+ All Categories
Home > Documents > curs 2015.pptx

curs 2015.pptx

Date post: 08-Nov-2015
Category:
Upload: albescu-amir
View: 321 times
Download: 11 times
Share this document with a friend
71
APLICAREA GENOMICII IN STUDIUL ONCOGENEZEI SI IN CLASIFICAREA TUMORILOR NEOPLAZICE
Transcript

Introducere in studiul GENOMICII

APLICAREA GENOMICII IN STUDIUL ONCOGENEZEI SI IN CLASIFICAREA TUMORILOR NEOPLAZICE

CUPRINSULCURSULUIONCOGENEZAMODIFICARI FIZIOPATOLOGICEGENE IMPLICATE IN ONCOGENEZASEMNALIZAREA INTRA SI INTERCELULARA MODIFICATA PATOLOGICMODIFICARI EPIGENETICE IN NEOPLAZIICLASIFICAREA TUMORILOR MALIGNECLASIFICAREA CLASICA A TUMORILORSTADIALIZAREA CLINICA CLASICAUTILIZAREA GENOMICII IN CLASIFICAREA SI STADIALIZAREA TUMORILOR MALIGNE

ONCOGENEZA

DEFINITIEBolile neoplazice reprezinta un grup de afectiuni caracterizate prin:cresterea celulara anormalainvazia la distanta fata de tesutul tinta.Cresterea celulara este datorata pierderii controlului ciclului celular normalInvazia la distanta este datorata schimbarii proprietatilor de adezivitate si de supravietuire in mediu a celulei neoplazice.Leziunea primara este la nivel genic dar modificarile epigenetice sunt aproape intotdeauna prezente.

MODIFICARI GENOMICE IN NEOPLAZII (Rudon)exprimarea in exces a proteinelor oncogene datorita translocarii, amplificarii sau mutatiilor cromozomiale.pierderea proteinelor de supresie a tumorilor prin deletii sau mutatii ale genelor ce le produc.alterarea pattern-ului de metilare a ADN-ului. erori de imprinting genetic cu supraproductie de substante de crestere (IGF-2 = insulin growing factor 2).cresterea sau reglarea la nivel crescut a factorilor de crestere (eg TGF- = transforming growth factor- ), factori tumorali de angiogeneza, PDGF= platelet-derived growth factor, factori de crestere hematopoetica (eg: CSFs= colony stimulating factor, interleukine).instabilitatea genomica cu pierderea progresiva a reglarii proliferarii celulare, cresterea invazivitatii, si cresterea potentialului metastatic. nivele mari de enzime implicate in sinteza acizilor nucleici si nivele ridicate de enzime litice (eg, proteaze, colagenaze, glicozidaze).exprimarea in exces a genelor de oncodezvoltare de tipul antigenelor oncofetale (eg, antigen carcinoembrionic), hormoni placentari (eg, human chorionic gonadotropin).

PUNCTELE DE CONTROL ALE CRESTERII CELULARE

G1 Este punctul in care se decide daca celula intra in diviziune sau nu si care leaga diviziunea de cresterea celulara. Este un punct de restrictie influentat de semnale interne (nutritie, dimensiuni celulare) si externe: factori de crestere si diviziune.Controlat de p53 care dicteaza apoptoza daca exista alterari majore ale ADN.G2M Este punctul in care se decide mitoza. Este controlat de MPF = M phase promoting factor, o ciclin dependent kinaza. ADN modificat are actiune de fosforilare a MPF, inhiband-o.Se asigura ca celula a parcurs toate procesele necesare completarii unei faze inainte de a avansa in etapa urmatoare a ciclului celular. Controlul se realizeaza prin ciclin kinaze. Spindle check point = se asigura ca toti cromozomii sunt aliniati pe fusul de diviziuneParcurgerea ciclului celular este stimulata de cyclin-kinaze.PUNCTE DE CONTROL ALE CRESTERII CELULARE In general, kinazele sunt enzime care adauga PO4+2, activnd proteinele iar fosfatazele (care indeparteaza PO4+2) dezactiveaza proteinele.Celula care a suferit o alterare a ADN-ului normal datorata radiatiei ultraviolete (UV) sau radiatiei X, este blocata in G1 pentru ca leziunea ADN sa fie reparata inaintea replicarii celulare. Celulele canceroase, care au putine sau nu au de loc puncte de control, continua sa isi replice ADN-ul modificat; in acest mod mutatiile persista si se acumuleaza progresiv.

G1- Gap 1- celula cresteS- faza de sinteza a ADNG2 Gap 2 celula se pregateste de diviziuneM- mitoza (diviziunea celulara)http://www.cancerquest.org/images/FLV/fullDocumentary/English/fullDocInterfaceEng.swfhttp://www.hhmi.org/coolscience/resources/SPT--FullRecord.php?ResourceId=37

7CEASUL DE CONTROL AL CICLULUI CELULAR

http://outreach.mcb.harvard.edu/animations/checkpoints.swfIn mod normal proliferarea este programata prin modul de exprimare a genelor in diferite momente ale ciclului celular si reglata de 3 categorii de factori: factorii de crestere (TGF = transforming growth factor, factori ce stimuleaza receptorii tyrosin kinazici)

factorii de inhibitie a cresterii

hormoniPROCESUL NORMAL DE REPARARE A ADN-ul

Structura ADN-ul este periodic modificata de diferiti factori:exogeni (carcinogeni chimici, lumina UV, etc) endogeni (reactii de tip oxidativ, deaminarea citozinei, etc).

In mod normal, interventia mecanismele de control al diviziunii celulare repara alterarea ADN-ului prin:Indepartarea dimerilor de pirimidina indusi de radiatii UV Excizia zonei in care s-a produs o ruptura a lantului si refacerea lungimii secventei normaleRepararea exciziei bazelor care a dus la formarea unor locusuri apurinice sau apirimidiniceRepararea prin excizie a nucleotidelor modificateO6-alkilguanine-ADN alkiltransferaza recunoaste si indeparteaza fragmente alchil de dimensiuni mici (alkyl adducts) din lantul de ADN

TELOMERIICelulele umane normale parcurg un numar finit de diviziuni celulare in culturi si, in final, nu se mai divid ( senescenta replicativa). Numarul de diviziuni celulare atins inainte de senescenta este de aprox. 50. O diferenta intre celulele tinere si cele senescente care continua sa se replice este lungimea cozilor/capetelor/ tails specializate ale capetelor cromozomilor, numite telomere. Celulele tinere au telomere mai lungi. Telomerele sunt alcatuite in medie din 5,000 -15,000 de perechi de baze repetate ce contin secventa (TTAGGG)n impreuna cu proteinele care leaga telomerul. In timpul fiecarei diviziuni, sunt pierdute 50-100 de perechi de baze si se emite un semnal celular de oprire a diviziunii.

ROLUL TELOMERAZEI

Telomeraza este un complex ribonucleoproteic care contine mai multe proteine si ARN. Componentul catalitic al acestui complex este o reverse transcriptaza (= enzima ce permite formarea de duble catene de ADN din monocatena-matrita de ARN), hTERT, care foloseste ARN-ul continut in complex ca matrice pentru reverse transcriptia necesara replicarii secventelor de ADN din telomere. Rolul principal al telomerazei: mentinerea lungimii telomerelorCelule germinale si celulele pluripotente au activitate telomerazica; telomeraza isi inceteaza activitatea in celulele din majoritatea tesuturilor, pe masura ce acestea se diferentiaza. Cele mai multe cancere umane par a fi capabile sa reactiveze activitatea telomerazica, reluandu-si capacitatea proliferativa; totusi 10%-15% din cancere nu exprima telomeraza si, aparent, mentin lungimea telomerului printr-un mecanism diferit.

MODIFICARI FENOTIPICE IN ONCOGENEZA(Stephen J. McPhee si Garry D Hammer)instabilitatea genomica: alterarea repararii ADN-ului, controlul aberant al punctelor de control ale ciclului celularcresterea proliferarii: crestere autonoma, anomalii ale controlului ciclului celular, raspunsul exagerat la factorii de stimulare a cresterii sau hormonali, lipsa de raspuns la factorii de contact sau inhibitori sau la factorii de inhibare a cresteriievitarea raspunsului imun: modulare sau mascare antigenica, sinteza de molecule antagoniste raspunsului imuninvazia tisulara si a stromei: atasare de matricea extracelulara, secretia de enzime proteolitice, recrutarea de celule mezenhimale care sa secrete enzime proteolitice, pierderea adeziunii celulare dobadirea capacitatii de a trece in sange si sistemul limfatic: cresterea motilitatii celulare, recunoasterea secventelor proteinelor endoteliale, modificari ale citoscheletuluiformare de metastaze: adeziune celulara si atasare celulara, tropism specific de tesutabilitatea de neoformare vasculara permite cresterea tumorii primitive si a celor secundarerezistenta la medicatie: metabolism alterat al medicamentelor, inactivarea medicamentelor, cresterea sintezei enzimelor tinta, cresterea efluxului de medicamente. Modificarea procesului de reparare a ADN-ului

INSTABILITATEA GENOMICAInstabilitatea genomica este generata de pierderea controlului normal asupra activitatii genelor, ducand in final la pierderea controlului asupra ciclului celular si la proliferare aberanta. Controlul genetic se realizeaza prin factorii de transcriptie, proteine care se leaga de multiplele locuri de legare situate in genomul normal: inaintea situsului de unde incepe transcrierea, ce contine structuri de legare a ARN-polimerazei (promotorii)la distanta variate (uneori la mare distanta) de gena tinta a transcrierii (amplificatorii = enhancers). Exista factori de transcriere universali, care se leaga specific de un enhancer in toate celulele din organism si factori de transcriere cu specificitate de actiune celulara, care actioneaza doar in anumite tipuri particulare de celule.

In neoplazii instabilitatea genomica se refera la o tendinta crescuta de aparitie a alterarilor in genom in timpul ciclului celular. Instabilitatea genomica este minimizata de 4 mecanisme: replicarea fidela a ADN-ului in faza S, segregarea corecta a cromozomilor in mitoza, repararea perfecta a alterarilor sporandice ale ADN-ului si o coordonare buna a progresiei ciclului celular. Zhiyuan Shen, Genomic instability and cancer: an introduction, Journal of Molecular Cell Biology (2011), 3, 13 | 1

13GENE IMPLICATE IN ONCOGENEZAGENE TUMOR SUPRESSORConfera un avantaj de crestere a celulelor neoplazice prin pierderea unor functii normale a celulei Sunt gene care in mod normal normal opresc progresia ciclului celular : ex p 53, gena Rb, genele BRCA1 si 2In absenta fenomenului de imprinting, in cazul tumor supressor genes, ambele alele trebuie sa prezinte modificarea.

PROTO-ONCOGENE Confera un avantaj celulei neoplazice prin castigarea unei functii inexistenta in celula de initiala, de provenienta. Sunt gene normale care sufera mutatii: de ex. ale factorilor de crestere celulara sau a cascadei cyclin ciclazelorPentru oncogene mutatia este de obicei la nivelul unei singure alele.

gene care confera un avantaj competitiv celulei neoplazice fata de celula de origineMECANISMUL DE ALTERARE GENICA CE DUCE LA ONCOGENEZATUMOR SUPRESSOR GENES Trebuie sa fie inactivate pentru a le anula functia specifica celulara. Inactivarea se realizeaza prin:frame-shift mutation deletia unei parti sau a totalitatii geneisilencing-ul genei secundar metilarii

PROTOONCOGENELEProtooncogenele trebuie sa fie activate, functia lor nefiind prezenta in celula normala. Activarea se realizeaza prin: mutatiiamplificare genica sau supra- exprimare translocare cromozomialainsertia unui material viral in genom

TUMOR SUPRESSOR GENESEXEMPLEGena RbGena p53 are rol in reglarea ciclului celular: BRCA1si 2 cu rol in repararea ADN dublu catenar (DNA ds-break repair). Mutatii ale lor sunt responsabile de majoritatea cancerelor de san familiale (5-10% din cancere la san) si ovariene familiale (8% din totalul cancerelor ovariene). Transmiterea este autosomal dominanta. BRCA2 se asociaza cu un RR intre 50 si 100 pentru cancerul la san la barbati, de 5 pentru cancerul de prostata sau pentru cel de vezica biliara, de 4 pentru cancerul pancreatic si de 3 pentru melanomul malign si cancerul de stomac.

GENA p53 permite recunosterea ADN-ului modificat si incetineste ciclul celular pana la repararea ei sau declanseaza activarea mecanismului de moarte programata a celulei (apoptoza)Gena pentru P53 este localizata pe cromozomul 17 (bratul scurt, 17p13), o regiune care sufera frecvent deletii in cancer.

Gena p53 umana are 22 000 bp , cu11 exoni (albastru ) codificand un ARN m de 2.2 Kb. Translatia incepe la exonul 2. Dimensiunile exonilor si intronilor sunt redate in bp.REPARAREA ADNROLUL p53

p53 este un factor de transcriptie, dar, in mod normal este foarte instabila si nu se acumuleaza suficient pentru a activa transcriptia. Nivelul p53 este mentinut scazut prin legare de alte proteine (MDM2, COP1, PIRH2 sau JNK) care ii si promoveaza degradarea pe calea ubiquitin/proteazomilor. MDM2 blocheaza transcriptia genei p53. Cele mai multe gene ale acestei cai sunt reglate de p53, formand o bucla de feedback negativa. Alterarea ADN stabilizeaza p53, crescandu-i concentratia. Una din genele a carei transcriptie o stimuleaza p53 codifica p21CIP, un inhibitor de cyclin- kinaza (CKI) care leaga si inhiba complexele Cdk-cyclina. Ca rezultat, celula este blocata in G1 (si G2) pana leziunea ADN-ului este reparata si nivelul p53 scade (ducand la scaderea p21CIP). In acest fel, cyclin-kinazele isi pot relua activitatea.Daca leziunea ADN este extinsa, p53 dicteaza apoptoza celulei respective.p53, denumita astfel deoarece codifica o proteina fosforilata cu GM = 53 kDa. Proteina p53 functioneaza atat la nivelul punctului de control G1 (unde poate opri ciclul celular) cat si in punctul de control G2.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21719/18Celulele cu p53 functionala se opresc in G1 sau G2 dupa expunere la radiatii, in timp ce celule fara p53 (mutante) continua diviziunea.

Distributia celulele umane in cultura a celulelor in G1, S, si G2 a fost determinata prin analiza continutului in ADN masurat prin fluorescentaREPARAREA ADN ROLUL p53Dupa un stres genotoxic sau non-genotoxic , activarea p53 se produce in doua etape: initial nivelul proteinei p53 creste prin inhibarea interactiuni ei cu mdm2 si alti reglatori negativi. Supra-translatia ARN-ului pentru p53 va asigura apoi acumularea p53. In al doilea rand, o serie de modulatori (kinaze, acetilaze) activeaza activitatea transcriptionala a p53.

Calea p53 a fost impartita conventional de Levine in 5 componente: Semnalul stresor: activeaza calea Mediatorii upstream: detecteaza si interpreteaza semnalele upstream Reglarea p53: interactiunile cu proteinele care ii moduleaza stabilitatea Evenimentele downstream: activarea transcriptiei si interactiunile proteina-proteina Rezultatul final: blocarea cresterii, apoptoza sau repararea ADN.

John Wiley & Sons, Inc.21GENA RbGena Rb este cunoscuta ca gena a retinoblastomului, o tumora a ce apare la copiii care poarta aceasta gena. Descoperita initial la familiile purtatoare ale acestei gene, este o gena recesiva mutata sau pierduta in retinoblastom. Gena complexa : 200 kb cu 27 exoni si introni cu dimensiuni intre 80bp - 60kbCodifica o fosfoproteina nucleara ce controleaza ciclul celular in G1. Aceasta se leaga nespecific de ADN, factori de transcripte (E2) sau de complexele proteice (trithorax group) implicate in reglarea ciclului celular.GENA RB este activa doar in jurul punctului de restrictie R al fazei G1. Inainte de punctul R din G1: Rb actioneaza ca un represor activ al cresterii celulareDupa punctul R d in G1: Rb devine un represor hiperforsforilat inactiv al cresterii (faciliteaza progresia in ciclul celular). Stimulii care cresc fosforilarea o inactiveaza.La sfarsitul mitozei Rb este defosforilata. MG1G2SRRbRbPPPPPPactiverepressorInactiverepressor23pRB ROL IN REGLAREA CICLULUI CELULAR

John Wiley & Sons, Inc.In urma legarii de proteinele E2F este inhibata transcriptia enzimelor care faciliteaza progresia in ciclul celular (ciclinele)24

John Wiley & Sons, Inc.In faza tardiva a ciclului celular, proteina Rb (pRB) fosforilata elibereaza E2F si genele tinta devin active25

John Wiley & Sons, Inc.26MECANISMELE DE INACTIVARE A GENEI RBMutatie ce elibereaza factorii proteici asociatiSechestrarea Rb de catre oncoproteinele virale, impiedicandu-i legarea de alti factori .SV40 T antigenadenovirus E1APapillomavirus uman E7Fosforilarea de catre complexele CDKcyclina in timpul ciclului celular ii anuleaza abilitatea de a se lega de complexele thorax group. Degradare prin proteoliza dependenta de caspaze in timpul apoptozei.

27RETINOBLASTOMUL SI MODELUL CARCINOGENEZEI IN DOUA ETAPE pentru genele tumour supressorKnudson: gena RAS (a retinoblastomului) este inactivata in 2 etape si de aceea:In cazurile familiale: frecventa retinoblastomului este mare si boala are debut precoce: In aceste cazuri retinoblastomul este datorat unei mutatii germinative a unei alele Rb + peste care se suprapune o mutatie dobandita a celeilalte alele ambele alele devin inactivateIn cazurile sporadice (frecventa mica, debut tardiv): retinoblastomul apare si necesita aparitia succesiva (intre care exista un interval de timp variabil) a 2 mutatii somatice dobandite la ambele alele ambele alele devin inactivate******mut.mut.earlyonsetlateonset28http://www.google.ro/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=7&cad=rja&ved=0CE0QFjAG&url=http%3A%2F%2Fwww.uio.no%2Fstudier%2Femner%2Fmatnat%2Fibv%2FMBV4230%2Fv05%2Fundervisningsmateriale%2F17-MBV4230-05%2520Rb.ppt&ei=2RV0UfCCMMPx4QSc6YHYBw&usg=AFQjCNHuKPEmh-DVqtwQ0LPHj28gElVwjQ&sig2=3FOPYF6Iaspc38VaWO570A&bvm=bv.45512109,d.YmsGENELE BRCA1 SI BRCA2BRCA1 este situata pe cromozomul 17q21 iar BRCA2 pe cromozomul 13q12.Codifica proteine mari, cu 1,863 si respectiv 3,350 de amino acizi, continand fiecare din ele peste 20 de exoni.Elemente comune cu alte gene: domeniul BRCT al capatului C-terminal al BRCA1, un domeniu intalnit in peste 40 de alte gene si asociat raspunsului la alterarea ADN-ului. Rol biologic:Un semnal al alterarii ADNUn efector al repararii ADN sau al punctelor de control ale diviziunii celulareAbsenta lor nu e compatibila cu supravietuirea (exp pe soarece) embrionului, iar deletia experimentala partiala determina aparitia de neoplaziiReglator al complexului BASC

G1- Gap 1- celula cresteS- faza de sinteza a ADNG2 Gap 2 celula se pregateste de diviziuneM- mitoza (diviziunea celulara)COMPLEXUL BASCBASC = BRCA1- associated genome-surveillance complex. Include multiple proteine (printre care ATM ataxia teleangiectazia, MSH2, MSH6, Rad50-MRE11 - Meiotic Recombination-11, RFC (DNA Replication Factor-C, etc.)Rol: Regleaza transcriptia, moduland nivelul p53 si a proteinei de reparare a ADN, RAD51; intervin in reglarea proteinelor ATM ce controleaza fosforilarea mai multor proteine ce actioneaz in punctele de control si in repararea ADN cum sunt: p53, MDM2, NBS1si al kinazelor CHK2 (cell-cycle-checkpoint kinase 2). ATM fosforileaza BRCA1 dupa tratament cu radiatii ionizante, ca feedback pozitiv Intervine post translatie implicat in remodelarea cromatinei site-urile ADN alterate care permit accesul proteinelor efectoare.

BRCA1/2 in repararea ADNNature review, vol: 4, 2004

MODEL AL CASCADEI DE SEMNALE MEDIATE DE ATM SI ATR DUPA ALTERAREA ADN (A.Tutt si A. Ashworth)

ATM regleaza raspunsul in mai multe puncte de control: punctului de control G1-S prin: cresterea activitatii p53, fie prin forsforilare directa, fie indirect prin fosforilarea reglatorului sau negativ , MDM2 punctului de control al fazei S reprezentat de kinaze CHK1 si CHK2. Acestea determina o crestere a transcriptiei inhibitorului p21 dependent de ciclin kinaza (CDK) si in final blocarea celulei. Fosforilarea CHK1 si CHK2 e mediata prin Cdc25C fosfataza. punctul de control G2M: blocarea lui este mediata de activarea transcrierii de catre p53 a 14-3-37 si GADD45 sau via CHK1 si CHK2 kinazelor, care inhiba Cdc25 fosfataza (care ar activa complexului Cdc2-B1-ciclina).

ATM = gena mutata a bolii ataxie-teleangiectazie ATR = gena ataxie teleangiectazie legata de Rad3ATM si ATR au atat roluri distincte cat si roluri care se suprapun.

MODEL AL CASCADEI DE SEMNALE MEDIATE DE ATM SI ATR DUPA ALTERAREA ADN (A.Tutt si A. Ashworth) ATM si ATR fosforileaza BRCA1: acest proces e important atat in repararea rupturilor lanturilor duble de ADN prin recombinare omologa si blocarea celulei in punctul de control G2-M, posibil prin stimularea GADD45. ATM fosforileaza NBS1 care este implicat in repararea DS8 (cand formeaza un complex cu MRE11 si RAD50) si ar putea fi implicata in controlul punctului de control al fazei S.ATM poate fosforila si c-BL-kinaza, care fosforileaza apoi RAD51 (un efector de reparare omolog), c-ABL si PK-ADN-dependenta se fosforileaza reciproc influentand interactiunea PK-AND cu proteinele de reparare DS8 implicate in jonctiunile terminale non omologe. (NHEJ)

PROTO-ONCOGENELEGene ce confera un avantaj competitiv de crestere celulelor neoplazice printr-un mecanism de castigare de functii celulare suplimentareMecanisme de aparitie a protoconcogenelor:Mutatii : exemplu, mutatia punctiforma a genei RasInlaturarea domeniului de reglare al genei (frecvent prin translocare)Translocarea: O gena non latenta (non quiescent) care promoveaza cresterea celulara poate fi dizlocata in timpul translocarii cromozomiale langa un enhancer gena devine activa (in mod patologic, deoarece rolul ei era sa fie inactiva) controlul cresterii celulare este pierdut. Amplificare: replicarea in exces, aleatorie, a unor regiuni din genom; ex copii multiple de ras se gasesc in anumite tumori.Insertie de oncogene virale

Exemplu de translocare a genei mycPROTO-ONCOGENELEUn mecansim de aparitie a oncogenele este insertia unui material viral in genom.Exemple: virusurilor HLTV 1 pentru leucemiile cu celulel T sau limfoame, virusului hepatitei B pentru carcinomul hepatocelular sau HPV pentru cancerul de col uterin. Retrovirusurile (virusuri ARN): o oncogena este transferata celulei gazda dupa ce a suferit o modificare: de exemplu in timpul transferului genei src (virusul sarcomului Rous) care codifica protein tirozin kinaza, se pierd secventele 3 ale genei si rezultatul este cel al unei proteine a carei sinteza celulara nu mai este controlata strict, devenind foarte activa si ducand la multiplicare celulara necontrolata. Virusurile ADN pot contine oncogene care sintetizeaza proteine ce inactiveaza semnalizatorii reglatori negativi ai celulei, cum ar fi p53 sau Rb.

FUNCTII ALE ONCOGENELOROncogenele pot realiza pentru celula maligna diferite functii care sa ii asigure multiplicarea si sinteza de proteine care sa ii medieze migrarea si metastazare, cum sunt:factorii de crestere (exemplu, Epithelium growth factor EGF , and platelet derived growth factor PDGF)receptorii pentru factorii de crestere (Exemplu; PDGFR)factorii de transductie celulara (exemplu; Ras, Raf, & MEK)factorii de transcriptie (exemplu; Jun, Fos, Elk-1 & myc)RASGenele RAS sunt cele mai frecvente oncogene intalnite in tumorile maligne umane (30% din neoplazii), in special in cancerele pancreatice, colorectale, endometriale, pulmonare si in cel de col uterin. Cele 3 gene RAS codifica 4 proteine (HRAS, NRAS, KRAS (4A and 4B). Denumirea genei provine de la rat sarcoma.Proteinele RAS sunt localizate pe suprafata interna a membranei celulare. Functioneaza ca GTP-aze care cupleaza factorii de crestere celulari membranari la mecanismele de semnalizare intracelulara a transcrierii, controland astfel multiple procese celulare care:mentin integritatea citoscheletului actinic, contribuie la proliferarea, diferentierea, adeziune celulara si migrare celularaProteinele RAS sunt activate in mod normal de peste 20 de proteine efectoare. Mutatia genelor poate duce la activarea independenta de semnalul factorilor de crestere.IMPLICATII ALE UNEI MUTATII PUNCTIFORME A GENEI K-Ras

SEMNALIZAREA INTRA SI INTERCELULARA MODIFICATA PATOLOGIC

NOTIUNI GENERALECele mai multe mecanisme fiziopatologice in oncogeneza presupun modificarea la un anumit nivel a cailor de semnalizare intracelulara. In mod normal, semnalizarea intra celulara este un proces generat de variate influente externe: factori de crestere proteine din matricea extracelulara hormonicitokine factori care influenteaza mobilitatea factori care influenteaza adeziunea celulara.

NOTIUNI GENERALEIn principiu, activarea unui receptor:Genereaza nu doar un singur efect biologic, ci o cascada de evenimente celulare cu exprimari fenotipice diferite. Aceste fenomene distincte sunt reglate in interiorul celulei de unul sau mai multi adaptori de cele mai multe ori o proteina cu multe domenii de interrelatie cu alte proteine dar si cu structuri lipidice.In celule diferite, acelasi ligand poate avea efecte diferite.Un semnal al unei cai metabolice poate afecta rezultatul unei alte alte cai metabolice, fenomen descris ca cross talk. Activarea unui receptor duce la activarea simultana a cailor de inactivare a cailor activate, dupa o anumita perioada de la semnalul initial.

RECEPTORII TIROZINKINAZEI (RTK)includ 90 de membrii. Cei mai bine caracterizati sunt receptorii pentru:factorul de crestere derivat din plachete (platlet derivated growth factor = PDGF), factorul de crestere epidermic (epidermal growth factor = EGF) efrina (ephrin) factorului de crestere hepatocitar (HGF)factorului de crestere pentru fibroblasti (FGF) insulina. Structura generala a RTK include 3 componente: un lant polipeptidic extracelular (monomeric pentru cei mai multi), o structura hidrofoba transmembranarao portiune citoplasmatica ce contine atat domeniul kinazic (un set distinct de residuuri de tirozina) cat si alte secvente care regleaza reciclarea si/sau turnover-ul receptorului si interactiunea cu moleculele semnalizatoare.

CALEA RECEPTORULUI TIROZINKINAZEIReziduurile fosforilate ale portiunii tirozinei citosolice a receptorului activat interactioneaza cu proteine adaptor ce contin grupari SH2 si situsuri de legare proteica.

In general, activarea lui presupune dimerizarea portiunii extracitoplasmatice juxtapunerea a doua domenii catalitice transfosforilarea reziduurilor tirozinei din bucla de activare a domeniului kinazic (autofosforilarea) + altor zone din domeniul intracelular. Fosforilarea initiaza modificari conformationale care favorizeaza legarea ATP de receptor si substrat; fosfotirozinele folosesc ca situsuri de legare pentru alte proteine implicate in semnalarea mediata de RTK. CALEA RECEPTORULUI TIROZINKINAZEI

Proteinele adaptor cupleaza RTK activati cu alte componente ale caii de semnalizare dar nu au ele insele proprietati de semnal. De ex. GRB2 (o proteina citoplasmatica) este un astfel de adaptor. Este o proteina care contine doua domenii SH2. Legarea ei de reziduul tirozinic specific este urmata de legarea si activarea Sos, proteina ce functioneaza ca o proteina schimbatoare de guanin nucleotid, convertind RAS intr-o forma activa. RAS este legata de ADP in forma inactiva si devine activa sub actiunea unui factor de schimb guanin nucleotid; forma activa se transforma in cea inactiva prin hidroliza GTP. Recrutarea si fosforilarea proteinei adaptor Shc, impreuna cu legarea subiacenta a Grb2/Sos, permite caii Ras/MAPK sa devina activa. MAPK fosforileaza multe proteine, inclusiv factori de transcriere

ACTIVAREA RASRAS activata stimuleaza mai multe cai de semnalizare:Recruteaza serine/threonine kinaza Raf din membrana citoplasmatica, care apoi, tot prin fosfolirare, va activa MEK 1 si 2, kinaze care fosforileaza specific reziduurile treonina si tirozina ale MAP kinazei, activandu-le capacitatea catalitica (ERK este un alt acronim pentru MAP= Extracellular Signal-regulated Kinase-1.) MEK se leaga de domeniul C-terminal catalitic al Raf si este fosforilat de Raf serine/ threonine kinaza; aceasta fosforilare declanseaza activitatea catalitica a MEK. In acest fel, activarea Ras induce o cascade kinazica ce include Raf, MEK, si MAP kinaza.O alta importanta clasa recrutata este clasa IA fosfatidil inozitol 3 kinaza (IA PI 3-K), care se asociaza direct cu receptorul prin intermediul domeniului SH2; cele 3 clase de IA PI 3-K sunt implicate in sinteza celulara, declansarea ciclului celular, supravietuirea celulara, proliferare, metabolism, autofagie, geneza ribozomala, translatia ARNm. Alte semnale efectoare mai selective pentru RTKs cum sunt PDGFr includ fosfolipaza Cg, protein adaptor Nck, si tirozin fosfataza Shp2, ca si reglatorii negativi Ras-GAP si Cbl.

ACTIVAREA RASRAS prezinta mutatii in 40-90% din neoplazii: frecventa cea mai mare de mutatii se intalneste in cancerele pancreatice (90%). Proteinele mutante din neoplazii permit legarea guanin nucleotidului de RAS dar nu si hidroliza acestuia, determinand in consecinta o stare de continua activare care duce la transformarea neoplazica prin proliferare celulara in absenta stimulului generat de factorii de crestere. In unele forme de cancere au fost identificati RTKs asociati cu forme mutante de receptori pentru factorii de crestere care trimit un semnal de proliferare la celule in absenta factorului de crestere. Un astfel de mutant, codificat intr-un nou locus, contribuie la proliferarea necontrolata a unor cancere la san.

CALEA Ras-MEK-ERK

Ras activata recruteaza serine/treonin kinaza Raf din membrana celulara.Raf, prin fosfolirare, va activa MEK 1 si 2.MEK 1 si 2 sunt kinaze care fosforileaza specific reziduurile treonina si tirozina ale ERK kinazei, activandu-le capacitatea catalitica. ERK induce transcriptia nucleara. In acest fel, activarea Ras induce o cascada kinazica ce include Raf, MEK, si MAP kinaza.Semnalizarea ERK este compartimentalizata in interiorul celulei. Sunt necesare molecule distincte de activare in membrana celulara (KSR), in endozomi (MP1), si in aparatul Golgi (Sef). ERK activat in membrana citoplasmatica si endozomi poate tinti atat moleculele citoplasmatice cat si pe cele nucleare. ERK activat in aparatul Golgi este retinuta in citoplasma de Sef si deci nu poate actiona decat in citoplasma.

http://www.rndsystems.com/mini_review_detail_objectname_MR04_ERKSignalTransduction.aspx49MODIFICARI EPIGENETICE

NOTIUNI GENERALELoci genetic activi sunt eucromatine, in timp ce heterocromatina (compacta) e inactiva. DNA are o lungime de 1.8 m si este comprimat la scara 1:400000 in nucleu. Cromatina este organizata in nucleosomi de catre histone. Fiecare nucleosom, contine un octamer de histone inconjurate de ADN. Un nucleozom, impreuna cu legaturile lui, impacheteaza 200 de perechi de baze (66 nm). Nucleosomii sunt infasurati prin rasucire in cromatina, ca o funie cu grosimea de 30 nm. Pentru ca informatia genetica sa poata fi copiata, zona de cromatina trebuie sa fie spatiata (relaxed).Modificarile conformationale pot duce la modificari ale promotorilor, enhacerilor sau la modificari de exprimare a unor gene.

MODIFICARI EPIGENETICEMetilarea DNA la nivelul cytosinei in insulele CpG este un alt mecanism de reglare a expresiei genice. In general, secventele hipermetilate ale ADN-ul sunt mai putin exprimate iar secventele hipometilate sunt mai bine exprimate. Insulele CpG sunt secvente scurte bogate in dinucleotide CpG si se gasesc in zonele reglatoare 5 din aprox. jumatate din genele umane. Alterarea patternului de metilare a ADN apare in liniile celulare tumorale, pe modele animale de tumori, si in cancerele umane.Hipermetilarea ADN poate duce la pierderea functiei tumour supressor genes. Ex: Hipermetilarea secventelor de reglare a unor gene cum ar fi p53, p15, p16, E-cadherin, vhl, and hmlh1, fiind una din cauzele tacerii (silencing ) genelor supresoare tumorale. Secvente CpG metilate aberant sunt detectate in ser si in tesuturile pacientilor cu cancer colorectal, pulmonar, hepatic si de prostata.

Metilarea ADNDeacetilarea histonelorImprintingMODIFICARI EPIGENETICE ACETILAREA HISTONELORIn conformatiile in care histonele impacheteaza strans ADN-ul, transcriptia acestuia in mRNA) este inhibata. Initierea transcriptiei genelor necesita o desfasurare partiala a miezului octameric, care este reglat de modificari biochimice ale histonelor centrale. Unele evenimente de amutire a genelor necesita atat deacetilare cat si metilarea ADN

MODIFICARI EPIGENETICE ACETILAREA HISTONELORGene implicate in acetilarea/ deacetilarea histonelor :2 categorii de gene asociate acetilarii: hat1 and hat2. De ex. Acetilarea histone H4 reduce afinitatea cozii aminoterminale a ADN si permite o reducere a infasurarii ADN-ului in jurul octamerului format de histone. In acest fel scade densitatea impachetarii nucleozomului. Aceasta face ca mai multe secvente ale ADN sa fie disponibile pentru transcriptie. Deacetilarea histonei H4 de catre deacetilaza (HDAC1 and HDAC2) creste afinitatea H4 pentru DNA si duce la o mai stransa infasurare a nucleozomilor si o reducere a transcriptiei. Membrii ai familiilor de gene HDAC1 and HDAC2 apartin unei retele de gene reglate in mod coordonat, gene care sunt implicate in remodelarea cromatinei in timpul diferentierii celulare. Unele evenimente de amutire a genelor necesita atat deacetilare cat si metilarea ADN

PIERDEREA IMPRINTING-ului GENOMICIn mod normal, imprinting- ul genomic este o modificare epigenetica a genomului care permite sa fie exprimata numai o singura alela (fie doar cea materna, fie doar cea paterna). Pana in prezent sunt identificate aprox. 30 de gene de mamifere care pot suferi fenomenul de imprinting. In cancer, poate apare pierderea imprinting-ului (LOI), care permite exprimarea ambelor alele (si a celei materne si a celei paterne). Daca fenomenul apare pentru un factor de crestere, cum ar fi insulin-like growth factor-2 (IGF-2), celule dobandesc o doza dubla de semnal de stimulare a cresterii. LOI al IGF-2 a fost observat in aproximativ 45% din pacientii cu cancer colorectal. LOI al IGF-2 a putut fi detectat si in leucocitele circulante ale acestor pacienti sugerand ca este o alterare care precede inceputul neoplaziei si ca ar putea fi folosita ca un test de screening al susceptibilitatii pentru cancer.

PIERDEREA IMPRINTING-ului GENOMICIn mod paradoxal, LOI este reversibil prin efectul unor medicamente care sunt inhibitori ai metiltransferazelor ADN-ului, cum este 5-aza-2-deoxycytidine, sugerand ca LOI este indus de un eveniment de metilare a ADN-ului aberant. LOI al genei igf2 pare sa fie implicata in progresia tumorii, ducand la un fenotip mai invaziv.

CLASIFICAREA TUMORILOR MALIGNE

CLASIFICAREA CLASICA A TUMORILORTumorile se clasifica in:tumori benignetumori maligne. Caracterele de benignitate sunt date de: asemanarea morfologica cu celulele normale lipsa de mitoze aberante, modificari cromozomiale lipsa de metastazare si existenta chiar a unei capsule care o delimiteaza foarte bine (element care nu e insa obligatoriu).Practic o tumora benigna este un tesut alcatuit din celule normale care si-au pierdut capacitatea de reglare a proliferarii si care se reproduce in exces. Complicatia majora a tumorilor benigne este compresia pe care o exercita asupra structurilor din proximitatea lor. Histologic, tumorile benigne sunt compuse din celule asemanatoare cu celulele mature ale tesutului respectivCu cat apar mai multe modificari fata de celulele normale cu atat celula ce compune tumora maligna este mai agresiva: aceea se vorbeste de grade de malignitate. Intreagul efort de clasificare al tumorilor are ca scop stabilirea locului tumorii respective pe scara dintre benign si malign.

TUMORILE MALIGNEHistologic, tumorile maligne sunt compuse din celule:care pastreaza doar in mica masura structura si functiilor tesutului de provenienta (cu cat sunt mai apropiate de celule mature cu atat gadul lor de malignitate este mai redus), se divid mult mai repede (un raport intre nucleu si citoplasma in favoarea nucleului), prezinta nucloli vizibili la microscopul optic, ca marker al multiplelor mitoze, prezinta relativ putine structuri de celula matura. dau metastaze la distanta; uneori, chiar si pe sectiunile histologice clasice se constata ruperea membranelor bazale sau extravazarea lor ca prim pas spre metastazare. Pe baza originii embriologice primitive ( in stadiile initiale ale dezvoltarii embrionului, se disting trei straturi: ectodermul, mezodermul si endodermul) tumorile se clasifica in:Carcinoame: Neoplaziile dezvoltate din celule ce apartin ectodermul si endodermulSarcoame: Neoplazii dezvoltate din celule derivate din mezoderm. Malignitatile celulelor sanguine desi ar trebui sa apartina sarcoamelor, sunt clasificate separat in malignitati ale sangelui (leucemii si limfoame).Dupa gradul de invazivitate:Carcinoamele se impart in: carcinoame in situ (nu depasesc membrana bazala a tesutului respectiv)carcinom invaziv depasesc membrana bazala, dar nu sunt leziuni la distanta si carcinom metastazat exista tumori secundare.Sarcoamele sunt claisficate dupa polimorfismul nuclear si rata mitotica (care determina gravitatea leziunii: un grad mai mare este corelat cu o tendinta mai mare la invazie la distanta).

STADIALIZAREA CLINICA CLASICAStadializarea tumorilor presupune:Stabilirea sediului leziunii primareStabilirea dimensiunii si a numarului tumorilorStabilirea afectarii sau nu a ganglionilor limfaticiStabilire tipului celular si a gradului de diferentiere fata de celula normalaPrezenta sau absenta metastazelor

Tumora primara (T)TX - Tumora primitiva nu poate fi stabilitaT0 - Nu exista o tumora primara evidentiataTis - Carcinom in situ (CIS) T1, T2, T3, T4 - Dimensiunea si/sau extensia tumorii primitive

Ganglioni limfatici regionali (N)NX - Ganglionii limgatici regionali nu pot fi evaluatiN0 - Nu exista ganglioni regionali invadatiN1, N2, N3 - Invadarea ganglionilor regionali (in functie de numarul statiilor ganglionare si /sau a extensiei)

Metastaze la distanta (M)MX - Metastazele la distanta nu pot fi evaluateM0 - Nu exista metastazele la distantaM1 - Exista metastaze la distantaCel mai important element este gradul de diferentiere a celulei neoplazice, impreuna cu consecintele ce decurg de aici: exprimarea sau nu a unor receptori de suprafata, proprietatile imunologice, formarea de proteine. Metodele clasice de histologie au fost completate cu metode de imunohistochimie, determinari de receptori, etc.CONTRIBUTII ALE GENOMICII IN ONCOLOGIE

TESTE DE BIOLOGIE MOLECULARA UTILIZATE IN ONCOLOGIEModificarile mari de aranjare ale unor gene in boala neoplazica sunt studiate prin:analiza citogenetica prin hibridizarea in situ si marcare cu fluoresceina a cromozomilor in metafaza. Este utila daca alterarea genetica este suficient de mare (cum ar fi o deletie importanta), de ex in Leucemia Mielocitara Cronica Modificari medii in aranjarea genelor:Analiza ADN-ului prin electroforeza si Southern blotting pentru analiza citogenetica detecteaza modificari mai mici in structura genelor, pe care studiile de cariotip nu le detecteaza.

TESTE DE BIOLOGIE MOLECULARA UTILIZATE IN ONCOLOGIEModificari de foarte mare sensibilitate:Polymerase chain reaction (PCR) poate detecta alterari in structura ADN cu o foarte mare sensibilitate. O particularizare a acestei tehnici este si tehnica de secventiere prin chip-uri (chip sequencing technique) utilizata in localizarea, izolarea si identificarea secventelor de ADN ocupate de proteine celulare de legare a ADN-ul in mod specific. Aceste site-uri de legare pot indica functiile unor reglatori ai transcriptiei si ajuta la identificarea genelor tinta ale acestor reglatori in timpul initierii si/sau evolutiei bolii. Tipurile de elemente functionale identificate in acest mod includ promotori, amplificatori, represori si factori silencing, izolatori (insulators), elemente de legatura si secvente care controleaza replicarea ADN.

SAGEAnaliza seriata a exprimarii genice (SAGE= Serial analysis of gene expression) permite o evaluare simultana si comprehensiva a multiplelor specii mARN. Spre deosebire de analiza prin microsonde (microarray), SAGE nu necesita cunoasterea anterioara a genelor de interes si furnizeaza date cantitative si calitative teoretic (potential) a tuturor secventelor transcrise intr-un tesut specific sau intr-o celula. Mai mult de cat atat, SAGE poate cuantifica transcripturi in cantitate mica (low-abundance transcripts) si poate sa detecteze in mod pertinent concentratii relativ mici ale diferentelor de concentratii de transcripti intre populatii celulare.

SAGEMetoda SAGE genereaza o secventa tag care functioneaza ca un unic identificator al transcrierii, derivat dintr-o locatie bine definita a transcriptului. Multe tinte ale transcrierii (transcript tags) sunt concatenate intr-o singura molecula si apoi secventiate, relevand identitatea multiplelor tinte simultan. Prezentarea relativa a fiecarui membru in bazele de date (library) SAGE este proportionala cu corespondentul de abundenta a mRNA in populatia de transcriere originala. Profilele de expresie comparativa pot fi deduse prin compararea abundentei tintelor individuale din fiecare set de probe. Aceasta permite modificari in profilele de expresie globale a tesuturilor normale sau maligne in conditiile terapeutice diferite care trebuie rapid evaluate.

PROFILLING TUMOURStehnica de determinare a profilului tumorii monitorizeaza patternul de expresie globala al genelor si a permis dezvoltarea taxonomiei moleculare a cancerului. Se bazeaza pe sondele de ADN colorate in 2 culori si evalueaza simultan mii de transcripti ai genelor si exprimarea lor relativa, furnizand o imagine snapshot a transcriptomului

Stabilirea profilului transcriptional prin utilizarea microsondelor implica screening-ul exprimarii mRNA din doua surse (tumora si celule normale), folosind cDNA complementar sau biblioteci (baze de date) de oligonucleotide aranjate intr-o extrem de mare densitate microchip-uri.

Transcriptom = intregul complement de transcripturi ARN produse la un anumit momentPROFILLING TUMOURSAcestea sunt studiate cu o mixtura de cDNAs marcat fluorescent generat din probele provenite din tumora si din celulele normale o colorare diferita a fiecarei gene (reprezentata in final printr-un punct).Intensitatea relativa a celor doua culori diferite reflecta nivelul de exprimare a RNA a fiecarei gene din fiecare proba asa cum ar fi analizata cu un scanner laser focalizat. Utilizand microsonde, se pot monitoriza sistematic si individualizat gene care constituie markeri de diagnostic, prognostic, sau markeri relevanti pentru terapie. De asemenea, intregul set de gene exprimate poate fi analizat colectiv prin utilizarea unor metode statistice pentru a clasifica tumorile pe baza profilului lor transcriptional.

IDENTIFICAREA IMPLICARII GENELOR BRCAEpidemiologia observationala a cuantificat contributia factorilor genetici si predictia asupra felului in care acesti factori vor actiona separat sau impreuna in cresterea riscului.Modelarea genica (analiza de segregare) - presupune prefigurarea de scenarii despre posibilitatile de aparitie a bolii datorita unor combinatii ale genelor cunoscute sau ipotetice cu un risc, prevalenta si modul de transmitere ereditara cunoscut. Pattern-urile de cancere prezise sunt apoi comparate cu frecventa observata a bolii si in acest fel este validat cel mai bun model.

ANALIZA DE LINKAREIn urma Studiului Cancer and Steroid Hormone s-a definit initial modelul genetic autosomal dominant cu penetranta mare validat prin analiza de linkare si identificat ca BRCA 1 si 2. Acestea sunt gene predispozante la cancer la san cu penetrare mare.Analizele de segreagare ulterioare, mai complexe au evidentiat si alte gene, favorizand modelul poligenic in care factori genetici multipli actioneaza independenti. Componentul poligenic al riscului este log normal distribuit, are o varianta care scade liniar cu varsta si se aplica similar purtatoarelor de mutatii BRCA si nepurtatoarelor.Datele sunt consistente cu observatiile ca excesul de cancer de san familial este distribuit in multe familii, fiecare cu un numar redus de cazuri mai degraba decat in putine familii cu multe cazuri. Studiile de linkaj sunt folosite pentru a mapa un locus al unei boli prin analiza co- segregarii markerilor genomici cu un fenotip specific de boala utilizand probe ale mai multor membrii ale familiilor numeroase. Regiunea din genom din jurul markerilor linkati este integrata pentru posibilitatea de a contine gene cauzatoare (determinante) celor care poarta mutatia. Daca corelatia dintre o gena cu penetranta redusa si cancer este mica status-ul mutatiei la familiile cu mutatia respectiva pozitiva ar putea fi insuficient pentru a genera un semnal.IDENTIFICAREA IMPLICARII GENELOR BRCAScreeningul mutatiilor genelor candidate: deoarece frecventa mutatiilor de acelasi tip este redusa, identificarea genelor implicate se poate realiza doar prin studierea intregii secvente de codificare a genei la un numar foarte mare de cazuri si de controale.Studiile de asociere genomica; pentru demonstrarea unei asocieri statistice este necesara depasirea pragului de 5% de variatie a frecventei in cele doua populatii celulare comparate. Pentru a permite evitarea erorii de asociere, a fost necesar studiului comparativ a zeci de mii de probe. Posibilitatea maparii de mare densitate, la nivel de polimorfism nucleotidic unic precum si a linkajului dezechilibrat (linkage dezechilibrium) a permis identificarea de asocieri semnificative.

UTILIZAREA GENOMICII IN CLASIFICAREA SI STADIALIZAREA TUMORILOR MALIGNEIdentificarea unor mutatii, cum este cea de tip BRCA1 sau 2, permite subclasificarea in tumori fenotipic diferite.De exemplu, tumorile BRCA1 sunt in mod tipic carcinoame ductale de grad inalt de malignitate, invazive, cu un triplu fenotip negativ:Nu se coloreaza pentru ER (receptor estrogenic), Nu se coloreaza pentru PR (receptor progesteronic), si Si nu se coloreaza nici pentru HER2 (ERBB2) (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)Aceste tumori se coloreaza pozitiv pentru un subset de keratine bazale exprimate in mod normal in mioepiteliul normal al sanului. In functie de profilului genomic al celulei maligne se pot face predictii adecvate privind evolutia si prognosticul.Inclusiv modul de selectie al tratamentelor s-a modificat prin contributia adusa de analiza genomului malign.


Recommended