CROMOZOMII CROMOZOMII Structurile celulare care contin ADN Structurile celulare care contin ADN si cele care intervin in realizarea si cele care intervin in realizarea functiilor sale (ribozomii si functiilor sale (ribozomii si centriolii) alcatuiesc centriolii) alcatuiesc Aparatul Aparatul genetic genetic . . Nucleul este elementul principal al Nucleul este elementul principal al aparatului genetic. aparatului genetic. In nucleu fiecare molecula de ADN se In nucleu fiecare molecula de ADN se asociaza cu proteine histonice, asociaza cu proteine histonice, nonhistonice si mici cantitati de nonhistonice si mici cantitati de ARN, formand un complex nucleo- ARN, formand un complex nucleo-
Transcript
CROMOZOMIICROMOZOMIIStructurile celulare care contin ADN si cele care Structurile celulare care contin ADN si cele care intervin in realizarea functiilor sale (ribozomii si intervin in realizarea functiilor sale (ribozomii si centriolii) alcatuiesc centriolii) alcatuiesc Aparatul geneticAparatul genetic..
Nucleul este elementul principal al aparatului Nucleul este elementul principal al aparatului genetic.genetic.
In nucleu fiecare molecula de ADN se asociaza In nucleu fiecare molecula de ADN se asociaza cu proteine histonice, nonhistonice si mici cu proteine histonice, nonhistonice si mici cantitati de ARN, formand un complex nucleo-cantitati de ARN, formand un complex nucleo-proteic denumit CROMATINA.proteic denumit CROMATINA.
Interactiunile dintre ADN si proteine au un rol Interactiunile dintre ADN si proteine au un rol structuralstructural in organizarea supramoleculara a in organizarea supramoleculara a ADN si un rol ADN si un rol functionalfunctional in mecanismele care in mecanismele care regleaza expresia si replicarea genelor.regleaza expresia si replicarea genelor.
Cromozomii sunt elemente dinamice si Cromozomii sunt elemente dinamice si constante ale celulei cu functii genetice constante ale celulei cu functii genetice esentiale.esentiale.
Exceptand procariotele care au un singur Exceptand procariotele care au un singur cromozom circular, la eucariote numarul cromozom circular, la eucariote numarul cromozomilor este caracteristic fiecarei cromozomilor este caracteristic fiecarei specii:specii:
Numarul cromozomilor in celula nu respecta Numarul cromozomilor in celula nu respecta gradul de evolutie biologica si complexitatea gradul de evolutie biologica si complexitatea structural functionala a speciei.structural functionala a speciei.
Ca urmare, numarul cromozomilor nu este un Ca urmare, numarul cromozomilor nu este un criteriu taxonomic de stabilire a pozitiei criteriu taxonomic de stabilire a pozitiei filogenetice, a gradului evolutiei biologice. filogenetice, a gradului evolutiei biologice.
In lumea vie sunt specii inferioare ca evolutie In lumea vie sunt specii inferioare ca evolutie filogenetica dar cu un numar mare de filogenetica dar cu un numar mare de cromozomi ( exemplu crapul are 104 cromozomi ( exemplu crapul are 104 cromozomi pe cand omul 46 cromozomi).cromozomi pe cand omul 46 cromozomi).
ADN reprezinta cel mai important constituent ADN reprezinta cel mai important constituent al cromozomilor eucariotici, in el gasindu-se al cromozomilor eucariotici, in el gasindu-se programul genetic al speciei respective.programul genetic al speciei respective.
Informatia genetica e codificata in Informatia genetica e codificata in macromolecula de ADN, un polimer linear macromolecula de ADN, un polimer linear care contine milioane de nucleotide. Un care contine milioane de nucleotide. Un milion de nucleotide inseamna un segment milion de nucleotide inseamna un segment de ADN cu o lungime de 3,4X10 la puterea 5 de ADN cu o lungime de 3,4X10 la puterea 5 nm, adica 0,034cm.nm, adica 0,034cm.
In cromozomii eucariotelor, ADN-ul In cromozomii eucariotelor, ADN-ul reprezinta 13-16 %, ARN-ul 12-13 % iar reprezinta 13-16 %, ARN-ul 12-13 % iar proteinele histonice si non histonice 68-72 %. proteinele histonice si non histonice 68-72 %.
HISTONELEHISTONELE Sunt proteine Sunt proteine bazicebazice cu o mare afinitate pt cu o mare afinitate pt
ADN prezente la toate eucariotele.ADN prezente la toate eucariotele.
Genele care codifica histonele au o structura Genele care codifica histonele au o structura particulara ( fara introni ) si se afla localizate particulara ( fara introni ) si se afla localizate pe cromozomii 1,6,12 . Se exprima in faza pe cromozomii 1,6,12 . Se exprima in faza SS a a ciclului celular, sincron cu replicarea ADN.ciclului celular, sincron cu replicarea ADN.
La eucariote se deosebesc 5 tipuri de La eucariote se deosebesc 5 tipuri de histone: H1, H2A, H2B, H3, H4. Cu exceptia histone: H1, H2A, H2B, H3, H4. Cu exceptia H1, celelalte tipuri (in special H3,H4) au o H1, celelalte tipuri (in special H3,H4) au o structura stabila, bine conservata in evolutie.structura stabila, bine conservata in evolutie.
H1 - bogata in lizinaH1 - bogata in lizina H2A - bogata in leucinaH2A - bogata in leucina H2B - bogata in serinaH2B - bogata in serina H3 - bogata in arginina si cisteinaH3 - bogata in arginina si cisteina H4 - bogata in argininaH4 - bogata in arginina
Au rol Au rol structuralstructural in compactarea ADN-ului in nucleu, in compactarea ADN-ului in nucleu, intrand in alcatuirea intrand in alcatuirea nucleozomilornucleozomilor, particula , particula fundamentala din structura fibrelor de cromatina.fundamentala din structura fibrelor de cromatina.
Au rol Au rol functionalfunctional fiind implicate in reglarea expresiei fiind implicate in reglarea expresiei genelor (transcriptie). genelor (transcriptie).
Acetilarea histonelor determina activarea unor gene, Acetilarea histonelor determina activarea unor gene, metilarea lor produce represie genica iar fosforilarea metilarea lor produce represie genica iar fosforilarea lui H1 provoaca condensarea fibrilelor de cromatina lui H1 provoaca condensarea fibrilelor de cromatina interfazica in cromozomi si declanseaza mitoza.interfazica in cromozomi si declanseaza mitoza.
Experimental s-a demonstrat ca histonele Experimental s-a demonstrat ca histonele stabilizeaza dublul helix si inhiba sinteza ARN.stabilizeaza dublul helix si inhiba sinteza ARN.
NON HISTONELENON HISTONELE
Sunt proteine Sunt proteine acide si neutreacide si neutre, heterogene si putin , heterogene si putin abundente ( exceptie face grupul proteinelor HMG- “ abundente ( exceptie face grupul proteinelor HMG- “ high mobility group”).high mobility group”).
Majoritatea au rol Majoritatea au rol functionalfunctional intervenind specific in intervenind specific in reglarea activitatii genelor ( ex. HMG participa se reglarea activitatii genelor ( ex. HMG participa se pare la reglarea replicarii ADN). pare la reglarea replicarii ADN).
Unele au rol Unele au rol structuralstructural formand matricea formand matricea cromozomilor.cromozomilor.
Moleculele de ADN si histonele sufera spiralizari Moleculele de ADN si histonele sufera spiralizari succesive alcatuind un sistem ierarhizat de fibre de succesive alcatuind un sistem ierarhizat de fibre de cromatina.cromatina.
La inceputul diviziunii, fibrele de cromatina se La inceputul diviziunii, fibrele de cromatina se spiralizeaza si se condenseaza suplimentar formand spiralizeaza si se condenseaza suplimentar formand cromozomii. La sfarsitul diviziunii, acestia se cromozomii. La sfarsitul diviziunii, acestia se despiralizeaza si persista in interfaza sub forma despiralizeaza si persista in interfaza sub forma filamentelor de cromatina.filamentelor de cromatina.
Deci, cromatina si cromozomii sunt doua modalitati Deci, cromatina si cromozomii sunt doua modalitati diferite de organizare morfofunctionala a diferite de organizare morfofunctionala a materialului genetic in interfaza si diviziunematerialului genetic in interfaza si diviziune
CROMATINACROMATINA Asocierea dintre ADN si proteine se numeste Asocierea dintre ADN si proteine se numeste
cromatina. cromatina. Prezinta diferite grade de condensare si se prezinta Prezinta diferite grade de condensare si se prezinta
sub doua tipuri morfofunctionale distincte : sub doua tipuri morfofunctionale distincte : eucromatina si heterocromatina ( clasificare facuta eucromatina si heterocromatina ( clasificare facuta de E.Heitz in 1928).de E.Heitz in 1928).
EucromatinaEucromatina::
este putin condensata si slab colorataeste putin condensata si slab colorata prezinta mult ADN nerepetitiv bogat in perechi de prezinta mult ADN nerepetitiv bogat in perechi de
baze G-C si proteine nonhistonicebaze G-C si proteine nonhistonice reprezinta partea activa genetic a cromatineireprezinta partea activa genetic a cromatinei se replica precoce la inceputul fazei Sse replica precoce la inceputul fazei S alcatuieste benzile R din cromozomialcatuieste benzile R din cromozomi
HeterocromatinaHeterocromatina
este puternic condensata si intens colorataeste puternic condensata si intens colorata prezinta ADN repetitiv bogat in A-T si histoneprezinta ADN repetitiv bogat in A-T si histone
desi inactiva genetic indeplineste anumite functii desi inactiva genetic indeplineste anumite functii celulare precum : stabilizeaza centromerul si celulare precum : stabilizeaza centromerul si telomerele cromozomului, intervine in desfasurarea telomerele cromozomului, intervine in desfasurarea meiozei ( in sinapsa cromozomilor omologi ) si meiozei ( in sinapsa cromozomilor omologi ) si probabil in diferentierea celularaprobabil in diferentierea celulara
este de doua feluri : este de doua feluri : constitutivaconstitutiva si si facultativafacultativa (clasificare facuta de S.Brown in 1975).(clasificare facuta de S.Brown in 1975).
- Se gaseste constant sub forma condensataSe gaseste constant sub forma condensata
- Nu contine gene functionale si este formata din ADN Nu contine gene functionale si este formata din ADN inalt repetitiv ( ADN satelit)inalt repetitiv ( ADN satelit)
- Se gaseste in regiunea centromerului, pe bratul lung Se gaseste in regiunea centromerului, pe bratul lung al cromozomului Y, pe bratele scurte ale al cromozomului Y, pe bratele scurte ale cromozomilor acrocentrici si in constrictiile cromozomilor acrocentrici si in constrictiile secundaresecundare
- Alcatuieste benzile C din cromozomiAlcatuieste benzile C din cromozomi
- Variaza la celule / organisme diferite: in unele Variaza la celule / organisme diferite: in unele celule, anumite parti sau gene din cromozomi celule, anumite parti sau gene din cromozomi pot fi active, in alte celule, aceleasi structuri pot fi active, in alte celule, aceleasi structuri pot sa nu functioneze fiind sub forma de pot sa nu functioneze fiind sub forma de heterocromatinaheterocromatina
- Aceasta heterocromatinizare poate fi limitata Aceasta heterocromatinizare poate fi limitata la un anumit segment din cromozom sau la un anumit segment din cromozom sau poate cuprinde tot cromozomul ( exemplu poate cuprinde tot cromozomul ( exemplu tipic la sexul feminin cand unul din cei doi tipic la sexul feminin cand unul din cei doi cromozomi X este inactiv formand cromozomi X este inactiv formand corpusculul sexual X).corpusculul sexual X).
NUCLEOZOMULNUCLEOZOMUL
Primul nivelPrimul nivel de organizare supramoleculara a ADN de organizare supramoleculara a ADN (structura primara a cromozomului) este filamentul (structura primara a cromozomului) este filamentul cu nucleozomi cu diametrul de 11 nm. cu nucleozomi cu diametrul de 11 nm.
Nucleozomul (super helixul cromatinian) este Nucleozomul (super helixul cromatinian) este alcatuit dintr-o secventa de ADN (de 146 pb) care se alcatuit dintr-o secventa de ADN (de 146 pb) care se infasoara de aproximativ doua rotatii complete ( 1 tur infasoara de aproximativ doua rotatii complete ( 1 tur si ¾) in jurul unui miez histonic format din 8 histone si ¾) in jurul unui miez histonic format din 8 histone (cate 2 molecule din H2A, H2B, H3, H4).(cate 2 molecule din H2A, H2B, H3, H4).
Nucleozomii sunt legati intre ei printr-un segment de Nucleozomii sunt legati intre ei printr-un segment de ADN liber ( 60 pb) formand un filament asemanator ADN liber ( 60 pb) formand un filament asemanator unui “sirag de margele”. Aceasta structura unui “sirag de margele”. Aceasta structura (mentinuta strans de histona H1 care leaga doi (mentinuta strans de histona H1 care leaga doi nucleozomi vecini) realizeaza o impachetare a ADN-nucleozomi vecini) realizeaza o impachetare a ADN-ului de circa 10 ori.ului de circa 10 ori.
Dimensiunile nucleozomilor depind de organism, Dimensiunile nucleozomilor depind de organism, tesut sau de starea de activitate a genomului celular tesut sau de starea de activitate a genomului celular ( exemplu : cand ADN-ul se replica, nucleozomii se ( exemplu : cand ADN-ul se replica, nucleozomii se deschid pentru ca informatia genetica sa devina deschid pentru ca informatia genetica sa devina accesibila ).accesibila ).
Nucleozomul contine cantitati aproximativ egale de Nucleozomul contine cantitati aproximativ egale de ADN si histone. Masa moleculara a nucleosomului ADN si histone. Masa moleculara a nucleosomului este de cca 262 000 de daltoni, fiind alcatuita astfel :este de cca 262 000 de daltoni, fiind alcatuita astfel :
H1 = 24000H1 = 24000 H2A X 2 = 28000H2A X 2 = 28000 H2B X 2 = 28000H2B X 2 = 28000 H3 X 2 = 30000H3 X 2 = 30000 H4 X 2 = 22000H4 X 2 = 22000 Deci in total histonele reprezinta 132000 de daltoni si Deci in total histonele reprezinta 132000 de daltoni si
ADN diferenta de 130000 de daltoni ( cca 200 pb).ADN diferenta de 130000 de daltoni ( cca 200 pb).
SOLENOIDULSOLENOIDUL Este Este al doilea nivelal doilea nivel de organizare ( structura de organizare ( structura
secundara sau super-super-helixul) sau fibra de secundara sau super-super-helixul) sau fibra de cromatina de 30 nm.cromatina de 30 nm.
Acesta rezulta prin spiralizarea filamentului cu Acesta rezulta prin spiralizarea filamentului cu nucleozomi. Aceasta structura ( cu pasul de 6 nucleozomi. Aceasta structura ( cu pasul de 6 nucleozomi) este stabilizata de histona H1 si nucleozomi) este stabilizata de histona H1 si realizeaza o compactare de 5 ori.realizeaza o compactare de 5 ori.
In solenoid zonele spiralizate alterneaza cu zone In solenoid zonele spiralizate alterneaza cu zone nespiralizate unde se pot fixa o serie de proteine nespiralizate unde se pot fixa o serie de proteine specifice. Totodata prin aceasta noua spiralizare, specifice. Totodata prin aceasta noua spiralizare, diferite regiuni care pe ADN-ul liniar se aflau la diferite regiuni care pe ADN-ul liniar se aflau la distanta, sunt apropiate favorizand interactiunile distanta, sunt apropiate favorizand interactiunile genice.genice.
BUCLA CROMOZOMICABUCLA CROMOZOMICA
Este Este al treilea nivelal treilea nivel de organizare ( structura tertiara de organizare ( structura tertiara a cromozomului) care rezulta prin plierea fibrei de a cromozomului) care rezulta prin plierea fibrei de cromatina de 30 nm in bucle laterale de lungimi cromatina de 30 nm in bucle laterale de lungimi diferite ( 20-100 Kb), formandu-se fibra cu diametrul diferite ( 20-100 Kb), formandu-se fibra cu diametrul de 300 nm.de 300 nm.
Buclele au o dispozitie helicoidala fiind dispuse in Buclele au o dispozitie helicoidala fiind dispuse in rozete hexametrice.rozete hexametrice.
Dispunerea bucleiforma a fibrei polisolenoidice si Dispunerea bucleiforma a fibrei polisolenoidice si conservarea buclelor in cromozomii metafazici sunt conservarea buclelor in cromozomii metafazici sunt determinate de prezenta proteinelor non histonice determinate de prezenta proteinelor non histonice Sc1 si Sc2 ( scaffold”)Sc1 si Sc2 ( scaffold”)
Se considera ca fiecare bucla ar putea fi o unitate Se considera ca fiecare bucla ar putea fi o unitate functionala, de transcriptie si replicare.functionala, de transcriptie si replicare.
STRUCTURA CUATERNARASTRUCTURA CUATERNARA
Este Este al patrulea nivelal patrulea nivel de organizare a cromozomilor de organizare a cromozomilor la eucariotela eucariote
Dupa dispozitia bucleiforma a fibrei nucleoproteice Dupa dispozitia bucleiforma a fibrei nucleoproteice urmeaza un proces de hipercondensare a ADN-ului.urmeaza un proces de hipercondensare a ADN-ului.
Prin spiralizarea fibrei de 300 nm, care are loc in Prin spiralizarea fibrei de 300 nm, care are loc in interfaza, ia nastere fibra de 700 nm care corespunde interfaza, ia nastere fibra de 700 nm care corespunde diametrului unei cromatide.diametrului unei cromatide.
Fiecare cromatida contine o singura molecula de Fiecare cromatida contine o singura molecula de ADN.ADN.
Buclele anterior descrise se vor rasuci suplimentar Buclele anterior descrise se vor rasuci suplimentar in metafaza. Intr-o rasucire de 360 apar aproximativ in metafaza. Intr-o rasucire de 360 apar aproximativ 30 de rozete hexametrice avand drept corespondent 30 de rozete hexametrice avand drept corespondent banda G de pe cromozomii umani. banda G de pe cromozomii umani.
Numarul de rasuciri complete depinde de cantitatea Numarul de rasuciri complete depinde de cantitatea de ADN/cromozom ( ex. la cr 1 ar fi intre 29-33 de de ADN/cromozom ( ex. la cr 1 ar fi intre 29-33 de asemenea rotatii).asemenea rotatii).
In procesele de rasucire participa in jur de 30 de In procesele de rasucire participa in jur de 30 de proteine non histonice HMG, MARs ( matrix proteine non histonice HMG, MARs ( matrix associated regions) sau SARs ( scaffold associated associated regions) sau SARs ( scaffold associated regions). Astfel molecula de ADN sufera o regions). Astfel molecula de ADN sufera o compactare de 10000 ori.compactare de 10000 ori.
NUCLEOZOMULNUCLEOZOMUL
CROMOZOMII BCROMOZOMII B Sunt numiti si cromozomi aditionali Sunt numiti si cromozomi aditionali
complementului normal de cromozomi complementului normal de cromozomi (cromozomi supranumerari)(cromozomi supranumerari)
Au fost identificati la peste 1000 specii de plante Au fost identificati la peste 1000 specii de plante si 260 specii de animalesi 260 specii de animale
Indivizii care au cromozomi B nu se deosebesc Indivizii care au cromozomi B nu se deosebesc fenotipic de indivizii conspecifici lipsiti de fenotipic de indivizii conspecifici lipsiti de prezenta acestor cromozomiprezenta acestor cromozomi
Se numesc B, deoarece prezenta lor nu este Se numesc B, deoarece prezenta lor nu este indispensabila pentru cresterea, dezvoltarea si indispensabila pentru cresterea, dezvoltarea si reproducerea normala a organismelor reproducerea normala a organismelor
Caracteristicile cromozomilor BCaracteristicile cromozomilor B
Morfologie diferita in comparatie cu cromozomii Morfologie diferita in comparatie cu cromozomii A (cromozomi esentiali)A (cromozomi esentiali)
Talie foarte micaTalie foarte mica Contin o cantitate mai mare de heterocromatina Contin o cantitate mai mare de heterocromatina
constitutivaconstitutiva Nu sunt omologi cu cromozomii A normali si nu Nu sunt omologi cu cromozomii A normali si nu
se cupleaza cu acestia in timpul meiozei sau se cupleaza cu acestia in timpul meiozei sau mitozei mitozei
Se mostenesc nemendelian la descendentiSe mostenesc nemendelian la descendenti
Nu contin gene indispensabile dezvoltarii si Nu contin gene indispensabile dezvoltarii si activitatii celulareactivitatii celulare
Efectul lor este cumulativEfectul lor este cumulativ Ca origine, provin din cromozomii A care au Ca origine, provin din cromozomii A care au
suferit o serie de deletii repetate, ce au dus la suferit o serie de deletii repetate, ce au dus la vidarea de ADN a cromozomului initial si vidarea de ADN a cromozomului initial si reducerea considerabila a taliereducerea considerabila a talie
Datorita transmiterii nemendeliene, nr. Datorita transmiterii nemendeliene, nr. cromozomilor B variaza intre indivizii conspecifici cromozomilor B variaza intre indivizii conspecifici ( uneori se constata ca un individ poate prezenta ( uneori se constata ca un individ poate prezenta mai multe populatii celulare care difera intre ele mai multe populatii celulare care difera intre ele prin numarul de cromozomi B).prin numarul de cromozomi B).
Replicarea cromozomilor umaniReplicarea cromozomilor umani In 1957 Taylor a demostrat ca in stadiul S In 1957 Taylor a demostrat ca in stadiul S
interfazic , cromozomii se replica conservativinterfazic , cromozomii se replica conservativ
Replicarea cromozomilor este legata direct de Replicarea cromozomilor este legata direct de replicarea semiconservativa a ADN-ului si de replicarea semiconservativa a ADN-ului si de dublarea cantitatii de histonedublarea cantitatii de histone
Exista mai multe metode: Taylor ( 1957, folosiind Exista mai multe metode: Taylor ( 1957, folosiind timidina tritiata; substanta radioactiva ); Dutrilaux timidina tritiata; substanta radioactiva ); Dutrilaux si Latt ( 1973, folosiind 5-brom-dezoxiuridina, si Latt ( 1973, folosiind 5-brom-dezoxiuridina, BrdU)BrdU)
Experimentul TaylorExperimentul Taylor Se cultiva plante de Vicia Faba in mediu “cald” Se cultiva plante de Vicia Faba in mediu “cald”
bogat in timidina tritiata, timp de 8 ore (timp bogat in timidina tritiata, timp de 8 ore (timp necesar pentru o replicare)necesar pentru o replicare)
Aceasta v-a fi incorporata in ADN-ul cromozomial Aceasta v-a fi incorporata in ADN-ul cromozomial in cursul replicarii acestuiain cursul replicarii acestuia
Se scot plantele din mediul radioactiv; se Se scot plantele din mediul radioactiv; se recolteaza un esantion si se cultiva inca 8 ore pe recolteaza un esantion si se cultiva inca 8 ore pe un mediu “rece” lipsit de precursori radioactiviun mediu “rece” lipsit de precursori radioactivi
Esantionul recoltat ( generatia nr. 1) se trateaza cu Esantionul recoltat ( generatia nr. 1) se trateaza cu colchicina si se face analiza autoradiografica a colchicina si se face analiza autoradiografica a cromozomilorcromozomilor
Dupa introducerea in mediul rece, la fiecare 8 ore Dupa introducerea in mediul rece, la fiecare 8 ore se recolteaza si se examineaza cite 1 esantion se recolteaza si se examineaza cite 1 esantion (generatiile nr.2 si 3)(generatiile nr.2 si 3)
Concluzii Concluzii Primul esantion:Primul esantion:- toate metafazele marcate- toate metafazele marcate- toti cromozomiii din placa metafazica prezinta ambele - toti cromozomiii din placa metafazica prezinta ambele
cromatide marcate cu timidina tritiatacromatide marcate cu timidina tritiata Al doilea esantionAl doilea esantion::- toate metafazele marcate- toate metafazele marcate- toti cromozomi marcati,prezentand o cromatida marcata si - toti cromozomi marcati,prezentand o cromatida marcata si
una nemarcatauna nemarcata Al treilea esantionAl treilea esantion::- 1/2 din cromozomi marcati si 1/2 nemarcati- 1/2 din cromozomi marcati si 1/2 nemarcati- cromozomii marcati au o cromatida marcata si una - cromozomii marcati au o cromatida marcata si una
nemarcatanemarcataAceste rezultate sunt posibile doar daca replicarea Aceste rezultate sunt posibile doar daca replicarea
cromozomilor este semiconservativa ca si replicarea cromozomilor este semiconservativa ca si replicarea ADN-uluiADN-ului
Analiza cromozomilorAnaliza cromozomilor Metode citogenetice de rutinaMetode citogenetice de rutina: folosesc culturi de limfocite : folosesc culturi de limfocite
din sangele periferic ( este produsul cel mai accesibil din sangele periferic ( este produsul cel mai accesibil pentru studiu)pentru studiu)
Metode specialeMetode speciale: folosesc culturi din alte tipuri celulare : folosesc culturi din alte tipuri celulare (maduva osoasa, fibroblaste obtinute prin biopsii de piele, (maduva osoasa, fibroblaste obtinute prin biopsii de piele, celule fetale recoltate prin amniocenteza sau biopsie de celule fetale recoltate prin amniocenteza sau biopsie de trofoblast). Dezavantaj: prelevare mai dificila si timp mai trofoblast). Dezavantaj: prelevare mai dificila si timp mai lung de culturalung de cultura
Metode directe (fara cultura): Metode directe (fara cultura): se aplica in anumite situatii se aplica in anumite situatii tesuturilor care se divid activ (maduva osoasa in leucemii, tesuturilor care se divid activ (maduva osoasa in leucemii, tumori solide, vilozitati coriale). Avantaj: rezultat rapid (3-tumori solide, vilozitati coriale). Avantaj: rezultat rapid (3-12 ore). Dezavantaj: nr. metafazelor e variabil si calitatea 12 ore). Dezavantaj: nr. metafazelor e variabil si calitatea cromozomilor este mediocracromozomilor este mediocra
Tehnici de analiza cromozomialaTehnici de analiza cromozomiala
Tehnici de generatia I (1956):Tehnici de generatia I (1956):
- cromozomii obtinuti sunt uniform colorati- cromozomii obtinuti sunt uniform colorati
- au putine repere pentru identificarea lor- au putine repere pentru identificarea lor
- tehnica e limitata la diagnosticul aneuploidiilor si - tehnica e limitata la diagnosticul aneuploidiilor si mozaicurilor cromozomiale, a situsurilor fragile, mozaicurilor cromozomiale, a situsurilor fragile, a rupturilor si polimorfismului cromozomiala rupturilor si polimorfismului cromozomial
Tehnici de generatia IITehnici de generatia II Sunt tehnici de bandare a cromozomilor Sunt tehnici de bandare a cromozomilor
metafazici (bandare G,Q,R,T,C,N)metafazici (bandare G,Q,R,T,C,N) Folosiind o serie de tratamente si coloratii Folosiind o serie de tratamente si coloratii
speciale a ADN-ului se vizualizeaza pe speciale a ADN-ului se vizualizeaza pe cromozomi o serie de benzi alternative, intens si cromozomi o serie de benzi alternative, intens si slab colorateslab colorate
Se evidentiaza ~ 300-400 de benzi pentru un set Se evidentiaza ~ 300-400 de benzi pentru un set haploid de cromozomi metafazicihaploid de cromozomi metafazici
Permit identificarea precisa a fiecarui cromozom Permit identificarea precisa a fiecarui cromozom precum si caracterizarea majoritatii anomaliilor precum si caracterizarea majoritatii anomaliilor cromozomialecromozomiale
Tehnici de generatia IIITehnici de generatia III Sunt tehnici de inalta rezolutie Sunt tehnici de inalta rezolutie Studiaza cromozomii in primele faze ale Studiaza cromozomii in primele faze ale
diviziunii cind sunt mai putin condensatidiviziunii cind sunt mai putin condensati Se obtin intre 650-850 de benzi corespunzatoare Se obtin intre 650-850 de benzi corespunzatoare
prometafazei sau profazeiprometafazei sau profazei Fiecare banda corespunde la 20-30 de gene, Fiecare banda corespunde la 20-30 de gene,
aceasta fiind limita maxima de rezolutie in aceasta fiind limita maxima de rezolutie in analiza citogenetica conventionalaanaliza citogenetica conventionala
Nu este o tehnica de rutina, se efectueaza cind Nu este o tehnica de rutina, se efectueaza cind exista suspiciunea de modificari mici (ex. exista suspiciunea de modificari mici (ex. Microdeletii)Microdeletii)
Tehnici de generatia IV (1991)Tehnici de generatia IV (1991)
Sunt tehnici de citogenetica molecularaSunt tehnici de citogenetica moleculara
Folosesc “sonde” de ADN monocatenar, Folosesc “sonde” de ADN monocatenar, specifice unui anumit cromozom, regiuni specifice unui anumit cromozom, regiuni cromozomice sau a unor gene cu cromozomice sau a unor gene cu localizare cunoscutalocalizare cunoscuta
Sondele se fixeaza (hibridizeaza) prin Sondele se fixeaza (hibridizeaza) prin complementaritate in aceste situsuri tintacomplementaritate in aceste situsuri tinta
Pentru a fi evidentiate dupa hibridizare, sondele Pentru a fi evidentiate dupa hibridizare, sondele sunt marcate cu sunt marcate cu fluorocromfluorocrom (vizibil la (vizibil la microscopul cu lumina UV)microscopul cu lumina UV)
De aceea tehnica se numeste “hibridizare De aceea tehnica se numeste “hibridizare fluorescenta in situ” sau fluorescenta in situ” sau FISH (Fluorescence In FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)Situ Hybridization)
FISH e o metoda performanta avand rezolutia FISH e o metoda performanta avand rezolutia de citeva megabaze, dar este dificila si de citeva megabaze, dar este dificila si scumpa.Se foloseste pentru suspiciunea de scumpa.Se foloseste pentru suspiciunea de translocatii criptice, deletii telomerice si unele translocatii criptice, deletii telomerice si unele microdeletii/microduplicatiimicrodeletii/microduplicatii
