demonstrat că oxaliplatina inhibă creşterea celulelor
tumorale colorectale la o anumită cantitate dependentă de timpul de administrare.
Celulele tumorale colorectale au fost sensibilizate de agentul chimioterapeutic în
cazul strategiei de administrare a dozelor multiple, ceea ce duce la o scădere
semnificativă a numărului de celule tumorale viabile.
Mecanismele care stau la baza efectelor acestui tratament implică inducerea
apoptozei, care se realizează prin intermediul supraexprimării genelor p53 şi NF κ B,
PDGF NfkB p530
1
2
3
Oxaliplatina (10 µg/ml)
niv
elul d
e ex
pre
sie
rela
tiv a
gen
elor
9
precum şi prin subexprimarea genei PDGF (Yang şi colab., 2011; Kim şi colab., 2009;
Nemoto şi colab., 2009).
Rezultatele sugerează că o nouă strategie de dozare a oxaliplatinei în corelaţie
cu un sistem definit de administrare multiplă pot creşte efectele sale şi, de asemenea,
creşte răspunsul pacienţilor la tratament, cu un impact mare asupra supravieţuirii şi a
calităţii vieţii pacienţilor afectaţi de acest tip de cancer. Rezultatele obtinute prin
evaluarea expresiei genice pentru PDGF, NFκB, p53 sunt in concordanta cu datele
din literatura de specialitate.
1.2. Evaluarea profilului apoptotic in cazul tratamentului combinat cu
oxaliplatin si 5-fluorouracil
Principala condiţie pentru ca o substanţă să fie considerată agent
chimioterapeutic este să inducă alterări în homeostazia celulelor tumorale. În ultimii
ani s-a pus din ce în ce mai mult accent pe mecanismele moleculare implicate în
controlarea proceselor apoptotice defective în cazul cancerelor precum şi pe
dezvoltarea unor noi terapii de restabilire a acestor mecanisme (Rigas şi colab., 2002).
Inhibarea proceselor apoptotice duce la alterarea homeostaziei tisulare astfel
contribuind la evoluţia şi dezvoltarea masei tumorale. Faptul că apoptoza este inhibată
în cancerele de colon (Bedi şi colab., 1995) a dus la dezvoltarea numeroaselor strategii
de tratament utilizate în mod curent cât şi la munca enormă depusă de cercetători în
încercarea de a crea noi tratamente.
5-florouracilu (5-FU) este un pro-citostatic utilizat frecvent în tratarea
cancerului de colon (Rahman şi colab., 2006). 5-FU odată ajuns în celulă este
transformat în substanţă biologic activă, 5-floro-2’-deoxiuridin-5’-trifosfat (FdUTP)
care poate fi incorporată în secvenţa moleculelor de ADN şi ARN ducând la creşterea
instabilităţii catenelor de acizi nucleici (Meyers şi colab., 2003).
1.2.1. Evaluarea efectului antiproliferativ indus de Oxaliplatin, 5-FU si
tratamentul combinat al celor doi agenti terapeutici.
În urma efectuării testului de viabilitate celulară (MTT) figura 4., se poate
observa că la 24 de ore de la tratament efectul citotoxic cel mai putermic este indus de
5-FU pe când Oxaliplatina prezintă o toxicitate mult mai redusă. La 48 de ore de la
10
tratament rolurile se inverseaza, de unde se poate trage concluzia că pe termen
îndelungat oxaliplatina prezintă efecte mult mai toxice decât 5-FU.
(A) (B)
Figura 4. Evaluarea efectului antiproliferativ in cazul tratamentului cu OXaliplatin, 5-
FU, sau a tratamentului combinat la 24 de ore dupa tratament (A), respectiv 48 ore
posttratament (B)
1.2.2. Evaluarea nivelului de expresie pentru genele implicate in mecanismul
de apoptoza
În urma tratamentului cu oxaliplatina, 50 de gene au prezentat valori statistic
sennificative. Dintre acestea 33 au fost supraexprimate şi 4 gene au fost identificate ca
fiind subexprimate. Majoritatea genelor inhibate aparţin căilor de inducere şi sustinere
a apoptozei .
În figura 5 se poate observ[ că în urma tratamentului celulelor tumorale
Colo320 cu 5-FU şi oxaliplatina, 33 de gene au fost diferit exprimate, dintre care 19
sunt supraexprimate şi 14 subexprimate. În cadrul celor supraexprimate se găsesc
majoritatea genelor codificatoare ale caspazelor implicate în inducerea şi susţinerea
evoluţiei apoptozei tumorale.
-2 -1 0 1 2 3
20
40
60
80
100
120
Oxaliplatin
Oxaliplatin+5-FU
MTT test (24h)
5-FU
log(conc)
% o
f co
ntro
l
-2 -1 0 1 2 3
20
40
60
80
100
120
Oxaliplatin
Oxaliplatin+5-FU
MTTtest (48h)
5-FU
log(conc)
% o
f co
ntro
l
11
Figura 5. Analize PCR array pentru stabilirea semnăturii moleculare ca urmare a
evaluarii genelor implicate în procesul de apoptoza în cazul grupului tratat cu
oxaliplatina, 5-FU, oxaliptatina+5FU versus lotul control. Cu roşu sunt marcate genele
supraexprimate iar cu verde genele subexprimate
Concluzii
Acest studiu a urmărit identificarea genelor implicate în apoptoză ca răspuns la
tratamentul cu 5-FU, oxaliplatina cât şi tratamentul combinat dintre cele două
citostatice, asupra liniei celulare tumorale Colo320, (Matuo şi colab., 2009)..
Rezultatele au demonstrat eficienta terapeutica superioară a administrarii combinate a
celor doi agenti terpaeutici faţă de administrarea individuală a acestora, însă nu se
poate afirma că avem de-a face cu un efect sinergic.
12
Chiar dacă datele de PCR array demonstrează la nivel genic eficienţa
tratamentului citostatic atât în cazul utilizării separate a celor două tratamente cât şi în
cazul combinării acestora, studii ulterioare sunt necesare în vederea identificării unor
biomarkeri de rezistenţă la terapia cu citostatice, cât şi pentru identificarea de noi ţinte
terapeutice.
1.2.3. Evaluarea profilului imunologic in cazul tratamentului combinat cu
oxaliplatin si 5-fluorouracil
Din totalul genelor care au fost evaluate prin tehnologia PCR array au fost
obţinute un număr total de 13 gene care prezintă valori statistic semnificative la nivel
de mRNA în urma tratamentului liniei celulare Colo320 cu 5-FU în comparaţie cu
grupul control. Dintre acestea doar 5 sunt supraexprimate şi 8 subexprimate.
În urma tratamentului cu oxaliplatina în cadrul liniei celulare tumorale de colon
Colo 320 s-a identificat un număr de 27 gene supraexprimate dintre care doar 14 sunt
semnificative din punct de vedere statistic (p value ≤ 0.05). În cazul genelor
subexprimate în urma analizei, o singură genă a fost gasită ca având valori statistic
semnificative din cadrul celor 8 gene care aparţin în mare parte familiei de citokine
(Dunn şi colab., 2002; Engel şi colab.,1997).
În urma tratamentului combinat dintre 5-FU şi oxaliplatina s-au identificat 5
gene supraexprimate şi 11 subexprimate.
Concluzii
Măsurarea nivelelor de expresie genică a citokinelor inflamatorii ale liniei
celulare Colo 320 ]n urma tratamentului cu 5-FU, oxaliplatina cât şi a tratamentului
combinat cu cele două citostatice, poate contribui la identificare unor molecule
implicate în procesele inflamatorii cu valoare de prognostic sau diagnostic şi poate
deveni utilă în selecţionarea cazurilor ce pot beneficia de terapia adjuvanta în patologia
colonului.
13
2. Evaluarea in vitro şi in vivo efectului antitumoral şi imunomodulator al EGCG. Scopul acestui studiu este de a investiga proprietăţile bioactive a unor compuşi
flavonoidici (EGCG). Investigările se realizează pe sisteme in vitro cât şi in vivo. În
acest studiu am urmărit evaluarea capacităţii EGCG-ului de a activa procesele
apoptotice şi răspunsul imun cu aplicaţii în terapia cancerului (Prodan şi colab., 2009).
2.1. Evaluarea in vitro pe cultura de celule de ascita Ehrlich a efectului
antitumoral şi imunomodulator al EGCG.
Celulele tumorale ascitice Ehrlich au o proliferare rapidă în sistemele in vitro şi
in vivo, (Bhattacharyyaet, 2003), fiind utilizate pentru studierea chimioterapicelor.
Literatura de specialitate descrie efectul inhibitor al compuşilor polifenolici în sinteza
de cytokine, precum şi o asociere între citokine şi inhibarea creşterii tumorii (El-
Mowafy şi colab., 2010). Studii anterioare au arătat că EGCG induce apoptoza pe
mai multe linii de celule tumorale. În acest studiu am urmărit dacă EGCG are vreun
efect asupra activitaţii antitumorale prin imunomodularea EGCG in vitro pe cultura de
celule ascitice Ehrlich.
2.1.1. Evaluarea in vitro pe cultura de celule de ascita Ehrlich a efectului
antitumoral a EGCG-ului.
Inhibarea proliferării şi scăderea viabilităţii celulare induse de EGCG a fost
evaluată în vitro, pe ascita Ehrlich. Efectul EGCG (Shimizu şi colab., 2008) asupra
numărului de celule tumorale şi asupra viabilităţii la timpi diferiţi (24, 48, 72 şi 96 de
ore) este prezentat în figura 6a. Rezultatele indică faptul că o doză unică de 10 µM
EGCG induce o reducere a proliferării celulelor, cea mai mare eficienţă fiind observată
la 42 de ore, după care eficienţa este constant descrescătoare, după cum arată datele
de la 72 de ore (figura 6b). Datele proliferării celulare sunt confirmate de datele
privind viabilitatea celulară. EGCG nu induce necroză, dar a fost capabil să inducă
apoptoză (Shimizu şi colab., 2008; Liu şi colab., 2008; D'Archivio şi colab., 2008;
Braicu şi colab., 2009)
14
(A) (B)
Figura 6. Efectul EGCG asupra numărului de celule tumorale şi a viabilităţii. (A)
EGCG inhibă proliferarea celulelor într-un mod dependent de timp, (B) EGCG reduce
viabilitatea celulară
2.1.2. Evaluarea in vitro pe cultura de celule de ascita Ehrlich a efectului
inumomodulator a EGCG-ului.
Evaluarea răspunsului imunologic prin analiza TNF-α, şi IL-6 folosind tehnici
de tip ELISA, pe culturi de celule de ascita Ehrlich a fost măsurată la 24 de ore după
tratarea culturilor cu 10 µM EGCG, respectiv la 48 de ore. Nu au existat diferenţe
semnificative în sinteza de IL-6 şi TNF-α la 24 ore. Cu toate acestea, nivelele
proteice ale IL-6 şi TNF-α la 48 de ore au fost uşor scăzute (figura 7).
Figura 7. Cuantificarea nivelelor de IL-6 şi TNF-α din supernatantul celular, în
prezenţa EGCG, (* p <0,05 comparativ cu controlul, cu ajutorul T-test), la 24 h,
respectiv 48 de ore după tratament.
0 20 40 60 80 1000.0
2000000.0
4000000.0
6000000.0
8000000.0
Control
EGCG*
*
*
Cel
ls/m
l
24 48 72 960
102030405060708090
100110
Control
EGCG
**
Timp (ore)
% i
n ra
port
cu
cont
rolu
l
TNF-αααα
Contro
l (24
h)
EGCG (2
4h)
Contro
l (48
h)
EGCG (4
8)65
70
75
80
85
90
95
*
Conce
ntr
atia
(pg
/ml)
IL-6
Control (24
h)
EGCG
(24h
)
Control (48
h)
EGCG
(48)
0
100
200
300
*
Con
cent
ratia (p
g/m
l)
15
2.2. Evaluarea in vivo efectului antitumoral şi imunomodulator al EGCG
În acest studiu a fost evaluat profilul molecular al TNF-αααα şi IL-6 la nivelul
diferitelor organe implicate în răspunsul imun. De asemenea s-a urmărit stabilirea unei
corelaţii între nivelul de expresie genică si cel proteic al TNF-αααα şi IL-6 precum şi
gradul de proliferare al tumorii şi nivelul apoptozei.
2.2.1. Evaluarea in vivo efectului imunomodulator al EGCG
2.2.1.1. Evaluarea profilului de expresie proteica a TNF-αααα şi IL-6 folosind metoda imunoenzimatică ELISA ca urmare a răspunsului la tratament cu EGCG
Celulele neoplazice prezintă o alterare a răspunsului la citokinele exogene, ca
urmare a creşterii producţiei endogene de citokine, alterarea expresiei receptorilor
membranari, alterarea mesagerilor secunzi (da Silva, şi colab., 2002;. Kumar şi colab.,
2010). Concentraţia serică a celor doi mediatori imuni pentru cele patru loturi de
animale a fost determinată şi este prezentată în figurile 8 şi 9.
Rezultatele obţinute pentru lotul inoculat cu ascită cu/fără EGCG au fost
raportate la lotul martor. Doar la 48 de ore se observă modificări semnificative faţă de
lotul martor, având loc a creştere a nivelui seric pentru IL-6, această activare indusă de
inocularea cu ascită este contracarată de EGCG. La 72 de ore are loc o activare
nespecifică în cazul lotului inoculat cu ascită şi tratat cu EGCG, acest lucru poate fi
datorat de efectul pro-oxidant al EGCG sau mai precis indus de produşi de
metabolizare a EGCG care au capacitatea de a stimula secreţia de EGCG .
16
Figura 8. Nivelul seric al IL-6 pentru lotul cu ascită şi lotul cu ascita şi EGCG, comparativ cu lotul martor la 24, 48, 72 ore, respectiv 6 zile post tratament
În cazul inocularii cu ascită are loc o inhibarea a nivelului de expresie seric a
TNF-α produsă de micromediul tumoral la 48 de ore post inoculare. Se observă o
creştere a producţiei de TNF-α de către macrofagele alveolare ale splinei, ca răspuns la
o stimulare indusă de EGCG, la acelaşi interval de timp, acest efect nu este menţinut la
72de ore post tratament, acest lucru sugerează încă o dată necesitarea unei administrări
multiple de EGCG pentru a fi eficient ca şi agent terapeutic.
Figura 9. Nivelul seric al TNF-α pentru lotul cu ascită şi lotul cu ascită şi EGCG, comparativ cu lotul martor la 24, 48,72 ore, respectiv 6 zile post tratament
17
2.2.1.2. Evaluarea profilului de expresie genică a TNF-αααα şi IL-6 folosind tehnologia RT-PCR ca urmare a răspunsului la tratament cu EGCG
Dintre factorii de creştere şi citokinele implicate în modularea de răspuns
inmun, s-au evaluat expresia genică a TNF-α şi IL-6 la nivel de splină şi timus. Nivelul
de expresie a TNF-α şi IL-6 în timus şi splină la 24 şi 48 de ore post-inoculare cu
ascită în paralel cu administrare de EGCG este prezentat în figura 10 şi Fig 11.
(A) (B)
Figura 10. Variaţia raportului exprimării genice pentru TNF-α (A) splina, (B) timus
(A) (B)
Figura 11. Variaţia raportului exprimării genice pentru IL-6 (A) splina, (B) timus
La 24 de ore în post-inoculare cu ascită Ehrlich avem o reducere a nivelului
de expresie relativ pentru TNF-α în timus în cazul loturilor de animale inoculate cu
ascită Ehrlich cu sau fără EGCG, dar paradoxal aceaşi reducere a nivelului de expresie
relativ se observă şi în cazul administrării de ser fiziologic. Nu acelaşi lucru se observă
la nivelul splinei, unde la 24 de ore are loc o activare puternică, tratamentul cu EGCG
18
are capacitatea de a reduce nivelul de expresie a TNF-α la nivel de mRNA. În general
se observă o creştere a nivelului de expresie pentru IL-6 pentru toate cele trei loturi
(ser, ascită, ascită+EGCG) atât la 48 cât şi la 72 de ore post inoculare. La nivel de
timus activarea IL-6 se observă doar la 48 de ore, nivelul de expresie relativ
restabilindu-se la nivelul lotului martor sau putem spune că avem o inhibiţie a
nivelului de expresie relativ în cazul lotului inoculat cu ascită şi tratat cu EGCG.
2.2.2. Evaluarea apoptozei prin marcare cu Anexina V/Cy5/Calceina,
utilizând Bioanalizorul Agilent 2100 prin metoda cu fluorescenţă Lab
Chip®.
Acest studiu a permis demonstrarea efectului proapoptotic al EGCG-ului, efectul maxim fiind observat la 72 de ore, conform figurii 12.
Figura 12. Evaluarea procelor apoptotice prin marcare cu Anexina V/Cy5/Calceina,
utilizând Bioanalizorul Agilent 2100 prin metoda cu fluorescenţă Lab Chip®, la 48,
48h
25.90 % celule apoptotice
EGCG
72h
29.5 % celule apoptotice
0 % celule apoptotice
6 zile
(A)
(B)0 % celule apoptotice
0 % celule apoptotice
0 % celule apoptotice
19
72, şi 6 zile post tratament, pentru lotul 1 şoareci sănătoşi grefaţi cu ascită Ehrlich,
lotul 2 şoareci sănătoşi grefaţi cu ascită Ehrlich şi trataţi cu o doză unică de EGCG
Se ştie că EGCG-ul provoacă apoptoză în mod specific numai în celulele
tumorale, prin intermediul unor multiple căi metabolice, unul dintre acestea fiind
calea Fas care este mecanismul major pentru inducerea apoptozei mediate imun, dar
din păcate acest efect este tranzitoriu şi este menţinut prin administrarea de doze
multiple. Astfel în acest studiu am observat că prin administrarea unei doze duble de
EGCG la interval de 72 de ore se menţine efectul pro-apoptotic după cum se vede în
cazul lotului 3 din figura 13.
Figura 13.Evaluarea procelor apoptotice prin marcare cu Anexina V/Cy5/Calceina,
utilizând Bioanalizorul Agilent 2100 prin metoda cu fluorescenţă Lab Chip®, la 48,
72, şi 6 zile post tratament, pentru lotul 1 şoareci sănătoşi grefaţi cu ascită Ehrlich,
lotul 2 şoareci sănătoşi grefaţi cu ascită Ehrlich şi trataţi cu o doză unică de EGCG,
lotul 3 şoareci sănătoşi grefaţi cu ascită Ehrlich şi trataţi cu două doze de EGCG la la
6 zile
Lot 2
Lot 2
9 zile
0 % celule apoptotice 0 % celule apoptotice
22 % celule apoptotice
0 % celule apoptotice
9 % celule apoptotice33 % celule apoptotice
Lot 4
0 % celule apoptotice0 % celule apoptotice
Lot 3
Lot 1
Lot 1
Lot 3
20
interval de 72 de ore, lotul 4 şoareci sănătoşi grefaţi cu ascită Ehrlich şi trataţi cu trei
doze de EGCG la interval de 72 de ore
3. Nanotuburile de carbon: transportori biologici mult ifuncţionali cu aplicaţii în medicină, testarea efectului biologic pe sistemele in vitro, respectiv in vivo
Nanotuburile de carbon (CNT) sunt materiale importante, cu o gamă largă de
aplicaţii în domeniul biomedicinei, cosmeticii, aeronauticii şi electronicii. Datorită
proprietăţilor fizice şi chimice au câştigat o atenţie enormă în biomedicină pentru
diferite aplicaţii; ca sisteme noi de transport pentru diferite medicamente, acizi nucleici
sau a anticorpilor şi ca şi componentă a tratamentului fototermic a cancerului.
3.1. Experimentarea capacitatii de internalizare a NTC pe linia celulară Hep2G
În acest studiu am evaluat capacitatea de internalizare a NTC pe linia celulară
Hep2G (Endo şi colab., 2008).. În figura 14 sunt evidenţiate particularităţi ale
structurilor celulare ca urmare a tratamentului cu NTC la 2, 5, 24, 48 de ore, fiecare
experiment realizându-se în triplicat. Asfel s-au selectat câteva imagini reprezentative
pentru cele patru intervale de timp selectate pentru cele trei tipuri de nanotuburi
testate
21
Figura 14. Imagine de microscopie electronică a celulelor Hep2G tratate cu
nanotuburile de carbon funcţionalizate (S SWNTC-COOH, DWNTC-COOH,
MWNTC-COOH) timp de 4, 24 şi 48 ore
Microscopia electronică evidenţiază anomaliile organitelor hepatocitului. Unele
dintre ele, cum este hipertrofia reticulului endoplasmic neted sunt fenomene de
adaptare, crescând activitatea sistemului de oxidare microsomală. Nanotuburile par a
fi prezente în citosol şi nucleu sub forma unor incluziuni citoplasmatice sau vacuole.
Aceste vaculole conţin un material granular, probabil precipitaţii ale unor săruri pe
suprafaţa nanotuburilor. La 4 ore după tratament nu s-au observat celule în diviziune,
în schimb la 24 şi 48 de ore s-au observat un număr mare de celule în diviziune, cu
păstrarea microvililor, acest lucru confirmă datele obţinute prin testul MTT şi datele de
microscopie optică.
Concluzii
Prin microscopia electronică se demonstrează capacitatea de penetrare a NTC la
nivel de citosol şi mai rar la nivelul nucleului. La 4 ore după tratament (celulele
hepatice Hep2G) nu s-au observat celule în diviziune, în schimb la 24 şi 48 ore
numărul celulelor în diviziune este crescut, cu păstrarea microvililor.
Control1:8000
Control1:12000
Imagini de microscopie electronica la 5 ore dupa tratemetul cu NTCNTC prins in vacuola
SWNTC-COOH1:15000
SWNTC-COOH1:8000
SWNTC-COOH1:15000
DWNTC-COOH1:8000
DWNTC-COOH1:12000
SWNTC-COOH1:20000
MWNTC-COOH1:8000
M-DAH71:12000MWNTC-COOH1:12000
MWNTC-COOH1:20000
4 ore dupa tratamentul cu NTC (0.25 µg/ml)
24 ore dupa tratamentul cu NTC (0.25 µg/ml)
48 ore dupa tratamentul cu NTC (0.25 µg/ml)
22
3.2. Aplicaţii ale nanotuburilor de carbon în transportul ţintit al TNF-α siRNA
ARN interferenţa (ARNi) este o metodă post-transcripţională de inhibiţie a
expresiei genice. Literatura a sugerat noi modalităţi de transport care să evite
degradarea lizozomală, cum sunt nanotuburile de carbon carboxilate (SWNTC-
COOH). Acestea sunt capabile să ofere un nivel de protecţie ridicat pentru
componentele terapeutice. Asfel în acest studiu s-a testat capacitatea de inhibiţie
genică a unui sistem comercial (siPortNeoFX, Ambion) în paralel cu un produs
nanoconjugat de TNF siRNA cu SWNT-COOH.
3.2.1. Caracterizarea chimică a nanotuburilor de carbon carboxilate
Analiza termo-gravimetrica (TGA) a nanotuburilor pristine şi a celor
carboxilate (SWNTC-COOH) s-a realizat pentru confirmarea purităţii nanotuburilor de
carbon carboxilate (Fig.15a). Spectrul FT-IR (Fourier transform infrared) este
prezentat în figura 15b, şi confirmă oxidarea SWNTC. Prin compararea celor două
spectre, cel roşu pentru SWNTC-COOH şi cel negru pentru SWNTC, se poate observa
două bezi caracteristice oxigenului, la 3420 cm-1. Pentru grupările carbonil şi carboxyl
sunt vizibile la 1580 şi 1380 cm-1.
Spectul UV-vis în mod clar confirmă funcţionalizarea şi ataşarea siARN-ului de
suprafaţa nanotuburilor. Microscopia electronică confirmă acumularea siARN-ului pe
suprafaţa nanotuburilor (Figura 15d). Săgeţile marchează zonele în care este ataşat
siARN-ul de SWNTC-COOH.
23
Figura 15. Evaluarea termogravimetrică a nanotuburilor pristine şi a celor oxidate
(SWNTC-COOH). (B) spectrul FTIR a nanotuburilor pristine şi a celor oxidate (C)
spectrul UV-vis şi evaluarea prin microscopie electronică (D) a SWNTC-COOH şi a
produsului nanoconjugat SWNTC-COOH-siRNA
3.2.2. Internalizarea siRNA în celulele hepatice HepG2
Studii anteriare au descris internalizarea nanotuburilor fucţionalizate cu siARN
în cateva tipuri celulare, însă internalizarea produsului nanoconjugat SWNTC-COOH-
siRNA pe linia celulară HepG2 nu a fost prezentat până în prezent. Astfel evaluarea
eficienţei transfecţiei a fost realizată folosind microscopia de flourescenţă (Figura 16 ).
Produsul nanoconjugat cu SWNTC-COOH are capacitatea de a penetra membrana
celulară, capacitatea de transfecţie fiind similară cu a agentului de transfecţie
comercial. Prin compararea cu grupul control se observă o rată crescută de
internalizare a siARN-ului în cazul ambelor complexe de transfecţie.
24
Figura 16. Imagini reprezentative în flourescenţă (400x) pentru internalizarea
controlului negativ de siARN în cazul complexului cu siPort NeoFX si SWNTC-
COOH la 24 de ore după reverstransfecţie.
3.2.3. Evaluarea supravieţuirii celulare (MTT)
Fiecare agent de transfecţie poate să aibă o performanţă diferită, dovedită şi de
experimentele noastre. După cum se observa atît în cazul transfecţiei cu siPORT
NeoFX cât şi în cea cu SWNTC-COOH, supravieţuirea celulelor la 24 si 48 de ore a
fost aproape neschimbată, în timp ce agentul în cazul complexelor de transfecţie cu
siRNA a influenţat în mod negativ proliferarea celulară. Reducerea supravieţuirii
celulare în cazul complexelor de trasfecţie cu siRNS poate fi datorată activării
proceselor de apoptoză sau inhibării angiogenezei asociate inhibiţiei genice şi nu
datorită efectelor citotoxice (Figura 17.).
Figura 17. Evaluarea efectului antiproliferativi pe linia celulara Hep2G
MTT test
siRNA- N
eoFX
αααα
TNF-
NeoFX
siRNA-S
WNTC
-COOH
αααα
TNF-
SWNTC
-COOH
0102030405060708090
100110120
% o
f co
ntro
l
25
Eficienţa inhibitţiei genice a fost evaluată prin analiza nivelului de exprimare
genică a β-Actine si TNF-α în celule transfectate cu siARN (TNF-α siRNA) utilizând
siPORTNeoFX respectiv SWNTC-COOH faţă de celule din lotul control. Un nivel de
inhibiţie genică bun s-a inregistrat în cazul celor trei siARN-uri testate. Nivelul de
inhibiţie genică pentru transfecţia cu siPORT NeoFX pentru TNF-αsiRNA este de
56,7. Nivel relativ similar de inhibiţie a expresiei genice a fost observat în cazul
sistemului de transport folosind SWNTC-COOH. SWNTC-COOH s-a dovedit a fi un
sistem de transport eficient a siRNA, după cum demonstrează rezultetele privind
nivelul de expresie genică (figura 18).
Figura 18. Analiza nivelului de expresie genica pentru TNF-α
Cuantificarea nivelului de expresie pentru TNF-α din mediul de cultura s-a
realizat folosind tehnica ELISA (figura 19).
Figura 19. Analiza nivelului de expresie proteic
TNF-
asiR
NA-Neo
FX
NeoFX
siRNA-S
WNTC
-COOH
αααα
TNF-
SWNTC-C
OOH
1
2
3
TNFα gene
**
*
Rela
tive g
ene
exp
ress
ion
leve
l (fo
ld c
hang
e)
TNF-αααα expression level
siRNA-N
eoFX
αααα
TNF-
Neo
FX
siRNA-S
WNTC-C
OOH
αααα
TNF-
SWNTC-C
OOH
0
50
100
150
24
48
*
** *
*
*
% o
f co
ntro
l
26
Metoda imunofluorecentă de coloraţie a confirmat datele de RT-PCR. Datele de
ELISA în ceea ce priveşte nivelul de secreţie în mediul de cultură a TNF-α au fost în
acord cu cele inregistrate la nivel de mARN. Nivelul scăzut de expresie la nivel de
mARN a fost confirmat în cazul transfecţiei TNF-α siRNA. Nivele crescute ale TNF-
α s-au onservat în cazul grupului tratat doar cu siPORT neoFX şi în cazul complexului
de transfecţie VEGFsiRNA-siPORT NeoFX.
Concluzii
Inhibiţia genică cu SWNTC-COOH reprezintă o alternativă validă pentru
sistemele lipidice de transfecţie în cazul terapei ţintite cu ARNi în tratamentul
cancerului. Datele indică faptul că SWNTC-COOH este o nanostructură robustă, cu
eficienţă bună, cu toxicitate redusă în cazul sistemelor in vitro. Acest studiu oferă
perspective ultilizării SWNTC-COOH în cobinaţie cu siRNA în tratamentul ţintit al
cancerului, dar aceste date trebuie validate pe sisteme in vitro (Gannon şi colab., 2007;
Kesharwani şi colab. 2012).
Studii suplimentare trebuie să se concentreze pe dezvoltarea de noi particule cu
capacitate mai mare de biodegradare care imită proprietăţile nanotuburilor pentru
transpostul siRNA.
27
4. Concluzii generale 1. În acest studiu a fost identificat un set de gene implicate in rezistenţa la
tratamentul cu oxaliplatina şi 5-FU care induc apopotoza şi modulează
raspunsul imun.
2. Evaluarea genelor implicate în procesele de apoptoză cât şi a moleculelor
implicate în răspunsul imun ca urmare a tratamentului cu 5-FU, oxaliplatină
precum şi a tratamentului combinat cu cele două citostatice, au contribuit la
identificare unor molecule cu valoare de prognostic în patologia colonului.
3. A fost evidenţiat efectul antiproliferativ şi imunomodulator al EGCG atât în
sistemele in vitro cât şi in vivo. Tratamentul cu EGCG a dus la imbunătăţirea
parametrilor imunologici evaluaţi atât la nivel de mRNA cât şi la nivel de
proteină pentru TNF-α şi IL-6. EGCG a avut o acţiune tranzitorie, administrarea
dozelor multiple determinand activarea mecanismelor antitumorale şi a
proceselor apoptotice.
4. S-a demonstrat pe sisteme in vitro că SWNTC-COOH reprezintă o alternativă
validă pentru sistemele lipidice de transfecţie în cazul terapei ţintite cu siARN
în tratamentul cancerului. Studiile in vitro au arătat că administrarea SWNTC-
COOH ar putea interfera cu mecanismele şi procesele inflamatorii, inducând
mecanismele pro-inflamatorii, mecanisme care pot fi exploatate în modularea
proceselor antiproliferative tumorale.
5. S-a evidenţiat internalizarea nanotuburilor la nivel de citosol şi nucleu prin
microscopie electronică şi în flourescenţă, ceea ce a permis utilizarea acestor
nanostructuri în transportul tintit de siRNA cu efecte negative minime. Prin
analiza FTIR s-au obţinut informaţii legate de caracteristica farmacocinetică şi
degradare a nanotuburilor de carbon.
Prin utilizarea studilor imunologice, de toxicologie sau cele de transcriptomică
(culturi celulare, analiza imunohistochimică microscopie optică şi electronică,
citometrie în flux, real-time PCR, PCR-array, teste de citotoxicitate) şi prin corelarea
cu analize complexe de bioinformatică permit dezvoltarea de noi strategii terapeutice
în tratamentul cancerului.
28
BIBLIOGRAFIE
1. BEDI A., PASRICHA P.J., AKHTAR A.J., BARBER J.P., BEDI G.C.,
GIARDIELLO F.M., ZEHNBAUER B.A., HAMILTON S.R., JONES R.J., 1995,
Inhibition of Apoptosis During Development of Colorectal Cancer. Cancer Res. 55,
1811–1816
2. BHATTACHARYYA A., CHOUDHURI T., PAL S., CHATTOPADHYAY S.,
DATTA G., SA G., DAS T., 2003, Apoptogenic effects of black tea on Ehrlich’s
ascites carcinoma cell. Carcinogenesis. 24: 1, 75–80
3. BRAICU C., BERINDAN-NEAGOE I., BURZ C., BALACESCU O., IRIMIE A.,
2009, Catechins therapeutic implications in cancer, Biology and Therapy of Cancer
Cell ; 1, 81–84
4. DA SILVA R., DA SILVA M., VILEA L., FECCHIO D., 2002, Cytokine profile
of Ehrlich ascites tumor treated with Bothrops jararaca venom. Mediators of
Inflammation; 11, 197–201
5. D'ARCHIVIO M., SANTANGELO C., SCAZZOCCHIO B., VARÌ R., FILESI C.,
MASELLA R., GIOVANNINI C., 2008, Modulatory effects of polyphenols on
apoptosis induction: relevance for cancer prevention. Int. J. Mol. Sci 9; 9, 213–228
6. DUNN G. P., BRUCE A. T., IKEDA.H., OLD L. J., SCHREIBER R. D., 2002,
“Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape,” Nature
Immunology, vol. 3, no. 11, pp. 991–998.
7. EL-MOWAFY A.M., AL-GAYYAR M.M., SALEM H.A., EL-MESERY M.E.,
DARWEISH M.M., 2010, Novel chemotherapeutic and renal protective effects for
the green tea (EGCG): role of oxidative stress and inflammatory-cytokine
signaling. Phytomedicine, 17, 1067-75
8. ENDO M, STRANO M.S., AJAYAN P.M., 2008, "Potential applications of
carbon nanotubes". Carbon nanotubes, Topics in Applied Physics,. 111, 13-61
9. ENGEL A. M., SVANE I. M., RYGAARD J., WERDELIN O., 1997, “MCA
sarcomas induced in scid mice are more immunogenic than MCA sarcomas
induced in congenic, immunocompetent mice,” Scandinavian Journal of
Immunology, vol. 45, no. 5, pp. 463–470.
29
10. GANNON C.J., CHERUKURI P., YAKOBSON B.I., COGNET L., KANZIUS
J.S., KITTRELL C., WEISMAN R.B., PASQUALI M., SCHMIDT H.K.,
SMALLEY R.E., 2007, Cancer 110, 2654-2665
11. KESHARWANI P., GHANGHORIA R., JAIN N.K., 2012, Drug Discov.Today,
http://dx.doi.org/10.1016/j.drudis.2012.05.003
12. KIM H.S., KIN Y.S., LEE H.J., JANG C., CHO Y.J., 2009, Knockdown of
RCAN 1.4 increases susceptibility to FAS-mediated and DNA damage-induced
apoptosis by upregulation of p53 expression. Korean J Physiol Pharmacol. 13, 483-
9
13. KUMAR V., ABBAS A.K., FAUSTO N., ASTER J.C., ROBINS şi COTRAN,
2010, Pathologic basis of disease. 8 edition. Philadelphia: Saunders Elsevier.25-32
14. MATUO R., SOUSA F.G., ESCARGUEIL A.E., GRIVICICH I., GARCIA-
SANTOS D., CHIES J.A., SAFFI J., LARSEN A.K., HENRIQUES J.A., 2009,5-
Fluorouracil and its active metabolite FdUMP cause DNA damage in human
SW620 colon adenocarcinoma cell line. J Appl Toxicol. May;29, 308-16
15. MEYERS M., HWANG A., WAGNER M.W., BRUENING A.J., VEIGL M.L.,
SEDWICK W.D., BOOTHMAN D.A., 2003, A role for DNA mismatch repair in
sensing and responding to fluoropyrimidine damage. Oncogene 22, 7376–7388
16. NEMOTO S., NAKAMURA M., OSAWA Y., KONO S., ITOH Y., OKANO
Y., MURATE T., HARA A., UEDA H., NOZAWA Y. şi BANNO Y., 2009,
Sphingosine kinase isoforms regulate oxaliplatin sensitivity of human colon cancer
cells through ceramide accumulation and Akt activation. The Journal of Biological
Chemistry. 284, 10422–10432
17. PRODAN I,. SEVASTRE B, TOIU A.M., BENEDEC D., ONIGA I., DELIU C.,
MARCUS I.., 2009, Antitumour activity of Hypericum Perforatum L. and
Hypericum Maculatum C. in Ehrlich Ascitic Carcinoma, Buletin USAMV-CN, 66 ,
176-181.
18. RIGAS A., DERVENIS C., GIANNAKOU N., KOZONI V., SHIFF S.J., RIGAS
B., 2002, Selective induction of colon cancer cell apoptosis by 5-fluorouracil in
humans. Cancer Invest.20, 657-65
30
19. SHIMIZU M., SHIRAKAMI Y., MORIWAKI H., 2008,Targeting receptor
tyrosine kinases for chemoprevention by green tea catechins. EGCG. Int. J. Mol.
Sci., 9: 1034–1049 LIU J., XING J., FEI Y., 2008, Green tea (Camellia sinensis)
and cancer prevention: a systematic review of randomized trials and
epidemiological studies. Chin Med, 3, 12, 10.1186/1749-8546-3-12
20. TEMMINK O.H., PRINS H.J., VAN GELDEROP E., PETERS G.J., 2007, The
hollow fibre assay as a model for in vivo pharmacodynamics of fluoropyrimidines
in colon cancer cells. Br J Cancer. 96, 61–66
21. YANG C., LIU H.Z., FU Z.X., 2011, PEG-liposomal oxaliplatine induced
apoptosis in human colorectal cancer cells via Fas/FasL and Caspase-8. Cell
Biology International
