(5) Limitele de detecfie si de cuantificare- pentru HPTLC-densitometrie:- s-au considerat, ca limita de detecfie si de cuantificare, rapoartele semnal/zgom

de fond de 3:1 si 10:1; aceste limite au avut urmatoarele valori: LOD = 10 ng/spot $iLQ= 20 ng/spot pentru tizanidina si LOD = 25 ng/spot si LOQ = 40 ng/spot pentru rofecoxib

- pentru HPLC- LOD = 0,01 u.g/mL tizanidina si LOD = 0,10 Ug/mL rofecoxib;- LOQ = 0,05 jig/mL tizanidina si LOQ = 0,15 (ig/mL rofecoxib.

(6) Specificitatea- pentru HPTLC-densitometrie: s-a evaluat puritatea picului pentru tizanidina

rofecoxib, prin compararea spectrelor lor la startul, apexul si finalul pozitiilor spotului;exemplu, r(S;M) = 0,9995; 0,9997 si r(M;E) = 0,9992; 0,9996.

- s-a obtinut o buna corelatie (r = 0,9998 si r = 0,9997) intre spectrele standardulu:probei de tizanidina si rofecoxib.

- pentru HPLC:- specificitatea acestei metode este prezentata in Fig. 8.26.

Fig. 8.26. Cromatograma HPLC a probei de tizanidina (50 Ug/mL; Rt = 3,192±0,05) si de rofecoxib (625 fig/mL; Rt= 7,108 ± 0,07) in raport de 1:12,5, masmatah 235 ̂

run; faza mobila: metanol-tampon fosfatpH = 5,5 (55:45 v/v)

(7) Determinarea regasiriiAmbele metode (HPTLC-densitometrie si HPLC) au fost utilizate pentru extractia

tizanidinei si a rofecoxibului din dozaje farmaceutice, urmata de determinarea lor dupaadausul de medicament standard; aceste mctode dau regasiri medii de 98-102% pentrutizanidina si rofecoxib din formule comercializate; regasirile sunt prezentate in tabelul 8.15(a) si (b), iar datele parametrilor de validate in tabelul 8.16.

r belul 8.15 Tebnica adaugarii de standard pentru determinarea tizanidinei (a) si rofecox-j (b) prin TLC - densitometrie si HPLC (n=6)

not a

ab,

151de

i ? i

) S

B•f«?i :

•.{• ,!

;'!

?

' ^

±

235 ,

J3C6S

rrTriz.JTL?°n<xL53̂

0["xnuM^M20"

TLC-densitometrieConjtoutteoretic

_J?R)

RegSsire RSD% SE

midina30546066

99,6598,5699,25100,04

2,501,841,711,95

1,019,981,231,56

ecoxib375675750825

99,62100,25100,85101,21

2,632,141,561,35

1,941,381,050,96

Ezces Confinutteoretic

(ng)

080100120

60

108120132

080100120

750137515001650

HPLCRegasire KSD%

100,2699,4199,88100,57

1,562,421,651,44

99,52100,47101,98101,77

1,681,652,011,46

SE

1,111,230,981,95

1,141,321,75L69

Tabelul 8.16 Validarea parametrilor: datele statistics pentru graficele de calibrate ale> tawidinei (a) si rofecoxibului (b) prin TLC - densitometrie si HPLC (n=6)

Faranietrnl

Uniantatea

Coeficientul de

corelajie

Limita detecjie

Limita decuantificare

Regasirea (n — 6)

Precizia (RSD%)- repetabilitatea

aplicarii"

- rcpetabttitateamasuratorii*

-preciziainter-zile(n = 6)

-preciziaintra-ri

Jobustejea

_Specificitatea

~^L

HPTLC-densitometrieTizanidina10-1 00 ng/spot

0,9996±1,15

10 ng/spot

20 ng/spot

99,38±0,63

1,89

0,48

1,85

1,65

RobustS0,9998

Rofecoxib100-1500 ng/spot

0,9995±1,25

25 ng/spot

40 ng/spot

100,48±0,70

1,26

0,67

134

Robusta0,9997

HPLCTizanidina1 0-200 fig/mL

0,9997±1,02

0,01 ng/mL

0,10 fig/mL

100,03±0,50

1,68

1,23

RobustS0,05

Rofecoxib100-2000 ng/mL

0,9992±1,52

0,05 HK/mL

0,15jigfe>L

100,94±I,16

1,45

Robusta0.07

(8) Stabilitatea in solutia probei- pentru HPTLC-densitometrie- din solutia amestecului de tizanidina si rofecoxib, pastrata la temperature camereide 0,5, 1,0, 2,0, 4,0 si 24 h, s-au preparat solutii cu doua concentratii diferite: 30

pot si 80 ng/spot tizanidina si 375 ng/spot si 1000 ng/spot rofecoxib;- aceste solutii au fost aplicate pe aceiasi placa TLC, iar dupa developare, s-a efectu-

352 353

at si evaluat densitograma, datele fiind prezentate in tabelul 8.17, pentru oricare dintre spo-turile adi|ionale; nu s-a observat nici un indiciu de instabilitate in solutia probei.

Tabelul 8.17 Stabilitatea tizanidinei $i rofecoxibului in solntii de probe (n=6)

Parametrul

Media ariei —

RSD%SE

HPTLC-densitometrie *Tizanidina

1845,90

1821,64-1875,36

1,251,14

Rofecoxib4943,60

4911,07^978,51

1,581,26

HPLC" |Tizanidini

426241,68426008,31-425911,82

0,810,04

Rofecoxib2887984^362887421,78-2887998,58

0,120,09

a media a 3 concentrafii 30, 50, 80 ng/spot 51 375, 625, 1000 ng/spot peatru flzanidma si rofecoxibmedia a 3 concentra|ii 50, 100, 1 50 ng/spot si 625, 1250, 1875 ng/spot pentru tizanidina si rofecoxib

- stabilitatea spotului: timpul de sedere a probei in solvent inaintea separarii cro-matografice poate influenta stabilitatea spoturilor separate si acest lucru trebuie investigat

pentru validare;- s-a utilizat cromatografia bidimensionala, utilizand acelasi sistem de solvenfi, pentru a

studia eventuala descompunere in timpul spotularii si developarii; de aceea s-a facut develo-parea bidimensionala, neobservandu-se nici o descompunere in timpul celor doua developari.

- pentru HPLC: din solutia probei s-au preparat solujii cu doua concentratii sianume: 50 p.g/mL si 100 [ig/mL tizanidina si 625 (ig/mL si 1875 (ig/mL rofecoxib, care aufost pastrate la temperatura camerei timp de 3 zile;

- aceste solutii au fost injectate in sistemul HPLC; pe cromatograma nu s-a observatnici un pic in plus, ceea ce indica stabilitatea celor doua medicamente in solutia probei

(tabelul 8.17).(9) Analiza formelor comerciale- pentru HPTLC-densitometrie:- in densitograma probelor de medicament extras din tablete s-au observat spoturile

cu Rf = 0,36 pentru tizanidina si Rf = 0,65 pentru rofecoxib, constatandu-se ca excipienjiicomuni existenti in tablete nu au nici o influenta;

- continutul medicamentelor gasit a fost de:- 99,40% ± 1,56 (RSD% = 0,58) pentm tizanidina;- 99,63% ± 1,68 (RSD% = 0,64) pentru rofecoxib;- prin urmare, se poate deduce ca nu are loc nici o degradare a tizanidinei si rofecoxi-

bului in formele comerciale analizate; rezultatele experimentale sunt prezentate in tabelul 8.18;valoarea redusa a RSD% arata ca aceasta metoda este potrivita pentru analiza de rutina.

- pentru HPLC:- in cromatograma probelor de medicamente extrase din tablete exists doua picuri la

tj. = 3,19 min pentru tizanidina si la t,. = 7,11 min pentru rofecoxib (Fig. 8.26);- rezultatele experimentale ale cantitatilor de tizanidina si rofecoxib gasite sunt in

buna concordanta cu valorile declarate de producator, ceea ce sugereaza ca excipientuprezenti in forma farmaceutica analizata nu interfera determinarea medicamentelor; can-titajile de medicamente gasite sunt:

354

, 99,91% ± 1,62; RSD% = 0,68, pentru tizanidina;. 100,16% ± 1,35; RSD% = 0,71, pentru rofecoxib;. evaluarea statistics s-a facut folosind testul Student t si raportul F la 95% nivel de

redere (Tabelul 8.18).

-1& Rezultate experimentale.

Parametri

•j^JP^ifdeclarat

-&^%±SD"S5%^

'^^Valoarea* t^Vaioarea'F

HPTLC-densitometrieTizanidina

299,40±1,56

0,580,230,0631,093

Rofecoxib25

99,63±1,680,640,26

0,1051,263

HPLCTizanidina

299,91±1,62

0,680,360,3151,255

Rofecoxib25

100,1 6±1,350,710,400,2541,278

' Valori teoretice pentru t ?i F, care sunt egale cu 2,57 5! 5,05 (p=0,05 sau 95%)

(10) Compararea HPTLC cu HPLC- in analiza si controlul tabletelor continand cele doua medicamente s-au preparat 6

"solutii diferite de proba pentru determinarea lor prin HPTLC si HPLC; fiecare proba a fost: jnalizata in duplicat;

- testele de diferenta dintre HPTLC si HPLC s-au efectuat la un nivel de incredere de95% (P = 0,05), aplicandu-se doua cai ANOVA pentru testarea ambelor interactiuni

•metoda-proba (variatia interactiei) si diferentele in precizia metodei (variatia coloanei);- deoarece variatia in interiorul celulei (variatia reziduala) este mai mare decat vari-

atia interactiei si decat variatiile coloanei, rezulta ca interactia metoda-proba si diferentelefiDtre metode nu sunt semnificative;

- pe langa mediile testelor, s-a aplicat si o operatic de test-t; acest test elimina oricevariatie dintre probe;

- valoarea ts(at obtinuta este mai mica decat doua tcrit, ceea ce conduce la concluziaca mi este nici o diferenta semnificativa intre medii;I - rezultatele celor doua variante (cai) ANOVA si perechea test-t sunt prezentate inlabelele 8.19 si 8.20.

8.9.3. Determinarea prin HPLC a aciclovirului si a impuritatilor inrudite

I ' •;| Aciclovirul este o nucleozida punnica sintetica analoaga, avand o activitate inhiba-•-•toare in vitro si in vivo fata de virusul herpes simplex si virusul varicella-zoster. Are aspec-tulunei pulberi albe cristaline (M = 225,21), solubila in apa (sub 2,5 mg/mL la 37°C),avand pKa = 2,27 si 9,25 [59].

Determinarea acestui medicament din forme farmaceutice se poate face prin metodespectrofotometrice (in VIS putin sensibila, sau prin derivare si determinare spectrofotome-taca sau prin spectrofotometrie diferentiala), dar mai ales prin HPLC cu detectie UV saum cuplaj cu spectrometrie de masa ' ' '. Insa nici una dintre aceste metode nu se refera la

355

Tabelul 8.19 Doua procedee - teslANOVA ale determinant tizanidinei (a) $i rofecoxibu^ 2lui (b) in $ase probe independents, duphcatprin HPTLC fi HPLC

-

Proba HPTLC"Prima prelucrare A doua prelucrare

HPLC'Prima prelucrare A dous prtjuciarc

(a) DouS procedee test ANOVA pentru dcterminarea tizanidinei113456

reznmat

98,3198,2499^098,51100,4898,45

98,4898,9499,9199,26100,3198,66

HPTLC

99,8899.6498.4198,24101,5798.74

98,169939983298,27101.1198,95

BPLCANOVA: factorul 2 cu replicareNumSrSumfiMediaVariantsNumarSvoBMediaVariantsNumSrSumaMediaVarianjaSnrsavarimflciANOVAProba

Coloane

Intersec-tieracadrul

Total

Proba

6593,1998,8650,74347

6595,5699,26

0.51916

SS

0,0003375

0,155204167

0,9009375

20,37121667

21,42769583

6 12596.48 1189,67

99,41333333 99,139166671.551426667 1,125135606

6 12594,2 1189,76

99,0333333 99,1466666671,260186667 0,822806061

d.t

I

1

!

20

23

121188,7599,06250,616475

MS

0,0003375

0,155204167

0,9009375

1,018560833

F"

0,00033135

0,152375942

0,884520071

HPTLC'Prim a prelncrare A dona prelucm

121190,68

99,22333333U 17387879

Valoarca P

0,98565727

0,700401589

OJ58188118

HPLC'

Frt

43512500027

43512500027

43512500027

e Prima prelucrare A doua prelncrare(b) Doufi procedee test ANOVA pentm detenninareaTofecoxibului

123456

Reznmat

99,429961100,21100,58101,3099.91

99,7499.94100,45101,30100,81100.18

HPTLC

100,3599.8699,48100.71101,89100.20

HrLC

99.7799,96100,78100,84101.62100,87

ANOVA: factDTul 2 cu icplicarcNumarSumfiMediaVarianlaNumarSunpJMediaVariant?!NurnSrSumaMediaVarianta

Sursavaria^ei

ProbaColoancIntersec-ticlocadrulTotal

6601,03

100,17166670,478056667

6602.42

100,40333330,333226667

SS

0,31281666703456

6.66666E-05

9,85396666710.51245

121203.45100,2875

0,384311364B |iii

2023

6602,49100.4150,69907

6603,84

0,45844

MS

0,3128166670,3456

6.66666E-05

9,85396666710,51245

F'

0,6349050640,7014434120,000135309

121203,52

100,29333330,551206061

121206.26

100,52166670376033333

12120633100,5275

0,539947727P

0,4349194090.4121960850,990834274

* Rezultatele sunt prezentate ca % ale caniiujii declarate de tizanidina pe comprimatbF»<F0),c R czultatclc sunt prezentate ca % ale canlilatii declaiatc dc rofecoxib pe comprimat" F™<FIrt

ry vpT[,C ?i HPLC fi corelatia lor prin perechea test t

I

l i

v!

~-—~ Proba

•jSrSiiilsL.r- 2-" 3

4-— 5r- 6

1 ~"~~ Media

NvfijiiiLMf1'9

rv^pT"pfrafTvatii (dctci tninfin)Aghga Pearsonpj^g mediei presupusS

t7T~~"wIHp.(T <; t) o intersectiejj nintersectiep (T ̂ t) dou8 intersectsi j douiintersecpi

5^Proba

Jb)Rofecoxib123456

MediaTestnl t: doni probe

tmperecbeate pentm medieMediaVarianta

^bservatii (detenninan)Corelatia Pearsonffiferenfa mediei presupusaM.&I[L^t)ointer3ectJe

fnbt

jLd^t^doua intersectii

I HPTLC' 1 HPLC'

98,4098,5999,5698,89100,4098,5699,07

Variabflal

99,0299,52983798,261013498,8599,23

Variab3a2

99,066666670,596146667

60,630454741

05

- 0,445108940337424859

2,0150491760,6748497182,570577635

HPTLC b

99^2666667U81026667

6

HPLC"

99,5899,7810033100,7010130100,05100,29

Variabilal

100,28750,4030075

60,910988973

05

-2,0874827340,045595459

HPTLC"0,091190918

100,0699,91100,13100,78101,76100,54100,53

Variabfla2

100,52750,4651875

6

HPLC'

j 'teuhatele sunt prezentate ca % ale cantiSfii declarate de n'yjmiHinS pe comprimat•JLSHKatele sunt prezentate ca % ale cantita)ii declarate de rofecoxib pe comprimat

356 357

compusii inruditi, exceptand guanina. Farmacopeile se refera la determinarea aciclovirulyjsi a formei sale - acetat, considerata ca impuritatea A (Fig. 8.27).

Aciclovir Guaniiii

X-f

Impuritalea CImpuritatea A

JUCOImpuritatea F

ImpuritateaVlR.3/4Impuritalea N'

Fig. 8.27. Stmcturile cbimice ale aciclovirului si ale compufilor inmditi

Prezenta acestor impuritati este importanta, in primul rand, pentru controlul calitatii, iarin al doilea rand, pentru intarirea drepturilor de patent, deoarece impuritatile pot arata calea sin-tezei aciclovirului. De regula, este dificila dozarea lor, deoarece este necesara extracts lichida,urtnata de HPLC, colectarea frac^iei analizate si determinarea prin spectrometrie de masi.

Aciclovirul si guanina sunt foarte polare, putandu-se ioniza usor, de aceea ele se potsepara pe faza inversa cu cromatografia perechii de ioni, in mediu acid, utilizand decansul-fonat. Se stie insa ca analiza cromatografica a perechilor de ioni are unele neajunsuri, cumsunt: timp mare de echilibrare, interactia putemica a substantelor ce se pot imperechea cufaza stationara, eliminarea lor dificila din coloana dupa utilizare, ca 51 slaba reprpductibih-tate a timpului de migrare; acest ultim aspect este foarte neplacut si ncdorit.

Aceste neajunsuri se pot evita prin utilizarea unor faze stationare noi, cu selectivitatinoi in HPLC cu faza inversa. Obiectivul studiilor acestora, care se dcscriu in continuare,este acela de a cerceta si experimenta noi coloane pentru separarea impuritatilor aciclovir-

ului, evitandu-se reactivii de imperechere a ionilor.

358

1) Aparatura. s-a utilizat un echipament HPLC LaChrom Elite dela VWR, alcStuit din:, o pompa cuaternara;- un injector automatic;. un detector la o singura lungime de unda;- cuptorul coloanei.- s-au utilizat diverse coloane si faze mobile, validandu-se, in final, metoda cu o

loans SB-CN de la Agilent (150 mm x 4,6 mm si 3,5 Jim), care ofera o separare baseline,, conditii izocratice, la pH = 3,0 si o durata a ciclului de lucru de 15 min pentru guanini,

iclovir si impuritatea A; in plus, daca se mareste timpul ciclului la 40 min, se pot separajclovirul si sase impuritati (guanina, impuritatile A, F, G, Vir 3 si N7) in aceleasi conditii;

- ca faza mobila, s-a utilizat amestecul de tampon A/acetonitril (96:4 v/v), tamponul|vfiind H3PO4 25 mM, adus la pH = 3,0 cu KOH;

- temperatura cuptorului a fost de 35°C; detectia in UV la 254 nm;- aceeasi coloana ofera separarea tuturor celor sapte impuritati, inclu2and impuritatea

; C care coelueaza cu aciclovirul in conditiile aratate mai sus, cu o faza mobila de H3PO4

& mM (pH = 1,8) / acetonitril (96:4 v/v).

f '(•• 2) Chimicale| - standardul de aciclovir si impuritati (A, C, F, G, Vir 3, N7), ca si tabletele si exci-^pientii (SiO2, talc, stearat de magneziu, povidona®, avicel® si pumagel®) de la CINEAS^.A., Pamplona, Spania;

- guanina de la Sigma-Aldrich (Steinheim - Germania, NaOH (> 99%) de la Panreac;:;{Barcelon, Spania), H3PO4 (85%) si CH3CN (de puritate HPLC) de la Merck (Darmstadt- Gennania), iar apa a fost purificata cu un sistem Milli-Q plus, de la Millipore (Bedford,

I Ma, USA).

!?• 3) Prepararea solutiilor standardj Pentru prepararea tuturor solutiilor standard, ca si pentru dizolvarea probelor, s-a uti-'faat, ca solvent, faza mobila tampon fosfat 25 mM (pH = 3,0) / acetonitril (96:4 v/v).'Jeatru prepararea solutiei standard de aciclovir, s-au cantarit exact 40,0 mg substanfa si s-:» dizolvat inrr-un flacon volumetric (balon cotat) de 100 mL.

Solutiile de impuritati s-au preparat individual, prin cantarirea exacta a cate 10 mgfaibstanta si dizolvarea intr-un flacon volumetric de 250 mL, cu exceptia solutiilor deS|uanina si aceea a impuritatii Vir 3, care necesita cate 25 mLNaOH 0,1 N. S-a preparat si• Osolutie conjinand toate impuritatile, prin masurarea a cate 0,2 mL din fiecare solutie stoc

tk irapuritate, aducandu-se impreuna la 10 mL cu faza mobila.Pentru cuantificare, s-a cantarit o cantitate de pulbere de tablets egala cu 53,75 mg,

siiarc s-a adus la 100 mL cu faza mobila; solutia s-a sonicat 5 min si apoi s-a filtrat pe filtre|A nylon de 0,45 ^m, inaintea injectarii.

4) Validarea metodei(1) Testarea selectivitatii s-a facut prin efectuarea ciclului cromatografic pe solutii

excipientii specialitatii (formei farmaceutice), in aceeasi cantitate si conditii ca si

359

in cazul probelor, pentru a arata ca nu apare nici un pic la timpii de retentie corespunzatorjanalitilor. Mai mult, s-au introdus, in acest ciclu cromatografic, solutii de standard cu impu.ritati identificate la nivel de 0,2%, pentru a demonstra rezolutia si selectivitatea metodei.

(2) Parametrii de validare au fost testa^i in doua domenii si anume in domeniul (Jecuantiiicare a analitilor si in domeniul impuritatilor.

- liniaritatea a fost testata pentru un domeniu mare prin prepararea solutiilor stan-dard la cinci nivele de concentratie (de la 75% la 120% din concentratia analitilor tinta); incazul acicloviruhii, concentratiile au fost de la 0,3 mg/mL la 0,48 mg/mL, cantarind exactfiecare cantitate de aciclovir (de la 30 mg la 48 mg) Intr-un flacon volumetric de 100 ml,dizolvand si completand la cota cu faza mobila; fiecare punct a fost analizat de trei ori, pen-tru domeniul scazut de concentrate; solutiile de aciclovir au avut concentratii in domeniul0,2 p.g/mL la 4 jlg/mL, in timp ce concentratiile guaninei au fost in domeniul 0,2 ug/mL la20 ug/mL, solutiile guaninei fiind preparate in flacoane volumetrice de 10 mL, adaugandvolvune de solutii standard stoc de aciclovir (0,050-1,00 mL) si de guanina (0,050-2,5 mL)si completand volumul total cu faza mobila;

- exactitatea (acuratetea), in cazul studiilor efectuate pe produsi medicamentosi, s-adeterminat prin aplicarea metodei analitice elaborate la un amestec sintetic al compo-nentilor medicamentului (forma farmaceutica reconstituita), la care s-au adaugat cantitaticunoscute de substanta medicamentoasa (aciclovir), pentru a fi analizata; aceasta a fostrepetata la trei nivele de concentratie de 80%, 100% si 110%, in paralel cu cercetarea liniar-itatii pentru aciclovir si guanina (principalii componenti); pentru domeniul de joasa con-centratie, s-au cantarit 7,0 mg excipienti intr-un flacon volumetric de 50 mL ?i s-au adau-gat volume corespunzatoare de solutie stoc de aciclovir pentru a se obtine 0,05%, 020%,050%, 1,00% si 5,00%; aceste domenii sunt incluse in limita declarata pentru o valoarelimita de acceptanta;

- precizia (fidelitatea); datele preciziei intra-zi s-au obtinut prin analizarea repetataintr-un laborator, intr-o zi, a 10 parti (portiuni) alicote din proba omogena (pentru domeni-ul inalt) si a sase parti alicote (pentru domeniul jos), fiecare dintre acestea fiind preparateindependent, conform metodei si standardelor corespunzatoare; s-au obtinut datele pentruprecizia intermediara prin repetarea intra experimentala pe o zi diferita cu solutii proaspatpreparate;

- limita de detectie - LOD s-a evaluat masurand zgomotul de fond (baseline) si cal-culand concentratia analitului care da S/N = 3;

- limita de cuantificare - LOQ s-a stabilit pentru concentratia de analit care da S/N= 10; aceasta este totusi numai o abordare, limita de cuantificare fiind stabilita prinvalidarea metodei pentru concentratia mai mica;

- factorii de raspuns pentru impuritatile A, F, G, Vir 3 si N7, fata de aciclovir, s-aucalculat prin analiza de 10 ori a amestecului continand impuritatile, plus 0,2% aci-clovir:

- stabilitatea standard s-a testat prin analizarea succesiva a aceleiasi probe core-spunzand la punctul mediu in studiul liniaritatii pentru 0-3 zile si cu aceeasi fazamobila; intre ciclurile analitice, solutiile s-au pastrat la temperatura ambianta;suprafata initials a fost considerata 100%, iar regasirile au fost evaluate in succe-siunea zilelor.

360

5) Rezultatc si interpretarea lor- pentru a obtine o rezolutie adecvata in conditii izocratice, fara a utiliza reactivi for-de perechi de ioni, s-au testat diverse faze stationare si faze mobile cu pH diferit; s-au

jtilizat noi faze stationare compatible cu faze mobile 100% apoase si faze stationare polarjuverse, precum polietilenglicol si ciano care pot ajuta sa se evite utilizarea gradientului de<lutie, cand se face separarea unui amestec de compusi cu concentratii mult variate; aces-juj'ofera un echilibru al retentiei pentru compusi polari si nepolari in faza cromatograficajoverea, cu retentie mai mare pentru compusii polari, in timp ce retentia este mai scazutafedusa) pentru compusii hidrofobi;

- au fost testate mai multe coloane, intre care:- Atlantis™ d CIS (Waters), o coloana de 250 mm x 4,6 mm, d = 5 urn, pe baza de

silicagel, faz£ legata C18 bifunctionala;- Zorbax SB C18 Aq, 150 mm x 4,6 mm, d = 5 um (Supelco);- Discovery cyanopropil, de 250 mm x 4,6 mm, d = 5 um, (Supelco), faza legata este

-0-Si(CH3)2CH2CH2CN, particule imbricate (acoperite) cu pori de 180 A;- aceste coloane au unele caracteristici (in functie de producatqr), intre care: hidrofo-

bicitate scazuta pentru elutia rapida a moleculelor hidrofobe, retentia si separareaanalitilor putemic bazici, compatibilitatea cu faze mobile cu procentaj mare de apasi stabilitate remarcabila si reproductibilitate mare;

- s-a testat si o coloana foarte diferita si anume: Agilent Zorbax SB-CN, cu acoperirecompleta, protejata steric, care este o faza stationara diizo-propil-cianopropil, nea-coperita cu pori de 80 A; aceasta coloana a fost incercata in doua marimi: clasica,de 250 mm x 4;6 mm, d = 5 Jim §i o alta, cu lungime mai mica si cu diametm maimic al particulelor, considerata, de catre producator, echivalenta cu o coloana de150 mm x 4,6 mm, d = 3,5 urn;

- s-a mai testat si o coloana de polietilenglicol - PEG (Supelco), de 250 mm x 4;6mm si d = 5 |J.m;

- toate coloanele incercate pot fi considerate echivalente in dimensiuni, de?i lucreaza|a viteze diferite ale fluxului: 1 ml/min pentru coloane de 250 mm x4,6 mm, d = 5 urn silux de 0,6 mL/min pentru coloanele de 150 mm x 4;6 mm, d = 3,5 um;

- prima incercare s-a facut pentru a studia efectul pH al fazei mobile, fiind verificatediferite coloane pentru amestecul de tampon fosfat 25 mM / acetonitril 90:10 si 95:5 (v/v):Ililizarea tamponului fosfat s-a facut la pH = 3,0, pH = 4,5. si pH = 7,0; incercarile preli-

Fig. 8.28, Influenta pH-ului fazei mobileasupra separarii aciclovimlui, guaninei

?i impuritatii A pe coloana. Agilent ZorbaxSB-CN (150 mm x 4,6 mm, d = 3,S \im),

cu faza mobila tampon fosfat 25 mM /acetonitril (95:5 v/v) fi detectia UV la

254 nm

361

minare s-au facut numai cu aciclovir, guanina si impuritatea A, care sunt incluse in metodelefarmacopeii; in Fig. 8.28 sunt date rezultatele pentru coloana Agilent Zorbax SB-CN(observandu-se tendintele similare pentru cele mai multe coloane), pentru care rezolutia estecrescuta la pH = 3,0, deoarece retentia guaninei descreste usor, ceea ce se poate justifica prinpK-L = 3,30 a guaninei, deoarece la un pH mai mic, azotul primeste un proton, iar forma ioni-zata este mai slab retinuta, in timp ce azotul echivalent din aciclovir are pK^ = 2,01;

- rezultatele pentru faza mobila de tampon fosfat 25 mM (pH = 3,0) / acetonitril 95:5

(v/v) sunt date in Fig. 8.29;

Fig. 8.29. Comportarea comparativa a aciclovirului, guaninei $i a impuritatii 4Ape diferite faze stationare ?

- conditii cromatografice: faza mobila data mai sus, detectie UV la 254 nm;

- coloane:A = Agilent Zorbax Eclipse XDB C18 (150 mm x 4,6 mm, d = 3,5 urn, viteza flu-

xului 0,6 mL/min);B = Supelco PEG (15.0 mm x 4,6 mm, d = 5 \im, viteza fluxului 1,0 mL/min); ,i|C = Agilent Zorbax SB-Aq (150 mm x 3 mm, d = 5 (im, flux 1,0 mL/min); ;|tD = Waters Atlantis (250 mm x 4,6 mm, d = 5 |im, flux 1,0 mL/min); :ffE = Supelco CN (250 mm x 4,6 mm, d = 5 urn, flux 1,0 mL/min); !|fjF = Agilent CN (250 mm x 4,6 mm, d = 5 um, flux 1,0 mL/min); •f|G = Agilent CN (150 mm x 4,6 mm, d = 3,5 um, flux 0,6 mL/min);- coloanele Polyetilenglycol PEG si CN de la Supelco au fost inlocuite, deoarece nu

dau o rezolutie suficienta in aceste conditii; a fost eliminata si coloana Agilent Zorbax SB-Aq CIS; iar coloana Atlantis (Waters) arata o rezolutie buna, dar un timp de retentie prea

mare pentru impuritate;- eel mai bun raport si valori ale timpilor de migrare le arata coloana SB-CN

(Agilent), demonstrandu-se experimentul ca cele doua tipuri de coloane, cu dimensiuru de250 mm x 4,6 mm, d = 5 urn 150 mm x 4,6 mm, d = 3,5 um, dau aproape acelasi timp deretentie, dar lucreaza cu viteze diferite ale fluxului, de 1,0 mL/min si 0,6 mL/min;

- toate impuritatile au fost injectate in coloana SB-CN Agilent, iar Fig. 8.30 arata sep-

ararea pentru toate standardele 0,2%;

362

3..S- • . " ' • • •Guanina

' .*— "•"

.Aciclovir

1 • /e. 1.5-£. i i] Impuritatea C '

S i 1 1* f "Impuritatea F Impuritatea N7

o ~ [| Impuritatea A £ Impuritatea G

1 : 1 1 ' Skj .^ Impuritatea Vir 3/4 V /as" ni UL . , ,__. pi ,fi — ̂ . - - . .J V /' V

•, .-vl. . ft

0 S 10 15 20 ^ : V) 35 «Timp (min.)

Fig. 8.30. Cromatograma aciclovirului (0,4 mg/mL) $i a impuritatilor inmdite10,2% pentru picul principal), pe coloana Agilent - CN (150 mm x 4,6mm, d = 3,5 fim),

'pastrate la 35°C; faza mobila: tampon fosfat (pH = 3,0) 25 mM/acctonitril (96:4 v/v),viteza fluxului 0,6 mL/min, detectie UV la 254 nm; linia cea maijoasa corespunde

excipientilor

Se observa ca impuritatea si aciclovirul coelueaza In aceste conditii, iar marirea can-

I titatii de apa la 100% nu imbunata^este acest rezultat.finand seama de valorile pKa, trebuie observat ca, la pH < 2, se poate produce o noua

protonare la azot cu modificarea corespunzatoare a timpilor de retenfie, care poate producea oarecare diferentiere. De aceea s-a testat compozitia fazei mobile formata di HgPC^ 25

finM (pH = 1,8) / acetonitril (96:4 v/v) cu coloana SB-CN, care este considerata stabila in; iceste conditii. in Fig. 8.31 este prezentata separarea obtinuta cu impuritatea C, separata de•jBiclovir si impuritatea Vir 3 care elueaza la un timp de retentie mai mic.

Placebo

/

I 1c, Q.

S S

Timp (min.)

Fig. 8.31. Cromatogramaaciclovirului (0,4 mg/mL),

a impuritatilor inmdite,toate la 0,2%

Icoloatia SB-CN Agilent de 150 mmx 4,6 mm, d = 3,5 (im;

faza mobila tampon fosfat 25 mM

(pH = 1,8) / acetonitril 96:4 (v/v);viteza fluxului: 0,6 mL/min;

detectie UV la 254 nm.

363

Insa impuritatea C provine din sinteza si deci nu este un produs de degradare, deaceea ea a fost indepartata in materia prima la pH = 1,8, asa cum se poate vedea in Fig8.32, dar metoda a fost validata la pH = 3,0, mai putin agresiv pentru lucrul de rutini

Timp (min.)

Fig. 8.32. Cromatograma corespunzand la:(a) aciclovir fi impuritati (guanina pi C) in cantitate de 0,2%;

(b) materia prima 100%.

Cromatograma finala a aciclovir-tablete in conditiile de lucru descrise este prezentatiin Fig. 8.33.

a

a.I

Timp (min.)

Fig. 8.33. Cromatograma corespunzatoare a aciclovir-tablete la nivel de cuantiGcare;conditii: - coloana Agilent ciano, 150 ram x 4,6 mm, d = 3,5 um, pastrate la 35°C;

- faza mobila: tampon fosfat 25 mM (pH = 3,0) / acetonitril (96:4 v/v);

- viteza fluxului: 0,6 mL/min, detecfie UV la 254 nm,

- picuri: 1 = guanina; 2 = aciclovir; 3 = impuritatea Vir %.

Validarea acestei metode s-a facut in confonnitate cu ghidurile ICH, cu standarde side validare sunt prezentati in tabelul 8.21.

nbelul 8.21 Validarea parametrilor principals pentru aciclovir $i guanina-— ~~ Domeniul de cuantificare

Aciclovir-rJl̂ iStea standardelor

^P~ -82±135

pU 12762i337r 0,9996Oonffliu 0,3040-0,4800/ino/innLj££ritateaprobeitoSSpT -41±93p ta 12632±I37

0,999

Domeniul impnritajilorAciclovir Guanina

0,37±0,1912804±950,99999

0,0002-0,0040

0,29iO,1312795±630,99997

0^8±0,3419019i370,999998

0,0002-0,0200

0,11±0,2918763±310,999996

I5tod~ 99,99RSD(%) 0,47proba 99,82JSD(%> 0,18

99,41,8

98,7U

98,43,496,46,7

Precizia instrumentalaStasdarde intra-eseuMedia 0,39(mg/ml) n=10RS0(%) 0,30Precizia intermediaraMedia 0,39(mg/ml) n=19RSD(%) 0,74

0,001n=6

0,61

0,001n=I2

1,3

0,002n=6

0,23

0,0002n=12

0,42Prccizia-instrunientalaPioba intra-eseuMedia 0,41(mg/ml) n=10RSDj%) 0,23Precizi intermediaraMedia 0,41(mg/ml) n=20|SD(%) 0,26Preciziametodelor

0,001n=6

0,69

0,30n=12

0,88

0,002n=6

0,51

0,002n=12

0,62

364

De subliniat ca standardele au aratat o liniaritate buna si mai ales pentru aciclovir indomeniul de cuantificare, ca si pentru aciclovir si guanina in domeniul scazut, coeficientiifc corelatie fiind de peste 0.999. Nu s-a observat nici o oblicitate in dreptele de regresie,"fcoarece inlerceptii cu limitele lor de incredere includ valoarea zero. De subliniat ca obiec-*vul validarii metodei la nivelul impuritatii pentru aciclovir a fost utilizarea dilutiei stan-tflaidului pentru a cuantifica toate impuritatilc, diferite de guanina, cu factori corespunza-!.tori de raspuns, deoarece aceste impurilati nu sunt disponibile de obicei.

Valorile RSD au fost reduse, deci metoda poate fi considerata precisa, atat pentru'darde, cat si pentru probele de aciclovir. Regasirile nu difera statistic de 100%% (tes-

365

tul t, p < 0,05); factorii de raspuns sunt dati in tabelul 8.23, pentru diverse impuritJtiapropiate de aciclovir, valorile fiind foarte apropiate de 1, deoarece cromoforul este foarteasemanator pentru toate irnpuritatile.

TabeM 8.22. Factorii de .raspuns pentru impuritati apropiate de aciclovir

AnalitulImpuritatea AImpuiitatea F

Impuritatea Vir %Impuritatea N7-diacetilaciclovir

Impuritatea G

Factoru! de raspuns0,69741,17320,90530,94590,9681

Limita reala de cuantificare a metodei este valoarea cea mai mica a concentratiei $jea a fost validate, fiind in toate cazurile egala cu 0,05%. De mentionat ca valoarea ei rezul-tata dintr-o abordare matematica este de 0,004%. Limitele de detectie au fost de 0,001%pentru aciclovir si guanina, ele fiind mai mici decat valorilepe care le da metoda.

Standardul a fost stabil pentru ultimele 72 ore de pastrare a solutiei la temperaturacamerei, iar regasirea dupa 3 zile a fost de 100%, cu RSD = 0,83%. Pe de alta parte, desi nus-a atins o dovedire formala a robustetii, aceasta metoda a fost aplicata peste sase luni intr-oformulare farmaceutica si a trecut sistemul de testare pentru a fi considerata potrivita.

8.9.4. Determinarea rapida a colchicinei prin TLC-densitometriedin medicamente $i extracte vegetale ps!

Colchicina este un medicament utilizat in atacul de guta si este componentul princi- •pal in Colchicum autumnale L., fiind toxica pentru om. Acest medicament inhiba migratialeucocitelor catre zonele inflamate, intrerupand raspunsul infiamator care provoaca ataculgutei. Colchicina are si o actiune antimitotica, opunand diviziunea celulelor in metafazaprin impiedicarea functionarii normale a axului mitotic, care favorizeaza diviziuneacelulelor (nu este totusi un agent antimitotic selectiv).

Se cunosc diverse tipuri de metode de determinare cantitativa a colchicinei: spectro-fotometrice, volumetrice, potendometrice, voltametrice, gravimetrica, cromatografice,fiecare cu avantajele si dezavantajele ei.

Autorii acestei metode au combinat separarea cromatografica pe strat subtire de sili-cagel cu determinarea densitometrica in situ a compusilor separati; aceasta metoda estefoarte eficienta, rapida, exacta, care elimina interferentele posibile ale altor compusi

apropiati (inruditi) structural.

1) Experimental

1) reactivi: metanol, etanol, cloroform, acetona, de puritate analitica (de la Merck) §i

dietilamina (de la Fluka, Switzerland).2) probe: s-au preparat solutii proaspete de colchicina, in fiecare zi, pastrate la

intuneric s-au colectat seminte de sofran din fanetele din jurul municipiului Cluj-Napoca-

366

mania, din care s-au obtinut extracte Soxhlet, turboextracte si prin sonicare in etanol de„/. aceste extracte au fost diluate de 10 ori cu apa distilata, iar aceste solutii de lucru aut injectate 1° sistemul HPLC (20 uL). In experientele TLC s-au aplicat pe placa 5 uX

s°]ujje etanolica bruta.- s-a delerminat colchicina din tablete de 1 mg (declarat) de la Fabiol S.A. Bucuresti

Romania; tabletele au fost catarite impreuna si apoi au fost pulverizate; din pulbere s-aantarit exact o cantitate cunoscuta intr-un balon cotat si s-a adaugat metanol la cota,01chicina fiind extrasa prin sonicare, timp de 5 min, iar suspensia a fost centrifugata treiminute la 5000 rpm; cca 200 uL supernatant s-au diluat la 10 mL cu apa distilata, aceastasolutie fiind utilizata pentru injectie in sistemul HPLC (20 \iL), iar in experience TLCs-au'depus cate 5 uJL din aceasta solutie.

3) experience TLC- separarea TLC s-a facut pe placi (de sticla) de Silicagel 60 si Silicagel 60 F254 cu

ainestec de cloroform /acetona / dietilamina (5:4:1), in camera de developare verticals siorizontala Desaga, dupa 15 min de saturare;

- s-a realizat o separare unidimensionala cu un parcurs de peste 7,5 cm, cu fazamobila mentionata mai sus si cu evitarea expunerii la lumina, cat mai mult posibil; sepa-jarile s-au facut la temperatura ambianta (20-24°C) si umiditate de 46-56%;

- detectia s-a realizat, ca de altfel si cuantificarea, prin scanare densitometrica cu undensitometru Desaga CD60, in reflectanta la 350 nm si fluorescenta (la 254 nm, lampa Hg);

- calibrarea TLC: s-au preparat solutii stoc de 10 mg/mL in etanol; s-au utilizat, infiecare din cele trei zile ale validarii, sase standarde de calibrare, de 0,1, 0,2, 0,3, 0,5 si 0,6mg/niL; s-au preparat cinci seturi de probe de control, corespunzand la 60%, 80%, 100%,120% si 140% din 0,3 mg/mL; aceste solutii s-au preparat prin cantariri separate, iar ele aufost pastrate la intuneric; solutii standard si de control s-au aplicat manual in benzi de 5mm, utilizand capilare Desaga de 5 |jJL, la 1,5 cm de marginea inferioara a placii.

4) experience HPLC- s-a utilizat un sistem HPLC HP Series 1100, cu o coloana Zorbax SB CIS (100 cm

*3mm, d = 3,5 (im);- faza mobila utilizata a fost acetonitril/apa (75:25 v/v), la o viteza a fluxului de 1

mL/min, la temperatura constants, de 42°C in timpul experientelor;- solutiile standard de colchicina in metanol au fost injectate automat (10 uX), iar

detectia s-a facut la 243 si 350 nm;- timpul de retentie al colchicinei este cca. 2,3 min;- calibrarea HPLC: s-au preparat solutii stoc separate de 0,505, 0,628, 0,996, 1,802,

2,387 mg/mL in metanol; din fiecare solutie s-au transferal parti alicote de 100 U.L in fla-coane volumetrice de 25 mL; parti alicote de 0,2 mL au fost diluate apoi la 5 mL cu apa"distilata, solutiile obtinute servind pentru injectii HPLC (cate 10 U.L); s-au utilizat douaabordari diferite: in prima s-au preparat cinci solutii standard de 30,1, 60,2, 120,4, 200,6 siW,3 ng/mL, iar in a doua s-a cercetat un domeniu de concentratie mai larg, de 30,1-24.000 ng/mL;

5) determinarea spectrofotometrica|;f - s-a realizat conform FR X;;|| - tabletele de colchicina au un continut de 1 mg substanta, iar normativele admit un

367

con|inut de 90%-110% din valoarea declarala;- pulberea de tablete corespunzand la cca 1 mg colchicina s-a agitat puternic cu 20

mT. etanol 100%, timp de 30 min, dupS care s-a centrifugal 2 min la 2000 rpm;- 10 mL supernatant s-a diluat la 50 mL cu etanol 100% si s-a masurat imediat

absorbanta la 350 nm; absorbanta pentru o solute 1% si pentru un parcurs de 1 cm este

egala cu 425 la 350 ran.

2) Rezultate si interpretarea lor

1) comportarea spectrala si comatografica a colchicinei §i a produsilor sai de

degradare:- colchicina se degradeaza puternic prin expunere la lumina, produsii sSi de

degradare fiind farmacologic inactivi;- spectrele de absorbtie sunt complet diferite dupa doua zile de expunere la lumina a

solutiei de colchicina (Fig. 8.34 (a)); datorita diferentelor structurale dintre colchicina §iprodusii sai de degradare, comportarea cromatografica se modifica foarte mult (Fig. 8.34 (b)).

40-

35-

30-

25-

20 40 BO BO 100

(6) Distanp (ram)

Fig. 8.34. Efectul expunerii la luminaasupra spectrului (a) si comportarea.cromatografica (b) a colchicinelor (-)fi a produsilor de degradare (—)

350 300 350 400 450 500 550

X(nm)

Fig. 8.35. Spectml de fluorescenfa aJcolchicinelor: excitatie (-) $i emisie

- datorita marii sensibilitati la lumina a colchicinei, nu este posibila decat o singurascanare densitometrica, dupa fiecare scanare picul fiind mai mic, de aceea nu se poate efec-tua o cromatografie bidimensionala pentru a face o separate mai buna; in aceste conditii,valoarea Rf= 0,65 a colchicinei, iar pentru derivatul expus la lumina. Rf = 0,83;

- din cauza dificulta|ii de a man selectivitatea si sensibilitatea detectiei, s-a masuratspectrul de fluorescenta al colchicinelor (Fig, 8.35); colchicina are o fluorescenta naturala,dar intensitatea semnalului este mult mai mica in comparatie cu absorbanta in UV; pe de

rnf ita part6' determinarea In fluorescenta nu este potrivita in TLC, deoarece colchicina se

'JP deaza JQ faza ,je excitafie, iar semnalul descreste pentru masuratori succesive; inten-semnalului se imbunatateste semnificativ prin utilizarea extinc^iei fluorescerrfei pe

ilaci de silicagel 60 F254.2) optimizarea picului:- pentru detectia UV, lungimea de unda este parametrul principal care influenteazaj JnSltirnea picului; in tehnica extinctiei fluorescentei, lungimea de unda nu se poateba din cauza fluorescentei indicatorului de la 254 sau 365 nm;- alp patru parametri opera^ionali care pot modifica forma picului sunt: largimea (Sw)

si inalpn163 (Sh) fantei luminii de excitatie, viteza de scanare exprimata ca numar de scanarir punct (nsc) si distanta dintre masuratorile succesive (d^;

- s-a realizat o optimizare pentru cresterea ariei si a inal|imii picului, cercetandu-seinfiuenta celor patru parametri folosind design-ul D optim; matricea confine 11 termenimodel (cu patru parametri, interactiunbile lor si un termen liber); au fost selectionate 18puncte si douS puncte centrale din 2888 puncte ale design-ului factorial complet, fiecarejjasuratoare lacandu-se in duplicat; valorile celor patru parametri au fost setate prin pro-pam-densitometru in domeniul indicat in tabelul 8.23;

Tabelul 8.23 Domeniile parametrului pentru desigmil D optim fi valorile lor optimizate

Parametrullirpmea deschiderii sw (mm)lalifimea fentei Sh (mm)Numar scanari per punct nK (mm)Distanta dintre doua masuratori dm (mm)

Domeniul0,04-0,4

0,4-32-16

0,05-0,2

Optimizat0,23160,1

- modelul a fost ajustat prin regresie multiliniara (MLR), constatandu-se o corelatiedestul de buna intre valorile prevazute si observate ale ariei (Fig. 8.36 (a), R2 = 0,8720, Q2

=0,7645, reproductibilitatea = 0,8984) si inaltimii (Fig, 8.36 (b), R2 = 0,9314, Q2 = 0,9051,Kproductibilitatea = 0,9913) picurilor;

: - s-a stabilit ca efectul principal il are numarul de scanari / punct pentru evaluareairiei si inaltimii, probabil din cauza intarzierii emisiei. prin cresterea numarului de scanariMSC, creste si inaltimea picului;

Pre2ds

368

Fig. 8.36. Aria (a) $i inaltimea (b) picurilor, observate (b) y; prevazute (a),pentru ajustarea MLR

369

- un alt parametru important este inaltimea fantei care afecteaza rezultatele in acela§imod ca si n^, dar al|i doi parametri au o influents mai mica decat ceilalti, chiar daca ei sunl

statistic semnificativi;- dupa optimizarea discutata, au fost alesi parametrii de scanare asa cum se observa

din tabelul 8.23. ;,;i,

3) Validarea metodei . ft

(1) Validarea TLC s-a facut utilizand ariile si inaltimile picurilor separate in dome.niul 0,1-0,6 mg/mL, rezulta o regresie polinomiala de gradul doi, atat pentru reflectanta,cat si pentru fluorescenta (Fig. 8.37), dar din pacate nu s-a atins o liniaritate intre semnalulmasurat si cantitatea de'colchicina aplicata, nici chiar pentru un domeniu ingust de concen- ;

tratie; ''i

(a)

02 0'.3 0.4 05 0.6Concentratia (mg/nU)

02 0.3 0.4 0.5 O.GConcenUaJia (mg/ml)

0.3 0.4 0.5

Concentrajia (mg/rol)

0.3 0-4

Concentratia (mg/ml)

fig. <?J7. Calibrarea neliniara a colchicinelorin reflectanta (a) fi in extinctia fluorescentei (b)

- datele curbelor de regresie in reflectan$a si in fluorescenta pentru arie si pic sunt

date in tabelul 8.24;

370

•lul 8 24 Exactitatea testarii colchicinei. Datele graficelor de calibrare$~ •TTdetoda;jedeteclie__

j^efiectanta

•p^orescis^

Aria "a

-4587,6R7=0,9987

-9596x2

R2=0,9995

b8088,3

28653X

c68,063

-4324,1

inaltimeaa

-2688,9x2

R2=0,9997-13956x2j

b3532^x

18787x

c9,1633

-2254,7

t^fbrm cu aria = a (cone/ + b (cone) + ck Conform cu inalfimea = a (cone) + b (cone) + c•n=6< n = 5

- curbele de calibrare au fost preparate triplicat in trei zile diferite, aplicind cate 5 |iL/fin fiecare solutie standard; au fost determinate ariile picurilor probelor de control si necunos-cute $i s-au calculat concentratiile in acord cu aria picului, aria = f(c), pentru reflectanta si flu-^escenta, deoai'ece panta lor este cea mai mare in domeniul de concentratie ulilizat;

- exactitatea metodei s-a evaluat folosind cinci probe de control si utilizand arii-je picurilor determinate pentru calcularea regasirii (Tabelul 8.25).

Tabelul 8.25 Exactitatea testarii colchicinei

ReflectantaProcent %

6080100120140

Media

regiisirii%RSD%TestCocbran

lest Fischer

Interval

de incredere[195%)

Nominal

mg/ml

0,180,240,300360,42

CW0.273

F^=0301

Regasire %

98,70104,44102.4497,8799,76100,64

7,67C(0,05;5;2)=0,68

F(0,05;4;14)=3,48100,64±4,28

FluorescentaProcent %

6080100120140

TestCochranTest FischerIntervalde Incredere(95%)

Nominalmg/ml0,180,240,300,360,42

0^= 0,644

F»lc=0,68S

Regasire %

114,4492,08105,66103,9899,12103,03

8,52C(0,05;5;2)=0,68

F(0,05;4;14)=3,4g104,60±5,70

Au fost masurate trei serii de probe de control, preparate in trei zile diferite ale validarii.- precizia: au fost calculate repetabilitatea intra-zi si precizia intermediara in zile diferite,

J fecinci concentratii (0,18, 0,24, 0,30, 0,36, 0,42 mg/mL), exprimate ca RSD%; in tabelul 8.26suit prezentate mediile a trei determinari (n = 3) efectuate pentru fiecare concentratie

Tabelul 8.26 Parametrii de fidelitate

•M

i^WKtni de fidelitate•paetabilitatea (RSD)Uaroductibilitatea (RSD)

Reflectanta3,6211,29

Fluorescenta8,269,99

K

371

- limita de detectie - LOD si cea de cuantificare - LOQ au fost exprimate canale pe baza deviatiei standard (Sb) a raspunsurilor blancului: LOD = 3Sb, iar LOQ = 10$, •aceste semnale au fost transformate in termeni de concentratie, utilizand dreapta de calj,brare pentru reflectanta, deoarece ariile picurilor sunt func^ii de concentratie, astfel ca:

- ariile = f(c) si deci:- LOD = 0,0021 mg/mL;- LOQ = 0,027 mg/mL;- deviatia standard a blancului, Sy, s-a determinat masurand sase solutii blanc (n =

6), ceea ce a fost posibil in reflectanja, dar nu si in fluorescenja;- ca probe reale, s-au luat tabletele de colchicina si semintele de sofran (din pasuni)

din care s-a determinat continutul in colchicina, dupa tratarea probelor in modul descrismai sus; rezultatele sunt date in tabelul 8.27.

Tabelul 8.27 Detenninarea colchicineiprin TLC - densitometrie

ProbeColchicina compr., 1 mg, Fabiol SA Buc. (mg/compr.)Semite cu colchicina; extractie Soxhlet (mg/lOOg)

TLC1,03 ±0,028

0,438 ± 0,022

(2) Validarea HPLC s-a facut pentru domeniul de concentratii 30,1-401,3 ng/mLalesolutiilor de colchicina; aceste cantitaji au fost injectate in sistemul HPLC pentru a se eva-lua liniaritatea detectorului; s-a lucrat, de asemenea, si intr-un domeniu mai mare de con-centratie, de 30,1-24075,7 ng/mL; in ambele cazuri, inaltimea picului a fost reprezentatagrafic functie de concentratia solutiilor injectate, inregistrandu-se raspunsul care a fost

liniar (r > 0,999) (tabelul 8.28).

Tabelul 8.28 Datele graGcelor de calibrare

Detectia (nm)Panta

30,1 - 401,3 ng/mL243

0,1246-0,26870,9988

3500,0650-0,01940,9997

30,1 - 24075,7 ng/mL243

0,13672,07020,9999

3500,07260,40330,9999

- probele de tablete si material vegetal au fost masurate la 350 nm, iar ariile picurilorau fost utilizate pentru calcularea concentratiilor lor, folosind curba de calibrare in dome-niul 30,1-401,3 ng/mL; datele experimentale sunt prezentate in tabelul 8.29.

Tabelul 8.29 Rezultatele pentm comprimatele de colchicina fi extracte

ProbeColchSemii

TurbcSonic

icina compr., 1 mg, Fabiol SA Buc. (mg/compr.)ije cu colchicina (mg/lOOg)

extractieare

HPLC1,016 .

0,5300^790,481 1

5 ° - utilizand HPLC, s-a cercetat influenta tehnicii de extractie prin compararea celeiai exhaustive metode — Soxhlet (2,5 h) cu tehnica de extractie cea mai rapida, cum esteirboextractia la 6000 rpm, timp de 5 minute si sonicare (30 min.).

(3) Determinarea spectrofotometrica s-a facut urmand protocolul descris in FR-Xdeterminarea colchicinei din tablete, singura forma disponibila cu continut de

a in Romania; rezultatele au fost foarte asemanatoare cu cele obtinute prin meto-•pLC-densitometrie si HPLC propusa; datele experimentale obtinute sunt prezentate in

tabelul 8.30; aceste rezultate arata o eroare de + 3% fata de valoarea farmacopeii (± 10%).

Tabelul 8.30 Rezultatele determinarii spectrofotometrice a colchicinei din comprimate

frnbe^cfrpfotometrie

Colchicina compr., 1 mg, Fabiol SA Buc. (mg/compr.)1,030

372

1. Marius Bojita, Liviu Roman, Robert Sandulescu, Radu Oprean,, Analiza ?/ controlulmedicamentehr, Vol. 1 p. 439-450 si Vol. 2 p. 26, Ed. Intelcredo, Deva, 2003

2. Liviu Roman, Marius Bojita, Robert Sandulescu, Validarea metodelor de analiza $icontrol, Ed. Medicals, Bucuresti, 1998, p. 168-210

3. Bartolincici A., Druskovic, Sporec A., Vmcovic, /. Pharm. Biomed Anal., 36 (2005),1003-1010

; 4 R.K. Bush, J.W. Georgitis, Handbook of Asthma and Rhinitis, first ed., BlackwellScience Ltd., Abingdon, England, 1997

5 J. Rosenberg, P. Larson, L. Nyborg, J. Clin. Pharmacol. 49 (2000) 199-2066K.H. Kim, H.J. Kim, E.Y. Jeun, S.H. Seo, S.P. Hong, J.S. Kang, J.R. Youm, S.C. Lee,

I Arch. Pharm. Res. 24 (2001) 281-2857D. Handley, Exp. Opin. Invest. Drugs 7 (1998) 2027-20418 D.W. Boulton, J.R Fawcet, Am. J. Respir. Med. I (2001) 1-79 J. Ahlner, R.G.G. Anderson, Eur. Respir. J. 13 (1999) 1230-1235

10R.P. Bakale, S.A. Wald, H.T. Butler, Y. Gao, Y. Hong, X. Nie, C.M. Zepp, Clin. Rev.Allerg. Immun. 14 (1996) 7-35

11Y.K. Tan, S.J. Soldin, J. Chromatogr. 422 (1987) 187-19512H.Y. Aboul-Enein, V. Serignese, Chirality 7 (1995) 158-16213 R. Dhand, M. Goode, R. Reid, J.B. Fink, P. Jahey, M.J. Tobin, Am. J. Respir. Crit. Care

Med. 160(1999)1136-114114 W. Boulton, IP. Fawcett, J. Chromatogr. B 672 (1995) 103-10915 R. Berges, J. Segura, X. Torre, R. Ventura, J. Chromatogr. B 723 (1999) 173-18416 K.B. Joyce, A.E. Jones, R.J. Scott, R.A. Biddlecombe, S. Pleasabce, Rapi Coomun.

Mass. Spectrom. 12 /1998) 1899-1910!7 K.M. Fried, P. Koch, J.W. Wainer, Chirality 10 (1998) 484-491*8 G.A. Jacobson, F.V. Chong, N.W. Davies, J. Pharm. Biomed. Anal.31 (2003) 1237-1243

- Tang, Cgirality 8 (1996) 136-142

373

20 D.W. Boulton, J.P. Fawcett, Clin. Pharmacokinet. 40 (2001) 23-4021 S. Palmarsdottir, L. Mathiasson, J.A. Jonson, L.-E. Edholm, J. Chromatogr. B 6gg

(1997) 127-13422 K. Tachibana, A. Ohnishi, J. Chromatogr. A 906 (2001) 127-15423 C. Yamamoto, E. Yashima, Y. Okamoto, J. Am. Chem. Soc. 124 (2002) 12583-1258924 M.P. Gasper, A. Berthod, U.B. Nair, D.W. Armstrong, Anal. Chem. 68 (1996) 2501-

251425 C. Karlsson, L. Karlsson, D.W. Armstrong, P.K. Owens, Anal. Chem. 72 (2000) 4394-

440126 E. Yashima, J. Chromatogr. A 906 (2001) 105-12527 Necraj Kaul, Dhaneshwax I.R., et al., J. Pharm. Biomed. Analysis 37 (2005) 27-3828 P. Koch, D.R. Hirst, B.R. von Wartburg, Xenobiotica 19 (1989) 1255-126029 F.L.S. Tse, J.M. Jaffe, S. Bhuta, Fundam. Clin. Pharmacol. 1 (1987) 479-48530 M.K. Shellemberg, L. Groves, J. Shah, G.D. Novak, Drug Metab. Dispos. 27 (1999)

201-20531 V. Healzlewood, P. Symonyw, P. Maruff, MJ. Eadie, Eur. J. Clin. Pharmacol. 25 (1983)

65-7232 J. Lee, J.H. Seo, D.H. Kim, Analyst 127 (2002) 917-92033 L.J. Jackman, T. Jen, J. Am. Chem. Soc. 97 (1975) 281834 B. Raman, D. Patil, Indian Drugs 39 (2002) 392-39435 M.L. Qi, P. Wang, L. Wang, Anal. Chim. Acta 478 (2003) 171-17736 K.R. Mahadik, A.R. Paradkar, H. Agrawal, N. Kaul, J. Pharm. Biomed. Anal. 33 (2003)

545-55237 J.R. Vane, R.M. Botting, Inflamm. Res. 4 (1995) 1-1038 H.R. Herschman, Biochim. Biophys. Acta 1299 (1996) 140-15539 D.E. Griswold, J.L. Adams, Med. Res. Rev. 16 (1996) 181-20640 M.C. Allison, A.G. Howatson, C.J. Torrance, F.D. Lee, R.I. Russell, N. Engl. J. Med.

327 (1992) 749-75441 Y. Harada, K. Hatanaka, M. Kawamura, M. Saito, M. Ogino, M. Majima, T. Ohno, K.

Ogino, K. Yamamoto, Y. Taketani, Prostaglandins 51 (1994) 19-33342 P. Prasit, Z. Wang, C. Brideau, C.C. Chan, S. Charleson, Bioorg.Med. Chem. Lett. 9

(1999) 1773-177843 E. Woolf, I. Fu, B. Matuszewski, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 730 (1999) 221-

22744 C.Z. Matthews, E.J. Woolf, B.K. Matuszewski, J. Chromatogr. A 949 (2002) 83-8945 C.M. Chavez-Eng, M.L. Constanzer, B.K. Matuszewski, J. Chromatogr. B Biomed. Sci.

Appl. 748 (2000) 31-3946 U. Werner, D. Werner, R. Mundkowski, M. Gillich, K. Brune, J. Chromatogr. B Biomed.

Sci. Appl. 760 (2001) 83-9047 C.M. Chavez-Eng, M.L. Constanzer, B.K. Matuszewski, J. Chromatogr. B Analyt.

Technol. Biomed. Life Sci. 767 (2002) 117-12948 T. Radhakrishna, D. Sreenivas Rao, G. Om Reddy, J. Pharm. Biomed. Anal. 26 (2001)

617-42849 S. Sattari, F. Jamali, J. Pharm. Pharmaceut. Sci. 3 (2000) 312-316

374

'"In pT. Vallano, R.S. Mazeno, E.J. Woolf, B.K. Matuszewski, J. Chromatogr. B Analyt.' Technol Biomed Life Sci 779 (2002) 249-257

51 M-K- Aravind, R. Prescilla, J.R Ofenstein, J. Chromatogr. Sci. 40 (2002) 26-28_„ g Mao, A. Abrahim, Z. Ge, O.K. Ellison, R. Hartman, S.V. Prabhu, R.A. Reamer, J.

Vyvratt, J. Pharm. Biomed. Anal. 28 (2002) 1101-1113I 53 K V.K. Reddy, J.M. Babu, P.K. Dubey, B.C. Sekhar, G. Om Reddy, K.J. Vyas, J. Pharm.

Biomed. Anal. 29 (2002) 355-36054 *** Indin Pharmacopoeia,Government of India, Ministry of Health and Family,

Welfare, vol. II, appendix 13, A-147, 199655 *** ICH, Q2A, Harmonised tripartite guideline, text on validation of analytical proce-

dures, IFPMA, in: Proceedings of the International Coference on Harmonization,Geneva. March 1994, pp. 1-5

55 *** ICH, Q2B, Harmonized tripartite guideline, validation of analytical procedure:methodology IFPMA, in: Proceedings of the International Conference onHarmonization, Geneva, March 1996, pp. 1-8

57 P.D. Sethi, High Performance Thin Layer Chromatography, Quantitative Analysis ofPharmaceutical Formulations, CBS Publishers and Distributors, New Delhi, 1996

58 J.C. Miller, J.N. Miller, Statistics for Analytical Chemistry, second ed., Ellis Horwood,New York, 1992

59A.L. Huidabro, F.J. Ruperez, C. Barbas, J. Pharm. Biomed. Analysis, 37 (2005) 687-69460 K. Balon, B.U. Riebesehl, B.W. Muller, Pharm. Res. 16 (1999) 882-88861 K. Basavaiah, H.C. Prameela, Farmaco 57 (2002) 443-44962H.G. Daabees, Anal. Lett. 31 (1998) 1509-152263 M.S. Mahrous, M.M. Abdel Khalek, H.G. Daabees, Y.A. Bellagy, Anal. Lett. 31 (1992)

1491-150164 G.C.K. Battermanru S. Heizenroeder, D. Lubda, Labor Praxis 30 (1998) 32-3465 Y. Pramar, V. Das Gupta, T. Zerai, Drug Dev. Ind. Pharm. 16 (1990) 1687-169566 S.S. Dubhashi, P.R. Vavia, Indian Drugs 37 (2000) 464-46867 E. Kourany Lefoll, T.D. Cyr, Ca. J. Appl. Spectrosc. 40 (1995) 155-15968 A.M. Kamel, P.R. Brown, B. Munson, Anal. Chem. 71 (1999) 5481-549269 D.S. Ashton, A. Ray, Anal. Proc. 30 (1993) 44-4670 *** The Official Compendia of Standards, U.S. Pharmacopeia National Formulary, 2004711. Chappel, LC GC Int. 7 (1994) 28272 K. Okusa, H. Tanaka, M. Ohira, J. Chromatogr. A 869 (2000) 143-14973 W. Pleiderer, Ann. Chem. 647 (1961) 16774 *** ICH, ICH Harmonised Tripartite Guideline, 1995, p. 175 *** ICH; ICH Harmonised Tripartite Guideline, 199676 *** ICH, ICH Harmonised Tripartite Guideline, 199677 *** ICHj 1CH Harrnonised Tripartite Guideline, ICH topic Q2B, 199678 E. Bodoki, R. Oprean, M. Tamas, R. Sandulescu, J. Pharm. Biomed Analysis, 37 (2005)

971-97779 J.M. Schmit, Bull, Trav. Soc. Pharm. Lyon 12 (1968) 31-4080 M.S. Karawya, A.M. Diab, J. AOAC 58 (1975) 1171-117381 *** Farmacopeea Romana, X ed., Editura Medicala, Bucuresti, 1998

375

82 *** European Pharmacopoeia, fourth ed., Directorate for the Quality of Medicines ofthe Council of Europe, 2002

83 P.M. Bersier, J. Bersier, Electroanalysis 6 (1994) 171-19184 J. Wang, M. Ozsoz, Talanta 37 (1990) 783-78785 *** French Pharmacopoeia, seventh ed., Commission Pennanente de la Pharmacopee,

Paris, 196586 A. Poulev, B. Deus-Neumann, E. Bombardelli, M.H. Zenk, Planta Med. 60 (1994) 77-8387 T.M. Sarg, M.M. El-Domiaty, M.M. Bishr, O.M. Salama, A.R. El-Gindy, Analyst 114

(1989) 575-57888 *** The United States Pharmacopeia 24 / The National Formulary 19, United States

Pharmacopeia Convention Inc., 200089 M. Al-Fayyad, F. Alali, A. Alkofahi, A. Tell, Nat Product. Lett 16 (2002) 395-400

376

CAP. 9. CRITERII STANDARD DE VALID ARE

APLIC ATII LA DETERMINAREA IN UV A VITAMEVEID3

DIN VITAMINOL, DUPA SEPARAREA El PRIN HPLC

9.1. Criterii standard de validate

Daca un laborator utilizeaza o anumita rnetoda de analiza, el trebuie sa aiba o docu-mentatie sigura ca metoda a fost validata in mod corespunzator, iar responsabilitatea inaceasta privinta revine in intregime utilizatorului, care trebuie sa se asigure ca metoda deanaliza corespunde cerintelor. Acest lucru este valabil atat pentru metodele standard (de laEPA, ASTMA, ISO sau USP), cat $i pentru metodele elaborate intern (In cadrul propriuluilaborator).

Pentru o metoda standard trebuie sa se verifice daca datele/parametrii validati (deexemplu, matricea probei, liniaritatea, domeniul, limitele de detectie si de cuantificare etc.)sunt concordante cu cerintele tipului de analize ce se fac in laborator; daca acestea nu con-corda, este necesara validarea metodei standard in conditiile caracteristice laboratorului,ntilizand criterii proprii.

In cazul In care, Jn documentatia unei metode standard, nu exista nici o indicatieteferitoare la tipul $i rezultatele validarii, se recomandJ efectuarea unei validari complete.

In general, pentru fiecare metoda de analiza trebuie sa fie definite domeniile de ope-1816 (aplicare), pe baza experientei privind metode similare sau acestea se cerceteaza inOtnpul elaborarii unei metode. Aceste domenii trebuie sa fie verificate in timpul validarii

, fnn studii de robustete, care sunt parte componenta a caracteristicilor metodei.Revalidarea se face atunci cand se modifica metoda sau una din conditiile de lucru.

;•* exemplu, daca o coloana lucreaza la 40°C si a fost validata la aceasta temperatura, daca

377

apoi se lucreaza la 41°C sau la o alta temperatura, este necesara revalidarea.Aceasta este necesarS. si in cazul in care se modifica matricea probei sau daca se

schimbS tipul instrumentului si, implicit, caracteristicile tehnice esentiale ale acestuia (deexemplu, daca in HPLC se modifica pompa, respectiv volumul ei).

in sfarsit, daca testele de acceptare ale unui sistem sau rezultatele analizei pentru con-trolul calitatii nu se incadreaza in criteriile de acceptare sau cand nu poate fi identificatasursa erorilor, este, de asemenea, necesara revalidarea partiala sau totala.

Asa cum s-a mai aratat, parametrii pentru validarea metodelor de analiza au fostdefiniti de ICH (International Conference on Harmonization of Technical Requirements forthe Registration of Analytical Procedures, 1995 si 1996) pentru aplicatii farmaceutice, casi de catre reprezentantii industriei si ai agentiilor de supraveghere din Europa, SUA,Japonia. Acesti parametri sunt:

- specificitatea;- selectivitatea;- precizia:- repetabilitatea (inclusa in documentele ICH);- precizia intermediara (inclusa in documentele ICH);- reproductibilitatea (inclusa in documentele ICH);- exactitatea;- caractcrul adevarat (exact);- oblicitatea;- liniaritatea (inclusa in documentele ICH);- domeniul (inclus in documentele ICH);- limita de detectie (inclusa in documentele ICH);- limita de cuantificare (inclusa in documentele ICH);- robustetea sau soliditatea (inclusa in documentele ICH).

Specificitatea este caracteristica metodei de analizS care da raspuns pentru un singuranalit. Exista insa foarte putine metode care dau un singur raspuns pentru un analit, deci unsemnal specific unui singur analit

Selectivitatea se refera la o metoda care da un raspuns (semnal) pentru un numarmic de specii cbimice (analiti), care pot sa fie sau nu diferentiate Una de alta. De aceea,selectivitatea este utilizata mai mult decat specificitatea (care exista, de exemplu, in cazulelectrozilor-enzima). Selectivitatea include si cazurile in care o metoda permite masurareacu exactitate a unui analit, in prezenta unor interferenti, cum sunt polimerii sintetici, enan-tiomcrii, excipientii si produsii de degradare cunoscuti care pot fi prezenji in matriceaprobei.

In cromatografia de lichide, selectivitatea se asigura prin alegerea optima a coloanei(fazei stationare) si a conditiilor de lucru, cum sunt compozitia fazei mobile, temperaturacoloanei si lungimea de unda la care lucreaza detectorul.

In schimb, este greu de precizat care dintre picurile unei cromatograme este pur ?icare corespunde mai multor componente. de aceea, in prezent se utilizeaza detecton spec-troscopici cuplati direct cu cromatograful (cu coloana capilara a acestuia).

Asa, de exemplu, detectorii UV/VTS cu diode in serie (barete de diode) si spectrome-

378

frele de mas5 pot prelucra toate picurile unei cromatograme (evident, pe rand, pe masuracomponentii parasesc coloana cromatografica) si ofera spectre complete ale intregii cro-

fflatograme.Spectrele obfinute in timpul eluani unui pic sunt normalizate si suprapuse pentru

zentarea grafica si pentru a vedea daca, in spectrele astfel prelucrate, picurile corespundC eel putin doi compusi. fn Fig. 9.1 se dau exemple de puritate a picurilor in HPLC.

pur

.limp (min)

Fig. 9.1. Exemple de picuri HPLC:pur fi impur (a) fi spectrele UV

corespunzatoare (b)

Daca semnalul cromatografic nu arata impuritati, evaluarea spectrala identifies piculdia stanga ca fiind impur. Nivelul impurita{ilor ce pot fi identificate astfel, prin aceastametoda, depinde de diferentele spectrale, de performantele detectorilor si de algoritmulsoftware. In conditii ideale, se pot detecta 0,05 - 0,1% impuritati. In ceea ce priveste prin-cipiul detectie in HPLC cu serii de diode, aplicatiile si limitarile privind puritatea picurilorsunt descrise in literatura.

Precizia unei metode este intervalul cu care concords rezultatele testului individualsau al unor serii multiple de mjectari de standarde. In fond, precizia caracterizeaza concor-danja dintre rezultatele masuratorilor individuale sau a masurStorilor seriilor multiple deinjectari.

Deviatiile standard masurate se pot imparti in trei categorii: ale repetabilitatii, alerepetabilitatii intermediare si ale reproductibilitatii. Repetabilitatea se refera la repetareadelerrainarilor (masuratorilor) sau aplicarca lor, in cadrul unui laborator, de catre un singuranalist (operator), cu un singur tip de echipament (aparat), intr-un interval de timp scurt.Trebuie sa se efectueze eel putin:

- 5 sau 6 determinari;- din 3 matrice diferite;

W - 2 sau 3 concentratii diferite.Pentru toate aceste determinari se calculeaza deviatiile standard.

379

Criteriile de acceptare (sau acceptanfa) depind mult de tipul de analiza, de matriceetc. Astfel, pentru analiza unor compusi in controlul fannaceutic de calitate, se poate obtineusor o precizie buna, cu RSD < 1 %, dar pentru probe biologice cu matrice complexe si con-centratii de analit mult mai mici, precizia si deci RSD sunt de ordinul a 16% pentru con-centrajii limita si 10% pentru alte concentratii. Precizia poate varia intre 2% si 20% sauchiar mai mult.

In literature se vorbeste despre precizia intermediara, concept defmit de ICH(1996), prin care se intelege variabilitatea pe termen lung a masuratorilor. Ea se evalueazaprin compararea rezultatelor metodei de analiza utilizati intr-un singur laborator timp de

mai multe saptamani.Precizia intermediara a unei metode poate reflecta si diferentele dintre rezultatele

obtinute de analisti diferi^i, cu instrumente diferite, cu standarde si reactivi proveniti de lafurnizori diferiti, cu coloane din loturi diferite sau poate reflecta diferentele determinate dedot sau mai multi factori din cei mentionati.

Reproductibilitatea, definita de ICH, exprima concordanfa dintre preciziile obtinutede laboratoare si ea permite sa se evalueze si sa se verifice daca metoda conduce la aceleajirezultate daca este aplicata in laboratoare diferite, deci in conditii usor diferite.

Reproductibilitatea unei metode analitice se determina prin analizarea unor portiunialicote din loturi omogene, in laboratoare diferite, de catre analisti diferiti, utilizandaparatura diferita si in conditii de mediu ce pot diferi de la un laborator la altul, care tre-buie sa ramana in parametrii specificaji ai metodei (teste interlaboratoare). In tabelul 9.1sunt date unele varia|ii ce pot afecta reproductibilitatea metodei.

Tabelul 9.1. Variatii care pot afecta reproductibilitatea metodei

- diferente ale temperaturii si umiditatii camerei (laboratorului);- diferenta dintre experienta si constiinciozitatea analistilor;- echipamente cu caracteristici diferite, cum este volumul ramas (intarziat) intr-un sis-

tern HPLC;- variatia conditiilor materialelor si aparatelor, cum este, de exemplu, compozi|ia fazei

mobile in HPLC, pH-ul, viteza de curgere etc.;- vechimea echipamentelor si a materialelor consumabile;- coloane din surse diferite de aprovizionare;- calitatea diferita a solventilor, reactivilor si a altor materiale.

Validarea reproductibilitajii este importanta daca o metoda trebuie sa fie utilizata

in laboratoare diferite.Exactitatea unei metode exprima concordanta intre rezultatele obtinute prin metoda

analizata si valoarea acceptata ca fiind adevarata.Valoare adevarata, pentru o exactitate impusa, se poate obtine in cateva moduri:- o cale consta in a compara rezultatele metodei cu rezultatele date de o metoda de

referinfa data (stabilita); aceasta abordare presupune ca incertitudinea metodei de referinfa

este cunoscutS;

i

y\ . o alta cale admite ca acuratetea poate fi stabilita analizand o proba cu concentratiinjjoscute, de exemplu un material de referinta certificat si comparand valorile masurate

valoarea adevarata furnizata' de producator pentru materialul de referinta; daca nu este(fcponibil un material de referinta certificat, se poate prepara o proba blanc a matricei care• tereseaza cu concentrate cunoscuta; dupa extractia analitului din matrice, acesta se.-jgcteaza in aparatul de analiza si se poate determina regasirea prin compararea raspunsu-. • gxtractului cu raspunsul materialului de referinta dizolvat intr-un solvent pur.

Concentratia trebuie sa acopere intreg domeniul ce intereseaza si sa includa obliga-toriu limita de cuantificare. Regasirea asteptata depinde de matricea probei, de desfasurareaprocedeului de analiza si de concentratia analitului.

In tabelul 9.2 sunt date valori estimate ale regasirii in functie de concenlrafia analitu-ilui.

^Jabelal 9.2. Regasiri ale analitului la diferite concentratii

"SJSstanta activa,%100S10

St l>0,10,01

0,0010,00010,000010,0000010,0000001

Proportie analit

1

10-110-2

10-3

10-4

10-5

10-610-7

io-8

io-9

Unitateade exprimare

100%10%

1%0,1%

100 ppm10 ppm1 ppm

100 ppblOppb1 ppb

Regasirea, media, %

98-10298-102

97-10395-10590-107

80-11080-11080-11060-11540-120

Liniaritatea unei metode de analiza exprima abilitatea de a evidentia ca rezultatelesunt direct proportionate cu concentratia analifilor in probe intr-un domeniu datLiniaritatea poate evidentia si ca media sau mediile unor transformari matematice bine de-

ifraite sunt proportionate cu concentratia din probe.Liniaritatea se determina printr-o serie de 3-6 injectii a 5 sau mai multe standarde ale

:caror concentratii sunt cuprinse intre 80-120% din domeniul de concentratii la care neajteptam. Raspunsurile trebuie sa fie direct proportionale cu concentratiile analitilor.

,.; Ecuatia de regresie liniara, aplicata rezultatelor, trebuie sa aiba o ordonata (inter-cept) nesemnificativ diferita de zero. Daca se obtine un intercept semnificativ diferit dezero, trebuie sa se demonstrcze ca aceasta nu are un efect asupra preciziei metodei.

Liniaritatea se apreciaza grafic sau printr-o evaluare matematica. Evaluarea graficase face observand inaltimea sau aria unui pic in functie de concentratie.

Intrucat deviatiile de la liniaritate sunt greu de sesizat (detectat), se pot utiliza doua, procedee grafice suplimentare:

380 381

- unul consta in reprezentarea deviatiilor de la linia de regresie In functie de logarit-mul concentratiei, daca domeniul de concentratie acopera cateva ordine de marime-pentru domeniile liniare, deviatiile trebuie sa fie egal distribute intre valorile poz-

itive si negative;- un alt mod de abordare consta in impartirea datelor semnalului la concentratiile ce

le corespund, obtinandu-se raspunsurile relative; apoi se reprezinta grafic raspun-surile relative fa[a de concentratie; trebuie sa se obtina o linie orizontala pe intresdomeniul de liniaritate; raspunsurile relative se inscriu pe ordonata, iar concentrati-ile corespunzatoare pe abscisa, pe o scala logaritmica; la concentratii mai mandeviatiile de liniaritate sunt negative; se traseaza linii orizontale paralele ce core-spund, de exemplu, la 95-105%; metoda este liniara pan! in punctul in care linja

raspunsului relativ intersecteaza linia de 95%; in Fig. 9.2 se prezinta, pentru exem-plificare, evaluarea HPLC a cafeinei prin cele doua procedee.

<00

,00 1000

Log cant (ng/L)

Fig. 9.2. Grafice ale liniaritatii cafeinei din probe analizate prin HPLCa) liniaritate clara raspuns/cantitate (11 citiri); b) reprezentare raspunsAogaritm de concentratie; ;"

domeniul liniar mai mare ; R,, = linia de raspuns constant.

Domeniul unei metode reprezinta intervalul dintre nivelul minim si eel maxim, p^*tru care s-a demonstrat ca au fost determinate cantitatile cu precizie, exactitate si liniantaw

382

prin metoda enuntata.Limita de detecfie este punctul in care o valoare masurata este mai mare decat incer-

titudinea ce o insofeste, fiind cantitatea ce mai mica de analit din proba care se poate detec-te dar nu cuantifica in mod necesar.

Spre exemplu, in cromatografie se intelege prin limita de detectie, cantitatea iajectatacare da un pic cu inaltimea de eel putin 2-3 on mai mare decat linia' de baza a zgomotului

d--Limita de cuantificare este egala cu cantitatea injectata care da masuratori precise;

pentru cromatografie, trebuie sa se obtina o inaltime a picului de 10-20 de ori mai mareiJecat aceca a zgomotului de fond.

DacS se specifica precizia necesara la limita de cuantificare, se poate utiliza metodaHURACHEM (Fig. 9.3). Se injecteaza de cate 6 ori un numar de probe ce contin cantitati: descrescatoare de analit. Se calculeaza valorile RSD% corespunzatoare ale preciziei, care| se reprezinta grafic in functie de cantitatea de analit.

Fig. 9.3. Deteiminarea limitei de cuan-tiGcare prin metoda EURACHEM

- se defineste precizia asteptata pentru limita de cuantificare Lq;- se prepara matricea probei stabilita (prevazuta);

• - se dilueaza si se injecteaza de 6 ori;- se calculeaza RSD% pentru fiecare concentratie;- se reprezinta precizia fata de concentratie;- se determina concentratia la precizia asteptata, care este egala cu limita de cuantifi-

care.

Prin urmare, limita de cuantificare este cantitatea egala cu cantitatea de analit carejtorcspunde la precizia necesara stabilita anterior.

Robustetea se evalueaza prin teste care examineaza efectele parametrilor operatio-asupra rezultatelor analitice. Dintre parametrii operationali in liPLC se pot mentiona:a fluxului, temperatura coloanei, volumul de injectie al probei, compozitia fazei mobile,nea de unda la care se face detectia (de regula, m UV), care poate varia intr-un dome-J; se determina cantitativ influenta acestor factori variabili. Cand influenta acestor;tri se situeaza in domeniul de toleranfa stabilit anterior, se considers ca pai-ametrii

383

operational! se afla in domeniul robustefii metodei, deci ca metoda este robustjDocumentele ICH recomanda ca evaluarea robuste^ii metodei HPLC sa se faca infazei de developare (desfasurarea) a analizei.

Evaluarea robustetii prin efectele produse de variajia unuia sau a mai multorparametri, in limite rezonabile, poate fi utilizata si pentru a aprecia necesitatea revalidarijmetodei.

9.2. Validarea unei metode de determinare in UV a Vitaminei D3 din

Vitaminol, dupa separarea sa prin HPLC

Vitaminolul este o formula farmaceutica care contine vitaminele D3, A, E, B2, B12,B6, pantotenat de calciu, niacinamida etc., in urmatoarele cantita$i:

- Vitamina D3 (20 mg D3) 1,6 mg/g ,,- Vitamina A 18,5 ng/g- Vitamina E - acetat (7,9 ng) 39,7 ng/g- Vitamina B2 (riboflavina) 3,1 ng/g- Vitamina B6 (piridoxin-HCl) 3,5 ng/g- Vitamina B]2 (ciancobalamina) 12,0 ng/g- Calciu - pantotenat 12,0 ng/g- Niacinamida (Vitamina PP) 75,9 ng/g- Menadion-Na-bisulfit 7,0 ng/g-Dextroza 826,7 ng/g

1 UI exprima a'ctivitatea a 0,025 g Vitamina D3 pura.

CH3

CH3

9.2.1. Separarea Vitaminei D3 prin HPLCInainte de determinarea spectrofotometrica a Vitaminei D3 este necesara separarea ei

prin HPLC, ceea ce implica:1) utilizarea unei coloane ODS;2) utilizarea, ca faza mobila, a unui amestec de metanol-acetonitril-apa (1000:200:50);

3) utilizarea, ca solvent de elu^ie, a unui amestec de metanol-tetrahidrofuran-dimetil-sulfoxid (DMSO) (500:500:50);

4) standardul intern contine ftalat de diundecil in faza mobila formats din acid acetic-metanol-tetrahidrofuran-dimetilsulfoxid (1000:50:50:50);

5) prepararea probei introducand 1,5 g proba in 20 mL ISS (solujie standard intern);6) injectarea si separarea cromatografica.Specificitatea separarii HPLC si implicit a dozarii Vitaminei D3 in raport cu al{i com-

nenti se evalueaza prin compararea cromatogramelor obtinute pentru:- ejantionul supus dozarii;- o proba de referinta de Vitamina D3 pura;- ua placebo care nu contine Vitamina D3;- un placebo care imboga^este referinfa de Vitamina D3 pura;- o solutie ce confine standardul intern si faza mobila.Jn efectuarea separarii HPLC trebuie sa existe certitudinea ca picul corespunzator

Vitaminei D3 nu se coelueaza intern impreuna cu alte substance. Trebuie, de asemenea, sacuste certitudinea ca standardul intern, faza mobila si alte substante nu sunt incompatibile,sdica nu trebuie sa existe un pic parazit, cu acelasi coeficient de retentie ca eel al Vitamineijj Un procedeu similar se aplica si pentru produsii potenjiali de degradare.

Procedand cu multa atentie si acuratete, respectand conditiile exact stabilite de sepa-jare cromatografica, se poate aprecia ca specificitatea confera garantia ca picul obtinut sisemnalul analitic masurat provin numai de la snbstanta de analizat, deci de la Vitamina D3.

Se reaminteste ca o metoda de analiza este selectiva daca ea permite detectia calita-liva a unei substante chiar in prezen^a alter component! existenti in proba. In cazulVitaminolului, nu se poate vorbi de o astfel de selectivitate, de aceea este necesara sepa-rarea cromatografica HPLC prealabila a Vitaminei D3 din solutia de proba, pentru a seputea identifica picul caracteristic Vitaminei D3 chiar in prezenta altor picuri corespunza-toare Vitaminei E, slandardului intern etc., asa cum se poate observa din Fig. 9.4.

I Fig. 9.4. Cromatogramele

: HPLC ale e$antionului $ireferintei

'i a) cromatograma HPLC a'Samionului de dozat (Vitamina

'I'.% b) cromatograma HPLC areferintei.

384 385

Compararea cromatogramelor HPLC ale probei de analizat §i ale referintei pertnitetestarea specificitajii separarii Vitaminei D3, care se dozeaza spectrofotometric in UV la

254 nm.Testarea specificitatii inseamna si testarea faptului ca nu exista nici o interferenta, deci

ca semanlul masurat se datoreaza numai Vitaminei D3, ceea ce se ob^ine separand cro-matografic un placebo si amestecul lui cu Vitamina D3, asa cum se poate vedea din Fig. 9.4

si 9.5.

Fig. 9.5. CromatogrameleHPLC ale unui placebo (a)$i ale aceluiafi placebo ceconfine fi Vitamina D3 (b)

Din aceasta figura se observa clai lipsa picuhii Vitaminei D3 din cromatograma

placeboului (a).Tot in vederea evaluarii specificitatii, s-au separat cromatografic prin HPLC solutia

de standard intern si aceea de faza mobila, Cromatogramele corespunzatoare fiind date in

Fig. 9.6.

Fig. 9.6. CromatogrameleHPLC ale standardului

intern (a) fi ale fazcimobile (b)

9.2. Dozarea Vitaminei D3 in UV la 254 nm

Odata stabilita specificitatea separarii Vitaminei D3, se procedeaza la dozarea eispectrofbtometrica in UV la 254 nm, interesand exactitatea, fidelitatea sau preciziametodei, care se caracterizeaza si se exprima prin repetabilitate si reproductibilitate, sensi-hilitate ?i liniaritate, adica domeniul de concentratie in care absorbanta (semnalul analitic)variaza proportional cu concentratia analitului.

1) Exactitatea exprima concordanta dintre rezultatele exoerimentale si valoarea ade-varata (sau media aritnictica a tuturor rezultatelor obfinute, X ).

Exactitatea exprima ingustimea acordului dintre valoarea adevarata (sau acceptataconventional ca fiind adevarata) si un rezultat obtinut experimental. Prin urmare, exacti-tatea exprima ingustimea intervalului de incredere. Ea poate exprima si mgustimea acordu-lui dintre valoarea adevarata si rezultatul final al analizei, obtinut prin efectuarea unuimimar de "n" determinari, rezultat final care se exprima prin media aritmetica X ce segaseste in mijlocul intervalului de incredere. Daca nu exista o valoare care sa poata fiacceptata conventional, se poate utiliza o valoare de referinta.

In general, evaluarea exacdtatii se face prin calcularea regasirii cantitafii de sub-stanta luata in analiza. Pentru determinarea exactitatii se aplica metoda de analiza de "n"on a unei solutii de standard (substanta de referinta) si de Vitamina D3 §i se calculeazaregasirea cantitatii de substanta de referin^a cunoscuta.

Exactitatea se poate aprecia prin "oblicitatea experimentala" si prin "oblicitateastatistica".

Oblicitatea experimentala maxima la diferite concentratii se evalueaza in cadrulunui interval de liniaritate care se exprima astfel:

^-•100<S%Xa

Xj = cantitatea de Vitamina D3, in mg/g produs care se dozeaza;Xr = cantitatea de Vitamina D3 gasita experimental, in mg/g produs analizat.

(9.1)

Abaterea P0| pentru fiecare concentratie analizata experimental se calculeazafacand diferenta dintre cantitatea adaugata Xa si cantitatea gasita X,.:

\Xd\ = \Xr-Xa\ (9.2)

Oblicitatea rezulta din compararea datelor pentru o concentratie gasita si o concentratieteoretica, in domeniul de valabilitate, deci validitate, admis pentru metoda de analiza utilizata.

- ; . Determinarea oblicitatii experimentale se face prin metoda adausurilor standard,aplicand metoda placebo-urilor (in prezenta tuturor componentilor, dar in absentaVitaminei D3), in care probelor de analizat li se adauga cantitati cunoscute de solutie stan-dard de Vitamina D3.

Abaterea calculate Xd trebuie sa fie mai mica de 50%, deci \Xd = \Xr -Xa\< 50% ,w domeniul dc liniaritate al metodei, cuprins intre 80% si 120%, in raport cu cantitatea teo-retica de Vitamina 03 de dozat (tabelul 9.3).

387

Tabelul 9.3. Abaterile Xd pentru trei concentrafii diferite

Concentratia teoretica

80%

100%

123,7%

Xa

16,00

17,67

19,15

20,05

21,00

23,10

24,74

xr

16,28

18,02

19,36

20,17

20,87

23,05

24,64

Regasirea, %

101,8

102,0

101,1

100,6

99,4

99,8

99,6

X,], %

1,8

2,0

1,1

0,6

0,6

0,2

0,4

Legenda:Xa = cantitatea de Vitamina D3 dozata (mg/g produs);Xr = cantitatea de Vitamina D3 gasita (mg/g produs);

(9.3)

Oblicitatile (abaterile) care pot sa apara sunt prezentate In Fig. 9.7, in care estereprezentata grafic variatia lui Xr in functie de Xa.

metoda ideala

oblicitate (panta = 1) X''oblicitate

constanta

oblicitate

~~~ cocrenla

oblicitate

proporjionala

Fig. 9.7. Tipuri deoblicit&ti

ce pot sa apara

2) Curba de regresie pentru valorile experimentale, obtinuta prin reprezentarea luiX,. in funcpe de X^ este data in Fig. 9.8.

388

Fig. 9.8. Curbs deregresie Xr/Xa

Aceasta curba de regresie arata o oblicitate crescuta, dar nesemnificativa.to continuare, se aplica tesrtil privitor la ordonata la origine, comparand valoarea zero

I cu un test Student (t). Variants $1 a coeficientului a se estimeaza prin urmatoarea relatie:

^a ~ ^rezidual '15 120,048

iar valoarea testului Student t este egalg cu:

71,329

(9.4)

(9.5)

Se compara cu t13 = 2,16 pentru P = 0,95 (sau 95%).Testul nefiind semnificativ, inseamna ca ordonata la origine nu este semnificativ

diferita de zero.

Desigur ca se poate face si un test de exactitate, comparand panta "b" a valorii teo-retice "1" pentru un test "t" (Student). Variants 5^ a coeficientului b se poate calcula cuajutorul relatiei:

sl = s2.rezidu°'

fn acest caz:

b-l= 0,866

(9.6)

(9.7)

Comparand cu t13 = 2,16 pentru P = 0,95 (deci 95%), se constata ca testul nu estesemnificativ si, prin urmare, panta "b" nu este semnificativ diferita de 1, deci metoda deanaliza este exacta.

Odata evaluata oblicitatea experimentala, se procedeaza la evaluarea "oblicitatiisfatisn'ce" globale maxime pentru o serie de concentrajii. Daca se noteaza cu |-^</| media

389

abaterilor individual \xd\ obtinute la toate concentratiile date in tabelul 9.4, oblicitateastatistica globala se poate aprecia astfel:

i-100 _r*sDii<L £

(9.8)

L = valoarea teoretica indicata pe eticheta medicamentului conditional;RSD = abaterea standard relativa a valorilor gasite prin analiza;t = testul sau variabila Student la un nivel de siguranta de 95% si pentru n-1 grade de

libertate;n = numarul determinarilor analitice, egal cu numarul de probe preparate si analizate.

Intmcat abaterea standard relativa este data de relatia RSD = 100 •anterioara se poate scrie astfel:

" S

•100

, expresia

(9.9)

Valorile oblicitatii statistice maxime sunt date in tabelul 9.4, iar rezultatele obtinutein cazul determinarii Vitaminei D3 sunt date in tabelul 9.5.

Tabelul 9.4. Valorile oblicitatiistatistice maxime

Tabelul 9.5. Rezultatele determinarii Vitaminei D3

xd

1,8

2,0

1,1

0,6

0,6

0,2

0,4

Numar de valori

Media r^l

Abaterea standard S

Abaterea standard relativa RSD

t (6 dd • 1,5%)

L in %Oblicitatea statistica maxima:

(0,96 - 100/1 00)- ̂ ,73/V7 ) 2,45 = 2,28%

0,96 in %

0,70 in %

0,73 in %

2,45

100

Unii autori admit ca oblicitatea statistica maxima poate avea valori situate in inter-valul 1,0-1,5% pentru o anurnita dozare, dar criteriul sau testul eel mai important consta indetectia unei eventuate oblicitati cu ajutorul studiului oblicitatii experimentale.

390

Rezultatul se exprima in procente, avand in vedere ca expresia anterioara reprezintadiferenja intre doua procente, ceea ce apare mai explicit inlocuind RSD cu valoarea sa si

rtaranjand termenii expresiei astfel:

i-100 -100 (9.10)

In aceasta expresie, termenul (g/Jn) t reprezinta intervalul de incredere.3) Fidelitatea exprima concordanta tuturor rezultatelor obtinute, intre ele, respectiv

gradul de dispersie (de imprastiere) intre rezultatele unei serii de masuratori, care provinJin prize multiple, luate din acelasi esantion omogen, in conditii experimentale precis sta-bilite. Fidelitatea este urmarita sub aspectul repetabilitatii si al reproductibilitafii.

Repetabilitatea exprima concordanta dintre rezultatele masuratorilor efectuate inconditii identice, adica: de catre acelasi analist, in acelasi laborator, cu acelasi echipament,cu aceiasi reactivi, al intervale scurte de timp. Repetabilitatea se poate evalua prin calcu-larea abaterii standard relative (RSD%) si prin calcularea intervalului de incredere sau desiguranta, la un prag de incredere de 95%:

- intr-un singur laborator, vezi tabelul 9.6;

Tabelul 9.6. Rezultate obtinute de acelafi laborator

ProdusulAnalistul

LaboratorulZiua

Numar de valori (n)Media X

Vitamir.a D3 (|Jg/g)- 20,23- 20,03- 20,13- 19,85- 20,05- 20,15

Abaterea standard a repetabilitatiiAbaterea standard relativa a repetabilitatii

1 Intervalul de incredere la uni

1 *=

L

nivel de siguranta de 95%

+(s/Vn}= 20,08 ± ̂ ,57 x 0

t(5 dd 1,5%)= 2,57

Vitaminol, Lot AXILI11

620,08 ng/g

S = 0,13ng/gRSD = 0,65%

19,94- 20,22 ug/g

,13/̂ 6)

- pe baza normelor ISO 5725; in acest caz, se aplica acelasi procedeu de calcul dar

391

alegand o abatere standard a repetabilitajii care provine din radicalul mediei vari-antelor rezultatelor mai multor laboratoare, in acest caz, trei: LI, L2, L3 (tabelul 9.7).

Tabelul 9.7. Evaluarea repetabilitafii pentru trei laboratoare diferite

rabelul 9-8- Evaluarea reproductibilitatii rezultatelor pentru trei laboratoare diferite

Produsul Vitaminol, lot A

LI L2

Vitamina D3, [ig/g

20,2320,0320,1319,8520,0520,15

n=18

2 Sl +S2 + S3

20,1819,6819,3519,9819,3319,23

X = 19,86

13

19,8820,2520,3019,6519,6319,53

S? = 0,017

S$ =0,151

sl =0,110

S = 0,305; RSD = 1,536; t = 2,11

Intervalul de incredere al mediei la 95% prag de siguran^t este egal or. 19,86 ± £,1 1 x 0,305/Vl819,71 - 20,01 ug/g

Indiferent de modul in care se calculeaza si se evalueaza rezultatele analitice,repetabilitatea se exprima, de regula, prin abaterea standard relativa (RSD) a repetabilitatiisi prin intervalul de incredere al mediei rezultatelor obtinute.

In general, calcularea RSD se face pentru o "populatie de rezultate" n > 6, iar inter-valul de incredere al mediei se poate determina cu un coeficient de siguranta a = 0,05.

Reproductibilitatea caracterizeaza precizia (fidelitatea) in conditii usor variabile

(putin diferite), variabilitatea referindu-se la:- laboratoare diferite care executa acelasi tip de analiza;- analisti diferiti cu pregatire similara, dar usor variabila;- reactivi identici, dar care provin din surse diferite;- aparate de masura de acelasi tip, dar de fabricatii diferite.Reproductibilitatea se evalueaza prin calcularea abaterii standard relative a repro-

ductibilita|ii si prin determinarea intervalului de incredere al mediei la un prag de sigurantade 95%, concomitent in trei laboratoare diferite, LI, L2, L3, asa cum se poate vedea din

tabelul 9.8. ;S

392

" "" ProdusulAnalistul XI

Laboratorul LIZiuall

| VitaminoL, lot AAnalistul X2

Laboratorul L2Ziual2

" Vitamina Da, ug/g20,2320,0320,1319,8520,0520,15

20,1819,6819,3519,9819,3319,23

Analistul X3Laboratorul L3

Ziual3

19,8820,2520,3019,6519,6319,53

j^iar de vabri (n) 1 8Media X 19,86 ng/gAbaterea standard a reproductibilitatii S = 0,34 )ig/gAbaterea standard relativa a reproductibirjta{ii SR = 1 ,73%Intervalul de incredere al mediei X la unnivelde siguranta de 95% 19,69? 20,03ng/g

X = 19,86 + ̂ ,1 1 x 0,34/Vl8 )t(lldd 1,5%)= 2,11

Trebuie subliniat ca este posibil sa nu poata fi utilizate trei laboratoare diferite pen-tru evaluarea reproductibilitafii. In astfel de cazuri trebuie sa lucreze trei analisti (saunumai unul), dar in conditii de variabilitate a factorilor mentionati mai sus, pentru validareacorecta a metodei de analiza.

4) Liniaritatea se refera la domeniul de variatie proportionala a scmnalului analitic! infunctie de concentratia analitului. Ecuatia dreptei celor mai mici patrate este urmatoarea:

Y= aX + b. Coeficientul de corelatie in cazul studiat este egal cu r > 0,990 pentru eel multS puncte si 3 rezultate pentru fiecare punct.

Pentru cercetarea liniaritatii se utilizeaza datele brute ale analizei pentru apreciereabblicitatii experimentale, prezentate in tabelul 9.9. Regresia liniara permite observareadreptei de raspuns a metodei de analiza utilizata (Fig. 9.9).

25n

y = 0,9512x +1,0619

17 19 21 23

Fig. 9.9. Curbs, deregresie liniarapentru dozarea Vitaminei D3

393

Tabelul 9.9. Rezultatele detenoinarii Vitaminei D3

Cantitatea de Vitamina D.i de dozat

16,00

19,15

20,05

21,00

24,74

Cantitatea de Vitamina D3 gasita((ig/g Vitaminol)

15,9516,4016,4819,6418,9519,5019,5220,8020,1823,5125,8924,5223,5125,8954,52

Ecuatia acestei curbe de regresie este unnatoarea: Xr = 0,951 • Xj + 1,06, iar coeficien-tul de corelatie r = 0,9778, ceea ce indica o oblicitate mica a metodei de analiza ( X, * 0 candXj = 0). Un test F (Fischer) permite sa se obtina asigurarea ca nu este prezent un defect dealiniere. Testul statistic asupra ordonatei la origine arata ca aceasta nu este semniflcativ

diferita de zero.In acelasi context, comparand panta curbei cu valoarea teoretica "1", printr-un test1

Student, se constata ca panta nu este statistic diferita de 1 si, prin urmare, se poate trageconcluzia ca metoda de analiza este liniara in domeniul de concentratie 80-120%, in raportcu valoarea teoretica a concentratiei in Vitamina D3 si nu prezinta oblicitate crescuta.

De regula, pentru studiul liniaritatii se analizeaza eel putin 5 probe cu concentratiidiferite cu eel putin trei determinari pentru fiecare concentratie (asa cum se vede si dintabelul 9.10). Cum ecuatia regresiei liniare este data de ecuatia dreptei: Y = 0.951 • X +1.062, coeficientul de regresie este r = 0,9978.

Pentru efectuarea testului de regresie F se utilizeaza datele prezentate in tabelul 9.11.

Tabelul 9.10. Parametrii necesari testului de regresie

TotalRegresieReziduala

Suma patratelor113,599108,6094,990

Grade de libertate141

L 13

Varianja8,114

108,6090,384

varianta regresiei _ 108,609 _: — ~ — 2,G)2t^yvarianta reziduala 0,384

Comparand cu FJJ = 4,67 pentru P = 95%, se constata ca exista o regresie, testulnefiind semniflcativ.

Testul F poate fi utilizat si pentru cercetarea liniaritatii, folosind datele din tabelul

9.H-

fabehd 9.11. Parametrii oecesari testului de liniaritate

"~Sursa de variajieRezidualaIntraDefect de aliniere

Suma patratelor4,9904,8790,111

Grade de libertate13103

VarianjH0,3840,4880,037

, _ varianta defectului de aliniere _ 0,037

~ 0,354varianta reziduala= 0,1045 (9.12)

Comparand cu F^ = 3,14 pentru P = 95%, se constata c4 testul nu este semnificativ,deci nu exista un defect de aliniere.

5) Sensibilitatea unei metode de analiza consta in capacitatea sa de a detecta variatiijnici ale concentratiei, respectiv a unor cantitati foarte mici de substanta.

Definitia sensibilitatii, potrivit Notei Explicative a Comisiei CEEITI/844/87-FR, esteurmatoarea: sensibilitatea este capacitatea unei metode de analiza de a inregistra variatiimici ale concentratiei, adica o variatie minima care se impune marimii X (de exemplu, con-centratia) de determinat pentru a obtine o variatie semnificativa a semnalului analiticmasurat.

Pentru o metoda deja elaborata si verificata, a carei variabilitate este constants intr-un domeniu de validitate, sensibilitatea ceruta, notata, de exemplu, cu RD, depinde defidelitatea "S" a dozajului, de marja existenta intre concentratia teoretica = 20 (ig/gVitamina D3 si Lj = 17 fig/g Vitamina D3 specificata in norma interna (sau a A.M.M), dee§antioanele dozate in analiza de rutina. Puterea de separare, in acest caz sensibilitateanotati cu RD, este data de diferenta celor doua valori ale lui Ct si L;:

394

(9.13)

8 Ct = concentratia teoretica.Prin urmare, puterea de separare a metodei RD = D (D este puterea de separare pen-

Ira metode a caror variabilitatea nu este Constanta in domeniul de validitate considerat). Deaceea, se calculeaza valoarea lui D astfel:

-Jn= 0,13,n = 3, (9.14)

395

D = 1.96-0,13 = 0^47 ̂ ^ . mtr.a(ieVar D < RD

Pentru metode a caror variabilitate nu este constants in domeniul de validitate considerat (este vorba de metode noi, nevalidate), puterea de separare D se calculeaza cu aju- :ak < ftorul relatiei: -Sp '1;j»i !

^ //\ f\c l.\ O .

(9.16)

in care:t == variabila Student, dependents de numarul gradelor de libertate (k = n-1), la un

nivel de siguranta de 95%;n = numarul de probe de esantion pentru care s-a estimat "S";S = estimata abaterii standard reale s a metodei analitice;ne = numarul esantioanelor prevazute a fi analizate in rutina (ex.: in dozajul duplicat

ne = 2);RD = puterea de separare impusa (ceruta).

Se admite ca se elaboreaza o alta metoda, mai putin precisa, pentru care S = 1,7 g/gVitamina D3 (6 valori) si mai rapida; in cazul unui eseu in duplicat:

)=2'57'1'.I = 3,lAJg/g; in acest caz D > RD (9.17)

Numarul de eseuri necesare in determinarile de rutina, pentru ca D sS fie mai mic

dccat RD, este egal cu:

D<RD=> — — < 3 ; deci ne = 3 (9.18)ne

Trebuie subliniat ca, pentru determinarile de rutina, se accepts o sensibilitate maimica numai dacS metoda este suficient de rapida pentru a permite efectuarea unui numar

mare de determinari intr-un timp rezonabil.De regula, sensibilitatea se exprima prin panta dreptei de regresie, sensibilitatea

putand fi asimilata cu puterea sau capacitatea de separare a metodei de analiza, deci cu ceamai mica abatere care se poate detecta prin metoda considerata, cu un coeficient de sigu-

ranta a = 0,05.Daca se considers ca numarul de prize "n" luate dintr-un esantion omogen este foarte

mare, puterea de separare se apreciaza cu expresia: D < 1,96 • Sj-Jn (rcpetabilitatea), incare 1,96 reprezinta valoarea variabilei t a lui Student pentru o incredere de 95%, caz incare n —» co (deci raportul numarului probelor si numarul citirilor tinde catre infinit).

In determinarile de rutina se recomanda, prin normativele in vigoare, triplarea doza-jului, cand n = 3; in acest caz, D > 0,147 ug/g. Expresia 1,96 • S/-Jn reprezinta o abatere,in care variabila "t" este aleasa la o valoare minima, daca se poate demonstra ca variabili-tatea metodei de analiza utilizata este constanta in domeniul de validitate (incredere sausiguranta), ceea ce este valabil pentru metodele bine cunoscute, care functioneaza corect.

396

I az contrar, trebuie schimbata valoarea tg 05 in functie de numarul gradelor de libertate_ ji-1 Daca n = 3, pentru K = n-1 = 2, tQ 05 = 4,30 (abaterea intre doua valori ale concen-tjei care se Poate distinge cu o probabilitate de 95%, este considerata, din prudenfa, mai

J^edecatdubla).jn normele CEE, unul dintre criteriile de validare este pragul de detectie. In cazul

ijdarii metodei de dozare a Vitaminei D3 din Vitaminol, pentru aprecierea pragului dedetectie, trebuie sa se tina seama de urmatoarele date:

Vitaminolcantitatea (cunoscuta) de Vitamina D3

din proba/e°antionul analizat este egalacua = 21,4(j.g/g

1 zgomotul de fond, s. pragul de detecjie (2 x zgomotul de

fond), deci 21,4 x 3/32 = 2 tig I g

Inaljimea picului

32mm

1,5 mm

3,0mm

Pentru estimarea pragului de cuantificare prin metoda blancurilor, se pot utiliza douadee:a) conform USP XXH- injectii blanc

- media X- abaterea standard- pragul de cuantificare = 10 s

- inaltimea picului2,1 mm2,8 mm2,3 mm1,8 mm2,9mm2,7 mm2,43 mm0,44mm4,40 mm

- deci: 21,b) conform metodologiei de validare

- injectii ale esantioanelor care contincantitafi cunoscute de Vitamina D3

1,02,02,53,03,54,05,0

1,53,03,54,55,06,07,5

Dreapta de regresie corespunzatoare acestor date analitice este prezentata in Fig. 9.10.

397

Fig. 9.10. Dreapta de regresiefi pragul de cuantiScare

Mai trebuie mentionat ca, la criteriile de validare cuprinse in nota explicativa a CEE,se adauga si unele "tcste de conformitate", cum sunt, de exemplu, pentru HPLC, numarulde talere teoretice, asimetria picurilor, timpii de retenjie, rezolutia etc.

Din toate cele prezentate in acest paragraf, se pot trage o serie de concluzii importante:1) o metoda de analiza poate fi considerate ca validata daca s-au determinat si sta-

bilit: exactitatea, fidelitatea (repetabilitatea, reproductibilitatea si chiarrobustetea), specificitatea-selectivitatea, sensibilitatea, pragurile de detectie si decuantificare, liniaritatea si domeniul de variabilitate (mcredere) si daca i se cunoscoblicitatea (abaterea) si interferentele, ca si posibilitatea de rezolvare a cestora;

2) pentru fiecare medicament si procedeu, tehnica sau metoda de analiza, seintocmeste un dosar de validare care trebuie sa cuprinda: o descriere complete,detaliata a modului de lucru, de operare (care include principiul care sta la bazametodei de analiza, reactivii necesari 5! gradul de puritate cerut, aparatura utiliza-ta si performantele ei, conditiile experimentale (domeniul de concentrate, pH-ul,solventii, forta ionica etc.), calculele care s-au facut, inclusiv evaluarea statisticsa rezultatelor si, implicit, a erorilor, astfel incat orice analist competent in dome-niul analizei si controlului de medicamente sa poata reproduce si aplica metoda;

3) de regula, la folosirea metodelor de analiza si control a medicamentelor au fostobservate unele probleme, Intre care:

- absenta dozajului probei care contine o impuritate critica, un produs dedegradare sau un standard intern necesar pentru obtinerea asigurarii ca meto-da este adecvata;

- absenta indicatiei tuturor specificatiilor metodei de analiza sau selectareanepotrivita a unora dintre acestea;

- insuficienta documentare asupra metodei sau alegerea nepotrivita sau inac-ceptabila a metodei de analiza, a reactivilor si a aparatclor de masurare;

- utilizarea unor materiale de referinta necorespunzatoare sau nccaracterizatecomplet si corect;

- date incomplete privitoare la metoda de analiza sau la produsul farmaceudcanalizat;

- toate aceste aspecte trebuie sa fie evitate si corijate, inainte de a publica o

398

metoda de analiza si control, deoarece, altminteri, o astfel de metoda, cudefectiunile si neglijentele mentionate, nu poate fi acceptata;

4) la elaborarea si, mai ales, la alegerea unei metode de analiza si control de medica-mente (cazul eel mai frecvent rntalnit in practica farmaceutica) trebuie sa se tinaseama de progresele tehnice si stiintifice ale momentului;

5) in unele cazuri se impune revalidarea unei metode de analiza si control, mai alescand:

- se transfera o metoda de analiza, elaborata anterior, la controlul de cah'tate aunui medicament;

- se modifica semnificativ un procedeu de obtinere a unei materii prime sau aunui intermediar;

- se schimba compozitia unui produs finit, deci a unui medicament;- o metoda de analiza este utilizata pentru prima data intr-un laborator, inclusiv

de analiza si control de medicamente, caz in care este bine sa se verifice dacarezultatele anaUtice obtinute concorda cu cele menfionate in dosarul de vali-dare, mai ales in ceea ce priveste exactitatea si precizia metodei;

6) datele inscrise in dosarul de validare trebuie sa faca o critica obiectiva a perfor-mantelor metodei de analiza, pentru ca acestea sa fie un ajutor real si util pentruanalistul care aplica metoda.

1. Liviu Roman, Marius Bojita, Robert Sandulescu, Validarea metodelor de analiza ficontrol, Bazele teoretice f i practice, Ed. Medicala, Bucuresti, 1998, p. 129-151

2. Marius Bojija, Liviu Roman, Robert Sandulescu, Radu Oprean, Analiza fi controlulmedicamentelor, Vol. 1, Ed. Intelcredo, Deva, 2003, p. 451-467

3. ICH - International Conference on Harmonization of Technical Requirements for theRegistration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of AnalyticalProcedures. Geneva, 1995, 1996

4. Commission of the European Communities "Guidelines on the Quality, Safety andEfficiency of Medicinal Products for Human Use", 1990

5. Ferret - Liandet A., Organisation, raise en oeuvre et suivi d'un systeme de qualite6. United States Pharmacopoeia, United States Pharmacopoeia! Convention Rockville

19951. United States Pharmacopoeia, XXIII, 1993

399

CAP. 10. VALEDAREA UNEIMETODE

GAZCROMATOGRAFICE

10.1. Notiuni introductiveCromatografia de gaze (gazcromatogarfia sau cromatografia in faza gazoasa) este,

prin excelenta, o metoda de separate a substantelor volatile si usor volatilizabile la tempe-ratori sub 400°C. Metodologia analizei gazcromatografice se aplica si substantelor medica-mentoase, impuritatilor continute de acestea si substantelor inrudite, acestea din urmaincluzand si metabolitii substantelor medicamentoase "~5'.

Separarea gazcromatografica (GC) se realizeaza pe coloane cromatografice specialconcepute, pe baza a doua procese (in functie de natura fazei stafionare) si anume:

- repartitia Tntre q faza stationara lichida si o faza mobila gazoasa, numita gaz purta-tor (ex.: He); aceasta tehnica se numeste cromatografie gaz-lichid (CGL);

- adsorbtia pe o faza stationara solida, urmata de elutia substantelor adsorbite cu ofaza mobila gazoasa; aceasta tehnica se numeste cromatografie gaz-solid (CGS).

Substantele supuse analizei GC strabat intreaga coloana (lunga de 1-4 m; exista sicoloane capilare Golay de 10-50 m, cu d.i. = 0,1-0,5 mm), cu viteze diferite, astfel ca eleparasesc coloana succesiv, fund conduse la un detector potrivit, unde se face identificarea;semnalele detectorului sunt apoi transmise la un recorder care inregistreaza gazcro-matograma amestecului de substante separate. Mentinerea moleculelor substantelor ana-lizate la o anumita temperatura (mai mica de 400°C) se face cu pastrarea integrita^ii chi-mice a moleculelor.

Realizarea practica a analizei GC se face cu un gazcromatograf, pentru care se da, tnFig. 10.1, o schema de principiu; pentru introducerea probelor in gazcromatograf, se potutiliza microseringi, Fig. 10.2, sau diverse tipuri de injectoare, Fig. 10.2.B si Fig. 10.2.C.

400

Fig. 10.1. Schema de principiu a unui gazcromatograf

...Mectie . Coloana Detector ;Inregistrator

Cuptor

Rezcrvorgaz purtalor

(A)

fi(A) Seringa de 10 uL; exista si seringi de 0,1-1,0 uL

3 —=

Fig. 10.2. Modele de microseringa (A), injector cu divizor (B), injector la rece (C) ?iinjector cu vaporizare directa (pentru o mie de injectii) (D)

- B 51 C: 1 = iejire sept de curatire; 2 = ie$ire splitare; 3 = seringa; 4 = sept otin cauciuc; 5 = intiare gaz purtator, 6 =

I'anjon din sticlS; 7 = camera de vaporizare; 8 = coloana capilara; 9 = aer de rScire; 10 = valva de intrare; - D: 1 =

seringa; 2 = sept; 3 = intrare gaz purtator; 4 = manson; 5 = coloani

401

Injectoarele utilizate sunt, de regula, incalzite (exista insa si injectoare la rece, exem-plul (C) in figura anterioara), ceea ce permite volatilizarea substantelor organice, inclusivmedicamentoase, inca din faza de injectie; apoi moleculele in faza gazoasa sunt antrenatede un gaz purtator, cum sunt AT, He, N2 etc., in coloana cromatografica in care se face se-pararea analitilor.

Trebuie precizat ca reusita separ5rii in GC depinde in mare masura de conditiile pe

care trebuie sa le indeplineasca un gaz purtator si anume: sa aiba puritate mare, sa fie inertefata de substance analizate, sa aiba o vascozitate redusa (pentru a nu fi necesara cre$tereatemperaturii), sa aiba conductibilitate termica potrivita, comparabila cu sistemul dedetectie, iar debitul sa se faca la o viteza optima, care variaza cu diametral interior alcoloanei gazcromatografice; asa, de exemplu, pentru un d.i. = '/< {ol = 0,635 cm = 6,35 mm(1 tol = 2,54 cm), viteza gazului purtator trebuie sa fie de 50-70 rnL/min, iar pentru un d.i.= 1/8 tol = 3,175 mm, viteza gazului purtator trebuie sa fie de 25-30 mL/min.

In general, se injecteaza 1-10 uL (sau mai putin) solute de analizat. In cazul sub-stantelor foarte volatile, introducerea probei in gaz-cromatograf se face prin tehnica "head-space", pentru care se prezinta o schema in Fig. 10.3; pentru date suplimentare referitoarela coloanele cromatograflce (clasice si capilare), la fazele stationare si suporturi etc., sepoate consulta "Analiza si controlul medicamentelor", Ed. Medicala, Bucuresti,2002/1003, Vol. 2, p. 202 si u., M. Bojija, L. Roman, R. Sandulescu, R. Oprean.

SchonoKTMprobo

Pozijie normals Prraurizare Injccpc

Fig. 10.3. Schema de principiu a tehnicii "head-space":A = sistemul Hcadspace HS6;

B = Sacon, gamituiS, incl si capsula de alutwniu;

C ~ sistemul de injecfie al HS6.

402

10.2. Conditii de operare in crornatografia de gaze

•„ Conditiile de lucru (operare) in crornatografia de gaze implies tratarea mai multor:, tinandu-se seama de relatiile urmatoare:

si b = nVR/^IN (10.1)in care: b = largimea picului cromatografic la baza; VR = volumul de retentie; VM =

j volumul mort; K = CS/CM = coeficientul de repartitie al substanjei in faza stationara si1 faza mobila; N = numarul de platouri teoretice.

Exista, desigur, mai multi factori care infiuenteaza procesele de separare in gazcro-matografie. O separare buna depinde de volumele substantelor sau de distantele dintrefimpii lor de retentie §i de largimea picurilor lor; de aceea, pentru a imbunatati separarea,trebuie sa se actioneze asupra unor factori, prin modificarea debitului fazei mobile gazoase,a naturii coloanei, dar si prin variatia temperaturii. Prin toate aceste modificari se conferagazcromatografiei o suplete reala de utilizare. Trebuie precizat ca temperatura modificatensiunea de vapori a substantelor ce se separa, a caror volatilitate intervine in procesul defepartitie a moleculelor de analiti intre faza mobila gazoasa si faza stationara. Astfel, oncecrestere a temperaturii determina o crestere a concentratiei substan^elor in faza mobilagazoasa si, implicit, o scadere a coeficientului de repartitie, K = CS JCM , iar once scaderea temperaturii actioneaza invers; aceste variatii ale temperaturii se rasfrang asupra:g 1) marimilor de retentie VR, dR sau t-^; cu cat temperatura creste, cu atat scade va-iparea K si, deci, cu atat substantele separate ies mai repede din coloana, iar VR este directproportional cu K; s-a observat ca o cre§tere a temperaturii cu 20°C mic§oreaza volumulde retentie la jumatate;

2) largimii picurilor substan^elor separate; cre?terea temperaturii determinaapropierea si ingustarea picurilor la baza (b) in functie de volumul de retentie, VR; conditii-le referitoare la temperatura sunt valabile numai in anumite limite, deoarece, conformteoriei cinetice, influenta temperaturii asupra inaltimii talerelor teoretice si, implicit, asupranumirului lor, pentru o coloana cu o anumita lungime data, trece printr-o valoare optima;de aici rezulta ca, pentru un anumit analit existent intr-un amestec, sunt necesare incercaripreliminare de stabilire a domeniului de temperatura pentru care eficacitatea coloanei estemaxima sau optima (acest domeniu se stabileste pe baza curbei De Wet si Pretorius, datade ecuatia H = A + B/T + C T ; A = difuzia turbulenta, B = difuzia longitudinala, C = coe-ficientul de rezistenta la transferul de masa, T = temperatura);

3) programarea temperaturii se face astfel incat sa permita obtinerea unor separaribune prin accelerarea proceselor cromatograflce; pentru aceasta, separarea cromatograficaincepe la o temperatura mai joasa, dar suficienta pentru separarea compusilor mai putinretinuti; apoi temperatura este marita treptat pentru a putea avea loc elutia celorlalte sub-stante, in timpi mai scurti (rapizi), cand se obfin picuri mai stranse, cu baza mai mica;

4) viteza de trecere a fazei mobile are o influenza asupra inaltimii talerului teoretic,<ie aceea trebuie utilizata o viteza optima, definita pe baza curbei lui Van Deemter pentrufiecare coloana; viteza optima a fazei mobile se calculeaza astfel: v = -J.B/C ; pentru o ast-fel de viteza, inaltimea talerului teoretic este mai mica, coloana avand un numar mare de

403

•*• .«M -**- mill'