Curst Tehnici microscopice

7/23/2019 Curst Tehnici microscopice

http://slidepdf.com/reader/full/curst-tehnici-microscopice 1/43

C A T A L I N AG H E O R G H I E S E I

T E H N I C I

M I C R O S C O P I C EU T I L I Z A T E Î N C R I M I N A L I S T I C A

LATEX



Copyright © 2015 Catalin AGHEORGHIESEI

editat cu LATEX

http://www.plasma.uaic.ro/didactica

Informaţii de licenţa: aceasta carte poate fi liber distribuita pentru utilizarea în scop educaţional.

Prima edit,ie 2013Edit,ia a doua Ianuarie 2015





Cuprins

1 Introducere 7

1.1 Obiective generale 7

1.2 Cont,inutul cursului 8

1.3 Scurt istoric 8

2 Formarea imaginilor 11

2.1 Obiectul imaginea sa 11

2.2 Principiile opticii geometrice 12

2.3 Reflexia s, i refract,ia 14

2.4 Sisteme de marire 15

3 Microscoape utilizate în criminalistica 23

3.1 Microscopul compus 24

3.2 Microscop stereoscopic 28

3.3 Microscopul de comparat,ie 28

3.4 Microscop cu lumina polarizata 28

4 Caracterizarea imaginilor obt,inute prin instrumente optice 314.1 Absorbt,ia 32

4.2 Reflexia, refract,ia s, i dispersia 33

4.3 Teoria lui Abbe de formare a imaginilor 33

Glosar 43





Lista de figuri

2.1 Sistemul optic delimiteaza spat,iul obiect de spat,iul imagine 112.2 Tipuri de fascicule de lumina. 132.3 Drumul optic 132.4 Spectrul luminii vizibile 142.5 Reflexia s, i refract,ia luminii 14

2.6 Elementele dioptrului sferic: [AOP] axa optica principala; [AOS] axaoptica secundara; [O] centrul dioptrului sferic; [V] vârful dioptruluisferic; [R] – raza dioptrului sferic; [n1, n2] indici de refract,ie pentrumediile separate de suprafat,a dioptrului sferic 14

2.7 Lentile convexe 152.8 Lentile concave 152.9 Principalele marimi caracteristice lentilelor 152.10 Mersul razelor de lumina prin lentile. 162.11 Lentila convergenta, obiect situat la distant, a mai mare decât distant,a

focala. 17

2.12 Lentila convergenta, obiect situat în focarul obiect. 172.13 Lentila convergenta, obiect situat la distant,a mai mica decât distant,afocala 17

2.14 Lentila divergenta. 172.15 Convent,ii de semn pentru dioptrul sferic. 182.16 Formulele lentilelor. 192.17 Formarea imaginii printr-o lupa 202.18 Formarea imaginii printr-un microscop optic. 21

3.1 Evolut,ia istorica a microscopului 233.2 Imagini ale gauncioarelor de polen de Floarea-Soarelui cu mariri de 40x,

100x s, i 400x. 253.3 Componentele microscopului compus 253.4 Mersul razelor de lumina prin microscopul compus. 273.5 Microscop drept. 273.6 Microscop inversat. 273.7 Microscop stereoscopic. 283.8 Microscop de comparat,ie. 293.9 Microscop cu lumina polarizata. 293.10 Analizorul (stânga) s, i polarizorul (2 imagini dreapta) componente ale

microscopului cu lumina polarizata. 293.11 Fibre vegetale colorate observate în lumina nepolarizata (stânga) respec-

tiv polarizata (dreapta). 303.12 Imaginea unei fibre de poliester în lumina liniar polarizata. 30



6

3.13 Imaginea unei fibre de poliester în lumina eliptic polarizata. 303.14 Birefringent,a cristalului de calcit. 30

4.1 Mediu transparent s, i filtru ros, u. 324.2 Combinat,ii datorate absorbt,iei din spectrul luminii albe. 32

4.3 Imagini obt,inute pentru obiecte colorate diferit când sunt iluminate curadiat,ii de culori diferite. 32

4.4 Deviereacontrolataaradiat,iilor prinutilizarea uleiului de imersie. 334.5 Dispersia prin prisma optica. 334.6 Interferent,a undelor stat,ionare 344.7 Interferent,a în dispozitivul Young. 344.8 Difract,ia printr-o diafragma circulara. 354.9 Legatura dintre discul Airy s, i rezolut,ia optica. 354.10 Apertura numerica a unui obiectiv. 354.11 Legatura dintre discul Airy s, i apertura numerica. 364.12 Determinarea rezolut,iei spat,iale optime pentru sistemul optic format din

obiectiv s, i condensor. 374.13 Contrastul/culoarea. 384.14 Compararea tehnicilor de iluminare prin transmisie utilizate pentru a

genera contrast într-un es, antion de hârtie. 384.15 Comparat,ie iluminare în câmp întunecat s, i în câmp luminos. 394.16 Detalii obt,inute în câmp întunecat. 39



1 Introducere

Acest material este destinat tuturor celor interesat,i de Tehnicile microsco-pice utilizate în criminalistica s, i reprezinta o compilat,ie de texte prezentate în cursul cu acelas, i nume prezentat în cadrul masterului de criminalisticaorganizat la Universitatea «Alexandru Ioan Cuza» din Ias, i1. 1 www.uaic.ro

Cititorii interesat,i de aprofundarea s, i studiul avansat a tehnicilor micro-scopice pot consulta bibliografia prezentata la sfârs, itul materialului. Trebuieprecizat însa ca aici ne vom ocupa mai mult de principiile de microscopie f araa insista asupra unor cazuri specifice muncii expert,ilor criminalis, ti.

1.1 Obiective generale

Acest curs îs, i propune sa pregateasca cursant,ii pentru:

• înt,elegerea s, i aplicarea cunos, tint,elor privind conceptele de analiza prinmetodele oferite de tehnicile de microscopie optica, electronica, precum s, ialte tehnici noi de analiza microscopica a suprafet,elor;

• sa cunoasca s, i sa aplice cunos, tint,ele privind modul de pregatire a probelorconform protocoalelor standard de analiza în criminalistica, prin metodeleoferite de tehnicile de microscopie;

• sa-s, i însus, easca s, i sa aplice cunos, tint,ele privind analiza comparativa s, ianaliza mezofazica a unor es, antioane, simulatoare de caz, în special prin

tehnicile de microscopie optica s, i electronica;

• sa aiba capabilitatea de a cauta, prelucra s, i analiza informat,ii dintr-o varie-tate de surse bibliografice s, i sa întocmeasca un raport de cercetare (consta-

tare);• sa aiba idei noi privind protocoalelor experimentale de analiza;

• sa posede abilitatea de a lucra în echipa pentru a rezolva probleme experi-mentale s, i tehnologice;

• sa aiba capabilitatea sa formuleze critici cu privire la stadiul actual dindomeniu s, i aceea de a întrevedea direct,ii noi de cercetare;

• sa init,ieze s, i sa administreze cu succes proiecte personale s, i de grup;

• sa aiba determinare s, i perseverent,a în realizarea sarcinilor primite s, i aresponsabilitat,ilor asumate.

http://www.uaic.ro/

http://www.uaic.ro/



8 tehnici microscopice utilizate în criminalistica

1.2 Cont,inutul cursului

Acest curs este structurat astfel:

• Introducere: Scurt istoric al microscopiei optice; Începuturile folosirii

metodelor optice de analiza în Criminalistica.• Principii fundamentale în Optica: Proprietat,ile fizice ale luminii; Elemente

de optica geometrica; Formarea de imagini prin lentile.

• Bazele Microscopiei Optice: Componentele principale ale unui microscopoptic; Obiective; Caracteristici (notaţii); Clasificare.

• Principii de funct,ionare: Iluminare Koehler; Teoria lui Abbe de formare aimaginii; Rezolut,ie - criteriul Rayleigh; Drum optic; Dinamica formariiimaginii.

• Microscopie în lumina alba (câmp luminos): Microscopul de comparat,ie;

Microscopul stereoscopic; Microscopie în câmp întunecat;

• Microscopie în lumina polarizata: Proprietat,ile luminii polarizate; Micro-scopie în contrast de faza; Microscopie în contrast diferent,ial de interferenţa;Microscopie de fluorescent,a integrala; Microscopie confocala;

• Posibilitat,i de utilizare în analiza Criminalistica (analize de caz).

1.3 Scurt istoric

Microscopul este simbolul universal al s, tiint,ei prin reprezentarea abilitat,ii

de a explora lumea dincolo de percept,iile bazate pe simt,uri.Microscopul optic: Instrument optic folosit pentru observarea obiectelormici marite de circa 2000 de ori s, i se pot distinge detalii de ordinul miimilorde milimetru. Puterea de marire microscopului depinde de tipul respectiv, ceamai mare fiind a microscopului electronic.

Microscopul a fost inventat în 1590 de catre Zacharias Janssen (Olanda)dar se pare ca existau astfel de instrumente optice mai vechi, denumirea demicroscop a fost data în 1624 de Johann Faber (sau Giovanni Faber) naturalist(doctor) papal.

Microscopul electronic instrument analog microscopului optic, în care rolulrazelor de lumina este îndeplinit de un fascicul de electroni care traverseaza

mai multe lentile electronice; poate mari imaginea obiectelor pânalaunmilionde ori, permit,ând distingerea detaliilor de ordinul ångströmilor (10−10m).

Microscopia este tehnica care foloses, te microscopul ca principal instruments, i care descrie modul în care se obt,in imaginile obiectelor foarte mici. Micro-scopia descrie relat,ia între obiect s, i imaginea sa prin sistemul optic/electronical microscopului. Presupune folosirea unor procedee specifice domeniului deaplicabilitate (în acest caz în criminalistica).

Microscopul în criminalistica este utilizat pentru analiza probelor în/de tip:

• Arta, Analiza fotografica, Amprente

• Benzi, Chimie, Droguri

• Gloant,e, Hârtie, Înscrisuri



introducere 9

• Fibre, Fire de par,

• Lemn, Materiale de construct,ie, Minerale

• Polen, Polimeri, Praf

• Sticla, Sol, Ser, Urme de unelte





2 Formarea imaginilor

Formarea imaginilor printr-un instrument optic (implicit printr-un micro-scop) se datoreaza propagarii luminii prin componentele optice ale instru-mentului (oglinzi, prisme, lentile etc.). Analiza imaginilor obt,inute prininstrumentele optice se va face as, adar plecând de la principiile s, i legile de pro-pagare a luminii prin componentele optice (studiate de optica) dar va depindes, i de as, ezarea geometrica a acestor componente (de geometrie). Ne aflamastfel in cadrul opticii geometrice: studiaza propagarea luminii prin diferitemedii sau prin suprafet,ele de separare ale acestora, f ara a lua în considerare

natura ondulatorie sau corpusculara a luminii.Obiectele formeaza imagini prin intermediul instrumentelor optice. În

optica geometrica vom gasi relat,ii care leaga obiectul de imaginea sa (v.Figura 2.1).

Sistem optic

S p a ț i u

o b i

e c t S p a ț i u i m

a g i n e

direcția de propagare a luminii Figura 2.1: Sistemul optic delimiteaza

spat,iul obiect de spat,iul imagine

2.1 Obiectul imaginea sa

Obiecte optice sunt considerate orice obiecte, vizibile sau nu cu ochiulliber, care formeaza imagini prin intermediul sistemelor optice. În opticaaceste obiecte sunt considerate a fi formate din puncte geometrice.

O clasificare simpla privind obiectele optice presupune ca acestea suntconsiderate:

• obiecte luminoase – surse directe de lumina;

• obiecte neluminoase – vizibile în prezent,a obiectelor luminoase

Un obiect luminos sau neluminos este vizibil doar daca este o diferent,a destralucire sau culoare între acesta s, i mediul care îl înconjoara. Diferent,a de

stralucire sau culoare între punctele unei imagini formate de un obiect peretina este cunoscuta sub numele de contrast.




Imaginea obt,inuta privind prin microscop, fotografie, film sau televiziunetrebuie sa fie o reprezentare fidela punct cu punct a obiectului (referitor înprimul rând la stralucire, culoare etc.). Ochiul uman percepe doar stralucireas, i culoarea, creierul interpreteaza stralucirea relativa s, i culorile punctelor delumina de pe retina s, i face o judecata ca fiind marimea, forma, localizarea s, ipozit,ia obiectului real. Ceea ce vedem nu este o reprezentare perfecta a lumiifizice deoarece:

• ochiul nu e perfect

• vazul este limitat de factori fizici (obiecte îndepartate/apropiate, întune-cate/stralucitoare, nu emit în vizibil

• factori psihologici (se poate pacali us, or simt,ul vazului)

Apar o mult,ime de întrebari privind informat,iile pe care le primim prinintermediul imaginilor:

1. Cum obt,inem (primim) informat,iile corecte despre mediul înconjurator?

2. Care este natura s, i validitatea informat,iei?

3. Care este relat,ia între percept,ia noastra s, i lumea reala?

4. Care este natura s, i validitatea informat,iilor obt,inute cu ajutorul instrumen-telor care extind limitele simt,urilor?

Pentruaputearaspunde trebuiesc definite o serie de principii s, i demonstrateo serie de legi legate de formarea imaginilor prin instrumentele optice. S-au dezvoltat teorii despre sursele, propagarea s, i percept,ia luminii. O teorie

interesanta dar care s-a extins în istorie a fost dezvoltata de Aristotel, Euclid în Grecia antica s, i a dainuit pâna la Isaac Newton în Renas, tere: ”Luminaizvoras, te din ochi s, i pipaie obiectele din jur.”.

2.2 Principiile opticii geometrice

Pentru studiul formarii imaginilor printr-un microscop vom da câtevadefinit,ii:

Definit,ie 2.1. Fasciculul de lumina ca fiind o port,iune din spat,iu marginit princare lumina se propaga;.

Definit,ie 2.2. Raza de lumina poate fi definita ca fiind un fascicul paralel delumina de grosime aproape nula (foarte subt,ire);

În optica geometrica fasciculele de lumina (raze de lumina) sunt clasificate în:

• Fascicule de raze omocentrice (au un punct comun): convergente saudivergente;

• Fascicule de raze paralele: razele de lumina nu se intersecteaza

Pricipiu 2.1. Principiul propagarii rectilinii a luminii: într-un mediu omogen

s, i izotrop lumina se propaga în linie dreapta pâna la întâlnirea unui obstacolsau a unui alt mediu.



formarea imaginilor 13

Figura 2.2: Tipuri de fascicule de lumina.

omocentricdivergent

omocentricconvergent

paralel

Fascicul Fascicul Fascicul

Pricipiu 2.2. Principiul independent,ei propagarii razelor luminoase: razele lu-minoase necoerente care se întâlnesc într-un punct nu se influent,eaza reciproc,pastrându-s, i fiecare direct,ia init,iala de propagare.

Pricipiu 2.3. Principiul reversibilitat,ii drumului razelor: O raza de luminacare parcurge un sistem optic într-un sens, va parcurge sistemul pe acelas, idrum optic daca este dirijata în sens invers.

Pricipiu 2.4. Principiul lui Fermat: Drumul optic parcurs de o raza luminoasa între doua puncte este un extremum în raport cu oricare alt drum posibil întreacele puncte. Acest extrem este de obicei un minim.

Pricipiu 2.5. Teorema Malus–Dupin: Daca din mediul obiect (aflat înainteasistemului optic) pornes, te un fascicul de raze normale la suprafat,a echifazaΣ, dupa parcurgerea sistemului optic (prin reflexii s, i refract,ii), razele dinfasciculul emergent sunt normale la suprafat,a echifaza imagine Σ. Drumurileoptice pentru fiecare raza dintre cele doua suprafet,e echifaza sunt egale.

Într-un mediu omogen s, i izotrop viteza de propagare a luminii este constata

s, i se poate defini:

Definit,ie 2.3. Indicele de refract,ie n

n = c0

c(2.1)

unde c0 este viteza luminii în vid

c0 ≈ 3× 108m/s = 300000km/s(2.2)

iar c este viteza de propagare a luminii în acel mediu.

Indicele de refract,ie este supraunitar n > 1.

Definit,ie 2.4. Drumul optic, se noteaza cu (L), este produsul dintre indicelede refract,ie n s, i lungimea geometrica a drumului parcurs de raza luminoasaL0

(L) = n × L0(2.3)

L0

ndrum optic (L)=nL0

Figura 2.3: Drumul opticIndicele de refract,ie a unui mediu de propagare depinde de:

• Temperatura

• Lungimea de unda a radiat,iei luminoase (notata cu λ)

• Undele luminoase din domeniul vizibil au lungimi de unda cuprinse între380nm (violet) s, i 700nm (ros, u)(v. Figura 2.4).




Figura 2.4: Spectrul luminii vizibile

2.3 Reflexia s, i refract,ia

2.3.1 Reflexia luminii

Definit,ie 2.5. Reflexia luminii este fenomenul de întoarcere (part,iala) a undei(razei) luminoase în mediul din care provine când întâlnes, te suprafat,a deseparare dintre doua medii optice diferite. (Figura 2.5)

Legile reflexiei:

Legea 2.1. Raza incidenta, raza reflectata s, i normala în punctul de incident, ala suprafat,a de separare dintre cele doua medii se afla în acelas, i plan.

Legea 2.2. Unghiul de incident,a (i1) este egal cu unghiul de reflexie (i

1)i1 = i 1(2.4)

2.3.2 Refract,ia luminii

Definit,ie 2.6. Refracţia luminii este fenomenul de schimbare a direct,iei depropagare a luminii la întâlnirea suprafet,ei de separare dintre doua mediioptice diferite, prin patrunderea luminii în mediul respectiv. (Figura 2.5)

Legile refract,iei:

Legea 2.3. Raza incidenta, raza refractata s, i normala în punctul de incident,a

la suprafat,a de separare dintre cele doua medii se afla în acelas, i plan.

Legea 2.4. Legea Snellius-Descartes:

n1 sin i1 = n2 sin i2(2.5)n1

n2

i1 i1

i2

r a z a i n c i d e n t ă

r a z a r e f r a c t a t ă

n or m

al a

Figura 2.5: Reflexia s, i refract,ia luminii

Observat,ii:

• Suprafat,a de separat,ie dintre doua medii transparente cu indici de refract,iediferit,i se numes, te dioptru (v. Figura 2.6)

• Daca suprafat,a de separat,ie este sferica atunci dioptrul este numit dioptru

sferic; daca suprafat,a este plana atunci dioptrul este numit dioptru plan;• Dioptrul sferic se caracterizeaza prin urmatoarele elemente:

– Vârful dioptrului V (polul calotei sferice)

– Centrul de curbura O este centrul sferei din care face parte suprafat,asferica

– Axa optica principala: dreapta VO care trece prin vârf s, i centru

– Axa optica secundara: orice dreapta care trece prin centrul optic

• Reflexia s, i refract,ia sunt fenomenele care stau la baza construct,iei instru-mentelor optice: oglinzi, prisme optice, lentile, obiective, oculare, micro-

scoape, lunete etc.

V O

R

AOP

A O S

n1

n2

Figura 2.6: Elementele dioptrului sferic:[AOP] axa optica principala; [AOS] axaoptica secundara; [O] centrul dioptruluisferic; [V] vârful dioptrului sferic; [R]– raza dioptrului sferic; [n1, n2] indicide refract,ie pentru mediile separate desuprafat,a dioptrului sferic




2.4 Sisteme de marire

Pentru a putea observa mai multe detalii a unui obiect (fie obiect microsco-pic, fie obiect foarte îndepartat) trebuie utilizat un sistem optic de marire.

Sistemele optice de marire pot fi clasificate în:

• sisteme simple: oglinda, proiector, lupa

• sisteme compuse: microscop, luneta

Sistemele de marire compuse cont,in o serie de sisteme simple: de regula maimulte lentile, diafragme, oglinzi etc.

Definit,ie2.7. Lentilelesunt sisteme optice transparenteformate prinalaturareaa doi dioptri.

Dupa diversele tipuri de dioptri alaturat,i lentilele sunt caracterizate astfel:

• lentile biconvexe (a), plan-convexe (b) s, i menisc convex (c);

a b c

Figura 2.7: Lentile convexe

• lentile biconcave (d), plan-concave (e) s, i menisc concav (f);

d e f

Figura 2.8: Lentile concave

F1

F2O

F2

F1

O

{ f <0

1

{

f >02

o b i e c t

i m a g i n e

o b i e c t

i m a gi n e

{

f >01

f <02

{

x <01

x >02

Figura 2.9: Principalele marimi caracteris-tice lentilelor

Principale caracteristici ale lentilelor subt,iri:

• Centrul optic al lentilei O;

• Focarul imagine F2 s, i focarul obiect F1;

• Distant,a focala obiect: f 1 = F1O;

• distant,a focala imagine f 2 = F2O;

2.4.1 Imagini prin lentile

Pentru a construi imaginile obiectelor prin lentile t,inem cont de câtevaconsiderente geometrice ce provin din aproximat,ia paraxiala a razelor delumina s, i din legile de propagare a razelor de lumina prin sistemele optice. Înaproximat,ia paraxiala razele de lumina care formeaza imaginile se propaga

foarte aproape de axa optica a sistemului (formeaza unghiuri mici cu axaoptica < 5o).




O imagine a unui obiect este considerata imagine clara daca fiecarui punctde pe obiect îi corespunde un punct imagine s, i numai unul. Punctele imaginese vor forma la intersect,ia a cel put,in 2 raze luminoase (sau la prelungireaacestora)

Pentru construct,ia geometrica a imaginilor prin lentile consideram propa-garea urmatoarelor raze luminoase:

• Orice raza paralelacuaxaoptica principaladupalentila va trece prin focarulimagine (raza sau prelungirea ei)

• Orice raza luminoasa care trece prin focarul obiect dupa lentila va deveniparalela cu axa optica;

• Orice raza care trece prin centrul lentilei se va propaga f ara a fi deviata

F1

F2O

F2

F1

O

o b i e c t

i m a g i n e

o b i e c t i m

a gi n e

F1

F2O

F2

F1

O

o b i e c t

i m a g i n e

o b i e c t i m

a gi n e

F1

F2O

F2

F1

O

o b i e c t

i m a g i n e

o b i e c t

i m a gi n e

Figura 2.10: Mersul raze-lor de lumina prin lentile.




2.4.2 Construct,ia imaginilor prin lentila convergenta

Daca obiectul este situat fat,a de lentila la o distant,a mai mare decât distant,afocala obiect (v. Figura 2.11) atunci imaginea va fi:

• reala (poate fi proiectata pe un ecran);

• rasturnata;

• mai mica sau mai mare decât obiectul F1

F2O

Figura 2.11: Lentila conver-genta, obiect situat la distant,a

mai mare decât distant,a focala.

Daca obiectul este situat în focarul obiect (v. Figura 2.12) atunci imagineava fi:

• reala dar nelocalizata (se formeaza la infinit);

• rasturnata;

• egala ca marime cu obiectul F1

F2O

Figura 2.12: Lentila convergenta,obiect situat în focarul obiect.

Daca obiectul este situat fat,a de lentila la o distant,a mai mica decât distant,afocala obiect (v. Figura 2.13) atunci imaginea va fi:

• virtuala (nu poate fi proiectata pe un ecran);

• dreapta;

• mai mare decât obiectul (în acest caz lentila este denumita lupa)F1

F2O

Figura 2.13: Lentila conver-genta, obiect situat la distant,a

mai mica decât distant,a focala

2.4.3 Construct,ia imaginilor prin lentila divergenta

Indiferent daca obiectul este situat fat,a de lentila la o distant,a mai mica sau

mai mare decât distant,a focala obiect (v. Figura 2.14) atunci imaginea va fi:

• virtuala (nu poate fi proiectata pe un ecran);

• dreapta;

• mai mica decât obiectul.F2

F1O

Figura 2.14: Lentila divergenta.2.4.4 Complemente matematice

Definit,ie 2.8. Stigmatismul este proprietatea unui sistem optic de a formapentru fiecare punct al unui obiect o imagine care este tot un punct s, i numai

unul.Altfel spus sistemele optice care formeaza imagini clare sunt sisteme care

au proprietatea de sigmatism. În cele ce urmeaza vom considera sistemele optice prezentate anterior

(dioptrul sferic, lentile) ca fiind sisteme stigmatice. O condit,ie pentru a asigurastigmatismul este ca razele de lumina sa fie paraxiale, adica sa fie „aproape”

paralele cu axa optica: fac unghiuri mici cu axa optica (mai mici decât 5o)Convent,ii de semn:

• Toate distant,ele pâna la punctele obiect s, i imagine vor fi masurate fat,a devârful V al dioptrului sau fat,a de centrul lentilei. Se considera distant,e po-

zitive daca masuratoarea se face în sensul propagarii radiat,iilor s, i negativedaca masuratoarea se face în sens opus propagarii razei de lumina;




• unghiurile se vor masura fat,a de axa optica s, i vor fi considerate pozitivedaca raza „se rotes, te” spre axa optica în sens trigonometric (antiorar) s, inegativ daca „rotat,ia” se face în sens antitrigonometric (orar)

Figura 2.15: Convent,ii desemn pentru dioptrul sferic.

V O

R

AOP

n1

n2

-x1 +x2

-1 2

+y1

-y2

2.4.5 Formule dioptru

Legea 2.5. Prima relat,ie (sau relat,ia punctelor conjugate)

n2

x2−

n1

x1=

n2 − n1

R(2.6)

Legea 2.6. A doua relat,ie (marirea liniara transversala)

β = y2

y1=

x2

x1·

n1

n2(2.7)

Pentru a afla pozit,ia focarului imagine: în relat,ia (2.6) se considera cao raza provine de la un obiect as, ezat la infinit (raza va fi paralela cu axa

optica principala) s, i dupa ce trece prin dioptru va ajunge în focar (matematicx1 → −∞ s, i x2 = f 2):

f 2 = n2R

n2 − n1(2.8)

Analog pentru pozit,ia focarului obiect: în relat,ia (2.6) se considera ca oraza provine de la un obiect as, ezat în focarul obiect ce trece prin dioptru va

ajunge paralela cu axa optica principala (matematic x2 → −∞ s, i x1 = f 1):

f 1 = −n1R

n2 − n1(2.9)

încât formula punctelor conjugate (2.6) se poate rescrie

f 2x2

+ f 1x1

= 1(2.10)

2.4.6 Formule lentile

Legea 2.7. Formula fundamentala a lentilelor subt,iri:

1

x2−

1

x1= (n− 1)

1

R1−

1

R2

(2.11)

Legea 2.8. Formula maririi liniare transversale pentru lentile:

β = y2

y1= x2

x1(2.12)




F1

F2O

{ f <0

1

{

f >02 o

b i e c t

i m a gi n e

x <01

x >02

Figura 2.16: Formulele lentilelor.

Focarul imagine a lentilei subt,iri:

f 2 = 1

(n − 1)

1R1− 1

R2

= f (2.13)

Focarul obiect:

f 1 = −1

(n − 1)

1R1− 1

R2

= − f (2.14)

Definim convergent,a unei lentile:

C = 1

f (2.15)

2.4.7 Caracteristici instrumente optice

Marirea liniara transversala: raportul dintremarimeaimaginii y2 s, i marimeaobiectului y1

β = y2

y1(2.16)

Puterea: raportul dintre tangenta unghiului sub care se vede prin instrumentun obiect α2 s, i marimea obiectului y2

P = tan α2

y2(2.17)

Grosismentul determina marirea unghiulara a instrumentului optic s, i este

definit ca fiind raportul între tangentele unghiurilor sub care se vede obiectulprin instrument α2 s, i f ara instrument α1:

G = tan α2

tan α1(2.18)

Puterea separatoare reprezinta capacitatea de a forma imagini distincte a

doua puncte vecine s, i poate fi definita prin:

• distant,a minima între doua puncte ce formeaza puncte distincte prin in-strumentul optic (pe imagine se disting 2 puncte) – putere separatoareliniara;

• unghiul minim între 2 raze de lumina care formeaza prin instrumentul opticimagini distincte – putere separatoare unghiulara




Pentru instrumentele optice la care imaginea este privita cu ochiul libero marime importanta este distant,a optima de citire notata cu δ care pentruochiul normal (emetrop) este δ = 0, 25m = 25cm s, i este distant,a între ochi

s, i punctul proxim. Pentru toate obiectele situate la distant,a mai mare decâtacest punct ochiul necesita acomodare pâna la aproximativ 6m unde se afla

punctul „remotum”. Ochiul normal nu poate forma imagini clare daca obiectulobservat este situat la mai put,in de 25cm de ochi. Trebuie remarcat aici faptulca aceasta distant,a depinde de la subiect la subiect s, i mai mult tinerii potfocaliza la distant,e mai mici de pâna la 125mm (de aproximativ 2x mai mica) încât aces, tia practic maresc cu ajutorul ochiului de 2x fat,a de adult,i deoareceimaginea acopera o mai mare parte a retinei.

2.4.8 Lupa

Lupa este un instrument optic simplu convergent alcatuit dintr-o lentilasau un grup de lentile care au o distant,a focala de ordinul centimetrilor.

Figura 2.17: Formareaimaginii printr-o lupa

F1

F2O

M

2

x1

a

y1

y2

Obiectul care formeaza imaginea prin lupa este as, ezat între focarul obiect F1

s, i lentila (v. Figura 2.17). Imaginea va fi virtuala, dreapta s, i mai mare decât

obiectul. Pentru observarea imaginii ochiul este plasat în imediata apropiere alentilei (punctul M) la o distant,a a de lentila s, i la δ = 25cm distant,a optimade observare. De obicei obiectul este situat cât mai aproape de focarul F1

astfel încât x1 ≈ f . Prin urmare puterea lupei va fi:

P = tan α2

y2=

y1/x1

y1=

1

x1≈

1

f (2.19)

În concluzie: puterea lupei este egala cu convergent,a ei. As, adar pentru arealiza o lupa cu putere cât mai mare va trebui s a se utilizeze o lentila (sau ungrup de lentile) cu convergent, a cât mai mare. Acest lucru presupune utilizareaunor lentile a caror dioptri au raze de curbura mici ceea ce mics, oreaza multsuprafat,a lentilei. Drept consecint,a puterea optica a lupelor nu depas, es, te 100de dioptrii iar puterea separatoare este de aproximativ 3µm = 3 × 10−6m.Pentru observarea obiectelor cu dimensiuni mai mici trebuie utilizat un altsistem de marire: microscopul optic.

2.4.9 Microscopul optic

Microscopul optic cont,ine 2 part,i optice numite obiectiv s, i ocular (v. Fi-gura 2.18). Obiectivul este partea optica cea mai apropiata de obiect s, i for-




meaza imagine reala, rasturnata s, i mai mare decât obiectul în spat,iul dintreobiectiv s, i ocular (imaginea A B). Aceasta imagine are rol de obiect pentrulentila ocular care se comporta ca o lupa formând în final imaginea virtuala,rasturnata mai mare decât obiectul (imaginea A B). Imaginea formata

Figura 2.18: Formarea imaginii printr-unmicroscop optic.

prin microscop des, i marita se afla situata destul de departe fat,a de ocular (Oc) încât ochiul (practic lipit de ocular) va privi aceasta imagine neacomodat.Astfel razele de lumina emergente sunt aproape paralele iar raza BF2 va facecu axa optica a sistemului unghiul α2 aproximativ egal cu unghiul formatde raza BO cu axa optica. As, adar tan α2 ≈ y1/ f 2 iar puterea optica amicroscopului va fi:

P = tan α2

y1≈

y1 y1 f 2

(2.20)

s, i cum imaginea y1 se formeaza foarte aproape de focarul F2 ca s, i în cazullupei practic F1 A ≈ e cu e distant,a dintre cele doua focare F 1 s, i F2. Distant,ae se numes, te interval optic s, i pentru unele microscoape este stabilita de catreutilizator prin operat,ia de „punere la punct” a microscopului (se deplaseazaocularul sau obiectivul pânacândseobserva clar imaginea marita a obiectului).Astfel puterea optica a microscopului va deveni:

P ≈ e f 1 f 2

(2.21)

În concluzie puterea optica a microscopului este cu atât mai mare cu câteste mai mare intervalul optic sau convergent,a obiectivului 1/ f 1 respectiv aocularului 1/ f 2.

Grosismentul microscopului definit de relat,ia (2.18) este:

G = tan α2

tan α1=

y1 f 2

·δ

y1≈

P

4(2.22)

unde am t,inut cont ca pentru un ochi normal delta = 0,25m = 1/4m. În

practica microscoapele au mai multe obiective s, i oculare care se pot combinapentru a se obt,ine puteri diferite.





3 Microscoape utilizate în criminalistica

Primele metode de examinare a probelor fizice, în laboratoarele de crimi-nalistica, s-au bazat aproape exclusiv pe microscopie pentru a studia structuras, i funct,iile materiei. Microscoapele utilizate în criminalistica nu difera cunimic fat,a de aparatele utilizate în cercetare. Diferent,a consta în protocolulutilizat pentru prelevarea probei, obt,inerea imaginii pe microscop s, i eventualfotografierea sau înregistrarea video a imaginilor.

Primele microscoape utilizate constau doar în alaturarea celor doua lentileconvexe s, i fixarea lor la distant,a corespunzatoare într-un tub analog cu cel utili-zat pentru lunete. Mai apoi au fost realizate monturi fixe s, is-auadaugat surselede lumina, diafragmele, filtrele, polarizorii s, i aparatul fotografic. Pe masurace tehnica s-a dezvoltat s-a ajuns la utilizarea microscoapelor electronice cu

baleiaj (v. Figura 3.1).

Figura 3.1: Evolut,ia istorica a microscopu-luiO lista a diferitelor tipuri de microscoape este prezentata mai jos:

• Microscop optic compus

• Microscop optic stereoscopic

• Microscop de comparat,ie

• Microscop în lumina polarizata

• Microscop în fluorescent,a




• Microscop electronic de baleaj (SEM & TEM)

• Microspectrofotometru

Pentrua alege tehnica de microscopie convenabila pentruanaliza criminalisticatrebuie sa raspundem la urmatoarele întrebari:

1. Ce tip de proba urmeaza sa fie studiata?

2. De ce marire este nevoie?

3. Dorit,i sa pregatit,i proba în as, a fel ca rezultatul sa conduca la evident,iereaanumitor aspecte (detalii)?

1. Ce tip de proba urmeaza sa fie studiata?Probe diferite au proprietaţi fizice diferite – intent,ia este sa se observe aproapeorice cu ajutorul microscopului! De exemplu: sângele este structural foartediferit fat,a de un diamant al unui inel s, i prin urmare difera tehnica de con-

trast folosita pentru observare. As, adar cerint,ele unui microbiolog pentru unmicroscop vor fi foarte diferite fat,a de cele ale unui producator de bijuterii!

2. De ce marire este nevoie?Celulele ros, ii din sânge au 6-8µm în diametru o dimensiune mica! Vet,iavea nevoie de o marire de minimum 400x pentru a vedea celule ros, ii dinsânge, dar daca doriţi sa vizualizat,i celulele ros, ii în detaliu, atunci veţi avea

nevoie de o marire mai mare. În plus, proba de sânge va trebui sa fie pregatitape o lamela de sticla, astfel încât sa poata fi vazute detaliile pe care le dorit,i.Un inel cu diamant are aproximativ 1,5 cm în dimensiune s, i poate fi vazut cuochiul liber. Un producator de bijuterii, poate vedea toate detaliile complicateale inelului cu o marire de 10x-–20x.

3. Dorit,i sa pregatit,i proba în as, a fel ca sa fie evident,iate anumite aspecte?Când se as, eaza un diamant într-un inel, bijutierul trebuie sa plaseze cu grija

piatra pret,ioasa. Pentru aceasta este nevoie de vedere 3D deoarece acest lucruofera percept,ia adâncimii, care ajuta la coordonarea mâna-ochi.Des, i celulele ros, ii din sânge sunt prea mici, se dores, te observarea diferiteloraspecte. Acest lucru ar putea implica modalitat,i diferite de pregatire a probeide sânge s, i/sau tehnici diferite de iluminare: câmp întunecat sau iluminare încontrast de faza.

3.1 Microscopul compus

Microscoapele simple au doar un singur set de lentile în timp ce microsco-pul compus poseda sisteme de lentile grupate în obiectiv s, i ocular. Marireamaxima va fi data de produsul maririlor corespunzatoare celor doua compo-

nente. microscopul compus are o marire uzuala cuprinsa între 40x s, i 450xdar s-a obt,inut valoarea maxima record de 1000x (în practica marirea maximafiind 650-700x în funct,ie de ocularele s, i obiectivele utilizate). În Figura 3.2

sunt prezentate imagini ale gauncioarelor de polen de Floarea-Soarelui cumariri de 40x, 100x s, i 400x.

Componentele microscopului compus sunt prezentate în Figura 3.3 pentrucazul în care se foloses, te un singur ocular (microscopul se va numi monocular)

dar nu difera cu nimic de cazul utilizarii a doua oculare când aceeas, i imagineeste privita prin doua oculare diferite (microscop binocular) foarte utilizat



microscoape utilizate în criminalistica 25

Figura 3.2: Imagini ale gauncioarelorde polen de Floarea-Soarelui

cu mariri de 40x, 100x s, i 400x.

Figura 3.3: Componen-tele microscopului compus

ocular

tub de observare

sursa de lumină

diafragma irisului

braț

șasiu

lentile condensor

masa pentruprobe

obiective

suport pentruobiective

reglaj fin

reglaj grosier

controler coaxialmasă probe

Monocular




astazi. Mersul razelor de lumina printr-un astfel de microscop estereprezentat în Figura 3.4




(imagine virtuală)

(condensor)

(proba)

(obiectiv)

(imagine planăintermadiară)

(ocular)

(ecran)

Figura 3.4: Mersul razelor de lu-mina prin microscopul compus.

3.1.1 Terminologie

Principalii termeni care sunt considerat,i în cazul compararii performant,elor

microscoapelor compuse sunt:

• Sursa câmpului de iluminare - iluminare prin transmise

• Sursa de epi-iluminare - iluminare prin reflexie

• Diafragma irisului

• Parfocal

• Monocular Binocular

• Adâncimea câmpului vizual

• Largimea câmpului vizual

toate aceste caracteristici sunt trecute pe fis, a tehnica ce însot,es, te microscopul. În funct,ie de pozit,ia surselor câmpului de iluminare s, i epi-iluminare s-aurealizat microscoape cu vizualizare de deasupra probei (microscop drept)respectiv cu vizualizare pe dedesubtul probei (microscop inversat). Astfel

Figura 3.5: Microscop drept.

în cazul microscopului drept (v. Figura 3.5) sursa câmpului de iluminare esteo sursa de iluminare prin transmisie s, i situata în partea de jos a microscopului

iar sursa de epi-iluminare este sursa prin reflexie s, i situata în partea de sus.

Figura 3.6: Microscop inversat.




Microscopul inversat (v. Figura 3.6) prezinta sursa câmpului de iluminare printransmisie în partea de sus iar sursa de epi-iluminare prin reflexie în partea de jos.

3.2 Microscop stereoscopicMicroscopul stereoscopic este cel mai utilizat în criminalistica (v. Fi-

gura 3.7) având un domeniu de marire 10–125x. Des, i marirea acestui micro-scop nu este foarte mare acest tip de microscop are un câmp de vedere largs, i adâncime mare de focalizare (sunt imagini 3D) ceea ce permite utilizareaacestuia pentru eliminarea artefactelor voluminoase s, i concentrarea studiilorurmatoare doar asupra zonelor de interes criminalistic. Nu trebuie

Figura 3.7: Microscop stereoscopic.

confundat microscopul stereoscopic cu cel binocular numai pentru faptul case utilizeaza ambii ochi pentru privirea imaginii formate. Microscopul stereo-scopic formeaza doua imagini distincte pentru cei doi ochi spre deosebire demicroscopul binocular la care pe fiecare ochi este proiectata aceeas, i imagine.Imaginea stereoscopica este interpretata ca fiind imagine 3D de catre creierulomului care face analiza, orice fotografie obis, nuita f acuta prin microscopulstereoscopic fiind totus, i o imagine 2D.

3.3 Microscopul de comparat,ie

Microscopul de comparat,ie (v. Figura 3.7) este un alt exemplu ce microscopfoarte utilizat în criminalistica ce permite compararea probei cu un model delaborator. Este format practic din doua microscoape compuse independentecare formeaza imagini alaturate sau suprapuse în acelas, i câmp vizual. Acest

tip de microscop este utilizat în special pentru compararea urmelor l asate dediferite unelte pe diferite tipuri de materiale sau în cazul analizei tuburilor decartus, ce provin de la diferite arme de acelas, i calibru.

3.4 Microscop cu lumina polarizata

Microscop cu lumina polarizata este un microscop compus în care seutilizeaza o lumina polarizata pentru cres, terea contrastului s, i evident,ierea




Figura 3.8: Microscop de comparat,ie.

(ocular)(lentile Bertrand)

(analizor)

(masă rotativă)

(condensor)

(polarizor)

(lentilă de focalizare)

(lampă de halogencu tungsten)

( asiu)

(buton pentrureglarea focalizării)

(control pentru reglareaintensității lămpii)

(buton pentrupornire/oprire)

(tuburi de observare)

(tuburi intermediare)

(cadru)

Figura 3.9: Microscop cu lumina polari-zata.

unor caracteristici speciale ale probelor analizate. Schema constructiva amicroscopului cu lumina polarizata este prezentata în Figura 3.9. Aici trebuieremarcate 2 componente ale acestui tip de microscop care cont,in polarizori

numite pe scurt: Analizor respectiv polarizor (v. Figura 3.10).

(compensator plat)

(controler polarizor)

(polarizor)

(lentile Bertrand)

(tub intermediar)

(polarizor)

(aperturadiafragmei)

(fata lentilei)

(controlul numeric

al aperturii)

(controlerul de

orientare

a polarizorului)

(vernier gradatpentru orientarea

polarizorului)

(controler pentru

lentilele Bertrand)

Figura 3.10: Analizorul (stânga) s, i polari-zorul (2 imagini dreapta) componente alemicroscopului cu lumina polarizata.

Polarizorul este componenta care transforma lumina nepolarizata de lasursa în lumina polarizata liniar prin introducerea unui material polarizor înfascicul (aici este un abuz de limbaj pentru ca un acelas, i cuvânt „polarizor”este utilizat pentru materialul care realizeaza polarizarea luminii s, i a întregiicomponente însa un material polarizor este cont,inut s, i de catre analizor).

Analizorul este componenta care cont,ine deasemenea un material polarizors, i care plasata sub diferite unghiuri fat,a de polarizor determina o variat,ie aintensitat,ii fasciculului de lumina s, i obt,inerea practic a contrastului imaginii

în microscopia cu lumina polarizata. Analizorul înlaturat din drumul optic per-mite obt,inerea imaginii în lumina polarizata s, i da probei „culoarea adevarata”.




Daca se intercaleaza în drumul optic analizorul s, i se rotes, te pâna la creareacondit,iei de extinct,ie (polarizorul s, i analizorul vor avea direct,iile de transmisie în cruce) vom obt,ine imaginea probei cu o „culoare de interferent,a”.

Îmbunatat,irea contrastului în cazul microscopiei în lumina polarizata seobt,ine as, adar prin intensificarea culorilor chiar daca aceste nu sunt culorilenaturale adevarate ale cont,inutului probelor respective. În plus se vor obt,ine

imagini cu contrast diferit prin utilizarea diferitelor tipuri de lumina polarizata:liniar polarizata sau eliptic/circular polarizata.

Figura 3.11: Fibre vegetale colorateobservate în lumina nepolarizata

(stânga) respectiv polarizata (dreapta).

colorate; lumina polarizata

Figura 3.12: Imaginea unei fibre depoliester în lumina liniar polarizata.

Figura 3.13: Imaginea unei fibre depoliester în lumina eliptic polarizata.

Acest lucru este observat us, or în imaginile prezentate în Figurile 3.11,3.12 s, i 3.13. Se remarca diferent,a atât între imaginile pentru tipurile de fibre(vegetale s, i sintetice) dar s, i modul în care este crescut contrastul în luminapolarizata.

Microscopia în lumina polarizata este utilizata pentru analiza medico-legala a fibrelor naturale/articiciale dar s, i pentru analiza medico-legala a unorsubstant,e cristaline din sol de exemplu deoarece unele componente acestorsubstant,e prezinta fenomenul de birefringent, a adica fenomenul de refract,ieatunci când lumina trece prin aceste substant,e depinde de polarizarea luminiiincidente. Practic se obt,in doua raze de refract,ie în funct,ie de polarizarealuminii (o raza se numes, te raza ordinara s, i alta raza extraordinara). Exemplu:cristalul de calcit prezinta un astfel de fenomen (v. Figura 3.14).

Figura 3.14: Birefringent,acristalului de calcit.



4 Caracterizarea imaginilor obt,inute prin

instrumente optice

Atunci când sunt studiate imaginile obt,inute prin instrumentele opticetrebuie sa se analizeze o serie de fenomene fizice care concura la formareaimaginii. Fara a avea pretent,ia ca vom face un tratat complet privind formarea

imaginilor vom studia în acest capitol o serie de astfel de fenomene fizice.Pentru aprofundarea acestui subiect recomand doua resurse on-line foartesimple s, i bine informate: Nikon MicroscopyU1 s, i Optical microscopy primer2. 1 www.microscopyu.com

2 micro.magnet.fsu.edu/primer/ Parte din materialul care urmeaza este bazat pe informat,iile cuprinse în acestesite-uri.

Prezentam mai jos o enumerare sumara a fenomenelor fizice ale luminiicare au consecint,e asupra formarii imaginilor:

Absorbt,ia Când lumina trece printr-un mediu optic transparent intensitatea sereduce in funct,ie de culoare absorbita. Astfel, absorbt,ia selectiva a luminiialbe produce lumina colorata.

Reflexia Fenomenul de întoarcere a luminii în mediul din care a provenit,atunci când întâlnes, te suprafat,a de separare dintre doua medii cu densitat,ioptice diferite.

Refract,ia Schimbarea direct,iei de propagare a luminii la trecerea dintr-unmediu transparent în altul cu densitate optica diferita (indice de refract,iediferit). O raza provenita dintr-un mediu mai put,in dens va fi deviata fat,ade normala la suprafat,a de separat,ie dintre cele doua medii, deviat,ia estecu atât mai mare cu cât radiat,ia este de lungime de unda mai mica.

Dispersia Separarea luminii în componentele spectrale, cu lungimi de undaconstitutive, atunci când strabate un mediu optic transparent – modificareaindicelui de refract,ie cu lungimea de unda.

Difract,ia Devierea de la propagarea rectilinie a unei unde luminoase atuncicând întâlnes, te un obstacol cu dimensiunea de ordinul lungimii de undaa radiat,iei (fenomenul de ocolire a obstacolelor). Cu cât lungimea deunda este mai mica în raport cu dimensiunea fantei/obstacolului, cu atâtfenomenul se manifesta mai put,in.

Interferent,a reprezinta fenomenul de suprapunere a doua sau mai multe undecare se întâlnesc într-un punct din spat,iu.

http://www.microscopyu.com/

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/.pdf


http://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_2/micro.magnet.fsu.edu/primer/

http://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_2/micro.magnet.fsu.edu/primer/


http://micro.magnet.fsu.edu/primer/.pdf





4.1 Absorbt,ia

Atunci când radiat,ia optica trece printr-un mediu intensitatea ei scade dupao lege exponent,iala:

Legea 4.1.I = I 0 exp[−(λ)x](4.1)

numita legea absorbt,ie sau legea Lambert-Beer. În relat,ia (4.1) I 0 esteintensitatea radiat,iei optice înainte de stratul absorbant, I este intensitatearadiat,iei dupa ce a parcurs o distant,a x prin stratul absorbant, este o marimece depinde de tipul de material absorbant s, i de lungimea de unda λ (culoarea)a radiat,iilor incidente.

Aplicat,iile directe a absorbt,iei sunt reprezentate cel mai bine de filtreleutilizate în optica. Ele se bazeaza pe absorbt,ia selectiva a anumitor culori dinspectrul luminii albe.

Figura 4.1: Mediu transparent s, i filtru ros, u.

De exemplu: pentru un filtru ros, u din spectrul luminii albe sunt absor-bite radiat,iile optice corespunzatoare culorilor verde, albastru, violet (v. Fi-gura!4.1).

În Figura 4.2 sunt reprezentate combinat,iile de radiat,ii optice absorbite dinlumina alba pentru ca radiat,ia ce trece de filtru sa fie de o anumita culoare(coloana 1). De exemplu: pentru obt,inerea culorii verzi se absoarbe ros, u s, ialbastru.

Figura 4.2: Combinat,ii datorateabsorbt,iei din spectrul luminii albe.

Culoarea în lumia albă Culoarea luminii absorbite

verde

ro șu

albastru

verde

purpuriu

cyan

galben

albastru

albastru

albastru

albastru

verde

verde

green

verde

ro șuro șu

ro șu

ro șunegru

gri verde albastr uroz

Figura 4.3: Imagini obt,inute pentru

obiecte colorate diferit când sunt ilu-minate cu radiat,ii de culori diferite.

Atunci când privim anumite imagini obt,inute prin trecerea radiat,iilor prininstrumente optice este important ce lungime de unda (culoare) au radiat,iile

respective ceea ce poate determina obt,inerea de imagini colorate diferit, cucontrast diferit (v. Figura 4.3).



caracterizarea imaginilor obt, inute prin instrumente optice 33

4.2 Reflexia, refract,ia s, i dispersia

Fenomenele de reflexie s, i refract,ie au fost studiate s, i în capitolul anteriorunde au fost prezentate legile reflexiei s, i refract,iei (v. relat,iile (2.4) pentrulegea reflexiei respectiv relat,ia (2.5) pentru refract,ie).

Reflexia s, i refract,ia sunt fenomene fizice optice ce apar întotdeauna îm-preuna la suprafat,a de separat,ie dintre doua medii optice diferite (cu indici derefract,ie diferit,i). Refract,ia este fenomenul principal care permite radiat,iilor

optice care trec printr-o lentila sa fie deviate controlat pentru a se realizaconvergent,a sau divergent,a fasciculelor (v. lentile convergente sau divergentestudiate în capitolul anterior).

În cazul microscopiei optice refract,ia s, i reflexia permite realizarea devie-rii razelor de lumina în mod controlat prin alegerea convenabila a mediilortransparente între obiectul studiat s, i obiectivul microscopului.

Figura 4.4: Devierea controlata a radiat,iilorprin utilizarea uleiului de imersie.

În cazul fenomenului de dispersie datorita variat,iei indicelui de refract,ie culungimea de unda (culoarea) radiat,iei optice se vor obt,ine unghiuri de refract,iediferite pentru culori diferite.

Cel mai cunoscut experiment în care este pusa în evident,a dispersia consta în trecerea radiat,iei albe printr-o prisma. Aici are loc refract,ia pe cele douasuprafet,e de separat,ie ale prismei s, i radiat,ia emergenta va fi colorata în com-ponentele radiat,iei incidente (v. Figura 4.5).

rac

Figura 4.5: Dispersia prin prisma optica.

Radiat,iile de lungimi de unda mici sunt deviate mai mult decât cele delungimi de unda mari.

4.3 Teoria lui Abbe de formare a imaginilor

Ernst Karl Abbe23 ianuarie 1840, Eisenach

14 ianuarie 1905, Jena

Fizicianul german Abbe a realizat prima teorie completa privind formareaimaginilor prin instrumentele optice. El a considerat ca: «Imaginea formataprintr-un sistem optic este efectul interferent,ei unor fenomene de difract,ie».

As, adar formarea imaginilor sunt determinate de interferent,a radiat,iilor opticecare trec prin sistemul optic dar s, i de modul în care apare difract,ia acestorradiat,ii atunci când întâlnesc obstacole de ordinul lungimii de unda. Estenecesar sa se studieze aceste fenomene pentru înt,elegerea completa a formariiimaginilor.




4.3.1 Interferent,a

Interferent,a este un fenomen specific undelor care consta în suprapunereaa 2 sau mai multe unde într-o regiune din spat,iul în care se propaga. Acestfenomen determina valoare intensitat,ii luminoase în acel punct dar cea mai

interesanta manifestare se obt,ine în cazul în care undele care se compun auaceeas, i frecvent,a (lungime de unda) (unde monocromatice) s, i sunt coerente(adica este o diferent,a de faza constanta între ele). Fenomenul de interferent,a în acest caz este numit interferent,a stat,ionara. În acest ultim caz într-un punctdin spat,iu se poate obt,ine prin interferent,a stat,ionara o intensitate luminoasamai mare sau chiar se poate obt,ine o valoare minima (la limita zero). În

Figura 4.6: Interferent,a undelor stat,ionare

figura 4.6 sunt ilustrate doua cazuri de interferent,a limita a 2 unde stat,ionare A s, i B între care exista o diferent,a de faza ce duce la cres, terea intensitat,ii

(interferent,a constructiva) sau la scaderea intensitat,ii (interferent,a destructiva).Pentru a ne asigura ca radiat,iile care interfera au o diferent,a de faza constanta între ele se utilizeaza de obicei o metoda de împart,ire a fasciculului de lumina în doua unde care parcurg drumuri optice diferite (altfel spus ele provin din

aceeas, i sursa init,iala dar parcurg drumuri optice diferite). Se obt,in astfeldispozitive numite interferometre.

Figura 4.7: Interferent,a în dispozitivul Young.

Un astfel de dispozitiv este s, i dispozitivul lui Young care consta în plasarea în fat,a unui fascicul de unde cuasiparalel a unui material opac în care s-au practicat doua fante dreptunghiulare paralele (v. Figura 4.7) Fiecare dinfantele respective pot fi considerate a fi noi surse de unde luminoase iar înspat,iul de dupa ele se va forma as, a numita figura de interferent,a care poate fi

descrisa ca zone luminoase (cu interferent,a constructiva) alternând cu zone întunecate (cu interferent,a destructiva). Practic în loc sa obt,inem doar doua

imagini luminoase (corespunzatoare celor 2 fante) se obt,in mai multe astfel deimagini (numarul lor depinde de cât de coerenta s, i monocromatica este radiat,iaincidenta dar s, i de dimensiunea fantelor fiind cu atât mai multe cu cât fantelesunt mai mici) ca s, i cum lumina „are direct,ii preferent,iale de propagare”.Concomitent cu fenomenul de interferent,a apare aici s, i fenomenul de difract,ie.

4.3.2 Difract,ia luminii

Difract,ia este un alt fenomen caracteristic undelor (s, i în particular undelor

luminoase) care consta în „ocolirea” aparenta a marginilor obstacolelor opace întâlnite de aceste unde. Altfel spus obiectele opace nu au o umbra net definita




ci apare s, i o zona luminoasa în imediata vecinatate a umbrei care este cu atâtmai us, or de observat cu cât dimensiunile obiectelor care produc difract,ia suntmai mici (de ordinul lungimii de unda). Fenomenul de difract,ie este studiat înspecial în cazul obiectelor de tip fante dreptunghiulare sau circulare. Pentruca în microscopie se utilizeaza fante circulare vom studia în cele ce urmeazadoar difract,ia prin fanta circulara.

Vom considera ca lumina provenita de la o sursa punctuala trece printr-odiafragma circulara (diafragma poate fi un ochi sau un obiectiv). Imagineaobt,inuta în urma difract,iei consta într-un cu intensitate luminoasa foarte marecentrat pe imaginea diafragmei circulare înconjurat de cercuri concentriceluminoase mult mai put,in intense (v.!Figura 4.8).

Figura 4.8: Difract,ia printr-o diafragma circulara.

Profilul 3D de distribut,ie a intensitat,ii luminoase se numes, te Discul luiAiry (sau „point spread function”, PSF – funct,ia de împras, tiere a unui punct).Dimensiunea discurilor Airy determina dimensiunea punctelor fizice de peimaginile formate într-un sistem optic (în particular printr-un microscop).

Aceasta marime determina rezolut,ia optica a sistemului optic.

4.3.3 Rezolut,ia

Cum rezolut,ia optica este capacitatea unui sistem optic de a distinge 2puncte luminoase ca fiind separate atunci cu cât discurile Airy a dou a puncteluminoase învecinate sunt mai mici cu atât rezolut,ia spat,iala este mai buna.Daca discurile Airy sunt mari cele doua puncte luminoase nu se vad separat în timp ce daca discurile Airy sunt mici cele doua puncte luminoase se vadseparat (v. Figura 4.9).

Figura 4.9: Legatura dintre discul Airy s, i

rezolut,ia optica.

Cres, terea rezolut,iei unui sistem optic este legata direct de modul în carereus, im sa obt,inem un disc Airy mai mic. Acest lucru se poate face prin utili-zarea unui obiectiv cu apertura numerica mare sau cu marire mare. Aperturanumerica este legata de modul în care se poate face focalizarea radiat,iei opticeprintr-un sistem convergent (v. Figura 4.10).

A = 2

Conul de lumină

Figura 4.10: Apertura numerica a unuiobiectiv.

NA = n sin α(4.2)

unde NA=apertura numerica (din engl. Numerical Aperture) n indicele derefract,ie a mediului prin care se propaga radiat,ia s, i α este jumatatea unghiului




de deschidere data de focalizarea radiat,iei la nivelul obiectivului. Gasim

Figura 4.11: Legatura dintre dis-cul Airy s, i apertura numerica.

as, adar s, i o legatura între rezolut,ia optica, discul Airy s, i Apertura numerica(v. Figura 4.11): NA=mica, discuri Airy mari s, i implicit rezolut,ie optica micaiar pentru NA=mare discurile Airy sunt mici s, i rezolut,ia optica mare.

O alta marime care intervine în caracterizarea imaginilor prin instrumenteoptice este s, i rezolut,ia spat,iala. Aceasta marime este determinata de criteriullui Rayleigh: „doua puncte luminoase se considera distincte daca:

• Discul Airy a primului punct luminos se suprapune peste primul ordin dedifract,ie al celui de al doilea punct luminos (determinat de primul cercluminos al discului Airy);

• Cele 2 puncte luminoase se considera la o distant,a d egala cu raza discului

Airy.”

Criteriul (limita) Rayleigh este utilizat pentru a defini cel mai bine puterea derezolut,ie (sau puterea separatoare) a unui obiectiv.

Definit,ie 4.1. Puterea de separare (de rezolut,ie) caracterizeaza capacitateaunui instrument optic sau a unui material fotosensibil de a forma imaginidistincte s, i clare pentru 2 puncte foarte apropiate ale obiectului.

Puterea de rezolut,ie a unui obiectiv este strâns legata de sistemul formatdin obiectiv s, i condensor (prin care este focalizata lumina pe obiectiv). Celedoua elemente din microscop sunt caracterizate fiecare de apertura numerica

notate NAobiectiv respectiv NA condensor. Se disting as, adar 2 cazuri:• NAcondensor > NAobiectiv de unde se calculeaza distant,a minima în

mum:

d = 0, 61λ

NAobiectiv(4.3)

cu 0,61 un factor ce depinde de geometria de cercuri.

• iar pentru NAcondensor ≤ N Aobiectiv

d = 1, 22λ

NAobiectiv + NA condensor(4.4)

Formulele de mai sus se utilizeaza pentru calculul distant,ei separatorii d cedetermina puterea de rezolut,ie a sistemului optic (v. Figura 4.12).




Figura 4.12: Determinarea rezolut,ieispat,iale optime pentru sistemul op-

tic format din obiectiv s, i condensor.

OKPrea aproape!

4.3.4 Contrast/culoare

Contrastul este numarul de nuanţe gasite într-o imagine. O imagine cucontrast ridicat va avea doar doua nuanţe, negru s, i alb. Mai multe nuant,e,contrast mai puţin, dar mai multe informaţii. Culoarea este, de asemenea,considerata o forma de contrast (v. Figura 4.13).

Imaginile formate în diferite tipuri de microscoape pot releva diverseamanunte (sau elimina artefacte) daca se pot obt,ine contraste diferite. Seutilizeaza mai multe metode de marire a contrastului:

• Iluminare în câmp luminos (Bright Field)

• Iluminare în câmp întunecat (Dark Field)

• Intensificarea culorilor

• Folosirea filtrelor

• Microscopie în lumina polarizata

• Contrast de faza

• Contrast interferent,ial• Microscopie de fluorescent,a

• Iluminare oblica

• Prin modificarea temperaturii probei

• Microscopie optica de baleiaj ce folosesc lasere

O parte din aceste metode vor fi descrie în cele ce urmeaz a.Iluminare în câmp luminos se obt,ine o imagine întunecata pe un fond luminoscontrastul în es, antion fiind cauzat de diferent,a de absorbant, a a componentelor

luminii transmisa prin zonele de densitat,i optice diferite ale probei. Caracte-ristici:




Contrast datorat absorbţiei luminii

Contrast datorat difracției luminii(contrast de fază)

Contrast datorat interferenței luminii(contrast interferențial)

Figura 4.13: Contrastul/culoarea.

câmp luminos lumină polarizată câmp întunecat contrast de fază Figura 4.14: Compararea tehnicilor deiluminare prin transmisie utilizate pentru agenera contrast într-un es, antion de hârtie.

• iluminarea probei este prin transmisie (proba este iluminata de jos s, i obser-vata de sus sau invers în cazul microscopului optic inversat);

• are mai multe lentile obiectiv;

• sistem optic (microscop) parfocal – ramâne aproximativ focalizat atuncicând este schimbata marirea (când obiectivele sunt schimbate între ele);

• marirea totala este produsul de mariri a lentilelor ocular s, i lentilelor obiec-tiv.

Avantajul metodei: nu necesita componente suplimentare, fat,a de configurarea

unui microscop optic obis, nuit! Microscopia în câmp luminos este o tehnicastandard de microscopie optica s, i prin urmare marirea este limitata de putereade rezolut,ie posibila, dependentadelungimeadeunda a componentelor luminiivizibile. Cu cît lungime de unda este mai mica cu atât rezoluţia este mai mare!Contrast scazut în cazul probelor care au aceeas, i absorbant,a pentru toatecomponentele radiat,iei de iluminare.

Pentruacres, tecontrastulîncazulcâmpuluiluminossîncearcaîmbunatat,ireaimaginii prin:

• Mics, orarea/marirea intensitat,ii luminii, prin intermediul diafragmei iris.

• Observarea probelor folosind tehnica „în imersie”, folosind obiective deimersie în apa sau ulei s, i respectiv apa/uleiuri de imersie adecvate cupretent,iile analizei. Daca uleiul de imersie are indicele de refract,ie egal cucel al lamelei ce acopera proba se va îmbunatat,i rezoluţia!

• Utilizarea de metode de colorare a probelor;

• Utilizarea filtrelor de culoare (de obicei albastru);

• Utilizarea filtrelor de polarizare a luminii pentru a evidenţia caracteristicicare nu sunt vizibile în lumina alba.

Iluminarea în câmp întunecat se realizeaza realizat prin iluminarea probei cu

raze de lumina care nu vor fi colectate de lentila obiectiv s, i prin urmare nu vorface parte din imagine. Are aspectul clasic al unui întuneric – fundal aproape




negru, cu obiecte luminoase. Un disc special blocheaza razele, provenite de lasursa de iluminare pe direct,ia axei optice a microscopului, permit,ând trecerealuminii numai printr-un inel exterior. Lentila condensor concentreaza luminaspre proba. Lumina intra în eșantion, cele mai multe raze sunt transmisedirect, în timp ce unele sunt împras, tiate de eșantion. Lumina împras, tiata(difuza) intra în lentila obiectiv, în timp ce lumina transmisa direct nu estecolectata. Numai lumina difuza (undele difractate de ordinul întâi s, i cele deordin superior) participa la formarea imaginii, în timp ce lumina transmisadirect (undele difractate de ordinul zero) lipsesc.

Figura 4.15: Comparat,ie iluminare în câmp întunecat s, i în câmp luminos.

Pentru a se asigura ca razele care provin de la condensor cad cît mai oblicposibil pe proba, trebuie sa se ridice condensorul cât mai sus sub proba s, idiafragma obiectiv sa fie deschisa la capacitate maxima. Astfel se lucreaza înimersie cu apa sau ulei între condensor s, i lamela de sticla ce acopera proba.Datorita refract,iei, la trecerea din lamela razele de lumina vor fi deviate launghiuri mai mari decât cele de incident,a, daca lamela are indicele de refract,ie

mai mare decât cel al apei/uleiului. Apa este folosita pentru mai mult confortiar imersia în ulei este folosita pentru o rezolut,ie mai buna.Microscopia în camp întunecat este cea mai potrivita pentru contururi

revelatoare s, i margini (limitate de obiecte). Este mai puţin utila pentru detaliirevelatoare interne din celule, cu excepţia cazului în care exista o mult,imede organite foarte refractile într-un citosol relativ transparent. Cu cât razele

de lumina cad mai oblic pe proba cu atât este mai us, or detectarea prezent,eiobiectelor foarte mici.

câmp luminos câmp întunecat

Figura 4.16: Detalii obt,inute în câmp întunecat.










Glosar

Analizor, 29Apertura

numerica, 35Aproximat,ia

paraxiala, 15

Birefringent,a, 30

Câmp întunecat, 38luminos, 37

Contrast, 37definit,ie, 11

Convergent,a, 19Criteriul

Rayleigh, 36

Difract,ia

luminii, 34Dioptru, 14Discul Airy, 35Distant,a

focala, 15Drum

optic, 13

Fasciculde lumina, 12

Filtruselectiv, 32

Focarimagine, 15, 18obiect, 15, 18

Formareaimaginilor, 33

Grosisment, 19microscop, 21

Indicede refract,ie, 13

Interferent,aconstructiva, 34destructiva, 34

Interferent,a, 34

intervaloptic, 21

Legeaabsorbt,iei, 32Lambert-Beer, 32

Lentileconcave, 15convexe, 15definit,ie, 15

Lungimede unda, 13

Lupa, 20

Mârireliniara, 19

Marireliniara, 18

Microscopdrept, 27electronic, 8inversat, 28optic, 8, 20stereoscopic, 28

Microscopiedefinit,ie, 8

Microscopulcu lumina polarizata, 28de comparat,ie, 28

Ochiemetrop, 19

Opticageometrica, 11

Polarizor, 29Punct

proxim, 19

Putereoptica, 19separatoare, 19separatorie liniara, 19separatorie unghiulara, 19

Putereade rezolut,ie, 36lupei, 20microscop, 21

Razade lumina, 12

Reflexia, 31, 33luminii, 14Refract,ia, 31, 33

luminii, 14Rezolut,ia

spat,iala, 36

Spat,iulimagine, 11obiect, 11

Stigmatism, 17

TeoriaAbbe, 33

Undecoerente, 34

Vitezaluminii, 13

Date post:	17-Feb-2018
Category:	Documents
Upload:	marius-cenua
View:	252 times
Download:	0 times

Curst Tehnici microscopice

Documents