Conf. Univ. Dr. Marian PETRE

METODE I TEHNICI MODERNE DE INVESTIGARE

MICROBIOLOGIC A APEI

CURS DE FORMARE PROFESIONAL

2012

2

CUPRINS PREFA SCURT INTRODUCERE Capitolul I

REGULI DE BAZ PENTRU FUNCIONAREA UNUI LABORATOR DE

ANALIZE MICROBIOLOGICE

1.1. Organizarea laboratorului de analize microbiologice

1.2. Procedurile de lucru

1.3. Instalatiile, echipamentul, instrumentarul, consumabilele, reactivii,

materialele de referinta

1.4. Executarea analizelor microbiologice de laborator

1.5. Raportarea rezultatelor

Capitolul II

REGLEMENTAREA ACTIVITILOR PRACTICE,

SPECIFICE LABORATORULUI DE ANALIZE MICROBIOLOGICE

2.1. Reguli generale privind desfurarea corespunztoare a

activitilor practice n Laboratorul de Analize Microbiologice

2.2. Msuri destinate asigurrii proteciei personalului de lucru

Capitolul III

PROGRAMA ANALITIC A SUPORTULUI DE CURS - TEMA 4:

METODE I TEHNICI MODERNE DE INVESTIGARE MICROBIOLOGIC A

APEI

3.1. Corelare competene coninuturi

3.2. Sugestii metodologice

3.3. Fia de observare

3

Capitolul IV

TEHNICI DE STERILIZARE A USTENSILELOR I A MATERIALELOR

CONSUMABILE N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

4.1. Procedee de sterilizare a ustensilelor i mediilor nutritive de cultivare a

microorganismelor

4.2. Pregtirea i sterilizarea sticlriei n laboratorul de analize microbiologice

Capitolul V

PREPARAREA I STERILIZAREA MEDIILOR NUTRITIVE DE CULTIVARE A

MICROORGANISMELOR

5.1. Prepararea i sterilizarea mediilor nutritive de cultivare

5.2. Prepararea mediilor nutritive pentru cultivarea bacteriilor, drojdiilor i

mucegaiurilor

Capitolul VI

INOCULAREA I INCUBAREA PROBELOR MICROBIOLOGICE

6.1. Estimarea densitii populaiilor microbene

6.1.1. Tehnica obinerii diluiilor decimale

6.2. Inocularea culturilor microbiene

6.2.1. Inocularea n eprubete (tuburi)

6.2.1.1. Inocularea cu ansa

6.2.1.2. Inocularea cu pipeta Pasteur sau cu pipeta gradat

6.2.2. Inocularea n plci Petri

6.3. Incubarea probelor microbiologice

Capitolul VII

STUDIUL CARACTERELOR MORFOLOGICE I FIZIOLOGICE ALE

COLONIILOR MICROBIENE

7.1. Caractere morfologice ale bacteriilor

4

7.2. Caractere morfologice ale drojdiilor

7.3. Caractere morfologice ale mucegaiurilor

7.4. Determinarea vitezei de cretere a coloniilor de mucegai

7.5. Estimarea densitii populaiilor microbiene cu ajutorul camerei Thoma

7.6. Estimarea numrului de celule microbiene prin metoda culturilor

7.7. Determinarea calitii microbiene a apei

7.7.1. Determinarea numrului total de microorganisme

7.7.2. Determinarea bacteriilor coliforme

Capitolul VIII

EXAMENUL MICROSCOPIC AL MICROORGANISMELOR

8.1. Examenul preparatelor n stare proaspt

8.1.1. Studiul microscopic al culturilor de drojdii

8.1.2. Studiul microscopic al culturilor de mucegaiuri

8.1.3. Evidenierea microscopic a bacteriilor

8.2. Examenul preparatelor n stare uscat

8.2.1. Tehnica de efectuare a preparatelor n stare uscat. Coloraia Gram

8.3. Determinarea dimensiunilor celulare cu scala micrometric

Capitolul IX

MICROORGANISME PATOGENE TRANSMISIBILE PRIN AP

9.1. Microorganismele definiie i caracteristici principale

9.2. Specii bacteriene patogene, transmisibile prin ap

9.3. Specii fungice patogene, transmisibile prin ap

9.4. Specii de protozoare patogene, transmisibile prin ap

9.5. Bioindicatori pentru determinarea gradului de contaminare bacterian a

apelor

5

Capitolul X

TEHNICI DE ANALIZ MOLECULAR UTILIZATE PENTRU INVESTIGAREA

MICROBIOLOGIC A CALITII APEI

10.1. Metode moderne de identificare chemotaxonomic a speciilor bacteriene

i fungice

10.1.1. Analiza compoziiei acizilor grai - metod de identificare

chemotaxonomic a bacteriilor i fungilor

10.1.2. Metode de analiz a metaboliilor secundari

10.2. Caracterizarea chemotaxonomic a bacteriilor i fungilor filamentoi, prin

extracie de ADN celular i evideniere electroforetic n gel de agaroz

10.2.1. Metoda extraciei de ADN bacterian

10.2.1.1. Fragmentarea peretelui celular i eliberarea coninutului celular

10.2.1.2. Prepararea extractului brut de ADN

10.2.1.3. Purificarea extractului de ADN

10.2.2. Metoda extraciei de ADN fungic

10.2.3. Metoda reaciei n lan a polimerazei (Polymerase Chain Reaction)

BIBLIOGRAFIE SELECTIV

6

SCURT INTRODUCERE

Apa reprezint una dintre componentele chimice indispensabile pentru

existena vieii pe Terra. Proporia de ap din organismul uman variaz dup

vrst: de la peste 97 % la embrionul de 7 zile, scznd treptat la 80 % la nou-

nscut, 60-65 % la adult i 50-55 % la vrstnic.

Totodat, procentul de ap variaz dup intensitatea proceselor

metabolice. Acest fapt se reflect i n proporia diferit a apei n esuturi: smal

dentar 0,2 %, dentin 10 %, esut osos 22 %, esut adipos 20 %, esut

cartilaginos 55 %, muchi striat 75 %, ficat 75 %, rinichi 80 %, creier (substan

cenuie) 85 %, plasm sangvin 90%.

Femeile avnd o proporie mai ridicat de esut adipos (relativ srac n

ap), procentul de ap din organism depinde de sex: n medie 52 % la femei i

63 % la brbai. La obezi, procentul de ap poate scdea astfel pn la 40 %.

n organismul uman, apa total (60% din greutatea corporal) se

repartizeaz n mai multe compartimente: Apa intracelular (40 %) i apa

extracelular (20 %), aceasta la rndul ei reprezentat de apa circulant =

intravascular (4- 4,5 %), apa interstiial (15 % - majoritatea legat n geluri) i

apa transcelular (1%).

Rolurile apei n organism sunt multiple, cele mai importante fiind:

- rolul structural, ca i principal component al organismului;

- rolul de mediu de reacie pentru i intervenia n toate procesele

metabolice; - contribuia la meninerea homeostaziei (fiind esenial pentru

variate procese, ca absorbia, transportul, difuzia, osmoza, excreia etc.);

- rol n metabolismul macronutrienilor (din a cror degradare rezult ap);

7

- surs de Ca, Mg, Na, K i alte substane utile pentru organism, dar

uneori i de elemente nedorite (toxice, ageni patogeni etc.).

Dinamica apei n corpul uman i bilanul hidric al organismului au fost

ndelung studiate n fiziologie i sunt astzi binecunoscute, avnd largi aplicaii

medicale. Deshidratarea respectiv hiperhidratarea, cu numeroasele variante

fiziopatologice, sunt ntlnite n cadrul multor afeciuni i pun serioase probleme

de diagnostic i tratament.

Un om are nevoie n medie de circa 100 de litri de ap pe zi: 4 litri pentru

nevoia fundamental, alimentar (2,5 litri pentru but i 1,5 litri prepararea

hranei), 13 litri pentru splat vesela, 13 litri pentru splat rufe, 70 de litri pentru

nevoi sanitare (splat pe mini i fa, du, apa pentru cltirea toaletei etc.).

Variabilitatea este desigur foarte mare, n funcie de disponibilitatea i

preul apei, de obiceiuri etc. Unde nu exist ap curent i consumul casnic e

mai mic, iar unde trebuie crat de la mari distane sau e foarte scump se face

economie.

Sunt i situaii, chiar ri ntregi, unde consumul este sub minimul

acceptabil i duce la consecine negative asupra igienei i sntii publice. A

face baie n van n loc de du duce automat la un consum mult mai mare de

ap, la fel i utilizarea frecvent de maini se splat haine, vesel etc. sau dac

aceste au eficien redus din punct de vedere al consumului de ap.

Pe primul plan al aciunii apei asupra sntii omului st patologia hidric

infecioas. Ea este astzi un concept firesc, dar a fost acceptat public trziu i

nu uor. Prima demonstraie oficial i practic a relaiei ap - epidemii a fcut-o

dr. John Snow la Londra n 1854, probnd corelaia dintre epidemia de holer

consumul apei din fntna de pe Broad Street i o latrin din vecintate, folosit

de bolnavi de holer, determinnd oficialitile s realizeze primele canalizri.

Patologia hidric infecioas a sczut semnificativ n prima parte a

secolului XX, dar n ultimele decenii este statistic n cretere, acest fapt

datorndu-se includerii n categoria celor transmise hidric a unor boli virale i

8

parazitare, care stau tot mai mult n atenia specialitilor. Bolile cu transmitere

hidric continu s fac n lume zilnic peste 25.000 de victime.

O statistic american pe 60 de ani (1920-1980) indic 1405 epidemii

hidrice, din care 5 cu peste 10.000 cazuri, 5 ntre 5-10.000 cazuri, 9 ntre 3.5000

cazuri, 31 ntre 1-3000 cazuri, 39 ntre 500-1000 cazuri, 44 cu 300-500 cazuri,

restul cu sub 300 de cazuri / epidemie. Din aceste 1405 epidemii, 603 au

survenit n sisteme comunitare, 500 n sisteme non-comunitare i 302 n sisteme

individuale. Spectrul de boli a cuprins zeci de afeciuni diferite. Germania a

nregistrat multe epidemii hidrice, unele de mare amploare cum este cea din

1882 de la Hamburg care a provocat decesul a 8500 de persoane.

n Romnia au fost nregistrate oficial n perioada 1985 - 1995 un numr

de 75 de episoade de epidemii hidrice, cu un total de 10238 persoane afectate.

Maximul s-a nregistrat n 1993. Se estimeaz ns c aceste date sunt mult

subevaluate fa de situaia real, din cauza raportrii deficitare.

Principala cale de transmitere a agenilor patogeni este cea prin ingestie

(direct, sau a alimentelor contaminate prin ap), dar este posibil infectarea i

prin splare i mbiere (leptospiroz, schistostomiaz, tularemie) i prin inhalare

(aerosoli cu Legionella). Principalele afeciuni determinate de transmiterea

(predominant sau posibil) hidric a agenilor patogeni sunt cele microbiene, virale

i parazitare.

Dac anumite afeciuni sunt specifice zonelor tropicale, iar altele au fost

cvasieradicate n Romnia, multe dintre aceste maladii au nc o frecven

ridicat n ara noastr. La nivel mondial, boala diareic este a doua cauz de

deces dup bolile cardiovasculare, iar studii n ri dezvoltate arat c incidena

bolilor diareice este puternic subestimat, ele fiind, contrar prerii generale, mai

frecvente la vrstnici dect la copii, iar efectele socio-economice foarte

importante. Un studiu pe 10 ani n Cleveland (SUA) indic boala diareic de

etiologie viral ca a doua cauz de boal dup rinofaringit.

Mari diferene n patologia hidric vid din diverse cauze, din care unele

legate de agentul patogen. Unii ageni patogeni triesc doar n anumit climat (de

9

regul tropical), alii au nevoie pentru ciclul lor biologic de anumite insecte sau

alte organisme vii ca s se nmuleasc. Acelai tip de surs de infecie face s

ajung n ap cantiti diferite de infectant.

Astfel, n cazul impurificrii fecaloide, ntr-un gram de fecale exist specii

bacteriene, cum sunt: Escherichia coli i Salmonella typhi (de ordinul miliardelor

de celule), Entamoeba histolitica, Vibrio cholerae, Giardia intestinalis (de ordinul

milioanelor de celule), Enterovirusuri (de ordinul sutelor de milioane de entiti

virale), precum i ou de Tenia solium i Ascaris lumbricolides (de ordinul zecilor

de mii) etc.

Timpul de supravieuire n ap a agentului patogen difer mult, n funcie

de particularitile intrinseci ale acestuia, precum i de factorii de mediu extern.

De aceea, unele ape contaminate masiv nu produc epidemii, deoarece

prin diluie scade doza care ajunge n organismul uman sau animal, iar agenii

patogeni liberi n ap, de regul, mor repede.

Astfel, supravieuirea n ap este n medie de 3 luni la enterovirusuri i

Escherichia coli, 2 luni la Salmonella typhi, 1 lun la Shigella sp. i Vibrio

cholerae, 25 de zile la Entamoeba histolitica, precum i Giardia intestinalis.

Doza infectant difer enorm de la un anumit tip de agent patogen la altul.

Astfel, pentru a se mbolnvi, statistic un om trebuie s ingere n medie (doza

infectant 50%) miliarde de Escherichia coli, sute de milioane de vibrioni holerici,

zeci de milioane de bacteriii din specia Salmonella typhi, zeci de mii de bacterii

ale speciei Shigella sp., dar numai cteva sute de enterovirusuri, cteva zeci de

celule de Entamoeba hstolitica sau Giardia intestinalis, civa ascarizi sau

leptospire.

n mod evident, doza depinde preponderent de organismul tip gazd, de

vrsta acestuia, precum i de starea sa de sntate etc.

Evoluiile recente sunt foarte ngrijortoare. Succesele obinute n prima

parte a secolului n combaterea bolilor infecioase cu transmitere hidric a dus la

o reducere a ateniei i fondurilor alocate n acest sector, iar autoritile sunt

10

adesea ignorante. 2 milioane de copii mor anual prin boli diareice transmise

hidric, iar numrul anual de astfel de mbolnviri se estimeaz la 900.000.000.

Astfel, n rile n curs de dezvoltare, se nregistreaz anual amibiaze (400

milioane infectai, 30.000 mori), poliomielit (80 milioane infectai, 10.000 mori),

febr tifoid (1 milion infectai, 25.000 mori), ascaridoz (1 miliard infectai,

20.000 mori), schistostomiaz (200 milioane infectai, 500.000 - 1.000.000

mori), trepanosomiaz (1 milion infectai, 5.000 mori), malarie (800 milioane

infectai, 1.200.000 mori) etc.

Calitatea microbiologic a apei este n scdere n majoritatea rilor, iar

germenii sunt tot mai rezisteni la dezinfectante. Scderea imunitii populaiei, n

principal prin mbuntirea general a igienei, a produs o cretere a

susceptibilitii la boli hidrice. Se preconizeaz c securitatea microbiologic a

apei va fi o mare problem a secolului viitor.

Analiza microbiologic const n aplicarea metodelor i tehnicilor

corespunztoare de analiz pentru observarea, izolarea, identificarea i

cuantificarea specific a microorganismelor existente n probele examinate, n

scopul stabilirii prezenei sau absenei microorganismelor nocive pentru

sntatea consumatorului sau pentru conservarea calitii alimentare a

produselor examinate.

n acest context, analiza microbiologic a probelor de ap reprezint un

capitol distinct din punct de vedere al impactului calitii surselor de ap asupra

consumatorilor. Astfel, metodele i tehnicile actuale de investigare microbiologic

se bazeaz pe principiile examinrii rapide i ct mai eficiente a probelor de

analiz, n vederea decelrii, identificrii i cunatificrii prezenei

microorganismelor patogene sau potenial patogene n produsele analizate.

11

Capitolul I

REGULI DE BAZ PENTRU FUNCIONAREA UNUI

LABORATOR DE ANALIZE MICROBIOLOGICE

1.1. Organizarea laboratorului de analize microbiologice

Orice laborator care realizeaza analize microbiologice trebuie sa aiba un

sistem de asigurare a calitatii bazat pe documente scrise (proceduri de operare

standard pentru fiecare etapa a analizei microbiologice efactuate ca si conditiile

de executie (instructiuni de lucru). Calitatea unei analize microbiologice depinde

nu numai de calitatea analizei n sine ci si de organizarea generala a

laboratorului, calificarea si motivarea personalului.

Organizarea i managementul laboratorului

Laboratorul trebuie sa aiba o identitate bine stabilita n cadrul organizatiei din

care face parte sau sa aiba personalitate juridica. Organizarea si functionarea

laboratorului trebuie sa ndeplineasca criteriile prevatute n prezentul document,

att pentru sediul permanent, ct si pentru punctele de lucru sau facilitatile de

analiza pe teren.

Laboratorul va avea:

a) personal de conducere cu autoritatea si competenta necesare ndeplinirii

sarcinilor de serviciu;

b) dovezi ca personalul de laborator nu este supus nici unei presiuni de ordin

financiar sau comercial care ar putea influenta negativ calitatea muncii sale;

12

c) acolo unde este cazul sunt nominalizati manageri adjuncti pentru a suplini

personalul de conducere cnd acesta lipseste din laborator;

d) participa la exercitii de inter-comparare ntre laboratoarele de profil.

Sistemul calitii

Documentatia sistemului calitatii dintr-un laborator trebuie sa contina

procedurile operationale stabilite pentru ndeplinirea criteriilor prezentei proceduri

si urmatoarele documente aditionale:

a) lista personalului de laborator cu semnatura autorizata;

b) procedura laboratorului pentru realizarea trasabilitatii masurarii;

c) unde este cazul o procedura care stabileste cum se documenteaza si se

urmaresc toate modificarile introduse n activitatea de analiza curenta;

d) descrierea metodelor de analiza utilizate;

e) procedurile de prelevare si manipulare a probelor;

f) procedurile pentru echipamentele majore si materialele de referinta utilizate;

g) procedura pentru actiuni corective

h) procedura pentru reclamatii

i) procedura pentru pastrarea confidentialitatii si proprietatii intelectuale, daca

este cazul.

Atunci cnd este nevoie de implementarea unor actiuni corective, acestea

trebuie documentate. Responsabilul cu asigurarea calitatii va supraveghea

punerea n aplicare a acestor masuri, cu respectarea calendarului stabilit.

Laboratorul va asigura calitatea rezultatelor furnizate clientilor prin

implementarea unor controale periodice. Procedura de control face obiectul

reviziilor periodice si va include cel putin urmatoarele aspecte:

a) participarea la exercitii de inter-comparare si teste de capabilitate;

b) utilizarea cu regularitate a materialelor de referinta si/sau materialelor cu

caracteristici cunoscute preparate n laborator, ca parte a controlului de calitate

al laboratorului;

c) repetarea analizelor pe probele conservate (contra probe), unde este cazul.

13

Organizarea unui sistem de calitate n laborator este responsabilitatea

unui responsabil cu asigurarea calitatii numit de director sau de seful de

laborator si priveste mai multe aspecte:

Personalul - stabilirea unei organigrame a laboratorului.

- stabilirea fiselor de post (se asigura ca personalul sa corespunde din punct de

vedere al numarului, educatiei, instruirilor periodice, cunostintelor tehnice si

experientei, pentru functiile pe care le ocupa si domeniul de activitate declarat) -

asigura formatia personalului pentru o anumita sarcina si instruirea permanenta a

personalului.

- Pune la dispozitia personalului procedurile de operare si instructiunile de lucru

cuprinse n ghidurile de specialitate.

- Informeaza personalul cu privire la orice decizie sau introducere de noi POS-

uri sau IL-uri

- Laboratorul trebuie sa mentina nregistrari relevante despre calificarea,

instruirea, aptitudinile, experienta si competenta personalului

- - normele de protectia muncii sunt cunoscute, respectate si aplicate.

Obligatiile biologului din laborator

- validarea analizelor (tehnica si biologica)

- semnarea buletinelor

- transmiterea lor fara ntrziere

Obligatiile personalului

- trebuie sa se conformeze la toate procedurile si instructiunile de lucru n vigoare

din laborator

14

Spatiul si conditiile de lucru

Cladirea laboratorului, spatiile de testare, sursele de energie, iluminatul,

sistemul de ncalzire si ventilatia, trebuie sa asigure coditiile optime de realizare

a analizelor.

Conditiile de mediu n spatiile n care se desfasoara analizele trebuie sa nu

conduca la invalidarea rezultatelor sau sa influenteze negativ acuratetea si

precizia masurarii. Trebuie acordata o atentie deosebita acestor aspecte atunci

cnd analizele se desfasoara n alte locuri dect spatiile permanente ale

laboratorului. Se va asigura o separare efectiva a spatiilor nvecinate n care se

desfasoara activitati incompatibile.

Accesul si utilizarea spatiilor destinate analizelor vor fi definite si controlate.

Se vor asigura curatenia si buna gospodarire a laboratorului

1.2. Procedurile de lucru

- se asigura ca procedurile n vigoare, scrise, verificate, aprobate, datate

sunt respectate de catre personal;

- se asigura revizuirile procedurilor sunt notate, aprobate, nregistrate,

datate si communicate ntregului personal al laboratorului;

- ntocmirea unei fise cronologice a tuturor operatiunilor (flux de lucru)

care sa permita supravegherea respectarii instructiunilor de lucru;

- n cazul n care se semnalizeaza o eroare de functionare sau de

executare are initiativa de nlocuirii acesteia si nregistreaza modurile de

corectare ntrepinse;

- asigura gestionarea adecvata a arhivelor.

1.3. Instalatiile, echipamentul, instrumentarul, consumabilele, reactivii,

materialele de referinta

Laboratorul va fi dotat cu toate echipamentele si materialele de

referinta necesare pentru desfasurarea corecta a analizelor.

15

Echipamentele vo fi mentinute n mod corespunzator, activitatea

fiind documentata de proceduri. Orice echipament defect sau care produce

rezultate suspecte va fi scos din uz, clar marcat si depozitat pe ct posibil ntr-un

spatiu exterior zonei de desfasurare a analizelor, pna cnd va fi reparat si se va

demonstra prin teste de calibrare si verificare ca a atins o performanta

satisfacatoare.

Laboratorul este obligat sa examineze influenta utilizarii acestui

echipament asupra rezultatelor analizelor anterioare.n cazul n care laboratorul

utilizeaza echipamente care nu sunt n proprietatea si/sau controlul sau, va lua

toate masurile necesare pentru a se asigura ca se respecta cerintele prezentului

document.

Consumabilele, rectivii sunt n termen, disponibili, conservati n

conditii bine definite, conform reglemetarilor n vigoare, n concordan cu

evolutia cunoaterii tiinifice i tehnice

Resursele informatice utilizate pentru controlul, verificarea

aparatelor sau pentru interpretarea rezultatelor sunt autorizate si cu versiuni

actualizate.

Trasabilitatea masurarii si calibrarea echipamentelor de lucru

Programul de calibrare/verificare si de validare a echipamentelor va fi

elaborat si pus n aplicare astfel nct sa asigure trasabilitatea la sistemul

national, a masurarilor efectuate de laborator.

Materialele de referinta sau substantele etalon vor fi utilizate de laborator

numai n scopul calibrarii, daca nu se pot prezenta dovezi obiective ca

performanta lor ca materiale de referinta nu se invalideaza prin utilizare n

activitatea curenta.

Materialele de referinta vor fi calibrate de catre un organism care poate

asigura trasabilitatea la sistemul national de masura. Laboratorul va avea un

program de calibrare si verificare a materialelor de referinta.

16

Materialele de referinta vor fi trasabile ori de cte ori este posibil la sistemul

national si international de masuri si greutati, sau la materialele de referinta

certificate, existente la nivel national sau international.

Echipamentele de laborator

Amenajare si ntretinere:

- constructia, localizarea - conform reglementarilor. Amenajarea trebuie sa

permita izolarea activitatilor cu risc de contaminare pentru operator si/sau proba

(evitnd asadar contaminarea la interior sau la exterior).

- Trebuie sa fie prevazute zone de stocare la diferite temperaturi a materiilor

prime, a reactivilor, separate fata de zonele de stocare a probelor. Depozitarea

reactivilor si a materiilor prime toxice sau periculoase se realizeaza separate si

pe ambalajul lor trebuie sa fie vizibile mentiunile: "coroziv", "iritant" sau "toxic",

pastrate si depozitate n conditii de securitate pentru personal si calitatea analizei

probei. Trebuie sa existe proceduri scrise privind modalitatea de ntretinere a

laboratorului.

Securitate:

- respectarea normelor regulamentare pentru evitarea riscului de incendiu si

explozie.

- Instalatiile de distribuire a gazului trebuie sa se conformeze regulamentului si

verificate de personal autorizat

- Substantele inflamabile, periculoase, radioactive trebuie conservate

regulamentar.

Instrumentar:

- carti tehnice

- adecvat pentru toate analizele microbiologice care pot fi efectuate

- actualizat, aprobat

- ntretinut, curatat, verificat periodic (metrologic)

17

Minim necesar de echipamente pentru laboratorul de analize microbiologice:

- centrifuga

- 2 termostate

- dispozitiv de anaerobioza

- hota cu flux laminar

- congelator -800C, tanc azot lichid dupa caz

- microscop optic

- microscop inversat (pentru virologie)

- micrometru optic (pentru parazitologie)

- dispozitiv de colorare a lamelor

Materiale si reactivi

- achizitionate din surse conforme cu normele specifice folosite i conservate

corespunzator, conform modului de utilizare prevazut de furnizor

- reactivii preparati si/sau reconstituiti n laborator trebuie sa poarte data

prepararii si cea a valabilitatii solutiei obtinute.

Toti reactivii expirati trebuie eliminati.

Mijloace informatice

Accesul total sau partial la date trebuie limitat la personalul autorizat. Materialul

informatic trebuie protejat fata de accesul extern al persoanelor neautorizate.

Modificarea programelor sau a informatiilor continute trebuie realizata numai de

persoane autorizate, iar modificarile trebuiesc nregistrate.

Responsabilul laboratorului trebuie sa semneze o conventie cu responsabilul de

mentinere a sistemului informatic care sa prevada ca:

- personalul implicat respecta regulile secretului professional

- sistemul este configurat si protejat pentru asigurarea confidentialitatii

18

- orice modificare se realizeaza de personal calificat, doar la cererea biologului

si face obiectul unui proces verbal detaliat, semnat si nregistrat si postat n

arhiva laboratorului.

Eliminarea deseurilor

-conform legislatiei si reglementarilor n vigoare

-se separa n 2 categorii: - deseuri cu risc

- deseuri asimilabile celor menajere.

Deseurile cu risc sunt separate n 3 grupe:

a) potential contaminate

b) produsi toxici sau chimici

c) produsi radioactivi

Pentru fiecare din cele 3 grupe, trebuie sa existe reguli stricte privind modalitatile

specifice de conditionare, de stocare, de transport, de tratare si pretratare;

eventual contractarea unei societati de profil pentru realizarea acestor procedee.

Deseurile asimilabile celor menajere sunt depozitate n containere care intra n

circuitul de eliminare prin circuitul deseurilor menajere (cu acordul colectivitatii

locale).

1.4. Executarea analizelor microbiologice de laborator

Laboratorul va avea proceduri de utilizare a tuturor echipamentelor

relevante, instructiuni de manipulare si pregatire pre-analitica a probelor si

proceduri de lucru pentru acele metode unde lipsa unor asemenea precizari ar

pune n pericol corectitudinea rezultatelor analizelor; pot fi substituite de

manuale, carti, articole (ex. POS-uri) privind: modul de recoltare al probelor;

identificarea probei, transportul probei, eventualele tratamente prealabile ale

probei, receptia probelor, conservarea probelor nainte si dupa analize, utilizarea

aparaturii, instrumentarului de laborator, IL privind utilizarea reactivilor, POS cu

descrierera metodei de lucru utilizata pentru o anumita analiza, POS privind

19

transmiterea rezultatului, POS privind igiena si securitatea laboratorului, POS

asigurarea calitatii, gestionarea sistemelor informationale eventual existente

Toate instructiunile, standardele de metoda, manualele si literatura de

referinta relevanta pentru domeniul de activitate al laboratorului, vor fi mentinute

la zi si vor fi accesibile personalului de laborator.

Laboratorul va avea un sistem documentat pentru identificarea unica a

probelor de analizat, pentru a preveni orice confuzie legata de identitatea

acestora.

Laboratorul va avea proceduri si facilitati adecvate pentru a preveni

deterioararea probelor n timpul depozitarii, manipularii, pregatirii si analizei. n

situatiile n care probele trebuie depozitate si/sau pregatite n conditii de mediu

speciale, aceste conditii vor fi asigurate, monitorizate si nregistrate. n cazul n

care o proba sau o parte dint-o proba trebuie pastrate pentru repetarea analizelor

(contra-proba), laboratorul va asigura toate conditiile pentru pastrarea integritatii

si securitatii acesteia.

Unde este cazul, laboratorul va avea proceduri pentru receptia si pastrarea n

siguranta a contra-probelor

Laboratorul va utiliza metode de analiza si proceduri de testare adecvate

scopului, inclusiv pentru prelevarea probelor, manipularea, transportul,

depozitarea si pregatirea lor. Performantele metodelor de analiza vor respecta

limita de detectie, precizia si acuratetea recomandate de legislatia n vigoare, n

domeniul apei.

Ori de cte ori este necasara utilizarea unei metode nestandardizate, se va

obtine acordul clientului, iar metoda de analiza va fi documentata, validata si

accesibila clientului sau altor persoane responsabile.

Atunci cnd prelevarea probelor este parte integranta a metodei de analiza,

laboratorul va documenta aceasta situatie printr-o procedura speciala. Unde este

aplicabil, se vor utiliza tehnici statistice pentru esantionare.

20

Atunci cnd se utilizeaza echipamente automate asistate de calculator pentru

prelevarea, pregatirea, manipularea, nregistrarea, raportarea si arhivarea

rezultatelor analizelor, laboratorul se va asigura ca:

a) sunt ndeplinite criteriile prezentului document;

b) soft-ul utilizat este adecvat si documentat;

c) sunt stabilite si implementate proceduri referitoare la protejarea integritatii

datelor; aceste proceduri vor include cel putin securizarea datelor introduse,

procesate, transmise, arhivate;

d) calculatoarele si echipamentele automate vor fi mentinute n stare de

functionarea adecvata prin asigurarea conditiilor de mediu si de operare;

e) se vor stabili si implementa proceduri pentru mentinerea securitatii datelor,

inclusiv prin prevenirea accesului neautorizat.

Unde este cazul vor exista proceduri pentru achizitionarea, receptia si

depozitarea materialelor consumabile utilizate n activitatea de laborator.

nregistrarea rezultatelor

Laboratorul va mentine un sistem de nregistare a rezultatelor adecvat

activitatii sale, n concordanta cu prevederile prezentului document. Laboratorul

va nregistra toate observatiile si calculele originale si o copie dupa buletinele de

analiza pe o perioada considerata adecvata. nregistrarile referitoare la fiecare

analiza vor contine suficiente informatii pentru a permite repetarea lor. Acolo

unde este cazul, nregistrarile conexe ca de exemplu calibrarile, vor fi arhivate pe

o perioada considerata adecvata.

Stocarea si conservarea arhivelor

- rezultatele analizelor realizate trebuie pastrate 5 ani (puse la dispozitia

controalelor externe de calitate)

- procesele verbale privind masurile luate pentru corectarea erorilor evidentiate

n urma CEC - 5 ani

- rezultatele CIC - 3 ani

21

- 1 exemplar de POS-uri, IL-uri si istoria receptiilor - 3 ani

- contractele cu societatile de profil si documentele legate de eliminarea

deseurilor - 3 ani

- documentatia privind reactivii si consumabilele - pe durata utilizarii lor

- documentele referitoare la modificarile programelor informatice.

Arhiva trebuie depozitata ntr-un loc adecvat si care sa asigure confidentialitatea

datelor.

Laboratorul va avea proceduri pentru nregistrarea electronica a datelor. Daca

arhiva este informatica se iau masuri de evitare a pierderii de informatie (copii

multiple pe CD-ROM - cel putin doua una pentru consultari, una pentru pastrare).

Raportarea rezultatelor

Rezultatele fiecarei analize sau serii de analize efectuate de laborator vor

fi raportate cu acuratete, clar, neambiguu si obiectiv, n conformitate cu

instructiunile din metoda de analiza. Rezultatele vor fi raportate sub forma unui

buletin de analiza care va include toate informatiile necesare pentru interpretarea

rezultatelor si toate informatiile cerute de utilizarea metodei de analiza.

Buletinul de analiza se transmite imediat ce rezultatul analizei este gata catre

"client".

Buletinul de analiza va include cel putin urmatoarele informatii:

Titlul, de exemplu "Buletin de analiza";

Denumirea si adresa laboratorului si locul n care a fost efectuata analiza;

Identificarea unica a buletinului de analiza, ca de exemplu un numar si

numerotarea fiecarei pagini, ca parte din numarul total de pagini;

Unde este cazul, numele si adresa clientului;

Descrierea si identificarea neambigua a probelor analizate;

Unde este cazul, caracterizarea probei si conditiile n care aceasta a fost

analizata;

Unde este cazul, data si ora la care proba a fost receptionata si data si ora la

care aceasta a fost analizata;

22

Unde este cazul, specificarea metodei de analiza utilizate si descrierea

neambigua a oricarei alte metode de analiza nestandardizate utilizate;

Unde este cazul, detalii despre procedura de prelevare a probei;

Unde este cazul, se va mentiona orice abatere de la metoda de analiza

standardizata si orice alta informatie relevanta, ca de exemplu conditiile de

mediu;

Masurarile, examinarile si rezultatele derivate, nsotite de tabele, grafice,

schite sau fotografii dupa caz si orice abateri constatate;

Unde este cazul, estimarea incertitudinii n masurare;

Semnatura si functia persoanei responsabile pentru continutul buletinului de

analiza si data eliberarii buletinului;

Unde este relevant, declaratia "rezultatele se refera exclusiv la proba

analizata";

Declaratia "acest buletin de analiza nu va fi reprodus partial, fara acordul scris

al laboratorului".

Cnd buletinul de analiza contine rezultate ale unor analize sub-contractate,

aceste rezultate vor fi clar marcate.

Acolo unde este cazul, se va acorda atentie formei grafice a buletinului de

analiza, astfel nct acesta sa fie usor de citit. Formatul poate fi adaptat fiecarui

tip de analiza, dar antetul se recomanda a fi standardizat.

Unde este cazul, materialele aditionale buletinului de analiza vor fi organizate

ntr-un document separat, intitulat de exemplu "Raport suplimentar la buletinul de

analiza nr..", care va primi un numar de ordine si va respecta prevederile

prezentului capitol.

Atunci cnd este cazul, laboratorul va notifica n scris, cu promptitudine,

clientul, asupra oricarui eveniment care produce dubii asupra validitatii

rezultatelor nscrise n buletinul de analiza.

Unde este cazul, laboratorul va asigura transmiterea rezultatelor catre client,

prin telefon, fax, alte mijloace electronice sau pe suport magnetic, pe baza unei

23

proceduri care respecta prevederile prezentului document si confidentialitatea

datelor.

Raportarea rezultatelor va respecta toate cerintele legislatiei n vigoare

referitoare la calitatea apei potabile.

Laboratorul trebuie sa cuprinda:

- un local de receptie

- un birou de secretariat si arhiva

- sala de prelevare a probelor

- spalatorie

- camera pentru efectuarea analizelor microbiologice

24

Capitolul II

REGLEMENTAREA ACTIVITILOR PRACTICE,

SPECIFICE LABORATORULUI DE ANALIZE MICROBIOLOGICE

2.1. Reguli generale privind desfurarea corespunztoare a activitilor

practice n Laboratorul de Microbiologie

Pentru respectarea tuturor normelor i reglementrilor actuale, referitoare

la efectuarea corespunztoare a activitilor practice cu profil microbiologic, este

absolut necesar ntocmirea unei documentaii tehnico-tiinifice privind

constituirea, amplasarea, precum i organizarea structural i funcional a

Laboratorului de Microbiologie.

Astfel, un asemenea laborator trebuie s cuprind trei compartimente

principale, proiectate i realizate cu scopul de a asigura spaiile de lucru n mediu

aseptic, precum i fluxul tehnologic de efectuare a tuturor activitilor practice

specifice, i anume:

1 - un compartiment de pregtire a instrumentarului de lucru i de

prepararea a mediilor de cultivare;

2 un compartiment de sterilizare a instrumentelor i a mediilor de

cultivare, repartizate anterior n vase de sticl;

25

3 un compartiment de manipulare aseptic a culturilor microbiene

- o sal de pregtire a mediilor i obiectelor de lucru i de decontaminare,

coninnd mese, un autoclav, o etuv, un congelator i un frigider (care va fi

utilizat i pentru pstrarea tulpinilor microbiene). Tot aici se poate stoca sticlria,

mediile de cultur precum i reactivii.

- o sal de lucrri propriu-zise, de manipulare a culturilor microbiene, la

adpost de curenii de aer, dotat cu mese cu suprafa neted, rezistent,

impermeabil, cu conducte de gaz i prize electrice, un sistem de vid i de aer

comprimat i o hot sterilizabil, cu radiaii ultraviolete (eventual o hot cu flux

laminar). n msura n care este posibil, n legtur cu aceast sal, ar trebui s

existe anexe prevzute cu termostate la diferite temperaturi ( 250C, 300C, 370C,

440C, 550C).

Manipulrile de culturi microbiene sau de produse susceptibile s conin

microorganisme se efectueaz innd cont de unele tehnici particulare prin care

s se evite cele dou tipuri de contaminare:

1. contaminarea culturii sau a produsului ce trebuie analizat datorit

personalului sau mediului inconjurtor;

2. contaminarea personalului sau a mediului nconjurtor de ctre

microorganismele studiate.

In laboratorul de microbiologie, operaia de baz este transferul de

microorganisme dintr-un recipient n altul, lucrare ce se execut n zona steril

de protecie din jurul flcrii becului de gaz.

Sticlria cel mai des utilizat n laboratorul de microbiologie const n

eprubete de diferite dimensiuni, flacoane Erlenmeyer, plci Petri, pipete Pasteur

i pipete gradate. n ultima perioad sunt din ce n ce mai mult utilizate

recipientele i pipetele din plastic, de unic folosin. Pentru prelevarea i

inocularea culturilor se utilizeaz ansa sau firul metalic, fabricate din nicrom.

Ustensilele de etalare permit repartizarea uniform a inoculului pe suprafaa

mediilor solidificate i pot fi fabricate prin ndoirea unui tub sau a unei baghete

26

din sticl. n afara acestor ustensile curente de lucru, mai pot fi ntrebuinate o

serie de alte instrumente, n funcie de operaia efectuat.

Laboratorul de microbiologie trebuie s fie dotat cu urmtoarele aparate i

echipamente:

robinet cu ap cald i rece, de preferin acionat cu piciorul;

hot cu flux laminar sau ni sterilizabil, indispensabil lucrrilor de

microbiologie;

bec de gaz tip Bunsen pentru lucrul n zona steril din jurul flcrii cu con

albastru i pentru sterilizarea ansei;

etuv pentru sterilizarea sticlriei;

incubator cu termostat pentru incubarea culturilor microbiene de tip

staionar;

incubator cu termostat i agitator orbital pentru incubarea culturilor

microbiene de tip submersibil;

autoclav pentru sterilizarea mediilor de cultur i pentru decontaminarea

obiectelor;

baie de ap termostatat;

frigidere pentru conservarea mediilor i a culturilor microbiene;

balane;

pH-metru;

microscoape optice i stereo-microscoape;

Pentru evitarea riscurilor de contaminare cu ageni patogeni din culturile

efectuate n laborator, precum i de introducere n incinta laboratorului a unor

microorganisme existente n spaiul exterior acestuia, pe tot parcursul

desfurrii activitilor practice n laborator, fiecare membru al personalului

de lucru este obligat s respecte ntocmai urmtoarele reguli specifice:

1 - Utilizarea echipamentului complet de protecie, compus din:

27

a) combinezon sau halat de protecie asociat cu pantaloni lungi, fiecare

dintre aceste obiecte fiind confecionate dintr-un material textil natural sau

sintetic, care s protezeje corpul uman de interaciunea cu diveri colorani sau

cu diferite substane reactive corozive sau decolorante i care s fie rezistente la

termosterilizarea cu abur sub presiune;

b) masc de protecie a feei, confecionat din tifon sau din materiale

sintetice uor sterilizabile prin metode fizice sau chimice;

c) mnui de cauciuc pentru ntrebuinare unic, sterilizate n prealabil cu

radiaii gamma;

d) bonet pentru protecia capului, confecionat din pnz, din tifon sau

din materiale sintetice uor sterilizabile prin metode fizice sau chimice;

e) ochelari de protecie, fabricai din sticl sau plastic incolor,

termosterilizabili prin iradiere cu ultraviolete;

f) papuci confecionai din cauciuc, termosterilizabili prin autoclavare,

special destinai lucrului n laborator sau, n lipsa acestora, huse de unic

folosin, confecionate din pnz sau hrtie rezistent la termosterilizare,

destinate acoperirii n ntregime a nclmintei de strad.

2 Echipamentul de protecie trebuie s fie pstrat ntr-un dulap special

destinat acestui scop, separat de hainele utilizate n spaiul exterior.

3 - Toate hainele sau alte obiecte personale vor fi pstrate n dulapuri

ermetice, amplasate la distan de incinta propriu-zis de lucru.

4 Introducerea n laborator a oricror obiecte de uz personal (exemple:

cri, caiete, mape, serviete, geni, sacoe, pungi etc.) este strict interzis,

acestea fiind, n mod obligatoriu, depozitate n anticamera special amenajat n

acest scop.

5 Lecturarea complet a coninutului lucrrii practice din manual,

preferabil n ziua premergtoare sosirii n laborator sau, n anumite situaii

extreme, cu minimum o or nainte de nceperea lucrrilor propriu-zise.

6 Elucidarea complet a oricror nelmuriri sau neclariti referitoare la

protocolul de lucru ce urmeaz a fi pus n aplicare, prin urmrirea cu atenie a

28

explicaiilor oferite de asistenta / asistentul cu rol coordonator al lucrrilor de

laborator i solicitarea de lmuriri suplimentare sau precizri absolut necesare

nelegerii corecte a modului de lucru i a rezultatelor preconizate a se obine la

finalul lucrrii efectuate.

7 ntocmirea planului de lucru pe etape cu stabilirea judicioas a

aparatelor, instrumentelor i materialelor ce urmeaz a fi utilizate pentru

efectuarea corespunztoare a lucrrii practice.

8 Identificarea tuturor ustensilelor i a obiectelor de lucru (anse

bacteriologice sau micologice, tuburi de cultur, pipete, plci Petri, baloane

Erlenmeyer, pahare Berzelius, cilindri gradai etc.), precum i a materialelor

consumabile absolut necesare pentru a fi utilizate n timpul desfurrii lucrrii

(colorani, reactivi, ingrediente pentru prepararea mediilor de cultur etc.).

9 Deplasarea prin laborator nu trebuie s se efectueze n vitez, prin

fug sau prin mers rapid, iar micrile trebuie s fie atent controlate, fr gesturi

brute, care s determine formarea de cureni de aer n zona de lucru.

10 - Toate culturile microbiene ce se utilizeaz n laboratorul de

microbiologie, precum i produsele biologice destinate analizelor microbiologice

specifice sunt considerate ca fiind potenial infectante.

11 Evitarea expunerii direct pe masa de lucru a tuburilor (eprubetelor)

sau a placilor Petri ce conin culturi bacteriene sau fungice, ci numai n interiorul

incintei cu aer steril, prevzut n acest scop.

12 Dezinfectarea cu alcool sau alte substane antiseptice a meselor de

lucru i a obiectelor auxiliare utilizate n timpului lucrului n laborator (creioane cu

grafit, creioane din plastic, tip markerdestinate inscripionrii obiectelor

confecionate din sticl, metal sau plastic etc.).

13 - Flambarea ansei la flacara emanat prin intermediul becului de gaz,

pn la nroirea complet a firului metalic n form de bucl i a unei poriuni din

lungimea acestuia pn la zona de conexiune a acestuia cu mnerul acoperit de

un material izolator ignifug.

29

14 Interzicerea transvazrii sub presiune a lichidelor din pipete n

interiorul eprubetelor, precum i a deschiderii brute a unor recipiente astupate

cu dopuri fixate ermetic pentru a se evita producerea de aerosoli cu grad ridicat

de contaminare.

15 Respectarea cu strictee a tuturor operaiunilor de manipulare a

culturilor de microorganisme, a ustensilelor, precum i a materialelor de

laborator, conform instruciunilor corespunztoare de lucru, n condiii de asepsie

total, fr efectuarea de micri brute sau violente care s pericliteze

desfurarea n siguran a activitilor specifice.

16 Interzicerea cu desvrire a fumatului sau a ingerrii alimentelor

sau buturilor n incinta laboratorului de microbiologie.

17 Semnalarea de urgen a asistentului coordonator de lucrri asupra

oricrui accident survenit n timpul lucrului n laborator (spargerea unui tub sau a

unei plci Petri de cultur microbian, spargerea unei pipete cu un anumit lichid,

rsturnarea unor flacoane coninnd acizi sau baze etc.) i acoperirea rapid i

complet, cu o lavet mbibat n soluie dezinfectant, a zonei n care s-a

produc accidentul respectiv i apoi curarea integral a particulelor reziduale

remanente.

18 Introducerea materialelor contaminate n recipientele special

destinate colectrii acestora pentru decontaminare prin sterilizare termic umed

(autoclavare).

19 Informarea temeinic asupra proprietilor fizice i chimice ale

substanelor manipulate n cursul efecturii experimentelor de laborator (gradul

de volatilitate, de inflamabilitate, de explozivitate, temperatura de aprindere, de

lichefiere, de sublimare etc.), n vederea evitrii unor posibile accidente datorate

lipsei de cunotine referitoare la reaciile poteniale pe care acestea le induc n

contact cu ali reageni chimici.

20 Activitatea practic n laboratorul de microbiologie implic n mod

direct sau indirect contactul cu un produs biologic infecios sau potenial

contaminant!

30

21 Utilizarea aparatelor i dispozitivelor de lucru trebuie efectuat n

conformitate cu instruciunile de folosire specifice.

22 La ncheierea oricrei lucrri practice n laboratorul de microbiologie,

este obligatorie dezinfectarea minilor prin imersarea acestora ntr-o soluie

antiseptic (bromocet, cloramin etc.) timp de 2 3 minute, iar apoi splarea

acestora cu ap cald i spun.

23 Pentru asigurarea unui control ct mai riguros al modului de

efectuare a lucrrilor de laborator, fiecare participant la activitatea practic, ce

urmeaz a se desfura pe parcursul unui semestru de an universitar, are

urmtoarele obligaii:

a) de a ntreine n mod corespunztor spaiul de lucru care i este

destinat, nc de la nceputul primei lucrri practice i pn la ncheierea stagiului

de activitate n cursul semestrului respectiv;

b) de a pstra ordinea i curenia n spaiul de lucru alocat;

c) de a asigura meninerea nealterat a suprafeei de lucru, precum i a

diferitelor dispozitive i obiecte adiacente spaiului de activitate.

24 Accesul persoanelor strine n laborator este strict interzis.

25 - Intrarea n laborator i participarea la efectuarea lucrrilor

practice se va realiza numai dup audierea i nsuirea temeinic a

regulilor de protecie a muncii.

2.2. Msuri destinate asigurrii proteciei personalului de lucru

Pentru a preveni accidentele de lucru, este absolut necesar respectarea

cu strictee a metodologiei specifice de lucru, precum i a regulilor de

dezinfectare i aseptizare, care se aplic laboratorului de microbiologie,

dup cum urmeaz:

a) toate operaiunile de inoculare se efectueaz la flacra unui bec de

gaz, prin flambarea orificiului vaselor de cultivare, att n momentul deschiderii

31

lor, prin detaarea lent (fr micri brute) a capacelor sau a buoanelor, ct i

al nchiderii acestora;

b) att ansa, ct i acul de platin se sterilizeaz prin nclzire la rou,

nainte i dup folosire, iar portansa se va flamba prin cteva treceri scurte pe

deasupra flcrii becului de gaz;

c) toate recipientele de cultivare (cutiile Petri, eprubetele, vasele

Erlenmeyer etc.) i materialele contaminate se introduc dup terminarea lucrului

n recipientul special destinat colectrii acestor materiale care vor fi ulterior

sterilizate prin autoclavare;

d) pipetele i lamele din sticl, ce au fost deja utilizate, nu se

decontamineaz la flacr, ci se imerseaz, dup ntrebuinare, n recipiente

coninnd soluie dezinfectant, amplasate n centrul fiecrei mese de lucru;

e) pentru efectuarea operaiunii de pipetare se vor utiliza instrumente sau

dispozitive special destinate acestui scop, respectiv, pipete automate cu vrfuri

sterilizate prin iradiere gamma sau pipete din sticl, sterilizate n prealabil prin

cldur uscat la 180oC; este total interzis efectuarea pipetrii prin aspiraie i

pompare cu gura;

f) manipularea substanelor inflamabile i a celor caustice este realizabil

numai prin respectarea cu strictee a regulilor de protecie mpotriva accidentelor.

32

Capitolul III

PROGRAMA ANALITIC A SUPORTULUI DE CURS - TEMA 4:

METODE I TEHNICI MODERNE DE INVESTIGARE

MICROBIOLOGIC A APEI

3.1. Corelare competene coninuturi

TABEL DE CORELARE COMPETENE CONINUTURI

Nr. crt.

Unitatea de competen

Competene individuale

Coninuturi

CONTROLUL CALITII MICROBIOLOGICE A APEI

Preleveaz probele de ap n vederea analizei microbiologice

Dispozitive de prelevare : - recipiente de sticl, polietilen, pompe, aparat de prelevare automat, recipient pentru prelevarea la adncime. Pregtirea : - Sterilizarea Probe de ap : -probe simple, probe medii, probe de suprafa, probe de adncime, probe pentru determinarea oxigenului Conservarea, marcarea, transportul - reactivi de conservare, unde este cazul, pstrarea la temperaturi sczute, etichete - transport; lzi frigorifice, auto, Buletin de prelevare: - denumire ap, zon de prelevare, punct de prelevare, data si ora, modul de prelevare, aspectul probei in

33

momentul prelevrii, condiii meteorologice, modul de conservare, numele persoanei care a fcut prelevarea

Determin indicatorii microbiologici ai apelor naturale

Indicatori microbiologici: - bacterii mezofile, coliformi totali, fecali Determinarea microbiologic: - bacterii mezofile, coliformi totali, fecali conform metodelor de analiz Interpretarea rezultatelor - normele de calitate in vigoare

3.2. SUGESTII METODOLOGICE

Ordinea cronologic recomandat pentru parcurgerea coninuturilor este

cea din tabelul de corelare competene coninuturi, dar poate fi oricare alta, la

alegerea profesorului.

Se impune doar tratarea succesiv a coninuturilor corespunztoare

aceleiai competene.

Numrul de ore recomandat, orientativ, pentru aceste coninuturi este prezentat

n tabelul de mai jos

Nr. crt. Coninuturi Total ore

Ore instruire teoretic

Ore laborator tehnologic

1. Preleveaz probe de ap n vederea analizei microbiologice a) Alegerea dispozitivelor de prelevare a probelor de ap b) Pregtirea dispozitivelor de prelevare pentru analiza microbiologic

8

2

6

34

c) Recoltarea probelor de ap pentru analiza microbiologic d) Conservarea, marcarea i transportul probelor de ap e) ntocmirea buletinului de prelevare

2. Determin indicatorii microbiologici ai apelor naturale a) Caracterizarea indicatorilor microbiologici b) Determinarea indicatorilor microbiologici b)Interpretarea rezultatelor analizelor

8 2 6

TOTAL 16 4 12

Se precizeaz faptul c numrul de ore alocat fiecrei teme este

orientativ.

Se recomand ca procesul de predare nvare s se desfoare, fie n

laboratoarele de microbiologie ale unor instituii specializate, fie la diferii ageni

economici sub ndrumarea profesorului de specialitate.

Colaborarea cu ageni economici de profil este deosebit de important

pentru parcurgerea acestui modul. Ageniile teritoriale de Protecia Mediului ar

putea fi, n acest caz, partenerii cei mai potrivii. Ideal ar fi ca aceste colaborri

s se materializeze n edine de practic la locul de munc n cadrul crora

cursanii s execute aceste tipuri de determinri, familiarizndu-se cu modul

specific de recoltare a probelor i cu echipamentele moderne utilizate pentru

efectuarea determinrilor specifice.

Dac, ns, acest lucru nu este posibil orele se pot desfura sub forma

vizitelor n cadrul crora cursanii pot doar s asiste la efectuarea acestor

determinri.

35

n demersul didactic se vor utiliza fie de lucru sau fie de observaie,

aplicnd metodele didactice precizate anterior.

La sfritul fiecrei determinri practice fiecare cursant i va ntocmi

propriul referat al lucrrii, referat care poate fi utilizat de ctre profesor ca

instrument de evaluare curent.

De asemenea, referatele pot fi utilizate pentru ntocmirea de ctre cursani

a unor portofolii sau proiecte utilizate, de asemenea, pentru evaluarea acestora.

Rolul profesorului este de a supraveghea atent activitatea cursanilor, de

a-i ndruma pe acetia i de a corecta, atunci cnd este cazul greelile acestora.

n scopul formrii competenelor prevzute de program, se recomand

utilizarea unor metode de predarenvare interactive cum ar fi: nvarea prin

descoperire, problematizarea, joc de rol, studiul de caz, proiecte de lucru,

portofolii etc.

Strategiile de predare presupun alegerea metodei n funcie de obiectivele

propuse. Alegerea tehnicilor de instruire revine profesorului, care are sarcina de

a individualiza i de a adapta procesul didactic la particularitile specifice

fiecrui cursant.

Profesorul are libertatea de a alege metodele i tehnicile didactice i de a

propune noi activiti de nvare n msur s asigure formarea competenelor

specifice prevzute de program.

Exersarea abilitilor-cheie se va realiza ori de cte ori este posibil pe

parcursul instruirii, cnd coninuturile i activitile de nvare o permit.

Evaluarea trebuie s fie corelat cu criteriile de performan i cu tipul

probelor de evaluare care sunt precizate n Standardul de Pregtire Profesional.

Cursanii trebuie evaluai numai n ceea ce privete dobndirea competenelor

specificate n cadrul suportului de curs.

Chiar dac se exerseaz i alte competene-cheie n procesul de predare-

nvare, trebuie precizat faptul c se va evalua numai competena-cheie

prevzut n suportul de curs. O competen se evalueaz numai o singur

dat.

36

Principala metod de evaluare a competenelor specifice menionate n

acest suport de curs este proba practic.

Pe lng aceasta se mai pot utiliza: observarea sistematic, proiectul,

portofoliul, tema n clas, autoevaluarea.

Probele de evaluare i autoevaluare se pot concepe sub form de fie de

observare, fie de autoevaluare, fie de evaluare.

Exemplu de fi de observare :

3.3. FI DE OBSERVARE Numele i prenumele cursantului : Data verificrii : Numr de nregistrare : Timp de lucru : Numele i prenumele evaluatorului : Semntura evaluatorului :

Rezultat Feed-back

Modulul : Controlul calitii apelor naturale Competena 1 : Preleveaz probe de ap n vederea analizei microbiologice Criterii de performan :

a) Alegerea dispozitivelor de prelevare a probelor de ap

b) Pregtirea dispozitivelor de prelevare pentru analiza microbiologic

c) Prelevarea probelor de ap pentru analiza microbiologic

d) Conservarea, marcarea i transportul probelor de ap

e) ntocmirea buletinului de prelevare

Instruciuni pentru cursant :

Citii cu atenie sarcinile de lucru ;

37

Solicitai lmuriri evaluatorului n cazul unor neclariti la cerinele din sarcinile de

lucru

Asigurai-v de existena instrumentelor materialelor i echipamentelor necesare

rezolvrii sarcinilor de lucru

Asigurai-v de ndeplinirea condiiilor de protecia i securitatea muncii precum

i de existena echipamentului specific de protecia muncii

Deplasai-v pe teren pentru ndeplinirea sarcinilor de lucru

Sarcini de lucru :

Preleveaz probe de apa din rul Arge respectnd etapele prelevrii

Evaluatorul pune la dispoziia cursantului materiale i reactivi, din care cursantul

i alege cele necesare

Not:

Pentru fiecare criteriu de performan se elaboreaz sarcini de lucru. Realizarea

acestora de ctre cursani se marcheaz prin bifarea csuelor respective

Nr.

probei

Etapele prelevrii Evaluator Data

1. Alegerea dispozitivelor de prelevare a probelor de

ap

2. Pregtirea dispozitivelor de prelevare pentru analiza

microbiologic

3 Prelevarea probelor de ap pentru analiza

microbiologic

4 Conservarea, marcarea i transportul probelor de ap

5 ntocmirea buletinului de prelevare

38

Capitolul IV

TEHNICI DE STERILIZARE A USTENSILELOR I A

MATERIALELOR CONSUMABILE N LABORATORUL DE

MICROBIOLOGIE

Distrugerea microorganismelor sau sterilizarea este indispensabil pentru

pregtirea materialului de lucru i a mediilor de cultivare.

Un produs este considerat steril cnd nu mai conine microorganisme ce

se pot revitaliza.

Exist mai multe procedee de sterilizare care corespund diferitelor tipuri

de materiale ce trebuie tratate. n laboratorul de microbiologie pentru analize de

rutin, cldura reprezint modalitatea de sterilizare cea mai frecvent

ntrebuinat.

4.1. Procedee de sterilizare a ustensilelor i mediilor nutritive de cultivare a

microorganismelor

Sterilizarea prin cldur

Cldura umed

Sterilizarea prin cldur umed se efectueaz n autoclavul cu aburi prin

procedeul de autoclavare.

39

Principiu: n atmosfera de vapori de ap sub presiune, toate bacteriile

(inclusiv formele sporulate) sunt omorte dup 20 minute la 1210C. Aceasta este

metoda cea mai eficient de sterilizare.

Autoclava permite:

- pregtirea materialului (medii de cultur, diferite obiecte) n vederea

utilizrii n laborator, prin distrugerea microorganismelor;

- decontaminarea materialelor dup folosirea n laborator (cel puin 30

minute la 1210C).

Microorganismele din produsele patologice, eantioanele de ap i

produse alimentare analizate, din culturile microbiene de laborator etc, trebuie

neaprat distruse.

Aceste dou operaii ar trebui efectuate de preferin n dou autoclave

diferite sau, cel puin,n mod separat.

Timpul de sterilizare

In tabelul 1, sunt prezentai parametrii de sterilizare doar pentru obiecte,

medii de cultur sau alte substane ce trebuie sterilizate n autoclav pentru

analizele de rutin.

Tabelul 1

Parametrii de sterilizare pentru obiecte, medii nutritive i substane auxiliare

Materialul sterilizat Temperatura

(0C)

Presiunea

(barr)

Timp (minute)

Sticlrie curat 121 1 20

Ap , ser fiziologic 121 1 20

Parafin 121 1 20

Sruri minerale 121 1 20

Medii curente (bulion nutritiv,

geloz nutritiv)

121 1 15 - 20

Lapte degresat 115 0,7 15

40

Medii cu substane termolabile

(ex. glucide)

110 0,5 20

Glucoz n soluie 110 0,5 20

Controlul eficienei sterilizrii prin autoclavare este realizat adesea cu

ajutorul unor indicatori de sterilizare cum sunt hrtiile indicatoare: sunt

comercializate benzi de hrtie special imprimate pentru a vira culoarea dac au

fost ndeplinite condiiile de sterilizare.

Pasteurizarea

Sterilizarea trebuie s fie deosebit de pasteurizare, care reprezint doar

un procedeu de conservare utilizat n industria alimentar.

Pasteurizarea const n tratarea produsului la o temperatur n domeniul

560C - 850C, o durat variabil de la cteva minute pn la o or, n mediu

umed, n funcie de produs.

n aceste condiii, majoritatea celulelor vegetative bacteriene sunt distruse,

dar nu i formele sporulate.

Tyndalizarea

Tyndalizarea const n 2 - 3 pasteurizari repetate, alternate cu perioade n

care proba este meninut n condiii favorabile pentru germinarea endosporilor

bacterieni, care devin vulnerabili trecnd n stare vegetativ i sunt distrui prin

pasteurizare.

Acest procedeu de sterilizare se poate realiza n baie de ap, de exemplu,

n urmtoarele condiii: nclzire la 560C (pn la 800C) timp de 1 or, 3 - 7 zile

consecutiv, cu un interval de 24 de ore.

Tyndalizarea se poate folosi pentru distrugerea microorganismelor n

mediile ce conin substane termolabile.

41

Cldura uscat

Sterilizarea prin cldur uscat se efectueaz n sterilizatoarele cu aer

cald (etuve).

Cldura uscat nu poate distruge bacteriile i n special sporii bacterieni,

dect la o temperatur mai ridicat ca n cazul cldurii umede. Tratamentul

pentru sterilizare cu cldur uscat este de 4 ore la 1400C sau 1 or la 1800C.

Un alt procedeu de sterilizare prin cldur uscat este flambarea, care

se efectueaz n flacra becului de gaz pentru: extremitatea firului ansei,

exteriorul pipetelor, gtul eprubetelor i al flacoanelor.

Sterilizarea prin filtrare

Filtrarea const n trecerea unui produs lichid printr-un perete poros sau o

membran care reine bacteriile. Se pot utiliza filtre de portelan (Chamberland),

de sticl poroas sau membrane tip Millipore, cu pori de diferite dimensiuni.

Sterilizarea prin gaze toxice

Oxidul de etilen, de exemplu, este foarte utilizat pentru sterilizarea

materialului medico-chirurgical, a materialelor din plastic numite sterile, de unic

folosin din industrie.

Sterilizarea cu ajutorul radiaiilor

Radiaiile ultraviolete - sunt radiaii cu utilizare curent n laboratorul de

microbiologie; ele sunt bactericide, dar nu distrug sporii bacterieni. Acest tip de

radiaii acioneaz n mod direct i au putere de penetraie sczut (civa

milimetri). Lmpile germicide al cror efect se bazeaz pe aciunea radiaiilor

UV cu lungimea de und de 254 nm sunt utilizate :

- pentru sterilizarea apei

- pentru sterilizarea incintelor i a aerului ambiant

42

Radiaiile gamma

Radiaiile gamma fac parte din categoria radiaiilor ionizante i au un efect

puternic microbicid. Sunt dificil de produs i de utilizat i foarte periculoase

datorit efectelor pe care le au asupra materiei vii.

Acest tip de radiaii poate fi utilizat n sterilizarea materialului medical i

microbiologic de folosin unic sau pentru sterilizarea unor deeuri.

4.2. Pregtirea i sterilizarea sticlriei n laboratorul de analize

microbiologice

Pregtirea i sterilizarea materialului n vederea utilizrii n laboratorul de

microbiologie este o operaie deosebit de important deoarece exactitatea

rezultatelor precum i reuita desfurrii proceselor microbiologice depind n

mare msur de rigurozitatea cu care se efectueaz.

Principalele operaii de pregtire a sticlriei de laborator sunt:

- splarea

- uscarea

- executarea dopurilor i ambalarea - recipientele pot fi pregtite cu dop

din vat hidrofob pentru a nu pstra umezeala dup autoclavare. Din ce n ce

mai folosite sunt dopurile din celuloz comprimat (comercializate), sterilizabile

pan la 2000C. Pentru nlocuirea eprubetelor cu dop de vat, n scopul pstrrii

optime a culturilor, se pot utiliza tuburi prevzute cu capsule care se monteaz

prin nurubare.

Pentru evitarea contaminrii mediilor de cultur utilizate n analiza

microbiologic sau n obinerea culturilor microbiologice, sticlria de laborator

trebuie ambalat i sterilizat corespunztor.

Sterilizarea se efectueaz la etuv (sau pupinel), iar materialele supuse

acestei operaii trebuie s fie curate i mpachetate n hrtie sau aezate n

conteinere metalice nchise.

Sterilizarea uscat se poate aplica pentru articole din sticl (plci Petri,

baloane, pipete, eprubete), obiecte din porelan, instrumentar metalic fr suduri

43

n cositor, pulberi uscate etc. Aerul fiind slab conductor de cldur, sterilizatorul

trebuie s uniformizeze temperatura i s asigure ptrunderea aerului fierbinte n

obiectele de sterilizat.

n calcularea timpului de sterilizare uscat trebuie avute n vedere

urmtoarele etape:

perioada de nclzire la temperatura de sterilizare, socotit n general o or;

perioada de meninere a temperaturii de sterilizare;

perioada de rcire n care scderea temperaturii trebuie realizat treptat pentru

evitarea spargerii obiectelor de sticl prin oc termic, aprox. 2 ore.

n practic se procedeaz la alegerea unei temperaturi de sterilizare de

180o C i a unei durate de o or. Din exces de pruden se practic sterilizri la

temperaturi mai ridicate sau de durate mai mari. n unele cazuri aceast practic

este duntoare deoarece, de exemplu, vata ordinar - la durate i temperaturi

mari de sterilizare uscat - elibereaz gudroane ce pot inhiba creterea

microbian.

Materiale utilizate:

- pipete;

- plci Petri;

- eprubete;

- flacoane Erlenmayer;

- vat hidrofob;

- tifon;

- hrtie ambalaj;

- etuv.

Mod de lucru:

Se confecioneaz dopuri de vat hidrofob pentru eprubete, astfel nct

s poat fi extrase uor n timpul inoculrii, iar densitatea materialului s asigure

sterilitatea. Eprubetele se introduc in coul de srm i se acoper cu hrtie.

44

Pipetele se astup la partea opus vrfului, cu un dop subire de vat care

s rein microorganismele ce ar putea ptrunde n pipet pe la partea

superioar. Pipetele se ambaleaz ntr-o fie de hrtie care se rsucete n

jurul tubului de sticl, ncepnd de la vrf.

Plcile Petri se ambaleaz n hrtie de ambalaj, n funcie de numrul

necesar. Flacoanele Erlenmayer pentru medii de cultur se astup cu dop de

vat nfurat n tifon.

Toat sticlria se sterilizeaz timp de 1 or la 180oC n etuv, perioad

calculat din momentul atingerii temperaturii. Dup aceast perioad etuva se

oprete i se ateapt rcirea materialului.

45

Capitolul V

PREPARAREA I STERILIZAREA MEDIILOR NUTRITIVE DE

CULTIVARE A MICROORGANISMELOR

5.1. Prepararea i sterilizarea mediilor nutritive de cultivare

Un mediu de cultur reprezint un substrat nutritiv complex, steril, care

trebuie s asigure microorganismelor cantitatea necesar de ap, sursa de

carbon, de azot, sruri minerale, factori de cretere, deci care s le furnizeze

substanele i energia necesare n procesele de cretere, reproducere i

ntreinerea funciilor vitale.

Mediul de cultur trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:

s corespund din punct de vedere nutritiv,

s aib o concentraie a substantelor dizolvate care s nu influeneze negativ

schimburile osmotice ale celulei

s nu conin substane toxice,

s aib un anumit pH

s fie steril (lipsit de microorganisme vii), astfel nct s se dezvolte numai

celulele introduse prin inocul.

Mediile de cultur se folosesc n practica de laborator sau n practica

industrial i sunt foarte difereniate n funcie de scopul urmrit.

46

n tehnicile de laborator, mediile se folosesc pentru izolarea din mediul

natural a diferitelor microorganisme, pentru obinerea de culturi pure, pentru

ntreinerea culturilor selecionate.

n scopuri industriale, mediile de cultur sunt utilizate pentru obinere de

biomas sau a unor compui de natur microbian.

Dup scopul utilizrii lor, mediile de cultur se mpart n:

* medii de cultur generale care asigur dezvoltarea unui mare numr de

specii

* medii de cultur selective care permit dezvoltarea unui numr restrns de

microorganisme

* medii de cultur de difereniere care permit separarea speciilor n funcie

de anumite caractere biochimice

* medii de mbogire destinate separrii i cultivrii unor microorganisme

pretenioase din punct de vedere nutritiv sau care se afl n numr redus

* medii de conservare

* medii de cultur industriale

Din punct de vedere al compoziiei chimice, mediile de cultur se mpart n

3 categorii:

* medii naturale (empirice) de origine animal sau vegetal, cu o

compoziie chimic nedefinit n mod exact;

* medii sintetice: acestea sunt soluii de substane chimice pure n ap

distilat, cu o compoziie perfect determinat;

* medii semi-sintetice: sunt constituite din produse chimice bine definite,

dar i din produse de origine natural (cu compoziie cunoscut).

Constituenii principali ai mediilor de cultur sunt:

1. Extracte de carne i macerate

Aceste produse, comercializate n form concentrat sub denumirea de

extracte de carne, conin n principal proteine puin hidrolizate, glucide, sruri

47

minerale, vitamine hidrosolubile. Compoziia lor variaz n funcie de carnea

utilizat pentru preparare.

2. Extracte de drojdie

Aceste extracte, comercializate sub form deshidratat, sunt preparate din

drojdia de bere, fiind utilizate ca surs de aminoacizi i de vitamine hidrosolubile

(vitamine din complexul B).

3. Peptone i hidrolizate

Peptonele reprezint un amestec de compui solubili n ap care provin n

urma aciunii enzimelor asupra materialului proteic.

Acestea pot fi: pepton pepsic din carne, pepton tripsic din cazein (cu

coninut crescut n triptofan), pepton pancreatic de cazein, pepton tripsic

de carne, pepton papainic de soia, peptone compuse.

Hidrolizatele sunt peptone obinute n urma aciunii compuilor anorganici

asupra proteinelor (acid clorhidric de ex.). Cel mai des ntrebuinat este

hidrolizatul acid de cazein, coninnd aminoacizii constitutivi ai cazeinei din

lapte.

4. Agar-agarul sau geloza

Agar-agarul denumit i geloz este un extract de alge roii

(Rhodophyceae) din genul Gelidium i Gracillaria, recoltate n mrile Japoniei

sau ale Noii Zeelande. Se dizolv n ap la o temperatur n jur de 900C i se

solidific sub 450C, fiind utilizat pentru solidificarea mediilor de cultur.

Agar-agarul nu este degradat de microorganismele obinuite i este

comercializat n forma sa iniial deshidratat, numit agar fibre (foarte impur),

sub form de paiete (mai puin impur), sau sub form de pulbere.

Numeroase firme sunt specializate n producerea i comercializarea

mediilor de cultur de laborator (firma Difco, Merck, Biokar, Oxoid).

48

Mediile fermentative sunt medii de cultur industriale destinate producerii

unor cantiti mari de celule sau produi de metabolism. n compozitia acestor

medii intr ca surse de carbon: melasa, produs secundar rezultat la fabricarea

zahrului i care conine 45 - 55% zaharoz, diferite tipuri de finuri, cereale

boabe, zer bogat n lactoz, tre etc.

Dintre sursele de azot cel mai des folosite sunt: finurile proteice de soia,

sulfatul de amoniu, ureea, ngrmntul complex. Ca sruri minerale se adaug

fosfai, sulfai, cloruri etc.

Pentru cultivarea microorganismelor care necesit factori de cretere, se

adaug extract de porumb (obinut prin concentrarea apelor rezultate la

nmuierea porumbului, bogat in aminoacizi, vitamine, acid lactic, microelemente),

extract de drojdie, extract din radicele de mal i germeni de gru i porumb.

5.2. Prepararea mediilor nutritive pentru cultivarea bacteriilor, drojdiilor i

mucegaiurilor

Materiale utilizate:

- balan cu precizie de 0,1 g;

- pahare Berzelius;

- sit azbest;

- agar nutritiv pulbere;

- mediu de cultur extract de mal - agar pulbere;

- mediu extract de cartof-dextroz-agar pulbere;

- eprubete cu dop, sterile;

- pipete de 10 ml;

- flacoane Erlenmayer;

- bec de gaz;

- autoclav electric automat

49

Mod de lucru:

Conform indicaiilor de pe flacoanele coninnd mediile de cultur

pulverulente, se vor cntri cantitile necesare pentru a obine cte 1 litru din

fiecare tip de mediu de cultur pentru eprubete i cte 300 ml mediu pentru

baloanele Erlenmayer.

n cazul n care nu exist medii deshidratate, procurate de la firme

specializate, mediile se vor prepara prin cntrirea componentelor pentru

volumul final dorit.

Mediul de cultur se aduce la fierbere n paharele Berzelius de 1 l, pn la

completa dizolvare a agarului, apoi se repartizeaz cte 10 ml n eprubete

sterile, prevzute cu dop de vat, care se aeaz n couri de srm i se

acoper cu hrtie. n mediu se determin pH-ul i, dac este necesar, se

ajusteaz la valoarea dorit.

Mediile cu agar nu trebuie s fie aduse la un pH mai mic de 6, deoarece

agarul este parial hidrolizat n timpul sterilizrii la pH acid i nu se mai solidific

la rcire. Cnd sunt necesare astfel de medii, pH-ul trebuie ajustat dup

sterilizare.

Baloanele Erlenmayer se astup cu dop de vat nvelit n tifon, se leag la

gur cu hrtie i srm subire oelit. Courile i baloanele Erlenmayer se

introduc n autoclava cu alimentare electric, iar sterilizarea se efectueaz

conform instruciunilor menionate n cartea tehnic a instalaiei de sterilizare.

Se verific nivelul apei n incinta de sterilizare, se nchide capacul, se

conecteaz la reeaua electric, se procedeaz la selectarea programului

automat de sterilizare i se ateapt nclzirea prin formarea de abur

supranclzit care, dup atingerea temperaturii de 100o C este eliminat prin

purjare, acesta antrennd spre exterior aerul rezidual, remanent n incinta de

sterilizare nc de la nceputul operaiunii de sterilizare.

Dup 1-2 minute de purjare se nchide robinetul, iar presiunea indicat de

manometru va urca pn la valoarea 1,1 unde va fi meninut timp de 15-20

minute de ctre sistemul automat de sterilizare al autoclavei .

50

ntre presiune i temperatura din autoclav exist o corelaie, aa cum se

prezint n tabelul urmtor:

Tabelul 2

Corelaia dintre temperatur i presiune n procesul de sterilizare

Temperatura n grade

Celsius

Presiunea

n kg/m3

Presiunea

n atmosfere

100 0,00 0,00

105 0,20 0,20

110 0,43 0,42

112 0,55 0,50

115 0,69 0,67

120 0,99 0,96

121 1,10 1,07

122 1,33 1,29

128 1,55 1,50

130 1,72 1,65

135 2,16 2,09

140 2,65 2,56

Dup acest interval de meninere a temeperaturii la valoarea de 121o C,

se ateapt scderea presiunii pe manometru, se deschide robinetul de purjare,

iar dup aproximativ 5-10 minute se poate deschide capacul autoclavei.

n general, mediile de cultur trebuie s ofere o suprafa de dezvoltare

suficient de mare pentru toate microorganisme. De aceea, dup sterilizare,

tuburile cu mediu de cultur se nclin pentru a se extinde la maximum suprafaa

de cretere.

51

nclinarea se face prin sprijinirea eprubetelor pe o baghet suficient de

groas, innd seama ca mediul negelificat s nu ating dopurile tuburilor de

sticl, ci s se opreasc la o distan de 2 - 3 cm fa de acestea.

Prin rcire, vaporii ce ies din mediul cald, se condenseaz pe pereii mai

reci ai eprubetelor i cad sub form de picturi pe mediu, colectndu-se la partea

inferioar a acestora. Din aceast cauz, eprubetele cu mediul rcit nu se

aeaz n poziie orizontal, ci doar vertical, n couri de srm, care se

acoper cu folie metalizat sterilizat n prealabil.

Pentru a nu se prepara n fiecare zi medii de cultur, sau, dac este

nevoie de mai multe tipuri de medii n acelai timp, acestea se pregtesc o

singur dat i apoi se depoziteaz pentru pstrare.

Sticlele cu medii de cultur se eticheteaz, notndu-se tipul mediului i

data preparrii. Pentru evitarea uscrii se recomand pstrarea mediilor nutritive

n frigider.

52

Capitolul VI

INOCULAREA I INCUBAREA PROBELOR MICROBIOLOGICE

6.1. Estimarea densitii populaiilor microbene

Numrarea microorganismelor se execut n mod frecvent n laboratorul de

microbiologie, n vederea aprecierii stadiului de multiplicare a celulelor din diferite

culturi folosite n industrie sau pentru determinarea gradului de contaminare a

unor produse, n special alimentare. Pentru a asigura o numrare rapid i n

acelai timp precis, innd cont c ncrctura microbian a diferitelor produse

i culturi poate s fie foarte ridicat, se recomand n prima etap s se

efectueze diluri ale produsului supus analizei microbiologice.

6.1.1. Tehnica obinerii diluiilor decimale

Dup recoltare, la omogenizarea probelor destinate analizei

microbiologice, se recomand ca raportul ntre produs i diluant s fie de 1:10,

obinndu-se astfel prima diluie (diluie 10-1). Pentru efectuarea urmtoarelor

diluii decimale, cu o pipet steril, se barboteaz lichidul pentru omogenizare ,

se recolteaz 1 ml din diluia I i se scurge lichidul n alt eprubet cu 9 ml ser

fiziologic steril, obinndu-se diluia a II-a (diluie 10-2) i se continu procedeul

pn la obinerea diluiei necesare. Gradul de diluare este condiionat de

53

numrul presupus de microorganisme din proba de analizat; cu ct numrul este

mai mare, cu att se fac mai multe diluii. Pentru majoritatea produselor sunt

suficiente 4 - 8 diluii succesive.

Cnd se face numrarea celulelor dintr-o anumit diluie considerat

corespunztoare, numrul obinut se multiplic cu coeficientul de diluie k,

pentru a obine numrul de celule existent n produsul iniial (pentru d I, k = 10,

pentru d II, k = 100 etc).

Pentru evitarea erorilor se recomand omogenizarea coninutului

eprubetelor n care s-a fcut diluarea fie prin rotirea eprubetei ntre palme, fie,

cu ajutorul pipetei sterile, prin barbotare, nainte de recoltarea volumului de 1 ml

destinat urmtoarei diluii. Se iau toate msurile de precauie pentru a evita

contaminarea cu microorganisme din mediul ambiant, lucrnd n zona de

protecie din jurul flcrii becului de gaz i respectnd regulile de manipulare.

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Suspensie iniial 1: 10 1 : 100 1 : 1000 1 : 10000

Fig.1. Schem reprezentativ pentru tehnica de obinere a diluiilor

decimale

Dup efectuarea diluiilor decimale, numrarea microorganismelor se poate

realiza prin metode directe, cu ajutorul camerelor de numrare sau prin metode indirecte.

54

6.2. Inocularea culturilor microbiene

Principiul metodei:

Microorganismele pot fi cultivate pe medii de cultur n plci Petri sau n

tuburi, att pentru studiul lor, pentru conservarea lor prin refrigerare, ct i pentru

obinerea culturilor stoc i de lucru, n diversele procese biotehnologice. Operaia

de trecere a unei culturi dintr-un vas de cultur n altul se numete repicare sau

trecere, iar fragmentul de cultur ce se trece pe alt mediu se numete

inoculum.

n jurul flcrii becului de gaz exist o zon steril cu diametrul de

aproximativ 20 cm, n lipsa curenilor de aer.

Toate manipulrile care necesit deschiderea recipientelor sterile

sau coninnd culturi trebuie efectuate n aceast zon de protecie.

6.2.1. Inocularea n eprubete (tuburi)

Materiale utilizate:

- culturi de Bacillus subtilis pe agar nutritiv;

- culturi de Saccharomyces cerevisiae pe mediul extract de mal - agar;

- culturi de Monascus purpureus, Aspergillus niger i Penicillium notatum pe

mediul extract de cartof - dextroz - agar;

- ans de inoculare;

- bec de gaz;

- eprubete cu mediu sterilizat i nclinat (nutrient-agar, extract de mal-agar,

extract de cartof-dextroz-agar);

- termostat la 30 oC;

- lamp bactericid.

55

Mod de lucru:

6.2.1.1. Inocularea cu ansa

Se terge suprafaa din interiorul niei de lucru cu un tampon mbibat cu

alcool 95%. Se aprinde lampa bactericid i se las 15 minute pentru

sterilizarea incintei de lucru. Se spal minile cu spun, apoi se cltesc cu alcool.

Se aprinde becul de gaz i se regleaz flacra, care trebuie s aib conul de

culoare albastr.

Se ine eprubeta n care exist cultura ce trebuie repicat cu mna

stng, n poziie oblic sau chiar orizontal. n mna dreapt se ine acul de

repicat. Acesta se arde n flacra becului de gaz, inndu-l n poziie vertical

pentru ca flacra s cuprind o poriune ct mai mare din el. Se ine n flacr

pn ce mai mult de jumtate din ac se nroete, apoi se plimb de 2 -3 ori i

restul acului pn la mner, n flacr.

Dup aceea se apropie gura eprubetei de flacr i, cu degetul mic de la

mna dreapt ndoit, se trage afar dopul de vat din gura eprubetei, apucndu-l

de captul rmas afar. Nu i se d drumul dopului pe mas sub nici un motiv, ci

se ine tot timpul n mn. Se trece gura eprubetei de 2 -3 ori prin flacr. Se

introduce acul fierbinte n eprubet i se rcete, nu n cultur, ci alturi, pe o

poriune de agar fr cultur. Se ia apoi o foarte mic poriune (de 1 - 2 mm) din

cultur pe vrful acului (se alege poriunea cea mai tipic i mai curat a culturii

respective).

Se scoate acul din eprubet, se arde din nou gura eprubetei i se astup

cu dopul de vat din mna dreapt. Se las jos eprubeta i se ia, tot cu mna

stng, o alt eprubet cu mediu steril.

Acul de repicat cu fragmentul de cultur, se ine mai departe n mna

dreapt ferindu-l acum de flacr.

Se procedeaz cu eprubeta a doua la fel cum s-a procedat cu prima,

adic: se ine n poziie orizontal sau putin oblic n mna stng, se scoate

56

dopul cu degetul cel mic de la mna dreapt ndoit, inndu-se tot timpul

operaiei de repicare n mn. Se trece gura eprubetei prin flacr, se introduce

acul de repicare cu fragmentul de cultur, atingnd uor mediul (n centrul

eprubetei), pn ce bucica de cultur rmne pe mediu. Uneori este bine ca

fragmentul de cultur s fie puin afundat n mediu, pentru a face un contact mai

strns cu el.

Se scoate acul de repicat din eprubet, se arde din nou gura eprubetei i

se astup cu dopul din mna dreapt. Se trece i captul dopului care a fost

inut cu mna prin flacr, dar foarte rapid.

Se arde din nou acul n flacr pan la rou. Aceast operaie este

absolut necesar i trebuie fcut cu rbdare, pentru a se evita infectarea

mediilor urmtoare. Dup arderea acului se ia din nou eprubeta cu cultura ce

trebuie repicat i se repet operaia de repicare cu o alt eprubet steril.

Toate micrile descrise mai sus, din care const operaia de repicare,

trebuie executate destul de repede pentru a nu permite infectarea mediilor sterile

din eprubete. Ele trebuie fcute cu o oarecare ritmicitate i nu prelungite prea

mult. De asemenea trebuie respectate o serie de indicaii, care la prima vedere

par minore, dar de care depinde foarte mult reuita unei repicri.

Astfel, trebuie avute n vedere:

-inerea eprubetei n poziie orizontal n timpul repicrii pentru a evita cderea

sporilor de ciuperci i bacterii din atmosfer pe mediu;

-inerea acului de repicat n poziie vertical n flacr i nu orizontal, pentru ca

arderea s se fac pe o poriune ct mai mare;

-scoaterea dopului de vat cu degetul mic al minii drepte i inerea lui tot timpul

n mn, pentru a-l feri de contaminri secundare;

-arderea gurii eprubetei la scoaterea i introducerea dopului de vat, deoarece

pe marginile exterioare ale eprubetei pot exista germeni de infecie secundar.

Dup dezvoltarea culturii se observ aspectul , culoarea, tipul coloniilor,

precum i eventuala prezen a contaminrii cu alte microorganisme.

57

6.2.1.2. Inocularea cu pipeta Pasteur sau cu pipeta gradat

Pentru pregtirea pipetei Pasteur, se ia un tub de sticl obinuit, cu

diametrul exterior de 6 mm i cel interior de 4 mm, care se taie la o lungime de

25 cm, se rotunjesc marg