I
U�IVERSITATEA DE ŞTII�ŢE AGRICOLE ŞI MEDICI�Ă VETERI�ARĂ
CLUJ-�APOCA FACULTATEA DE ZOOTEH�IE ŞI BIOTEH�OLOGII
ŞCOALA DE STUDII DOCTORALE Domeniul: BIOTEH�OLOGII
Ing. ADRIA�A ŞERBA� (PĂUCEA�)
OBŢI�EREA ŞI CARACTERIZAREA U�UI
PRODUS LACTAT FU�CŢIO�AL CE VALORIFICĂ POTE�ŢIALUL BIOACTIV AL
DROJDIILOR SACCHAROMYCES
REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT
Conducător ştiințific: Prof. Univ.dr. Carmen Socaciu
CLUJ-�APOCA 2009
II
CUPRI�S INTRODUCERE: SCOP ŞI OBIECTIVE ......................................................................................................... III
REZULTATE EXPERIMENTALE ....................................................................................................................... VI
1.ELABORAREA ŞI OPTIMIZAREA PROCESULUI BIOTEH�OLOGIC Ȋ� SCOPUL OBŢI�ERII U�UI PRODUS LACTAT FU�CŢIO�AL CE VALORIFICĂ POTE�ŢIALUL BIOACTIV AL DROJDIEI SACCHAROMYCESVII
I.1. MATERIALE ŞI METODE ................................................................................................................. VII
I.1.1 Elaborarea procesului tehnologic de obținere a produsului lactat funcțional ....................... VII
I.1.2 Optimizarea compoziției şi cantității inoculului .................................................................... IX I.1.3 Monitorizarea procesului biotehnologic ȋn bioreactor ........................................................... X I.1.4 Analiza senzorială a produsului ............................................................................................... XI
I.2 REZULTATE ŞI DISCUŢII ................................................................................................................... XI
I.2.1 Elaborarea procesului tehnologic de obținere a produsului lactat funcțional ........................ XI I.2.2 Optimizarea compoziției şi cantității inoculului ................................................................... XVII I.2.3 Monitorizarea procesului biotehnologic ȋn bioreactor ........................................................ XXI I.2.4 Selecția produsului pe baza analizei senzoriale ................................................................... XXV
II.CARACTERIZAREA MICROBIOLOGICA A PRODUSULUI LACTAT FU�CŢIO�AL CE VALORIFICĂ POTE�ŢIALUL BIOACTIV AL DROJDIEI SACCHAROMYCES .................................................................................................. XXIX
II.1 MATERIALE ŞI METODE .............................................................................................................. XXIX
II.2 REZULTATE ŞI DISCUŢII .............................................................................................................. XXIX
III.CARACTERIZAREA U�OR COMPUŞI BIOACTIVI CE DAU FU�CŢO�ALITATE PRODUSULUI................................................................... XXXII
III.1 MATERIALE ŞI METODE ............................................................................................................ XXXII
III.1.1 Metode enzimatice cu detecție UV ................................................................................. XXXII III.1.2 Metoda reflectometrică ................................................................................................... XXXII III.1.4 Cromatografia lichidă de ȋnaltă performanță(HPLC) ........................................................ XXXII
III.2 REZULTATE ŞI DISCUŢII ........................................................................................................... XXXIII
III.2.1 Metode enzimatice cu detecție UV ................................................................................ XXXIII II.2.2 Metoda reflectometrică .................................................................................................. XXXVII III.2.3 Caracterizarea compuşilor bioactivi cu ajutorul spectroscopiei IR ................................ XXXIX III.2.4 Identificarea şi caracterizarea unor vitamine prin HPLC ................................................... XLVI
DISCUŢII GENERALE ................................................................................................................................. XLIX
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ ........................................................................................................................... LIII
III
I�TRODUCERE: SCOP ŞI OBIECTIVE
Alimentele funcționale sunt produse care dacă sunt consumate ȋn cadrul unei
alimentații curente, prin compuşii lor biologic activi, contribuie la menținerea stării de
sănătate a omului. Obținerea şi studierea unor noi alimente funcționale este esențială
pentru etapa contemporană, ȋn care organismul uman este supus unei multitudini de
agresiuni, ceea ce-i solicită la maximum sistemele de protecție, de adaptare şi de
menținere a echilibrului. Prin acțiunea lor specifică, compuşii bioactivi din astfel de
alimente pot contribui la menținerea ȋn parametri normali a echilibrului organismului.
Ȋn acest context se ȋncadrează şi produsele lactate funcționale. Numeroase studii
evidențiază noi efecte privind influențele benefice aduse sănătății de aceste produse.
Astfel, ȋn ȋntreaga lume, producția acestora se dezvoltă şi se diversifică iar consumatorii
devin din ce ȋn ce mai interesați de aceste produse. Este important să subliniem că un rol
deosebit ȋn amploarea acestui fenomen ȋl are educația consumatorului referitoare la starea
de bunăstare şi/sau la reducerea riscului apariției unor boli, oricum foarte răspândite ȋn
epoca noastră. De asemenea subliniem faptul că aceste produse trebuie să facă parte din
dieta zilnică a tuturor categoriilor de vârstă, mai ales a copiilor şi vârstnicilor.
Ȋncă de la ȋnceputul anilor ’80, drojdia de bere a fost ȋncadrată ȋn categoria
alimentelor de protecție datorită faptului că prezintă avantajul unui echilibru natural a
complexelor vitaminice şi a bioionilor concomitent cu a unor sisteme antioxidante care
acţionează la diferite nivele redox. Astfel drojdia de bere, datorită compoziţiei chimice
complexe şi armonioase, este capabilă să asigure organismului uman un aport de
nutrienţi cu valoare energetică şi nutriţională ridicată şi uneori chiar o valoare terapeutică.
Studiile din domeniul medical, asupra dietelor cu produse din drojdii sau chiar cu drojdii
ca atare, au arătat modificări sensibile ale stării de sănătate ale subiecţilor cu diferite
afecţiuni: boli digestive, hepatice, inflamatorii sau ale nervilor.
In prezent, ȋn țara noastră, drojdia rezultată ca subprodus ȋn fermentația secundară
a berii este foarte puțin valorificată şi nu de puține ori este tratată ca deşeu.
IV
Scopul acestei lucrări este obținerea şi caracterizarea unui produs lactat funcțional
ce valorifică potențialul bioactiv al drojdiei de bere Saccharomyces cerevisiae.
Principalele obiective ale studiului de față sunt:
1. Elaborarea şi optimizarea procesului biotehnologic de obținere a produsului lactat
funcțional tip chefir prin studii experimentale la scară pilot, de laborator şi de
bioreactor.
2. Utilizarea analizei senzoriale ca metodă de selecție a produsului lactat funcțional.
3. Caracterizarea microbiologică a produsului lactat funcțional ce valorifică potențialul
bioactiv al drojdiei Saccharomyces cerevisiae.
4. Caracterizarea compuşilor biologic activi (acid D/L lactic, glucide, etanol, vitamine,
dioxid de carbon, arome) ce dau funcționalitate produsului lactat funcțional prin
diverse metode analitice ca: HPLC, FT-IR, metode enzimatice cu detecție UV,
spectrometrie de reflexie.
STRUCTURA TEZEI
Teza este structurată ȋn două părți principale, prima parte incluzând studiul de
literatură, iar cea de-a doua parte, contribuții personale, rezultate, discuții şi concluzii.
PARTEA Ȋ�TȂI: STUDIU DE LITERATURĂ, cuprinde trei capitole:
Capitolul 1. Caracterizarea morfologică şi funcțională a drojdiei Saccharomyces,
descrie principalele proprietăți structurale, fiziologice, metabolice, biochimice precum şi
calitățile funcționale ale drojdiilor de bere.
Capitolul 2. Culturi starter pentru obținerea de produse lactate acide, descrie
caracteristicile morfo-fiziologice ale bacteriilor din genurile Lactococcus şi Leuconostoc
Capitolul 3. Produse lactate funcționale-chefirul, cuprinde o descriere generală a
acestui produs din perspectivă tradițională şi modernă, precum şi o descriere a
compuşilor bioactivi şi a beneficiilor aduse sănătății de aceştia.
PARTEA A DOUA: CERCETĂRI PROPRII, cuprinde trei capitole, fiecare dintre
acestea urmărind patru subcapitole principale: motivație şi obiective, materiale şi metode,
rezultate şi discuții, concluzii.
Capitolul 4. Elaborarea şi optimizarea procesului biotehnologic ȋn scopul
obținerii unui produs lactat funcțional ce valorifică potențialul bioactiv al drojdiei
Saccharomyces, cuprinde patru subcapitole care tratează: elaborarea procesului
V
tehnologic de obținere a produsului lactat funcțional, optimizarea compoziției şi cantității
de inocul, monitorizarea procesului biotehnologic ȋn bioreactor şi selecția produsului
lactat funcțional pe baza analizei senzoriale.
Capitolul 5. Caracterizarea microbiologică a produsului lactat funcțional ce
valorifică potențialul bioactiv al drojdiei Saccharomyces urmăreşte dinamica de
dezvoltare a bacteriilor Lactococcus lactis şi a drojdiilor Saccharomyces cerevisiae ȋn
condiții de co-cultivare, precum şi identificarea microorganismelor de contaminare din
produs.
Capitolul 6. Caracterizarea unor compuşi bioactivi ce dau funcționalitate
produsului, descrie ȋn patru subcapitole identificarea şi cuantificarea unor compuşi
biologic activi prin diverse metode analitice: HPLC, FT-IR, metode enzimatice cu
detecție UV şi metoda reflectometrică (spectrometrie de reflexie).
Partea de cercetări proprii se ȋncheie cu Discuții generale şi Concluzii ale studiului
şi bibliografia aferentă studiilor efectuate. Pentru interpretarea statistică a datelor s-a
folosit analiza monofactorială (one-way ANOVA) şi bifactorială (two-way ANOVA) .
Studiul a fost efectuat ȋn cadrul Universității de Ştiințe Agricole şi Medicină
Veterinară din Cluj-Napoca România, Departamentul de Chimie şi Biochimie
Agroalimentară, laboratorul de microbiologie şi stația pilot de obținere a produselor
lactate din cadrul secției de Tehnologia Prelucrării Produselor Agricole şi ȋn cadrul
Facultății de Chimie a Universității Babeş-Bolyai Cluj-Napoca.
Elementele de originalitate ale tezei sunt:
1. Primul studiu din România care propune o modalitate de valorificare a
potențialului bioactiv al drojdiei Saccharomyces cerevisiae, subprodus al
industriei berii, prin obținerea unui produs lactat funcțional.
2. Evidențierea şi caracterizarea compuşilor biologic activi (acid D/L lactic, lactoză,
glucoză, etanol, vitamine, dioxid de carbon, arome etc.) din produsul lactat
funcțional folosind o multitudine de metode analitice moderne: HPLC, FT-IR,
metode enzimatice cu detecție UV, spectrometrie de reflexie.
3. Caracterizarea, pentru prima dată ȋn România, a speciilor microbiene din cultura
starter cu ajutorul amprentei specifice (fingerprint) obținute prin spectroscopie
FT-IR şi obținerea amprentei specifice a produsului lactat funcțional.
VI
REZULTATE EXPERIME�TALE
Produsele lactate fermentate sunt extrem de populare ȋn ȋntreaga lume atât datorită
caracteristicilor senzoriale plăcute cât şi datorită potențialului pe care ȋl au pentru
menținerea şi chiar ȋmbunătățirea sănătății consumatorilor.
Corelațiile dintre consumul de iaurt şi chefir şi buna funcționare a sistemelor
digestiv, circulator, imunitar sunt doar câteva dintre motivele pentru care consumatorii
din lumea ȋntreagă sunt din ce ȋn ce mai atraşi de aceste alimente.
Pe de altă parte, drojdiile, datorită compoziţiei chimice complexe şi armonioase,
sunt capabile să asigure organismului uman un aport de nutrienţi cu valoare energetică şi
nutriţională ridicată şi uneori chiar o valoare terapeutică. Drojdia de bere rezultată ca
produs secundar la fabricarea berii, datorită condiţiilor stricte de igienă din fabricile de
bere şi a mustului de malţ, care este un mediu cu valoare nutritivă ridicată pentru drojdie,
se impune prin calitățile sale funcționale. Cercetările au arătat că pe must de malţ se
biosintetizează cantităţi mai mari de vitamine şi substanţe biologic active faţă de alte
medii de cultură. Din punct de vedere nutritiv, drojdia de bere este un concentrat valoros
în proteine şi vitamine.
Utilizarea culturilor starter selecționate al căror metabolism poate fi coordonat
prin dimensionarea inocului şi reglarea condițiilor fizico-chimice de activitate, reprezintă
garanția unor procese reproductibile, pentru obținerea unor produse cu proprietăți care să
satisfacă cerințele de calitate şi preferințele consumatorilor.
Fermentația nu este numai un mijloc de a furniza, de a menține sau de a
ȋmbunătăți calitățile de păstrare a produsului. Astfel procesul fermentativ s-a dovedit a
avea un puternic impact asupra calității şi acceptabilității produsului. Pe perioada
procesului fermentativ nutrienții primari din lapte, cum ar fi compuşii proteici de calitate
superioară, calciu, fosfor şi vitamine ale complexului B, rămân disponibili şi dau valoare
nutritivă ridicată produsului lactat fermentat. Dar, mai important este că, aceste produse
lactate fermentate pot depăşi granița proprietăților nutritive devenind funcționale dacă
procesul fermentativ este condus optim. Aroma, vâscozitatea, caracteristicile microbiene
şi chimice pot fi afectate de mărimea inoculului adăugat ȋn lapte, de prezența agitării pe
durata fermentării sau de alte astfel de aspecte .
VII
1.ELABORAREA ŞI OPTIMIZAREA PROCESULUI BIOTEH�OLOGIC Ȋ� SCOPUL OBŢI�ERII U�UI PRODUS LACTAT FU�CŢIO�AL CE
VALORIFICĂ POTE�ŢIALUL BIOACTIV AL DROJDIEI SACCHAROMYCES
I.1. MATERIALE ŞI METODE
I.1.1 Elaborarea procesului tehnologic de obținere a produsului lactat funcțional
Pentru obținerea unui produs lactat funcțional care să valorifice potențialul
bioactiv al drojdiei Saccharomyces cerevisiae s-au realizat teste, mai ȋntâi ȋn fază de
laborator apoi la scară pilot, prin fermentarea laptelui cu diferite variante de inocul,
obținute prin varierea cantității de culturi starter de ȋnsămânțare. Ulterior produsele au
fost urmărite pe o durată de 21 de zile. Având ȋn vedere standardele şi reglementările
legislative naționale şi internaționale ȋn vigoare pentru produsele lactate fermentate, s-a
hotărât ca produsul să fie considerat de tip chefir.
S-a folosit lapte degresat cu 1,8% grăsime. Inoculul folosit a fost constituit din :
1.Cultură mezofilă FD-DVS CHN-22 ce conține speciile: Lactococcus lactis
ssp.cremoris, Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp lactis biovar
diacetylactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris.
2. Cultură de drojdii pentru chefir LAF 3 (Debaryomyces hansenii)
3. Suspensie de drojdie de bere (Saccharomyces cerevisiae) prelevată din fermentația
secundară a berii, cu o viabilitate celulară de 96%.
Obținerea chefirului prin testări la scară de laborator şi de stație pilot ( la USAMV
Cluj-Napoca), s-a realizat după schemă tehnologică prezentată in figura nr 1.
Parametrii fizico-chimici ce au fost urmăriți pe durata perioadei de valabilitate a
produsului sunt: pH-ul, aciditatea titrabilă şi sinereza.
1. Pentru determinarea pH-ului s-a utilizat un pH-metru portabil Hanna Instruments.
2. Aciditatea titrabilă s-a determinat folosind metoda prin titrare (STAS 6353-85).
3. Sinereza, exprimată ca % zer liber, s-a obținut prin cântarirea probei de chefir ȋnainte
şi după eliminarea zerului prin filtrare ȋn condiții de vacuum.
VIII
Fig. 1. Schema tehnologică de obținere a produsului lactat funcțional tip chefir Fig.1. Flow chart for manufacturing kefir type product
LAPTE
PASTEURIZARE
RACIRE
INOCULARE
DISTRIBUIRE IN
AMBALAJE
TERMOSTATARE
PRERACIRE
RACIRE
DEPOZITARE
CULTURI
REACTIVATE
(1,2)
AMBALAJE
DROJDIE BERE din
fermentatia
secundară(3)
CHEFIR CU DROJDIE
SACCHAROMYCES
IX
I.1.2 Optimizarea compoziției şi cantității inoculului
Optimizarea compoziției şi cantității de inocul s-a realizat ȋn două etape ȋn fază de
laborator şi la scară pilot, urmărindu-se dinamica de dezvoltare şi viabilitatea bacteriilor
lactice din specia Lactococcus lactis şi a drojdiilor Saccharomyces cerevisiae.
Protocolul experimental a urmărit realizarea mai multor variante experimentale care să
conducă la obținerea unui inocul cu o compoziție microbiologică optimă, obiectiv absolut
necesar pentru obținerea produsului tip chefir cu caracteristici fizico-chimice şi
microbiologice corespunzătoare. Procesul de optimizarea s-a realizat ȋn două etape.
In ambele etape probele obținute au fost analizate pe durata perioadei de
valabilitate la 4-6°C a produsului, respectiv după 24 de ore, 7 zile, 14 zile şi 21 zile.
Pentru a urmări dinamica de dezvoltare şi viabilitatea bacteriilor lactice şi a
drojdiilor s-au folosit tehnici de numărare a coloniilor conform reglementărilor ȋn vigoare
(SR EN ISO 4833,SR ISO 7954). Mediile de cultură selective folosite au fost M17
pentru Lactococcus ssp. şi WLN pentru Saccharomyces cerevisiae.
Tabelul 1 Table 1
Descrierea variantelor experimentale ȋn etapa I Description of experimental’s variants in first stage
�umăr Variantă Variant’s
number
Cod Variantă Variant’s
code
Microorganisme co-cultivate
Type of co-cultivate
microorganisms
Compoziția inoculului Inoculation rate
1
C+B • Cultură lactică mezofila
• Drojdie Saccharomyces
cerevisiae
• 2l lapte • 1 ml cultură mezofilă
reactivată • 2ml drojdie
Saccharomyces
cerevisiae 2 C+K • Cultură lactică
mezofila • Drojdie pentru chefir
Debaryomyces
hansenii
• 2l lapte • 1ml cultură mezofilă
reactivată • 2ml cultură pentru chefir
reactivată
3 C+K+B • Cultură lactică mezofila
• Drojdie pentru chefir • Drojdie
Saccharomyces
cerevisiae
• 2l lapte • 1ml cultură mezofilă
reactivată • 1ml cultură de chefir
reactivată • 1ml drojdie S.cerevisiae
X
Tabelul 2 Table 2
Descrierea variantelor experimentale ȋn etapa II Description of experimental’s variants in the second stage
Cod probă Sample code
Inocul
Termostatare anaerobă Anaerobical incubation
Termostatare aerobă Aerobical incubation
Pb 1 Pb 2 Pb 3 Pb 4 Pb 5 Pb 6 Pb 7 Pb 8 Lapte Milk
0,5 l
0,5 l 0,5 l 0,5 l 0,5 l 0,5 l 0,5 l 0,5 l
Cultură lactică mezofilă Mesophilic
culture
0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
Drojdie pentru chefir Kefir yeast
_ 0,5 ml 1 ml 2 ml _ 0,5 ml 1 ml 2 ml
Drojdie Yeast
Saccharomyces
cerevisiae
1 ml 0,5 ml 0,25 ml _ 1 ml 0,5 ml 0,25 ml _
Numărul inițial de microorganisme din inocul s-a determintat prin numărare cu
Camera Thoma iar viabilitatea celulelor de drojdii de bere s-a determinat prin colorare
diferențiată datorită permeabilității diferite a citoplasmei celulare.
I.1.3 Monitorizarea procesului biotehnologic ȋn bioreactor
Monitorizarea procesului biotehnologic s-a dovedit necesară având ȋn vedere
introducerea ȋn inoculul destinat ȋnsămânțării laptelui, pe lângă cultura lactică şi cea de
drojdie de chefir, a tulpinii de drojdie Saccharomyces cerevisiae, prelevată din
fermentarea secundară a berii. Plecând de la caracterele fenotipice şi tehnologice ale
acestor microorganisme s-a ajuns la concluzia că este important să se cunoască care sunt
parametrii de proces ce influențează procesul biotehnologic, respectiv dinamica de
dezvoltare a microorganismelor competitive şi formarea de acid lactic. S-a utilizat un
bioreactor tip Tryton- Pierre Guerin Technologies, cu capacitate maximă de 2l şi
capacitate utilă de 1,5 l. Biofermentatorul este dotat cu echipamente de reglare şi control
a temperaturii de fermentație, un senzor de pH, un senzor de măsurare a concentrației de
oxigen dizolvat şi un analizor de gaze (CO2, O2). Echipamentul permite supervizarea,
XI
controlul şi achiziția de date de proces. Protocolul de inoculare s-a realizat folosind
cantitățile de inocul necesare probei optime.
I.1.4 Analiza senzorială a produsului
S-au aplicat următoarele teste: testul triunghi, testul hedonic, testul punctajului şi
testul profilului de aromă, unui eşantion format din 10 persoane, neantrenate ca
degustători, cu vârste între 13 şi 55 de ani, studenţi şi cadre didactice din cadrul
Universitătii de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară din Cluj-Napoca, precum şi
membri ai familiei. Degustătorii au fost selectați pe baza unei discuții pentru a se
observa potențialul şi disponibilitatea acestora. S-au avut ȋn vedere condițiile SR 6345 de
analiză senzorială a laptelui şi produselor lactate. Analiza senzorială s-a realizat ȋn două
etape: prima etapă ȋn care s-a urmărit optimizarea calității şi cantității inoculului iar a
doua etapă ȋn care s-a caracterizat produsul finit.
I.2 REZULTATE ŞI DISCUŢII
I.2.1 Elaborarea procesului tehnologic de obținere a produsului lactat funcțional
Valorile parametrilor fizico-chimici urmăriți pe perioada de păstrarea la 4-6°C a
produsului au fost: pH-ul, aciditatea titrabilă şi sinereza. Valorile sunt ȋnregistrate ȋn
tabelele 3 şi 4 şi corespund celor două etape de obținere a produsului tip chefir, respectiv
la scară de laborator şi la scară pilot .
Din rezultatele obținute ȋn prima etapă, tabelul 3, se poate observa că nu au existat
variații semnificative ale parametrilor fizico-chimici urmăriți față de valorile ȋnregistrate
pentru proba care a fost considerată martor şi care s-a obținut făra adaos de drojdie
Saccharomyces cerevisiae. Astfel pH-ul a ȋnregistrat o creştere uşoară de la prima zi
până la ziua a 14-a, de 0,18 respectiv 0,12 unități de pH, dar apoi creşterea a fost mai
mică doar de 0,08 unități de pH, corespuzătoare ultimei săptămâni de păstrare a
produsului la 4-6°C. Considerând o valoare medie pentru creşterea de pH
corespunzătoare ultimei zile din perioada de valabilitate, ȋn cazul celor trei variante
experimentale s-a ȋnregistrat o creştere de pH de 7,44 %.
Variația acidității titrabile pe perioada primelor 14 zile de păstrare a produsului la
4-6°C a fost foarte apropiată pentru toate variantele experimentale. Valorile maxime ale
XII
acidității titrabile au fost atinse ȋn prima zi de depozitare a produsului la 4-6°C. Ȋn
intervalul următor, aciditatea titrabilă a avut o scădere uşoară cu 13°T pentru proba cu
drojdie de bere şi, respectiv 14°T pentru proba martor.
Ȋn ceea ce priveşte procesul de sinereză a coagulului pe durata de păstrare a
produsului la 4-6°C, acesta a fost analizat prin calcularea % de zer liber. Din datele de
mai jos se poate observa că nu există diferențe majore ȋntre varianta martor şi cele cu
adaos de drojdie de bere. Cantitatea de zer eliberată a crescut progresiv pe durata
studiului, fără ȋnsă a depăşi limitele normale.
Pentru ca aceste rezultate să fie cât mai concludente, ele au fost analizate ȋmpreună
cu rezultatele testelor microbiologice efectuate pe aceleaşi variante experimentale şi s-a
ajuns la concluzia că este necesar un studiu mai aprofundat pentru a determina cantitatea
optimă de drojdie de bere ce se va adăuga ȋn inocul.
Datele statistice au fost obținute utilizând testul Bonferroni, analiza bifactorială
(two way ANOVA), prin compararea parametrilor fizico-chimici ȋnregistrați pentru
probe pe durata perioadei de depozitare.
Fig.2 Variația pH-ului, acidității titrabile şi a % de zer liber pe durata perioadei de depozitare, etapa I
Fig.2 pH’s, titratable’s acidity and % of free whey’s variation during shelf life in the
first stage
XIII
Variatia pHpH's variation
0
1
2
3
4
5
Pb 1 Pb 2 Pb 3 Pb 4 Pb 5 Pb 6 Pb 7 Pb 8
probesamples
pH
Variatia aciditate titrabilaTitratable acidity's variation
0
50
100
150
Pb 1 Pb 2 Pb 3 Pb 4 Pb 5 Pb 6 Pb 7 Pb 8
probesamples
gra
de(degree)
Th
orn
er
variatia %zer liber% of free whey's variation
0.0
0.5
1.0
1.5
Pb 1 Pb 2 Pb 3 Pb 4 Pb 5 Pb 6 Pb 7 Pb 8
probesamples
%
Fig. 3 Valorea medie a parametrilor fizico-chimici- etapa II
Fig.3 Physicochemical parameters average values- second stage
Ȋn etapa a II-a a studiului s-a urmărit modul ȋn care sunt influențați parametrii
fizico-chimici (pH, aciditate titrabilă şi % zer liber ) de varierea cantității de culturi din
inoculul destinat ȋnsămânțării laptelui. Totodată variantele experimentale au fost studiate
atât ȋn condiții de termostatare aerobă cât şi anaerobă (cu 20% CO2), având ȋn vedere
caracteristicile fiziologice ale microorganismelor ce alcătuiesc inoculul.
Din analiza acestor rezultate se poate observa că nu există diferențe semnificative
ȋntre valorile parametrilor fizico-chimici ȋn cazul termostatării aerobe respectiv anaerobe.
Deci din acest punct de vedere produsul se poate obține prin termostatare aerobă iar
XIV
procesul tehnologic se poate extinde la scară pilot unde termostatarea are loc ȋn condiții
aerobe. De asemenea nu există diferențe semnificative ȋntre valorile parametrilor fizico-
chimici pentru cele patru probe termostatate aerob. Ȋn aceste condiții, rezultatele au fost
analizate ȋmpreună cu rezultatele testelor microbiologice pentru aceleaşi variante
experimentale şi s-a ajuns la concluzia că varianta experimentală optimă este proba 3.
Pentru această variantă experimentală ȋn figura 4 (A,B) sunt prezentate variația pH-ului şi
a acidității titrabile, respectiv variația pH-ului şi a sinerezei.
1 day 7 days 14 days 21 days
4.30
4.35
4.40
4.45
4.50
4.55
4.60
4.65
4.70
pH
AT
storage time
pH
102
104
106
108
110
112
114
116
Titra
tab
le a
cid
ity, T
1 day 7 days 14 days 21 days
4.30
4.35
4.40
4.45
4.50
4.55
4.60
4.65
4.70
pH
free whey
storage time
pH
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
% fre
e w
he
y
A. B.
Fig.4 Variația pH-ului şi a acidității titrabile(A) şi variația pH-ului şi a % zer liber (B) pentru proba optimizată
Fig.4 pH and titratable acidity’s(A) and pH’s and % of free whey’s (B) variation for
optimized sample
Se poate observa că pH-ul ȋn produsul tip chefir variază puțin pe durata perioadei
de depozitare la 4-6 °C, spre deosebire de alte produse fermentate ca de exemplu iaurtul,
unde pH-ul scade mult şi aciditatea creşte prin formare de noi cantități de acid lactic
(Irigoyen et al., 2004). Ȋn cazul chefirului, pH-ul nu scade şi produsul nu devine mai acid
probabil datorită prezenței drojdiilor. Bacteriile lactice se ȋnmulțesc şi produc acid lactic
mai ȋncet atunci când sunt co-cultivate cu drojdii (Collar et al., 1996). Prezența drojdiilor
Saccharomyces cerevisiae nu afectează negativ calitățile fizico-chimice ale produsului.
XV
Tab
elul
3
Table
3
V
alor
ile
para
met
rilo
r fi
zico
-chi
mic
i ȋn
etap
a I
Valu
es o
f p
hys
ico-c
hem
ical
para
met
ers
in t
he
firs
t st
ag
e
Cod
V
aria
ntă
Va
rian
t’s
code
pH
pH
Aci
dita
te t
itra
bilă
,°T
T
itra
table
aci
dit
y, °
T
Sine
reză
,% z
er li
ber
S
yner
sis,
%fr
ee w
hey
1 z
7 z
14z
21z
1 z
7 z
14z
21z
1 z
7 z
14z
21z
C+
B
4,35
±0,0
1 4,
49±
0,01
4,
61±
0,02
4,
69±0
,01
115±
1,01
11
1± 1
,2
105±
1,3
103±
1,52
0,
5±0,
15
1,2±
0,0
7 1,
4± 0
,05
1,8±
0,15
C
+K
4,33
±0,0
1 4,
45±0
,02
4,66
±0,0
2 4,
71±0
,015
11
6±1,
02
110±
1,03
10
4±1,
1 10
2±1,
4 0,
5±0,
1 1,
1±0,
05
1,3±
0,15
1,
9±0,
02
C
+K
+B
4,36
±0,0
1 4,
52±0
,01
4,66
±0,0
2 4,
7±0,
015
115±
1,1
109±
1,05
10
4±1,
2 10
2±1,
02
0,5±
0,07
1,
1±0,
1 1,
4±0,
15
1,9±
0,04
XV
I
Tab
elul
4
Table
4
Val
oril
e pa
ram
etri
lor
fizi
co-c
him
ici ȋ
n et
apa
a II
-a
Valu
es o
f p
hys
ico-c
hem
ical
para
met
ers
in t
he
seco
nd s
tage
Cod
pro
bă
Sam
ple
’s c
ode
Par
amet
ru
Para
met
er
Ter
mos
tata
re a
naer
obă(
An
aer
obic
al
incu
bati
on
)
Pb
1 P
b 2
Pb
3 P
b 4
1 z
7 z
14z
21z
1 z
7 z
14z
21z
1 z
7 z
14z
21z
1 z
7 z
14z
21z
pH
4,32
±0,
01
4,54
±0,
01
4,51
±0,
08
4,58
±0,
06
4,31
± 0,
02
4,52
± 0,
05
4,59
± 0,
01
4,64
± 0,
02
4,31
± 0,
03
4,56
± 0,
01
4,68
± 0,
01
4,63
± 0,
02
4,31 ±
0,01
4,58
± 0,
02
4,77 ±
0,01
4,72
± 0,
02
Aci
dita
te t
itra
bilă
, °T
T
itra
table
aci
dit
y, °
T
116±
0,
5 11
0±
1,2
111±
1,
5 10
6±1,
3 11
5±
1,1
109±
0,
6 10
6±
1,2
104±
1,
1 11
5±
1,5
112±
1,
2 10
4±
1,4
103±
0,
8 11
5±
0,7
106±
0,
8 10
3±
1,2
102±
1,
1
% z
er li
ber
% f
ree
wh
ey
0,
4±
0,08
0,9±
0,
09
1,2±
0,
5 1,
3±
0,2
0,4±
0,
01
0,9±
0,
08
1,3±
0,
09
1,4±
0,
1 0,
4±
0,05
0,
9±
0,1
1,3±
0,
1 1,
4±
0,09
0,
4±
0,02
1,
1±
0,05
1,
5±
0,06
1,
3±
0,09
T
erm
osta
tare
aer
obă(
aer
obic
al
incu
bati
on
)
Cod
pro
bă
Sam
ple
’s c
ode
Par
amet
ru
Para
met
er
P
b 5
Pb
6 P
b 7
Pb
8
1 z
7 z
14z
21z
1 z
7 z
14z
21z
1 z
7 z
14z
21z
1 z
7 z
14z
21z
pH
4,36 ±
0,01
4,55 ±
0,04
4,56 ±
0,02
4,61 ±
002
4,36
± 0,
02
4,56
± 0,
02
4,67
± 0,
01
4,66
± 0,
02
4,34 ±
0,03
4,58 ±
0,02
4,71 ±
0,01
4,7±
0,
02
4,37 ±
0,01
4,66 ±
0,01
4,79 ±
0,02
4,69 ±
0,02
Aci
dita
te t
itra
bilă
, °T
T
itra
table
aci
dit
y, °
T
115±
0,
5 11
0±
0,6
109±
1,
1 10
5 ±
115±
10
9±
104±
10
4±
114±
10
6±
102 ±
102±
11
5 ±
105±
10
3 ±
105±
% z
er li
ber
% f
ree
wh
ey
0,6±
0,
06
0,8±
0,
1 1,
25 ±
0,5
1,4±
1,
2 0,
6±
0,9
0,8±
0,
1 1,
3±
0,9
1,2±
0,
9 0,
5±
0,1
0,9±
0,
5 1,
2±
0,8
1,2±
0,
7 0,
6 ±
0,2
1,2±
0,
9 1,
6 ±
0,2
1,3±
0,
8
XVII
I.2.2 Optimizarea compoziției şi cantității inoculului Numărul inițial de microorganisme din inocul :
� Cultură mezofilă FD-DVS CHN-22 : 2x1010 cfu/ml
� Cultură de drojdii de chefir LAF 3: 3 x1010 cfu/ml
� Suspensie de drojdie de bere: 5,5x106 cfu/ml şi viabilitate celulară 96%
Evaluarea microbiologică a probelor ȋn etapa I a condus la următoarele rezultate
exprimate ȋn cfu/ml (unități formatoare de colonii/ ml):
a. Bacterii lactice Lactococcus cultivate pe mediul de cultură selectiv M 17
Tabelul 5 Table5
Variația numărului de bacterii Lactococcus pe timpul perioadei de conservare
etapa I Variation of Lactococcus bacteria’s count during shelf life-first stage
Probă(Sample)
Perioada(period)
1 zi(day) 7 zile(days) 14 zile(days) 21 zile(days)
C+B (2±1,1) x 106 (7± 1,6)x 103 ( 8± 1,3)x 103 (1,2±0,5) x 103
C+K (3± 1,2)x 106 (5± 1,2)x 105 ( 2±0,7) x 105 (8±0,9) x 104
C+K+B (2,5±0,9) x106 (3,2±1,1)x 103 (5,8± 0,9)x 103 (3,8±0,4) x 103
a. Drojdii Saccharomyces cerevisiae cultivate pe mediul de cultură selectiv WLN
Tabelul 6 Table 6
Variația numărului de drojdii Saccharomyces cerevisiae pe timpul perioadei de conservare –etapa I
Variation of yeast’s count(Saccharomyces cerevisiae) during shelf life- first stage
Probă (Sample)
Perioada(Period)
1 zi(day) 7 zile(days) 14 zile(days) 21 zile(days)
C+B (2,5±0,8) x104 (1,5±0,7) x105 (2,8±0,5) x106 (3±1,1) x 106
C+K+B (3±1,1) x104 (2 ±1,1)x 105 (3±0,9)x 106 (4±1,5) x 106
*Rezultatele reprezintă media aritmetică a 4 determinări
XVIII
Din analiza acestor rezultate se observă că ȋn variantele experimentale cu adaos
de drojdie Saccharomyces cerevisiae, numărul de lactococi a scăzut la jumătate ȋn
primele şapte zile de depozitare după care până la sfârşitul perioadei s-a menținut
constant la un nivel de 103 cfu/ml. Ȋn ceea ce priveşte proba martor, ȋn care nu s-a
adăugat drojdie de bere, numărul de lactococi a scăzut progresiv iar nivelul final a fost
mai ridicat față de variantele experimentale cu adaos de drojdie de bere (104 față de 103).
Ȋn ceea ce priveşte numărul de drojdii Saccharomyces cerevsiae ȋn cele două
variante experimentale, acesta a crescut progresiv atingând un maxim de 106 cfu/ml după
21 de zile de depozitare. Valorile foarte apropiate ale numărului de drojdii ȋn cele două
variante experimentale se datorează faptului că s-a folosit aceeaşi proporție de inocul.
Datele au fost analizate şi statistic, utilizând testul Bonferroni (two way ANOVA) şi s-a
obținut că există variații distinct semnificative(**) p=0,0025(p<0,05) ȋntre numărul de
lactococi din ziua 1 şi zilele 14 şi 21 de depozitare. De asemenea există variații distinct
semnificative(**) p=0,0058 (p<0,05) ȋntre numărul de drojdii Saccharomyces cerevisiae
din ziua 1 şi zilele 14 şi 21 de depozitare.
Fig. 5 Dinamica de dezvoltare a populației de bacterii şi drojdii - etapa I Fig.5. Development dynamics of bacteria and yeasts’s population-first stage
Ȋn etapa a II-a s-a urmărit să se găsească varianta experimentală optimă din punct
de vedere al proporției de combinare a speciilor de microorganisme ce alcătuiesc
inoculul, astfel ȋncât numărul de lactococi să nu scadă aşa de mult iar numărul de drojdii
XIX
să nu crească aşa de mult. Deci prin varierea cantităților de suspensii microbiene din
inocul s-a urmărit obținerea unui raport optim ȋntre numărul de lactococi viabili şi
numărul de drojdii Saccharomyces cerevisiae viabile pe durata de depozitare. Acest
obiectiv a fost considerat prioritar pentru obținerea unui produs lactat funcțional.
Evaluarea microbiologică a probelor ȋn etapa a II- a, a condus la următoarele
rezultate exprimate ȋn cfu/ml (unități formatoare de colonii/ ml):
a. Bacterii lactice Lactococcus cultivate pe mediul de cultură selectiv M 17
Tabelul 7 Table7
Variația numărului de bacterii Lactococcus pe timpul perioadei de conservare etapa II
Variation of lactic bacteria’s count during shelf life-second stage
Probă(sample)
Perioada(period)
1 zi(day), cfu/ml
7 zile(days), cfu/ml
14 zile(days), cfu/ml
21 zile(days), cfu/ml
Pb 1 (3± 0,9)x 105 (1,2±0,7)x105 (8±1,2) x 104 (4,5±0,9)x104 Pb 2 (3 ±0,5)x 106 (2±0,9) x 105 (2,8±0,9)x104 (8 ±1,1) x 104
Pb 3 (1,8±0,4)x106 (3±1,2) x 105 (5±1,1) x 105 (2,3±0,5)x105
Pb 4 (2,5±1,1)x106 (5,5±1,2)x105 (3,2±1,5)x105 (1,1±0,3)x105
Pb 5 (6±1,2) x 105 (1,6±0,8)x105 (8,4±2,1)x104 (3,2±0,9)x104
Pb 6 ( 3±0,8) x 106 (3±1,1) x 105 (1,9±0,5)x105 (1,4±0,5)x105
Pb 7 (4,3±1,1)x106 (2,8±0,8)x105 (2,1±0,7)x105 (1,5±0,6)x105
Pb 8 (2,8±0,8)x106 (1,6±0,9)x105 (1,8±0,3)x105 (2±0,8)x 105
Se poate observa că, față de etapa I, s-a obținut o viabilitate mai bună a
bacteriilor Lactococcus lactis, numărul lor nu a mai scăzut sub 104cfu/ml pentru nici
una dintre variantele experimentale propuse iar pentru câteva dintre variante
experimentale s-a obținut o viabilitate de 105 cfu/ml. Variația numărului de drojdii
Saccharomyces cerevisiae a fost similară cu cea din etapa I pentru cele mai multe dintre
variantele experimentale, cu excepția probelor 3 şi 7 unde s-a folosit cea mai mică
cantitate de suspensie de drojdie de bere pentru inoculare.
Din analiza rezultatelor obținute pentru cele două tipuri de microorganisme
urmărite se observă că un raport optim ȋntre numărul de celule viabile lactococi: drojdii
de bere, pe ȋntreaga durată a perioadei de depozitare se obține la proba 3 realizată prin
XX
termostatare aerobă. Datele pentru proba 3 au fost analizate statistic folosind testul de
comparare multiplă Bonferroni şi s-a obținut că nu există diferențe semnificative (ns)
ȋntre numărul de lactococi (p=0,9523>0,05) pe durata depozitării şi numărul de drojdii
(p=0,8280>0,05) pentru această perioadă. Deci proba poate fi considerată optimă
deoarece nici scăderea numărului de bacterii lactice şi nici creşterea numărului de drojdii
de bere nu este semnificativă.
b. Drojdii Saccharomyces cerevisiae cultivate pe mediul de cultură selectiv WLN
Tabelul 8 Table 8
Variația numărului de drojdii Saccharomyces cerevisiae pe timpul perioadei de conservare –etapa II
Variation of yeast’s count(Saccharomyces cerevisiae) during shelf life- second
stage
Probă(sample)
Perioada(period)
1 zi(day), cfu/ml
7 zile(days), cfu/ml
14 zile(days), cfu/ml
21 zile(days), cfu/ml
Pb 1 (4,5±1,2)x104 (1,2±0,9)x105 (8±0,9) x 105 (2±0,6) x 106
Pb 2 (5,8±1,1)x104 (1,2±0,8)x105 (7,8±1,3)x105 (1± 0,8)x 106 Pb 3 (5±1,5) x 104 (8±1,4) x 104 (4,5±0,7)x105 (9,5±1,8)x105 Pb 4 Absent, proba fără drojdie Saccharomyces cerevisiae
Pb 5 (5,2±0,9)x104 (1,2±0,5)x105 (7,8±1,5)x105 (1,9±0,6)x106 Pb 6 (3,4±0,9)x104 (2,6±1,1)x105 (4,2±0,8)x105 (6±0,7)x 106 Pb 7 (3,8±1,1)x104 (9,7±1,9)x104 (3±0,5) x 105 (4,5±0,9)x105 Pb 8 Absent, proba fără drojdie Saccharomyces cerevisiae
Ȋn cazul variantei de inoculare optime, numărul de bacterii Lactococcus lactis a scăzut ȋn
primele şapte zile de depozitare de la 106 cfu/ml la 105 cfu/ml iar apoi s-a menținut
constant la acest nivel până la sfârşitul perioadei. Numărul de drojdii Saccharomyces
cerevisiae s-a menținut la nivelul de 104 cfu/ml ȋn primele şapte zile de depozitare după
care a crescut la 105 cfu/ml ȋn ziua a 14-a şi s-a menținut la acest nivel până la sfârşitul
studiului.
XXI
Fig. 6 Dinamica de dezvoltare a populației de bacterii şi drojdii pentru proba optimizată Fig.6 Development dynamics of bacteria and yeasts’s population for optimized sample
I.2.3 Monitorizarea procesului biotehnologic ȋn bioreactor
Ȋn urma analizei parametrilor ȋnregistrați de sistemul de achiziție a datelor de proces,
s-au considerat semnificativi următorii parametri: timpul, pH-ul şi concentrația
oxigenului dizolvat ȋn lapte. Valorile acestor parametri au fost ȋnregistrați ȋn tabelul 9.
Datele au fost analizat statistic, urmărind valoarea t, şi s-au obținut diferențe foarte
semnificative(***) p<0,0001 pentru aceste variații (t=15,5; t=18,9).
Tabelul 9 Table 9
Variația parametrilor de proces ȋn bioreactor Process parametrs variation in biofermentor
Timp, h Time,h
pH pH
Indice de saturație a
oxigenului,% Oxygen
saturation,%
0 6,44 28 2 6,31 6,83 4 5,96 0,535 6 5,5 0,469 8 4,96 0,469
10 4,58 0,535 12 4,56 1,27 14 4,58 1,47 16 4,56 1,54 18 4,54 1,54 20 4,52 1,54 22 4,51 1,54 24 4,49 1,47
XXII
Se poate observa că plecând de la pH-ul laptelui inițial de 6,44, după 12h de la
ȋnsămânțarea acestuia cu inocul, valoarea de pH devine 4,56, ceea ce ȋnseamnă o scădere
cu 0,156/oră. După următoarele 12 ore pH-ul devine 4,49 iar scăderea este de 0,0058/oră.
Fig.7 Curba de acidificare la 30°C Fig. 7 Acidification curve at 30°C
Ȋn primele 12h de la ȋnsămânțarea cu inoculul pH-ul a avut o scădere abruptă de
aproape 2 unități de pH, perioadă care coincide cu existența numărului maxim de
lactococi ȋn probă de 108 cfu/ml. Ȋn următoarele 12h scăderea de pH a fost mult mai lentă
probabil datorită scăderii numărului de lactococi până la 106 cfu/ml. Această variație a
pH-ului este caracteristică produselor tip chefir. Valoarea pH-ului după 24h de
fermentație a fost de 4,49 şi poate fi un motiv al scăderii uşoare a numărului de drojdii
Saccharomyces cerevisiae.
Ȋn ceea ce priveşte concentrația oxigenului dizolvat ȋn lapte, aceasta scade ȋn
proporție de 63,57% după prima oră de la ȋnsămânțare. După ȋncă o oră concentrația
oxigenului dizolvat scade cu 87,96% iar după a patra oră s-a consumat 90,58% din
cantitatea de oxigen aflată inițial ȋn laptele materie primă.
Fig. 8 Variația consumului de oxigen
Fig.8 Oxygen’s consumption variation
XXIII
Aşa cum se poate observa şi din schema tehnologică de obținere a produsului tip
chefir (fig.1), procesul biotehnologic poate fi ȋmpărțit ȋn două etape: fermentarea
propriu-zisă la 30°C, timp de 12h şi postfermentarea la 4-6°C, timp de 10-12h. Urmărind
şi variația parametrilor de proces: pH-ul şi concentrația oxigenului dizolvat, s-a
considerat că este necesar să se analizeze produsul obținut ȋn bioreactor atât din punct de
vedere microbiologic cât şi chimic. Rezultatele analizei microbiologice sunt centralizate
ȋn tabelul 10 iar cele care evidențiează valorile parametrilor chimici vor fi prezentați ȋn
capitolul 3. Ȋn ceea ce priveşte influența oxigenului dizolvat ȋn lapte asupra procesului
fermentativ, trebuie specificat faptul că s-a folosit lapte dezaerat care are un conținut de
oxigen dizolvat foarte mic şi poate fi considerat un mediu semi-anaerob pentru
dezvoltarea microbiană. Conținutul de oxigen din mediul de fermentație este un factor
competitiv pentru cele două specii de microorganisme considerate principale ȋn acest
studiu: Lactococcus lactis şi Saccharomyces cerevisiae. Astfel lactococii sunt
microorganisme microaerofile şi este ştiut faptul că se poate controla cinetica acidificării
la fabricația produselor lactate cu ajutorul nivelului de oxigen dizolvat ȋn lapte. O
acidificare mai bună a laptelui se obține la o concentrație mică de oxigen ȋn lapte. Astfel
se poate explica scaderea pH-ului ȋn lapte chiar din prima jumătate de oră de la inoculare.
Acest mediu semi-anaerob asigură cea mai rapidă rată de acidificare a laptelui.
Pe de altă parte drojdiile Saccharomyces cerevisiae sunt microorganisme care se
adaptează condițiilor de mediu ȋn ceea ce priveşte concentrația de oxigen. Totuşi ȋn
condițiile unei concentrații de oxigen dizolvat foarte mică, celulele de drojdie vor folosi
oxigenul pentru menținerea viabilității.
Astfel, ȋn condițiile co-cultivării celor două specii microbiene, pe durata primelor
12h ale procesului fermentativ are loc o scădere drastică a nivelului oxigenului dizolvat
cu 90,58%, el fiind probabil consumat de către drojdii pentru păstrarea viabilității
celulare alături de glucoza rezultată ȋn urma scindării lactozei de către β-galactozidaza
bacteriilor lactice. Considerăm că ȋn aceste condiții de co-cultivare, drojdiile
Saccharomyces cerevisiae nu au prezentat un metabolism fermentativ. Lipsa unei
fermentații alcoolice este susținută de faptul că nu s-a ȋnregistrat nici o variație
XXIV
semnificativă a conținutului de dioxid de carbon la senzorul bioreactorului şi nici analiza
organoleptică a produsului final obținut nu a evidențiat prezența acestuia.
Tabelul 10 Table10
Dinamica de dezvoltare a populației de bacterii lactice şi a drojdiilor
Saccharomyces cerevisiae Development dynamics of lactic bacteria and yeasts’s population
Proba prelevată
după Sampling after
Lactococcus
lactis
cfu/ml
Saccharomyces
cerevisiae,
cfu/ml 12h de fermentație 1,2 x 108 9 x 106 24h de fermentație 4,6 x 106 3 x 105
Fig .9 Evoluția microflorei specifice din proba(bioreactor) Fig.9 Evolution of specific microflora(biofermentor)
Se poate observa că ȋn condițiile fermentării laptelui cu acest inocul ȋn bioreactor,
după 12h de la ȋnsămânțare numărul bacteriilor Lactococcus lactis a fost de 108 cfu/ml
iar după 24h de 106 cfu/ml. Numărul drojdiilor Saccharomyces cerevisiae a fost după
12h de 106 cfu/ml iar după 24h de 105 cfu/ml.
XXV
I.2.4 Selecția produsului pe baza analizei senzoriale a. Testul triunghi
Prin folosirea celor două seturi de variante experimentale, conform tabelelor 1 şi
2, s-a urmărit dacă degustătorii sesizează diferențe ȋntre probele ce conțin drojdie
Saccharomyces cerevisiae şi probele martor, care s-au obținut folosind numai culturile
starter de bacterii lactice şi drojdii de chefir. Dacă la primul set de variante experimentale
rezultatele au demonstrat că există diferențe semnificative ȋntre probele ce au conținut
drojdie de bere şi martor, la cel de-al doilea set de variante experimentale s-a demonstrat
că se obțin diferențe semnificative şi prin varierea cantității de suspensie de drojdie de
bere introdusă ȋn inocul.
b. Testul hedonic
Analiza statistică a valorii medii a punctajului obținut de probele din cele două
seturi experimentale, utilizând testul postcalcul Bonferroni de comparare multiplă (two-
way ANOVA, Bonferroni posttests) a arătat existența unei diferențe distinct
semnificative (**) p<0,01 cu valoarea lui t=3,57 ȋntre proba martor şi cea cu drojdie de
bere (C+K+B, cod Z), corespunzător valorilor acceptabilității ȋn zilelea 14-a şi a 21-a.
Deci proba Z poate fi considerată ca fiind proba optimă din primul set de variante
experimentale. Pentru setul al doilea de probe, există diferențe distinct semnificative(**)
p<0,01 tot pentru partea a doua a perioadei de depozitare, ȋntre probele cu adaos de
drojdie (Pb 3, cod C) şi proba martor (Pb 4, cod D). De asemenea valoare lui t pentru
ziua a 14-a t=3,571(** p<0,01) şi ziua a 21-a, t=5,00 (** p<0,01) a arătat că există
diferențe semnificative ȋntre valorile acceptabilității probelor C şi Z. Ȋn concluzie a fost
aleasă probă optimă proba C.
Fig.10 Variația acceptabilității variantelor optime Fig. 10 Acceptability’s variation of optimum variants
XXVI
c. Testul punctajului- aplicat produsului cu varianta de inoculare optimă a
ȋnregistrat următoarele rezultate:
Tabelul 11 Table 11
Centralizator pentru testul punctajului Centralization table for score test
Ziua/Perioada de depozitare Day/ shelf life
�umărul de puncte acordate (Pi) 1umber of points (Pi)
Aspect şi consistenţă Appearance
and
consistence
Culoare Color
Gust Taste
Miros Odour
Aromă Flavour
1 zi(1 day) 50 50 47 50 48 7 zile(7 days) 50 50 46 50 48 14 zile(14days) 47 50 43 48 44 21 zile(21days) 45 50 42 47 42 Punctaj mediu Average score Pm
4,8 5,0 4,45 4,875 4,55
Punctaj mediu ponderat, Pmp
Weighted
Average score
4,8 2,5 6,67 2,43 2,27
Punctaj mediu total, Pt(Total
average score)
18,67
Din analiza acestor rezultate se poate observa că parametrul organoleptic care a
primit punctajul cel mai mare pe ȋntreaga perioadă de depozitare a fost culoarea; acest
parametru a fost punctat cu punctaj maxim (5), ceea ce ȋnseamnă că nu s-au ȋnregistrat
modificări de culoare. Mirosul, aspectul şi consistența au fost punctate cu un punctaj
mediu de 4,8, scăderi la nivelul punctajului ȋnregistrându-se ȋn cea de-a doua jumătate a
perioadei de depozitare când s-au identificat câteva abateri minime de la proprietățile
specifice: respectiv un uşor miros de drojdii şi o slabă eliminare de zer. Aroma şi gustul
produsului au ȋnregistrat punctaje mai mici ȋncepând cu ziua a 7-a de depozitare, când
produsul s-a caracterizat printr-un uşor gust de drojdii şi o aromă mai slabă.
XXVII
Evaluarea nivelului calitativ al produsului s-a realizat folosind punctajul mediu
total (Pt), calculat pe baza punctajelor medii ponderate (Pmp). Valoarea de 18,6 situează
produsul ȋn categoria “foarte bun”, conform SR 6345-95, şi poate fi caracterizat astfel:
“produsul are ȋnsuşiri organoleptice pozitive, specifice, bine conturate; nu prezintă nici
un fel de defecte perceptibile”.
Fig.11 Variația punctajelor medii pe durata perioadei de depozitare Fig.11 Scores’ variation for sensory characteristics during shelf life
d.Testul profilului de aromă a fost aplicat produsului finit şi s-au obținut
rezultatele:
Tabelul 12 Table12
Centralizator pentru testul profilului de aromă Centralization table for sensory profiling test
Miros Odor
Punctaj(score) Gust Taste
Punctaj (score) 1 zi day
7 zile days
14 zile days
21 zile days
1 zi day
7 zile days
14 zile days
21 zile days
Acru Sour
10 10 14 16 Dulce Sweet
8 10 6 4
Fructe Fruity
0 2 2 1 Acru Sour
14 14 18 16
Unt Buttery
0 2 2 2 Ințepător Sharp
0 0 0 0
Alcool Alcoholic
0 0 0 0 Fructe Fruity
0 0 0 0
Drojdie Yeasty
3 4 4 6 Drojdie Yeasty
5 6 6 8
XXVIII
A. B.
Fig.12 Profilul mirosului(A) şi al gustului(B) Fig. 12 Odour(A) and taste’s(B) profiles
Degustătorii au notat cu cel mai mare punctaj mirosul de acru, care a ȋnregistrat o
uşoară creştere pe durata perioadei de depozitare, dar a fost cotat cu gradul de intensitate
“moderat”. A doua caracteristică identificată şi punctată de degustători a fost mirosul de
drojdie, care a crescut pe durata depozitării fără ȋnsă a cauza un miros dezagreabil.
Gradul de intensitate al mirosului de drojdie a fost considerat ”slab”. Mirosul de fructe şi
de unt au fost cotate cu gradul de intensitate “abia sesizabil”. Nu a fost identificat miros
de alcool de către nici un degustător. Ȋn ceea ce priveşte gustul produsului, cu punctajul
cel mai mare a fost notat gustul acru care a crescut ȋn ziua a 14-a dar a scăzut uşor ȋn ziua
a 21-a. Gustul dulce a ȋnregistrat o creştere ȋn ziua a 7-a dar a scăzut ȋn a doua jumatate a
perioadei analizate. Gustul de drojdie a crescut uşor pe durata perioadei de depozitare,
fară ȋnsă a depăşi gradul de intensitate “moderat”. Trebuie să menționăm că nici ȋn ziua a
21-a, gustul de drojdie nu a fost identificat de către toți degustătorii, ceea ce este ȋn
legătură cu pragul de sensibilitate şi probabil cu antrenamentul degustătorilor ȋn a sesiza
diferite intensități ale gusturilor. Nici unul dintre degustători nu a identificat gustul
ȋnțepător şi gustul de fructe.
XXIX
II.CARACTERIZAREA MICROBIOLOGICA A PRODUSULUI LACTAT FU�CŢIO�AL CE VALORIFICĂ POTE�ŢIALUL BIOACTIV AL
DROJDIEI SACCHAROMYCES
II.1 MATERIALE ŞI METODE
Materialele şi metodele utilizate pentru determinarea numărului de bacterii
Lactococcus lactis şi a drojdiilor Saccharomyces cerevisiae prin numărarea coloniilor
după inoculare ȋn plăci cu medii selective au fost conform SR EN ISO 4833 şi SR ISO
7954.
Pentru identificarea microorganismelor patogene şi de alterare din microflora de
contaminare s-au utilizat tehnicile descrise de următoarele standarde:
Tabelul 13 Table 13
Metodologia utilizată ȋn analiza germenilor patogeni Methodology used for pathogenetic germs’ analysis
�r. crt
Indicatori microbiologici
Mycrobiological
indicators
Metoda de analiză conform
Analysis methods
1
Bacterii coliforme SR ISO5541/1-94 SR ISO5541/2-94
2 Escherichia coli SR ISO 7251/1996 3 Salmonella ssp. SR ISO 6579/2003 4 Listeria monocytogenes SR ISO
11290/1/2/2000 5 Staphylococcus sp.
(coagulazo-pozitivi) SRISO 6888/1/2/2002
6 Mucegaiuri SR ISO 7954/2001
II.2 REZULTATE ŞI DISCUŢII
Pentru evidențierea dinamicii de dezvoltare a bacteriilor Lactococcus lactis şi a
drojdiilor Saccharomyces cerevisiae studiul s-a realizat pe perioada de păstrare a
produsului la 4-6°C. Rezultatele obținute sunt prezentate ȋn tabelele 14 şi 15.
XXX
Tabelul 14 Table14
Variația numărului de bacterii Lactococcus pe timpul perioadei de conservare ȋn
produsul finit Variation of lactic bacteria’s count during shelf life in the end product
Perioada Period
Chefir cu adaos de drojdie de bere Kefir with brewers’ yeast in
composition
Chefir (probă martor) Kefir control sample
24 h(24h) 3 x 106 2,5 x 106 7 zile(7 days) 4,2 x 106 6 x 105
14 zile(14 days) 15 x 105 5 x 105 21 zile(21 days) 11 x 105 8 x 104
Tabelul 15 Table 15
Variația numărului de drojdii Saccharomyces cerevisiae pe timpul perioadei de
conservare ȋn produsul finit Variation of brewers’ yeasts count during shelf life in the end product
Perioada Period
Chefir cu adaos de drojdie de bere Kefir with brewers’ yeast in composition
24 h(24h) 3,5 x 104
7 zile(7 days) 6 x 105 14 zile(14 days) 5 x 105 21 zile(21 days) 2,7 x 105
Fig.13 Dinamica de dezvoltare a populației de bacterii şi drojdii ȋn produsul finit Fig. 13 Development dynamics of bacteria and yeasts’s population for the end product
XXXI
Tabelul 16 Table 16
Evoluția microflorei de contaminare ȋn perioada de păstrare
Contamination microflora’s evolution during shelf-life
�r. crt
Indicatori microbiologici Microbiological indicators
Perioada, zile Period, days
1 7 14 21 1 Bacterii coliforme/ml absent absent absent absent 2 Escherichia coli/ml absent absent absent absent 3 Salmonella sp./25 g absent absent absent absent 4 Listeria monocytogenes/25 g absent absent absent absent 5 Staphylococcus sp.
coagulazo-pozitivi/ml absent absent absent absent
6 Mucegaiuri/ml absent absent absent absent
Din analiza acestor rezultate se poate observa că numărul de lactococi s-a menținut
la un nivel de 106 cfu/ml ȋn primele 7 zile de depozitare la 4-6°C, scăzând ulterior la 105
cfu/ml ȋn a 14-a zi, menținându-se la acest nivel şi-n ziua a 21-a. Urmărind comparativ
evoluția cu cea din proba martor, se poate observa că ȋn cazul acesteia din urmă, ȋn ziua a
7-a numărul de lactococi a fost 105 cfu/ml şi s-a menținut până-n ziua a-14-a dar ȋn
ultima zi a perioadei de depozitare a scăzut la 104 cfu/ml. Se poate considera că față de
un produs fără adaos de drojdie de bere, s-a obținut o viabilitate mai bună a bacteriilor
Lactococcus lactis. Numărul drojdiilor Saccharomyces cerevisiae a fost după 24h de 104
cfu/ml iar după 7 zile de 105 cfu/ml, menținându-se la acest nivel până la sfârşitul
perioadei de depozitare. Dinamică comparativă arată că ambele specii de
microorganisme şi-au păstrat viabilitatea pe toată durata perioadei de depozitare fără să
coboare sub nivelul de 105 cfu/ml. Numărul de bacterii Lactococcus lactis s-a menținut
relativ constant ȋn primele 7 zile dar apoi a scăzut până la sfârşitul perioadei. Numărul de
drojdii a avut o evoluție ascendentă ȋn primele şapte zile după care s-a menținut aproape
constant pe restul perioadei studiate.
Toți indicatorii microbiologici urmăriți au fost absenți pe ȋntreaga durată de
depozitare a produsului. Aceste rezultate confirmă că produsul tip chefir obținut are o
inocuitate microbiologică ridicată, fapt datorat respectării stricte a cerințelor de igienă .
XXXII
III.CARACTERIZAREA U�OR COMPUŞI BIOACTIVI CE DAU FU�CŢO�ALITATE PRODUSULUI
III.1 MATERIALE ŞI METODE
III.1.1 Metode enzimatice cu detecție UV
S-au utilizat următoarele kituri Boehringer Mannheim/ R-Biopharm (Enzymatic
BioAnalysi/Food Analysis): Kit D-acid lactic/ L-acid lactic, Kit Etanol, Kit Lactoză/ D-
glucoză. Ȋn toate cele trei determinări s-au folosit metode de detecție UV care se bazează
pe măsurarea creşterii sau descreşterii absorbanței coenzimei NADH/ NADPH la 340
nm. Citirea s-a efectuat la Spectrofotometrul tip Multi-Detection Microplate Reader
SynergyTM HT livrat de firma BioTek Instruments, Inc. USA. Supervizarea, controlul şi
achiziția datelor este permisă de prezența softului Gen 5.
III.1.2 Metoda reflectometrică
Metoda măsoară acidul lactic total, ca sumă a acidului L-lactic şi D-lactic.
Domeniul de măsurare este 1,0-60,0 mg/l acid lactic şi se bazează pe spectroscopia de
reflexie. Aparatul folosit RQflex este face parte din sistemul REFLECTOQUANT
(Merck), care utilizează stripuri ce absorb proba şi aduc informația moleculară.
III.1.3 Spectroscopia ȋn infraroşu (IR)
Inregistrarea spectrelor de absorbție ȋn infraroşu s-a făcut direct prin utilizarea
spectofotometrului Shimadzu IR Prestige-21 cu accesoriu HATR (Horizontal Attenuated
Total Reflectance) . Spectrele au fost ȋnregistrate pe domeniul de lungimi de undă 650-
4000 cm -1 şi s-au identificat benzile de absorbție caracteristice tipului de legături şi
grupărilor functionale specifice compuşilor chimici analizați (exprimate ȋn cm-1).
III.1.4 Cromatografia lichidă de ȋnaltă performanță(HPLC)
S-a folosit cromatografia lichidă de ȋnaltă performanță cuplată cu un detector PDA
(HPLC Szimadsu–PDA Photo Diode Array). Detecția PDA a fost monitorizată la 260nm.
Pentru separarea vitaminelor s-a utilizat o coloană tip Restek Ultra Aqueous C18 column
(250×4,6 mm, 5 µm) şi s-a lucrat la temperatura ambiantă. Faza mobilă a fost formată din
0,05 M CH3COONH4/ CH3OH (99/1) (A) şi H2O/ CH3OH (50/50) (B) la o viteza de
curgere de 0,8 mL/min.
XXXIII
S-a folosit un program de lucru gradient conform tabelului de mai jos:
Tabelul 17 Table17
Program de lucru gradient la HPLC HPLC’s gradient protocol
Timp/min Time / min
%A %A
%B %B
0-3 99 1 4-18 0 100
19-25 0 100 26-30 99 1 31-43 99 1 43.01 STOP
III.2 REZULTATE ŞI DISCUŢII
III.2.1 Metode enzimatice cu detecție UV
Au fost analizate şase probe prelevate din produsul obținut ȋn bioreactor şi ȋn stația pilot.
Tabelul 18 Table18
Modificări ale compuşilor chimici ȋn diferite probe Changes of chemical compounds in different samples
Probe prelevate din bioreactor Samples from biofermentor
Probă Sample
Acid L lactic L lactic acid
Acid D lactic D-lactic acid
Lactoză Lactose
Glucoză Glucose
Etanol Ethanol
Pb 1(12h) 0,318±0,04 n.d. 4,36±0,22 n.d. 0,005±0,002 Pb 2(24h) 0,588±0,05 n.d. 3,9±0,16 n.d. 0,01±0,001 Probe prelevate pe durata păstrării Samples durinf shelf-life
Pb 3( 1zi) 0,6±0,02 n.d. 3,75±0,18 n.d. 0,008±0,004 Pb 4(7 zile) 0,576±0,032 n.d. 2,15±0,14 n.d. 0,018±0,006 Pb 5(14 zile) 0,54±0,01 n.d. 1,9±0,09 n.d. 0,025±0,005 Pb 6(21 zile) 0,458±0,01 n.d. 1,4±0,1 n.d. 0,032±0,002 Lapte n.a n.a 4,72±0,38 n.a n.a
*rezultatele reprezintă media aritmetică a două determinări şi sunt exprimate ȋn g/100g
Abreviere:*n.d.-nu s-a putut determina, * n.a-nu s-a analizat
Abreviation: *n.d- not detectable, *n.a- not analised
Din rezultatele prezentate mai sus se poate observa că lactoza prezentă ȋn laptele
materie primă a fost consumată pe parcursul procesului fermentativ de către bacteriile
lactice inoculate astfel:
XXXIV
• ȋn bioreactor după 12h de fermentație s-a consumat 7,62% din lactoză iar după 24h
de fermentație 17,37 % din cantitatea inițială de lactoză
• la scară pilot după 24 h de fermentație s-a consumat 20,55% din cantitatea inițială de
lactoză
Pe perioada de depozitare a produsului la 4-6°C, cantitatea de lactoză a continuat să
scadă. Astfel, ȋn primele şapte zile de depozitare conținutul de lactoză a scăzut cu 42,66%
față de prima zi de depozitare, apoi a avut loc o scădere cu 11,62% ȋn a doua săptămână
de depozitare față de ziua a 7-a şi 26,3% ȋn ultima săptămână de depozitare față de ziua a
14-a. Cu această evoluție, conținutul de lactoză din produsul finit la sfârşitul perioadei de
depozitare a ȋnregistrat o valoare mai scăzută decât datele prezentate ȋn literatură pentru
alte tipuri de chefir.
Datele au fost analizate statistic folosind testul postcalcul Bonfferoni de
comparare multiplă (two- way ANOVA- Bonfferoni posttests) rezultând că variabiliatea
datelor este distinct semnificativă(**) cu valoarea p=0,0028(p<0,01). De asemenea a fost
analizată variația conținutului de lactoză pe durata fermentației şi pe durata perioadei de
depozitare. Rezultatele arată că variația conținutului de lactoză este foarte semnificativă
(*** p<0,001) pe durata primelor 24h de fermentație şi pe durata perioadei de depozitare
dar este distinct semnificativă (** p<0,01) ȋn zilele a 14-a şi a 21-a de depozitare.
Continut de lactozaLactose's content
0
1
2
3
4
5
Pb 3 Pb 4 Pb 5 Pb 6lapteprobesamples
lacto
za(lactose),
g/1
00g
Fig.14 Valoarea medie a conținutului de lactoză Fig. 14 Average value of lactose’s content
Această evoluție a conținutului de lactoză este cu siguranță ȋn legătură cu faptul că ȋn
nici una dintre probă nu a fost detectată glucoza. Astfel, monozaharidele formate prin
hidroliza enzimatică a lactozei de către β-galactozidaza eliberată de bacteriile lactice, au
XXXV
fost imediat metabolizate de către celelalte specii microbiene prezente ȋn produs, cu
precădere de către drojdiile Saccharomyces cerevisiae, care le-au utilizat ca nutrienți
pentru a asigura viabilitatea celulară până la un nivel de 105 cfu/ml mai ridicat decât
numărul de drojdii prezente ȋn suspensia folosită la ȋnsămânțarea laptelui, aşa cum a fost
prezentat ȋn capitolul II, subcapitolul II.2. O cantitate mai mică de glucoză a fost utilizată
de celelalte specii microbiene, bacterii Lactococcus lactis şi Leuconostoc mesenteroides
pentru producerea de metaboliți specifici.
Prin urmare, datorită scăderii mai accentuate a conținutului de lactoză din produs
pe perioada depozitării şi a lipsei glucozei putem considera că această caracteristică se
datorează prezenței ȋn inocul a drojdiilor Saccharomyces cerevisiae.
Cantitatea maximă de acid lactic s-a format după primele 24h de fermentație,
ȋnregistrându-se valori apropiate pentru procesul fermentativ din bioreactor şi cel din
stația pilot. Aceste valori corespund acidului L lactic iar acid D lactic nu s-a detectat ȋn
nici o probă din cele analizate. Lipsa acidului D lactic se datorează faptului că ȋn inoculul
destinat ȋnsămânțării laptelui singura specie microbiană ce ar fi putut produce acest
izomer a fost Leuconostoc mesenteroides care probabil s-a aflat ȋntr-o proporție mică
chiar şi-n cultura starter ȋn comparație cu celelalte specii de bacterii lactice.
La nivelul procesului fermentativ din bioreactor după primele 12h de fermentație s-a
format 54% din cantitatea maximă de acid lactic acumulată ȋn produs. Pe durata
perioadei de depozitare s-a ȋnregistrat o scădere a cantității de acid lactic cu 23,67%.
Dacă comparăm această modificare a conținutului ȋn acid lactic ȋn produs cu
variația pH-ului, putem observa că maximul de acid lactic, obținut după 24 h de
fermentație, corespunde valorii de pH =4,31 ȋnregistrate după aceeaşi perioadă de timp,
care a fost valoarea cea mai scăzută. De asemenea pe durata perioadei de depozitare a
produsului valoarea pH-ului creşte uşor ȋn timp ce conținutul de acid lactic scade. Este
posibil ca această variație să se datoreze tot drojdiilor Saccharomyces cerevisiae care ȋn
anumite condiții pot consuma acidul lactic.
Valorile obținute pentru acidul L lactic prin metoda enzimatică au fost analizate statistic
utilizând testul postcalcul Bonfferoni de comparare multiplă (two-way ANOVA-
Bonfferoni posttests). Ȋn urma acestei analize putem spune că ȋn primele 7 zile de
depozitare variația conținutului de acid lactic este nesemnificativă (n.s.), p>0,05 dar
XXXVI
devine distinct semnificativă (**) p<0,01 după 14 zile de depozitare şi foarte
semnificativă (***) p<0,001 ȋn ziua a 21-a de depozitare față de prima zi. De asemenea
este doar semnificativă (*) p<0,05, variația conținutului de acid lactic ȋntre zilele a 7-a şi
a -14-a.
Continut acid L lacticL lactic acid's content
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Pb 3 Pb 4 Pb 5 Pb 6probesamples
acid
L l
acti
c(L lactic acid),
g/1
00g
Continut etanolEthanol's content
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
Pb 3 Pb 4 Pb 5 Pb 6probesamples
eta
no
l(ethanol)
,g/1
00g
Fig. 15 Valoarea medie a conținutului de acid lactic şi etanol Fig.15 Average value of lactic acid’s and ethanol’s content
Ȋn ceea ce priveşte cantitățile de etanol determinate, valorile sunt scăzute dar se
ȋncadrează ȋn cele prezentate de literatura de specialitate pentru diverse tipuri de chefir.
După primele 24 h de fermentație etanolul s-a situat la nivelul de aproximativ 0,01% iar
apoi pe durata perioadei de depozitare a ȋnregistrat o uşoară creştere până la 0,032%.
Deci pe durata depozitării produsului la 4-6 °C, sub acțiunea metabolismului
microorganismelor prezente se formează cea mai mare parte din cantitatea de etanol.
Valorile obținute pentru etanol prin metoda enzimatică au fost analizate statistic
utilizând post-testul Bonfferoni de comparare multiplă (two-way ANOVA- Bonfferoni
posttests). Rezultatele indică creşterea conținutului de etanol pe perioada depozitării
produsului ca fiind semnificativă(*) p<0,05 pentru zilele a 7-a şi a 14-a şi devine distinct
semnificativă(**) p<0,01 pentru ziua a 21-a față de prima zi.
XXXVII
II.2.2 Metoda reflectometrică Tabelul 19
Table 19
Conținutul de acid lactic determinat cu reflectometrul Lactic acid’s content by reflectometrical determination
Proba Sample
Acid lactic,g/l Lactic acid, g/l
Pb 1(12h- bioreactor) Sample1(12h-biofermentor)
3,5± 0,01
Pb 2(24h- bioreactor) Sample2(24h-biofermentor)
5,9 ± 0,01
Pb 3( 24h- pilot) Sample3(24h-pilot plant)
6,25 ± 0,02
Pb 4(7 zile-pilot) Sample4(7 days-pilot plant)
5,875± 0,015
Pb 5(14 zile-pilot) Sample5(14days-pilot plant)
5,665± 0,02
Pb 6(21 zile-pilot) Sample6(21days-pilot plant)
5,125 ± 0,01
Valorile conținutului de acid lactic determinat prin metodă reflectometrică sunt ȋn general
mai mari decât cele determinate prin metoda enzimatică, dar diferențele sunt mici.
Diferența apare de la faptul că metoda reflectometrică determină conținutul total de acid
lactic (acid D, L lactic) iar prin metoda enzimatică s-a putut determina doar conținutul
de acid L lactic.
Fig. 16 Conținutul de acid lactic determinat prin cele două metode
Fig.16 Lactic acid’s content by the two methods
XXXVIII
Pentru a compara aceste valori cu cele obținute prin metoda enzimatică, s-a folosit
analiza statistică, testul t de comparare a perechilor de date (one-way ANOVA t paired
test). Astfel s-a comparat valoarea medie a celor două grupe perechi pentru a se vedea
dacă ditribuția diferențelor urmează o distribuție gaussiană.
0
2
4
6
8
reflectometricareflectometrycal
metodamethod
enzimaticaenzymatic
acid
lacti
c(lactic acid),
g/l
Fig.17 Valoarea medie a conținutului de acid lactic determinat prin cele două metode
Fig.17 Average value of lactic acid’s content determinated by the two methods
Putem să considerăm că ȋntre cele două şiruri de valori există o corelație directă,
creşterea sau descreşterea conținutului de acid lactic ȋntr-un sens este valabilă pentru
ambele metode de determinare. Prin urmare rezultatele obținute prin metodă
reflectometrică se corelează cu cele obținute prin metoda enzimatică.
0
2
4
6
8
enzimaticaenzymatic
reflectometricareflectometrycal
metodamethod
g/l
acid
lacti
c
Fig. 18 Corelarea metodelor enzimatică şi reflectometrică de determinare a acidului lactic
Fig.18 Correlation between enzymatic and reflectometrical methods for lactic acid’s
determination
XXXIX
III.2.3 Caracterizarea compuşilor bioactivi cu ajutorul spectroscopiei IR Pentru interpretarea spectrelor FTIR obținute a fost necesară identificarea lungimilor de
undă specifice compuşilor de interes.
Tabelul 20 Table20
Frecvențe caracteristicile spectrelor IR microbiene Characteristic frequencys for microbial IR spectra
Zona de frecvențe, cm-1
Frequency zones,cm-1
Frecvente caracteristice,cm-1
Characteristic frequencys,
cm-1
Atribuire Assignment
Zona A 600-900
Zona de fingerprint
690 745
Aminoacizi aromatici: fenilalanină, tirozină, triptofan nucleotide
Zona B 900-1200
1010 1150
Grupări fosfat din acizii nucleici, PO2
- Oligo si poliglucide C-O-C, C-O-P
Zona B 1200-1300
1220 1230
Fosfolipide Fosfodiesteri, monoesterifosfati, P=O
Zona C 1300-1500
1310 1414
Amide III Proteine,lipide Grupări carboxil ale esterilor
Zona D 1500-1800
1637, 1655 1548 1740 1715
Amide I, Amide II Grupare tip esteri din lipide Structuri heterociclice din acizi nucleici
Zona E 2800-3100
2921,2934,2959 Acizi graşi
* Adaptat după Haumann et al.,2000
Aşa cum se poate observa din tabelul 20, aceste frecvențe sunt utile pentru a
caracteriza unii compuşi bioactivi din produsul tip chefir cum ar fi: acidul lactic,
oligoglucidele, glucidele fosforilate, fosfații, esterii, aromele, acizii graşi şi dioxidul de
carbon.
XL
Pentru caracterizarea spectrelor microbiene s-a urmărit ȋn special zona amprentei
specifice (fingerprint region) şi astfel s-au identificat : aminoacizii, acizii nucleici,
poliglucidele, peptidele, proteinele, fosfolipidele, esterii şi acizii graşi.
Tabelul 21
Table 21
Frecvențe caracteristice spectrelor IR ale produselor lactate Characteristic frequencys for dairy products’IR spectra
*Adaptat după Sakhamuri et al.,2004
Atât spectrele cât şi reprezentarea grafică a frecvențelor caracteristice s-a realizat cu
ajutorul softului Origin MFC Aplication Microcal Software Inc. Spectrele FTIR ale
speciilor microbiene, cuprinzând frecvențele caracteristice compuşilor chimici de interes,
sunt prezentate ȋn figurile 19, 20, 21. De asemenea pentru o mai bună interpretare a
acestora am considerat necesară prezentarea comparativă a acestora ȋn figura 22.
Zona de frecvențe, cm-1
Frequency zones, cm-1
Frecvente caracteristice,cm-1
Characteristic
frequencys, cm-1
Atribuire Assignment
Zona A < 1000
976 964 961
Fosfați (P=O) Compuşi cu legături duble conjugate: acizi graşi polinesaturați, carotenoide
Zona B 1000-1100
1035 1065 1079
glucoza Oligo şi polizaharide Acizi organici alcooli
Zona C
1100-1300
1120 1240
Glucide fosforilate Amine secundare
Zona D 1500-1700
1566, 1574 1650, 1662 1655
Acid lactic Proteine, peptide Amide I,II
Zona E 1700-1750
1715 1741
Esteri (C=O) Arome
Zona F 2272-2403
CO2
Zona G >2800
2854 2920 2934
Acizi graşi Colesterol Pigmenți carotenoidici (lanțuri polienice)
XLI
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
drojdiebere
Ab
sorb
anta
Absorbance
Lungimea de unda, cm-1
wavenumber,cm-1
proteine, peptide
poliglucide
nucleotide, acizi nucleiciaminoacizi
fosfolipide
esteri
zona de fingerprint
Fig.19 Spectrul FTIR al drojdiei Saccharomyces cerevisiae
Fig.19 FTIR spectrum of Saccharomyces cerevisiae yeast
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
cultura lactica
Absorb
anta
Absorbance
lungimea de unda, cm-1
wavenumber,cm-1
aminoacizi
acizi nucleici
poliglucide
proteine
esteri
zona de finger print
Fig.20 Spectrul FTIR al culturii lactice mezofile Fig.20 FTIR spectrum of mesophilic lactic culture
XLII
Din analiza acestor spectre se poate observa existența zonei amprentei specifice
(fingerprint zone) ȋn care se disting o multitudine de peak-uri, unele mai evidente, altele
mai slab evidențiate, dar care sunt extrem de caracteristice speciei microbiene respective.
Zona de frecvențe cuprinsă ȋntre 3100-4000 cm-1 este dominată de caracteristicile
spectrale ale grupării –OH cu un vârf caracteristic la 3400 cm-1 (Naumann et al.,2000).
Ȋn cazul nostru este vorba de gruparea –OH din apă, deoarece toate speciile au fost
analizate sub formă de suspensii apoase. Astfel, putem observa că bacteriile lactice,
drojdia de bere Saccharomyces cerevisiae şi drojdia de chefir Debaryomyces hansenii
prezintă ȋn zona acestei amprente specifice compuşi chimici diferiți. Cultura lactică
mezofilă, unde predomină speciile bacteriene Lactococcus lactis, este caracterizată de
prezența ȋn zona amprentei specifice a aminoacizilor, acizilor nucleici, poliglucidelor,
proteinelor şi esterilor. Drojdia Saccharomyces cerevisiae se distinge prin conținutul ȋn
aminoacizi, nucleotide, acizi nucleici, poliglucide, fosfolipide, peptide, proteine şi esteri.
Drojdia de chefir Debaryomyces hansenii prezintă compuşi specifici celulelor de drojdie,
mulți dintre ei existenți şi-n drojdia de bere. Astfel identificăm aminoacizi, acizi nucleici,
poliglucide, fosfolipide, proteine, esteri şi acizi graşi. Prezența acestor compuşi este ȋn
concordanța cu datele din literatura de specialitate, unii dintre ei fiind caracteristici
pereților şi membranelor celulare iar alții se gasesc ȋn celule sub formă de compuşi de
rezervă, ca de exemplu poliglucidul glicogen.
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500
-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
drojdie de kefir
Absorb
an
ta
Absorbance
lungimea de unda, cm-1
wavenumber,cm-1
aminoacizi
acizi nucleici
poliglucide
fosfolipide
lipide
proteine
esteri acizi grasi
zona de fingerprint
Fig. 21 Spectrul FTIR al drojdiei Debaryomyces hansenii
Fig.21 FTIR spectrum of Debaryomyces hansenii yeast
XLIII
Prezența calitativă a acestor compuşi este considerată un marker taxonomic iar
compoziția cantitativă depinde de condițiilele de cultivare a microorganismelor.
Folosind datele furnizate de această metodă analitică calitativă putem să subliniem
ȋncă o dată potențialul bioactiv al drojdiei de bere, Saccharomyces cerevisiae, care se
remarcă aşa cum putem observa din figura 19, prin conținutul său ȋn aminoacizi, acizi
nucleici, peptide şi proteine. Pentru acesți compuşi peak-urile prezente pe spectrul din
figura 19 sunt mult mai evidente decât ȋn cazul drojdiei de chefir sau a bacteriilor lactice.
Astfel putem să considerăm că prin viabilitatea lor ȋn produsul finit, celule de drojdie
Saccharomyces cerevisiae sporesc funcționalitatea produsului.
Dacă comparăm spectrele acestor specii microbiene cuprinzând frecvențele
caracteristice unor compuşi bioactivi specifici chefirului (figura 22) putem considera că
aportul cel mai ridicat ȋn aceşti compuşi este prezent ȋn bacteriile lactice. Remarcăm
prezența acidului lactic, a glucozei, acizilor graşi precum şi a esterilor şi aromelor. Cele
două specii de drojdii au spectre mai apropiate sub aspectul prezenței acestor compuşi dar
remarcăm că nivelul de fosfați din drojdia Saccharomyces cerevisiae este egal cu cel al
culturii lactice şi că nivelul glucozei din drojdia de bere este sub cel al drojdiei de chefir.
500 1000 1500 2000 2500 3000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
cukturalactica
drojdiekefir
drojdiedebere
Absorb
anta
Absorbance
lungimea de unda, cm-1
wavenumber,cm-1
fosfati
glucoza
acid lactic
esteri si arome
co2
acizi grasi
Fig.22 Reprezentarea comparativă a compuşilor bioactivi ȋn culturile microbiene Fig.22 Comparative representation of bioactive compounds in microbiological cultures
XLIV
Acelaşi studiu al prezenței compuşilor bioactivi, a fost realizat şi pentru laptele materie
primă respectiv pentru produsele finite obținute ȋn bioreactor şi-n stația pilot. Din figura
23 putem observa evoluția compuşilor bioactivi ȋn chefirul obținut ȋn bioreactor față de
lapte. Laptele are un aport mai ridicat ȋn fosfați, al căror nivel scade ȋn produsul fermentat
ca urmare a activității microbiene şi tot ca o dovadă a desfăşurării metabolismului
microbian este creşterea nivelului de glucide fosforilate ȋn produsul finit.
500 1000 1500 2000 2500 3000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
lapte
bioreactor
Absorb
anta
Absorbance
lungimea de unda, cm-1
wavenumber,cm-1
fosfati
lactoza
glucide fosforilate
acid lacticesteri
arome
co2
acizi grasi
Fig. 23Reprezentare comparativă a compuşilor bioactivi din lapte şi chefirul obținut ȋn bioreactor
Fig.23 Comparative representation of bioactive compounds in the milk and in the kefir
obtained in biofermentor
Față de laptele folosit ca materie primă putem observa formarea ȋn produsul tip
chefir a acidului lactic, esterilor, aromelor şi acizilor graşi, toți compuşi specifici acestei
categorii de produse lactate şi care-i dau funcționalitatea. Prezența acizilor graşi este ȋn
legătură cu formarea aromelor caracteristice.
Ȋn ceea ce priveşte nivelul de CO2, se poate observa că acesta este mai scăzut decât
ȋn lapte. Acest fenomen a fost identificat şi prin urmărirea acestui parametru ȋn
bioreactor, de aceea considerăm că la nivelul acestui proces biotehnologic nu are loc o
fermentație alcoolică produsă de drojdii, dioxidul de carbon fiind consumat probabil ȋn
anumite etape ale metabolismului microbian.
XLV
Pentru a caracteriza produsul pe toată durata perioadei de păstrare ȋn condiții de
refrigerare la 4-6°C, s-a realizat analiza comparativă a prezenței compuşilor bioactivi ȋn
zilele 1, 7, 14 şi 21, corespunzătoare acestei perioade (figura 24). Se poate observa că
produsul din prima zi are un nivel al compuşilor bioactivi similar cu cel obținut ȋn
bioreactor şi că pe durata zilelor a 7-a şi a 14-a nivelul lor creşte. Ȋn schimb pentru toți
produşii analizați se ȋnregistrează o scădere a nivelului ȋn ziua a 21-a.
500 1000 1500 2000 2500 3000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Absorb
an
ta
Absorbance
lungimea de unda, cm-1
wavenumber,cm-1
lapte
kefir1zi
kefir7zile
kefir14zile
kefir21zile
fosfati
lactoza
glucide fosforilate
acid lactic
esteri
arome
CO2
acizi grasi
Fig. 24 Reprezentare comparativă a compuşilor bioactivi din lapte şi chefir pe durata depozitării
Fig.24 Comparative representation of bioactive compounds in the milk and in the kefir
during shelf-life
Acest fenomen este probabil ȋn legătură cu acceptabilitatea produsului corespunzătoare
acestei zile de păstrare care, aşa cum s-a arătat ȋn subcapitolul I.2.4 când s-a realizat
analiza organoleptică, scade, iar unii dintre degustători au sesizat creşterea sau
descreşterea ȋn intensitate a unor arome.
XLVI
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1 zi 14 zile 21 zile
arome
esteri
acizi grasi
7 zile
perioada depozitareshelf-life
ab
so
rba
nta
,u.a
absorbance,u.a
Fig.25 Variația valorilor absorbanțelor specifice pe durata de depozitare Fig.25 Absorbances’ values variation during shelf-life
Se poate observa că față de prima zi de depozitare ȋn perioada următoare nivelul
de dioxid de carbon creşte, ceea ce este un indiciu al formării acestuia pe perioada de
păstrare a produsului ca urmare a activității metabolice a microorganismelor. Cantitatea
de dioxid de carbon formată nu a atins un nivel sesizabil de către degustători şi nici nu a
cauzat bombarea ambalajelor.
Ȋn concluzie, spectroscopia FTIR este o metodă foarte utilă pentru caracterizarea
unor compuşi chimici de interes. Rezultatele se obțin ȋntr-un timp relativ scurt, metoda
nu necesită etapă de prelucrare a probelor pentru analiză deci este mai economică.
III.2.4 Identificarea şi caracterizarea unor vitamine prin HPLC In acest studiu au fost analizată prezența ȋn produsul lactat funcțional a două vitamine:
acidul nicotinic(vitamina B3) şi acidul ascorbic(vitamina C). Despre acidul nicotinic se
ştie deja că este un component bioactiv prezent ȋn cantitate mare ȋn drojdia de bere.
Studiile recente arată ȋnsă că şi vitamina C poate fi produsă de către drojdiile
Saccharomyces cerevisiae ȋn anumite condiții de mediu (Hancock et al., 2000; Spickett et
al., 2000). Există numeroase discuții referitoare la capacitatea drojdiilor de a sintetiza
acidul L-ascorbic. Datorită metodelor analitice moderne, se ştie că drojdiile
Saccharomyces cerevisiae produc acidul D-eritroascorbic, un analog al acidului L-
XLVII
ascorbic dar cu aceleaşi proprietăți reducătoare şi care poate fi de asemenea oxidat de
către ascorbatoxidază. Prin urmare acidul D-eritroascorbic are aceleaşi proprietăți
antioxidante ȋn celula de drojdie ca şi omologul său din plante. Datorită faptului că
drojdiile Saccharomyces cerevisiae nu posedă abilitatea de a sintetiza acidul L-ascorbic
din D-aldoze, se pare că substratul acestei tranformări metabolice sunt L-galactono-1,4
lactonele, ipoteză demonstrată de izolarea a două L-galactono-1,4lactono- oxidaze din
mitocondriile drojdiei (Hancock et al., 2000). Pentru obținerea acidului ascorbic ȋn vivo,
drojdiile au nevoie de un mediu (substrat) care să conțină o sursă de carbon, ce poate fi
glucoza, galactoza, lactoza şi de o sursă de azot, de exemplu aminoacizii, purinele sau
pirimidinele. Se poate deci observa că laptele poate fi considerat un mediu bun pentru
sinteza de acid ascorbic sau analogi ai acestuia, cu toate că ȋn lapte conținutul de vitamină
C este mic. Un alt factor care se pare că ȋnclină procesul metabolic ȋn această direcție este
stress-ul oxidativ la care este supusă celula de drojdie (Branduardi et al., 2007), ȋn lipsa
unei concentrații suficiente de oxigen pentru a desfăşura un proces fermentativ.
200 250 300 350 nm
0
500
1000
1500
2000
2500
mAU 7.16/ 1.00
21
1
23
9
30
5
20
3
21
5
26
2
32
3
200 300 400 500 600 700 nm
0
1000
2000
3000
mAU 3.39/ 1.00
25
22
18
34
4
48
6
19
42
12
23
72
64
36
2
64
6
A. B. Fig.26 Spectrul UV de absorbție a vitaminei B3(A) şi vitaminei C(B)
Fig.26 The UV absorbtion spectrum of B3(A) vitamin and C vitamin(B)
Din analiza rezultatelor din tabelul 22, se poate observa că pe durata perioadei de
conservare a produsului ȋn condiții de refrigerare, se ȋnregistrează o creştere a
conținutului de vitamină B3. Cea mai mare creştere se ȋnregistrează ȋn primele şapte zile
de depozitare, ceea ce considerăm că se datorează ȋnmulțirii celulelor de drojdie din
această perioadă, aşa cum s-a arătat ȋn capitolul II, până la un nivel de 105 cfu/ml. Ȋn
perioada următoare deşi numărul de drojdii Saccharomyces cerevisiae se menține relativ
XLVIII
constant, totuşi procesul metabolic de sintetizare a acestei vitamine continuă cu un ritm
crescător.
Tabelul 22
Table 22
Rezultate obținute prin analiza HPLC Results obtained by HPLC analysis
Vitamina Vitamin
mg/100g
Timp retenție Retention
time
Pb 1 zi Sample
1 day
Pb 7 zile Sample
7 days
Pb 14 zile Sample
14 days
Pb 21 zile Sample
21 days
Vitamina B3
1iacin
7,49 23,8 58 80 104
Vitamina C Ascorbic
acid
3,61 13,9 7 8,8 8,4
Fig.27 Variația conținutului de vitamină B3 pe durata perioadei de depozitare Fig. 27 Vitamin B3 content’s variation during shelf-life
Fig. 28Variația conținutului de vitamină C pe durata perioadei de depozitare Fig.28 Vitamin C content’s variation during shelf-life
XLIX
Ȋn ceea ce priveşte conținutul de vitamină C, acesta ȋnregistrează o valoare
maximă ȋn prima zi a perioadei analizate după care ȋn ziua a 7-a a depozitării se
ȋnregistrează o scădere aproape la jumătate iar ȋn perioada următoare o uşoară creştere.
Considerăm că această variație se datorează faptului că ȋn prima etapă ambele specii
microbiene, Lactococcus şi Saccharomyces sintetizează vitamina C, posibil sub forma
mai multor analogi. Ȋn perioada următoare participarea bacteriilor lactice la sinteza
vitaminei C se reduce iar cele care folosesc substratul disponibil ȋn condiții de stress
oxidativ sunt drojdiile Saccharomyces. Acest fenomen este cu siguranță ȋn legătură cu
lipsa monoglucidelor din mediu, aşa cum s-a arătat ȋn subcapitolul III.2.1 şi cu dinamica
de dezvoltare celulară a drojdiilor pe durata depozitării produsului.
Ȋn concluzie putem considera că produsul tip chefir are o valoare nutritivă crescută
datorită conținutului ȋn aceste vitamine, aspect raportat şi de alți cercetători (Tamine et
al., 1999, Durga et al., 1986) pentru anumite tipuri de iaurturi cu drojdie Saccharomyces.
Totodată prezența acestor vitamine dovedeşte potențialul bioactiv al drojdiei de bere şi
contribuie la caracterul funcțional al produsului.
DISCUŢII GE�ERALE
Scopul acestui studiu a fost obținerea şi caracterizarea unui produs lactat
funcțional ce valorifică potențialul bioactiv al drojdiei de bere Saccharomyces cerevisiae,
urmărind elaborarea şi optimizarea procesului tehnologic de obținere a produsului lactat
funcțional dar şi caracterizarea microbiologică şi a compuşilor biologic activi ce dau
funcționalitate produsului.
Ȋn raport cu obiectivele generale ale tezei şi cele specifice prezentate ȋn cele trei
capitole ale studiului destinat cercetărilor proprii, putem considera următoarele:
1. Ȋn capitolul 4, prin teste realizate ȋn fază de laborator şi la scară pilot, s-a
constatat că prezența drojdiilor Saccharomyces cerevisiae ȋn produs nu afectează
negativ parametrii fizico-chimici ai acestuia, aspect demonstrat şi prin analiză
statistică. De asemenea, s-a optimizat cantitatea şi calitatea inoculului obținându-
se o dinamică de dezvoltare optimă pentru co-cultivarea speciilor de Lactococcus
lactis şi Saccharomyces cerevisiae pe perioada de conservare a produsului la 4-
6°C.
L
Procesul biotehnologic de obținere a produsului lactat a fost monitorizat ȋntr-un
bioreactor şi s-a determinat evoluția pH-ului, conținutului de oxigen dizolvat
precum şi dinamica de dezvoltare a bacteriilor lactice şi a drojdiilor de bere.
Rezultatele au arătat că:
� Variația pH-ului(curba de aciditate) este caracteristică unui produs tip chefir
� Conținutul de oxigen dizolvat ȋn laptele materie primă este un factor
competitiv pentru cele două specii microbiene studiate
� Nu s-a evidențiat formare de dioxid de carbon pe durata fermentației
� Dinamica de dezvoltare a bacteriilor Lactococcus lactis şi a drojdiilor
Saccharomyces cerevisiae după 12h şi 24h de fermentație, a confirmat
alegerea acestei variante de inoculare ca fiind cea optimă din punct de
vedere al viabilității pe perioada de depozitare
Analiza senzorială a fost utilizată ȋn scopul selecției probei optime; s-au folosit
patru teste care au condus la următoarele:
� Testul triunghi a arătat că există diferențe semnificative de gust ȋntre
produsul obținut cu adaos de drojdie de bere şi o probă martor (fără acest
adaos).
� Testul hedonic a arătat că acceptabilitatea produsului e maximă ȋn primele
şapte zile de depozitare la 4-6°C dar apoi scade treptat până la sfârşitul
perioadei. Prin analiză statistică s-a ales proba cu variația cea mai bună a
acceptabilității pe durata perioadei de depozitare.
� Testul punctajului a evidențiat că produsul obținut ȋn urma procesului de
optimizare are ȋnsuşiri organoleptice specifice, pozitive, bine conturate şi nu
prezintă defecte perceptibile.
� Testul profilului de aromă a identificat principalii markeri de miros şi gust ai
produsului şi gradele de intensitate ale acestora; gustul şi mirosul de drojdie
a fost considerat moderat până la sfârşitul perioadei de depozitare.
� Analiza senzorială a confirmat alegerea acestei variante de inoculare ca fiind
cea optimă şi din punct de vedere al proprietăților senzoriale.
LI
2. Ȋn capitolul 5, prin analiza microbiologică a produsului lactat funcțional s-a
obținut o dinamică de dezvoltare celulară pe durata perioadei de depozitare după
cum urmează:
� ȋn prima parte a perioadei de depozitare (zilele 1-a şi a -7-a), numărul de
bacterii Lactococcus lactis a fost de 106 cfu/ml iar ȋn partea a doua a
perioadei (zilele a 14-1 şi a 21-a) de 105 cfu/ml
� ȋn prima parte a perioadei de depozitare (zilele 1-a şi a -7-a), numărul de
drojdii Saccharomyces cerevisiae a fost 104 cfu/ml iar ȋn partea a doua a
perioadei (zilele a 14-a şi a 21-a) de 105 cfu/ml
Toți indicatorii microbiologici studiați pentru determinarea microflorei de
contaminare au fost negativi pe ȋntreaga durată a perioadei de păstrare a
produsului. Din punct de vedere al profilului microbiologic produsul poate fi
păstrat ȋn condiții de refrigerare pe o durată de 21 de zile.
3. Ȋn capitolul 6 au fost identificați şi caracterizați principalii compuşi bioactivi din
produsul lactat funcțional, folosind o metodologie analitică modernă:
� prin metode enzimatice (Boehringer Mannheim/ R-Biopharm) s-au dozat
lactoza/glucoza, acidul D,L lactic şi etanolul din produsul obținut in bioreactor
şi-n stația pilot. S-a caracterizat evoluția acestor compuşi bioactivi pe durata de
păstrare a produsului ȋn condiții de refrigerare la 4-6°C.
� Acidul lactic s-a dozat şi prin metodă reflectometrică (spectrometrie de reflexie),
rezultatele obținute au fost corelate ,prin analiză statistică, cu cele ale metodei
enzimatice. Metoda reflectometrică s-a dovedit foarte utilă pentru determinări
rapide ce se pot realiza pe durata controlului de calitate ȋn laborator sau pe fluxul
tehnologic de fabricare a produselor.
� Prin tehnica FTIR s-au caracterizat :
� Speciile microbiene din cultura starter şi drojdia de bere obținându-se
amprenta specifică (fingerprint)
� Compuşii bioactivi din lapte şi produsul finit, precum şi evoluția acestora
pe durata perioadei de depozitare ȋn condiții de refrigerare.
LII
Amprenta specifică obținută pentru drojdia Saccharomyces cerevisiae a evidențiat
potențialul său bioactiv comparativ cu alte specii studiate ca Lactococcus lactis şi
Debaryomyces hansenii.
� Cu ajutorul cromatografiei lichide de ȋnaltă performanță s-au identificat şi
caracterizat două vitamine, acidul nicotinic (vitamina B3) şi acidul ascorbic
(vitamina C), considerate de interes datorită provenienței lor din drojdia
Saccharomyces cerevisiae. Conținutul ȋn aceste vitamine dovedeşte caracterul
funcțional al produsului tip chefir.
CO�CLUZII
Față de obiectivele prezentului studiu se pot evidenția următoarele concluzii generale:
1. S-a obținut un produs lactat funcțional cu adaos de drojdie de bere prelevată din
fermentația secundară a berii, ȋn inoculul destinat ȋnsămânțării laptelui alături de o
cultură lactică mezofilă şi o cultură de drojdii de chefir, ȋn urma unui studiu de
elaborare şi optimizare a procesului tehnologic.
2. S-a realizat selectarea produsului lactat funcțional cu caracteristici optime pe baza
analizei senzoriale.
3. S-a caracterizat produsul lactat funcțional prin analiză microbiologică atât din
punct de vedere al microflorei de interes cât şi al celei de contaminare.
4. Au fost identificați şi caracterizați compuşi bioactivi (acid D/L lactic, lactoză,
glucoză, etanol, vitamine, dioxid de carbon, arome etc.) din produsul lactat
funcțional prin utilizarea unei metodologii analitice moderne: HPLC, FT-IR,
metode enzimatice cu detecție UV, spectrometrie de reflexie.
LIII
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1. BRANDUARDI, P., FORSATI, T., SAUER, M., PAGANI, R.,
MATTANOVICH, D., PORRO, D., 2007, Biosynthesis of vitamin C by yeast
leads to increased stress resistance, PLOS OHE
2(10):e1092,doi:10.1371/journal.pone.0001092.
2. COSTIN, G.,M.,(editor), 2007,Produse lactate functionale, Ed. Academica Galați
3. DRAKE, M. A., 2007, Sensory Analysis of Dairy Foods, J. Dairy Sci. 90:4925–
4937.
4. FONTAN GARCIA, M., MARTINEZ,S.,FRANCO,I.,CARBALLO,J.,2005,
Microbiological and chemical changes during manufacture of Kefir made from
cows’ milk, using a commercial starter culture,International Dairy Journal
16:762-767.
5. GU¨ZEL-SEYDIM, Z.B., SEYDIM, A.C., GREENE, A.K. AND BODINE,
A.B.,2000a, Determination of organic acids and volatile flavor substances in kefir
during fermentation, Journal of Food Composition and Analysis 13: 35-43
6. GU¨ZEL-SEYDIM, Z.B., SEYDIM, A.C. AND GREENE, A.K.,2000b,Organic
acids and volatile flavor components evolved during refrigerated storage of kefir,
Journal of Dairy Science 83: 275-277.
7. IRIGOYEN A., ARANA I., CASTIELLA M., TORRE P., IBANEZ F.C.,2005,
Microbiological,physicochemical, and sensory characteristics of kefir during
storage, Food Chemistry, 90: 613–620.
8. NAUMANN,D., 2000,Infrared spectroscopy in microbiology, In: Encyclopedia of
Analitycal Chemistry R.A. Meyers (ed.),pp.102-131.
9. SAKHAMURI,S.,BOBER,J.,IRUDAYARAJ,J.,DEMIRCI,A.,2004,Simultaneos
determination of multiple components in nisin fermentation using FTIR
spectroscopy, GIGR Journal of Scientific Research and Development, FP 03
10. VILJOEN, B.C., 2001, The interaction between yeasts and bacteria in dairy
environments, International Journal of Food Microbiology 69: 37-44.
LIV
Fig
.29
Cro
mat
ogra
me
ale
prob
elor
de
chef
ir p
e du
rata
dep
ozit
ării
(1zi
,7 z
ile,
14
zile
, 21
zile
) F
ig.2
9 C
hro
ma
tog
ram
s o
f ke
fir’
s sa
mp
les
du
rin
g s
hel
f-li
fe(1
da
y, 7
da
ts,
14
da
ys,
21
da
ys)
02
46
81
01
21
41
61
82
02
22
42
62
83
03
23
43
63
84
0
0
20
00
0
40
00
0
60
00
0
80
00
0
10
00
00
12
00
00
14
00
00
Aria,mAU(Area,mAU)
(Tim
p,m
in)(Tim
e, min
)
Ch
efi
r 1
zi
Ke
fir
1 d
ay
vit
C
vit
B3
02
46
81
01
21
41
61
82
02
22
42
62
83
03
23
43
63
84
0
0
10
00
0
20
00
0
30
00
0
40
00
0
50
00
0
60
00
0
70
00
0
80
00
0
Aria,mAU(Area, mAU)
Tim
p,m
in(Time, min)
ch
efi
r 7
zile
ke
fir
7 d
ay
s
vit
C
vit
B3
02
46
81
01
21
41
61
82
02
22
42
62
83
03
23
43
63
84
0
0
20
00
0
40
00
0
60
00
0
80
00
0
10
00
00
Aria,mAU(Area,mAU)
Tim
p,
min
(Time, min
)
Ch
efi
r 1
4 z
ile
Ke
fir
14
da
ys
vit
C
vit
B3
02
46
81
01
21
41
61
82
02
22
42
62
83
03
23
43
63
84
0
0
10
00
0
20
00
0
30
00
0
40
00
0
50
00
0
60
00
0
70
00
0
80
00
0
Aria,mAU(Area, mAU)
Tim
p,
min
(Tim
e,m
in)
Ch
efi
r 2
8 z
ile
Ke
fir
28
da
ys
vit
C
vit
B3
LV
