Analize clinice. Importanță.

Organismul uman reprezintă un sistem biologic extrem de complex. Funcționarea lui normală reflectată prin starea de sănătate, este rezultatul unor numeroase procese fizico-chimice, care decurg unele din altele, sau care se desfășoară în paralel, inhibându-se sau stimulându-se reciproc. Orice abatere de la starea de echilibru, orice tulburare a funcțiilor normale, reprezintă un aspect patologic. Restabilirea funcțiilor normale constituie obiectul terapiei medicale.

Informațiile necesare se obțin cu metode chimice analitice. Obținerea informațiilor analizei presupune: detecția, identificarea și determinarea cantitativă a componenților.

Sursa de informare analitică (proba supusă analizei – materialul biochimic sau lichidul biologic) conține mai mulți componenți, care pot da semnal direct sau unificat (aditiv – semnal mare deoarece reprezintă o sumă a tuturor componenților, precum și neaditiv – unii dau semnal pozitiv, alții negativ).

Rezultatele analizei se obțineau în trecut calitativ. Majoritatea diagnosticelor erau puse pe baza simptomelor sau (și) cu ajutorul razelor X deși se cunoștea faptul că o serie de boli produceau modificări chimice în lichidele metabolice. Se utilizau o serie de teste pentru a depista componenții normali și anormali pe diferite probe recoltate, teste care au fost ulterior transformate în metode cantitative de determinare.

Dacă aceste analize se execută corect și se interpretează judicios, ele pot fi folosite pentru stabilirea stării fiziologice sau patologice a unui organism.

Pentru examinarea medicală generală a unui bolnav sau pentru a diagnostica complet un ansamblu specific de simptome se recurge la o serie de analize cantitative ale unor probe recoltate din corpul uman.

Analizele medicale sunt un ansamblu de procedee, tehnici sau metode care furnizează informații asupra aspectului și funcționalității unor organe sau compartimente ale organismului. Ele dau informații și asupra gradului de boală sau sănătate ce afectează organismul – ”prelungește simțurile medicului”.

Analizele medicale sunt foarte variate pentru că foarte variată este și funcționalitatea organismului uman – cea mai complexă mașină biologică creeată de natură.

Laboratoarele medicale sunt de diferite profiluri:

1

Laboratorul clinic – studiază calitativ și cantitativ diverși constituenți ai produselor biologice normale și patologice (sânge, urină, LCR, spută);

Laborator de morfopatologie – vizualizează structura organelor și țesuturilor;

Laborator de endoscopie – prin tehnica endoscopiei se poate privi pe viu în interiorul unor organe cavitare (stomac, bronhii);

Laborator de electrocardiografie – înregistrează potențialele electrice ale inimii;

Laborator de encefalografie – înregistrează potențialele electrice ale creierului;

Mai există laboratoare care folosesc diferiți agenți ca raze X (radiologie), radioizotopii (laborator de medicină nucleară), ultrasunete (laborator de ecografie).

Diversitatea metodelor de investigare face ca în prezent să existe sute de analize medicale.

Analizele constituie doar un mijloc pentru a se ajunge la diagnostic.Laboratorul clinic – aici se examinează diferite produse ale bolnavilor

pentru diagnosticarea bolii sau pentru depistarea unor boli de largă răspândire. Aceste produse examinate sunt foarte diferite, unele se găsesc în mod normal la orice individ: sânge, urină, LCR, altele doar în caz de boală: puroi, secreții, lichid pleural etc.

Majoritatea analizelor clinice includ determinări de compuși minerali sau organici: uree, glucoză, acid uric, Ca, Mg, Na, K; pH. Orice analiză făcută în laborator începe cu recoltarea probelor, etapă foarte importantă, de efectuarea ei corectă depinzând în mare măsură rezultatele analizei.

Rezultatele ce apar în laboratorul clinic se pot exprima cifric și descriptiv, cele descriptive sunt de cele mai multe ori imagini care au valoare în stabilirea unui diagnostic.

Rezultatele cifrice pot fi afectate de erori care se pot datora reactivilor, aparaturii sau executării defectuoase a tehnicii de lucru.

Factorii care influențează rezultatele analizelor

2

Un examen de laborator efectuat în timpul vieții unui individ poate da valori diferite în funcție de starea de sănătate sau de boală a organismului.

Cu câțiva ani în urmă, problema variațiilor fiziologice era, cel mai adesea, ignorată când se interpreta un examen de laborator. Astăzi sunt studiate cu atenție toate cauzele de fluctuație a rezultatelor și se cercetează influența factorilor de variație, legați fie de metodă, de condițiile de prelevare sau de diferențele intra- și interindividuale.

Examenul biologic care urmărește variațiile fiziologice demonstrează faptul că acestea sunt de amplitudine mai mică decât variațiile patologice. Este deci necesară precizarea riguroasă a limitelor în care se încadrează populația sănătoasă și stabilirea de intervale de referință. În aceste condiții cunoașterea variațiilor biologice și a factorilor care afectează concentrația diverșilor componenți ai organismului uman este indispensabilă. Trebuie subliniat faptul că conceptul de valori de referință nu poate fi aplicat decât subiecților sănătoși și deci este necesar să cunoaștem biologia omului sănătos.

Pentru o interpretare mai bună a analizelor de laborator trebuie să ținem seama de factorii care pot influența rezultatele analizelor.

Din punct de vedere didactic putem distinge două surse de variații:- variații analitice;- variații biologice.Variații analiticeLucrările lui Statland și Winkel au pus în evidență cele două componente

principale ale variabilei analitice:- eroarea preinstrumentală- eroare instrumentalăVariabila analitică preinstrumentală depinde de toate sursele de variații

cauzate de la recoltarea probei până la determinare, cum sunt:= pregătirea bolnavului= recoltarea probelor: trebuie să se țină cont de ora recoltării, felul

sângelui (venos, arterial, capilar), aplicarea garoului sau nu, poziția bolnavului, anticoagulantului utilizat.

= pregătirea probelor pentru analiză: trebuie să se țină cont de timpul de la prelevarea probei până la centrifugare și de utilizare sau nu a conservanților.

Variabila analitică instrumentală este eroarea analitică datorată metodelor de dozare.

3

Variațiile analitice trebuie menținute constante și la un nivel scăzut pentru a mări incertitudinea în momentul evaluării unui rezultat individual în intervalul de referință.

Variabilitatea biologică derivă din diferitele surse. Clasificarea factorilor de variație biologică se efectuează cu greutate. S-a propus clasificarea lor în variații genetice și dobândite, variații datorate mediului, în variații datorate factorilor exogeni și endogeni.

Dacă ținem cont de diferențele de concentrație plasmatică a unor constituenți, putem distinge două grupe de factori fiziologici:

- factori de masă: importanța masei musculare, adipoase, hepatice, care este determinată de exemplu, pentru nivelul anumitor enzime care provin din aceste țesuturi;

- factori metabolici: acționează pe substratele care suferă variații rapide și sunt supuse reglării hormonale și nervoase.

Ținând cont de faptul că procesul de reglare intervine foarte net asupra variațiilor fiziologice, putem distinge 3 categorii de constituenți:

- constituenți foarte bine reglați (electroliții, albuminele), cei care nu variază decât foarte puțin;

- constituenți cu variații importante (de exemplu produșii finali ai catabolismului, ca ureea, urații sau enzimele eliberate din țesuturi);

- constituenți implicați parțial în mecanisme de sinteză (glucoza, colesterolul) care suferă variații medii.

Deci este important să se cunoască și mecanismele biochimice și fiziologice care stau la baza variațiilor biologice, ca de exemplu mecanismul de ieșire a enzimelor, timpul de înjumătățire al diverselor substanțe etc.

Deoarece acești factori, după cum am văzut, sunt greu de clasificat, în continuare vom descrie factorii mai importanți care pot influența rezultatele analizelor.

VârstaVariațiile în funcție de vârstă sunt bine cunoscute. În primul rând trebuie

să menționăm concentrațiile hormonilor care suferă variații datorită creșterii, de la nou născut la copil și la adult.

Se cunoaște, de asemenea, variația colesterolului și a ureei. În ultimul timp s-a constatat că și activitatea fosfatazei alcaline variază funcție de vârstă.

4

Sexul Numeroși constituenți plasmatici au concentrații diferite în funcție de

sex. Dintre aceștia enumerăm doar câțiva: hemoglobina, hematocritul fierul, cuprul, trigliceridele etc.

La femei amilaza, transferina au concentrații mai crescute, pe când la bărbat activitatea fosfatazelor alcaline, transaminazelor, ureei și uratului sunt mai crescute.

RasaS-a constatat că la rasa neagră concentrația plasmatică în trigliceride,

potasiu și sodiu este mai crescută decât la albi, iar concentrația în acid uric este mult mai crescută la anumite populații din Oceania.

Stări fiziologice deosebite: sarcină, menopauză, menstruație.S-a constatat, în primul rând, o modificare a concentrației hormonale,

care atrage după sine și alte modificări.În timpul sarcinii printre variațiile importante cauzate de această stare, pe

lângă variațiile hormonale, amintim scăderea albuminelor plasmatice, a calciului care este legat de acestea, a imunoglobulinelor, glucoza, acidul uric, hemoglobina și eritrocitele, a vitaminei C. Se observă o creștere a proteinelor care transportă hormonii, a activității fosfatazei alcaline care crește de două ori prin aportul fosfatazei alcaline placentare. Mai cresc: colesterolul, trigliceridele, fosfații și volemia.

În menopauză scade mai întâi progesteronul, apoi estrogenii. Tot în menopauză crește net activitatea fosfatazei alcaline, concentrația plasmatică a calciului, colesterolului, acidului uric.

În timpul menstruației, pe lângă hormonii implicați în ciclu, apar numeroase variații ale aldosteronului, acizilor aminați, colesterolului și magneziului.

Alimentația poate interfera dozarea colorimetrică a anumitor constituenți datorită conținutului lor în diverse principii, cum sunt: pigmenții, carotenii, antocianii. Există alimente care au efect asupra unor constituenți biologici prin conținutul lor crescut în anumite substanțe, cum sunt spre exemplu: spanacul, măcrișul care conțin cantități crescute de acid oxalic și care interferă în dozarea calciului; un exces alimentar de sfeclă provoacă hipokalemie și hiperaldosteronism.

5

Cafeaua și cofeina cresc glucoza plasmatică și acizii grași esterificați și scade timpul Quick (Timpul de protombina (PT) masoara timpul necesar sangelui sa se coaguleze. In organism,procesul coagularii implica o serie de reactii chimice).

Cele mai importante efecte sunt cele datorate unui regim alimentar neechilibrat, unui regim vegetarian sau în cazul unui regim alimentar cu aport mare de carne, care modifică pH-ul. În cazul unui post alimentar îndelungat, se observă pe lângă creșterea cantității corpilor cetonici plasmatici, se constată și creșterea secreției de aldosteron, a glicerolului, a trigliceridelor, a acidului uric, a ureei.

Efortul fizic crește concentrația albuminei și a altor enzime plasmatice. În cazul unui efortde mică intensitate se constată o creștere ușoară a proteinelor plasmatice și a fosfatului. În condițiile unui efort intens cresc enzimele de origine celulară: creatinkinaza, LDH, AST, ALT și chiar ornitil-carbamil-transferaza.

Stress-ul Stress-ul este un factor important de care trebuie să se țină seama în

momentul recoltării probelor, deoarece acesta duce la creșterea concentrației plasmatice a colesterolului, a trigliceridelor, a glucozei, a acidului uric, a noradrenalinei, a hormonilor tiroidieni, a hormonului de creștere, acizilor neesterificați.

Ritmurile circadiene (Ritmul circadian, sau ritmul nictemeral este un ciclu de aproximativ 24 de ore al proceselor biochimice, fiziologice sau comportamentale aparținând entităților vii, inclusiv plante, animale, ciuperci sau cianobacterii)

Se constată că activitatea plasmatică a fosfatazei alcaline scade dimineața, de la 25% până la 50% . Concentrația plasmatică a aldosteronului crește de la 6 dimineața până la ora 15, secreția sa fiind mai scăzută noaptea. Se presupune că acest efect se datorează poziției ortostatice. Excreția noradrenalinei este mai crescută ziua decât noaptea, iar concentrația plasmatică a fierului are un ritm circadian maxim după-amiaza și minim la 4 dimineața.

Mediul ambiantInsecticidele, pesticidele, solvenții organici, vaporii de benzină, oxidul de

carbon, soluțiile fixative pentru păr dau modificări ale valorilor obținute în urma examenelor de laborator, cel mai frecvent datorită modificărilor toxice (citopenie, afecțiuni hepatice, nefrotoxicitate, anemie hemolitică). Astfel, bilirubina,

6

transaminazele colinesteraza au valori crescute, în timp ce elementele figurate și timpul Quick sunt diminuate.

FrigulLa temperaturi scăzute cresc în plasmă leucocitele, hormonul de creștere,

hormonii tiroidieni precum și catecholaminele. Activitatea enzimatică a creatinkinazei crește, în timp ce acizii aminați cum este tirozina și triptofanul plasmatic prezintă valori scăzute.

FebraS-a observat o scădere a glucozei plasmatice și o creștere a

metabolismului bazal, a ureei și a uraților urinari la persoanele cu febră mare.Greutatea corporalăS-a constatat că hemoglobina, creatininei plasmatice, acidul uric

plasmatic, ALT-ul și γ-glutamil-transferazei cresc direct proporțional cu greutatea corporală.

TutunulPot apărea diferențe între examenele de laborator la nefumători față de

fumători. Astfel, pe lângă oxihemoglobina care este crescută la fumători, mai crește acidul ascorbic în plasmă, glucoza plasmatică, trigliceridele, colesterolul precum și ionul tiocian în salivă. S-a demonstrat de asemenea că valoarea concentrației de antigen carcino-embrionar este net crescută, de la 3% la 19%, la fumători față de nefumători.

Medicamentele, pot influența examenele de laborator. Variațiile pe care le pot da medicamentele conduc la interpretarea greșită a rezultatelor examenelor de laborator și la stabilirea unui diagnostic eronat.

Medicamentele pot influența analizele medicale astfel:= din punct de vedere pur analitic: medicamentele sau metaboliții

acestora pot perturba sau pot interfera în dozarea unor constituenți biologici. Spre exemplu, unele medicamente pot da colorații similare cu unii

constituenți biologici, cum ar fi cazul salicilaților care dau cu reactivul Folin aceeași colorație cu aceea a acidului uric.

Unele medicamente și/sau metaboliții acestora prezintă proprietăți reducătoare, ca în cazul acidului ascorbic care interferă numeroase dozări ale constituenților biologici care prezintă aceleași proprietăți (glucoza, acidul uric, creatinina).

7

= din punct de vedere biologic: pot provoca aceste medicamente modificarea unui parametru biologic printr-un mecanism fiziologic, farmacologic sau toxicologic.

Medicamentele pot acționa asupra enzimelor și proteinelor inhibând activitățile și proprietățile caracteristice acestora. Pot forma diferite complexe cu compușii biologici, pot prezenta fluorescențe proprii și pot modifica pH-ul.

Principalele boli și dereglări dependente de ioni metalici și molecule de interes clinic

Fiecare organism necesită o concentrație optimă dintr-un element dat peste care sau sub care nu se mai poate dezvolta corespunzător.

Elementul sau compusul organic

Afecțiunile în care este implicat

Ca Cataracte și tetanie;Co Anemie pernicioasă, miocardiopatie;Cu Infarct miocardic, artrite reumatice, psoriazis, leziuni

arteriale, hepatite infecțioase, leucemie, ciroze, nefrite, dereglări pigmentare;

Fe Anemie feriprivă, iritații ale mucoaselor, colaps cardiac;Li Sindrom maniaco-depresiv;Mg Spasmofilie infantilă, boli gastro-intestinale;Na, K Gută;Zn Anemie, cancer, tulburări de creștere, anomalii de schelet,

ciroză hepatică;F Fluoroză, cariiPb, Hg, As, Be Toxici puternici, poluanți;Glucoza Diabet zaharat, acromegalie, insuficiență tiroidiană, afecțiuni

hepatice grave, intoxicațiiColesterol Hipercolesterolemie, ateroscleroză, diabet, icter, pancreatite;Uree Insuficiență renală, cardiacă, encefalită;Creatinina Insuficiență renală cronică, distrofie musculară, acromegalieBilirubină Hepatite toxice, ciroză hepatică, insuficiență cardiacă;Acid uric Boli infecțioase, leucemii, intoxicații cu Pb și Hg.

8

Metode și tehnici analitice utilizate în laboratorul clinicO analiză chimică poate fi considerată ca un lanț informațional compus

din 3 etape reprezentat grafic:1. mărimile de intrare sunt constituite din luarea și pregătirea probei.

Semnalul de intrare reprezintă acțiunea chimică sau fizico-chimică care se aplică sistemului cu scopul de a perturba starea lui inițială și a obține un semnal caracteristic măsurabil. De exemplu, în metodele titrimetrice semnalul de intrare este adăugarea titrantului. În metodele optice, semnalul de intrare este radiația electromagnetică;

2. informațiile primite de la mărimile de intrare sunt preluate de un sistem intermediar ”black-box” - care efectuează măsurarea propriu-zisă (sunt constituite din traductoare închise în cutii);

3. semnalul de răspuns. Valoarea mărimii măsurate este corelată cu conținutul calitativ sau cantitativ al probei analizate sub forma unui semnal informațional de ieșire. Informația poate fi afectată de erori dacă instrumentația folosită, oricât de sofisticată ar fi nu este utilizată corect sau dacă nu se acordă o importanță deosebită etapei de pregătire și prelucrare a semnalului.

Veriga principală a lanțului informațional o constituie metoda analitică utilizată.

Metode analiticeÎn laboratorul clinic se folosesc majoritatea metodelor chimice analitice

la care se adaugă și metode microbiologice. Datorită complexității deosebite a metodelor biochimice, uneori este necesar să se efectueze o serie de separări a elementelor (concentrări de elemente chiar) de analizat.

Dintre metodele de separare și concentrare se folosesc în special metode cromatografice (cromatografia pe hârtie, în strat subțire) (cromatografia de schimb ionic, în fază gazoasă), electroforeza, extracția cu solvenți.

Metodele microbiologice sunt destul de laborioase iar în unele situații au o precizie și specificitate redusă.

Metodele chimice și fizico-chimice instrumentale: sunt folosite la determinarea cantitativă.

Metode chimice: gravimetriatitrimetria

Se bazează pe determinarea de masă sau de volum

9

Metodele fizico-chimice sau instrumentale s-ar putea include și metodele de separare dar importante sunt metodele de determinare (informare și caracterizare).

Funcție de natura semnalului de intrare sau ieșire:= metode optice= electrochimice= termice= magnetice= nucleareÎn laboratorul clinic se utilizează metode optice. În funcție de interacțiunea radiației electromagnetice cu sistemul studiat

întâlnim: - spectrometrie de absorbție (bazată pe absorbția radiației ) în UV, VIS,

IR;- spectrometrie de emisie (emisie de radiații) în UV, VIS, raze X,

fluorescență - spectrometrie Raman, bazată pe difuzia radiației în medii omogene;- metode turbidimetrice și nefotometrice bazate pe difuzia radiației în

medii eterogene;- refractometria – bazată pe refracție;- difractometria – bazată pe difracția radiației cu raze X, cu electroni sau

neutroni;Se preferă metodele analitice cu sensibilitate și selectivitate ridicată

capabile să detecteze prezența unor componente în concentrații foarte mici.Utilizarea în scop analitic a absorbției și fluorescenței atomice,

fluorescenței de raze X, polarografie cu redizolvare anodică, a cromatografiei gaz-lichid, metode ce permit evidențierea și determinarea unor cantități de ordinul ppm și ppb deschid noi perspective în aprofundarea cunoștințelor actuale privind rolul microelementelor în organismele vii.

Tehnici analitice utilizate în laborator sunt:= directe = indirectePentru determinarea cantitativă a unei specii chimice sunt folosite metode

de analiză prin intermediul anumitor tehnici analitice. Alegerea uneia sau alteia dintre acese tehnici depinde de o serie de factori: rapiditatea cu care trebuie făcută

10

analiza; acuratețea cerută analizei respective, cantitatea de probă luată în lucru și concentrarea probei, tipul instrumentelor disponibile pentru efectuarea analizei.

Tehnici analitice directe: semnalul de ieșire este corelat direct cu informația analizată care, de cele mai multe ori este o funcție de concentrație.

1. Metoda comparației sau metoda etalonării standard = constă în compararea valorilor proprietăților măsurate pentru proba de analizat cu valoarea proprietăților măsurate pentru o probă etalon de concentrație cunoscută.

Dacă semnalul analitic măsurat este o funcție liniară de concentrație atunci prin efectuarea măsurătorilor pentru proba de analizat x și pentru proba standard se vor obține relațiile:

Sx = k·cx

Sstandard = k·cstandard

→ Sx/ Sstandard = cx/ cstandard → cx = Sx/ Sstandard · cstandard

Dacă dependența semnalului analizat este o funcție log de concentrație (metode potențiometrice) atunci etalonarea scalei instrumentului de măsură se va face direct în unități logaritmice. Ca exemplu măsurătorile de pH – pHmetre.

Metoda comparativă dă rezultate cu atât mai precise cu cât proba de analizat și proba standard sunt prelucrate și măsurate în condiții aproximativ identice.

Uneori nu este necesară adăugarea acelorași reactivi în aceleași cantități ci trebuie respectată și succesiunea de adăugare de reactivi, timpul scurs între adăugarea reactivilor și efectuarea măsurătorilor, temperatură, pH.

2. Metoda curbei de etalonareSe folosește o soluție standard din care prin diluții succesive se prepară o

serie de soluții de concentrații cunoscute. Se măsoară proprietatea fizică în aceleași condiții pentru soluția etalon și proba supusă analizei.

a) Dacă semnalul analitic dat de proprietățile fizice măsurate este o funcție liniară de concentrație (absorbanță, intensitate de curent) se obțin o serie de valori care reprezintă grafic funcție de concentrație conduc la o curbă de etalonare

11

b) Se pot folosi mărimi proporționale cu proprietățile fizice măsurate: înălțimea, suprafața picurilor obținute la înregistrări, grafice ale spectrelor de absorbție;

c) Dacă semnalul analitic este o funcție logaritmică de concentrație (metode potențiometrice) curba de etalonare se realizează printr-o reprezentare semilogaritmică : ε = f (lg c)

În cazul probelor biochimice tăria ionică (este un lucru important) a probei de analizat este mare, ca urmare soluțiile standard utilizate pentru curbele de etalonare trebuie să aibă o tărie ionică apropiată de a probei de analizat.

Pentru efectuarea măsurătorilor la aceeași tărie ionică se folosește adăugarea unui electrolit inert în exces. Ca electrolit inert: soluții tampon pentru ajustarea tăriei ionice totale TISAB

Dacă tăria ionică a probei de analizat este foarte mare se impune o diluare prealabilă a acesteia.

3. Metoda adaosurilorÎn cazul unor probe cu un conținut complex, de tipul probelor

biochimice, când alături de componenta principală de determinat se găsesc cantități necunoscute și variabile din alți ioni (componenți interferenți care influențează semnalul analitic), metoda comparației și a curbei de etalonare nu mai dau rezultate exacte. Ar fi necesară astfel o separare a componentelor prin metode adecvate.

Tehnici analitice indirecte:Din această categorie fac parte diferitele titrări instrumentale, în care

punctul de echivalență se stabilește prin urmărirea variației unei proprietăți fizice pe tot parcursul titrării (intensitatea curentului de difuzie, conductibilitate, absorbanță).

12

Titrarea instrumentală oferă o mărire a acurateței și precizie a măsurătorilor pentru că la punctul de echivalență proprietatea fizică urmărită se poate măsura suficient de precis, față de panta de răspuns necesar în cazul determinărilor directe (la punctul de echivalență are loc o variație bruscă a concentrației).

În cazul titrării indirecte nu este necesară cunoașterea absolută a mărimilor fizice măsurate pe parcursul titrării. Trasarea graficului semnal analitic-volum de titrant permite evaluarea grafică a punctului de echivalență.

Metode spectrale de analiză – metode opticeMetodele spectrale se bazează pe fenomenul de emisie sau interacțiune a

radiațiilor electro-magnetice cu atomii sau moleculele substanței ce se determină. Emisia sau absorbția radiațiilor e.m. de către sistemul studiat se consideră ca un proces de apariție a unor semnale analitice care posedă informații calitative și cantitative despre compoziția substanțelor studiate. Observarea și studierea semnalelor analitice se poate face în diferite regiuni ale spectrului radiațiilor e.m. Energia acestor radiații cuprinde un domeniu foarte larg 108 – 10-6 eV.

Metodele optice au la bază proprietățile optice ale unui sistem de atomi, molecule simple sau complexe. Proprietățile optice depind de natura atomilor, structura combinațiilor, lungimea de undă a energiei radiante.Exemple de proprietăți optice ce pot fi corelate cu concentrația: absorbția, emisia radiației, difracția, dispersia, emisia întârziată a energiei radiante.

Spectrometria de absorbție moleculară în UV-VIS Legea de bază a absorbției: fie un fascicul luminos de intensitate I0 care

străbate soluția ce conține proba de analizat, pot avea loc o serie de fenomene – o parte din radiație e reflectată, o parte difuzată și o parte e transmisă.

Absorbția radiației este caracterizată de transmitanță T = It/I0

absorbanță A = - lgT = - lg It/I0 Dacă toată lumina este absorbită It = 0.Dacă I0 nu se absoarbe, T = 1.A ia valori între 0 și ∞ teoretic, iar practic între 0 și 2.Legea Lambert-Beer: A = ε.l.c arată dependența dintre absorbanță și

concentrație. Se pot face determinări cantitative directe.ε = absorbtivitate molară (coeficient molar de absorbție)(l/mol.cm);l = grosimea stratului absorbant;c = concentrația (mol/l).

13

Aparatura are următoarele părți principale:- sursa de radiații; în VIS – bec cu filament de wolfram; în UV – lampă de

hidrogen sau deuteriu;- monocromator: VIS – prismă de sticlă; UV – cuarț sau NaCl sub formă de

prismă cu unghi mic sau rețea densă;- suport pentru probe: VIS – cuvă din sticlă transparentă; UV – cuve din

cuarț.- receptori sau detectori;- amplificatorul.Radiația transmisă neabsorbită de probă este transformată de detector în

curent electric care este înregistrat sub formă de spectre de absorbție.Receptorul spectrometrului de absorbție este o celulă fotoelectrică sau un

fotomultiplicator.Aplicații: determinări de concentrații; ≈90% din dozările compușilor

organici din clasa glucidelor, lipidelor, proteinelor, aa, h., enzime, vitamine.Dozarea glucozei este unul din cele mai frecvente teste cerute de medici – se

folosește sânge, plasmă, ser, urină, LCR.Dozarea ureei: este un test indispensabil în special în cazul bolnavilor cu

afecțiuni renale acute sau cronice; - determinările se fac în sânge, plasmă, ser, urină.

Refractometrie și interferometrieLa baza metodelor refractometrice de analiză stă determinarea indicelui de

refracție (n) al substanței de analizat.O rază de lumină care cade sub un anumit unghi de incidență pe o suprafață

ce separă două medii omogene transparente parțial se reflectă și parțial se refractă. Trecerea energiei radiante dintr-un mediu transparent omogen în alt mediu are loc cu schimbarea direcției de propagare a fasciculului. Fenomenul este numit refracția radiației și are ca măsură cantitativă indicele de refracție.

14

Aparatura folosită: - refractometre (se bazează pe măsurarea unghiului limită de refracție, care este o măsură a indicelui de refracție);

- interferometre (aparate destinate determinării unor diferențe mici de indici de refracție; ele funcționează pe baza fenomenului de interferență. Determinările se fac cu mare precizie.)

Aplicații ale determinărilor cu indicele de refracțieIndicele de refracție face parte dintre constantele fizice care se pot măsura cu

precizie într-un timp scurt, cu o cantitate minimă de probă. Refractometria și interferometria au aplicații atât ca metode analitice propriu-zise cât și ca mijloace de caracterizare fizico-chimice.

Determinări calitative: identificarea substanțelor cercetate respectiv evaluarea gradului de puritate se poate face cu ajutorul n – care sunt tabelați pentru fiecare substanță.

Determinări cantitative: în sistemele binare există relații de legătură între n și concentrație. Aceste relații sunt liniare, într-un domeniu foarte îngust de concentrație și se folosesc doar la determinări foarte precise ale compoziției sistemului.

Precizia determinării depinde de forma curbelor: n = f (compoziție); n = f (conc.); de diferențele între valorile n ale componenților.

Polarimetria se ocupă cu studiul fenomenelor optice în lumină polarizată. Are ca obiect determinarea cantitativă a rotației radiației polarizate în plan respectiv determinarea unghiului de rotație.

Aplicații: Pentru dozarea și control în determinarea structurală pentru substanțele organice și anorganice optic active. Se pot determina și substanțe care nu sunt optic active. după prealabila lor precipitare sau complexare cu substanțe optic active și îndepărtarea excesului de substanță activă.

Determinări biochimice în ser prin metoda spectrofotometricăPrincipiul metodei spectrofotometrice constă în măsurarea densității optice

pe baza căreia se calculează concentrația parametrului în probă, conform legii Lambert-Beer.

Metoda se aplică în două moduri:

15

- end-point: măsurarea modificării absorbanței după un anumit timp stabilit de metoda de lucru specifică fiecărui parametru;

- cinetic: măsurarea modificării absorbanței pe minut timp de 150-180 secunde, funcție de parametru.

1. Determinarea glucozei în lichide biologice (ser, urină)Prin metoda GOD/PAP glucoza este măsurată după oxidarea ei enzimatică

în prezența glucooxidazei, cu formare de peroxid. Peroxidul format reacționează cu 4-aminofenazona și fenol sub acțiunea peroxidazei, când rezultă un compus colorat în roșu violet, quinoneimina, a cărei culoare este direct proporțională cu concentrația glucozei (măsurată la λ = 505 nm).

2. Ureea Ureea este determinată prin metoda cinetică enzimatică cu urează, în UV.

Ureea este hidrolizată în prezența apei de către urează la amoniu și CO2. Amoniul produs se combină cu α-cetoglutaratul și cu NADH-ul în prezența glutamat-DH, cu formarea de glutamat și NAD. Modificarea absorbanței datorită formării de NAD în locul NADH-ului consumat este proporțional cu concentrația de uree din lichidul biologic (ser și plasmă).

Pentru dozări de uree din urină se diluează urina (colectată fără aditivi, timp de 24 ore) 1:20, cu ser fiziologic și se multiplică rezultatul cu 21.

3. Acid uricMetoda utilizată pentru măsurarea acidului uric în ser sau plasmă este

enzimatică/colorimetrică. Acidul uric este convertit de către uricază la alantoină și peroxid. Acesta, sub influența catalitică a peroxidazei, formează cu 4-aminofenazona un compus colorat roșu-violet, quinoneimina, a cărui culoare este direct proporțională cu concentrația de acid uric măsurată.

4. Creatinina

16

Se determină prin metoda colorimetrică după următorul principiu: în mediu alcalin, creatinina reacționează cu acidul picric formând picratul alcalin, compus complex de culoare galbenă care se fotocolorimetrează la λ = 500 nm. Se măsoară rata de formare a complexului colorat în primele 5 minute de la inițierea reacției.

Cleareance-ul de creatinină se calculează după formula:

5. Proteinele totaleSe dozează prin metoda colorimetrică cu reactivul biuret. Proteinele

formează în mediul alcalin cu ionii de Cu- un compus colorat a cărui intensitate a culorii este direct proporțională cu concentrația proteinelor măsurată în ser sau plasmă.

6. Bilirubina totalăSe dozează prin metoda colorimetrică Jendrassik Grog (1938). În prezența

cafeinei, bilirubina totală este eliberată de pe molecula de albumină și reacționează cu acid sulfanilic diazotat cu formarea unui compus colorat a cărui intensitate a culorii este direct proporțională cu bilirubina totală.

7. Bilirubina directăDeterminarea bilirubinei conjugate (directe) se bazează pe capacitatea ei de

a reacționa direct cu acid sulfanilic și reactivul diazo. Se formează un compus colorat în roșu, intensitatea culorii fiind direct proporțională cu concentrația bilirubinei directe în ser.

8. Colesterolul

17

18

19

20

21

22

Analize biochimie

23

24

25

26

reactant de fază acută negativ (scade ca răspuns la procesele infecțioase și inflamatorii acute).

Albumina constituie un indicator global al stării de nutriție a organismului, în special la persoanele vârstnice cu diverse afecțiuni cronice. S-a constatat astfel că la persoanele vârstnice spitalizate, hipoalbuminemia reprezintă un factor de risc independent în ceea ce privește mortalitatea.

27

În urină, prezența proteinelor și deci și a albuminei este considerată patologică dar cu toate acestea se acceptă ca un nivel urinar al proteinelor de circa 20-30 mg/24ore este fiziologic.Albumina urinară provine din albumina sanguină și în mod normal ea nu se găsește în urină. În bolile care afectează rinichiul precum și în bolile care dau sângerări pe traiectul căilor urinare, albumina trece în urină (albuminurie).

Exemple: glomerulonefrite, nefroză, cistită, tuberculoză renală, calculi urinari.Alte boli care pot să ducă la albuminurie sunt:- hipertensiune arterială esențială;- bolile de inimă;- diabetul zaharat;- diferite infecții și intoxicații cu substanțe minerale sau organice;- mielor multiplu.Alte semne asociate: deseori albuminuria se însoțește de hematurie (prezența hematiilor din sânge în urină).

Bilirubina se produce prin degradarea eritrocitelor în sistemul reticuloendotelial.Bilirubina serică este compusă din trei fracțiuni:= bilirubina indirectă (Bu) neconjugată, insolubilă în apă, circulă în plasmă legată de albumină.= bilirubina directă(Bd) conjugată circulă legată de un zahar, solubilă în apă;= delta bilirubina (BI), molecula de bilirubină este legată covalent de albumină.Determinarea bilirubinei se utilizează pentru diagnosticul bolilor hepatice, anemie hemolitică, diagnostic diferențial între diferitele tipuri de icter, se bazează pe următoarele criterii:

28

29

30

31

Determinarea concentrației de Ca în urină diferențiază hipercalciuria de hipocalciurie și poate fi o cauză a litiazei renale.

32

33

34

35

36

37

Se pot recolta 4 tipuri de probe:= glucoza plasmatică/serică determinată á jeun (bazală)= glucoza serică determinată la 2 ore postprandial= glucoza plasmatică/serică determinată dintr-o probă de sânge recoltată într-un moment oarecare al zilei, indiferent de intervalul de la ultima masă (”random”).= glucoza plasmatică/serică determinată în cadrul testului de toleranță la glucoză (la 2 ore după administrarea a 75g glucoză).

38

39

Lipoproteinele cu densitate mare (HDL) reprezintă colesterolul bun. HDL transportă

(lipoproteinele cu densitate mică)

40

În organismul uman trigliceridele intră în constituția lipoproteinelor cu densitate foarte joasă (VLDL) 59%, chilomocronilor 81-88% și HDL (3%).

Determinarea în plasmă sau ser a trigliceridelor este importantă, deoarece se identifică cu determinarea factorilor de risc în ateroscleroză.

VLDL transportă trigliceridele, fosfolipidele și colesterolul și reprezintă mecanismul intern al organismului de transport al lipidelor.

VLDL este adesea numit colesterol rău deoarece depozitează colesterolul pe pereții vaselor sanguine. Valorile crescute de VLDL sunt asociate deseori cu ateroscleroza și afecțiuni ale inimii.

41

Determinarea concentrației lipidelor totale se face prin: metoda SPV, metoda turbidimetrică

42

43

44

45

46