IntrodeucereBiologia molecular a evoluat n ultimii 10 ani datorit progreselor realizate n cercetrile de biochimie, genetic, tehnicilor de microscopie electronic, tehnologia ADN recombinat i a informaticii. Toate acestea au permis modificarea experimentului biologic cu a substratului molecular.

Ultimii ani s-au caracterizat prin accelerarea cercetrilor la nivelul ntregului genom la multe specii.

Secvenializarea genomului uman a avut un rol important n biologia molecular prin care, lumea tiinific de azi sper s neleag modul n care acesta este organizat, cum funcioneaz i va permite tratarea unor boli. Gradul nalt de conservare ale secvenelor genomului uman i a principalelor specii de ferm, a permis folosirea hrilor fizice ale acestora.

Primul genom secvenializat aparinnd unei specii de ferm a fost cel de gin (Hillier i col., 2004; Wong i col., 2004), taurine, iar n 2005 a nceput cel de la suine. Existena acestor informaii va permite localizarea genelor cu efect major asupra caracterelor economico-productive, va asigura informaiile din domeniul molecular n managementul i ameliorarea animalelor.

Numrul de markeri moleculari descoperii a crescut, iar o parte din acetia vor fi folosii n programele de ameliorare, acolo unde se va considera c pot mbunti progresul genetic. Informaiile provenite de la aceti markeri vor fi completate cu performanele rezultate n urma testrii, ambele fiind luate n considerare la estimarea valorii de ameliorare a unui anumit caracter, mbuntindu-se acurateea estimrii sale i crend astfel, o generaie mai valoroas din punct de vedere productiv sau al rezistenei la mbolnviri.

n Romnia exist o serie de uniti de cercetare dezvoltare cu preocupri n ameliorarea i n identificarea markerilor moleculari la rasele crescute de noi. Primele studii au fost realizate utiliznd markeri imunohistochimici i biochimici (grupe sanguine i proteine serice pentru taurine cabaline i ovine la IBNA Baloteti i la ICDB Baloteti. Alte uniti de cercetare determin profilele proteinelor serice i din lapte pe care le coreleaz cu diferitele caractere fenotipice de interes economic folosite n ameliorarea ovinelor, ICDOC Palas Constana, SCDO Popui, SR Romsuin.n domeniul diagnosticului i profilaxiei unor boli majore la animale (gripa aviar, pesta porcin, etc) s-au fcut progrese remarcabile. Tehnicile de biologie molecular se aplic n cadrul Institutului de Diagnostic i Sntate Animal dar i n multe laboratoare sanitare veterinare judeene.I. EVOLUIA CELULELOR

Lehninger (1992), consider celula ca o combinaie complex de molecule organice capabile de autoorganizare, autoreplicare, schimb de energie i materie cu mediul, prin intermediul unor reacii organice consecutive i catalizate enzimatic.

Primii polimeri biologici sunt considerai acizii nucleici deoarece sunt singurele molecule capabile de autoreglare (care ar fi putut servi drept matrice pentru propria lor replicare).

n orice proces de copiere se produc inevitabil erori, care vor genera copii imperfecte. Prin replicri repetate, secvena de nucleotide din polinucleotidul original va suferi modificri importante. n acest mod va aprea o varietate de molecule cu informaie diferit. n cazul ARN aceste molecule diferite, care apar, pot explica proprietile fundamentale, forma i comportamentul acestuia. Molecula de ADN posed dou caracteristici speciale;

conine n secvena nucleotidelor informaia pe care o poate transmite n procesul de sintez a proteinelor prin ARN mesager;

molecula are o structur unic de nfurare care permite s interacioneze cu alte molecule si s rspund la condiiile de mediu (ARN ribozomal i ARN de transfer).

Cele dou caracteristici una informaional i alta funcional reprezint dou proprieti eseniale pentru evoluie. Secvena nucleotidic din ADN reprezint genotipul, adic informaie transmisibil a unui organism, n timp ce forma structural reprezint fenotipul, adic expresia informaiei genetice asupra creia opereaz selecia natural (1, 34, 56, 86).Dintre acizii nucleici ARN a aprut primul

Cercetrile de biologie molecular (1981) au artat c intronul, o secven care se gsete n molecula de ARN premesager, dar care este eliminat din ARN mesager matur, poate s se autoexcizeze din molecula precursor, fr intervenie enzimatic. Apare prima dovad c ARN poate funciona ca o enzim i c secvena intronic poate reprezenta enzima ARN replicaza care ar cataliza propria replicareas.n 1983 s-a descoperit a doua specie de ARN catalitic ARN replicaza, care poate fi considerat, primul sistem viu sau molecula primordial a vieii. ARN replicaza se presupune c a aprut ca o condensare prebiotic aleatorie care a condus la formarea de polimeri cu o cretere progresiv n lungime a catenelor. La nceput, aceti polimeri nu aveau nici o funcie dar o molecul dintre acestea a putut s dobndeasc funcia de ARN polimeraza-replicaza, capabil de a introduce erori din cnd n cnd. ARN replicaza ipotetic a evoluat spre variante capabile de a asigura replicri mai rapide i cu o precizie mai mare de copiere a moleculelor parentale (52, 56, 86).ARN este considerat molecula primordial a vieii i nu ADN, deoarece:

riboza (glucidul coninut de ARN) se realizeaz mult mai uor dect dezoxiriboza (glucidul coninut de ADN);

structura ciclic a dezoxiribozei (din ADN) nu posed gruparea 2hidroxil. Gruprile 2 i 3 joac rol structural n ARN i sunt implicate n formarea structurii teriare a ARN de transport (forma de trefl), prin legturi de H; ADN neavnd gruparea 2hidroxil nu se poate replia pentru a lua forme tridimensionale compelxe, impuse de activitatea catalitic. gruparea 2hidroxil a ribozei joac ea nsi un rol catalitic direct. Exemplu capacitatea de autoexcizie (matisare) a intronilor din ARN mitocondrial

celulele cunoscute azi, toate au n genom ADN, dar precursorii ADN sunt todeauna sintetizai prin reducerea precursorilor difosfai nucleotidici ai ARN cu ajutorul unei enzime conservate de-a lungul evoluiei: ribonucleoziddifosfat reductaza.S-a demonstrat astfel c molecula de ARN posed cele dou proprieti obligatorii evoluiei: de replicare al informaiei genetice i de catalizator enzimatic (ribozomii).

Se sugereaz c acum 3,5-4 miliarde ani molecula de ARN a devenit un sistem autoreplicativ. Cu acest sistem ncepe evoluia sistemelor vii pe pmnt, pentru ca mult mai trziu ADN s preia funciile ARN, la nivelul celulei organizate. Aceast schimbare apare atunci cnd celula devine mai complex i cnd ea va necesita o cantitate mai mare de informaie i mai stabil dect cea oferit de moleculele de ARN. Deci ADN apare ca o adaptare la creterea complexitii sistemului celular i nu ca o parte component a celulei ancestrale.

Este foarte greu de stabilit momentul n care molecula de ADN a preluat funcia exercitat de ARN. Ambele tipuri de molecule se gsesc n celulele actuale, ndeplinind funcii diferite , fiind n strns colaborare.

Funciile distincte se datoresc diferenelor chimice mici (ADN conine timin i dezoxiriboz, iar ARN conine n loc de timin, uracil i riboz n loc de dezoxiriboz).

ADN ca depozit al informaiei genetice, este mult mai stabil din punct de vedere chimic (genetic) dect ARN. Stabilitatea moleculei de ADN este dat de:

structura dublu catenar, care permite moleculei s se repare rapid, n cazul n care apare o modificare n secvena ei (n timpul replicrii) sau o leziune la nivelul catenei datorit dezoxiribozei care nu are gruparea 2hidroxil ceea ce o face mai rezistent la hidroliz comparativ cu riboza din ARN.

ADN care conine ntreg setul de gene i sisteme de control care permit transcripia sub forma moleculelor de ARNm specifice proteinelor celulare i celorlalte tipuri de ARN (de transport i ribozomal) necesare pentru sinteza lor (2, 15, 29, 34).

1.1 Caracteristicile procariotelorCelula procariot (pro- nainte, karyion smbure sau nucelu).

Din categoria procariotelor fac parte toate bacteriile de forme i mrimi diferite. Au membrana celular care formeaz un singur compartiment citoplasmatic, fr o structur intern bine organizat. Conine un singur cromozom, constituit dintr-o singur molecul de ADN circular, fr a prezenta un nucleu bine conturat (fig.1.1). Bacteriile se multiplic prin diviziune simpl, n dou pri, numit diviziune binar, n funcie de condiiile de mediu. Neexistnd compartimente intracelulare transcripia ADN i transducia ARNm (sintez proteic) au loc concomitent. Un singur tip de ARN polimerizeaz, transcrie cele trei tipuri de ARNm, ARN r, ARNt. Fig.1. 1. Celula procariot.ADN circular, specific procariotelor.Bacteria cea mai cunoscut din punct de vedere biochimic i genetic este Escherichia coli (E.coli).

Cercetrile de biologie molecular au demonstrat c 90-99% din informaia genetic, existent n genomul unei celule eucariote, este represat, deci este netranscriptibil i nu se exprim fenotipic. Exist gene funcionale comune aproape tuturor tipurilor celulare ale organismului respectiv, sunt n mod selectiv activate sau represate n funcie de tipul i stadiul de difereniere al celulei respective. Dac toate genele din organism ar fi transcrise, toate celulele constitutive ar produce acelai tip de proteine i n consecin ar fi identice. Realitatea nu este aceasta, pentru c dei toate celulele conin ntreg patrimoniul genetic, provenit de la oul fecundat, exist un sistem de control care decide i menine expresia anumitor gene i represia altora, n funcie de necesitile celulei respective.

Factorii de control sunt proteinele reglatoare. Aceste proteine sunt codificate de gene reglatoare, mai mult sau sau mai puin active n funcie de tipul celular funciile i vrsta celulei. Proteinele reglatoare au capacitatea de a se lega de ADN, la nivelul unor secvene (regiuni) care controleaz activitatea unei anumite gene structurale i pot bloca represa) sau activa expresia acestei gene (transcripia ARNm necesar sintezei unei proteine specifice), n funcie de cerinele fiziologice ale celuei.

Diferitele forme de via nu sunt stabile, de aceea ele au putut da natere n mod continuu, la organisme diferite fa de predecesori. La schimbarea mediului organismele rspund prin capacitatea de adaptare.

Teoria darwinist implic repetarea a trei procese:

1) selecia, procesul care triaz indivizii api;

2) reproducerea, procesul de generare a progeniturilor i

3) mutaia, care introduce variaii, fr de care nu ar exista alternative asupra crora selecia ar putea aciona.

1.2. Caracteristicile celulelor eucariote

Nucleul, component fundamental prezent la toate celulele eucariote, conine aproape ntreaga cantitate de ADN care formeaz genomul celular. Nucleul ocup aproximativ 10% din volumul total al celulei, dar acesta variaz n funcie de esut, vrsta celulei, activitatea metabolic, gradul de difereniere, patologia celulei.

n structura nucleului s-au pus n eviden patru componente distincte: cromatina nuclear, nucleolul i matrixul nucleolar care formeaz nucleoplasma (sau carioplasma) i membrana nuclear care nchide acest compartiment.Membrana nuclear

Nucleul este nconjurat de o membran dubl trilaminat:

membrana nuclear intern, prin proteinele specifice se leag de lamina nuclear. Membrana nuclear este n contact cu ADN i ARN-urile transcrise n nucleu;

membrana nuclear extern, care se continu cu membrana reticulului endoplasmatic.

ntre cele dou membrane nucleare exist un spaiu perinuclear care are diametrul de 20-40 nm. Proteinele sintetizate de ribozomii legai de membrana nuclear extern, sunt transportate n spaiul perinuclear, care se continu cu lumenul reticulului endoplasmatic (fig.1.2).

Fig.1.2. Structura nucleului la microscopul electronic.Nucleul reprezint centrul metabolic activ care realizeaz funcii primordiale pentru celul: replicarea ADN, transcripia informaiei n ARN, realizarea diviziunii celulare, repararea ADN. n desfurarea acestor funcii proteinele joac un rol important. ARN-urile sintetizate i procesate n nucleu, sunt urmate de sinteza proteic care se desfoar n citoplasm (fig. 1.3).

Fig.1.3 Celula prokariot i eukariot.Transcripia i transducia la celula eukariot.

ARN-urile i alte componente ca proteinele din nucleu trebuiesc exportate n citoplasm, i invers. Toate aceste componente traverseaz membrana nuclear prin porii nucleari, fiind un proces selectiv, nepermind dect anumitor proteine ptrunderea n nucleu. Porii nucleari apar ca nite canale de legtur ntre coninutul nucleoplasmatic i cel citoplasmatic (fig. 1.4). Numrul porilor variaz cu specia i tipul celular.

Fig. 4. Porii membranei nucleare la ME.

n centrul fiecrui complex al porului nuclear apare un canal prin care moleculele solubile n ap pot circula din nucleu i citoplasma i invers. Acest canal conine adesea i un complex proteic granular, situat n zona central, care apare ca o diafragm n mijlocul canalului.Diametrul porului (tunelul cilindric) este de 9 nm i lungimea de 15 nm. S-a observat c moleculele mici (greutate molecular pn la 1500 daltoni) difuzeaz rapid, iar cele mari, mai greu. Proteinele porului nuclear sunt n numr de 100, diferite. Unele au rol de receptori specifici pentru proteinele selectate i un mecanism deosebit de utilizare a energiei pentru trecerea lor n interiorul nucleului sau spre citoplasm. Astfel de proteine conin o peptid caracteristic, numit secven de localizare nuclear (NLS) care este esenial pentru traversare. Transportul nuclear este selectiv necesit un semnal nuclear de import care este prezent numai n proteinele nucleare (enzime, histone, factori de transcripie). Acest semnal este reprezentat de o secven scurt de aminoacizi (4 pn la 8 aminoacizi) care are sarcina electric pozitiv (conferit de obicei de lizin i arginin) i este recunoscut de receptorii specifici din complexul por.Moleculele mai mari dect diametrul porului (de exemplu, ARNm) sunt complexate cu diferite proteine (nucleoproteine), i interacioneaz cu receptorii specifici coninui de proteinele globulare ale porului (2, 30, 34, 56). Receptorii activeaz tranzitul acestor particule n sau n afara nucleului, prin lrgirea canalelor porilor.

1.2.1 Structura cromatinei

Cromatina este complexul ADN-proteine al unei mase dezorganizate de fibre n care, sunt agregai cromozomii n interfaz. Moleculele de ADN ale unui cromozom de la organisme superioare s-ar ntinde pe o distan de centimetri dac ar fi desfurat, dar ea trebuie s fie foarte mpachetat (printr-un proces numit compactare) n nucleu. Molecula de ADN trebuie, de asemenea, s se organizeze n uniti funcionale care s permit exprimarea genelor i replicarea lor. Prin colorare se pot distinge dou zone care formeaz eucromatina i heterocromatina. Genele active transcriptibile n ARNm formeaz zona eucromatic, pe cnd cele inactive zona heterocromatic. Cele dou zone se disting prin sensibilitatea la atacul ADN-azei. La nivelul eucromatinei, cromatina fiind mai puin condensat, enzima are acces i poate aciona, n timp ce la nivelul heterocromatinei enzima este inactiv, accesul ei fiind mpiedicat de gradul mare de condensare a acesteea. Cromatina eucariotelor conine i proteine nehistonice (proteine reglatoare, factori de transcripie precum i enzime ca ADN polimeraza sau ARN polimeraza, enzime de reparare, topoizomeraze).

Toat informaia genetic coninut de nucleu constituie aa numitul genom. Genomul bacteriei E.coli este format de 4, 7x106 pb coninute de o singur molecul de ADN (deci un singur cromozom). Genomul uman (celulele diploide) conine 46 de cromozomi i ADN este format din 6x109 pb iar celulele haploide conin 3x109 pb (6, 25, 32, 34, 75, 86).

1.1.2. NucleolulNucleolul (fig. 1.5) este situat la celulele aflate n interfaz (excepie fac celulele embrionare care nu au nceput sinteza proteinelor proprii).

La microscopul electronic, nucleolul este format din:

centru fibrilar, de ADN netranscriptibil;

o regiune fibrilar dens, de ARN n curs de sintez; o component granular care conine particulele de preribozomi (15, 56, 86).

Fig.1.5 . Nucleolul la MO n plasmocite (a) i la ME (b).

n 1960 s-a descoperit c nucleolul joac rol n sinteza ARN ribozomal (ARNr) i n asamblarea componentelor ribozomale. Sinteza ARNr n nucleol a fost pus n eviden prin folosirea uridinei marcate (3H uridin). Astfel a fost relevat sinteza unui singur tip de transcript primar, reprezentat de molecule precursor de ARNr 45S. Din ARNr 45S, prin clivarea parial rezult cele 3 tipuri de ARN ribozomal: ARNr 18S (ncorporat n subunitatea mic a ribozomilor, ARNr 5,8S i ARN 28S (ncorporate n subunitatea mare a ribozomilo). Aceste molecule de ARN, nainte de a fi exportate n citoplasm, formeaz complexe ribonucleoproteice cu mai multe tipuri de proteine (peste 70 proteine). Proteinele necesare sunt sintetizate n citoplasm i importate de nucleu. Complexele formate stau la baza formrii ribozomilor.

Transcripia ADN deci sinteza ARNr, are loc numai n interfaz. Pe msur ce se apropie faza mitotic, cromozomii se condenseaz, nucleolul se micoreaz iar n metafaza el dispare complet. n telofaz sinteza ARNr este reluat i mininucleolii se reformeaz n apropierea genelor ARNr localizate, n regiunile bine delimitate a 10 cromozomi.

La sfritul mitozei mininucleolii fuzioneaz rapid i formeaz un nucleol mare, care obinuit se observ n interfaz. n mod normal nucleolul ocup 30% din volumul nucleului. n celulele canceroase nucleolii apar hipertrofiai avnd o form neregulat. Gradul lor de hipertrofie este proporional cu gradul de malignitate (2, 15, 34, 86).1.2.3. Matricea nuclearMatricea nuclear este structurat dintr-o reea de filamente insolubile, care ar fi echivalent citoscheletului citoplasmei. Se consider c fiecare tip celular ar avea un set distinct de proteine, pe acestea fiind structurate loops-urile din structura cromozomilor. Acestea ajut la organizarea cromozomilor, reglarea replicrii i a transcripiei ADN.

S-a observat de asemenea, c i ARNm i de transport este coninut n cadrul unor compartimente specifice din nucleu. S-a pus n eviden c sinteza acestor molecule de ARN are loc n zone numite domenii de transcripie. n aceste domenii are loc i ndeprtarea intronilor din transcriptul primar (matisare ), nainte ca ARNm s fie exportat n citoplasm (1, 2, 32, 86, 88).

2. STUCTURA ACIZILOR NUCLEICIAND

Acizii nucleici suntADN-ul i ARN-ul Sediul principal al localizrii ADN-ului este nucleul celulelor.

Sedii secundare sunt: mitocondriile i cloroplastele (n celula vegetal). ARN

Diferitele tipuri de ARN sunt localizate n nucleu, citoplasm, mitocondrii, ribozomi.

Acizii nucleici sunt polinucleotide (produi de policondensarea aunor uniti denumite nucleotide).

Nucleotidele reprezint unitatea monomeric a acizilor nucleici i sunt compuse din:

- o baz azotat heterociclic:

- purine: adenin (A) i guanin (G)

- pirimidine: citozin (C) i timin (T) pentru ADN

citozin (C) i uracil (U) pentru ARN

- o pentoz:

- dezoxiriboza (este prezent n ADN)

- riboza (este prezent n ARN)

- fosfat

2.1. FosfaiiMoleculele biologice care conin informaia genetic sunt acizii nucleici. Acizii nucleici sunt polimeri.

Exist dou tipuri de acizi nucleici: acidul dezoxiribonucleic (ADN) i acidul ribonucleic (ARN). Acizii nucleici sunt produi de policondensare, unitatea monomer fiind un nucleotid, astfel c toi acizii nucleici sunt polinucleotidici.

Un nucleotid este format din fosfat, glucid cu 5 atomi de C (pentoza) i baze azotate (purine sau pirimidine).

Fosfatul anorganic este un complex stabil, format pornind de la acidul fosforic PO4H3 (scris Pi).Esterii fosfat se pot forma dintr- un fosfat i o grupare hidroxil liber (alcool, enol, fenol).

Condensarea unui fosfat i a unui acid de exemplu, sau a unui fosfat cu un alt fosfat d o anhidrid. Exist i anhidride mixte ntre un acid fosforic i un acid carboxilic de exemplu.

Pirofosfatul care este o anhidrid a acidului fosforic (14, 42, 52, 67).

Fig. 2.1. Fosfaii.

2.2. Riboza i deoxiriboza Glucidul specific ARN-ului este riboza iar al ADN-ului este deoxiriboza.

Riboza este o pentoz din seria D n care toi hidroxilii sunt orientai la dreapta. Deoxiriboza deriv din riboz printr-o reducere a funciei alcool a C2-hidroxil. Gruparea 2-hidroxil prezent n ARN l face susceptibil la hidroliz alcalin, n timp ce ADN este rezistent. n schimb att ADN ct i ARN sunt hidrolizai n mediu acid.

Atomii de carbon ai pentozelor sunt numerotai de la 1 la 5.

Fig. 2.2. Riboza i deoxiriboza.

2.3. Baze azotate

Bazele azotate sunt mprite n dou grupe: purinice-adenina, guanina i pirimidinice-citozina, uracil,timin.Singura diferen ntre ele este c ADN conine timin (T) n timp ce ARN conine uracil (U). n ARNt, este prezent i inozina (I). Inozina este nucleozidul hipoxantinei, adenina care este deaminat. ARNt conine, de asemenea, alte nucleozide neuzuale cum pseudouridina, ribotimidina i dihidrouridina.Bazele azotate ale acizilor nucleici aparin celor dou molecule n funcie de nucleul aromatic de baz care constituie scheletul. Nucleul aromatic pirimidinic este format din 6 atomi din care 4 de C i 2 de N (fig.2.3). Cei doi atomi de N se afl n poziia meta (numrul 1 i 3).

O baz purinic este constituit din doi nuclei heterociclici alipii, unul de 6 atomi i altul de 5 atomi, avnd 2 atomi de C n comun (situai la mijloc). n raport cu carbonii comuni, atomii de N ocup poziii simetrice 1 i 3 la stnga, 7 i 9 la dreapta(fig.2.3).

Fig.2.3. Nucleu purinic i pirimidinic.

Diferite baze ntlnite n compoziia acizilor nucleici se deosebesc prin substituienii purtai de acetia.Bazele puriniceAdenina este constiuit dintr-un nucleu purinic n care atomul de C 6 este substituit cu gruparea amin. Ea este singura baz azotat nucleotidic a crei formul nu conine atomi de oxigen (fig.2.4).

Guanina este constituit dintr-un nucleu purinic la care atomul carbon 2 este substituit cu o grupare amin i carbonul 6 printr-o legtur cetonic.

Fig. 2.4. Baze purinice.

Atomii heterociclului purinic sunt numerotai de la 1 la 9 (astfel ncat atomii de N din ciclu s primeasc indicele minim).

Bazele pirimidinice

Sunt reprezentate de citozin, uracil i timina.Citozina este format dintr-un nucleu pirimidinic n care C4 este substituit de gruparea amin i C2 ceton.

Uracilul este constituit din nucleu pirimidinic n care carbonii 2, 4 poart gruparea ceton (fig. 14).

Timina este constiuit din nucleu pirimidinic n care C2 i C4 posed gruparea ceton dar C5 are legat un metil i se mai numete metil-uracil.

Fig.2.5. Baze pirimidinice.Bazele azotate prezint fenomenul de tautomerie

Formele mai stabile:

Forma lactam este mai stabil dect forma lactim

Forma amino este mai stabil dect forma imino

n acizii nucleici exist formele lactam i amino

2.4. Nucleozide i nucleotide

Glucidele, riboz sau deoxiriboz se leag de bazele azotate prin legturi care implic unii din atomii de N ai bazei (N1 la bazele pirimidinice sau N9 la purinice). Legtura dintre o baz azotat cu zaharurile (ozele) d un nucleozid; acestea sunt legturi N-ozidice. ntr-o nucleozid atomii bazei se numeroteaz prin cifre 1 ...n, iar pentru a se distinge carbonii ozei sunt numerotai 1( - 2( (4, 42, 46, 52, 67, 69).Legtura unei ozide cu un fosfat se face prin esterificare la funcia alcool primar (C5() a ozei cu una din cele 3 grupri acide ale fosfatului. Esterul obinut este o nucleotid format dintr-o baz azotat legat printr-o legtur N-ozidic cu o oz i aceasta fiind de asemenea, legat esteric de un fosfat (fig. 2.6). Fig. 2.6. Nucleozide i nucleotide

2.4.1 Denumirea nucleotidelorBazele azotate sunt notate convenional printr-o iniial i o culoare. Adenina cu A i verde; G cu galben. Fiecare baz poate intra n structura a 2 nucleozide n funcie de oz, riboz sau deoxiriboz, fiecare nucleozid poate fi legat de una, dou sau trei grupri fosfat. Se noteaz prin sigla convenional GMPguanozin monofosfat, ADP adenozindifosfat sau ATP adenozintrifosfat.BazaNucleozidulNucleotidul

Adenina (A)Adenozina (A)Adenozin monofosfat (AMP) sau adenilat

Adenozin difosfat

(ADP)

Adenozin trifosfat

(ATP)

Nucelotidelor li se desemneaz baza nucleozidei monofosfat exemplu adenozin monofosfat sau AMP.

Nucleozidele polifosfat sunt difosfat ADP sau trifosfat, ultimile fiind mai bogate n energie ATP.

BazaNucleozidulNucleotidul

Adenina (A)Adenozina (A)Adenozin monofosfat (AMP)

Adenozin difosfat (ADP)

Adenozin trifosfat (ATP)

Guanina (G)Guanozina (G)Guanozin monofosfat (GMP)

Guanozin difosfat (GDP)

Guanozin trifosfat (GTP)

Citozina (C)Citidina (C)Citidin monofosfat (CMP)

Citidin difosfat (CDP)

Citidin trifosfat (CTP)

Uracil (U)Uridina (U)Uridin monofosfat (UMP)

Uridin difosfat (UDP)

Uridin trifosfat (UTP)

Timina (T)Timidina (T)Timidin monofosfat (TMP)

Timidin difosfat (TDP)

Timidin trifosfat (TTP)

AdenozinaEste o nucleozid format dintr-o pentoz riboz legat printr-o legtur N ozidic la o baz azotat adenina (fig 2.7). Alte ribonucleozide sunt guanozina, citidina i uridina.

Fig. 2.7. Adenozina.

DezoxiguanozinaEste o molecul format din pentoz-dezoxiriboz legat de o baz azotat-guanina (fig.2.8).

Alte dezoxiribonucleozide sunt dezoxiguanozina, dezoxitimina.

Fig. 2.8. Dezoxiguanozina.

Uridinmonofosfat

Uridinmonofosfatul sau acidul uridinic UMP este o molecul rezultat prin legtur esteric a fosfatului cu riboza i N ozidic cu uracilul (fig. 2.9).

Fig. 2.9. Uridina monofosfat sau uridilat.

BazaNucleozidulNucleotidul

Adenina (A)Dezoxiadenozina (A)Dezoxiadenozin monofosfat (dAMP)

Dezoxiadenozin difosfat (dADP)

Dezoxiadenozin trifosfat (dATP)

Guanina (G)Dezoxiguanozina (G)Dezoxiguanozin monofosfat (dGMP)

Dezoxiguanozin difosfat (dGDP)

Dezoxiguanozin trifosfat (dGTP)

Citozina (C)Dezoxicitidina (C)Dezoxicitidin monofosfat (dCMP)

Dezoxicitidin difosfat (dCDP)

Dezoxicitidin trifosfat (dCTP)

Uracil (U)Dezoxiuridina (U)Dezoxiuridin monofosfat (dUMP)

Dezoxiuridin difosfat (dUDP)

Dezoxiuridin trifosfat (dUTP)

Timina (T)Dezoxitimidina (T)Dezoxitimidin monofosfat (dTMP)

Dezoxitimidin difosfat (dTDP)

Dezoxitimidin trifosfat (dTTP)

Dezoxitimidinmonofosfat

O nucleotid timin monofosfat sau acidul timidilic este o nucleotid format din timina legat de dezoxiriboz. Se neglijeaz adesea precizarea denumirii de dezoxitimidin monofosfat dTMP. Dezoxiriboz se leag numai de timin i riboz de uracil (fig. 2.10).

Fig. 2.10. Dezoxitimidina Mono Fosfat.

Adenozin Tri Fosfat -ATPUn nucleotid n care trei grupri fosfat sunt ataate la un nucleozid la poziia C5( a glucidului se numete nucleozid trifosfat (fig.2.11). Asfel ATP se numete adenozin trifosfat (P-P-P- C5(- riboz-adenin).

Fig 2.11. Adenozin Tri Fosfat ATP.

Dezoxicitozina trifosfat este o nucleotid compus, cu structura bazat pe adenina legat N ozidic de (D riboz trifosfat (fig. 2.12). Funciile acide ale acizilor fosforici distali sunt foarte ionizate la pH fiziologic. Legturile anhidridice sunt bogate n energie. Dintre gruprile fosfat CTP este unul din substratul ADN polimerazei. Enzimele care utilizeaz nucleotid trifosfat necesit Mg cofactor. Alte nucleotide trifosfat sunt ATP, GTP, CTP, UTP, TTP (14, 31, 42, 52, 67).

Fig. 2.12. Dezoxicitozina trifosfat

RibonucleotideDezoxiribonucleotide

Adenozin monofosfat

(AMP) sau adenilatDezoxiadenozin monofosfat

(dAMP) sau dezoxiadenilat

Adenozin difosfat

(ADP)Dezoxiadenozin difosfat

(dADP)

Adenozin trifosfatDezoxiadenozin trifosfat

(dATP)

Nucleotide naturale libere: AMPc

3,5adenozin monofosfatul ciclic (AMPc) este mesager secund imlicat n transmiterea mesajului hormonal din mediul extracelular n interiorul celulei.

2.5. Legturile de hidrogenO legtur de hidrogen este o legtur srac n energie ntre doi atomi care se atrag electrostatic primul fiind bogat n electroni- nucleofil i cellalt bogat n protoni deci electrofil (atrage electroni).

Astfel, atomul de H cu electron unic necesit pentru completarea orbitalului un alt electron deci nu poate fi dect electrofil fiind atras de atomi care au dublete electronice libere (fig.2.13). Atomii de N i O au 2 i respectiv 4e- pe stratul perifric care nu particip la orbitalii legturilor covalente ai moleculei, (O2 are 2e- neparticipani) i N are 4 e-. Aceasta le confer caracter nucleofil care le permite atracia atomilor electrofili, n special a atomilor de H aceast atracie constituie o legtur de H. Atunci cnd orbitalii care unesc atomul de H cu molecula la stnga i dubletele electronice libere cu atom nucleofil sunt pe aceeai ax legtura de H este mai puternic.

Fig. 2.13. Legturi de H

2.6. Hibridizarea bazelor azotate Hibridizarea AT

Un acid nucleic prezent n soluie molecular formeaz legturi de H asociind nucleotidele 2 cte 2 astfel c o nucleotid cu A s se lege cu T sau cu U n ARN i o nucleotid de G cu C (fig.2.14). Aceast legtur se numete hibridizare (46, 52, 59).

Fig. 2.14 Hibridizarea adenina- timina.

Legtura-hibridizare AT este mai puin stabil dect G C, deoarece ntre adenin i timin se formeaz dou legturi de H iar ntre citozin i gunin 3 (fig. 2.15).

Fig. 2.15. Hibridizarea Guanin-Citozin.

2.8. Conformaia helixului dublu catenar al ADN

Moleculele ADN exist ca un dublu helix cu dou lanuri (catene) care au direcii opuse (antiparalele), extremitatea 5( a uneia este opus cu 3( a celeilalte (modelul Watson i Crick 1953). Ele difer prin conformaie, fenomen numit polimorfism structural.

La ADN se cunosc dou conformaii dublu helicoidale orientate spre dreapta: ADN-A i ADN-B (lanurile se rsucesc spre dreapta pe msur ce progreseaz n sus). ADN-B este caracterizat printr-o repetiie regulat a anurilor de tip minor i major. O form diferit de ADN este ADN-Z care un helix orientat spre stnga dar care are un schelet neregulat. Neregularitatea ADN-Z este ilustrat prin linia groas care leag gruprile fosfat. Se speculeaz c este posibil schimbarea conformatiei ADN in vivo i c aceasta poate fi important n exprimarea genic. Astfel, transcripia ADN are loc, probabil, la jonciunea dintre ADN-B i ADN-Z unde are loc desfacerea helixului.

ADN este format din dou catene n care nucleotidelele sunt hibridate 2 cte 2 pe baz de complementaritate pe toat lungimea, prin legturi de H, AT, GC. Pentru ca toate nucleotidele s se poat hibridiza trebuie ca ordinea n care se leag s fie complementar catenei opuse. Bazele azotate legate prin legturi de H se orienteaz spre interior n timp ce ribozele i acizii fosforici hidrofili sunt orientai spre exterior.

Fig. 2.16 Tipuri de ADN.

Se formeaz o secven complementar secvenei originale. Datorit enzimelor specfice o secven de acid nucleic zis original este capabil de a dirija sinteza unei secvene de acid nucleic complementar (14, 42, 46, 52, 67).

n al doilea rnd aceast secven complementar izolat va fi de asemenea capabil s dirijeze sinteza secvenei originale care i este complementar (Fig. 2.17).

Fig. 2.17. Complementaritatea bazelor azotate

Se denumesc nucleotidele prin A, C, G i T n funcie de bazele azotate care le conin i se poate astfel citi un text.

Fig. 2.18. Complementaritatea purin-pirimidin sau pirimidin-purin

Complementaritatea purin-pirimidin sau pirimidin-purin confer structurii helicoidale bicatenare a ADN o form filiform regulat cu un diametru constant de-a lungul ntregului traiect (fig.2.18). O mperechere purin-purin sau pirimidin-pirimidin ar face ca dublul helix ADN s prezinte de-a lungul su neuniformiti, regiuni cu diametru mai mare (purina-purin) sau mai mici (pirimidin-pirimidin). Ar aprea astfel distorsiuni neregulate, care ar mpiedica funcionarea normal, ceea ce nu se ntmpl n condiii normale. Planurile bazelor azotate sunt perpendiculare pe axa fibrei. Fiecare spir a dublului helix cuprinde cte 10 perechi de nucleotide (fig. 2.19).

Fig. 2.19 Dublu helix- structura secundar a ADN

Cele dou catene se pot disocia la cldur. Structura bicatenar a ADN prezint de regul o mare stabilitate fizic la temperatura camerei, asigurat de:

punile fosfodiesterice intracatenare, pe vertical ntre dezoxiriboze;

legturile de H, pe orizontal, intercatenare, ntre bazele azotate;

fore de stivuire (staking) a perechilor de baze azotate n cadrul dublului helix.

n cadrul dublului helix ADN, din nfurarea relaional a celor dou catene rezult o alternan regulat de ferestre minore i majore, astfel c la acelai nivel al dublului helix, o adncitur minor de pe o parte corespunde cu una major de pe cealalt parte numite i ferestre (fig.2.20).

Fig. 2.20. Ferestre minore i majore.

Aceste ferestre reprezint zone de interaciune cu diferite proteine (ARN polimeraza), ageni de intercalare de tip bromur de etidiu sau situsuri de inserie a profagilor.

Compoziia de baze azotate este specific fiecrei specii. Secvena de baze azotate din ADN reprezint forma n care informaia genetic este nscris n macromolecula de ADN, aceste secvene codificnd o anumit protein.Dublul helix n seciune transversal prezint bazele azotate paralele ntre ele, nucleotidele acestora fiind aezate ca farfuriile, stivuite n interiorul dublului helix (fig. 2.21).

Fig. 2.21. Dezoxiribozele i fosfaii orientai spre exterior.

Nucleotidele complementare nu sunt diametral opuse, axul helixului este gol (Fig. 2.22).

Fig. 2.22. Bazele azotate orientate ctre interiorul dublului helix.

2.8.1 Condensarea i hidroliza nucleotidelor Creterea lanului de acizi nucleici se face totdeauna prin extremitatea 3(OH terminal a acidului nucleic. Condensarea se face pornind de la un substrat activat o nucleotid trifosfat. Hidroliza ultimilor doi fosfai va furniza energia necesar condensrii. Nucleotida monofosfat rmas va fi esterificat printr-o funcie acid a fosfatului cu funcia alcool eliberat din carbonul 3( al ribozei.

Va fi eliberat o molecul de ap.

Invers adugarea unei molecule de ap pe aceast legtur ester va produce o reacie de hidroliz care va detaa ultima nucloetid i va elibera C3( a nucleotidei precendente (fig. 2.23).

Fig. 2.23 Condensare i hidroliza nucleotidelor.

2.9 Acidul dezoxiribonucleic (ADN)

Un comportament caracteristic doar nucleului celulelor eucariote, este asocierea unor proteine mici , bazice cu ADN, numite histone. Patru din cele cinci tipuri se grupeaz n perechi pentru a forma octamerul histonic, n jurul creia se nfoar ADN.Aceast structur se numete nucleozom.ADN este protejat de ctre proteine atunci cnd nu se realizeaz transcripia sau replicarea genelor. Aceast protecie se face prin rulare n jurul proteinelor bazice (cationice) capabile de a se lega cu ADN care este un complex de polianioni. Octomerul histonic prezint n jur ADN rulat, care realizeaz dou ture n jurul lui. ADN format din 146-166 perechi de baze (fig. 2. 24).

Fig. 2.24 Nucleozomul (21, 97).

Octamerul histonic conine cte dou molecule din fiecare tip de histon: H2A, H2B, H3 i H4. Nucleozomii core sunt conectai ntre ei prin segmente de ADN formate de 20-100 pb i care reprezint regiunile de legtur denumite ADN linkeri. La punctul de intrare i ieire ADN se asociaz cu o alt histon H1, situat n afara octamerului. Ea este asociat att cu nucleozomul, ct i cu segmentul ADN linker i are rol n stabilitatea nucleozomului.O endonucleaz poate digera ADN linker dintre perle i detaa particule de 11 nm, nucleozomii (Fig. 2.25).

Fig. 2.25. Structura nucleozomului (91).

Nucleozomul este o form de organizare a cromatinei. Celulele umane conin aproximativ 3x107 nucleozomi.

Nucleozomii legai prin intermediul linkerilor asemntor unui irag de perle realizeaz o structur compact, cu un diametru de 250-300nm numite fibre groase care conin aproximativ 45000 pb (fig 2.27).

Fig. 2.27. Fibre de cromatin (46).

Studiile fizico-chimice sugereaz c aceste fibre groase se formeaz printr-o mpachetare helicoidal (a 6-9 nucleozomi), care se ruleaz pe ele nsele i formeaz un solenoid (fig. 2.28). n aceast structur mpachetarea crete foarte mult.

Fig. 2.28. Organizarea cromatinei in diverse trepte pn la stadiul de cromozom n metafaz (14).

Fibrele devin mult mai condensate, prin mpachetri adiionale, formnd structuri mai complexe denumite domenii (sau loops-uri) care cuprind 35000-90000 pb de ADN. Acest tip structural de cromatin este bine legat de un suport structural din nucleu, denumit matrix nuclear sau scaffold care sufer la rndul lui mpachetri i structureaz cromozomul din metafaz.Proprietile fizice ale ADN

Denaturarea ADN poate fi termic i chimic.Denaturarea termic. Peste anumite limite de temperatur (63-100C) stabilitatea legturilor de H cedeaz, astfel se desface dublul helix n cele 2 catene polinucleotidice, complementare, fenomen numit denaturarea termic; ADN trece de la condiia de dublu catenar la cea monocatenar nsoit de reducerea vscozitii soluiei ADN.

Denaturarea este de obicei efectuat experimental prin nclzire. Temperatura la care 50% dintre catene sunt separate se numete temperatur de topire (Tm).

Aspectul curbei de denaturare a ADN ne permite s concluzionm coninutul n perechi de baze azotate avnd n vedere c perechile A-T cu 2 puni de H denatureaz mai uor dect perechile G-C ntre care sunt 3 legturi de hidrogen. Timpul de topire crete odat cu creterea coninutului G-C, fapt evideniat de ADN diferitelor specii de bacterii, al cror coninut G-C variaz ntre 20-80%.

Denaturarea chimic. Pentru denaturare se pot utiliza i alcalii. La pH mare ncrctura multor gene angajate n formarea legturilor de H se schimb. Astfel bazele pierd capacitatea de a forma legturi de hidrogen. La pH mai mare de 11,3-12 toate legturile de hidrogen sunt rupte i ADN este complet denaturat. n tehnicile de bandare cromozomial se utilizeaz denaturarea cu alkali, ADN fiind destul de rezistent la hidroliza alcalin .Dac amestecul se rcete brusc, monocatenele rmn permanent separate i ADN se numete denaturat. Cnd o soluie de ADN este supus unor temperaturi mai mari de 100C are loc ruperea legturilor fosfodiesterice, cu destrmarea coloanei glucido-fosforice . Denaturarea ADN este nsoit de efectul hipercromatic, adic de cretere a intensitii absorbiei razelor UV de ctre bazele azotate expuse la exterior. Bazele azotate sunt cromofile i hidrofile.Pentru a preveni reasocierea monocatenelor (dup o denaturare complet la 90) prin mperecheri de baze se pstreaz ADN denaturant la concentraii saline mari la temperatura camerei (14, 42, 46, 52, 67, 69).

Fig. Denaturarea i renaturarea ADN (97).

Renaturarea

Renaturarea reprezint refacerea structurii native, dublu catenar a ADN, pornind de la monocatene separate prin denaturare. Pentru renaturare sunt necesare dou condiii:

concentraia salin trebuie s fie suficient de mare pentru a nltura repulsia electrostatic dintre fosfaii celor dou catene polinucleotidice (se utilizeaz 0,15-0,5 M NaCl).

temperatura trebuie s fie cu 20-25C sub valoarea temperaturii de topire, i are rolul de a elimina legturile de hidrogen intracatenare aprute la ntmplare (randomizat)..

In urma filtrrii o soluie de ADN renaturat are i monocatene rmase nesociate. Prin utilizarea filtrelor de nitroceluloz, ADN renaturat trece, pe cnd monocatenele sunt reinute de filtru putnd fi msurat astfel fracia de ADN care a renaturat.

Renaturarea ADN este nsoit de efectul hipocromatic deoarece prin refacerea structurii dublu catenare, bazele azotate se afl spre interiorul structurii bicatenare. Dac denaturarea ncepe de la nivelul unor sectoare ale dublului helix ADN bogate n A-T, renaturarea este iniiat n sectoarele bogate n G-C mai stabile. Aceste sectoare la nivelul crora se iniiaz renaturarea se numesc centre de nucleaie sau de renaturare.

Denaturarea i renaturarea acizilor nucleici sunt procese fizice folosite pentru studiul relaiilor filogenetice dintre specii fie in tehnologia ADN recombinant. Speciile nrudite filogenetic au secvene de baze azotate cu un grad mare de similitudine i prezint temperaturi apropiate de denaturarea ADN, realiznd o renaturare mai rapid a monocatenelor amestecate.

Renaturarea este un proces mult mai lent dect denaturarea n urma creia ia natere o structur bicatenar hibrid.Procentul de renaturare ntre monocatene de ADN de la om si de la cimpanzeu este de aproximativ 90% pe cnd cel dintre ADN uman i de oarece este de 25%.

n tehnologia ADN recombinant, hibridarea molecular ajut la stabilirea exact i rapid a transferului unei gene eucariote n celula bacterian prin folosirea sondei moleculare. Aceasta este o monocaten de ADN sau ARN marcat radioactiv sau neradioactiv i care este complementar segmentului genei eucariote transferate. Dac are loc asocierea sondei moleculare cu un segment ADN extras de la celula bacterian n care a fost clonat gena eucariot nseamn c transferul acestei gene n celula bacterian a fost eficient.Totodat prin hibridri moleculare ADN-ARN se poate realiza cartarea genelor rspunztoare de sinteza ARN prin hibridarea in situ adic fr extracie de ADN, denaturarea acesteia realizndu-se la nivelul cromozomilor, n preparate citologice, pe lame microscopice. Aceste preparate sunt incubate cu molecule de ARN ribozomal, de un tip dat, marcate i aflate ntr-o soluie salin corespunztoare. Monocatenele ARN se vor uni pe baz de complementaritate cu un segment dat al monocatenelor ADN pe care se afl gena pentru acel tip de ARN ribozomal. Dup splarea preparatelor, pentru a ndeprta restul de monocatene ARN rmase neasociate, pe aceste lame se aplic emulsie fotografic, se incubeaz la ntuneric spre a realiza impresionarea, se developeaz i se analizeaz la microscop. Zona unde a avut loc hibridarea ADN-ARN, la nivelul cromozomului, este marcat prin urme de argint fiind localizat astfel gena pentru tipul ARN, folosit n hibridare. Prin astfel de modele de hibridare se pot localiza poziia altor gene, folosind alte tipuri de ARN, cum ar fi ARN solubil i ARNm. De exemplu, folosind n hibridare ARNm purttor al mesajului genetic pentru sinteza insulinei (ARN nu poate fi extras uor din celulele pancreasului endocrin) aceasta se poate localiza pe cromozom la poziia genei pentru insulin (14, 31, 42, 52, 67).

2.10.3 Respiraia i absorbia ADN

ADN este o structur dinamic n care regiunile bicatenare se deschid frecvent spre a forma ochiuri sau bucle monocaternare. Acest fenomen se numete respiraie ADN i-i permite acestuia interaciunea cu diferite proteine spre a-i fi citit informaia codificat. Respiraia apare mai frecvent n regiunile bogate n perechi A-T dect n cele cu G-C, deoarece perechile A-T sunt mai uor de denaturat fiziologic. Nu ntmpltor la nivelul originii replicrii perechile A-T sunt foarte frecvente.

Absorbia reprezint capacitatea unei soluii ADN de a absorbi lumina UV. Bazele acizilor nucelici absorb lumina UV de 260 nm.2.11 ADN mitocondrialFurnizeaz energie prin fosforilare oxidativ. Conin propriul lor ADN diferit de ADN nuclear, este extracromozomial. ADN mitocondrial este dublu catenar de 16,5 kb circular, codant pentru 13 subuniti proteice, constituind 4 complexe biochimice i 24 molecule de ARN structural (2 ARNr i 22 ARNz) indispensabil pentru transducia mitocondrial a proteinelor. ARNm este independent de ADN nuclear. Replicarea, transcripia i transducia este independent de a ADN nuclear. El codific proteinele care particip la fosforilarea oxidativ, necesare funcionrii i structurii mitocondriale. Aceste proteine (codificate de gene nucleare) sunt produse n citoplasm nainte de a ajunge n mitocondrie. Exist o interelaie ADN nucelar ADN mitocondrial.

Caracteristicile ADN mitocondrial:

nu are introni

are un repertoriu de mutaii de 10 ori mai mare dect ADN nuclear. Nu are sistem de reparaie, nici histone care s protejeze ADN

are un mare polimorfism genetic

este transmis de la celula mam

nu se recombin

fiecare mitocondrie conine 2-10 molecule de ADN

fiecare celul conine numeroase mitocondrii... mii

n aceeai mitocondrie poate coexista ADN normal i mutant, fenomen numit heteroplasmie

- prezena doar a ADN normal sau numai a ADN mutant, se numete homoplasmie

n cursul replicrii proporionale a ADN normal i a celui mutant n heteroplasmie, ADN poate fi modificat n celulele fiice ca urmare a repartiiei la ntmplare.

2.12 Acidul ribonucleic -ARN

Pentru a forma ARN nucleotidele GMP, AMP, UMP, CMP sunt condensate prin legturi fosfodiesterice ntre C3( a primei nucleotide i 5( a nucleoditei urmtoare.Prima nucleotid a lanului polinucleotidic poart pe carbonul 5( al ribozei, un fosfat, a crui funcie acid nu este esterificat. Aceasta este extremitatea 5( fosfat terminal a acidului nucleic este desemnat convenional ca nceputul secvenei (fragmentului) de acid nucleic. Ultima nucleotid a lanului poart o funciune alcool pe C3( a ribozei neesterificat. Aceasta este extremitatea 3(OH terminal a acidului nucleic descris convenional ca sfritul fragmentului de acid nucleic. Aceste legturi definesc sensul moleculei.

Fig. 2.29. Extremitile 3(-5( ale acidului ribonucleic (97).

Dup funcie se disting mai multe tipuri de ARN:

ARNracid-ribonucleic ribozomal (82 %) intr n structura ribonucleotidelor ribozomilor alturi de proteine (fig. 2.29). Se cunosc dou tipuri de ribozomi: de tip procariot cu constanta de sedimentare 70S (subunitatea mic 30S, subunitatea mare 50S) i eucariot de 80S (subunitatea mic 40S, subunitatea mare 60S). n funcie de constanta de sedimentare se distig urmtarele fraciuni de ARNr: -la procariote: ARNr 23S i ARNr 5S n subunitatea mare i ARNr 16S n subunitatea mic;

-la eucariote, ARN 18S intr n structura subunitii mici a ribozomilor;

-ARN 28 S, ARN 5,8 S i ARN 5S structureaz alturi de proteine subunitatea mare a ribozomilor. Ribozomii sunt implicai n sinteza proteinelor.ARNt Acid ribonucleic de transfer (16 %) transport aminoaiczii activai pentru transducie.

snARN (< 1 %) ribonucleoproteine mici nucleare ARN structureaz particula de recunoatere a proteinei- semnal. Altele, mai puine, particip la structura diferit a ribonucleoprotidelor responsabile de excizie a intronilor, legarea sau matisarea exonilor, n procesul de maturare a transcriptului primar din timpul transcripiei i de selecie a poliribozomilor pentru sinteza proteinelor semnal, orientarea proteinelor sau altor activiti enzimatice, metabolice.ARNm- Acid ribonucleic mesager(2%) realizeaz transcripia genei purttoare de informaie pentru a fi tradus (reprezint o copie a genei) i este modelul pentru dirijarea transduciei. Prin intermediul ARNm ribozomii primesc informaia pentru sinteza proteinelor.Alte molecule sunt coenzime transportoare de aminoacizi;

Fig. 2.30 Ribozomii la procariote i eucariote (97).

2.12.1 Diferenele dintre ARN i ADNDiferenele dintre ARN i ADN sunt: ARN este mai scurt, are 70-100 000 nucleotide; conine riboz n loc de dezoxiriboz (ADN);

uracilul nlocuiete timina din ADN.

ARN este monocatenar. Totui n unele regiuni, pe distan scurt, monocatenele sunt unite prin legturi de H pe baz de complementare, deci devine bicatenar i formeaz structura secundar a ARN. Un exemplu tipic este structura n form de frunz de trifoi a ARNt (fig. 2.31).

Fig. 2.31 Structura secundar a ARN (46).

Structura secundar a ARN este prezentat i n fig 2.32. Lanul monocatenar formeaz urmtoarele structuri: agraf de pr, bucl multipl, pseudonod, bucl interioar, tulpin (stem).

Fig. 2.32. Structura secundar a ARN (102).

3. GENAGenomul uman este constituit din 3,5 miliarde de perechi de nucleotide sau perechi de baze (pb). Gena este estimat ntre 50000 i 100000pb i nu reprezint dect 3-5% din acest ansamblu. Restul de ADN este constitut din secvenele de reglare a expresiei genei, secvene repetitive i secvene cu funcii necunoscute.

Varianta nepatologic a genomului este polimorfismul

La om, ntre 2 indivizi exist mici variante de secvene estimate ntre 1 i 2% considerate ca nepatogene i numite gene de polimorfism (exp. de polimorfism, culoarea ochilor: bleo, maron, verde). Acest polimorfism genotipic se poate gsi n regiuni codante i necodante ale unei gene. n cursul studiilor de patologie (maladii genetice, cancer) sau n alte cazuri (epidemiologie bacterian) astfel de secvene specifice pot servi ca markeri genetici (2,14, 25, 26, 36, 44, 49 67).

Fig. 3.1 Alele (104).

Un polimorfism const ntr-o diferen purtat de o singur nucleotid ntre 2 secvene ale aceleeai perechi de cromozomi (de exp. A pe o alel i G pe o alt alel). Vorbim deci de polimorfism alelic a unei singure nucleotide (SNP).

Polimorfisumul, este dat de secvene scurte, repetate, a unui numr mai mic sau mai mare baze care pot varia pe fiecare din cei 2 cromozomi, numrul repetiiilor poate s nu fie identic. Numrul de variaii ale secvenelor poate s nu fie aceleai ntre 2 indivizi diferii (fig. 3.2 ).

Fig.3.2 Polimorfisumul alelic dat de secvene scurte, repetate.

Se vorbete deci de un polimorfism multialelic n care se disting dup talia lor:

- secvene scurte repetate STRs (short tandem reapeats) acestea sunt 2, 3, 4 i 5 nucleotide de exp. [AC]n = 5AC AC AC repetare de n ori; numrul lor este estimat ntre 50000 i 100000 copii n genom;

- secvene repetate n tandem n numr variabil sau VNTRs (variabile number of tandem repeats). Printre aceste secvene VNTRs se pot distinge i secvene repetate scurte de mai puin 500 pb SINEs (short interopersed repetitive nucleotides elements).

O secven particular din cadrul SINEs este secvena Alu. Secvenele Alu sunt repartizate n genom la nivelul intronilor.

Fig. 3.3 Secvene repetate n tandem. Secven Alu, este considerat de 4 kb- 5 kb. Aa se face c secvena Alu este repartizat n grupe separate prin cteva sute de baze de ADN numite non Alu. Aceste secvene sunt compuse din 2 pri omoloage dreapta i stnga, distincte, derivate din gena ARN 7SL. n anumite cazuri, aceste secvene sunt responsabile de mutaii sau de modulare a expresiei genelor;

- secvene mai lungi de cteva milioane de pb (n jur de 6-7 kb) sau LINEs (long interpersed repetitive nucleotides elements);- ADN satelit i . Sateliii , prezeni la nivelul centromerilor sunt secvene repetate n tandem de 171 pb constituie ntre 1-3% din cromozomi. Sateliii sunt secvene repetate n tandem de 68 pb situate n cromatina cromozomilor 9 i a celor acrocentrici.

3.1 Structura genei

Secvenele de nucleotide ADN conin informaia necesar pentru sinteza ARNm i ulterior a unei proteine.n secvena genei se disting :

-secvene n amonte reglatoare care structureaz promotorul,

- un situs de iniiere al transcripiei, sau start point notat cu +1, locul unde este ncorporat primul nucleotid de unde ncepe transcripia -o succesiune variabil de exoni i introni.

n general intronii nu exist la virusuri i bacterii. Ei sunt prezeni doar la eucariote. intronii coninnd eventual alte secvene reglatoare i n sfrit -ultimul exon sau terminator unde se termin transcripia.

Fig.3.4 Structura genei i expresia ei.

Ansamblul mecanismelor care stau la baza secvenelor genei conduc la producerea unui acid ribonucleic sau a unei proteine desemnate prin termenul de expresia genei.Promotorul este situat n amonte de gen, n poziia 5', are ntre 800 i 1000 pb. El nu este transcris i tradus, intervine n iniierea transcripiei i orientarea direciei n care aceasta se va derula, secvene consens pentru situl de fixare a ARN polimerazei II i a unui capion pe ARNm indispensabil pentru transducia sa ulterioar.

n poziia 3' a genei pe ultimul exon, se afl unul din 3 codoni STOP TAA, care se continu cu o secven de poliadenilare AAAAA care va semnala oprirea transduciei la nivelul ribozomilor. Coada de poliadenilare este situat n aval de codonul STOP, secven care nu va fi tradus. Ea reprezint un sit de recunoatere a ARNm primar i este indispensabil pentru stabilitatea ARNm. Pot exista mai multe situri de poliadenilare corespunztoare mrimii diferite a ARNm. Ele sunt specifice esuturilor.Exist gene care se exprim n toate esuturile (ubicvitare sau gene de menaj) sunt coninute constant n aceeai regiune. Acestea, conin secvene bogate n GC (5'GGG CGG3') pe care se fixeaz factori de transcripie SP1. Factorii proteici numii i factori de transcripie interactiv prezint secvene reglatoare care moduleaz expresia genei.O gen poate avea mai mui promotori. Unii promotori pot fi specifici esuturilor (2, 14, 26, 36, 44, 46, 49, 67).

3.2 Secvena unei gene apoA IIApolipoproteina apoA este componenta proteic a oricrei lipoproteine, n special a celor plasmatice. Ea este protein asociat lipoproteinelor cu densitate mare (HDL) i realizeaz stabilizarea acestora.

Scrierea pe baz de litere ACGT n ordinea n care se ntlnesc nucleotidele pe un lan ADN de la extremitatea 5(-3( duce la un text indescifrabil. Suportul acestui text astfel transcris conine toat informaia necesar pentru sinteza unei proteine apolipoproteina AII. Ansamblul informaiei genetice transcris este de 3 miliarde de litere (o biblioteca de 7000 cri cu 300 pagini fiecare).

Fig. 3.5 Secvena unei gene (apoA-II) (46).

Proteinele implicate n transcripie se vor fixa pe lanurile dublului helix ADN, pentru transcripia unor secvene specifice i va permite expresia informaiei .

3.3 Expresia unei geneExpresia unei gene este o succesiune de sinteze chimice care conduc la producerea unei proteine. n prima etap are loc sinteza ARN premesager sau ARN precursor (denumit i ARN heterogen sau Hn-ARN). Secvena de ARN premesager este complementar catenei antisens a genei, deci identic catenei sens i este orientat n aceai direcie cu aceasta (Fig. 3.6).Dup reacii de maturare a transcriptului primar ARN devine ARNm i trece din nucleu n citoplasm. Ulterior ARNm este citit de un grup de cte 3 nucleotide de la 5( la 3( i are loc sinteza proteinelor de ctre ribozomi. Cuplarea aminoacizilor se realizeaz de la extremitatea NH2 terminal ctre extremitatea COOH terminal. Dup reacia de maturare proteina matur este gata s-i ndeplineasc funcia n celul (fig. 3.6).

Fig. 3.6. Expresia unei gene (46).

3.4 Transcripia

Sinteza ARNpremesager este catalizat de ARN polimeraze, ADN-dependente, utiliznd catena antisens ca matria ADN. ARN polimeraza ataeaz nucleotid trifosfai ca substraturi care polimerizeaz n direcia 5'-3', asemntor ADN polimerazelor (fig. 3.7). Numai un singur lan al dublului helix ADN, complementar catenei sens este utilizat ca matri. ntruct dubla caten a ADN este conservat, sinteza ARN este descris ca fiind conservativ i asimetric (se produce numai un lan polinucleotidic).

Fig. 3.7 Prima etap a transcripiei, ataarea ARN polimerazei de promotor (97)

Secvena de baze a ARN sintetizat va fi identic fa de catena codificatoare, cu meniunea c uracilul nlocuiete timina. ARN polimerazele sunt enzime multisubunitare mari i complexe, care au capacitatea de a identifica locul n care este iniiat sinteza ARN pe matria ADN. Spre deosebire de ADN polimeraze, ARN polimerazele nu au nevoie de amors. Cele dou catene de ADN se separ la locul de iniiere a transcripiei.

Fig. 3.8 Derulerea transcripiei (97).

Atunci cnd ARN polimeraza ajunge la terminator se va desprinde ARNpremesager, dublul helix se reface i ARNpolimeraza se desprinde de ADN(fig 3.9).

Fig. 3.8 Terminarea transcripiei.

Nucleii celulelor eucariote conin 3 tipuri distincte de ARNpolimeraze:

-ARN polimeraza I este localizat n nucleoli, unde se gsesc genele ribozomale i catalizeaz sinteza precursorilor majoritii moleculelor de ARNr 18S, 5, 8S, 28S;

-ARN polimeraza II este localizat n nucleoplasm i catalizeaz sinteza precursorilor ARNm i a unor snARN (ribonucleoproteine mici). Ea este inhibat specific de toxic extras Amanite phalloide, amanitin. -ARN polimeraza III este localizat n nucleoplasm i catalizeaz sinteza precursorilor moleculelor ARNr, 5S i o varietate de mici fragmente de ARN nucleari i citoplasmatici (ARNt, , snARN, 7SL-ARN) (14, 25, 26, 36, 44, 46).

Promotorul apolipoproteina AII

Ultima linie a fig. 3.10 este secvena primului exon a genei apolipoproteinei AII. Cele 900 nucleotide care o preced conin numeroase secvene recunoscute de proteine care permit nceperea transcripiei sau reglarea acestei etape i formeaz promotorul.Poriunea de ADN care va fi transcris se numete unitate de transcripie. Aceasta este delimitat de promotor, urmat de un punct de iniiere sau start point notat cu +1, unde ncepe transcripia i un terminator unde se termin (Fig. 3,10).

Fig. 3.10 .Secvena unui promotor (46)..Nucleotidul aflat dinaintea situsului start este notat cu -1. Acesta se refer la catena sens, nu la catena matri. Catena sens are aceeai secven ca i catena ARNm (doar c T este nlocuit cu U). Promotorii pentru fixarea ARN polimerazei sunt pe latura 5' a startului (n amonte de situsul start).

Secvena aflat naintea punctului start, se numete din amonte, iar cea de dup punctul start, n aval.

Promotorului i se disting urmtoarele secvene:

-secven numit caseta TATA(sau domeniu) , care este recunoscut specific prin proteinele TPB ca subuniti ale TFIID, cofactor al ARN polimeraza II;

-secvene sau caset CAAT i GG box, pe care vin s se fixeze alte proteine de transcripie CTF i SP1 (fig. 3.11).Genele apolipoproteinei AI i AIII care sunt vecine i sunt situate pe cele dou lanuri ADN de la stnga la dreapta i de la dreapta la stnga.

Transcripia se face sintetiznd ARNpremesager de pe secvena lanului antisens, deci identic cu catena sens.

Fig. 3.11. Caten sens i antisens (46).

3.6 Modularea activitii promotorilor

Activitile multor promotori sunt amplificate de ctre secvene de ADN numite enhanceri sau activatori, situai la distan, pn la cteva sute de perechi de baze de promotor (fig. 3.12). Legarea poate fi la captul 5' n amonte, sau 3'(n aval) i chiar n interiorul genei, ntr-un exon sau intron. Funcia lor este independent de poziie i orientare. Asemenea amplificatori sunt recunoscui de proteine specifice denumite factori de transcripie care stimuleaz legarea ARN polimerazei de un promotor vecin. Fiecare enhancer conine cel puin un sit de fixare pentru un factor de transcripie. n general sunt mai multe situsuri pentru factorii de transcripie care acioneaz sinergic.

Fig. 3.12 Modularea activitii promotorului (7)

Enhancerii sunt secvene care stimuleaz expresia genei. Faptul c amplificatorii sunt aezai la distan (considernd ADN liniar) fa de promotorii pe care i controleaz este explicat pe baza foldingului (mpachetrii sau plierii) ADN. Ia natere o structur teriar care aduce cele 2 elemente n poziii apropiate (3.13).

Fig. 3.13 Enhancerii sau activatorii.

Silancerii. Aceaste secvene diminu sau inhib expresia genei. Sunt localizai adesea ntre promotori i enhanceri, numii i antienhanceri.

Factori care acioneaz n transcripie. Sunt proteine care acioneaz asupra ADN prin inhibarea parial sau total a receptorilor transcripiei.

Rolul cromatinei. Este un ansamblu complex care constituie asocierea ADN-ului cu proteine histonice i nehistonice.

Enzima cheie pentru transcripia genelor proteinelor structurale este ARNpolimeraza. Promotorii recunoscui de aceast enzim sunt mult mai mari i mai diveri (1, 14, 25, 26, 36, 44, 46, 49, 67).

3.7 Operonul lacn timp ce toate celulele unui individ au acelai ADN, natura proteinelor sintetizate de celule difereniate variaz att la celulele eucariote, dar i la bacterii (determinate de schimbri nutriionale i de mediu). Cea mai frecvent cale de sintez proteic difereniat se face prin controlul transcrierii ADN pentru producerea de ARNm.

Prima demonstraie a controlului transcrierii a fost fcut de Jacob i Monod pentru operonul lac. Un operon este definit ca un grup de gene adiacente care structureaz promotorul, operatorul i gene structurale care sunt transcrise ntr-un singur ARNm. Operonul controleaz transcrierea ARNm pentru 3 proteine. Segmentul de ADN care conine toat informaia pentru producerea unui singur polipeptid este numit cistron i operonul lac iar ARN-ul policistronic.

Sinteza proteic specific unui segment de ADN n operonul lac arat modul general de aciune i controlul transcripiei n toate tipurile de celule. Operonul lactozei este format din operator care include i promotorul, i trei gene structurale. n amonte de operator sunt situate gene reglatoare care sintetizeaz proteine represoare (fig. 3.14). Cnd n celule lactoza este absent proteinele represoare se ataeaz la operator iar promotorul realizeaz o bucl, i modific configuraia i nu permite transcripia genelor structurale. Genele sunt astfel blocate transcripiei (14, 36, 44, 49).

Fig. 3.14 Genele sunt blocate transcripiei (7).

Atunci cnd lactoza este prezent, bacteriile convertesc lactoza n alolactoz care se leag de represor. Funcia acestuia din urm este alterat, elibereaz promotorul operatorului i este permis transcripia genelor structurale (fig. 3,15).

Fig. 3,15 Prezena lactozei permite transcripia genelor structurale.

Vor fi sintetizate 3 enzime galactozidaza, permeaza i transacetilaza care degradeaz lactoza avnd un rol important n metabolismul lactozei.

ntruct starea normal este aceea n care operonul lac este inhibat, fenomenul descris este cunoscut ca i control negativ.

Operonul lac poate realiza i un control pozitiv. Astfel AMPciclic (cAMP) se leag de o protein de activare a genei catabolit (CAP) i complexul format stimuleaz transcripia prin intensificarea legrii ARNpolimerazei la promotor (fig. 3.16).

Fig. 3.16 Controlul pozitiv al operonului lac.

Glucoza este sursa preferat de energie i n prezena sa sunt cantiti mici de galactozidaza format i alte enzime catabolice, ceea ce explic fenomenul de represie a catabolismului. Prezena glucozei determin scderea concentraiei cAMP i prin urmare se reduce controlul pozitiv menionat mai sus (2, 14, 25, 26, 36, 44, 49).

3.8 Controlul sintezei proteice la eucarioten majoritatea esuturilor, toi ribozomii sunt legai de ARNm i sunt implicai n sinteza proteic. n anumite esuturi, cum este glanda mamar la animale gestante, unii ribozomi nu sunt asociai cu ARNm. Activitatea de sintez proteic a unei celule poate, prin urmare, s fie schimbat, fie prin formare de poliribozomi din ribozomii existeni fie prin producerea de poliribozomi adiionali. n situaia n care sinteza unei anumite proteine este schimbat este cunoscut ca i control specific.

Sinteza proteic la eucariote poate fi controlat pe ci multiple. Astfel structura cromatinei sufer schimbri probabil datorate modificrii histonelor n nucleozomi. Este dovedit deja contolul nivelului traducerii prin fosforilarea factorilor de iniiere. n acest caz controlul primar este la nivelul transcripiei. Aa cum s-a descris pentru operonul lac, acest control specific este fcut de ctre poriunea n amonte a ADN fa de situsul de transcripie i prin prezena multor proteine diferite. Enzima cheie n transcripia genelor pentru proteine structurale este ARN polimeraza II. Promotorii recunoscui de aceast enzim sunt mult mai mari i mai diveri dect cei ai operonului lac. Factorii care sunt produi ai genelor, altele dect cele pe care ei le controleaz, sunt denumii factori trans-activatori. n organisme superioare acest fenomen nu are loc ntruct nu sunt ARN policistronici i genele individuale sunt transcrise n ARN monocistronici individuali codificnd proteine singulare. Astfel trebuie s existe alte ci de coordonare, mai ales c adesea, genele implicate sunt pe cromozomi diferii. n acest fel, producerea unei molecule de anticorp funcional necesit sinteza de proteine imunoglobulinice cu lan greu (H) sau uor (L). n timp ce locusul lanului greu H este pe cromozomul 14 la om, genele lanului uor sunt pe cromozomii 2 i 22. O situaie similar exist i n cazul hemoglobinei, unde familia -globinei este pe cromozomul 16 la om, i gena -globinelor pe cromozomul 11.Antibioticul actinomicina D inhib transcripia prin legarea de matri, n timp ce rifampicina o inhib prin legarea de ARNpolimeraza.

La virusurile cu ADN dublu catenar, transcripia va avea loc la fel ca n celulele normale, de obicei utiliznd ARNpolimeraza din nucleul celulei gazd. O excepie o reprezint virusul vaccinia care determin boala vrsatul vacilor (cawpox). n acest caz replicarea are loc n citoplasma deoarece particulele virale posed ARNpolimeraza proprie. Dac ADN viral este monocatenar, replicarea sa implic o form replicativ bicatenar, ADN viral fiind obinut prin sinteza asimetric numai a unei singure catene din cele dou.

n anumite cazuri, genomul virusului este reprezentat de ARN, care apare n dou forme. Dac ARN servete ca ARNm, este notat (+), polimeraza implicat este o protein format din 4 subuniti, numai una dintre ele este virus specific, celelalte subuniti fiind oferite de ctre celula gazd. Dac ARN viral nu servete ca ARNm este notat cu -, celula gazd nu l poate replica i virionul trebuie s poarte o replic pentru a forma catene (+) ce servesc ca ARNm. Exemple de astfel de virusuri: influenza, pojar, rabie.

3.9 Controlul transcripiei prin hormoni Muli hormoni i exercit efectele biologice prin legarea la receptorii de la suprafaa celulei care activeaz mesageri secundari cum este AMPc. Hormonii steroizi i tiroxina acioneaz n mod diferit. Ei intr n celula int i se leag de proteine receptor specifice din citosol. Acetia migreaz n nucleu i controleaz transcripia prin legare la ADN i controleaz exprimarea a 50-100 de gene. Diferitele proteine receptor posed o arhitectur similar i reprezint o superfamilie, Ele conin un domeniu nalt conservat de legare a ADN, un domeniu de legare a hormonilor, un domeniu variabil N terminal care interacioneaz cu ali reglatori ai transcripiei. Cnd hormonul leag receptorul, domeniul de legare al ADN este blocat (1, 14).

3.10 Reglarea expresiei genelor

Sinteza ARNm se mai numete expresie genic, deoarece din molecula de ADN reprezentnd o gen, cand este activat se transcrie un ARNm pentru o protein dat. Genele din genomul celulelor eucariote sunt ntrerupte de secvene care nu vor fi regsite n secvena proteinelor. Astfel unitatea transcriptibil a genei la eucariote este format din introni i exoni.

Reglarea ntregii ci metabolice se face n principal de la prima reacie pentru a nu sintetiza intermediari inutili i este legat de 4 nivele:

transcripia;

maturarea transcriptului;

transducia;

activarea proteinelor mature.

Punctul de control principal al transcripiei este ARN polimeraza II, enzima cheie a expresiei unei gene (Fig. 3,17).

Fig. 3.17 Reglarea expresiei genei (46)Secvene cis i transreglatoare Secvena nucleotidelor promotorului formeaz factorul cis reglator i este recunoscut printr-o clas de proteine specifice, 8 factori transreglatori, a cror structur permite o legtur cu ADN (ADN proteine de legtur).

Factorii transreglatori influenez viteza de transcripie. Ei pot fi enhanceri cu rol activator, sau pot fi inhibitori (secvene silencer). Legtura lor cu ADN depinde de circumstane fiziologice care induc sau reprim expresia genelor (3,18).

Fig. 3,18. Cis i transreglatori (46).

Elementele eseniale prezente n majoritatea genelor:

caseta TATA ;

- factorul OCT1 prezent n aproape toate celulele;- elemente care rspund la semnale care parvin la celule, n special hormoni ca insulina sau mesagerii de ordinul II ca AMPc;

- elemente specifice tipului celular care permit expresia diferit a genelor n fiecare esut. Astfel, promotorul lipoprotein- lipazei conine TATA box, elemente de rspuns la hormoni i elemente de expresie tisular specifice. n promotorul genelor exist 20-30 situsuri pentru factorii transreglatori din care majoritatea au efect inductor, sau represor asupra expresiei unei gene (2, 14, 36, 44, 49, 67).

3.11 Recunoaterea ADN de ctre proteine

Au fost identificate 3 motive sau domenii proteice importante care recunosc ADN: motivul helix-turn-helix, protein de tipzinc finger i proteine leucine zipper (fig. 3.19).

Fig. 3. 19 Proteine de legtur ADN.

Primul descoperit, motivul sau domeniul helix-turn-helix este prezent n proteine care leag gene homeotice (cele care controleaz planul arhitectonic al embrionului) n proteine de structur, factori de transcripie i elemente transreglatoare. n structura spaial a acestor proteine se recunosc domenii proprii acestei legri specifice. Acest motiv este format dintr-o regiune scurt care seamn cu un helix urmat de un turn i apoi un alt helix . Domeniu helix-turn-helix, permite legarea specific a helixului cu nucleotide n marele silon, n jur de 10 perechi de baze (fig. 3.20). Fig. 3.20 Domeniu helix-bucl-helix (21, 97)Motivul Zinc finger

Acest motiv conine o pereche de resturi de cistein, urmat de aproximativ 12 resturi de aminoacid i o alt pereche de resturi de cistein sau histidin. Perechile de cistein coordoneaz ionii de zinc, aa nct ceilali aminoacizi formeaz o proeminen finger. Fiecare deget de zinc se leag cu 5 nucleotide n marele silon a ADN (fig. 3.21).

Fig.3,21 Amprenta Zinc (Zinc finger)

Exist adesea mai multe prelungiri de zinc n aceeai protein.

Aceast structur este repetat de 9 ori n factorul de transcripie TFIIIA (factor de transcripie pentru ARN polimeraza III), care se leag de gena pentru ARN 5S, n ferestrele mari ale helixului ADN. Acest model s-a gsit n civa factori de transcripie ai ARN polimerazei II.

3.12 Fermoarul de leucinFactorul de transcripie C/EBP, care este implicat n stimularea exprimrii unor gene specific hepatice, are o regiune de 35 aminoacizi, din care tot al 7-lea este leucina. O asemenea structur a fost gsit n protooncogenele Myc, Fos i Jun. Fermoarul (zipper) leucin nu se leag direct de ADN dar faciliteaz dimerizarea proteinelor din domenii specifice, bogate n arginin i lizin. Pentru a aciona ca factori de transcripie, proteinele trebuie s dimerizeze fie ca homodimeri paraleli (de exp. Fos-Fos), fie ca heterodimeri (Fos-Jun) (2, 14, 25, 26, 44, 49, 67).

3.13 Reglarea expresiei genelor n timpul hipoglicemiei

n cursul hipoglicemiei concentraia glucozei n snge diminueaz. Creierul a crui nutrient major este glucoza reacioneaz, determin secreia de ctre hipofiz a unor factori de stimulare, corticotrofine sau ACTH. Acestea provoac secreia unui hormon, de ctre celulele din zona fasciculat a corticosuprarenalei, respectiv a cortisolului (Fig.3.22).

Cortisolul acioneaz asupra ficatului i se leag de proteine specifice, receptorii pentru cortisol. Aceste proteine leag hormonii constituind factorii transreglatori.

Factorii transreglatori trec n nucleul hepatocitelor se leag de ADN la nivelul promotorului anumitor gene care au elemente cis reglatoare specifice: GRE (glucocorticoid responsive element). Fig. 3.22. Reglarea hipoglicemiei

Legtura factorilor transreglatori (proteine+hormoni) pe secvena elementelor cis-reglatoare (secvena AGAACA) vor activa transcripia genei n aval de acest promotor de unde se sintetizeaz ARNm n concentraie mare. Mesagerii astfel produi vor induce sinteza enzimelor ce aparin cii gluconeogenezei. Creterea concentraiei acestor enzime n hepatocite va permite transformarea aminoacizilor n glucoz, care va fi eliberat n circulaie i va ajunge la creier; are loc o cretere a nivelului glicemiei (1, 46, 66). 3.14 Reglarea la efort

Stresul activeaz mecanisme care pregtesc organismul pentru efort fizic, care necesit utilizarea glicogenului pentru contracia muscular.Creierul activeaz medulosuprarenala pe cale nervoas pentru producerea adrenalinei. Dac concentraia glucozei n snge este sczut (hipoglicemie) pancreasul secret glucagon. Cei doi hormoni acioneaz asupra muchilor i a ficatului activnd sinteza AMPc.

Acesta din urm este activator a protein-kinazei A, care este capabil s fosforileze CREB (element responsabil de legarea AMPcilcic de proteine). Fosforilarea CREB-P va trece n nucleul celulei i se leag de ADN la nivelul promotorului unor gene, care au un element cis reglator specific: CRE (elemente responsabile de AMP cilcic).

Legarea factorilor trans-reglatori (CREB fosforilate) pe secvena elementelor cis-reglatoare (secvene TGACGTCA), vor activa transcripia genei n aval de promotori, cu formarea ARNm. Mesagerii astfel produi vor induce sinteza enzimelor aparinnd cii de glicogenoliz. Creterea concentraiei acestor enzime n muchi vor permite transformarea glicogenului n energie care va fi utilizat pentru contracia muscular (Fig. 3.23).

Fig. 3.23. Reglarea la efort (46).

3.15 Mecanismul transcripiei3.15.1 Iniierea transcripiein urma cercetrilor analitice s-a reuit s se izoleze i purifice din extractul nuclear o serie de factori de transcripie.

Fig.3.24 Legarea TFIID pe ADN.

Dac ARN polimerazele sunt universale, identice pentru toate celulele i esuturile, factorii de transcripie sunt specifici pentru anumite esuturi. Ei joac un rol important n diferenierea celular i meninerea tipurilor de celule.

Pe lng aceti factori de transcripie implicai direct n sinteza ARNm, exist i proteine care regleaz desfurarea procesului, n sensul c l intensific, atenueaz dar nu-l blocheaz. Atunci transcripia poate ncepe dac sunt prezente i ribonucleotidele trifosfat substrat.

Complexul de iniiere al transcripiei recunoate o secven de aproximativ 100 nucleotide a lanului antisens de ADN. TFIIH provoac deschiderea i derularea parial a dublului helix la acest nivel.ARN polimeraza I i II formaez complexe cu factori de transcripie care se leag upstream n amonte (deci naintea punctului de iniiere) pe cnd majoritatea factorilor de transcripie pentru ARN polimeraza II se leag downstrem-n aval (chiar la mijlocul unitii de transcripie).

Fig. 26. Iniierea transcripiei.

Transcripia ncepe la a 22-a nucleotid de pe TATA box, n direcia opus elementelor GC-CAAT i se continu crescnd lanul antisens n direcia extremitii sale 5(. Formarea acestui complex este activat sau inhibat de factori transreglatori legai de secvena cis reglatoare a aceluiai promotor.

Fixarea factorului TFIID pe TATAbox este prima etap a complexului de iniiere a transcripiei. Dup aceast fixare se deformeaz dublul helix de manier important. Acest ansamblu va servi ca punct de ancoraj pentru ali factori de iniiere a transcripiei, dup cum urmeaz:

-complexul ADN-TFIID acioneaz ca un situs de legare pentru un alt factor: TFIIB care leagndu-se va stabiliza complexul. Acest factor are aciune ATP-azic, elibernd energia necesar desfacerii catenelor de ADN, pentru formarea complex lui deschis (open);

-la acest complex se asociaz ali factori: TFIIE i TFIIH;

-ARN polimeraza II i n urma unui proces ATP-dependent ncepe iniierea transcripiei. Iniierea ncepe cnd s-a format complexul de iniiere, la nivelul promotorului genei int;

-la care se asociaz un alt factor : TFIIF, care este factorul de elongaie.

Acest factor mpiedic terminarea prematur a sintezei ARN.

Reglarea ARN polimerazeiActivatorii sau inhibitorii transcripiei (factori trans-reglatori) sunt proteine produse de ARN polimeraza II i ca urmare induc sau reprim expresia genelor transcrise.

Aceti factori transreglatori se leag de ADN (ADN proteine de legtur) n regiunea genei situate n amonte de partea transcris. Situsul de fixare a acestor factori transreglatori pe ADN sunt secvene specifice numite elemente cis reglatoare.

Cuplul elemente cis reglatoare cu factorii transreglatori legai, intr n contact cu complexul de iniiere a ARN polimeraza prin intermediul unui ansamblu de proteine numite mediatori.

Fig. 28. Reglarea ARN polimerazei.

ARN polimeraza poate deci demara transcripia, dac este activat prin factorii de transcripie, unii fiind legai de aceste elemente ca TATA box sau CAAT i dac prin intermediul mediatorilor ele au primit un semnal de activare sau inhibare. Acest semnal depinde de prezena unui factor transreglator legat la elemente din promotor. Legarea de reglatori ai mediatorilor necesit o repliere a ADN din promotor pentru a permite legarea de aceste proteine.

Elongaia transcripiei Fiecare nucleotid trifosfat este aleas specific, pentru a fi complementar cu baza din lanul antisens care vine n faa ei. Legturile bogate n energie ntre primul fosfat, care esterific C5( a ribozei i ceilali doi fosfai sunt hidrolizate elibernd pirofosfat, care la rndul lui va fi hidrolizat printr-o pirofosfataza. Fosfatul rmas se leag printr-o legtur ester la carbonul 3( a ultimei nucleotide a transcrisului n curs de sintez.

ARN polimeraza construiete un ARN hibrid cu lanul de ADN antisens, a crei secven primar este o copie a lanului sens dar compus din ribonucleotide n loc de dezoxiribonucleotide i de uracil n locul timinei. n cursul acestei elongri ARN polimeraza II este nsoit de o serie de factori de elongaie care modific cromatina pentru a permite avansarea enzimei, care mpiedic formarea de obstacole, ca o agraf de pr i faciliteaz avansarea policondensrii.

Transcriptul primar rmne hibridat pe cteva nucleotide cu lanul antisens apoi se detaeaz pentru a permite dublului helix s se reformeze dup trecerea polimerazei

Fig. 29 Elongaia transcripiei

. Extremitatea 5( a transcriptului primar eliberat se condenseaz n diverse structuri secundare. Polimeraza se aeaz pe catena antisens i merg n sensul 3(-5( Ea lectureaz sinteza transcrisului primar prin condensarea ribonucleotidelor, pn ntlnete semnalele de terminare. La ntlnirea semnalului de terminare, ARN polimeraza se detaeaz de ADN elibernd transcriptul primar i dublul helix se renchide.Viteza de sintez a ARN este de 45 nucleotide/secund. Transcripia trebuie fcut cu acuratee pentru c la nivelul ARN nu exist sisteme de corectare a erorilor. Daca au aprut erori, ARN avnd un timp de injumtire biologic (T) relativ scurt, nu se pot produce perturbaii de ordin genetic (transmisibile) ca n cazul ADN.

Fig. 30. Elongaia transcripiei.

Discontinuitatea genelor

Moleculele de ADN ale fiecrui cromozom sunt foarte lungi pn la sute de milioane de perechi de nucleotide i conin mai multe mii de gene. La om genele sunt foarte dispersate i nu reprezint dect 10% din ADN genomic total.

Fiecare gen conine regiuni care prezint secvene codate care vor fi exoni, dar i regiuni reglatoare ca promotori i regiuni netraduse numite introni care separ exonii. O gen poate s nu conin dect un singur exon i s nu conin intron dar exist gene cu peste o sut de exoni. Dup transcripia ARN produs de ARN polimeraza transcrisul primar conine de asemenena introni i exoni dar nu i promotor.

Dup excizia intronilor i matisarea sau nndirea exonilor, mesagerul nu conine dect exoni reunii ntr-o singur secven codant.

Fig.31 Discontinuitatea genelor.

ExonulExonul reprezint partea secvenei unei gene transcrise n structura ARNm pn la transducie. Exonii sunt fragmente ale secvenei primare ale unor gene care vor fi recopiate n structura primar a ARNm dup matisare. Exist exoni de lungimi variabile: fragmente scurte (34 nucleotide pentru exonul 1 al apoAII), lung (7572 nucleotide pentru exonul 26 al apoB).

Un exon codific cel mai adesea un domeniu funcional al proteinei sau o parte a acestuia. Astfel c poteinele eucariotelor sunt formate din mai multe domenii codificate de gene care posed cel puin atea exoni (ct are proteina). n cursul evoluiei, gena poate fi modificat prin substituia, inseria sau deleia unui exon ntreg (conversia genei) ceea ce modific proteina (aduce sau retrage proteinei un domeniu funcional n ntregime).

Exemplu de exon. Exon 1 apoAII.Dup fixarea ARN polimerazei pe caseta TATA prin intermediul factorului TFIID, transcripia va ncepe. n acest punct, secvena lanului sens este de 5(AGGCACAGA3( cea a lanului antisens va fi deci 3(TCCGTGTGT ... 5( (complementar i antiparalel).

Fig. 32. Exon I.

Pentru a alege ca substrat ribonucleotidele complementare ale acestei catene antisens ARN polimeraza va compune 5(AGGCACAGA3( care va fi nceputul secvenei ARN transcris. Transcripia se desfoar pe toat lungimea catenei antisens prin ncorporarea a 1329 nucleotide n ARN transcris de apoAII.

Sfritul transcripiei

Transcripia genei apoAII se desfoar pn la a 1329-a nucleotid. Ctre sfritul genei factorii legai de ARN polimeraza recunosc pe lanul antisens o secven 3(TTATTT5( urmat la majoritatea genelor de alt semnal 3(ATACAAAC5( este eliberat ARN polimeraza. Transcripia se oprete cu puin dup primul semnal i sfritul transcripiei se scrie 5(AAUAAAUGCUGA ... AUCC 3(OH.

ARN polimeraza fiind eliberat de ADN i transcriptul primar, care conine copia informaiiei genetice, va reprezenta expresia genei sub form de proteine.Modificri ale transcrisuluiCapion sau bonet: o enzim adug o guanina la fosfatului 5( a primei nucleotide a transcrisului formnd 7-metilguanilat trifosfat i transfer radicalii metil pe primele nucleotide. Aceste modificri au loc n debutul tuturor transcripilor

Fig. Capion sau boneta ARNm.Enzimele de bonetare (Fig. 33). Elongarea transcrisului primar ncepe de la extremitatea COOH terminal a polimerazei compelxului de iniiere. Pentru adugarea coifului un complex multienzimatic excercit trei activiti:

hidroliza fosfatului printr-o fosfataz la nucleotidul 5( a transcriptului primar;

transferul pe fosfatul rmas a unui guanilat de la GTP de ctre o guanililtransferaz; metilarea acestui guanilat pe N7 realizat de o metilaz.

Fig. 33. Enzime de bonetare.

Primele 2 reacii sunt catalizate de o protein de 68Kda, iar metilarea de o alt subunitate de 57Kda.

ARNm sunt distrui de ribonucleazele din citoplasm. Prin hidroliza lor se elibereaz nucleotide care vor fi refolosite la sinteza altor acizi nucleici. Pentru a proteja ARNm de acest catabolism, o structur special ascunde extremitatea 5( terminal a acestuia de exonucleaze specifice. Aceast structur este numit coiful mesagerului. Exist cel puin o fixare a GMP pe al II-lea fosfat din nucleotida trifosfat care se gsete la extremitatea 5( din transcris. Acest GMP este metilat pe azotul nr.7. Dac nucleotida iniial conine o adenin aceast poate fi metilat pe N6.

Ribozele nucleotidelor iniiale sunt uneori metilate pe oxigenul fraciunii alcool n 2(.

Coada poli A. O enzim -endonucleaza- secioneaz transcrisul primar cu 10-20 nucleotide nainte de secvena AAUAAA i o polimearaz A sintetizeaz pe C3(OH liber a ultimei nucleotide a transcrisului rmas, o caten de adenin numit cutia de poliadenilare (coada polyA). Este o caten cu o lungime de 500-2000 nucleotide a adeninei policondensate.Semnalul de sfrit al transcripiei se afl la sfritul majoritii genelor mamiferelor TATGTTTC. Citirea acestor semnale de ctreARN polimerazei II, se oprete din transcripie i prsete ADN elibernd transcrisul primar.

Aceast coad polyA este indispensabil maturrii i activitii ARNm pe care-l poart. Ea va fi digerat lent de o exonucleaz din citoplasm dac mesagerul va fi activ. Dac va fi redus la cteva sute de nucleotide mesagerul va fi distrus total pentru a fi nlocuit de un mesager nou.

Fig. 35. Coada poly A.

Transcrisul primar al apoAIITranscrisul primar al apoAII conine 1329 nucleotide. El primete un coif, bonet sau 7 metilguanilat care se fixeaz pe fosfatul ( a ATP n poziia 5( a transcrisului primar. Primete de asemenea i o coad poly A sintetizat n 3( dup sfritul transcrierii.Trei introni vor fi excizai: ei vor fi recunoscui printr- un situs donor GU n 5( a fiecrui intron, urmat de o secven bogat n purine; un situs primitor n 3(AG a fiecrui intron precedat de o secven bogat n pirimidin. Dup aceast maturare transcriptul primar devenit ARNm va fi transportat ctre citoplasm pentru transducie.

Fig. 36 Transcrisul primar.

Excizia, matisarea. Excizia, matisarea este o etapa de maturare a ARNm, unde intronii, prile necodante ale structurii primare a transcrisului sunt secionai din structura primar i exonii legai unul cte unul formnd o singur secven codant. Dup excizia intronilor i matisarea exonilor, mesagerul nu conine dect exoni

Etapa de eliminare a intronilor. Intronii, prile necodante a genelor eucariote, sunt decupai (excizai) din structura primar a ARN n cursul maturrii mesagerului.

Exonii, pri codante, sunt temporar legai cap la cap (matisare) pentru a forma secvena primar a ARNm. Excizia i matisarea se realizeaz prin aciunea unor enzime i a ribozomilor care catalizeaz secionarea ARN (endoribonucleaze mici nucleare) i inchiderea breelor prin ARN ligaze. Matisarea poate fi alternativ adic poate conduce la mai multe structuri ale ARNm. ARNm alternativ are fiecare anumii exoni proprii ca i unii exoni n comun.

Formarea lasoului

Excizia intronilor i matisarea exonilor este o etap foarte important a maturrii transcrisului n nucleul celular. Se face apel la factori specifici: ribonucleoproteine coninnd mici subuniti de ARN nuclear (snRNP), ARN avnd proprieti catalitice, ribozomi, enzime specifice (maturaze).Structura secundar a transcrisului pune n contact 3 secvene ale intronului:- secvena de debut a intronului (extremitatea 5( sau situsul donor), -secvena de sfrit a intronului (extremitatea 3( sau sistus acceptor) i

- un situs situat ntre 20-50 nucleotide n amonte de situsul de tiere 3( numit situs de ramificare. Situsul de ramificare este folosit pentru formarea unui lasou (la).

Procesul are loc prin dou reacii transesterificare. Situsul donor ncepe obinuit printr-o guanin a crui fosfat este detaat de exonul precedent pentru a fi transferat pe C2( a A situsului de ramificare. Se formeaz un grup 2, 5( fosfodiesteric, cu detaarea concomitent a exonului n potiia 5(. Ultima nucleotid a situsului acceptor este de asemenea o guanin, care este detaat de exonul urmtor a primei nucleotide, este legat prin fosfatul 5( la C3( a ultimei nucleotide a exonului precedent.

Apoi gruparea 3(-hidroxil a exonului 5( formeaz o legtur fosfodiesteric cu captul 5( terminal al exonului 3(, rezultnd produsul nndit.Intronul eliberat sub form de lasou este distrus de nucleaze. Transcrisul pierde succesiv toi intronii si i exonii se leag constituind secvena codant a ARNm.Jonciunile de nndire sunt recunoscute i cei doi exoni care trebuiesc unii sunt adui mpreun prin intermediul unor molecule mici de ARN nuclear (snARNs) care formeaz complexe proteice mici, numite ribonucleoproteine mici nucleare (snRNPs). Complexul este cunoscut ca spliceosome o structur foarte mare de 50-60S. Anticorpii de la pacienii cu lupus eritematos sistemic diseminat au avut un rol crucial n descoperirea snRNPs.n aceast boal autoimun, pacienii au o gam larg de anticorpi fa de componentele nucleare. S-a demonstrat c anticorpii specifici anti- snRNPs blocheaz procesul de splicing.

Fig.37 Formarea lasoului.

Splicing alternativ care duce la formarea de proteine diferiten genaral, exonii sunt coliniari cu domeniile proteice. Astfel prin selectarea exonilor ntr-un pre-ARNm dat, ar fi posibil generarea unor molecule de ARNm diferite, pornind de la aceeai seciune a ADN genomic. Splicing-ul alternativ apare frecvent.

Un exemplu este acela de generare a dou imunoglobuline diferite. Limfocitul B poart un monomer de IgM pe suprafaa sa. Cnd un astfel de limfocit este recunoscut de un imunogen, acesta este stimulat s formeze o clon de plasmocite care sintetizeaz i secret IgM pentamer.

Fig. Monomerul de IgM de pe suprafaa limfocitului B.Regiunea C-terminal a lanului greu H st la baza diferenei ntre monomerul IgM o protein membranar i pentamerul IgM protein secretat. Lanul greu H al monomerului posed o peptid hidrofob de 26 resturi de aminoacizi care are afinitate pentru membrana plasmatic, n timp ce lanurile grele ale pentamerului au o peptid hidrofil de 20 aminoacizi.

Fig. Pentamerul IgM protein secretat.

Un animal poate sintetiza multe milioane de anticorpi diferii, fiecare cu potenial de interaciune cu un antigen specific. Exist 3 surse ale acestei diversiti:

-o diversitate de gene cu regiuni variabile;

-recombinarea somatic: de exemplu fiecare din cele cteva sute de gene V pot s se lege de oricare din cele 5 gene J;

-mutaia somatic (de exemplu formarea lanurilor uoare).

Genomul celulei stem conine multiple variante ale genelor V i J pentru lanul uor (L) i ale genelor V, J, D (diversitate) pentru lanul greu (H). Genele V sunt precedate de un segment mic S ce codific o peptid semnal. Cnd limfocitele se maturizeaz, fiecare celul n difereniere i construiete anumite gene L i H cu o structur virtual unic printr-un proces de recombinare care selecteaz ntmpltor unul din setul de segmente de gene i le asambleaz mpreun cu gena C. PreARNm este prelucrat pentru a da un ARNm matur care este tradus i peptida semnal este eliminat. Se formeaz apoi prin oxidare punile S-S.

Fig. Genomul celulei stem cu multiple variante ale genelor V, J, pentru lanul uor (L) i ale genelor V, J D pentru lanul greu (H).Un alt exemplu de splicing alternativ este al troponinei.

Datorit prezenei proteinelor reglatoare pe transcrisul primar legarea poate fi de mai multe feluri, se face difereniat de la o celul la